ENVOLVIMENTO DO NÚCLEO PRÉ-ÓPTICO ÃO_ALINE.pdfPor saber que pude contar...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ENVOLVIMENTO DO NÚCLEO PRÉ-ÓPTICO MEDIANO NA REGULAÇÃO AUTONÔMICA E CARDIOVASCULAR

ALINE ANDRADE MOURÃO

GOIÂNIA-GO

2015



Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal de

Goiás, como requisito parcial para obtenção do título

de Mestre em Ciências Biológicas.

Área de Concentração: Farmacologia e Fisiologia

Orientador: Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino

GOIÂNIA-GO

2015

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E

DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG)

a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG),

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da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação [ ] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação

Autor (a): Aline Andrade Mourão

E-mail: [email protected]

Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ X ]Sim [ ] Não

Vínculo empregatício do autor Bolsista

Agência de fomento: Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior

Sigla: CAPES

País: Brasil UF:GO CNPJ: 00889834/0001-08

Título: Envolvimento do Núcleo Pré-Óptico Mediano na regulação

autonômica e cardiovascular

Palavras-chave: MnPO, Pressão Arterial, SHR, Simpatoinibição Renal

Título em outra língua: Involvement of the Median Preoptic Nucleus in autonomic and

cardiovascular regulation

Palavras-chave em outra língua: MnPO, Arterial Pressure, SHR,

Renal Sympathoinhibition

Área de concentração: Biologia Celular

Data defesa: (dd/mm/aaaa) 25/02/2015

Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Biologia

Orientador (a): Gustavo Rodrigues Pedrino

E-mail: [email protected]

Co-orientador

(a):*

E-mail: *Necessita do CPF quando não constar no SisPG

3. Informações de acesso ao documento:

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________________________________________ Data: ____ / ____ / _____ Assinatura do (a) autor (a) 1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa

junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante o período de embargo.

mailto:[email protected]

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BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________

Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino Universidade Federal de Goiás

_____________________________________________

Prof. Dr. Daniel Alves Rosa Universidade Federal de Goiás

_____________________________________________

Prof. Dr. Daniel Breseghello Zoccal Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho

Aprovada em: ____/____/________

1

Dedicatória

Aos meus pais Sebastião de Almeida Mourão Neto e Maria Elena Andrade Mourão,

por absolutamente tudo! Por terem me educado, me ensinado a viver. Por terem me

ensinado o que são valores, o que é ter fé em Deus e fé na vida!

Às minhas irmãs, Ângela Priscilla Andrade Mourão e Amanda Andrade Mourão por

todos os momentos de companheirismo, de carinho e amor. Sei que passamos por

muita coisa juntas e que sabermos que tínhamos uma à outra foi primordial para

seguirmos em frente.

A todos meus familiares e amigos que verdadeiramente torceram por mim e pela

concretização desse passo importante em minha vida.

2

Agradecimentos

À Deus por mais essa grande vitória em minha vida. O Senhor foi minha

fortaleza e me manteve firme no meu propósito e me ajudou a seguir em frente.

Obrigado Senhor por ter me amparado em tantas batalhas. Louvo a Deus todas as

coisas!!

Aos meus pais, minhas irmãs e meu sobrinho Pedro. Obrigada por tanto

carinho. Por saber que pude contar com vocês em todos os momentos... mesmo sem

querer ou com aquele grilo de ter que ir no ponto me buscar da facu. Mas que sim,

estavam ali sempre me apoiando e me encorajando cada um à sua maneira.

À turma maravilhosa do EaD. Obrigada Profa. Gláucia por ter me acolhido, por

todos os ensinamentos e pela consideração. Obrigada Ruthinha, Paulo, Julinho,

Flávia, Cris e Cléver.

Ao Prof. Dr. Gustavo Rodrigues Pedrino pela oportunidade de fazer parte do

Laboratório, por sua confiança, por permitir que eu fizesse parte desse grande projeto

que é construir o nome da Fisiologia na UFG!

Aos colegas do Departamento de Ciências Fisiológicas.

À Universidade Federal de Goiás e à Capes pelo apoio financeiro.

À Gleice linda. Obrigada por sempre ser essa pessoa gentil e, principalmente,

por seu profissionalismo e cuidado para com os alunos.

Ao Prof. Dr. Carlos Henrique Xavier Custódio pelos seus ensinamentos e

atenção.

3

À família Bom Pastor por todos os momentos em que passamos juntos e por

mudarem meu modo de pensar a vida. Obrigada Clarice, Eleuzinha, Sr Lico, Anderson,

Socorro, Souza, Maria Célia, Raimundo, Igor, Allan, Marcela, Bia, Ju, Léo, Amanda,

Angela, Clóvis, Pedro, Elena, Pe Aurélio.

Às minhas amigas irmãs Mikita e Rosana. Obrigada por serem as mais lindas

do mundo e por serem aquelas pessoas que não importa onde esteja ou quanto

tempo passemos afastadas que ainda assim serão as melhores companhias que

alguém pode ter! Amo vocês.

As amigas especiais que fizeram e fazem parte da minha vida e que me

apoiaram cada uma a sua maneira em praticamente tudo. Obrigada Elisa, Lud e

Carolzinha.

À turma topíssima do Centro de Neurociência e Fisiologia Cardiovascular.

Obrigada Iza Tesouro, Aryanne Gorduxa, Marineras, Elaine Bretinho, Oda, Larinha,

Neide, Thais Bagaça, Lari, Kellen, Carol, Paulinho e Jaminhos. Obrigada por todos os

momentos que passamos juntos, bons ou ruins. Obrigada pelos almoços no RU da

pobreza. Por todos os bolos e festinhas na pamonharia. Por todas as gargalhadas e

por serem a melhor turma de ararajubas que alguém pode trabalhar. Obrigada pela a

amizade e carinho que cada um a sua maneira depositou em mim!

4

Sumário

Lista de Abreviaturas e Siglas. 6

Lista de Figuras 8

Lista de Tabelas 11

Resumo 12

Abstract 14

1. Introdução 18

2. Objetivos 22

2.1. Objetivo Geral 23

2.2. Objetivo Específico 23

3. Materiais e Métodos 24

3.1. Modelo Animal Utilizado 25

3.2. Grupos Experimentais 25

3.3. Desnervação Sinoaórtica 25

3.4. Teste de Sensibilidade Barorreflexa e Quimiorreflexa 26

3.5. Procedimentos Cirúrgicos Gerais 26

3.6. Registro da Pressão Arterial e do Eletrocardiograma 27

3.7. Registro da Atividade Nervosa Simpática Renal 27

3.8. Nanoinjeções no MnPO 28

3.9. Histologia 28

3.10. Análise Estatística 29

5

4. Resultados 30

4.1. Histologia 31

4.2. Participação do Núcleo Pré-Óptico Mediano no controle dos

parâmetros cardiovasculares e da atividade nervosa simpática renal em

ratos normotensos e hipertensos 32

4.2.1. Nanoinjeções de muscimol no terceiro ventrículo de ratos

normotensos e hipertensos 36

4.3. Participação dos aferentes sinoaórticos nas respostas

autonômicas e cardiovasculares induzidas pelo bloqueio farmacológico do

MnPO em ratos normotensos e hipertensos 38

4.3.1. Análise da desnervação sinoaórtica (DSA) sobre a

sensibilidade barorreflexa e quimiorreflexa em ratos normotensos 38

4.3.2. Nanoinjeções de muscimol no MnPO de ratos normotensos

submetidos à desnervação sinoaórtica (DSA) 39

4.3.3. Análise da desnervação sinoaórtica (DSA) sobre a

sensibilidade barorreflexa e quimiorreflexa em ratos hipertensos 42

4.3.4. Nanoinjeções de muscimol no MnPO de ratos

espontaneamente hipertensos submetidos à desnervação sinoaórtica

(DSA) 43

4.4. Participação da neurotransmissão glutamatérgica no MnPO sobre

o controle cardiovascular e autonômico em ratos normotensos e

hipertensos 47

5. Discussão 49

6. Considerações Finais 56

7. Referências Bibliográficas 58

6

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Ang II Angiotensina II

ANSR Atividade Nervosa Simpática Renal

AP5 Ácido 2-amino-5-fosfonovalerico

AV3V Região Anteroventrolateral do Terceiro Ventriculo

bpm Batimentos por Minuto

commNTS Núcleo do Trato Solitário Comissural

DSA Desnervação Sinoaórtica

ECG Eletrocardiograma

EPM Erro Padrão da Média

FC Frequência Cardíaca

ƒANSR Integral de Atividade Nervosa Simpática Renal

IB Índice de Barorreflexo

IML Medula Intermédio Lateral

Kg Kilograma

mM Milimolar

MnPO Núcleo Pré-Óptico Mediano

Na+ Sódio

NaCl Cloreto de Sódio

nl Nanolitro

NMDA N-Metil-Aspartato

NTS Núcleo do Trato Solitário

OVLT Órgão Vasculoso da Lâmina Terminal

7

PA Pressão Arterial

PAM Pressão Arterial Média

PAP Pressão Arterial Pulsátil

PVN Núcleo Paraventricular

RVLM Região Rostroventrolateral do Bulbo

SFO Órgão Subfornicial

SHR Rato Espontaneamente Hipertenso

SNA Sistema Nervoso Autônomo

SNC Sistema Nervoso Central

WT Wistar

V Volts

8

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação esquemática das vias envolvidas no controle da

pressão arterial. MnPO: núcleo pré-óptico mediano; mPVN: subnúcleo

magnocelular do PVN ; pPVN: subnúcleo parvocelular do PVN; RVLM:

região rostroventrolateral do bulbo; CVLM: região caudoventrolateral do

bulbo; NTS: núcleo do trato solitário; SFO: órgão subfornical; OVLT: órgão

vasculoso da lâmina terminal; NH: neurohipófise; OT: ocitocina; VP:

vasopressina; Ang II: angiotensina II; Na+: íon sódio. (Modificado de

Pedrino et al., 2015, em redação). 19

Figura 2. Verificação histológica dos animais que receberam

nanoinjeções de soro 150mM, muscimol 4mM e ácido quinurênico 50mM

no MnPO (seta); ca (Comissura Anterior). Fotomicrografia de um corte

coronal (40 μm) do cérebro corado pela técnica de vermelho neutro (A).

Imagens coronais sequenciais que mostram o espalhamento das drogas

nanoinjetadas no MnPO (B); área escura (espalhamento máximo); área

azul (espalhamento mínimo). 31

Figura 3. Traçado representativo mostrando as alterações na pressão

arterial pulsátil (PAP); eletrocardiograma (ECG); atividade nervosa

simpática renal (ANSR) e integral de ANSR (u.a.) induzidas por

nanoinjeções de soro fisiológico (150 mM) e muscimol (4mM) no MnPO e

administração intravenosa de hexametônio em WT (A) e SHR (B).. 29

Figura 4. Média ± EPM das variações da pressão arterial média (Δ PAM;

A), frequência cardíaca (∆ FC; B) integral de atividade nervosa simpática

(Δ ANSR; C) induzidas pela nanoinjeção de soro fisiológico (150 mM) e

muscimol (4mM) no MnPO em WT e SHR. * diferente da nanoinjeção de

soro fisiológico; † difere do grupo; p < 0,05.. 30

9


A), frequência cardíaca (Δ FC; B) e integral de atividade nervosa

simpática (Δ ANSR; C), induzidas pelas naninjeções de soro fisiológico

(150 mM) e de muscimol (4 mM) no terceiro ventrículo em WT e SHR 37

Figura 6. Média ± EPM do índice de barorreflexo (IB; bpm•mmHg-1)

mediante infusões de fenilefrina dos animais controles e submetidos à

DSA. † diferente do controle. p < 0,05. 38

Figura 7. Média ± EPM da variação da pressão arterial média (PAM; A) e

da frequência cardíaca (FC; B) após o teste de quimiorreflexo nos animais

controles e submetidos à DSA. † diferente do controle. p < 0,05. 39



(Δ ANSR; C) induzidas pela nanoinjeção de muscimol (4mM) no MnPO

em WT (traço vertical em preto no tempo 0). * difere do tempo 0; p < 0,05..

