El estado sanitario del animalario y su impacto en los …20160525… · Biomedicina Cualquier...
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El estado sanitario del
animalario y su impacto en los
resultados experimentales:
Problemas y soluciones
Estudios in vivo en
Biomedicina
Cualquier estudio experimental es una ecuación compleja en la que el animal de laboratorio es un factor importantísimo A diferencia de otros factores, es más difícil de estandarizar: • Componentes genéticos • Componentes ambientales • Instalaciones y manejo • Alimentación…….
Estudios in vivo en Biomedicina
Cualquier estudio experimental es una ecuación compleja en la que el animal de laboratorio es un factor importantísimo A diferencia de otros factores, es más difícil de estandarizar: • Componentes genéticos • Componentes ambientales • Instalaciones y manejo • Alimentación…….
…….y factores sanitarios
Los microorganismo pueden afectar claramente al fenotipo del animal.
– Muerte
– Signos clínicos
– De forma subclínica:
– Cambios en los parámetros fisiológicos
– Cambios en los parámetros reproductivos
– Cambios en la respuestas a diferentes procedimientos, que pueden enmascarar los resultados experimentales
Las preguntas clave
• ¿Cual es el estado sanitario de mi
colonia?
• ¿Cual me gustaría que fuera?
• ¿Puedo permitirmelo?
• ¿Como puedo conseguirlo?
• ¿Puedo mantenerlo?
Tipos de estados sanitarios
• Convencional: animales sin sintomatología clínica
• Virus free: animales libres de los principales virus o
anticuerpos frente a ellos.
• SPF: Specific Pathogen Free. Libre de agentes definidos
en una lista y/o anticuerpos frente a alguno de ellos.
• SOPF: Specific Pathogen Free and Oportunistic. Libre
de agentes definidos en una lista, donde se incluyen
agentes oportunistas.
• Gnotobióticos: animales con una flora microbiologica
definida
• Germ free: animales libres de microorganismos
Sabiendo que el estado sanitario de la colonia
interfiere con los resultados experimentales
¿Que agentes debería controlar?
• FELASA recommendations for the health monitoring
of mouse, rat, hamster, guinea pigs, and rabbit
colonies in breeding and experimental units.
Laboratory Animals (2014) 4,1-38
Contemporary prevalence of infectious
agents in laboratory mice and rats
Laboratory Animals 2009 Pritchett-
Corning,K. R.,
(5 años USA, 3 años UE)
• Las infecciones suelen ser SUBCLINICAS, con leves lesiones.
• Tropismo entérico y tropismo “respiratorio” (politropico: sistema nervioso central, hígado, tejido linfoide, médula osea, etc.)
• Transmisión fecal oral o por contacto y las cepas de tropismo respiratorio se suelen transmitir por muestras biológicas
• Afecta al sistema inmune. Provoca inmunomodulación dependiendo de la cepa del virus y el hospedador.
MHV (Mouse hepatitis virus)
(Pathology of Laboratory rodents and rabbits. Percy & Barthold)
Cepa politrópica Hepatitis multifocal en ratón BALB/c (cepa JHM)
MHV (Mouse hepatitis virus)
Cepa enterotópica Sincitios en la células epiteliales de la mucosa
Cepa politrópica Necrosis coagulativa
Cepa politrópica Sincitios en las células hepáticas
(University of Missouri - Comparative Medicine Program and IDEXX-RADIL)
• Cambios importantes en la morfología del tejido intestinal, hepático, y nervioso.
Las preguntas clave
• ¿Cual es el estado sanitario de mi
colonia?
• ¿Cual me gustaría que fuera?
• ¿Como puedo conseguirlo?
• ¿Puedo permitírmelo?
• ¿Puedo mantenerlo?
