El diagnóstico de las enfermedades...

"El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”. Joan FiblaOctubre, 2001

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"El diagnóstico de las enfermedades hereditarias”Dr. Joan Fibla PalazónDepartament de Ciències Mèdicas BàsiquesFacultat de MedicinaUniversitat de Lleida

Introducción

El diagnóstico de las enfermedades hereditarias consisteen la detección de las alteraciones o variaciones de laconstitución genética de un individuo que están directa oindirectamente relacionadas con estados patológicos. Eldiagnóstico basado en el estudio del ADN haexperimentado un avance considerable en el últimodecenio fruto de la identificación, caracterización ycartografiado de un elevado número de genes implicadosen patologías humanas. En la actualidad, el análisis denumerosas patologías genéticas puede ser abordado enlos laboratorios de genética molecular humana, tanto conuna finalidad clínica como de investigación básica.

Las estrategias para el diagnóstico genético las podemosclasificar como directas o indirectas en función de si sedetecta o no el gen implicado. En el primer casopodremos realizar el diagnóstico identificando en lospacientes las diferentes mutaciones del gen en cuestión.Desafortunadamente el número de enfermedadesproducidas por más de un tipo de mutación en un mismoo diferentes genes supera a aquellas que sonconsecuencia de una única mutación. Ello hace que eldiagnóstico directo presente en muchas ocasionesproblemas prácticos.

La segunda estrategia es independiente del conocimientodel gen implicado, pues se fundamenta en el estudio de laherencia conjunta de marcadores anónimos y el locus dela enfermedad estudiada. Para este fin, es preciso que elmarcador utilizado presente un fuerte ligamento con ellocus de interés, además de otras características que loharán más o menos adecuado para el diagnóstico.

Respecto a otros tipos de diagnóstico médico, eldiagnóstico genético presenta característicasdiferenciadoras muy significativas como son:

• El resultado de un diagnóstico genético tiene no soloefectos sobre el paciente (al que denominamospropositus) sino que todos los individuosemparentados con este se ven afectados. Así, launidad de estudio en el diagnóstico genético es lafamilia y todo proceso de diagnóstico implica unestudio familiar.

• El diagnóstico genético debe dar respuesta asituaciones con dimensión ético-social importante.Su aplicación durante los períodos prenatal oneonatal tiene como objetivo el facilitar a los padres

una información completa y fiable que les permita latoma de decisiones durante las primeras semanasde gestación o para poder dar una rápida respuestaterapéutica al recién nacido.

• Una parte importante de las estrategias diagnósticastienen una mayor o menor componenteprobabilística. Por ello, los resultados obtenidos y la“calidad” de la información facilitada al paciente y asu familia deben ser matizadas en este sentido.

Estrategia y métodos de diagnóstico

La estrategia y métodos de diagnóstico más apropiadosdependerán del tipo de alteración genética que presentela patología estudiada, del periodo vital en el que esanalizado el propositus y del colectivo estudiado (Figura1).

Atendiendo al tipo de alteración genética• Un número importante de patologías genéticas están

asociadas a alteraciones en el complementocromosómico, sobre todo aquellas que se manifiestande forma sindrómica. La estrategia diagnóstica másadecuada en este caso será la caracterizacióncromosómica del propositus y de su familia. Dichacaracterización consistirá básicamente en laelaboración del cariotipo para el estudio de posiblesalteraciones cromosómicas estructurales o numéricas.

• De tratarse de una patología con herenciamultifactorial, como es el caso de numerosasenfermedades con una alta frecuencia en la poblacióncomo la hipertensión, la diabetes, las enfermedadescardiovasculares u otras, la aproximación diagnósticaconsistirá en la determinación de factores de riesgomediante estudios de asociación.

• Si se trata de una enfermedad monogénica conherencia mendeliana definida, la estrategiadiagnóstica dependerá de si se ha localizado o no allocus implicado, de si se conoce o no al gen y de sieste presenta una o múltiples mutaciones que causenla patología en estudio. Según sea el caso podremosaplicar un diagnóstico probabilístico basado en elpatrón de herencia de la enfermedad, un diagnosticoprobabiliístico basado en la utilización depolimorfismos genéticos o un diagnóstico de certezafruto de la detección de la mutación en el paciente.

Atendiendo a la etapa del ciclo vital del pacienteLa aplicación de las distintas estrategias antesmencionadas se podrá realizar en distintas etapas deldesarrollo del individuo afectado definiendo distintostipos de diagnóstico genético (Figura 1).

• El diagnóstico preimplantacional, cuando se analiza elgenotipo en las primeras etapas del desarrolloembrionario de óvulos fecundados mediantefertilización “in vitro ”.

• El diagnóstico prenatal cuando el genotipo esanalizado durante las primeras semanas dedesarrollo fetal.

Figura 1. El diagnóstico genético según la etapa del desarrollo y el colectivoanalizado.


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• El diagnóstico postnatal cuando el genotipo sedetermina después del nacimiento, normalmentedurante los primeros días después del parto (neonatal)o en períodos posteriores de la infancia o de adulto.

Atendiendo al colectivo estudiadoSegún sea el colectivo de estudio podremos referirnos aun diagnóstico individual, familiar o poblacional.

Análisis del patrón de segregación

La aproximación más simple que podemos hacer en eldiagnóstico de una enfermedad hereditaria es el estudiode su patrón de herencia. Esta será la única aproximacióndiagnóstica en muchas de las enfermedades hereditariastodavía no caracterizadas. El estudio del patrón deherencia es una etapa imprescindible en todo diagnósticogenético, sea cual sea la estrategia utilizada.

Los patrones mendelianos clásicamente definidos no sonsiempre tan diáfanos y transparentes cuando se analizanen genealogías humanas. Para empezar, el número dedescendientes que podemos estudiar en una familia es,por lo general, muy reducido y ello dificulta en muchasocasiones el establecimiento de un patrón de herenciaconcreto. Por otra parte diversos factores pueden alteraro modificar la presentación del fenotipo en los miembrosde una familia y enmascarar un determinado patrón deherencia. Discutiremos a continuación algunos de estosfactores.

Variabilidad en la manifestación clínica . Lamanifestación clínica de una enfermedad hereditariapresenta, en la mayoría de los casos, una granvariabilidad que dificulta el establecimiento del patrón deherencia. Un carácter presenta expresividad variablecuando su manifestación clínica es heterogénea entreindividuos afectados. Un ejemplo de esta situación lotenemos en la neurofibromatosis tipo 1, cuyamanifestación clínica puede ir desde manchas oscuras enla piel (manchas “cafè-au-lait”) o pequeños neurofibromascutáneos hasta enormes deformaciones óseas. Laexpresividad no debe confundirse con la penetrancia delcarácter. Un carácter será penetrante cuando todos losindividuos portadores del alelo mutado manifiestan elcarácter en uno u otro grado de expresividad. En casocontrario, cuando individuos portadores del alelo mutadono manifiestan el carácter, diremos que este es nopenetrante (Figura 2).

Las razones que justifican la baja penetrancia de uncarácter son en muchas ocasiones desconocidas. Puedetratarse de una caracterización clínica incompleta, o bienser el resultado del efecto de factores ambientales ogenéticos que impiden la manifestación del carácter en elindividuo en cuestión. Así mismo, la penetrancia puedevariar en función de la edad del individuo portador delalelo mutado. Este es el caso de las enfermedades demanifestación tardía como la poliquistosis renal del adultoo la enfermedad de Huntington.

Variabilidad en la base genética de la patología.Cuando se analiza un patrón de herencia, se suelesimplificar al considerar el modelo de un gen que causaun efecto fenotípico. Desafortunadamente la situación reales mucho más compleja. En numerosas ocasiones laalteración en un determinado gen produce efectospleiotrópicos dando lugar a alteraciones fenotípicas endistintos tejidos, órganos o sistemas. Así mismo, unadeterminada manifestación fenotípica presentaheterogeneidad genética cuando puede producirse por

alteraciones en distintos genes (heterogeneidad de locuso génica) o distintas mutaciones de un mismo gen(heterogeneidad alélica). Ambas situaciones dificultan elestablecimiento de un patrón de herencia.

Variabilidad en la expresión génica. Diversos procesosepigenéticos pueden alterar la expresión de un carácter ypor ello modificar el patrón de herencia observado. Elmodelo mendeliano asume que la manifestaciónfenotípica de un carácter autosómico es independientedel origen materno o paterno del alelo heredado. Dichoprincipio, como tantos otros, no puede generalizarse deacuerdo con la información actualmente disponible sobrela impronta del genoma. Dicho fenómeno se refiere alhecho de que en determinados genes un mismo alelopresenta una actividad génica distinta según seaheredado por la línea materna o paterna. La naturalezamolecular de la impronta es en muchos aspectosdesconocida, aunque parece estar relacionada con elgrado de metilación del ADN.

Otro proceso capaz de alterar la expresión génica, eneste caso de genes localizados en el cromosoma X, es elfenómeno de inactivación de dicho cromosoma que sepresenta en el sexo femenino.