41

Figura 9. Média ± EPM do índice de barorreflexo (IB; bpm·mmHg-1)

mediante infusões de fenilefrina dos animais SHRs controles e

submetidos à DSA. † diferente do controle. p < 0,05. 42

Figura 10. Média ± EPM da variação da pressão arterial média (PAM; A)

e da frequência cardíaca (FC; B) após o teste de quimiorreflexo nos

animais SHRs controles e submetidos à DSA. † diferente do controle. p <

0,05. 43



(Δ ANSR; C) devido à nanoinjeções de muscimol (4mM) no MnPO em

SHR (traço vertical em preto no tempo 0). * difere do tempo 0; † difere do

grupo; p < 0,05. 45

10



(Δ ANSR; C) devido à nanoinjeções de muscimol (4mM) no MnPO em WT

e SHR (traço vertical em preto no tempo 0). * difere do tempo 0; † difere

do grupo; # difere do WT; p < 0,05. 46



(Δ ANSR; C) devido a nanoinjeções de soro fisiológico (150 mM) e ácido

quinurênico (50mM) no MnPO em WT e SHR. * diferente da nanoinjeção

de soro fisiológico; p < 0,05. 48

11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Valores basais médios ± EPM da pressão arterial média (PAM),

frequência cardíaca (FC) e integral da atividade nervosa simpática renal

(ƒANSR) dos ratos wistar que receberam nanoinjeções de muscimol 4mM

no MnPO (WT) ou no terceiro ventrículo (WT – 3V), e de ratos

espontaneamente hipertensos (SHRs) que receberam nanoinjeções de

muscimol 4mM no MnPO (SHR) ou no terceiro ventrículo (SHR – 3V).. 32

12

RESUMO

Estudos têm demonstrado que os neurônios do núcleo pré-óptico mediano

(MnPO) desempenham um importante papel na regulação cardiovascular e

hidromineral, principalmente, por meio de suas projeções para o núcleo

paraventricular (PVN) do hipotálamo. O PVN, por sua vez projeta-se para a região

rostroventrolateral do bulbo (RVLM) um dos principais núcleos geradores da

atividade simpática vascular, renal e cardíaca. Todavia, as respostas autonômicas

frente a inibição do MnPO, bem como vias centrais e/ou mecanismos envolvidos

nessas respostas permanecem desconhecidos. O presente estudo buscou

determinar a participação do MnPO na regulação autonômica e cardiovascular em

ratos wistar (WT) e espontaneamente hipertensos (SHR). Para tanto, ratos das

linhagens WT e SHR, pesando entre 250 e 350g foram anestesiados com uretano

(1,2 g/kg, iv.) após a indução com halotano (2% em O2 100%). A artéria e veia

femorais direitas foram canuladas para o registro da pressão arterial média (PAM), e

a infusão de drogas, respectivamente. A frequência cardíaca (FC) foi calculada

como frequência instantânea do sinal de eletrocardiograma (ECG). Os animais

foram posicionados em um aparelho estereotáxico e instrumentalizados para registro

da atividade nervosa simpática renal (ANSR), e nanoinjeções (100nl) de soro

fisiológico (NaCl; 150mM); ácido quinurênico (antagonista glutamatérgico; 50mM) e

muscimol (agonista gabaérgico; 4mM) no MnPO. Como esperado, as nanoinjeções

de soro não alteraram os valores da PAM (WT: 0,4 ± 0,2 mmHg; SHR: 0,2 ± 0,4

mmHg), FC (WT: 0,7 ± 0,9 bpm; SHR; 1,1 ± 1,4 bpm) e da ANSR (WT: 0,4 ± 0,2 %;

SHR: -0,2 ± 1,3 %).Em ratos WT (n=6), o bloqueio farmacológico do MnPO com

muscimol promoveu queda na PAM (-17,0 ± 1,2 mmHg), bradicardia (-55,4 ± 12,3

bpm) e redução na ANSR (-37,5 ± 3,9 %). As nanoinjeções de muscimol no MnPO

dos SHR (n=6) promoveram hipotensão (-31,6 ± 5,0 mmHg), bradicardia (-18,3 ± 7,2

bpm), e simpatoinibição renal (-54,4 ± 6,2 %). As variações dos parâmetros

autonômicos e cardiovasculares induzidas pela inibição do MnPO também foram

avaliadas em ratos WT e SHR submetidos à desnervação dos aferentes

sinoaórticos. Nos ratos normotensos, a inibição do MnPO com muscimol promoveu

queda na PAM nos ratos inervados (n=6) e desnervados (-19,4 ± 1,9 vs. -20,9 ± 4,3

mmHg, respectivamente; 3min; n=6), sendo esta mantida por todo período

experimental (-13,5 ± 2,0 vs. -22,5 ± 4,3 mmHg; 30min). Também não foram

13

evidenciadas diferenças na redução da ANSR nos ratos WT inervados (-23,0 ± 1,5

%; 3min) e desnervados (-21,0 ± 4,9 %; 3min). Nos ratos hipertensos desnervados

(n=5), o bloqueio do MnPO promoveu uma progressiva redução na PAM (-31,1 ±

6,7; -38,7 ± 9,7 e -44,7 ± 7,1 mmHg; respectivamente 3, 15 e 30 min após o bloqueio

do MNPO). As alterações promovidas na FC (-1,3 ± 3,3; -21,5 ± 12,6 e -24,9 ± 12,2

bpm; respectivamente 3, 15 e 30 min após o bloqueio do MNPO) e ANSR (-16,4 ±

8,8; -37,3 ± 10,1 e -45,1 ± 8,7 %; respectivamente 3, 15 e 30 min após o bloqueio do

MNPO) também seguiram esse padrão de resposta. Por fim para identificarmos a

participação da neurotransmissão glutamatérgica no MnPO sobre o controle

cardiovascular e autonômico, nanoinjeções de ácido quinurênico foram realizadas

neste núcleo. O bloqueio glutamatérgico no MnPO promoveu queda na PAM (WT: -

18,2 ± 4,1 mmHg vs. SHR: -21,0 ± 2,5 mmHg), bradicardia (WT: -7,1 ± 1,9 bpm vs.

SHR: -9,0 ± 6,0 bpm e simpatoinibição renal (WT: -19,7 ± 2,4 % vs. SHR: -24,7 ± 2,4

%). Em conjunto, os resultados obtidos nesse estudo demonstraram que o bloqueio

agudo do MnPO reduz a pressão arterial (PA), corroborando com dados recentes

que indicam que esse núcleo participa do controle tônico da PA. Nossos dados

sugerem o envolvimento do MnPO na regulação tônica da atividade simpática em

WT e SHR. Ademais, sugerem a participação desse núcleo no aumento da atividade

simpática e consequente hipertensão arterial observada em SHR. Os resultados

evidenciaram ainda, que os aferentes aórticos e carotídeos participam na modulação

das respostas autonômicas e cardiovasculares induzidas pelo bloqueio do MnPO em

SHR. Além disso, nossos dados sugerem que a neurotransmissão glutamatérgica no

MnPO é importante para a regulação tônica da PA, FC e ANSR trazendo assim

novas evidências de que esse núcleo participa do controle autonômico e

cardiovascular.

14

ABSTRACT

Studies have demonstrated that neurons in the median pre-optic nucleus (MnPO)

play a key role in the organization of cardiovascular responses induced by changes

in circulating volume mostly through their projections to the paraventricular nucleus

(PVN) of the hypothalamus. PVN in turn, projects to the rostroventrolateral medulla

(RVLM) one of the main generators nucleus of vascular sympathetic, renal and

cardiac activity. However, the autonomic response of blocked of the MnPO and

central pathways and / or mechanisms involved in these responses remains

unknown. The present study sought to determine the involvement of the MnPO in

cardiovascular and autonomic regulation in Wistar (WT) and spontaneously

hypertensive rats (SHR). For these, rats of the lineages WT (n = 6) and SHR (n = 6),

weighing between 250 and 300g were anesthetized with urethane (1.2 g / kg, iv.)

after induction with halothane (2% in O2 100%). The right femoral artery and vein

were cannulated for recording of mean arterial pressure (MAP), and infusion of

drugs, respectively. Heart rate (HR) was calculated as instantaneous frequency

signal electrocardiogram (ECG). The animals were positioned in a stereotaxic

apparatus, and instrumented for recording renal sympathetic nerve activity (RSNA).

The nanoinjections of saline (NaCl; 150 mM), kynurenic acid (glutamate receptor

antagonist; 50 mM) and muscimol (GABA agonist; 4 mM) were also performed. As

expected, saline nanoinjections did not change the values of MAP (WT: 0.4 ± 0.2

mmHg; SHR: 0.2 ± 0.4 mmHg), HR (WT: 0.7 ± 0.9 bpm; SHR, 1.1 ± 1.4 bpm) and

RSNA (WT: 0.4 ± 0.2%; SHR: 0.2 ± 1.3%). In WT (n=6) rats, the blockade of the

MnPO with muscimol promoted fall in MAP (-17.0 ± 1.2 mmHg), bradycardia (-55,4 ±

12,3 bpm) and reduces in RSNA (-37.5 ± 3.9 %). The muscimol nanoinjections into

the MnPO in SHR (n=6) promoted hypotension (-31.6 ± 5.0 mmHg), bradycardia (-

18.3 ± 7.2 bpm), and renal sympathoinhibition (-54.4 ± 6.2 %). The changes in

cardiovascular and autonomic parameters were evaluated in WT and SH rats

submitted to sinoartic denervation. In normotensive rats, the inhibition of the MnPO

by muscimol promoted decrease of MAP in innervated rats (n=6) and denervated (-

19.4 ± 1.9 vs. 20.9 ± 4.3 mmHg, respectively; 3min; n=6), which was maintained

throughout the experimental period (13.5 ± 2.0 vs. 22.5 ± 4.3 mmHg, 30 min). Also

did not evidenced differences in RSNA in WT innervated (-23.0 ± 1.5%; 3min) and

denervated (-21.0 ± 4.9%; 3min) rats. In denervated hypertensive rats (n=5), the

15

blocked of MnPO resulted in progressive decrease in MAP (-31.1 ± 6.7, ± 9.7 and -

38.7 ± 7.1 -44.7 mmHg, respectively 3, 15 and 30 min after MnPO blockade). The

changes observed in the HR (-1.3 ± 3.3; -21.5 ± 12.6 and -24.9 ± 12.2 bpm,

respectively 3, 15 and 30 min after MnPO blockade) and RSNA (-16.4 ± 8.8; -37.3 ±

10.1 and -45.1 ± 8.7%, respectively 3, 15 and 30 min after MnPO blockade) also

followed this pattern of response. Finally to identify the involvement of glutamatergic

neurotransmission in the MnPO on the cardiovascular and autonomic control,

nanoinjections of kynurenic acid were performed in this nucleus. The glutamatergic

blockade promoted decrease in MAP (WT: -18.2 ± 4.1 mmHg; SHR: -21.0 ± 2.5

mmHg), bradycardia (WT: -7.1 ± 1, 9 bpm; SHR: -9.0 ± 6.0 bpm) and renal

simpathoinhibition (WT: -19.7 ± 2.4%; SHR: -24.7 ± 2.4%) in normotensive and

hypertensive rats. In summary, the results obtained on this study demonstrated that

acute blockade of MnPO reduces blood pressure (BP), confirming recent data that

indicate that this nucleus participates of tonic control on BP. Our data suggest the

involvement of MnPO the tonic regulation of sympathetic activity in WT and SHR. In

addition, suggest the participation of this nucleus in increased sympathetic activity

and consequent arterial blood pressure in SHR. The results demonstrated that aortic

and carotid afferent participates in the modulation of autonomic and cardiovascular

responses induced by blockade the MnPO in SHR. Furthermore, our data suggest

that glutamatergic neurotransmission in the MnPO is important for the tonic

regulation of BP, HR and RSNA thus, bringing new evidence that this nucleus

participates of the autonomic and cardiovascular control.

