Tehnica ELISA

Enzyme Linked ImmunoSorbent AssayBiochimie Medicina dentara

Ce este ELISA?

Tipuri

Aplicatii

PrincipiuELISABiochimie Medicina dentara

ELISABiochimie Medicina dentaraCe este? Evaluarea prezentei si concentratiei anticorpilor si antigenilor dintr-o proba

Primele studii au fost facute in 1971 folosita pentru screeningul HIV

O tehnica biochimica folosita in special in imunologie

Primul si cel mai comun test folosit pentru detectarea unui patogen dintr-o proba

Avantaje - sensitiva (0.01-10ng/ml) - cantitativa - reproductibila - format de kit

ELISABiochimie Medicina dentaraTipuri ELISA Calitativa- rezultatele sunt pozitive sau negative ELISA Cantitativa- densitatea optica a probei este comparata cu un standard

ELISA - indirecta - competitiva - sandwich (directa)

ELISABiochimie Medicina dentaraAplicatii Evaluarea cantitativa/calitativa a anticorpilor si antigenilor dintr-o proba

Medicina: metoda de diagnostic - HIV, holera, boli venerice, gripa aviara sau porcina, hormoni (sarcina)

Industria alimentara: detectarea alergenilor din mancare lapte, alune, oua

Toxicologie: detectarea drogurilor

Cercetare

ELISABiochimie Medicina dentaraPrincipiu Ce este un antigen? Ce este un anticorp?Enzyme-linked immunosorbent assay: numele sugereaza 3 componente Anticorp - permite detectia analitului de interes Faza solida - suportul unde are loc adsorbtia Enzima - determina schimbarea de culoare-semnalul

ELISABiochimie Medicina dentaraPrimul anticorpAntigenulAl doilea anticorp conjugat cu enzimaELISA-sandwich directPrincipiu 213

ELISABiochimie Medicina dentaraPrincipiu substratprodus

Tehnica PCRPolymerase Chain ReactionBiochimie Medicina dentara

PCRCe este PCR?

Tipuri

Aplicatii

PrincipiuBiochimie Medicina dentara

PCRCe este?Biochimie Medicina dentara Polymerase Chain Reaction (Reactia in lant a polimerazei)

Mullis & Faloona Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction, 1987

Mullis: Premiul Nobel, Chimie, 1993

Amplificarea cu ajutorul unei enzime (ADN-polimeraza) a numrului de copii ale unei regiuni specifice dintr-un lan ADN

Kary Mullis

PCRTipuriBiochimie Medicina dentara Exista multe variatii ale acestei tehnici: long PCR, late PCR in situ PCR, colony PCR, single cell PCR

Cele mai folosite:

- standard PCR- RT-PCR ( real-time)

PCRAplicatiiBiochimie Medicina dentaraTestarea unor mutatii (ex.: fibroza chistica, gene tumorale)

Testare prenatala (si screening preimplantare)

Infectii virale (HIV), bacteriene (BK)

Teste de histocompatibilitate

Medicina legala

Teste de paternitate

Identificarea de persoane

Cladistica

clade

PCRPrincipiuBiochimie Medicina dentaraMateriale

ADN de amplificat: Sange, Sperma, Par, Periuta de dinti, Insecte (in chilhlimbar), Mumii, Amprente, Urina

Primeri (oligonucleotide, amplimeri) : 20-30 de dezoxiribonucleotide complementare extremitatilor 5 sau 3 ale fragmentului de amplificat

ADN-polimeraza : enzima care catalizeaza polimerizarea dTNP in catene ADN (elongarea primerilor)

dNTP (dezoxiribonucleotid trifosfati)

Solutie tamponColectare probe ADN

PCRPrincipiuBiochimie Medicina dentaraEtapele PCR

Denaturarea ADN-ului dublu catenar

Cuplarea primerilor de ADN-ul simplu catenar

Extensia primerilor

PCRPrincipiuBiochimie Medicina dentaraDenaturarea ADN 94-98 C, 20-30 de secunde ADN-ul este desfasurat in doua lanturi ADN simplu-catenare complementareCuplarea primerilor 50-65 C, 20-40 de secunde Lant dublu-catenar hibrid primeri si ADN de amplificat

Extensia primerilor ADN-polimeraza: Se leaga de lantul hibrid Citeste secvena lantului ADN-tinta; Alungeste primerii prin adaugarea de dNTP, pe baza regulii complementaritatii

PCRPrincipiuBiochimie Medicina dentaraAmplificarea

MW: dimensiuni cunoscute1: ~1850 bp2: ~800 bp3: nu s-a amplificat4: ~800 bp5: benzi multiple

Vizualizare produsi de amplificare

2. PRINCIPIUL SEPARRII CROMATOGRAFICE Principiul de baz al separrii cromatografice const n distribuia inegal a componentelor unui amestec ntre faza mobil i faza staionar. Acest amestec strbate sistemul cromatografic, fiind antrenat de ctre faza mobil. Distribuia inegal este determinat fie de afinitatea diferit a componentelor amestecului fa de cele dou faze, fie de capacitatea diferit de a difuza n acestea. Acest principiu este ilustrat n Figura 1, pe un exemplu din cromatografia de gaze pe coloane capilare. Aceste coloane se caracterizeaz prin faptul c faza staionar se gsete depus n strat foarte subire pe pereii coloanei.

Fig.1.- Principiul separrii cromatografice Moleculele celor doi compui, 1 i 2 care se gsesc n momentul iniial ametecate, ntr-un volum restrns, vor avea tendina de a se transfera continuu din faza mobil n faza staionar i invers, din cauza agitaiei termice. Deoarece moleculele compusului 2 au o afinitate mai mare fa de faza staionar, ele vor fi mai puternic reinute n aceast faz. Drept urmare, dup un anumit interval de timp se va nregistra o rmnere n urm a acestei componente, comparativ cu componenta mai slab reinut 1. Trebuie remarcat faptul c aceast separare are loc n timpul deplasrii n coloan, deci este in proces dinamic.

4. SCHEMA DE PRINCIPIU A CROMATOGRAFULUI Fig. 2.- Schema de principiu a cromatografului

1 - rezervor faz mobil2 - dispozitiv de reglare i msurare a debitului3 -dispozitiv de introducere a probei4-coloan cromatografic5 - detector6-nregistrator sau integrator

ProteinaProteina + SDSSDS-PAGE121Proteina de determinat2SDS confera o sarcina negativa uniforma proteinei3Proteina se incarca pe gel.1: proteine marker 2: proteina de determinatCurent electric4Proteinele migreaza in campul electric in functie de dimensiuneELECTROFOREZA PROTEINELOR IN GEL

ELECTROFOREZA BI-DIMENSIONALA