Hombres y mujeres difieren en el número de cromosomasX. Así, el hombre presenta una sola copia de dichocromosoma mientras que la mujer presenta dos copias.Con el objeto de compensar la dosis de expresión de losgenes localizados en el cromosoma X, durante lasprimeras fases del desarrollo embrionario de un zigotofemenino se inactiva de forma aleatoria el cromosoma Xde origen materno o de origen paterno. Dicha inactivaciónno comporta ningún cambio irreversible en el ADN sinoque tan solo afecta a la expresión de los geneslocalizados en dicho cromosoma. El resultado es tal, quela mujer es un mosaico de expresión de los geneslocalizados en el cromosoma X (Figura 3). Unaconsecuencia directa del fenómeno de inactivación del

Figura 2. Penetrancia y expresividad. En el histograma de la izquierda se representan enel eje de las ordenadas valores arbitrarios de la expresión de distintos caracteres y en lasabcisas distintos individuos que presentan el alelo correspondiente al mismo. De arriba aabajo, el primer histograma se corresponde con un carácter que se manifiesta y expresapor igual en todos los individuos, es decir, un carácter penetrante con expresividadconstante. El segundo histograma hace referencia a un carácter que se manifiesta entodos los individuos pero su grado de expresión es variable, es decir, un carácterpenetrante con expresividad variable. En el tercer histograma se presenta un carácter queno se manifiesta en todos los individuos (en 4 de 10 no hay manifestación del carácter),pero cuando se expresa lo hace por igual en todos ellos, es decir un carácter con bajapenetrancia (60%) y expresividad constante. Finalmente el cuarto histograma se refiere aun carácter que no se manifiesta en todos los individuos (en 3 de 10 no lo hace) y con ungrado de expresión variable, es decir un carácter con baja penetrancia (70%) yexpresividad variable. En la genealogía de la derecha se presenta una familia en la quese está heredando un carácter autosómico dominante. El fenotipo normal de los individuos“a” y “b” y la aparición del carácter en la descendencia de ambos, nos indica que se tratade un carácter con baja penetrancia.


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cromosoma X es que una mujer heterozigota para unamutación en el cromosoma X, manifestará el alelo

mutante en aquellas células en las que se haya inactivadoel cromosoma con el alelo normal, independientementede que dicho alelo sea dominante o recesivo.

Casos esporádicos. El nacimiento de un individuoafectado de una patología hereditaria en una familia en laque dicha patología no ha sido detectada previamente,genera serias dificultades en el momento de establecer elpatrón de herencia.

En primer lugar, puede tratarse de un carácter recesivo yque ambos padres sean heterozigotos y por lo tantoasintomáticos, o bien, de un caso de mutación de novoproducida en la línea germinal de uno de los padres quese manifiesta en el hijo afectado. Es obvio que elescenario es distinto en uno u otro caso. En la primerahipótesis se trataría de un carácter con un riesgo derecurrencia del 25%, mientras que en el segundo caso elriesgo de recurrencia dependería del número de gametosmutados presentes en el progenitor y por lo general seriamucho menor que el 25%.

La mutación de novo puede afectar a la línea germinal o ala línea somática. En el primer caso, el individuo encuestión no manifestará la enfermedad pero transmitirá asu descendencia el alelo mutado. En el segundo caso, elindividuo manifestará la enfermedad pero no la transmitiráa su descendencia. En este último caso, el grado demanifestación dependerá del número de célulassomáticas afectadas y del tipo de mutación.

Las mutaciones de novo o espontaneas son eventos pocofrecuentes, sin embargo determinados genes presentanfrecuencias de mutación significativamente altas, bienporque se trata de genes grandes que ocupan cientos dekilobases y en los cuales es más probable un eventomutacional, bien porque estén localizados en regioneshipermutables o “puntos calientes” del genoma. Laincidencia de mutaciones de novo es importante enpatologías con una herencia dominante como son laosteogénesis imperfecta o la acondroplasia.

El diagnóstico molecular

Sin duda alguna, la aplicación en genética humana de latecnología del ADN recombinante y de los métodos deamplificación enzimática de ácidos nucleicos hansupuesto una auténtica revolución metodológica.Paralelamente a este desarrollo tecnológico, elaislamiento y la caracterización de un número cada vez

mayor de loci polimórficos repartidos a lo largo de todo elgenoma humano ha permitido la aplicación del análisisgenético en la especie humana y con ello lacaracterización de un importante número de genesimplicados en patologías.

Gracias a la estrecha relación entre la ciencia básica y suaplicación clínica en el ámbito de la genética humana,dichos avances han sido transferidos de forma casiinstantánea de los equipos de investigación básica a losservicios de diagnóstico genético. Un claro ejemplo deello lo tenemos en el diagnóstico de las mutaciones portripletes inestables, en las cuales el tiempo transcurridodesde su caracterización hasta su utilización prácticapuede contarse en semanas.

El diagnóstico molecular pretende la caracterización, conla mayor precisión posible, del genotipo de un individuo.Dicha caracterización la podemos realizar mediante dosaproximaciones básicas, i) el diagnóstico directo,mediante la detección del cambio producido a nivel delADN, ii) el diagnóstico indirecto, mediante el estudio de lacosegregación del carácter estudiado y marcadorespolimórficos íntimamente ligados a éste.

El diagnóstico molecular directo

El máximo nivel de precisión del diagnóstico directo seobtiene con la secuenciación de los nucleótidoscorrespondientes al locus mutado, sin embargo laaplicación de esta estrategia diagnóstica de formageneralizada es por el momento inviable.

Por lo general el diagnóstico directo de una mutación serealiza mediante el estudio de los cambios que éstaproduce en la estructura primaria (secuencia), en laspropiedades fisico-químicas de la molécula de ADN obien en los cambios que se presentan en el productogénico (sea este ARN mensajero o proteína).

Básicamente podemos distinguir cuatro tipos de cambioso mutaciones del ADN:

a. cambios de nucleótidos. Una base es substituida porotra distinta. Existen dos tipos de cambios, lastransversiones (una purina (A o G) por unapirimidina (C o T)) y las transiciones (una pirimidinapor una pirimidina o una purina por una purina),

b. pequeñas deleciones o inserciones. Un númeroreducido de nucleótidos se pierden o insertan,alterando la secuencia y tamaño de la molécula deADN,

c. grandes reorganizaciones . Ganancias, pérdidas oreorganizaciones de grandes fragmentos de ADN y

d. mutaciones dinámicas. Repetición inestable detrinucleótidos en distintas regiones de un gen.

Los cambios de nucleótidos y las pequeñas deleciones oinserciones alteran la estructura primaria del ADN ypueden dar lugar a variaciones del tamaño de la moléculao bien, como veremos más adelante, pérdidas oganancias de dianas de restricción. Así mismo lamolécula mutada puede presentar variaciones en suspropiedades fisico-químicas que alteren su movilidadelectroforética o sus propiedades de apareamientocomplementario. Las grandes reorganizaciones y lasmutaciones dinámicas provocan generalmentevariaciones en el tamaño de la molécula de ADN.Finalmente, las mutaciones pueden ser detectadas en elproducto génico cuando estas dan lugar a mensajerosinestables o de tamaño distinto o bien a proteínastruncadas.

Xm Xp

m+ p-

m- p+

m- p+

m+ p-

m+ p-

© JFP’98Figura 3. Inactivación del cromosoma X. Durante las primeras etapas deldesarrollo embrionario se inactivan de forma aleatoria el cromosoma X deorigen materno (p+m -) o paterno (p - m+). Dicha inactivación se mantiene entodo el linaje de cada una de las células. El resultado final es un mosaico deexpresión en el cual cada tejido u órgano expresará los alelos situados en elcromosoma X no inactivado.


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Herramientas y metodologías para la detecciónde mutaciones

Las técnicas y protocolos utilizados en el diagnósticomolecular se circunscriben en el ámbito de la biologíamolecular básica. No estamos hablando de unatecnología excesivamente compleja y de hecho cualquierlaboratorio de biología molecular está capacitadotécnicamente para llevar a cabo este tipo de análisis.

Básicamente las técnicas comunes a todos loslaboratorios de diagnóstico molecular son:

a. los enzimas de restricción,b. las técnicas de separación electroforética de ácidos

nucleicos,c. la hibridación de ácidos nucleicos yd. la amplificación enzimática del ADN (PCR)

Brevemente discutiremos cada una de esta técnicas.

Los enzimas de restricción (ER). Los ER son proteínasque reconocen secuencias concretas del ADN,denominadas dianas de restricción y tienen actividadendonucleasas (cortan la doble hélice del ADN). Existendistintos tipos de ER según sea el tipo de secuenciareconocida y el lugar de corte. Las que tienen unaaplicación más generalizada en el diagnóstico molecularson las de tipo II, que reconocen secuenciaspalindrómicas de entre 4 y 8 nucleótidos (secuencias quese leen igual de izquierda a derecha que de derecha aizquierda) y cortan el ADN en dicha secuencia (Figura 4).

Este tipo de enzimas tiene una total especificidad por lasecuencia diana y el cambio de un solo nucleótido en estaproduce la pérdida de reconocimiento. Las mutacionesdebidas a variaciones nucleotídicas o las pequeñasdeleciones o inserciones pueden producir la pérdida deuna diana o la aparición de una nueva diana donde antesdel cambio esta no existía.

