Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka
description
Transcript of Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka
![Page 1: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/1.jpg)
Produkt protoonkogenu c-mos Produkt protoonkogenu c-mos częściowo degradowany po częściowo degradowany po uwolnieniu z bloku metafazy uwolnieniu z bloku metafazy
drugiego podziału mejotycznego i drugiego podziału mejotycznego i utrzymywany podczas interfazy w utrzymywany podczas interfazy w
zygocie myszyzygocie myszy
Embriologia eksperymentalna ssaków
Opracowała: Małgorzata Wierzbicka
![Page 2: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/2.jpg)
WstępWstęp
![Page 3: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/3.jpg)
Badania na płazachBadania na płazach
W niezapłodnionych komórkach jajowych kregowców, cykl komórkowy jest zatrzymany w metafazie drugiego podziału mejotycznego (metafaza II) przez czynnik cytostatyczny CSF
W metafazie II, kiedy CSF jest aktywny, aktywność MPF jest wysoka i pozostaje nienaruszona
Oocyt zostaje uwolniony z bloku metafazowego po zapłodnieniu lub aktywacji
Produkt protoonkogenu c-mos jest zaangażowany w aktywność CSF Bialko Mos jest obecne w dużych ilościach w oocycie w metafazie II
i nie zostało wykryte w zapłodnionych komórkach Białko Mos może być degradowane po zapłodnieniu lub aktywacji
przez proteazę kalpainową zależną od wapnia
![Page 4: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/4.jpg)
Badania na myszachBadania na myszach Działanie CSF nie zostało dowiedzione Wykazano, że blok metafazowy zależy od syntezy
pewnych białek Zarówno c-mos mRNA jak i jego produkt (białko p39mos)
są obecne w oocycie od wczesnych stadiów pęcherzyka zarodkowego do stadium metafazy II, kiedy to następuje zatrzymanie cyklu komórkowego
Wstrzyknięcie do oocytu w stadium pęcherzyka zarodkowego c-mos-specyficznych antysensownych oligonukleotydów zapobiega wyrzuceniu I ciałka kierunkowego i przejściu do metafazy drugiego podziału mejotycznego
![Page 5: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/5.jpg)
Materiały i metodyMateriały i metody
5-6 tygodniowym samicom myszy podano 5 IU oraz (48h później) hCG
Owulowane oocyty uzyskano 14 i 16 h po podaniu hCG przez nakłuwanie ampuli jajowodów w roztworze hialuronidazy
Oocyty zaktywowano 18 h po podaniu hCG przez 6,5 min.ekspozycję w 8% alkoholu
Komórki hodowano w pożywce M2 pod parafiną w 37 0C Zapłodnione komórki jajowe uzyskano przez połączenie samic z
samcami i wyizolowanie z jajowodów 25-27h po podaniu hCG
Do obserwacji wczesnych etapów (wyrzucenie ciałka kierunkowego, formowanie przedjądrza) wybrano, ze względu na lepszą synchronizację, jaja aktywowane w alkoholu
![Page 6: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/6.jpg)
Materiały i metody c.dMateriały i metody c.d
Badano aktywność kinazy histonu H1(cdc2) (badanie aktywnosci MPF) w HK buforze przy użyciu egzogennych histonów H1. Odpowiednio przygotowane próbki poddano eloktroforezie na 15% żelu poliakrylamidowym
Zaktywowane oocyty po wyrzuceniu ciałek kierunkowych poddano immunoprecypitacji używając przeciwciał skierowanych przeciwko cyklinie B. Próbki badano na 10% żelu poliakrylamidowym
W celu stwierdzenia obecności produktu genu c- mos zastosowano immunoblotting
![Page 7: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/7.jpg)
WynikiWyniki
![Page 8: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/8.jpg)
Aktywność kinazy histonu H1(cdc2) Aktywność kinazy histonu H1(cdc2)
1-oocyty w bloku metafazy II2-oocyty zaraz po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego3-oocyty 5-7 h po aktywacji (G1)4-oocyty 13-15 h po zapłodnieniu (S)
![Page 9: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/9.jpg)
WniosekWniosek
aktywność MPF
(wyrażona aktywnością kinazy cdc2)
spada gwałtownie po wyrzuceniu
II ciałka kierunkowego
![Page 10: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/10.jpg)
Degradacja cykliny B w momencie wyrzuceniaDegradacja cykliny B w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego II ciałka kierunkowego