COSTES Vs. BENEFICIOS
Características técnicas de la infraestructura
Requerimientos de los usuarios Recursos de la
institución
Los ingredientes de la ecuación final
- Costes de mantenimiento: Las barreras son físicas. Piensos irradiados, agua filtrada, acceso restringido del personal y de animales, control de presiones, autoclaves, necesidades de equipos redundantes de climatización, filtros de aire
- Costes de personal: El cambio al sistema de rack ventilado implica mantener menos cubetas con el mismo personal
- Se puede compensar con una concentración de recursos. Varias instalaciones unificadas y maximizar el uso
- Es una inversión muy importante que hay que mantener en el tiempo
€ €€€
Recursos de la institución
- Acceso mas restringido que afecta a personas, animales y equipos: - La entrada de una nueva cepa lleva mas tiempo, - No es posible que una misma persona trabaje en dos animalarios
distintos. - El animalario puede estar físicamente bastante separado del laboratorio - Se pierde acceso a infraestructura externa al animalario
- Costes de mantenimiento:
- En centros con co-financiación puede reducirse la parte aportada por la institución
- Se pierde libertad de trabajo - El acceso a la instalación es mas largo y para actuaciones pequeñas
puede representar incluso mas tiempo que lo que se tarda en hacerla
- Se puede compensar con personal experimentador especializado en la instalación que reduzca la necesidad de entrada del personal del laboratorio
Dos escenarios diferentes…
• Eliminar agentes patógenos en la propia
instalación. (Logísticamente complejo)
– Vaciados sanitarios y repoblación
– Tratamientos generales
– Separación de zonas/cuarentenas
Siempre es mejor si vamos a una
nueva instalación
Aunque, aún así, hace falta una buena organización y la colaboración de todos
• Rederivación sanitaria
– Embriones, obtenidos directamente o
mediante fecundación in vitro
– Cesarea,
– Transferencia de neonatos
Solución para controlar la entrada de invitados molestos:
Agentes infecciosos
controlables mediante T.E.
• Parásitos externos e internos
• Agentes bacterianos
• Hongos
• Agentes víricos que no se trasmitan en forma de provirus
Todos los agentes que se controlan en el perfil sanitario recomendado por FELASA
Ventajas e inconvenientes de
cada sistema
• Es una técnica más
sencilla
• Requiere el
trasporte de
animales vivos
• Requiere una buena
sincronización entre
donante y madre
adoptiva
• Técnica mas restringida
• No requiere el transporte de animales vivos
• Da más margen de maniobra entre receptora y donante
• Es más segura, es más fácil evitar infecciones accidentales
Cesarea/Neonatos
Transferencia de embriones
En que consiste el proceso
• Estimulación a nivel ovárico de maduración
folicular y ovulación superior a lo normal
• Cruce con machos fértiles individualizados
• Recogida de embriones en fases previas a la
implantación de hembras donantes, que
deben ser sacrificadas
• Lavado y potencialmente cultivo
• Transferencia a las hembras receptoras
¿Cuánto dura el proceso ideal? Fase del procedimiento Cronograma
Superovulación de hembras donantes para obtener un maximo numero de embriones por animal
Día 1-3
1 de enero 2016
Recogida de embriones del tracto genital previo sacrificio Día 4-7
Lavado cuidadoso de los embriones y potencialmente cultivo
Día 4-7
Transferencia a hembra receptora Día 4-7
Gestación y mantenimiento hasta el destete 44-50 días
Genotipado ?