Separación electroforética de ácidos nucleicos. Elmétodo más común y eficaz de fraccionar moléculas deADN en función de su tamaño es la electroforesis ensoporte de agarosa o acrilamida. En ambos casos lasmoléculas de ADN (o ARN) se aplican a una matrizsemisólida, generalmente un polímero de agarosa oacrilamida, que actúa como cedazo restringiendo el pasode las moléculas en función de su tamaño. Laelectroforesis se realiza en un tampón a pH básico deforma que las moléculas de ADN están cargadas

negativamente. Para inducir el desplazamiento a travésde la matriz se aplica un campo eléctrico y las moléculasse desplazan hacia el polo positivo. Dado que la carganeta de cada molécula es la misma, sea cual sea sutamaño, el único parámetro discriminatorio es el tamañodel poro de la matriz utilizada. El resultado final es laseparación de las moléculas de ADN en función de sutamaño. Las moléculas más pequeñas pasarán másfácilmente a través del poro mientras que las grandesquedarán retenidas.

Hibridación y transferencia de ácidos nucleicos. Unade las características más singulares de la molécula deADN es la complementariedad de bases. La doble hélicede ADN está formada por dos cadenas antiparalelas enlas que las bases nitrogenadas están apareadas de formaque una adenina (A) está siempre frente a una timina (T)y una citosina (C) está siempre frente a una guanina(G).La unión entre las bases se establece mediante puentesde hidrógeno, dos en el par AT y tres en el par GC queconfieren a la doble hélice una alta estabilidad.Experimentalmente podemos separar las dos cadenas,proceso que denominamos desnaturalización, aplicandoenergía en forma de calor, rompiendo los enlacesquímicamente o disminuyendo la concentración salina(Figura 5). Modificando estos parámetros en sentidoopuesto podremos renaturalizar dos moléculas de cadenasencilla y obtener una cadena doble. El proceso derenaturalización dependerá fundamentalmente de lacomplementariedad de bases que presenten las doscadenas sencillas.

La identificación de secuencias de ADN mediante latécnica de hibridación consiste en obtener un fragmentode ADN (sonda) de secuencia complementaria a la regióna identificar y marcarla enzimática o radioactivamente.

La hibridación de ambas moléculas, sonda y secuencia adetectar, puede realizarse en solución o bien con una deellas fijada a un soporte sólido. En éste último caso elsoporte suele ser un filtro de nitrocelulosa o nylon. Lasmoléculas de ácidos nucleicos se absorben pasivamenteal filtro y posteriormente son fijadas mediante luzultravioleta.

Los fragmentos de ADN separados en un gel de agarosao acrilamida, pueden ser transferidos y fijados a un filtrode nitrocelulosa o nylon para ser detectados medianteuna sonda. El sistema de transferencia, conocido comométodo Southern, permite obtener en el filtro una réplicaexacta del gel.

Amplificación enzimática de ADN . La amplificaciónenzimática del ADN consiste en la obtención de copias deuna secuencia específica de ADN mediante una reacción

Figura 4. Los enzimas de restricción (ER). En la figura se presenta laactividad endonucleasa de los ER Taq I (obtenida de la bacteriatermófila Thermus aquaticus) y EcoR V (obtenida de la enterobacteriaEscherichia coli). Ambos enzimas tienen especificidad para lasecuencia reconocida (diana) y cortan a la misma liberandofragmentos con extremos cohesivos o romos respectivamente.

Formamida Temperatura

Concentración salina

Cadena sencilla

Cadena doble

DESNATURALIZACIÓN

Cadena sencilla

Cadena doble

RENATURALIZACIÓN

© JFP’98

Figura 5. Hibridación de ácidos nucleicos. Procesos de desnaturalización yrenaturalización. Véase el texto para explicación.


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en cadena de la ADN polimerasa (PCR). Dichametodología ha supuesto una auténtica revolución en elcampo de la biología y genética molecular y su aplicaciónen el diagnóstico genético es en la actualidadimprescindible.

Las ADN polimerasas son los enzimas que llevan a cabola replicación del ADN. Para ello precisan de unamolécula de ADN de cadena sencilla que actúe comomolde, un cebador (pequeña molécula de ácido nucléicode unos 15 a 20 nucleótidos) de secuenciacomplementaria a la cadena a sintetizar y nucleótidosactivados para ser incorporados en la cadena naciente.

Para amplificar cíclicamente una determinada secuenciade ADN deberemos disponer de cebadores (tambiéndenominados oligonucleótidos) que flanqueen losextremos de la región que deseamos amplificar (verFigura 6). Incrementando la temperatura por encima delos 90 ºC obtendremos cadenas sencillas de ADN queactuarán como molde en la reacción de amplificación.Para favorecer el apareamiento del cebador con susecuencia complementaria bajaremos la temperaturahasta un valor preestablecido y específico para cadaoligonucleótido, a la cual el cebador se apareará con susecuencia complementaria. Utilizando como anclaje alcebador apareado, la ADN polimerasa iniciará laextensión de la cadena. El ciclo se iniciará de nuevo conla desnaturalización por calor de la molécula reciénsintetizada. La repetición de este proceso entre 20 o 30veces nos permitirá obtener millones de copias de lasecuencia inicial.

El enzima utilizado para esta reacción es una ADNpolimerasa resistente a temperaturas elevadas obtenidade bacterias termófilas (Thermus aquaticus).

Métodos de detección directa de mutaciones

Veremos a continuación mediante algunos ejemploscomo se aplican estas técnicas básicas en el diagnósticogenético.

Detección directa de una mutación que altera unadiana de restricción. La anemia falciforme es unaenfermedad autosómica recesiva con una alta prevalenciaen determinadas regiones geográficas. Los pacientesafectados por esta patología presentan en homozigosis lasubstitución de una glutamina por una valina en el terceraminoácido de la β-globina (βS). Dicha mutación secorresponde con el cambio de una adenina por una timinaen el codón 6 de dicho gen que al mismo tiempo altera ladiana de restricción para el enzima MstII.

Aprovechando esta circunstancia se ha diseñado unmétodo muy sencillo para detectar la mutación. Como seindica en la Figura 7, la secuencia normal del gen de laβ -globina en los codones 5, 6 y 7 (cct gag gag) incluye ladiana para el enzima Mst II (cctgagg). Dicha diana sepierde con la mutación que causa anemia falciforme alpasar a ser (cctgtgg). Flanqueando a esta diana existendos dianas para el mismo enzima: una a 1,2 kb y otra a0,2 kb de distancia. La digestión del ADN genómico de unindividuo con el enzima Mst II, dará lugar a miles defragmentos entre los cuales estarán los correspondientesal locus de la β-globina. Podemos ahora separar todos losfragmentos según su tamaño en un gel de agarosa ytransferir el resultado a un filtro de nitrocelulosa.Utilizando una sonda complementaria al fragmento de 1,2kb, podremos detectar aquellos fragmentos de ADN quecontengan la secuencia complementaria a la sonda(véase parte inferior de la Figura 7).

Si un individuo es homozigoto para el alelo normal de laβ -globina, el único fragmento que será detectado por lasonda será el de 1,2 kb. Si el individuo es portador delalelo de anemia falciforme detectaremos dos fragmentos:el de 1,2 kb y el de 1,4 kb, uno proveniente delcromosoma que tiene la secuencia normal (con diana) yel otro proveniente del cromosoma con la secuencia de laanemia falciforme (sin diana). Finalmente, en un individuohomozigoto para la anemia falciforme solo detectaremosel fragmento de 1,4 kb.

Una variación del método anterior se presenta en laFigura 8. La aplicación de la técnica de PCR facilitaenormemente la detección de mutaciones en las quevaria una diana de restricción. El método consiste enobtener oligonucleótidos que flanquean la mutación ymediante PCR obtener millones de copias de dicharegión. Seguidamente los fragmentos amplificados seponen en presencia del enzima en cuestión, en nuestrocaso Mst II. Si el ADN proviene de un individuo normaltodos los fragmentos amplificados presentarán la dianapara el enzima y por lo tanto después de la digestiónobtendremos dos subfragmentos (en el ejemplo, delfragmento amplificado de 300 pb se obtendrán dossubfragmentos: uno de 200 y otro de 100 pb). Si el ADNproviene de un individuo afectado todos los fragmentosamplificados tendrán la secuencia que no es reconocidapor el enzima y por lo tanto la digestión no alterará sutamaño (todos continuarán siendo de 300 pb).Finalmente, si el ADN proviene de un individuo

Apareamiento

Extensión

Desnaturalización

oligonucleótidos

© JFP’98

Figura 6. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase textopara explicación.

cctgAggagggacTcctc

cctgAggag

ggacTcctc

cctgAggag

ggacTcctc

1,2 kb 0,2 kb

1,4 kb

1,4 kb

1,2 kb

Normal Portador Afectado

Mst II Mst II

Mutación de anemia falciforme

cctgTggagggacAcctc

cctgAggagggacTcctc

cctgAggagggacTcctc

© JFP’98

Figura 7. Detección de la mutación que causa anemia falciformemediante digestión con e l enz ima Mst I I . V éase texto paraexplicación.


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heterozigoto los fragmentos amplificados serán de dosclases, con la secuencia diana o sin dicha secuencia. Ladigestión de los primeros dará lugar a dos fragmentos de200 y 100 pb, mientras que los segundos mantendrán eltamaño de 300 pb después de la digestión. La resoluciónen un gel de agarosa de cada una de estas muestras sepresenta en la parte inferior de la Figura 8.