16

1. Introdução

17

O sistema nervoso central (SNC) possui núcleos e regiões que desempenham

papeis importantes na regulação cardiovascular bem como manutenção da

homeostase do fluido corporal. O núcleo paraventricular (PVN) do hipotálamo e as

regiões anteroventrolateral do terceiro ventrículo (AV3V) e rostroventrolateral do

bulbo (RVLM) representam exemplos destes centros regulatórios (Brody et al., 1968;

De Luca & Menani, 1996; Colombari & Cravo, 1999; Pedrino et al., 2005; Stocker et

al., 2006; Toney et al, 2003; Toney & Stocker, 2010; Vieira et al., 2004).

A região AV3V constitui um dos principais centros envolvidos no controle da

osmolaridade do fluido corporal. Esta, por sua vez, possui estruturas capazes de

perceber alterações na osmolaridade plasmática e concentração de hormônios

circulantes, como a angiotensina II (ANG II) (Brody & Johnson, 1980; Bealer, 2002).

Estudos demonstraram que esta região, possui papel crucial na manutenção do

equilíbrio hidroeletrolítico, regulação da atividade nervosa simpática, além de fazer

conexões com circuitos envolvidos na regulação cardiovascular (Brody et al., 1968;

De Luca & Menani, 1996; Colombari & Cravo, 1999; Vieira et al., 2004; Pedrino et

al., 2005).

Dentre as principais estruturas que compõem AV3V, destacamos o núcleo

pré-óptico mediano (MnPO) (Johnson & Edwards, 1991; Johnson et al., 1996). O

MnPO também constitui um dos centros regulatórios e desempenha um importante

papel no controle da osmolaridade e volume extracelular (Stoker & Tonney, 2005). O

MnPO localiza-se na lâmina terminal adjacente à comissura anterior e recebe

densas projeções excitatórias de osmorreceptores centrais, como do Órgão

Vasculoso da Lamina Terminal (OVLT; Chiba & Murata, 1985) e do Órgão

Subfornicial (SFO; Miselis et al., 1979). Em sua maioria, estas projeções excitatórias,

são de natureza glutamatérgica (Johnson et al., 1996; Johnson e Lowevy, 1990;

Kolaj et al., 2004). De fato, estudos realizados por Tanaka et al. (1995)

evidenciaram aumentos da frequência de deflagração de potenciais de ação dos

neurônios do MnPO em resposta a estimulação do SFO.

O papel do MnPO tem sido funcionalmente estabelecido utilizando lesões

teciduais da área pré-óptica ventral. Lesões do tecido que envolve o MnPO e o

OVLT reduziram ingestão de sódio (Na+) causada por aumento sistêmico desse íon

(Fitts et al., 1990; Gardiner et al., 1986; De Luca et al., 1992). Ademais, lesões do

18

MnPO atenuaram a secreção de vasopressina pela neuro-hipófise em resposta a

hiperosmolalidade (Mangiapane et al., 1983; Mckinley et al., 2004).

Estudos demonstram a participação dos neurônios do MnPO na regulação

hidromineral e cardiovascular (Amaral et al., 2014; Johnson et al., 1996; Llewellyn et

al, 2012; McKin; ley et al., 1996; Stocker e Toney, 2005; Yasuda et al., 2000; Pedrino

et al., 2009). No entanto, os neurônios do MnPO não são estimulados de forma

homogênea, o que sugere uma complexa organização deste núcleo e sua

heterogeneidade em termos de populações neuronais (Voisin et al., 2012). Nesse

contexto, registros in vivo demonstraram que hiperosmolalidade plasmática aumenta

a frequência de disparos de potenciais de ação em uma subpopulação de neurônios

que se projetam para o PVN, mas não tem efeito em outras subpopulações que se

projetam para o mesmo núcleo (Stoker & Tonney, 2005). Registros in vitro de

neurônios do MnPO revelaram que soluções extracelulares hiperosmóticas ou

hiposmóticas afetam de forma diferenciada a atividade nervosa nesse núcleo.

Enquanto as soluções hiposmóticas reduzem a frequência de disparo dos neurônios

do MnPO, soluções hiperosmóticas as aumentam (Travis & Johnson,1993). De

modo geral, estes estudos ilustram a heterogeneidade das populações neuronais

que respondem de forma diferente às mudanças na osmolalidade sistêmica ou local.

Como mencionado anteriormente, o MnPO pode ser considerado um centro

de integração, uma vez que este recebe informações sobre a osmolaridade

plasmática de osmorreceptores centrais (OVLT e SFO), e através de suas projeções

para o PVN, modula respostas autonômicas e endócrinas fundamentais para a

manutenção da composição e/ou volume do líquido extracelular. O MnPO recebe

ainda, aferências de neurônios catecolaminérgicos do núcleo do trato solitário (NTS;

grupamento A2) e da região ventrolateral do bulbo (grupamentos A1 e C1; Saper et

al., 1983; Tucker et al., 1987) regiões, conhecidas por participarem da modulação

cardiovascular, recebem informações dos aferentes carotídeos e aórticos

(baroceptores e quimioceptores periféricos) e projetam-se para principalmente para

o MnPO (Saper et al., 1983; Tucker et al., 1987). De fato, estudos evidenciaram que

estímulos elétricos destes aferentes aumenta a atividade dos neurônios A1 que

projetam-se para o PVN (Chiba & Murata, 1985; Fernandez-Galaz, 1994; Tanaka et

al., 1992; Figura 1). Ademais, em estudo recente, Moreira et al (2009) demonstraram

a importância da integridade de estruturas hipotalâmicas (AV3V) e de estruturas

19

bulbares envolvidas no baro e quimiorreflexo, como o núcleo do trato solitário (NTS)

na manutenção da hipertensão arterial em SHR. Indicando assim, a importância das

conexões entre as regiões bulbares e hipotalâmicas para o desenvolvimento da

hipertensão arterial.

Figura 1. Representação esquemática das vias envolvidas no controle da pressão arterial. MnPO:

núcleo pré-óptico mediano; mPVN: subnúcleo magnocelular do PVN ; pPVN: subnúcleo parvocelular

do PVN; RVLM: região rostroventrolateral do bulbo; CVLM: região caudoventrolateral do bulbo; NTS:

núcleo do trato solitário; SFO: órgão subfornical; OVLT: órgão vasculoso da lâmina terminal; NH:

neurohipófise; OT: ocitocina; VP: vasopressina; Ang II: angiotensina II; Na+: íon sódio. (Traduzido de

Pedrino et al., 2015, em redação).

20

O PVN pode ser funcional e anatomicamente subdividido nas porções

magnocelular e parvocelular (Sawchenko & Swanson, 1981). A porção magnocelular

é constituída por neurônios secretores de vasopressina (região magnocelular

posterior) e de ocitocina (regiões magnocelulares anterior e medial). A porção

parvocelular é constituída de neurônios que regulam a atividade nervosa simpática,

através de projeções para os neurôios pré-gânglionares simpáticos localizados na

coluna intermédio lateral da medula espinal (IML), e para os nerônios pré-motores

simpáticos localizados na região rostroventrolateral do bulbo (RVLM; Stocker et al.,

2006; Toney et al, 2003;. Toney & Stocker, 2010). Assim, o aumento do drive

exitatório, proveniente do MnPO, para o PVN poderia resultar em aumentos na

secreção de peptídeos vasoativos e da atividade simpática.

Em conjunto, esses estudos propõem que o MnPO participe da integração de

informações acerca de variações da composição do fluido corporal e pressão

sanguínea e, ainda, que promova respostas humorais e cardiovasculares através,

principalmente, de suas projeções para o PVN. Esse por sua vez, se projeta para a

região RVLM um dos principais núcleos geradores da atividade nervosa simpática

(Miselis et al., 1979; Pyner & Coote., 1999; Stoker & Tonney, 2005; Toney &

Stocker, 2010; Ross et al., 1981; Tucker et al., 1987; Figura 1).

Nesse contexto, várias evidências na literatura apontam a participação do

SNC no desenvolvimento e manutenção da Hipertensão arterial (HA) (Blanch et al.,

2013; Silveira et al., 2014; Toney et al., 2010). A participação do SNC parece

ocorrer, principalmente, através da divisão simpática do sistema nervoso autônomo

que inerva regiões responsáveis pelo controle cardiovascular como coração, vasos,

rins e a glândula adrenal (Guyenet, 2006).

Dados recentes de nosso laboratório apontaram para a participação tônica do

MnPO no controle da PA (Silveira et al., 2014). Nesse estudo, nanoinjeções do

agonista GABAA muscimol promoveram quedas na PA de ratos normotensos e SHR.

Ademais, a resposta hipotensora observada nos SHR foi significativamente maior

quando comparada à observada nos ratos normotensos. Em conjunto, estes

resultados sugerem uma possível hiperatividade neuronal do MnPO em animais

SHR.

De fato, estudos evidenciam o aumento da atividade simpática em diversos

modelos de HA (Guyenet, 2006; Oliveira-Sales et al., 2014; Toney et al., 2010) . Em

21

ratos com HA renovascular ou SHR foram observados aumentos do tônus simpático

e da concentração plasmática de noradrenalina (Linz et al., 2014; Oliveira-Sales et

al., 2014; Tsyrlin et al., 2013). Em conjunto esses estudos sugerem a direta

participação do sistema nervoso simpático no desenvolvimento e manutenção desta

patologia.

A região RVLM é a principal área do SNC onde estão localizados os

neurônios pré-motores simpáticos responsáveis pelo controle cardiovascular. Estes

neurônios recebem projeções inibitórias (gabaérgicas) e excitatórias

(glutamatérgicas; Ito et al 2000; Schreihofer et al 2000; Sved et al 2002). As

projeções excitatórias são mediadas principalmente pela liberação de glutamato, que

atuando sobre receptores NMDA e não-NMDA, é responsável pelas respostas

simpatoexcitatórias viscerais (Wang et al 2007; Zhou et al 2006). A partir do exposto

é lícito supor que excitações provenientes de eferentes do MnPO para o PVN e,

consequentemente para o RVLM, poderiam contribuir para o controle tônico da

atividade simpática. Assim, o estudo de regiões que se projetem para regiões

geradoras do tono simpático, como o RVLM, se faz necessário para o entendimento

da gênese e manutenção da HA neurogênica.

22

2. Objetivos

23

2.1. Objetivo Geral

Determinar a participação do núcleo pré-óptico mediano (MnPO) na regulação

autonômica e cardiovascular em animais normotensos e hipertensos.

2.2. Objetivos Específicos

2.2.1. Avaliar a participação do MnPO no controle da pressão arterial média

(PAM), frequência cardíaca (FC) e atividade nervosa simpática renal (ANSR) em

ratos normotensos (WT) e espontaneamente hipertensos (SHR).

2.2.2. Avaliar a participação dos aferentes sinoaórticos nas respostas

cardiovasculares e autonômicas promovidas pelo bloqueio do MnPO em ratos

normotensos (WT) e espontaneamente hipertensos (SHR).

2.2.3. Avaliar a participação da neurotransmissão glutamatérgica do MnPO

sobre o controle cardiovascular e autonômico de ratos normotensos (WT) e

espontaneamente hipertensos (SHR).

24

3. Materiais e Métodos

25

3.1. Modelo Animal Utilizado

Todos os experimentos foram realizados em ratos normotensos da linhagem

Wistar (WT) e ratos espontaneamente hipertensos (SHR), pesando entre 250 e

350g. Os animais foram fornecidos pelo biotério central da Universidade Federal de

Goiás (UFG), mantidos com água e ração ad libitum. Todos os protocolos utilizados

neste projeto foram previamente submetidos à aprovação do comitê de ética da UFG

(processo número: 34/12).