Reestablecimiento de la cría limpia en barrera
72-80 días
Nacimiento de la primera camada en el nuevo sitio 110-120 días
20 Abril-1 Mayo
En que consiste el proceso
• Estimulación a nivel ovárico de maduración
folicular y ovulación superior a lo normal
• Cruce con machos fértiles individualizados
• Recogida de embriones en fases previas a la
implantación de hembras donantes, que
deben ser sacrificadas
• Lavado y potencialmente cultivo
• Transferencia a las hembras receptoras
Superovulación
• Muy estandarizada desde los años 60
• Funciona relativamente bien en todas las especies de laboratorio, aunque tiene margen para mejorarse técnicamente
Eficiencia de la superovulación en
diferentes fondos genéticos del ratón
Línea
Media de ovocitos
recogidos tras la
superovulación
A/J 5.4 ± 0.6
BALB/cJ 14.0 ± 0.8
C3H/HeJ 14.9 ± 1.0
C57Bl/6J 25.0 ± 1.2
DBA/2J 31.1 ± 3.1
FVB/NJ 18.9 ± 1.3
SJL/J 12.4 ± 1.1
Adaptado de Byers et al. Theriogenology 65(2006) 1716-1726
Efecto estirpe
• Hembras que proporcionan embriones: – (24-95%, media 65%)
• Media de embriones recuperados por hembra con respuesta: (5,3 – 32,2, media 13,7)
• Eficiencia final: – 33% con oscilaciones entre el 11 y 53%
Datos de Rall et al, ILAR Journal 41 (4)221-227, año 2000
Recogida de embriones
• Implica el sacrificio de la donante……
• Realizable en las fases de desarrollo
previo a la implantación
• Diferentes territorios anatómicos
Etapa dedesarrollo
Hora post- hCG Dia degestación
Localizaciónanatómica
1 célula 16 h Dia 1 Ampolla del oviducto
2 células 40 h Dia 2 Oviducto4 células 58-60 h Dia 3 8.00h Oviducto
8 células 68-70h Dia 3 14.00H Oviducto
8-16 células(morula)
74-78 h Dia 3 19.00 h Unión oviducto-utero
Blastocistotemprano
84-88 Dia 4 8.00 h Utero
Blastocisto 86-88 Dia 4 800 h UteroBalstocistoexpandido
86-90 Dia 4 10.00-12.00h
Utero
Blastocistoeclosionado
88-92 Solo in vitro Utero
Desarrollo embrionario del ratón:
fases previas a la implantación
Condiciones mínimas de un embrión para
poder utilizarse para control sanitario
• Integridad de la zona pelúcida
• Ausencia de células procedentes del
cúmulo
• Lavado un mínimo de 10 veces en una
proporción de dilución 1/100 y con cambio
de placa y pipeta entre lavados.
En que consiste el proceso
• Estimulación a nivel ovárico de maduración
folicular y ovulación superior a lo normal
• Cruce con machos fértiles individualizados
• Recogida de embriones en fases previas a la
implantación de hembras donantes, que
deben ser sacrificadas
• Lavado y potencialmente cultivo
• Transferencia a las hembras receptoras
Rederivación de una instalación
completa: lo que hace falta
• Sentido común
• Buena planificación
• Mucha paciencia
• Entender que no es posible mantener el
animalario funcional. HAY que parar en
algún momento
• Entender que dependemos de la Biología,
que es no es una ciencia exacta
Planificar una rederivación general I
• La causa de alguna forma condiciona la estrategia
• Hay que ser consciente que siempre habrá un pequeño porcentaje de líneas conflictivas
• La planificación debe de involucrar a los usuarios y al personal del animalario de forma activa
Planificar una rederivación general II
• Obtener la mayor cantidad de información posible, preguntando incluso lo mas obvio.
• Establecer prioridades: – Disponibilidad
– Dificultad de recuperar el genotipo experimental o la edad a la que se realizan los experimentos. Por ejemplo empezar por los que tienen que hacer cruces a partir de líneas parentales, estudios de longevidad….
• Planificar la cría de las líneas que deban de utilizarse para la recogida de embriones, pero procurando no coincidir todos al mismo tiempo
• Intentar contar con la criopreservación
Recomendaciones para la
erradicación de agentes infecciosos
mediante rederivación • Recordar que los embriones no son la única
fuente de contaminación, lo son el equipo y el
personal
– Sala sucia y limpia y a ser posible diferente persona
• Recabar información sobre el agente infeccioso
que se quiera erradicar.
• Conocer la necesidad real del laboratorio y
basado en ello plantear el número de embriones
y transferencias necesarias.