Detección directa de la secuencia mutada.- Cuando lamutación ha sido caracterizada y se conoce su basemolecular es posible diseñar estrategias diagnósticasbasadas en la detección de la secuencia mutada. Se handescrito distintos métodos de detección directa, de entrelos cuales comentaremos la detección medianteoligonucleótidos específicos de alelo (ASO, del inglés“alelle specific oligonucleotides ”). Un ejemplo de estemétodo lo tenemos en la Figura 9 donde se presenta ladetección de mutaciones en el gen de la fibrosis quística.

La fibrosis quística (CF) es una grave enfermedadhereditaria con una alta incidencia en la poblacióncaucasiana. En esta enfermedad las funciones depulmones y páncreas están alteradas por un aumento enlas secreciones de dichos órganos. Los pacientesafectados manifiestan los síntomas propios de la CF,alteraciones en las vías respiratorias e infeccionesrecurrentes, durante el primer año de vida viéndose muyafectada su calidad y esperanza de vida. Se han descritonumerosas mutaciones del locus CF, siendo la másfrecuente la deleción de tres nucleótidos (CTT) quesupone la pérdida del aminoácido 508 de la proteínaCFTR (mutación ∆508). Según el área geográfica un 65-

70% de los alelos mutados corresponden a ∆508. El 30%restante corresponde a alelos con una frecuencia nosuperior al 3%. La problemática derivada de la existenciade un gran número de mutaciones para un determinadolocus (heterogeneidad alélica) es común a muchasenfermedades hereditarias. En estos casos puederesultar más apropiado el diagnóstico indirecto mediantepolimorfismos anónimos (ver más adelante). Sinembargo, en el caso de la CF, dada su alta incidencia y laprevalencia de la mutación ∆508 se han puesto a puntométodos de detección directa como el ASO.

El método consiste en el diseño de oligonucleótidos conla secuencia correspondiente a cada uno de los alelosdescritos para CF, incluyendo como control a lasecuencia normal. Cada mutación puede estar localizadaen una región distinta del gen. En la Figura 9 se

presentan 4 mutaciones situadas en cuatro exonesdistintos. De cada mutación se dispone de la secuencia yde cebadores que permiten amplificar el exóncorrespondiente. Después de obtener ADN de cada unode los pacientes, mediante los cebadores apropiados serealiza una PCR para cada exón. Esta reacción se realizaen un solo tubo de forma que se obtiene una mezcla detodos los exones amplificados. La muestra así obtenidase aplica por duplicado a un filtro de nylon y el ADN se fijamediante luz UV. Seguidamente el filtro se hibrida con elASO correspondiente a cada mutación y a su controlnormal, marcados previamente de forma enzimática, confluorescencia o radioactividad. Después del reveladoapropiado obtendremos una señal positiva que nosrevelará los alelos presentes en cada paciente. En elejemplo de la Figura 9, el paciente 1 es heterozigoto parala mutación ∆508, pues da positivo para el ASO del alelonormal de todas las mutaciones y también para el ASOdel alelo ∆508. El paciente 2 es homozigoto para la

mutación ∆508, pues en el filtro de dicha mutación solo

obtenemos señal positiva para el ASO del alelo ∆508. Lospacientes 3, 4 y 5 son heterozigotos compuestos para lasmutaciones ∆508 - W1282X , ∆508 - R177H y ∆508 -R553X respectivamente. Finalmente el paciente 6 dapositivo para todos los ASO normales y negativo para lascuatro mutaciones. Ello nos indica que debe presentaruna mutación distinta a las estudiadas. Más allá delinterés académico por conocer que mutación estápresente en un paciente, el interés del diagnósticoespecífico del alelo o alelos mutados reside en la relaciónexistente entre dicho alelo y la manifestación clínica de laenfermedad. No son muchas las enfermedades en lascuales se ha podido establecer este tipo de correlación,pero en el caso de la CF se ha podido demostrar que lospacientes homozigotos para la mutación ∆508 presentaninsuficiencia pancreática mientras que los heterozigotoscompuestos R117H / ∆508 tienen una función pancreáticanormal.

Detección de mutaciones por deleción.- Lasmutaciones que suponen una pérdida de nucleótidos enla secuencia de ADN son fácilmente detectadas mediantePCR. Un ejemplo de aplicación lo tenemos en ladetección de mutaciones en el gen de la distrofiamuscular de Duchenne (DMD).

Esta enfermedad presenta una herencia ligada alcromosoma X por lo que su frecuencia es muy superioren hombres que en mujeres. Se caracteriza por la pérdida

Figura 9. Detección de mutaciones en el gen de la fibrosisquística mediante oligonucleótidos específicos de alelo. Véasetexto. ( cebadores).

cctgAggagggacTcctc

cctgTggagggacAcctc

AT

AT

A

TAT

TA

TA

TA

TA

+

Secuencia mutanteSecuencia normal

Reacción de PCR

Digestión con enzima Mst II

Normal Portador Afectado

300 pb

200 pb

100 pb

© JFP’98

Figura 8. Detección de la mutación de anemia falciforme mediantePCR y digestión con el enzima Mst II. Véase texto para explicación.


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progresiva del tono muscular que se manifiesta desde elprimer año de vida. Los niños afectados de DMD tienenproblemas para mantenerse derechos y correr. A edadesmás avanzadas la musculatura se debilita presentándoseparadas cardíacas y parálisis. La esperanza de vida nosupera los 25 años. Existe una manifestación másbenigna conocida como distrofia muscular de Becker.

El diagnóstico de la enfermedad puede realizarsemediante la determinación de la actividad creatininfosfoquinasa, muy elevada en los pacientes con DMD ypor biopsia muscular para visualizar al microscopio laestructura degenerativa de las células musculares.Cuando se pretende un diagnóstico prenatal, no esposible aplicar la estrategia anterior y éste debe realizarsemediante el análisis del genotipo.

El gen DMD es el gen humano de mayor tamaño hastaahora caracterizado. El locus DMD ocupa más de 2megabases de ADN que dan lugar a un tránscrito de 13kb. La proteína denominada distrofina tiene un total de3.685 aminoácidos y presenta una estructura repetitiva. Elanálisis molecular del gen DMD ha revelado que unnúmero importante de mutaciones se producen pordeleciones distribuidas a lo largo del locus,presentándose tanto pequeñas como grandes pérdidasde ADN (2/3 de los varones afectados presentandeleción). No se ha detectado ninguna correlación entreel tamaño de la deleción y su manifestación en forma dedistrofia muscular de tipo Duchenne o de tipo Becker. Sinembargo, sí que existe una clara correlación entre laausencia de distrofina y manifestación en la forma gravede distrofia muscular de Duchenne.

Así pues, las deleciones que causan una pérdida total delproducto génico presentan una manifestación clínicamucho más grave (Duchenne) que aquellas querespetando la pauta de lectura, dan lugar a la síntesis deuna proteína anómala (Becker).

La detección de distrofina en biopsia muscular, mediantela utilización de anticuerpos específicos, es una buena

metodología diagnóstica. Sin embargo, su carácterinvasivo y elevado coste económico hacen que seasubstituida por el diagnóstico genético.

En la Figura 10 se presenta un esquema de la estrategiade “multiplex PCR” desarrollada para la detecciónsimultánea de distintas deleciones en el gen DMD envarones afectados. Mediante la utilización de parejas decebadores, previamente optimizados, se amplifican deforma simultánea distintos exones del gen DMD. Elresultado de cada PCR múltiple se analiza en un gel deagarosa obteniéndose un patrón de bandas del cual esposible inferir las regiones delecionadas.

Una vez se han determinado cuales son los exonesdelecionados es posible definir en cada paciente losextremos de la deleción y estimar así el comportamientoclínico esperado de dicho paciente.

El método de PCR múltiple tiene una proporción muy bajade errores de diagnóstico, es muy versátil, rápido (en tansolo un día es posible analizar varios individuos) y barato.Así mismo, las cantidades de ADN necesarias para elanálisis son muy reducidas por lo que su aplicación esposible tanto en el diagnóstico postnatal como en elprenatal.

Detección de mutaciones inestables.- A principios delos años 90 se identificó un nuevo tipo de mutaciónconocida como “mutación inestable”, producida por laexpansión de unidades de repetición de tres nucleótidos.En la actualidad, se han identificado más de 50 geneseucariotas que presentan este tipo de repeticiones, entrelos cuales se encuentran genes humanos responsablesde un número importante de patologías neurológicas(Tabla I).