3.2. Grupos Experimentais

Os ratos utilizados no presente estudo foram divididos randomicamente em

quatro grupos:

Grupo Muscimol (WT, n=6; SHR, n=6) – Submetidos ao bloqueio dos

receptores GABAA no MnPO.

Grupo Terceiro Ventrículo (WT – 3V, n=4; SHR – 3V, n=4) –

Utilizados como controle negativo, foram realizadas nanoinjeções de

Muscimol no terceiro ventrículo desses animais.

Grupo Desnervação Sinoaórtica (DSA; WT – DSA, n=6; SHR – DSA,

n=5) – Submetidos à cirurgia de desnervação sinoaórtica.

Grupo Ácido Quinurênico (WT, n=6; SHR, n=6) – Submetidos ao

bloqueio dos receptores Glutamatérgicos no MnPO.

3.3. Desnervação Sinoaórtica

Para a realização da DSA foi utilizada a técnica descrita por Krieger, 1964. Os

animais foram anestesiados com Ketamina (100 mg/Kg) e Xilazina (20 mg/Kg) pela

via intraperitoneal (i.p) e em seguida, foram colocados em decúbito ventral. Uma

incisão mediana na região cervical anterior foi realizada, de modo a expor os

músculos que cobrem a traqueia. Após separação dos músculos pré-traqueais, o

feixe vásculo nervoso (constituído pela artéria carótida, nervo vago e tronco

26

simpático) foi cuidadosamente separado em seus componentes. As fibras

pressoreceptoras aórticas que trafegam junto ao tronco simpático ou como fibras

isoladas foram seccionadas, bem como o nervo laríngeo superior e o nervo

depressor aórtico. Logo após, a região da bifurcação carotídea foi extensamente

exposta e dissecada dos nervos e tecido conectivo a sua volta, para retirada do

gânglio cervical superior e do corpúsculo carotídeo. Após a DSA, os animais foram

suturados, artéria e veia femoral foram canuladas e em seguida, as cânulas foram

exteriorizadas para o dorso do animal.

Após um dia de recuperação, foi realizado o teste de barorreflexo e

quimiorreflexo para confirmar a desnervação.

3.4. Teste de Sensibilidade Barorreflexa e Quimiorreflexa

Os animais foram submetidos aos testes de barorreflexo e quimiorreflexo

mediante infusões em bólus (0,1 ml) de fenilefrina (1 g, 1,5 g and 2 g; agonista

α1 adrenérgico; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) e cianeto de potássio (40 g;

Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA), respectivamente. Para comparar a sensibilidade

barorreflexa dos grupos, foi calculado o índice de barorreflexo (IB), dado como a

razão entre a variação da frequência cardíaca e a variação da pressão arterial média

(ΔFC·ΔPAM-1) mediante a infusão dos fármacos acima citados. Todas as injeções

foram realizadas com intervalos de 5 min entre cada injeção ou até que os

parâmetros cardiovasculares retornassem a valores semelhantes ao basal.

3.5. Procedimentos Cirúrgicos Gerais

Os animais de todos os grupos foram anestesiados com halotano (2% em O2

100%; Tanohalo; Cristália, SP, Brasil). A artéria e veia femorais foram canuladas

para o registro da PA, e infusão de drogas, respectivamente. Após a canulação, a

anestesia foi mantida pela administração de uretano (1,2 g/kg, i.v.; Sigma-Aldrich,

MO, EUA). Foi realizada a traqueostomia a fim de diminuir o esforço respiratório dos

animais. Os animais foram posicionados em um aparelho estereotáxico (David Kopf

Inst., CA, EUA) para realização da craniectomia e posterior nanoinjeção no MnPO.

Para registro da atividade nervosa simpática renal (ANSR), o nervo renal esquerdo

27

foi localizado e cuidadosamente posicionado sobre um par de eletrodos bipolar de

prata acoplado a um micromanipulador e conectado ao sistema de aquisição e

registro da ANSR. A temperatura dos animais foi mantida entre 36º e 37º com o

auxilio de uma mesa térmica.

3.6. Registro da Pressão Arterial e do Eletrocardiograma

A pressão arterial pulsátil (PAP) foi registrada continuamente acoplando-se a

cânula arterial a um transdutor de PA acoplado a um amplificador (ETH-200;

CBSciences, Dover, NH, EUA) conectado a um sistema de aquisição de dados

(PowerLabSystem; ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA). A pressão arterial

média (PAM) foi calculada a partir do sinal pulsátil utilizando o programa LabChart

(Chart 7 v7.3.7; ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA).

Os sinais analógicos do eletrocardiograma (ECG) obtidos através dos

eletrodos posicionados nos membros anteriores foram amplificados em 1.000 vezes

e filtrados entre 100 e 1.000 Hz (ECG100C; ADInstruments, Colorado Springs, CO,

EUA). A frequência cardíaca (FC) foi calculada como frequência instantânea do sinal

de ECG (Chart 7 v7.3.7; ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA).

3.7. Registro da Atividade Nervosa Simpática Renal

Para o registro da ANSR, o nervo renal foi localizado com o auxílio do

microscópio, cuidadosamente dissecado e posicionado sobre um par de eletrodos

bipolar de prata acoplado a um micromanipulador, conectado ao sistema de

aquisição e registro da ANSR. A ANSR foi amplificada em 20.000 vezes e filtrada

entre 30 e 1.000 Hz (Grass Tecnologies, P511 AC amplifier; Warwick, EUA).

Posteriormente, os sinais amplificados e filtrados foram digitalizados em uma

frequência de 2.000 amostras∙ s-1 utilizando-se um conversor analógico digital

(PowerLab System; ADInstruments, Colorado Springs, CO, EUA). Durante o

experimento, foi adicionado ao campo cirúrgico da ANSR óleo mineral (Nujol –

Schering-Plough, SP, Brasil) a ± 37,5° C, para evitar ressecamento e isolar a

captação de ruídos externos. Para quantificarmos o ruído do sinal obtido, ao final do

experimento, foi administrado o bloqueador ganglionar hexametônio (30 mg · kg-1

i.v.; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). O sinal de ANSR foi quantificado através da

28

integração do valor absoluto em intervalos de 1s (Chart 7 v7.3.7; ADInstruments,

Colorado Springs, CO, EUA).

3.8. Nanoinjeções no MnPO

Para a realização das nanoinjeções no MnPO, os animais foram posicionados

em decúbito ventral em um aparelho estereotáxico e foi realizada a craniectomia e

posterior posicionamento de uma nanopipeta de vidro acopladas a uma seringa,

formando um sistema de nanoinjeção sob pressão. As coordenadas estereotáxicas

utilizadas para a localização do sítio de nanoinjeção foram obtidas e modificadas a

partir do Atlas de Paxinos & Watson (1998).

Antero-Posterior = 0,6 mm rostral ao bregma

Latero-Medial = 0,0 mm lateral ao seio venoso sagital

Dorso-Ventral = 7,1 mm ventral ao seio venoso sagital

Após este procedimento, os animais receberam nanoinjeções de 100 nL de

soro fisiológico (NaCl; 150mM) no MnPO. Em seguida, foram realizadas as

nanoinjeções de Muscimol (agonista GABAérgico; Sigma-Aldrich, MO, EUA) 4 mM e

Ácido Quinurênico (antagonista glutamatérgico; Sigma-Aldrich, MO, EUA) 50 mM.

Nos animais utilizados como controle negativo (n=4) foram realizadas nanoinjeções

de soro e Muscimol 4mM diretamente no terceiro ventrículo de ratos WT e SHR a 0,0

mm rostral ao bregma e 7,1 mm de profundidade. Ao término do período

experimental foram injetados 100 nL de uma solução de azul de Evans (2%; Sigma-

Aldrich, MO, EUA) no mesmo sítio em que foram realizadas as nanoinjeções

anteriores para posterior confirmação histológica.

3.9. Histologia

Ao final dos experimentos os animais foram perfundidos com uma solução de

soro fisiológico (0,15M), seguido por formaldeído 10% (LabSynth, SP, Brasil). Para

tanto, o coração foi exposto e uma cânula, acoplada a uma bomba de perfusão, foi

introduzida no ventrículo esquerdo. Em seguida, o encéfalo foi removido e fixado na

mesma solução de formaldeído e, posteriormente, armazenado por um período de

29

48 horas em solução de sacarose 30%. Os cérebros foram então seccionados em

cortes coronais de 40 µm com auxílio de um micrótomo de congelamento (Leica;

Wetzlar, Alemanha). Para determinarmos os sítios de nanoinjeção no MnPO, os

cortes obtidos desta região hipotalâmica foram corados pela técnica do vermelho

neutro.

3.10. Análise Estatística

As análises estatísticas e confecção dos gráficos foram realizadas utilizando o

software GraphPad Prism (v 5.01). Todos os resultados foram expressos como

média ± EPM (erro padrão da média). Os valores basais de PAM, FC e ANSR dos

grupos foram analisados utilizando-se teste t não pareado. As alterações nas médias

de PAM, FC e ANSR dos ratos que receberam nanoinjeções de soro, muscimol ou

ácido quinurênico no MnPO,foram analisadas utilizando-se análise de variância de

uma via (ANOVA one way). As alterações nas médias de PAM, FC e ANSR após a

nanoinjeção no MnPO dos animais submetidos à DSA foram analisadas utilizando-

se análise de variância de duas vias (ANOVA two way). Foi utilizado o pós teste de

Newman Keuls. Assumiu-se nível de significância p < 0,05.

30

4. Resultados

31

4.1. Análise histológica

A figura 2A contém uma fotomicrografia de um caso típico onde se visualiza a

marcação com azul de Evans da região onde ocorreram as nanoinjeções de

muscimol 4mM, ácido quinurênico 50 mM ou de soro 150mM. Apenas os resultados

obtidos em experimentos em que a nanoinjeção de azul de Evans esteve confinada

ao MnPO foram considerados para análise (Figura 2 B).

Figura 2. Verificação histológica dos animais que receberam nanoinjeções de soro 150mM, muscimol

4mM e ácido quinurênico 50mM no MnPO (seta) Fotomicrografia de um corte coronal (40 μm) do

cérebro corado pela técnica de vermelho neutro (A). Imagens coronais sequenciais que mostram o

espalhamento das drogas nanoinjetadas no MnPO (B); área azul escuro (espalhamento máximo);

área azul claro (espalhamento mínimo). ca (Comissura Anterior).

32

4.2. Participação do Núcleo Pré-Óptico Mediano no controle tônico dos

parâmetros cardiovasculares e da atividade nervosa simpática renal em ratos

normotensos e hipertensos

A média de massa corpórea e os valores basais médios de PAM, FC e

ƒANSR dos ratos normotensos e hipertensos que receberam nanoinjeções no

MnPO, estão representados na tabela 1.

Tabela1. Valores basais médios ± EPM da pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e

integral da atividade nervosa simpática renal (ƒANSR) dos ratos wistar que receberam nanoinjeções

de muscimol 4mM no MnPO (WT) ou no terceiro ventrículo (WT – 3V), e de ratos espontaneamente

hipertensos (SHRs) que receberam nanoinjeções de muscimol 4mM no MnPO (SHR) ou no terceiro

ventrículo (SHR – 3V).

Os resultados representam as médias ± EPM. n, número de animais. * p < 0.05 comparado com o

grupo normotenso.

Como esperado, as nanoinjeções de soro fisiológico (NaCl, 150 mM) no

MnPO não promoveram alterações na PAM (WT: 0,4 ± 0,2 mmHg; SHR: 0,2 ± 0,4

mmHg), FC (WT: 0,7 ± 0,9 bpm; SHR: 1,1 ± 1,4 bpm) e ANSR (WT: 0,4 ± 0,2 %;

SHR: -0,2 ± 1,3 %; Figuras 3 e 4A).