1-oocyty kontrolne
2-komórki tuż po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego
![Page 11: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/11.jpg)
WniosekWniosek
Ponad 65% cykliny B jest degradowane w momencie wyrzucenia
II ciałka kierunkowego
![Page 12: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/12.jpg)
Eksperyment (immunoblot ) pokazujący obecnośćEksperyment (immunoblot ) pokazujący obecność białka Mos w oocytach białka Mos w oocytach
Rysunek lewy 1- 1500 oocytów w metafazie II: 2- 1500 oocytów we wczesnej interfazie (zaraz po wyrzuceniu
II ciałka kierunkowego): 3- 1500 oocytów w póżnej fazie G1: 4- 1500 oocytów w fazie S Rysunek prawy 125, 250, 500 ,750 oocytów w metafazie II
![Page 13: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/13.jpg)
Spostrzeżenia Spostrzeżenia
Ilość Mos po wyrzuceniu II ciałka kierunkowego jest podobna do ilości obserwowanej w metafazie II (87%)
Ilość Mos w fazie G1 i w późnej fazie S znacznie się zmniejszyła (pozostało jedynie 23% białka obecnego w metafazie II)
![Page 14: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/14.jpg)
WniosekWniosek
Białko Mos nie jest w znaczący sposób degradowane w momencie wyrzucenia II ciałka kierunkowego =>
jest degradowane później, podczas fazy G1Około 23% białka Mos nie jest
degradowane i jest obecne podczas 1 cyklu mitotycznego w zygocie
![Page 15: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/15.jpg)
PodsumowaniePodsumowanie
![Page 16: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/16.jpg)
U płazów, produkt protoonkogenu c-mos jest kluczowym katalitycznym komponentem CSF; celem kinazy Mos może być cyklina B, regulatorowa podjednostka MPF
U myszy białko Mos jest syntetyzowane w dojrzewających oocytach, ale nie w zygocie; c-mos RNA jest degradowane podczas dojrzewania mejotycznego
U obu gatunków, podczas zapłodnienia, CSF powinien być inaktywowany, żeby umożliwić dalszy rozwój =>
Nie ma jednak bezpośrednich dowodów, że CSF jest inaktywowany podczas wyjścia z bloku metafazy II
![Page 17: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/17.jpg)
Istnieją dwie możliwości:
1.inaktywacja CSF jest konieczna do wyjścia z II podziału mejotycznego
2.aktywacja powoduje zniszczenie cykliny w sposób, który nie może być zablokowany przez aktywny CSF
W 2. Przypadku destrukcja CSF ma miejsce póżniej, podczas pierwszego cyklu, i ten przypadek, jak wynika z badań, dotyczy myszy
![Page 18: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/18.jpg)
Mos jest kluczowym, katalitycznym składnikiem czynnika cytostatycznego (CSF) =>
Istnieją dwie potencjalne możliwości inaktywacji CSF:
1.zmiana aktywności białka Mos
2.degradacja Mos przez proteazę kalpainową zależną od wapnia
W 2.przypadku aktywacja proteazy mogłaby zachodzić w momencie napływu wapnia, który ma miejsce zaraz po zapłodnieniu.
![Page 19: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/19.jpg)
Degradacja produktu c-mos ma miejsce po degradacji cykliny B i inaktywacji MPF.
Jeśli inaktywacja CSF ma związek z destrukcją białka Mos oznacza to, że inaktywacja CSF nie jest konieczna do wyjścia z bloku metafazowego. Degradacja Mos podczas fazy G1 1.cyklu komórkowego zygoty może być konieczna, aby uniknąć bloku metafazowego podczas mitotycznych podziałów
Jeśli inaktywacja CSF jest wymagana do wyjścia z bloku metafazy II, to nie ma ona związku z degradacją Mos, tylko raczej z mechanizmem regulacyjnym, który modyfikuje aktywność CSF (np. przez zmianę stanu fosforylacji Mos)
23% białka Mos obecnego w metafazie II jest w zygocie jeszcze w późnej fazie S (częściowo mogą to być nowo zsyntetyzowne białka, ponieważ pewne ilości c-mos mRNA są obecne na tym etapie)
Niewielkie ilości Mos obecnego w zygocie mogą odgrywać rolę podczas przejścia z fazy G2 do M
![Page 20: Embriologia eksperymentalna ssaków Opracowała: Małgorzata Wierzbicka](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022051620/568143c8550346895db055e8/html5/thumbnails/20.jpg)
KoniecKoniec