Este nuevo tipo de mutación presenta diversascaracterísticas:

a. la repetición es polimórfica y se presenta tanto enindividuos sanos como en afectados, siendo elnúmero de repeticiones como mínimo de entre 2 y 5veces superior en los afectados que en los sanos.

b. el número de repeticiones puede variar, expandirseo, en algunos casos contraerse de generación engeneración. En algunas de las patologías implicadasse observa una progresión partiendo de un númerode rango normal, pasando por una premutación derango intermedio y finalmente una mutacióncompleta.

c. en varias de las patologías se encuentra una fuertecorrelación entre el número de repeticiones ydistintos parámetros clínicos como la edad demanifestación (fenómeno conocido comoanticipación) o el tipo de presentación clínica(gravedad, órganos o tejidos afectados, etc.).

d. todas las mutaciones inestables con carácterpatológico identificadas hasta el momento, afectande forma directa o indirecta al sistema nervioso o

Tabla I. Patologías neurológicas causadas por mutaciones inestables

Herencia Repetición Región NormalPre-

mutación Mutación

X Frágil XD CGG 5’ nc 6-46 50-200 > 200

Distrofia Miotónica AD CTG 3’ nc 5-40 50-80 > 100

Atrofia muscular espinal XD CAG exón 17-26 40-52

Enfermedad de Huntington AD CAG 5’ nc 13-35 36-120

Atrofia dentatorubral AD CAG exón 7-23 49-75

Ataxia espinocerebelosa 1 AD CAG exón 19-37 39-63

Enfermedad de Machado-Joseph AD CAG exón 13-16 68-79

Ataxia de Friedreich AR GAA intrón 7-22 200-1200nc no codificante, XD ligada al X dominante, AD autosómica dominante, AR autosómicarecesiva

Figura 10. Multiplex PCR. Detección de mutaciones por deleción en el locusDMD. Utilizando los oligonucleótidos indicados en la parte superior de la figura(puntas de flecha) se amplifican, en una sola reacción, distintos exones del genDMD. Los primeros carriles corresponden a controles, un estandar d efragmentos amplificados, un control negativo de la PCR en el cual no se añadeADN y un control positivo de un individuo con el alelo normal. De 1 a 5 sonvarones afectados de DMD. El paciente 1 presenta una deleción de los exonesb y c. El paciente 2 presenta una deleción desde el exón b al exón f. Elpaciente 3 presenta una deleción de toda la región analizada. El paciente 4tiene delecionado el exón a y finalmente el paciente 5 ha perdido los exones dy e.


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neuromuscular. La mayoría comparten el patrón deherencia dominante, salvo la ataxia de Friedriechque lo presenta recesivo. La repetición puedelocalizarse tanto en región codificante (exones) o nocodificante (región 5’, región 3’ o intrones), por loque sus efectos pueden ir desde alteraciones en laexpresión del gen hasta la abolición del productogénico.

El diagnóstico molecular de este tipo de mutaciones tieneun alto interés dado que el tamaño de la repeticiónpermite extrapolar una parte importante delcomportamiento clínico del paciente. Durante los últimosaños se han estandarizado diversos métodos dedetección basados en las técnicas de Southern(hibridación y detección mediante una sonda) o PCR(Figura 11). La aplicación del método Southern (Figura11, izquierda), la detección se realiza mediante una sondade ADN homóloga a una secuencia adyacente a la regiónrepetida. Se obtiene ADN genómico del paciente y sedigiere con un enzima de restricción con dianas queflanquean al locus inestable. Una vez digerido sefracciona en un gel de agarosa y éste se transfiere a unfiltro de nitrocelulosa. El filtro se hibrida con la sonda paradetectar los fragmentos que contienen la región inestable.El tamaño de los fragmentos detectados es del orden dekilobases.

Para la aplicación de la técnica de PCR en el diagnósticode las mutaciones inestables se utilizan cebadores queflanquean la región amplificada (figura 11, derecha). Elproducto de la amplificación, cuyo tamaño puede estar enel rango de unos cientos de pares de bases, se aplica aun gel de agarosa o acrilamida con el objeto dedeterminar el tamaño de cada fragmento. Tal y como sepresenta en la figura es posible detectar los fragmentosamplificados de individuos normales o en aquellos quepresentan premutación, sin embargo puede suceder queno se detecte el fragmento procedente de un individuocon la mutación completa. Esto es así debido a que laDNA polimerasa puede tener problemas al intentaramplificar los tamaños del orden de kilobases (Kb) que sepresentan en el cromosoma con la mutación completa.En el esquema también puede observarse que las bandasamplificadas mediante PCR tienen una cierta

heterogeneidad en su definición. Esto es así debido poruna parte al polimorfismo en el número de repeticiones ypor otra a los errores de la DNA polimerasa.

Detección de nuevas mutaciones.- Hasta el momentohemos presentado diversas estrategias diagnósticas parala detección de mutaciones previamente caracterizadas,sin embargo en la rutina diaria del laboratorio dediagnóstico genético se plantea con frecuencia laidentificación de mutaciones que bien por serdesconocidas o bien por ser poco prevalentes, precisande una aproximación diagnóstica diferente.

Probablemente éste es el ámbito del diagnóstico genéticoque más vinculación tiene con la investigación básica,confundiéndose en numerosas ocasiones una con la otra.

Las distintas estrategias de detección de nuevasmutaciones pueden ser agrupadas en tres grandesapartados:

a. detección de variaciones en el apareamiento entrelas cadenas “normal” y mutada.

b. detección de cambios de conformación yc. detección de productos génicos alterados

En el primer grupo se incluyen dos métodos ampliamenteutilizados como son el análisis de heteroduplex y ladigestión química de cadenas con apareamientoserróneos (CCM, del inglés “chemical cleavage ofmismatch”). En ambos métodos el cambio o mutación sedetecta mediante la hibridación en solución de la cadenanormal (N) y la cadena mutada ( m) obtenidaspreviamente mediante PCR. Moléculas de ADN quecorresponden a la secuencia de la cadena mutada (mm)se mezclan con moléculas de ADN que corresponden a lasecuencia de la cadena normal (NN). Después de ladesnaturalización por calor de ambas cadenas se permitesu renaturalización. Si existe alguna diferencia en lasecuencia de nucleótidos entre ambos tipos de cadenas,además de los híbridos NN y mm (homoduplex),también se formarán hídridos del tipo Nm (heteroduplex)que presentarán errores de apareamiento. En el métodode heteroduplex los híbridos se analizan en un gel deacrilamida y las diferencias entre ellos se visualizan por laaparición de un patrón de bandas anómalo. En el métodoCCM los híbridos son tratados con un reactivo químico(por ejemplo tetróxido de osmio) que cortan a la doblecadena de ADN en regiones de apareamiento erróneo. Laaparición de fragmentos de degradación será indicaciónde la existencia de una variación entre la cadena normal yla mutada.

De los métodos de análisis de cambios de conformación,destaca por su versatilidad, economía y aceptacióngeneralizada el análisis de conformación de cadenasencilla (SSCP, del inglés “single-strand conformationpolymorphism”). El método SSCP se fundamenta en loscambios de conformación que presentan dos cadenassencillas de ADN que difieren entre sí en un úniconucleótido. Dichos cambios de conformación se puedenponer de manifiesto en un gel de acrilamida por laaparición de un patrón de bandas diferencial. El métodoes muy resolutivo y su aplicación es técnicamente simple.

Algunas de las limitaciones de la técnica son:a. las condiciones de la electroforesis (temperatura y

concentración de aditivos como glicerol o sacarosa)deben ser determinadas empíricamente,

b. el tamaño de la molécula a analizar no puedeexceder los 300-350 pares de bases (pb) y

c. presenta una sensibilidad inferior al 100%

Figura 11. Detección de mutaciones dinámicas mediante PCR ohibridación. Vese texto para explicación. N, normal; P, premutación;M, mutación.


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A pesar de estas limitaciones es una técnica ampliamenteutilizada como primera aproximación al estudio ycaracterización de nuevas mutaciones. Su aplicación enla detección rutinaria de nuevas mutaciones consistebásicamente en amplificar mediante PCR fragmentos de200 pb del locus a estudiar. Los productos deamplificación se desnaturalizan por calor y se analizan enun gel de acrilamida juntamente con un control desecuencia normal. La aparición de un patrón de bandasanómalo es indicativo de un posible cambio nucleotídico.Dicho cambio será posteriormente confirmado mediantela secuenciación del fragmento cuyo patrón se ha vistoalterado.

La simplicidad del método permite también su aplicaciónen la detección de variantes polimórficas del tipo SNP(ver más adelante). En la Figura 12 se presenta unejemplo de la aplicación de la técnica de SSCP en ladetección de una variación polimórfica del extremo 3’ dellocus del receptor de la vitamina D. Dicho polimorfismoaltera la diana de restricción del enzima BsmI, al cambiarla secuencia ACATTC (alelo B) por GCATTC (alelo b).Mediante oligonucleótidos sintéticos que flanquean ellocus polimórfico se obtienen fragmentos de ADN de 192pb. Los productos de amplificación se desnaturalizan paraobtener cadenas sencillas de ADN y estas se resuelven atemperatura ambiente en un gel de acrilamida. El patrónde bandas obtenido será distinto en función del genotipodel paciente. Si éste es homozigoto para la secuenciacorrespondiente a la diana (BB), se obtienen tres bandas:dos de cadena sencilla correspondientes a cada una delas cadenas complementarias y una banda, localizada enla parte inferior del gel en la Figura 12, que corresponde ala cadena doble no desnaturalizada. El mismo número debandas aparecerán en un paciente homozigoto para elalelo b (ausencia de diana en homozigosis), pero en estecaso y dado que cada cadena complementaria difiere delas anteriores en un nucleótido, la posición en el gel esdistinta. Finalmente el heterozigoto presentará, como enlos casos anteriores, una banda procedente de la cadenadoble no desnaturalizada y cuatro bandascorrespondientes a las cuatro cadenas sencillas.

Para finalizar comentaremos el test de proteína truncada(PTT, del inglés “protein truncation test”), como modelode los métodos basados en el estudio de modificacionesen el producto génico.