A inibição do MnPO promovida pela nanoinjeção de Muscimol alterou os

parâmetros cardiovasculares e autonômicos nos grupos de animais normotensos

(n=6) e hipertensos (n=6). A Figura 3 apresenta um traçado representativo das

Grupo n Massa

(g)

PAM

(mmHg)

FC

(bpm)

ƒANSR

(u.a.)

WT 6 278,6 ± 9,8 108,4 ± 2,6 367,5 ± 15,1 0,0457 ± 0,0091

WT – 3V 4 274,1 ± 3,1 105,3 ± 4,5 324,2 ± 18,3 0,0402 ± 0,0078

SH 6 287,8 ± 18,7 124,0 ± 0,7* 378,2 ± 15,7 0,0790 ± 0,0185*

SH – 3V 4 290,0 ± 3,4 128,6 ± 1,5* 375,2 ± 21,1 0,0883 ± 0,0067*

33

alterações cardiovasculares e autonômicas promovidas por nanoinjeções no MnPO

de WT e SHR (Figura 3A e 3B, respectivamente).

Figura 3. Traçado representativo mostrando as alterações na pressão arterial pulsátil (PAP);

eletrocardiograma (ECG); atividade nervosa simpática renal (ANSR) e integral de ANSR (u.a.)

induzidas por nanoinjeções de soro fisiológico (150 mM) e muscimol (4mM) no MnPO e administração

intravenosa de hexametônio em WT (A) e SHR (B).

34

A inibição do MnPO promoveu queda na PAM dos ratos normotensos (-17,0 ±

1,2 mmHg). Todavia, essa resposta foi significativamente maior nos ratos

hipertensos (-31,6 ± 5,0 mmHg; Figuras 3 e 4A). Contrária à resposta de pressão, a

faixa de cronotropismo negativo em resposta à nanoinjeção de muscimol no MnPO

foi maior em WT (-55,4 ± 12,3 bpm; Figuras 3A e 4B) comparado ao SHR (-18,3 ±

7,2 bpm; Figuras 3B e 4B).

A inibição dos neurônios do MnPO induzida por muscimol resultou em

simpatoinibição renal em ambos os grupos WT e SHR. O bloqueio farmacológico

resultou em diminuição da ANSR, sendo essa resposta maior em SHR (-54,4 ± 6,2

%; Figuras 3B e 4C) quando comparado aos ratos WT (-37,5 ± 3,94 %; Figuras 3A e

4C), destacando assim, que o MnPO controla tonicamente a PA, FC e ANSR

durante condições basais em animais normotensos e hipertensos.

35

Figura 4. Média ± EPM das variações da pressão arterial média (Δ PAM; A), frequência cardíaca (∆

FC; B) integral de atividade nervosa simpática (Δ ANSR; C) induzidas pela nanoinjeções de soro

fisiológico (150 mM) e muscimol (4mM) no MnPO em WT e SHR. * diferente da nanoinjeção de soro

fisiológico; † difere do grupo; p < 0,05.

36

4.2.1. Nanoinjeções de muscimol no terceiro ventrículo de ratos


A figura 5 apresenta a média ± EPM das variações da PAM, FC e integral de

ANSR devido a nanoinjeções de soro 150mM e muscimol 4mM no terceiro ventrículo

de ratos normotensos (WT – 3V, n=4) e hipertensos (SHR – 3V, n=4).

As nanoinjeções desse agonista GABAA não promoveram alteração na PAM

(WT – 3V: 0,5 ± 1,6 mmHg; SHR – 3V: -1,8 ± 0,2 mmHg; Figura 5A), FC (WT – 3V:

1,4 ± 1,5 bpm; SHR – 3V: -0,4 ± 2,1 bpm; Figura 5B) e ANSR (WT – 3V: 0,5 ± 0,8 %;

SHR – 3V: -1,6 ± 1,0 %; Figura 5C), evidenciando que as respostas observadas no

MnPO não se devem a aproximação desse núcleo com o terceiro ventrículo, e

possível espalhamento do muscimol para este ventrículo.

37

Figura 5. Média ± EPM das variações da pressão arterial média (Δ PAM; A), frequência cardíaca (Δ

FC; B) e integral de atividade nervosa simpática (Δ ANSR; C) induzidas pelas nanoinjeções de soro

fisiológico (150 mM,) e de muscimol (4 mM) no terceiro ventrículo em WT e SHR.

38

4.3. Participação dos aferentes sinoaórticos nas respostas autonômicas

e cardiovasculares induzidas pelo bloqueio farmacológico do MnPO em ratos


4.3.1. Análise da desnervação sinoaórtica (DSA) sobre a sensibilidade

barorreflexa e quimiorreflexa em ratos normotensos

Após a cirurgia, os animais submetidos à DSA (n=6), apresentaram

aumento nos valores basais de PAM (126,4 ± 3,3 vs. 113,3 ± 2,9 mmHg) e FC

(390,0 ± 12,2 vs. 338,8 ± 10,6 bpm) comparados ao grupo controle (n=6).

A partir de infusões em doses crescentes de fenilefrina, o IB dos animais

com DSA se mostrou reduzido (-0,7370 ± 0,0390 bpm·mmHg-1, Figura 6) em

comparação com os animais controle (-2,10 ± 0,07 bpm·mmHg-1 ;Figura 6).

Figura 6: Média ± EPM do índice de barorreflexo (IB; bpm·mmHg-1) mediante infusões de fenilefrina

dos animais controles e submetidos à DSA. † diferente do controle. p < 0,05.

Os gráficos da figura 7 apresentam as médias ± EPM das variações na PAM

e FC registradas durante o teste de quimioreflexo nos ratos normotensos. Nos

animais controles (n=6), a infusão de cianeto de potássio promoveu aumento na

39

PAM (63,0 ± 5,1 mmHg) e bradicardia (-198,0 ± 21,2 bpm). Nos ratos DSA (n=6) as

variações da PAM (8,0 ± 2,7 mmHg) e FC (-13,0 ± 4,2 bpm) foram abolidas (Figuras

7A e 7B).

Figura 7: Média ± EPM da variação da pressão arterial média (PAM; A) e da frequência cardíaca

(FC; B) após o teste de quimiorreflexo nos animais controles e submetidos à DSA. † diferente do

controle. p < 0,05.

4.3.2. Nanoinjeções de muscimol no MnPO de ratos normotensos

submetidos à desnervação sinoaórtica (DSA)

Os resultados obtidos nos ratos normotensos inervados (n=6) demonstraram

que o bloqueio farmacológico por muscimol provocou sustentada resposta

hipotensora (-19,4 ± 1,9 e -13,5 ± 2,0 mmHg em relação ao basal, 3 e 30 minutos

após a nanoinjeção no MnPO, respectivamente; Figura 8A). A inibição no MnPO

promoveu bradicardia inicial (-40,3 ± 10,2 bpm em relação ao basal, 3 minutos após

a nanoinjeção; Figura 8B), seguido por uma tendência de retorno aos valores basais

(-21,9 ± 5,9 bpm em relação ao basal, 30 min após a nanoinjeção; Figura 8B).

Ademais, o bloqueio do MnPO promoveu simpatoinibição renal (-23,0 ± 1,5 % em

relação ao basal, 3 minutos após a nanoinjeção; Figura 8C), seguido por um retorno

próximo aos valores basais (-1,6 ± 3,2 % em relação ao basal, 30 minutos após a

nanoinjeção; Figura 8C).

Nos ratos normotensos submetidos à DSA (n=6), a nanoinjeção de muscimol

promoveu queda na PAM semelhante ao observado nos ratos inervados (-20,9 ± 4,0

40

e -22,5 ± 4,3 mmHg em relação ao basal, 3 e 30 minutos após a nanoinjeção no

MnPO, respectivamente; Figura 8A). As nanoinjeções de muscimol promoveram

sustentada resposta bradicardica (-21,1 ± 9,0 e -16,2 ± 7,8 bpm em relação ao basal,

3 e 30 minutos após a nanoinjeção no MnPO, respectivamente; Figura 8B) e queda

da ANSR (-21,0 ± 4,9 % em relação ao basal, 3 minutos após a nanoinjeção no

MnPO; Figura 8C), seguida de retorno aos valores basais (-1,2 ± 5,2 % em relação

ao basal, 30 min após a nanoinjeção no MnPO; Figura 8C).

Comparando os dois grupos de ratos normotensos, observa-se que as

respostas cardiovasculares e autonômicas após a inibição do MnPO não

apresentaram diferenças significativas entre os animais invervados e os animais

submetidos à DSA.

41

Figura 8: Média ± EPM das variações da pressão arterial média (Δ PAM; A), frequência cardíaca (∆

FC; B) integral de atividade nervosa simpática (Δ ANSR; C) induzidas pela nanoinjeção de muscimol

(4mM) no MnPO em WT (traço vertical em preto no tempo 0). * difere do tempo 0; p < 0,05.

42

4.3.3. Análise da desnervação sinoaórtica (DSA) sobre a sensibilidade

barorreflexa e quimiorreflexa em ratos hipertensos

Os animais submetidos à DSA hipertensos (SHR – DSA; n=6),

apresentaram aumento nos valores basais de PAM (153,6 ± 4,0 vs. 171,0 ± 6,7

mmHg), semelhante ao observado nos animais normotensos. Todavia, ao contrário

dos ratos WT, os valores basais de FC (389,2 ± 8,9 vs. 390,7 ± 14,9 bpm), não

apresentaram diferença em comparação ao grupo inervado (SHR; n=6).

O teste de barorreflexo em SHRs apresentou diferenças significativas entre

os animais controles (-1,52 ± 0,10 bpm·mmHg-1 , n=6) e os desnervados (-0,39 ±

0,05 bpm·mmHg-1, n=6; Figura 9).

Figura 9: Média ± EPM do índice de barorreflexo (IB; bpm·mmHg-1) mediante infusões de fenilefrina

dos animais SHRs controles e submetidos à DSA. † diferente do controle. p < 0,05.

As médias ± EPM das variações na PAM e FC registradas durante o teste

de quimioreflexo nos ratos hipertensos estão apresentadas na Figura 10.

Semelhante ao observado nos animais inervados normotensos, nos animais

inervados hipertensos (n=6), o teste promoveu aumento na PAM (76,0 ± 3,1 mmHg)

e bradicardia (-126,0 ± 14,7 bpm). Todavia, nos ratos DSA (n=6) as alterações na

PAM (9,0 ± 2,8 mmHg) e FC (-11,0 ± 2,2 bpm) foram abolidas (Figuras 10A e 10B).

43

Figura 10: Média ± EPM da variação da pressão arterial média (PAM; A) e da frequência cardíaca

(FC; B) após o teste de quimiorreflexo nos animais SHRs controles e submetidos à DSA. † diferente

do controle. p < 0,05.

4.3.4. Nanoinjeções de muscimol no MnPO de ratos espontaneamente

hipertensos submetidos à desnervação sinoaórtica (DSA)

Nos animais hipertensos inervados (n=6) a inibição por muscimol no MnPO

promoveu grande hipotensão (-28,0 ± 6,4 mmHg em relação ao basal, 3 minutos

após a nanoinjeção no MnPO), sendo esta, sustentada ao final do registro (-20,0 ±

5,5 mmHg em relação ao basal, 30 minutos após a nanoinjeção no MnPO; Figura

11A). O bloqueio do MnPO também promoveu uma redução inicial na FC (-15,6 ±

7,9 e -19,9 ± 10,6 bpm em relação ao basal, 3 e 6 minutos após a nanoinjeção no

MnPO, respectivamente), seguida por um retorno aos valores basais (-4,5 ± 6,8 bpm

em relação ao basal, 30 minutos após a nanoinjeção no MnPO; Figura 11B). Quanto

ao tônus simpático renal, a nanoinjeção de muscimol no MnPO promoveu queda na

ANSR (-35,6 ± 7,6 % em relação ao basal, 3 minutos após a nanoinjeção no MnPO),

seguida por retorno aos valores basais (-3,9 ± 2,8 % em relação ao basal, 30

minutos após a nanoinjeção no MnPO; Figura 11C).