Recomendaciones para la limpieza de una
colonia mediante rederivación
• Una contaminación ocurre aún en las mejores instalaciones, planificar una estrategia de emergencia cuando no la hay ahorra muchos quebraderos de cabeza
• Prescindir de la rederivación de los animales que puedan ser sustituidos de alguna otra manera (comerciales),
• Congelar embriones de líneas con excedentes
• A mayor tiempo que la colonia sucia y limpia tengan que convivir, mayor riesgo de recontaminación
• Concienciar a los usuarios que el proceso llevará meses. ¿Evaluar posibles alternativas?.
• Ser consciente de las propias limitaciones y no confiar en la suerte, la ley de Murphy se cumple con demasiada frecuencia.
• Separar en la medida de lo posible las instalaciones
Como se plantea una rederivación:
estrategia específica
• Fondo genético de la línea
• Numero de construcciones que lleva y para
cada una de ellas si está en homocigosis o en
heterocigosis
• Disponibilidad de animales y de espacio en las
instalaciones para por ejemplo hacer los cruces
Que supone cada “intento”
• Disponer de un lote de 5-6 hembras con
edad adecuada (5-8 semanas)
• Disponer de tantos machos reproductores
individualizados como hembras se vayan a
superovular y que sean realmente fértiles
• Hormonar en fin de semana
• Disponer de receptoras pseudogestantes en
el animalario receptor
Líneas en heterocigosis
• Requieren un mayor número de
embriones para asegurar la transmisión
de la mutación
• Suelen responder mejor a los tratamientos
de superovulacion y a la transferencia
• Requieren un análisis posterior y el
restablecimiento de la línea mediante
cruces
Líneas en homocigosis
• Requiere menos transferencias, todos los embriones nacidos serán positivos
• Ahorran mucho tiempo a la hora de establecer la línea
• Son mas complejos de obtener (superovulación)
• Suelen ser mas sensibles a la manipulación (endogamia)
• Aunque no se genotipe normalmente, en este caso si debe hacerse
El caso mas sencillo……
• Línea en fondo definido disponible comercialmente, una sola mutación en heterocigosis
• Se comprarían hembras comerciales si es posible. Si no deberán ser cedidas por el usuario
• Una sesión de rederivación debería ser suficientes, enfondos híbridos y 2 en líneas consanguíneas cada una con 5 hembras
• La FIV es una buena alternativa
• Se transferirán en total unos 60 embriones a 4-5 receptoras y deberían nacer unos 20 hijos, de los cuales servirá sólo el 50%
El siguiente caso…… • Línea en fondo desconocido, una sola
mutación en heterocigosis
• No hay posibilidad de comprar las hembras, hace falta que procedan de la colonia original
• Posiblemente hagan falta dos sesiones de rederivación, cada una con 5
• Se transferirán en total unos 50-80 embriones a 5-6 receptoras y deberían nacer unos 20 hijos, de los cuales servirá sólo el 50%
Y si son homocigotes….?
• Línea en fondo puro C57Bl/6J, una sola mutación en homocigosis
• El laboratorio deberá disponer de al menos 10 hembras en edad reproductiva adecuada además de los machos (5)
• Dos sesiones de rederivación debería ser suficientes, cada una con 5 hembras porque sólo un 40% se cubrirán.
• Todos los hijos que nazcan serán del genotipo deseado, pero DEBE de comprobarse.
El peor escenario……..
• Animales con fondo genético con baja respuesta a la superovulacion, viabilidad embrionaria limitada……. Por ejemplo BALB/c y todas aquellas líneas que en condiciones naturales tienen problemas reproductivos.
• Animales de fondo genético totalmente desconocido.
• Dobles y triples mutantes y todas sus combinaciones. Solo podremos transferir las líneas parentales. El restablecimiento del modelo es mas complejo
Nuestra experiencia….
52%
38%
7% 3%
CBM 2012 42 líneas
1 intento
2 intentos
3 intentos
fracaso
34%
33%
33%
0%
CEU San Pablo 6 líneas 2016
1 intento
2 intentos
3 intentos
fracaso
80%
20%
0% 0%
CNB 2016 10 líneas internas
1 intento
2 intentos
3 intentos
fracaso