El test PTT es un método de reciente aplicación diseñadode forma específica para detectar mutaciones que causanla aparición de un codón de paro prematuro en lamolécula de ADN. Es un método técnicamente complejo,muy sensible para este tipo de mutaciones peroinaplicable para la detección de otro tipo de variacionesdel ADN.

El método consiste en la amplificación mediante PCR dedistintas regiones del locus a analizar, utilizandocebadores que además de contener la secuenciahomóloga del fragmento a amplificar contienen en pautade lectura, la secuencia del lugar de iniciación de latranscripción para la RNA polimerasa de T7 y un codónATG de iniciación. Los fragmentos amplificados se utilizancomo moldes en una reacción de transcripción in vitroutilizando la RNA polimerasa de T7. Así se obtienenmoléculas de RNA que son simultáneamente traducidas aproteína en presencia de un aminoácido marcado. Lasproteínas obtenidas son analizadas en un gel deacrilamida-SDS que permite detectar su tamaño. Laaparición de proteínas con un tamaño inferior al esperadorespecto a un control de secuencia normal, será indicativode la existencia de una mutación de codón de paroprematuro en la molécula analizada.

Además de los métodos aquí descritos, existeninnumerables estrategias diseñadas para la detección denuevas mutaciones que son el fruto, en muchasocasiones, de la capacidad imaginativa del investigador.Así mismo, numerosas casas comerciales han puesto enel mercado adaptaciones y protocolos estandarizadospara la detección de mutaciones, basados en algunos delos métodos aquí comentados.

El diagnóstico indirecto

El diagnóstico indirecto es independiente delconocimiento previo de la naturaleza molecular de lamutación a diagnosticar y para llevarlo a cabo solo espreciso conocer la localización cromosómica del locusimplicado. Dicha estrategia consiste en estudiar, en lafamilia del propositus, la segregación conjunta de laenfermedad y secuencias polimórficas físicamentepróximas (ligadas) al locus de la misma.

El ADN es una molécula lineal en la que las secuenciasde nucleótidos se hallan contiguas y distribuidas a lo largode la doble hélice en un mundo de una dimensión. Existepues una relación física de proximidad entre secuenciasde ADN. Dicha relación de continuidad puede alterarsedurante el proceso de la división meiótica que se presentadurante la formación de las células germinales. En laprofase de la primera división meiótica, los cromosomashomólogos (uno proveniente de la línea paterna y el otrode la línea materna) intercambian material por el procesode entrecruzamiento. El resultado final es tal que loscromosomas de la célula germinal madura(espermatozoide u óvulo) presentan nuevascombinaciones de las secuencias existentes en la célulaoriginal (nuevos recombinantes). Dada la relación físicaexistente entre secuencias adyacentes en un mismocromosoma, la frecuencia en que dos de estassecuencias se transmiten (segregan) juntas de unageneración a la siguiente es inversamente proporcional a

Figura 12. Detección de variantes polimórficas mediante PCR ypolimorfismo de cadena sencilla (SSCP). Véase texto paraexplicación.


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la distancia que las separa. Es decir, cuanto menor es ladistancia que separa a dos secuencias de ADN, menosprobable es el entrecruzamiento entre ellas y por lo tantosegregan juntas con una mayor frecuencia. Cuando se daesta situación decimos que ambas secuencias estánligadas.

El ligamiento entre secuencias de ADN se establecemediante el estudio de la segregación de los alelos dedichas secuencias en genealogías. Este tipo de estudiospermiten la obtención del mapa genético de unadeterminada región cromosómica. Dicho mapa contendrápuntos de referencia al estilo de un mapa de carreteras.Así, mientras que el mapa de carreteras nos informa de laposición de pueblos y ciudades, el mapa genéticocontendrá información sobre la posición de los genes.Además de pueblos y ciudades el mapa de carreterascontiene otros puntos de referencia orientativos comopueden ser un cruce de carreteras, un puerto de montañao una vista panorámica. Dichos puntos de referencia sonfundamentales para orientarse a lo largo de la carretera.Su equivalente en el mapa genético serán por ejemplo lospuntos de rotura de una determinada translocación o lassecuencias polimórficas repartidas a lo largo de lamolécula de ADN..

Secuencias polimórficas

Como su nombre indica, las secuencias polimórficas(también conocidas como secuencias anónimas, locianónimos, loci polimórficos, marcadores anónimos omarcadores polimórficos) son secuencias de ADN que,normalmente, no codifican para un producto génico, sedistribuyen de forma más o menos aleatoria a lo largo delgenoma y presentan como característica singular elhecho de ser polimórficas. Este último hecho es de sumaimportancia pues confiere a este tipo de secuencias lacaracterística primordial del análisis genético, lavariabilidad.

Las variantes de un locus es lo que conocemos comoalelos. Ya hemos utilizado este concepto anteriormente al

hablar de los alelos de loci implicados en enfermedades(el alelo ∆508 de la fibrosis quística o el alelo βS de laanemia falciforme). Sin embargo, este tipo de alelos son,afortunadamente, muy poco frecuentes y no nos seríanútiles en los estudios de ligamiento. Por el contrario lassecuencias anónimas o loci polimórficos presentan pordefinición varios alelos con una frecuenciasignificativamente alta en la población (superior al 1%para el menos frecuente).

Supongamos que queremos saber si el locus a, que estáimplicado en una enfermedad hereditaria, esta ligado allocus b, que es una secuencia anónima de ADN. Loprimero que necesitaremos será identificar las variantesde la secuencia anónima en cada uno de los miembros dela familia y estudiar su segregación juntamente con la dela enfermedad. La aplicación de diversos métodosestadísticos nos permitirá establecer la existencia o no deligamiento entre los dos loci investigados y estimar ladistancia que los separa.

En los estudios de ligamiento la distancia que separa ados loci se mide en función de la frecuencia en queambos recombinan. La unidad de distancia es elcentimorgan (cM) . Si dos loci recombinan en el 1% de lasmeiosis, decimos que les separa una distancia de 1 cM.La frecuencia de recombinación entre dos loci puedevariar desde 0 (decimos entonces que dichos loci estáníntimamente ligados) hasta el 50% y decimos entoncesque son independientes. Aunque no nos podemosextender aquí sobre este aspecto, no existe siempre unarelación lineal entre distancia genética (frecuencia derecombinación medida en cM) y distancia física (númerode nucleótidos que las separan, medida en pares debases). Para frecuencias de recombinación inferiores al20% se puede establecer una relación de 106 pares debases por cada 1% de recombinación.

Tipos de variación polimórfica en secuenciasanónimas

Hemos indicado que la característica primordial de lassecuencias anónimas es su variabilidad, veamos ahoraen que consiste dicha variabilidad. Básicamente existendos tipos de polimorfismos, los que derivan de lasubstitución de un nucleótido por otro (polimorfismosSNP, del inglés “single nucleotide polymorphism”) y losque derivan de la inserción o deleción de secuencias deADN. En estos últimos distinguimos dos subtipos: lasinserciones o deleciones de fragmentos de ADN y lasrepeticiones de secuencias de entre dos y cientos denucleótidos.

Polimorfismos del tamaño de los fragmentos derestricción (RFLP del inglés “restriction fragment lengthpolymorphism”).- Cuando el cambio de un nucleótidoaltera la diana para un determinado ER o la inserción odeleción de un fragmento de ADN se localiza entre dosdianas de un ER, podemos detectar el polimorfismo enfunción de la variación que éste genera en el patrón derestricción (Figura 13). Los RFLP son polimorfismos quepresentan normalmente un número bajo de alelos y por lotanto su utilización en el diagnóstico indirecto es limitada.

Polimorfismos de repetición.- Existen dos tipos depolimorfismos de repetición de uso en diagnósticogenético, los VNTR-minisatélites y los VNTR-microsatélites. En ambos casos presentan un númerovariable de repeticiones en tándem (VNTR del inglés“variable number of tandem repeats”).Los minisatélites son loci que corresponden a secuenciasde ADN de unas pocas decenas de nucleótidos repetidas

Figura 13 .- Polimorfismos del tamaño de fragmentos derestricción (RFLP). La pérdida o ganancia de una diana derestricción por efecto de la substitución de un nucleótido (A), o lainserción o deleción de un fragmento de ADN (B), pueden serdetectados por las variaciones en los tamaños de los fragmentosde restricción. En la figura se presenta el resultado esperado deeste tipo de polimorfismos en individuos homozigotos para lapresencia de la diana o la deleción (+ +), los homozigotos para laausencia de diana o la inserción (- -) y los heterozigotos (+ -). Elmétodo de detección puede ser tanto hibridación y southern(esquematizado en la figura) como mediante PCR.


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en tándem. El número de dichas repeticiones varia decromosoma a cromosoma, de forma que en uncromosoma el número de repeticiones en tándem puedeser de 10, en otro de 15 en otro de 22, etc, etc. Lasingularidad más especial de este tipo de polimorfismosestá en que cada loci puede presentar muchos alelosdistintos (tantos como repeticiones), sin embargopresentan el inconveniente que no están distribuidos portodo el genoma y por lo tanto solo pueden ser utilizadosen el diagnostico de un número muy reducido deenfermedades. Los VNTR-minisatélites han encontradosu máxima aplicación en la determinación de lapaternidad y en los protocolos de identificación genéticaen el ámbito judicial. Cuando se habla de huellasdactilares del ADN se está hablando de este tipo depolimorfismo.