Nos ratos hipertensos desnervados (SHR - DSA; n=5), o bloqueio

farmacológico do MnPO promoveu uma progressiva redução na PAM (-31,1 ± 6,7; -

38,7 ± 9,7 e -44,7 ± 7,1 mmHg em relação ao basal; 3, 15 e 30 minutos após a

nanoinjeção, respectivamente; Figura 11A). As alterações promovidas na FC (-1,3 ±

44

3,3; -21,5 ± 12,6 e -24,9 ± 12,2 bpm em relação ao basal; 3,15 e 30 minutos após a

nanoinjeção, respectivamente; Figura 11B) e ANSR (-16,4 ± 8,8; -37,3 ± 10,1 e -45,1

± 8,7 % em relação ao basal; 3, 15 e 30 minutos após a nanoinjeção,

respectivamente; Figura 11C) também seguiram esse padrão de resposta.

A partir desses resultados, é possível observar que a inibição por muscimol

promoveu alteração nos parâmetros cardiovasculares e autonômicos em todos os

grupos, normotensos e hipertensos, inervados e desnervados. Como observado

anteriormente, nos SHRs ocorre maior hipotensão e simpatoinibição renal. Todavia,

a recuperação dos parâmetros cardiovasculares e autonômico à valores próximos

aos basais, mostrou-se dependente dos aferentes sinoaórticos apenas nos animais

hipertensos (Figura 12).

45


FC; B) integral de atividade nervosa simpática (Δ ANSR; C) devido à nanoinjeções de muscimol

(4mM) no MnPO em SHR (traço vertical em preto no tempo 0). * difere do tempo 0; † difere do grupo;

p < 0,05.

46


FC; B) integral de atividade nervosa simpática (Δ ANSR; C) devido à nanoinjeções de muscimol

(4mM) no MnPO em WT e SHR (traço vertical em preto no tempo 0). * difere do tempo 0; † difere do

grupo; # difere do WT; p < 0,05.

47

4.4. Participação da neurotransmissão glutamatérgica no MnPO sobre o

controle cardiovascular e autonômico em ratos normotensos e hipertensos

Para avaliar o papel das aferências glutamatérgicas excitatórias para o MNPO

foram realizadas nanoinjeções do antagonista glutamatérgico ácido quinurênico

50mM neste núcleo em ratos WT e SHR.

O bloqueio glutamatérgico promoveu quedas semelhantes da PAM (WT: -18,2

± 4,1 mmHg; SHR: -21,0 ± 2,5 mmHg; Figura 13A), bradicardia (WT: -7,1 ± 1,9 bpm;

SHR: -9,0 ± 6,0 bpm; Figura 13B) e simpatoinibição renal (WT: -19,7 ± 2,4 %; SHR: -

24,7 ± 2,4 %; Figura 13C) entre os ratos normotensos e hipertensos.

48

Figura 13. Média ± EPM das variações da pressão arterial média (Δ PAM; A), frequência cardíaca (∆

FC; B) integral de atividade nervosa simpática (Δ ANSR; C) devido a nanoinjeções de soro fisiológico

(150 mM) e ácido quinurênico (50mM) no MnPO em WT e SHR. * diferente da nanoinjeção de soro

fisiológico; p < 0,05.

49

5. Discussão

50

Os resultados obtidos nesse estudo demonstraram que a inibição aguda do

MnPO reduz a PA, corroborando com dados recentes que indicam que esse núcleo

participa do controle tônico da pressão arterial. Nossos dados sugerem o

envolvimento do MnPO na regulação tônica da atividade simpática em WT e SHR.

Ademais, observamos a participação desse núcleo no aumento da atividade

simpática e consequente HA observada em SHR. Os resultados evidenciaram ainda,

que os aferentes aórticos e carotídeos participam na modulação das respostas

autonômicas e cardiovasculares induzidas pelo bloqueio do MnPO nos SHR. Além

disso, nossos dados sugerem que a neurotransmissão glutamatérgica do MnPO é

importante para o controle tônico da PAM, FC e ANSR .

Localizado no prosencéfalo, na lâmina terminal adjacente à comissura

anterior, o MnPO tem sido descrito na literatura como parte integrante do controle

hidromineral e cardiovascular (Amaral et al., 2014; Johnson et al., 1996; Llewellyn et

al, 2012; McKin; ley et al., 1996; Stocker e Toney, 2005; Yasuda et al., 2000; Pedrino

et al., 2009). De fato, evidências experimentais demonstraram que tal papel exercido

pelo MnPO se deve, principalmente ao fato de que seus neurônios se projetam para

regiões magnocelulares e parvocelulares do PVN (Sawchenko & Swanson,

1983; Zardetto-Smith et al., 1993; Tanaka et al., 1995; Stocker et al., 2005; Llewellyn

et al., 2012).

Em um desses estudos, Llewellyn e cols (2012) demonstraram que a ativação

do MnPO via nanoinjeções de N-Metil-Aspartato (NMDA) promoveram aumentos

naPAM, a FC e a ANSR em ratos anestesiados, respostas que foram atenuadas

após a nanoinjeção de Ácido 2-amino-5-fosfonovalerico (AP5), um antagonista

seletivo de receptores glutamatérgicos NMDA, no PVN. No mesmo estudo, os

autores evidenciaram, em registros neuronais, que a ativação do MnPO aumenta a

atividade dos neurônios do PVN. Ademais, nesse estudo, a desinibição do MnPO

com bicuculina (antagonista GABAA) também foi atenuada com nanoinjeção prévia

de AP5 no PVN. Estes resultados sugerem que, em condições normais, os

neurônios no MnPO podem ser inibidos por aferentes gabaérgicos. Por fim, o estudo

aponta que a ativação do MnPO estimula os neurônios pré-motores simpáticos do

PVN, por mecanismos glutamatérgicos.

Investigações de nosso laboratório corroboram com esses dados uma vez

que a inibição do MnPO promoveu hipotensão de ratos normotensos e hipertensos,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6886068



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Llewellyn%20T%22%5BAuthor%5D

51

sendo que a resposta hipotensora foi maior nos animais hipertensos (Silveira et al.,

2014). Consistentes com estes resultados, no presente estudo evidenciamos que a

inibição do MnPO promove hipotensão tanto em ratos normotensos como

hipertensos. Ademais, nossos resultados estendem os achados anteriores, uma vez

que também demonstramos que a inibição farmacológica do MnPO induz

simpatoinibição renal, indicando o envolvimento deste núcleo na regulação tônica da

atividade nervosa simpática.

Evidenciamos em nosso estudo, diferenças nas respostas entre WT e SHR.

Corroborando com o presente trabalho, diversos autores tem demonstrado que os

SHR possuem aumento na ANSR basal quando comparado aos ratos normotensos

Em relação à inervação simpática para os rins, estudos evidenciam que aumentos

na atividade simpática produzem: (i) vasoconstrição renal através da ativação de

receptores α-1 adrenérgicos levando a reduções no fluxo simpático renal e taxa de

filtração glomerular (TFG); (ii) aumentos na reabsorção tubular renal de água e sódio

em todo o néfron através da ativação de receptores α-1 adrenérgicos do epitélio

tubular e da bomba de sódio e potássio (Na-K-ATPase); e (iii) aumento da taxa de

secreção de renina mediado por receptores β-1-adrenérgicos das células

justaglomerulares (DiBona & kopp, 1997; Wyss & Carlson, 1999). Em conjunto,

estes resultados demonstram que o aumento da atividade nervosa renal, contribui

para ativação do sistema renina angiotensina, aumento da resistência vascular

periférica e aumento da volemia, resultando em aumento da PA.

De fato, estudos demonstram que em SHR a atividade simpática esta

aumentada mesmo antes da hipertensão se desenvolver (Simms et al., 2009).

Ademais, vários autores têm destacado que o aumento persistente do tônus

simpático é um dos principais contribuintes tanto para a iniciação quanto

manutenção do estado de hipertensão (Yamada et al 1988;. Grassi, 2004b; Smith et

al., 2004; Guyenet, 2006; Fisher & Paton, 2012). Outra evidência da literatura mostra

que o aumento da atividade simpática pode contribuir para a hipertrofia do músculo

liso vascular e músculo cardíaco, inflamação e hipoperfusão cerebral, levando a HA

de origem neurogênica nestes animais (Zubcevic et al. 2011).

Localizado no hipotálamo, o PVN é uma das principais áreas envolvidas no

controle autonômico e cardiovascular. Estudos anatômicos e eletrofisiológicos

demonstraram que neurônios do PVN projetam-se diretamente para a medula

52

espinhal ou para a região RVLM (Coote, 2007; Toney et al, 2003;. Toney & Stocker,

2010), modulando assim a atividade simpática e a PA (Hosoya et al 1991;. Loewy,

1991; Coote, 1995, 2005; Ranson et al. 1998; Motawei et al. 1999; Pyner & Coote,

1999, 2000; Badoer, 2001). Estudos evidenciaram que a atividade neuronal desta

área encontra-se aumentada em SHR (Allen, 2002). Consistente com estes

achados, a lesão eletrolítica ou a inibição farmacológica do PVN promoveram

reduções na ASNR e na PA (Takeda et al. 1991; Allen, 2002). Estes resultados

indicam o importante papel do PVN na manutenção da hiperatividade simpática e

consequente HA observadas nestes ratos.

Como mencionado anteriormente, estudos neuroanatômicos demonstram que

os neurônios parvocelulares do PVN projetam-se sobre neurônios pré-motores

simpáticos presentes na região RVLM. Esta região representa a principal área na

regulação do tônus simpático cardiovascular. Assim, o aumento da atividade das

eferências do PVN para o RVLM, poderia resultar no aumento do tônus simpático,

levando ao aumento do débito cardíaco, da resistência vascular periférica e

consequente, elevação da PA (Miselis et al., 1979; Pyner & Coote., 1999; Stoker &

Tonney, 2005; Toney & Stocker, 2010; Ross et al., 1981; Tucker et al., 1987).

A PA é constantemente regulada por variáveis hemodinâmicas como o débito

cardíaco e a resistência vascular periférica total. O SNC exerce o controle desses

parâmetros momento a momento via reflexos neuronais, onde podemos destacar o

barorreflexo. Localizados no arco aórtico e no seio carotídeo, os barorreceptores

arteriais são estimulados por variações bruscas da PA que, em consequência,

causarão deformações na parede destes vasos, sendo por isso, usualmente

considerados pressorreceptores. O mecanismo pelo qual os barorreceptores atuam

na manutenção da PA ocorre através do controle reflexo da atividade do sistema

nervoso autônomo. Os sinais aferentes provenientes da estimulação dos

barorreceptores são dirigidos ao SNC, onde fazem sua primeira sinapse no NTS. Os

neurônios do NTS por sua vez, conectam-se com os neurônios do complexo vagal e

das regiões caudoventrolateral do bulbo (CVLM) e RVLM, sendo este complexo

neuroanatômico chamado de centro vasomotor (Vasquez et al., 1997). Além de

receber informações do braço aferente do barorreflexo, o NTS também recebe

entrada direta via nervo vago dos quimiorreceptores periféricos. A ativação dos

quimiorreceptores periféricos, localizados nos corpúsculos carotídeos e arco aórtico

53

por hipóxia e hipercapnia provoca aumento generalizado da atividade das eferências

simpáticas quimiossensíveis. Anormalidades das entradas aferentes de baro ou

quimiorreceptores, ou de seu processamento no NTS, podem contribuir para várias

formas de hipertensão neurogênica (Guyenet, 2006).

Uma vez verificado que as nanoinjeções no MnPO promoveram hipotensão,

bradicardia e simpatoinibição renal em ratos normotensos e hipertensos e sabendo-

se que os aferentes sinoaórticos são responsáveis por parte da modulação de

respostas cardiovasculares e autonômicas, buscamos então verificar a participação

desses aferentes nas respostas observadas após o bloqueio por muscimol.

Observamos em nossos resultados que um dia após a cirurgia de DSA os ratos

normotensos e hipertensos apresentaram PAM elevada durante o registro acordado,

comparada aos seus pares do grupo controle. Esses dados corroboram com a

literatura, uma vez que foi observado que após a cirurgia os animais apresentaram

variabilidade na PA e hipertensão e taquicardia transitória (Osborn & England, 1990;

Barres et al., 1992; Cowley et al., 1973). Outros estudos demonstraram que cinco

dias após a DSA os níveis de PA e FC retornaram ao normal, todavia a variabilidade

na pressão arterial é permanente (Barres et al., 1992; Schreihofer and Sved, 1992).

Estudos demonstram que os animais de diversos modelos de HA apresentam

redução na função barorreflexa (Judy & Farrell, 1979; Moreira et al., 2014; Oliveira-

Sales et al., 2014; Schenk & McNeill, 1992). Em SHRs, além da função barorreflexa

comprometida, apresentam também sensibilidade quimiorreflexa aumentada em

relação aos ratos normotensos (Fukuda et al., 1987; Kato et al., 2012; Tan et al.,

2010), o que poderia contribuir para o desenvolvimento e manutenção da HA nesse

modelo (Abdala et al., 2012; Przybylski, 1981) provavelmente desencadeada por

hiperativação simpática devido ao aumento da atividade quimioceptora.

As respostas evocadas pela inibição do MnPO foram semelhantes no grupo

WT (inervados e desnervados) indicando que as respostas agudas e tardias (retorno

aos valores basais) são independentes dos aferentes sinoaórticos. Todavia,

observamos que no grupo SHR, houve diferença entre os ratos inervados e os

desnervados. A integridade dos barorreceptores e quimiorreceptores mostrou-se um

fator crucial para recuperação dos valores basais após o bloqueio do MnPO em

SHR.

54

Sabendo-se que os aferentes sinoaórticos fazem sua primeira comunicação

com o SNC via NTS e que o MnPO é parte integrante da região AV3V, ao

desnervarmos esses aferentes periféricos e inibirmos o MnPO, realizamos então um

duplo bloqueio. Nesse contexto, nossos resultados estão consistentes aos

observados por Moreira e cols (2009). Esses autores demonstraram que a lesão no

NTS comissural (commNTS) combinada à lesão da AV3V reduziu a PAM dos SHRs

não anestesiados por até quarenta dias após a lesão, sendo que nos primeiros cinco

dias os valores de pressão foram reduzidos a níveis semelhantes aos de animais

normotensos. Nos animais normotensos, a lesão do commNTS combinada à lesão

AV3V produziu apenas redução transitória na PAM. Em conjuntos estes trabalhos

demonstram que a integridade dos aferentes sinoaórticos, do NTS e do MnPO é

fundamental para simpato-excitação e consequente hipertensão arterial observada

em SHR.

Dentre os neurotransmissores que medeiam à comunicação neuronal, tem-se

o glutamato como principal neurotransmissor excitatório do SNC. Estudos

eletrofisiológicos demonstraram que conexões entre o SFO e o MnPO (Kolaj &

Renauld, 2010), e via MnPO e PVN (Llewellyn et al., 2012) são mediadas, ao

menos em parte, por neurotransmissão glutamatérgica. Nesse sentido, nossos

resultados corroboram e ampliam esses dados, pois o bloqueio da neurotrasmissão

glutamatérgica no MnPO com ácido quinurênico promoveu quedas na PAM, e

ANSR de ratos normotensos e hipertensos indicando a importância dos aferentes

glutamatérgicos para o MnPO no controle tônico da PA. Em conjunto os resultados

apresentados trazem novas evidências que apontam para a participação do MnPO

no controle autonômico e cardiovascular.

55

6. Considerações Finais

56

Em conjunto, os resultados obtidos no presente trabalho demontraram que a

inibição aguda do MnPO promoveu alterações na PAM, FC e ANSR em animais

normotensos e hipertensos, indicando a participação dos neurônios do MnPO no

controle tônico da PA e ANSR. Uma vez que essas respostas foram maiores em

animais hipertensos, esses resultados apontam para a importância do MnPO na

manutenção da HA em SHR.

Ademais, demonstramos que a inibição do MnPO nos ratos Wistar

submetidos à DSA promoveu alterações nos parâmetros avaliados sendo que essas

respostas foram semelhantes às observadas nos ratos inervados. Entretanto, a

recuperação dos parâmetros cardiovasculares e autonômicos avaliados após a

inibição do MnPO mostrou-se dependente dos aferentes sinoaórticos em SHR. Por

fim, nossos dados apontam para a importância da neurotransmissão glutamatérgica

no MnPO na regulação cardiovascular e autonômica.

57

7. Referências Bibliográficas

58

Abdala AP, McBryde FD, Marina N, Hendy EB, Engelman ZJ. Hypertension is

critically dependent on the carotid body input in the spontaneously hypertensive rat. J

Physiol 590: 4269–4277, 2012.

Allen AM. Inhibition of the hypothalamic paraventricular nucleus in

spontaneously hypertensive rats dramatically reduces sympathetic vasomotor tone.

Hypertension 39: 275–280, 2002.

Amaral NO, Naves LM, Ferreira-Neto ML, et al. Median Preoptic Nucleus

Mediates the Cardiovascular Recovery Induced by Hypertonic Saline in Hemorrhagic

Shock. The Scientific World Journal 2014:496121, 2014.

Angheben JMM, Schoorlemmer GHM, Rossi MV, Silva TA, Cravo SL

Cardiovascular Responses Induced by Obstructive Apnea Are Enhanced in

Hypertensive Rats Due to Enhanced Chemoreceptor Responsivity. PLoS ONE 9(1):

2014.

Badoer E. Hypothalamic paraventricular nucleus and cardiovascular

regulation. Clin Exp Pharmacol Physiol 28: 95–99, 2001.

Barres C, Lewis SJ, Brody MJ. Arterial pressure lability and renal sympathetic

nerve activity are dissociated in SAD rats. Am J Physiol. 263: R639–R646, 1992.

Bealer S.L. Systemic angiotensin II alters intrinsic heart rate through central

mechanisms, Brain Res. Bull. 58: 61–65, 2002.

Blanch GT, Freiria-Oliveira AH, Speretta GF, Carrera EJ, Li H, Speth RC,

Colombari E, Sumners C, Colombari DS. Increased Expression of Angiotensin II

Type 2 Receptors in the Solitary-Vagal Complex Blunts Renovascular Hypertension.

Hypertension.114.03188, 2014.

Brody MJ, Fink GD, Buggy J, Haywood JR, Gordon FJ, Johnson AK. Role of

anteroventral 3Rd ventricle (Av3V) region in experimental-hypertension, Circ. Res.

43: I2–I13, 1968.

59

Brody MJ, Johnson AK. Role AV3V in fluid and electrolyte balance, arterial

pressure regulation and hypertension, in: L. Martini, W. Ganone (Eds.), Frontiers in

Neuroendocrinology, Raven Press, New York, pp. 249–292, 1980.

Cabassi A, Vinci S, Cantoni AM, Quartieri F, Moschini L, Cavazzini S,

Cavatorta A, Borghetti A. Sympathetic activation in adipose tissue and skeletal

muscle of hypertensive rats. Hypertension 39: 656–61, 2002.

Chiba T, Murata Y. Afferent and efferent connections of the medial preoptic

area in the rat: a WGA-HRP study, Brain Res. Bull. 14: 261–272, 1985.

Colombari DS, Cravo SL. Effects of acute AV3V lesions on renal and hindlimb

vasodilation induced by volume expansion, Hypertension 34: 762 767, 1999.

Coote, JH. A role for the paraventricular nucleus of the hypothalamus in the

autonomic control of heart and kidney. Exp. Physiol 90: 169–73, 2005.

Coote, JH. Cardiovascular function of the paraventricular nucleus of the

hypothalamus. Biol. Signals 4: 142–9, 1995.

Coote, JH. Landmarks in understanding the central nervous control of the

cardiovascular system. Exp. Physiol 92: 3–18, 2007.

Cowley, AW Jr, Liard JF, Guyton AC. Role of the baroreceptor reflex in daily

control of arterial blood pressure and other variables in dogs. Circ. Res. 32: 564–576,

1973.

Dampney RA, Horiuchi J, Killinger S, Sheriff MJ, Tan PS, McDowall LM. Long-

term regulation of arterial blood pressure by hypothalamic nuclei: some critical

questions. Clin Exp Pharmacol Physiol 32: 419–425, 2005.

De Luca LA, Galaverna O, Schulkin J, Yao SZ, Epstein AN. The anteroventral

wall of the third ventricle and the angiotensinergic component of need-induced

sodium intake in the rat. Brain Res Bull 28: 73–87, 1992.

DiBona GF, Kopp UC. Neural control of renal function. Physiol Rev 77:75–

197, 1997.

60

Fernandez-Galaz C, Dyer RG, Herbison AE. Analysis of brainstem A1 and A2

noradrenergic inputs to the preoptic area using microdialysis in the rat. Brain Res.

636: 227–32, 1994.

Fisher JP, Paton JF. The sympathetic nervous system and blood pressure in

humans: implications for hypertension. J Hum Hypertens 26: 463–475, 2012.

Fitts DA, Tjepkes DS, Bright RO. Salt appetite and lesions of the ventral part

of the ventral median preoptic nucleus. Behav Neurosci 104: 818–827, 1990.

Franchini KM, Krieger EM. Carotid chemoreceptors influence arterial pressure

in intact and aortic-denervated rats. Am J Physiol 262: R677-83, 1992.

Fukuda Y, Sato A, Trzebski A. Carotid chemoreceptor discharge responses to

hypoxia and hypercapnia in normotensive and spontaneously hypertensive rats. J

Auton Nerv Syst 19: 1–11, 1987.

Gardiner TW, Jolley JR, Vagnucci AH, Stricker EM. Enhanced sodium appetite

in rats with lesions centered on nucleus medianus. Behav Neurosci 100: 531–535,

1986.

Grassi G. Counteracting the sympathetic nervous system in essential

hypertension. Curr Opin Nephrol Hypertens 13: 513–519, 2004.

Grisk O, Rettig R. Interactions between the sympathetic nervous system and

the kidneys in arterial hypertension. Cardiovasc. Res. 61: 238–46, 2004.

Guyenet PG. The sympathetic control of blood pressure. Nat Rev Neurosci 7:

335–346, 2006.

Hosoya Y, Sugiura Y, Okado N, Loewy AD & Kohno K. Descending input from

the hypothalamic paraventricular nucleus to sympathetic preganglionic neurons in the

rat. Exp Brain Res 85: 10–20, 1991.

Ito S, Komatsu K, Tsukamoto K, Sved AF. Excitatory amino acids in the rostral

ventrolateral medulla support blood pressure in spontaneously hypertensive rats.

Hypertension. 35:413– 417, 2000.

61

Ito S, Sved AF: Tonic glutamate-mediated control of rostral ventrolateral

medulla and sympathetic vasomotor tone. Am J Physiol 273:R487–R494, 1997.

Johnson AK, Cunningham JT, Thunhorst RL. Integrative role of the lamina

terminalis in the regulation of cardiovascular and body fluid homeostasis, Clin. Exp.

Pharmacol. Physiol. 23: 183–191, 1996.

Johnson AK, Edwards GL, Central projections of osmotic and hypovolaemic

signals in homeostatic thirst, in: D.J. Ramsay, D.A. Booth (Eds.), Thirst: Physiological

and Psychological – Aspects, Springer-Verlag, Berlin, pp. 149–175, 1991.

Johnson AK, Loewy AD. Circumventricular organs and their role in visceral

functions. In: Loewy, AD.; Spyer, KM., editors. In Central regulation of autonomic

functions. Oxford University Press; New York Oxford: p. 247-267, 1990.