Los VNTR-microsatélites son por excelencia lospolimorfismos anónimos utilizados en el diagnósticogenético. Corresponden a la repetición en tándem desecuencias de entre 2 y 5 nucleótidos. Los microsatélitespresentan dos características que los hacen ideales parasu uso. En primer lugar, están distribuidos de forma casihomogénea por todo el genoma y en segundo lugar,presentan un número elevado de alelos con frecuenciassimilares entre sí, de forma que la probabilidad de que unindividuo sea heterozigoto es muy elevada (presentanuna alta heterozigosidad). Su detección se realizanormalmente mediante la técnica de PCR (Figura 14).

Aplicación en el diagnóstico indirecto de lasenfermedades hereditarias

El ejemplo más sencillo de aplicación de lospolimorfismos anónimos en el diagnóstico indirecto lotenemos en el caso de enfermedades ligadas alcromosoma X. Veamos el ejemplo de la Figura 15. En la

familia en cuestión ha nacido un varón afectado de unaenfermedad hereditaria ligada al cromosoma X. Deacuerdo con el patrón de herencia, su padre presentará elalelo normal de la enfermedad, mientras que su madreserá portadora, es decir heterozigota. El varón afectadohabrá heredado de su madre el cromosoma con el alelode la enfermedad y dada su condición de hemizigoto,manifestará el fenotipo correspondiente a la misma. Sinembargo no podemos predecir, más allá del modelomendeliano, el genotipo de la hermana ni el del feto quese está desarrollando.

Supongamos que existe un locus polimórfico, tipomicrosatélite, próximo al locus de la enfermedad,íntimamente ligado (frecuencia de recombinación igual a0). Si identificamos los alelos de dicho polimorfismo encada uno de los miembros de la familia podremos inferirel alelo del locus de la enfermedad que porta cadaindividuo.

En la parte inferior de la figura se presenta, de formasimplificada, el resultado obtenido al caracterizarmediante PCR el locus polimórfico. En el margenizquierdo se presenta un patrón correspondiente alnúmero de repeticiones del dinucleótido CA (de 1 a 6) yperpendicularmente a cada individuo el alelocorrespondiente a cada uno de ellos. Podemos ver que elvarón afectado ha heredado de su madre el alelo de 2repeticiones, por lo que podemos inferir que dicho aleloestá junto al alelo de la enfermedad. Según ello, lahermana habrá heredado de su padre el alelo 4 delpolimorfismo junto con el alelo normal de la enfermedad yde su madre el alelo 6 que también en este caso irá juntoal alelo normal. Por lo tanto la hermana será homozigotapara el alelo normal de la enfermedad. Siguiendo unrazonamiento similar podemos inferir que el feto será unaniña (presenta dos alelos del polimorfismo) y heterozigotapara la enfermedad, pues ha heredado de su madre elalelo 2 del polimorfismo que como hemos indicadoanteriormente está acompañado por el alelo que causa laenfermedad.

En el ejemplo anterior hemos utilizado como marcador dellocus de la enfermedad a un locus altamente polimórfico,los cromosomas paternos presentan alelos distintos y porlo tanto los podemos identificar sin ambigüedad alguna, yíntimamente ligado, es decir no existe recombinaciónentre ambos loci y por lo tanto el alelo del polimorfismoque en la madre va junto al alelo de la enfermedad

?

2 - 2 6 4 6 4 - 2 4st

654321

Figura 15.- Genealogía de una familia en la que se hereda unaenfermedad ligada al cromosoma X. Véase texto para explicación.

Figura 14.- Detección mediante PCR de distintos alelos deun polimorfismo microsatélite. En el ejemplo se presentandos individuos heterozigotos para los alelos d e 6 y 7repeticiones y de 4 y 8 repeticiones del dinucleótido (CA)n.La detección se realiza mediante PCR utilizando comocebadores oligonucleótidos que flanquean a la región quecontiene la repetición (flechas). De cada individuo seamplifican fragmentos de ADN que difieren entre si por elnúmero de repeticiones. El resultado de la amplificación sefracciona en un gel de acrilamida-urea para determinar elgenotipo de cada individuo.


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continuará junto a éste en los cromosomas de ladescendencia. Estas dos características sonfundamentales en el momento de escoger undeterminado polimorfismo en el desarrollo de unaestrategia de diagnóstico indirecto.

Si el marcador utilizado no presenta muchos alelosentonces pueden darse situaciones de ambigüedadcuando uno o ambos padres sean homozigotos para undeterminado alelo del marcador. En este caso diremosque la familia es “no informativa” para dicho marcador ypor lo tanto deberemos utilizar otro polimorfismo en eldiagnóstico de dicha familia. Por otra parte, si el marcadorno esta íntimamente ligado, es decir existe recombinaciónentre el locus de la enfermedad y el locus del marcador,el diagnóstico deberá tener en cuenta dicha posibilidad.

Veamos el siguiente ejemplo. En la Figura 16 se presentala genealogía correspondiente a una familia en la que sehereda una enfermedad con una herencia autosómicadominante. Con una probabilidad del 50% la madreafectada transmitirá a sus descendientes el carácter. Lautilización de un locus polimórfico ligado al carácter encuestión nos permitirá establecer un diagnóstico másajustado para el feto en desarrollo. En la Figura 16(A) semuestra el resultado obtenido al analizar un polimorfismomicrosatélite (repetición del dinucleótido CA). Vemos quela madre esta afectada de la enfermedad y presenta losalelos 2 y 6 del polimorfismo. El padre esta sano y tienelos alelos 4 y 7. Por su parte el hijo afectado es portadorde los alelos 6 y 7, el primero procedente de la madre y elsegundo del padre. Según este resultado, podemosconsiderar que el alelo 6 en la madre está junto al alelomutado del locus de la enfermedad. Por lo tanto, dadoque el feto presenta el alelo 2 del polimorfismo podremosinferir que este lo ha heredado de la madre junto al alelonormal.

Sin embargo, tal y como se presenta en la Figura 16(B), sila distancia que separa a ambos loci es suficientementegrande como para que se produzca recombinación entreellos, es posible que el feto haya heredado de su madreel alelo 2 del polimorfismo junto con el alelo de laenfermedad. La recombinación de ambos loci en lameiosis de la madre daría este resultado. La frecuenciacon la que se presentará este segundo caso será lafrecuencia de recombinación entre los loci implicados.Así, si la distancia que les separa es de 5 cM, es decir sufrecuencia de recombinación es del 5%, el diagnósticoque daremos en el caso presentado en la Figura 16 seráde un 95% de probabilidad de que el feto sea normal(apartado A) y de un 5% de que el feto haya heredado elalelo de la enfermedad junto con el alelo 2 delpolimorfismo (apartado B).

Para obtener una mayor fiabilidad en el diagnóstico seutilizan varios loci polimórficos localizados a ambos ladosdel locus de la enfermedad. Con ello se consiguen evitarlas ambigüedades generadas por el entrecruzamiento.

El diagnóstico citogenético

Un número importante de las anomalías congénitas yalteraciones del desarrollo embrionario y neonatal sondebidas a cambios numéricos o estructurales de loscromosomas. El complemento cromosómico de la especiehumana consiste en 23 pares de cromosomas. Unmiembro de cada par lo hemos heredado de nuestropadre y el otro miembro de nuestra madre. Loscromosomas 1 al 22 se identifican con un número y seconocen como autosomas . Del par 23 existen doscromosomas distintos identificados con las letras X e Y y

que denominamos gonosomas o cromosomassexuales. De cada autosoma tenemos dos copias,mientras que de los gonosomas las mujeres poseen doscopias del cromosoma X y los hombres poseen una copiadel cromosoma X y otra del cromosoma Y. Elcomplemento cromosómico masculino se simboliza como46, XY y el femenino como 46, XX.

Alteraciones numéricas de los cromosomas . Lapresencia por exceso o defecto de uno o varioscromosomas tiene graves consecuencias en la viabilidady calidad de vida de un individuo. Las células somáticaspresentan un complemento diploide, es decir dos copiasde cada cromosoma, mientras que las células germinalespresentan un complemento haploide, es decir una solacopia de cada cromosoma. El exceso de todo elcomplemento cromosómico o poliploidía es incompatiblecon la vida y los casos documentados provienen delestudio de abortos en primeras etapas del desarrollo. Sehan documentado poliploidías en mosaico , individuoscon células diploides y células poliploides. La extensióndel mosaico poliploide determinará la viabilidad o no delindividuo.Mucho más frecuentes son las anomalías numéricas queafectan a uno o pocos cromosomas. En este casohablamos de somías cuando existe un exceso o defectode un determinado cromosoma. Las gonosomías, esdecir la presencia en exceso o defecto de un cromosomasexual (cromosomas X o Y), suelen ser la causa másfrecuente de abortos espontáneos. Sin embargo, suviabilidad post-parto es significativamente alta. Sonejemplos de gonosomías la monosomía (una sola copia)del cromosoma X conocida como Síndrome de Turner ,(cuyo complemento cromosómico es 45, X) y la disomía(dos copias) del cromosoma X con presencia del Y oSíndrome de Klinefelter (cuyo complemento cromosómicoes 47, XXY).La viabilidad de los individuos con autosomías(presencia en exceso o defecto de un determinadoautosoma) es muy baja y para determinados cromosomastan solo se han descrito en tejidos extraembrionarios oabortos espontáneos. Solo para algunos de loscromosomas de pequeño tamaño la incidencia de dichaalteración es significativa. Son ejemplos de ello lastrisomías (presencia de tres copias) de los cromosomas13 (Síndrome de Patau ), 18 ( Síndrome de Edwards ) y 21

Figura 16.- Diagnóstico indirecto de una enfermedadautosómica dominante. En A el locus del polimorfismo y el dela enfermedad no presentan recombinación. En B, el feto endesarrollo presenta un cromosoma materno en el cual se hadado un evento de recombinación (flechas) durante lameiosis de la madre.


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(Síndrome de Down). La trisomía 21 es una de lasalteraciones cromosómicas más frecuentes en reciénnacidos.La causa más frecuente de las somías son los errores enla distribución de los cromosomas durante la divisióncelular (meiosis) que da lugar a los gametos masculino(espermatozoide) y femenino (óvulo).

Alteraciones estructurales de los cromosomas.Distinguimos dos grandes tipos de cambios estructuralesen los cromosomas, las reorganizaciones cromosómicascomo las translocaciones (intercambio de material entrecromosomas) y las inversiones (reordenación porinversión de grandes fragmentos de un cromosoma) y lasdeleciones (perdidas) o duplicaciones (ganancias) dematerial cromosómico. Si el cambio estructural nocomporta ni perdida ni ganancia de material cromosómicodiremos que está balanceado o equilibrado y ennumerosas ocasiones puede pasar desapercibido en unindividuo afecto. La viabilidad será mucho menor cuandoel cambio estructural de lugar a una perdida o gananciade material cromosómico.

Estratégias y pocedimientos en el diagnósticocitogenético.La naturaleza de los cambios que afectan a loscromosomas determinan dos grandes tipos de estrategiasde diagnóstico, las que pretenden determinar si el númerode cromosomas difiere del normal y las diseñadas paradetectar variaciones en la estructura de los cromosomas.

Los cromosomas solo pueden ser observados almicroscopio óptico durante el proceso de la divisióncelular (mitosis o meiosis) ya que en la interfase (periodoentre dos divisiones celulares) el ADN de los cromosomasestá descondensado y no es posible su observación. Asípues, para observar cromosomas y poder realizar unrecuento de los mismos es necesario trabajar con célulascultivadas y en división. Para la observación decromosomas de individuos adultos, la fuente más comúnde células consiste en el cultivo de células nucleadas desangre periférica en presencia de drogas mitogénicas(inductoras de la división celular). Cuando se pretendeobservar cromosomas de fetos en desarrollo las célulasobtenidas mediante biopsia de las vellosidades coriónicaso bien del líquido amniótico pueden ser cultivadasdirectamente en medio adecuado. Tras la incubación a37ºC durante 48-72h los cultivos son tratados concolchicina con el objeto de parar la mitosis en la etapade metafase, en la cual los cromosomas adquieren sumáximo estado de condensación. Seguidamente se

obtienen los núcleos que se depositan en un portaobjetospara su posterior tinción y observación al microscopio.

Existen distintos protocolos de tinción de cromosomas. Elcolorante más utilizado es el GIEMSA, que permiteobtener una tinción azulada y homogénea de loscromosomas. En combinación con otros reactivos comopor ejemplo la tripsina (enzima proteolítico) la coloracióncon GIEMSA permite la observación de patrones debandas definidos y característicos de cada cromosoma(Bandas G). La tinción homogénea solo es útil paradeterminar el número total de cromosomas sin que seaposible la identificación de cada uno de ellos. Con latinción mediante bandas es posible tanto el recuentocomo la identificación inequívoca de los cromosomas. Asímismo, la técnica de bandas permite identificarreorganizaciones cromosómicas como las translocacioneso las inversiones.

La preparación de cromosomas observada en elmicroscopio recibe el nombre de cariotipo. En la Figura17 se muestra el cariotipo de un paciente obtenidomediante la tinción de Bandas G. Tras el recuentocromosómico de varias preparaciones de cromosomas dedicho paciente se observa la falta de un cromosoma. Laobservación del patrón especifico de bandas G permitenconcluir que el cromosoma en defecto es el X. Eldiagnóstico será pues de monosomia para el cromosomaX o Síndrome de Turner.

El diagnóstico molecular en citogénéticaEl campo de la citogenética ha experimentado un avanceespectacular con la aplicación de técnicas de análisismolecular a la observación de cariotipos. La utilización desondas (secuencias de ADN) marcadas con fluorescencia(Técnica FISH ) permite en la actualidad la detección de“cromosomas” en interfase (Figura 18). Con esta técnicano es necesario trabajar con células en cultivo ni esperarvarios días para obtener un resultado. Así mismo, lasreorganizaciones cromosómicas pueden ser observadasy caracterizadas de forma muy precisa (Figura 19) .

La dimensión social del diagnóstico genético

No quisiera finalizar esta revisión sin abordar algunos delos aspectos ético-sociales que acompañan al diagnósticogenético. En la introducción se enumeraron algunas delas características distintivas de este tipo de diagnósticorespecto al diagnóstico convencional. Las diferencias noson de índole metodológica o tecnológica, dado que enlos distintos ámbitos de la biomedicina la complejidadtecnológica es similar, sino que estas radican en el ámbitode sus implicaciones ético-sociales. Desearía destacaralgunos de los aspectos más significativos de estadimensión ético-social.

Figura 17. Cariotipo por bandas G de un paciente de sexofemenino. Ver explicación en el texto.

Cr. 18

Cr. X

Cr. Y Cr. 21

Cr. 18

Figura 18. FISH en interfase. Marcaje de núcleos en interfasemediante sondas fluorescentes. a) Determinación del sexo.Sondas específicas de los cromosomas 18 (azul), X (verde) eY (rojo). b) Detección trisomia cromosoma 21. Sondas de loscromosomas 18 (verde) y 21 (rojo).

a b


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El primero se refiere a la relación que seestablece entre el paciente y su familia.Todo diagnóstico genera en el pacienteuna tensión que se resuelve en unsentido positivo o negativo según sea elresultado. El diagnóstico genético nosolo genera tensión en el propositussino que toda su familia se ve implicadaen él. Esta implicación no es solo deíndole solidaria, la tensión en la familiaobedece a una reacción primaria alverse directamente implicados en lapatología como potencialmenteafectados. Es por ello que el genetistadebe considerar a la familia como launidad de diagnóstico y aliviar mediantela adecuada información, la angustia yla tensión que el diagnóstico puedagenerar.

El segundo aspecto hace referencia a lacomponente predictiva del diagnósticogenético. Sin duda alguna la fatalidadque acompaña al diagnostico positivo deuna enfermedad hereditaria no tieneparangón en otras disciplinas médicas.Ello es así, porque en la actualidad lamayoría de las enfermedadeshereditarias carecen de una terapiacurativa. Cuando en una familia sediagnóstica un hijo con fibrosis quísticano solo se esta dando una predicciónsobre la progresión clínica del paciente en un futuropróximo, sino que además se esta asignando a la familiauna predicción sobre futuros embarazos. Así mismo,cuando uno de los miembros de una familia esdiagnosticado como afecto de una enfermedad hereditariade manifestación tardía, los miembros jóvenes de lafamilia reciben una carga de angustia y tensión. Unejemplo de esta situación lo tenemos en el diagnóstico dela enfermedad de Huntington. ¿Querrán los miembros dela familia saber cual es el diagnóstico del propositus?¿Desearán los familiares asintomáticos ser sometidos aun diagnóstico? Estas y otras cuestiones se podránplantear y la respuesta no es obvia.

La determinación de los factores de riesgo y el estudio dela predisposición o susceptibilidad genética es uno de loscampos de futura aplicación del diagnostico genético. Sinduda alguna esto comportará grandes beneficios medico-sociales, al facilitar la medicina preventiva enenfermedades como la diabetes, la hipertensión, lasenfermedades cardiovasculares u otras de caráctermultifactorial, que tienen una gran prevalencia en nuestrapoblación. Sin embargo, todo lo positivo que comportaeste tipo de estudios puede verse truncado por una malautilización de la información obtenida.

No se debe asignar rango de infalibilidad a unainformación de tipo probabilístico. La probabilidad depadecer la enfermedad de Alzheimer se incrementa en unfactor de 8 en los individuos homozigotos para el aleloAPO-e4, pero ello no implica que un individuo homozigotopara dichos alelos vaya a manifestar inexorablemente laenfermedad. Los factores ambientales, la historia naturalde cada individuo, y el fondo genético tienen un papelmuy importante en la manifestación fenotípica de uncarácter. Resulta curioso constatar que en la actualidad

los más acérrimos defensores del papel del ambiente enla ecuación: fenotipo = genotipo + ambiente, sean losgenetistas.

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Figura 19. Detección de una inversión pericéntrica (icluye al centrómero)del cromosoma 4 (46,XX, inv(4) (p15q12). Se utiliza una sonda del brazocorto del cromosoma 4 (4p) marcada con rodamina (rojo) y una sondaproximal (cercana al centrómero) del brazo largo del mismo cromosomamarcada con fluoresceína (verde). a) tinción de contraste con DAPI. b)marcaje con la sonda 4p. c) marcaje con la sonda 4q proximal. d) marcajecon ambas sondas al unísono. e) representación esquemática del resultadoobtenido.

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