Judy WV, Farrel SK. Arterial Baroreceptor Reflex Control of Sympathetic

Nerve Activity in the Spontaneously Hypertensive Rat. Hypertension 1:605-614,1979.

Kato K, Wakai J, Matsuda H, Kusakabe T, Yamamoto Y. Increased total

volume and dopamine b-hydroxylase immunoreactivity of carotid body in

spontaneously hypertensive rats. Auton Neurosci 169: 49–55, 2012.

Kolaj M, Bai D, Renaud LP. GABAB receptor modulation of rapid inhibitory

and excitatory neurotransmission from subfornical organ and other afferents to

median preoptic nucleus neurons. J Neurophysiol 92: 111–122, 2004.

Kolaj M, Renaud LP. Metabotropic glutamate receptors in median preoptic

neurons modulate neuronal excitability and glutamatergic and GABAergic inputs from

the subfornical organ. J Neurophysiol 103: 1104–1113, 2010.

Linz D, Hohl M, Schutze J, Mahfoud F, Speer T, Linz B, Hubschle T,

Juretschke HP, Dechend R, Geisel J, Rutten H, Bohm M. Progression of Kidney

Injury and Cardiac Remodeling in Obese Spontaneously Hypertensive Rats: The

Role of Renal Sympathetic Innervation. Am J Hypertens: hpu123, 2014.

Llewellyn T., Zheng H., Liu X., Xu B., Patel K.P. Median preoptic nucleus and

subfornical organ drive renal sympathetic nerve activity via a glutamatergic

62

mechanism within the paraventricular nucleus, Am. J. Physiol Regul. Integr. Comp.

Physiol. 302: R424–R432, 2012.

Mangiapane ML, Thrasher TN, Keil LC, Simpson JB, Ganong WF. Deficits in

drinking and vasopressin secretion after lesions of the nucleus medianus.

Neuroendocrinology 37: 73–77, 1983.

McKinley MJ, Mathai ML, McAllen RM, McClear RC, Miselis RR, Pennington

GL, Vivas L, Wade JD, Oldfield BJ. Vasopressin secretion: osmotic and hormonal

regulation by the lamina terminalis. J Neuroendocrinol 16: 340–347, 2004.

McKinley MJ, Pennington GL, Oldfield BJ. Anteroventral wall of the third

ventricle and dorsal lamina terminalis: headquarters for control of body fluid

homeostasis? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23: 271–281, 1996.

Miselis RR, Shapiro RE, Hand PJ. Subfornical organ efferents to neural

systems for control of body water. Science 205: 1022–1025, 1979.

Moreira MC, Silva EF, Silveira LL, de Paiva YB, de Castro CH, Freiria-Oliveira

AH, Rosa DA, Ferreira PM, Xavier CH, Colombari E, Pedrino GR. High sodium intake

during postnatal phases induces an increase in arterial blood pressure in adult rats.

Br J Nutr 112: 1923-32, 2014.

Moreira TS, Takakura AC, Colombari E, Menani JV. Antihypertensive effects

of central ablations in spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol (6):R1797-806,

2009.

Oliveira-Sales EB, Toward MA, Campos RR, Paton JF. Revealing the role of

the autonomic nervous system in the development and maintenance of Goldblatt

hypertension in rats. Auton Neurosci 183: 23-29, 2014.

Oparil S, Chen YF, Berecek KH, et al.: The role of the central nervous system

in hypertension. In Hypertension: Pathophysiology, Diagnosis and Management, edn

2. Edited by Laragh JH, Brenner BM. New York: Raven Press;713–740, 1995.

63

Osborn JW & England SK. Normalization of arterial pressure after

barodenervation: role of pressure natriuresis. Am J Physiol 259: R1172–R1180,

1990.

Paxinos G, Watson C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Orlando:

Academic, 1998.

Pedrino GR, Monaco LR, Cravo SL. Renal vasodilation induced by

hypernatremia: role of alpha-adrenoceptors in the median preoptic nucleus, Clin.

Exp. Pharmacol. Physiol. 36: e83–e89, 2009.

Pedrino GR, Nakagawa Sera CT, Cravo SL, Colombari DS. Anteroventral third

ventricle lesions impair cardiovascular responses to intravenous hypertonic saline

infusion, Auton. Neurosci. 117: 9–16, 2005.

Przybylski J. Do arterial chemoreceptors play a role in the pathogenesis of

hypertension? Med Hypotheses 7: 127–131, 1981.

Pyner S, Coote JH. Identification of an efferent projection from the

paraventricular nucleus of the hypothalamus terminating close to spinally projecting

rostral ventrolateral medullary neurons. Neuroscience 88: 949– 957, 1999.

Ross C.A., Armstrong D.M., Ruggiero D.A., Pickel V.M., Joh T.H., Reis D.J.

Adrenaline neurons in the rostral ventrolateral medulla innervate thoracic spinal cord:

a combined immunocytochemical and retrograde transport demonstration, Neurosci.

Lett. 25: 257–262, 1981.

Saper CB, Reis DJ & Joh T. Medullary catecholamine inputs to the

anteroventral third ventricular cardiovascular regulatory region in the rat. Neurosci

Lett. n.42, p.285-291, 1983.

Sawchenko PE & Swanson LW. Central noradrenergic pathways for the

integration of hypothalamic neuroendocrine and autonomic responses. Science 214,

685-687, 1981.

Schenk J & McNeill JH. The pathogenesis of DOCA-salt hypertension. JPM

27:161-170, 1992.

64

Schreihofer AM & Sved AF. Nucleus tractus solitarius and control of blood

pressure in chronic sinoaortic denervated rats. Am J Physiol 236: R258–R266, 1992.

Schreihofer AM, Stornetta RL, Guyenet PG. Regulation of sympathetic tone

and arterial pressure by rostral ventrolateral medulla after depletion of C1 cells in rat.

J Physiol 529: 221–236, 2000.

Silveira LL, Silva EF, Andrade AM, Xavier CH, Freiria-Oliveira AH, Colugnati

DB, Castro CH, Colombari E, Pedrino GR. Involvement of the median preoptic

nucleus in blood pressure control. Neuroscience Letters 558; 91–96, 2014.

Simms AE, Paton JF, Pickering AE, Allen AM. Amplified

respiratorysympathetic coupling in the spontaneously hypertensive rat: does it

contribute to hypertension? J Physiol 587: 597–610, 2009.

Smith PA, Graham LN, Mackintosh AF, Stoker JB & Mary DA. Relationship

between central sympathetic activity and stages of human hypertension. Am J

Hypertens 17: 217–222, 2004.

Stocker SD, Simmons JR, Stornetta RL, Toney GM, & Guyenet PG. Water

deprivation activates a glutamatergic projection from the hypothalamic

paraventricular nucleus to the rostral ventrolateral medulla. J.Comp Neurol. 494,

6673-685, 2006.

Stocker SD, Toney GM. Median preoptic neurones projecting to the

hypothalamic paraventricular nucleus respond to osmotic, circulating Ang II and

baroreceptor input in the rat. J Physiol 568: 599–615, 2005.

Sved AF, Ito S, Yajima Y. Role of excitatory amino acid inputs to the rostral

ventrolateral medulla in cardiovascular regulation. Clin Exp Pharmacol Physiol 29:

503–506, 2002.

Takeda K, Nakata T, Takesako T, Itoh H, Hirata M, Kawasaki S, Hayashi J,

Oguro M, Sasaki S & Nakagawa M. Sympathetic inhibition and attenuation of

spontaneous hypertension by PVN lesions in rats. Brain Res 543: 296–300, 1991.

65

Tan ZY, Lu Y, Whiteis CA, Simms AE, Paton JF, et al. Chemoreceptor

hypersensitivity, sympathetic excitation, and overexpression of ASIC and TASK

channels before the onset of hypertension in SHR. Circ Res 106: 536–545, 2010.

Tanaka, Y. Yamamuro, H. Saito, Matsuda M., Nomura M. Differences in

electrophysiological properties of angiotensinergic pathways from the subfornical

organ to the median preoptic nucleus between normotensive Wistar-Kyoto and

spontaneously hypertensive rats, Exp. Neurol. 134: 192–198. 1995.

Toney GM, Chen QH, Cato MJ, Stocker SD. Central osmotic regulation of

sympathetic nerve activity. Acta Physiol. Scand. 177(1):43–55, 2003.

Toney GM, Pedrino GR, Fink GD, Osborn JW. Does enhanced respiratory-

sympathetic coupling contribute to peripheral neural mechanisms of angiotensin II-

salt hypertension? Exp Physiol 95: 587-594, 2010.

Toney GM, Stocker SD. Hyperosmotic activation of CNS sympathetic

drive:implications for cardiovascular disease. J. Physiol. 588:3375–3384, 2010.

Travis KA, Johnson AK. In vitro sensitivity of median preoptic neurons to

angiotensin II, osmotic pressure, and temperature. Am J Physiol Regul Integr Comp

Physiol 264: R1200–R1205, 1993.

Tsyrlin VA, Galagudza MM, Kuzmenko NV, Pliss MG, Rubanova NS,

Shcherbin YI. Arterial baroreceptor reflex counteracts long-term blood pressure

increase in the rat model of renovascular hypertension. PLoS One 8: e64788, 2013.

Tucker DC, Saper CB, Ruggiero DA & Reis DJ. Organization of central

adrenergic pathways. I. Relationships of ventrolateral medullary projections to the

hypothalamus and spinal cord. J. Comp. Neurol. n.259, p.591–603, 1987.

Vasquez EC, Meyrelles SS, Mauad H, Cabral AM. Neural reflex regulation of

arterial pressure in pathophysiological conditions: interplay among the baroreflex, the

cardiopulmonary reflexes and the chemoreflex. Braz J Med Biol Res 30: 521-532,

1997.

66

Vieira AA, Colombari E, De Luca LA JR, De Almeida, Colombari DS, Menani

JV. Cardiovascular responses to microinjection of L-glutamate into the NTS in AV3V-

lesioned rats. Brain Res 1025:106-12, 2004.

Voisin AN, Drolet G, Mouginot D. Intrinsic properties of the sodium sensor

neurons in the rat median preoptic nucleus. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol

303: R834–R842, 2012.

Wang WZ, Wang LG, Gao L, Wang W. Contribution of AMPA/kainite receptors

in the rostral ventrolateral medulla to the hypotensive and sympathoinhibitory effects

of clonidine. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 293: R1232–R1238, 2007.

Wang WZ, Wang LG, Gao L, Wang W. Contribution of AMPA/kainite receptors

in the rostral ventrolateral medulla to the hypotensive and sympathoinhibitory effects

of clonidine. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 293: R1232–R1238, 2007.

Wyss JM, Carlson SH. The role of the central nervous system in hypertension.

Curr Hypertens Rep 1:246–53, 1999.

Yamada Y, Miyajima E, Tochikubo O, Matsukawa T, Shionoiri H, Ishii M &

Kaneko Y. Impaired baroreflex changes in muscle sympathetic nerve activity in

adolescents who have a family history of essential hypertension. J Hypertens Suppl

6: S525–S528, 1988.

Yasuda Y, Honda K, Negoro H, Higuchi T, Goto Y, Fukuda. The contribution of

the median preoptic nucleus to renal sympathetic nerve activity increased by

intracerebroventricular injection of hypertonic saline in the rat, Brain Res. 867: 107–

114, 2000.

Zhou W, Fu LW, Tjen-A-Looi SC, Guo ZL, Longhurst JC. Role of glutamate in

a visceral sympathoexcitatory reflex in rostral ventrolateral medulla of cats. Am J

Physiol Heart Circ Physiol 291: H1309–H1318, 2006.

Zubcevic J,Waki H, Raizada MK & Paton JFR. Autonomic-immune-vascular

interaction: an emerging concept for neurogenic hypertension. Hypertension 57:

1026–1033, 2011.

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