EKSPERIMENTALNA BIOKEMIJA - bf.uni-lj.si · Abram V., Cigić B., Poklar Ulrih N., Skrt M....

Univerza v Ljubljani Biotehniška fakulteta Oddelek za živilstvo

EKSPERIMENTALNA

BIOKEMIJA

za študente biotehnologije in živilske tehnologije

Veronika Abram Blaž Cigić

Nataša Poklar Ulrih Mihaela Skrt

Ljubljana, 2006

Abram V., Cigić B., Poklar Ulrih N., Skrt M. Eksperimentalna biokemija: za študente biotehnologije in živilske tehnologije Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2006

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

EKSPERIMENTALNA BIOKEMIJA

za študente biotehnologije in živilske tehnologije

Veronika Abram, Blaž Cigić, Nataša Poklar Ulrih, Mihaela Skrt

Ljubljana, 2006


Recenzenti: prof. dr. Metka Renko prof. dr. Marija Žakelj-Mavrič Kraj: Ljubljana Izdajatelj: Univerza v Ljubljani

Biotehniška fakulteta Oddelek za živilstvo

Tisk: Tiskarna Pleško d.o.o. Rožna dolina c.IV/32-34 1000 Ljubljana

Naklada: 200 izvodov Vse pravice pridržane. Ponatis (grafični, elektronski ali mehanski, vključno z razmnoževanjem, snemanjem ali prenosom v baze podatkov) celote ali posameznih delov ni dovoljen brez pisnega soglasja nosilca avtorskih pravic.

CIP - Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana 577.1(075.8)(076.5) EKSPERIMENTALNA biokemija : za študente biotehnologije in živilske tehnologije / Veronika Abram ... [et al.]. - Ljubljana : Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2006 ISBN 961-6333-43-7 1. Abram, Veronika 225211136


KAZALO 1. Struktura proteinov 1

1.1 Splošen uvod 1 1.1.1 Aminokisline 1

1.1.1.1 Lastnosti aminokislin 1 1.1.1.2 Določevanje aminokislinske sestave 5

1.1.2 Proteini 6 1.1.2.1 Primarna struktura 6 1.1.2.2 Sekundarna struktura 8

1.1.2.3 Terciarna struktura 10 1.1.2.4 Kvartarna struktura 11 1.1.2.5 Določevanje višjih ravni strukturne organiziranosti proteinov 11

1.2 Eksperimentalno delo 13 1.2.1 Namen vaje 13

1.2.2 Osnove 13 1.2.3 Izvedba 14 2 Določanje koncentracije proteinov 18

2.1 Splošen uvod 18 2.1.1 Absorpcija svetlobe 18

2.1.1.1 Absorpcija organskih molekul 18 2.1.1.2 Absorpcija s prenosom naboja (Charge-transfer absorbtion) 18

2.1.1.3 Relaksacijski proces (znižanje energije vzbujenega stanja) 19 2.1.2 Beer –Lambertov zakon 19

2.1.3 Spektrofotometer 21 2.1.4 Spektrofotometrične metode za določanje koncentracije proteinov 21

2.1.4.1 Posredne, kolorimetrične metode določanja koncentracije proteinov 21 2.1.4.1.1 Biuretska metoda 22

2.1.4.1.2 Bradfordova metoda 22 2.1.4.1.3 Lowryjeva metoda 23 2.1.4.1.4 Metoda z bikinhonsko kislino (BCA) 24

2.1.4.2 Določanje koncentracije proteinov z UV absorpcijsko spektroskopijo 24 2.2 Eksperimentalno delo 26

2.2.1 Namen vaje 26 2.2.2 Osnove 27 2.2.3 Izvedba 28

2.2.3.1 Biuretska reakcija 28 2.2.3.1 Merjenje absorbance pri 280 nm 28

2.2.4 Rezultati 28 2.2.4.1 Biuretska reakcija 28 2.2.4.2 Merjenje absorbance pri 280 nm 29


3 Vpliv pH, temperature in kofaktorjev na aktivnost α-amilaze 31 3.1 Splošen uvod 31

3.1.1 Encimi 31 3.1.2 Kako definiramo in izmerimo hitrost encimsko katalizirane reakcije 32 3.1.3 Vpliv temperature na hitrost encimsko kataliziranih reakcij 33 3.1.4 Vpliv pH na hitrost encimsko kataliziranih reakcij 35 3.1.5 Vpliv kofaktorjev in aktivatorjev na aktivnost encimov 36

3.2 Eksperimentalno delo 36 3.2.1 Namen vaje 36 3.2.2 Osnove 36 3.2.3 Izvedba 37 3.2.4 Rezultati 38

4 KM kisle fosfataze 41

4.1 Splošen uvod 41 4.1.1. Izpeljava Michaelis-Mentenove enačbe 41

4.1.2. Razlaga in pomen parametrov KM, Vmax in kcat/KM. 44 4.2 Eksperimentalno delo 47

4.2.1 Namen vaje 47 4.2.2 Osnove 47 4.2.3 Izvedba 48

4.2.4 Rezultati 50 5 Kvantitativno določanje glikogena v živalskih tkivih 52

5.1 Splošen uvod 52 5.1.1 Struktura in funkcija glikogena 52 5.1.2 Metabolizem glikogena 53

5.2 Eksperimentalno delo 54 5.2.1 Namen vaje 54 5.2.2 Osnove 54

5.2.3 Izvedba 55 5.2.4 Rezultati 56

6 Izolacija in karakterizacija molekul DNA 59

6.1 Splošen uvod 59 6.1.1 Struktura molekul DNA 60 6.1.2 Stabilnost molekul DNA 63 6.1.3 Postopki izolacije molekul DNA 63

6.1.3.1 Sproščanje DNA iz celic 64 6.1.3.2 Deproteinizacija DNA 64 6.1.3.3 Obarjanje DNA 64

6.2 Eksperimentalno delo 65 6.2.1 Namen vaje 65 6.2.2 Uvod 65 6.2.3 Izvedba 65

6.2.3.1 Izolacija DNA 65 6.2.3.2 Denaturacija DNA 66

6.2.4 Rezultati 66


7 Izolacija kisle fosfataze iz pšeničnih kalčkov 69 7.1 Splošen uvod 69

7.1.1 Detekcija proteinov 69 7.1.2 Vir proteina 69 7.1.3 Homogenizacija 70 7.1.4 Stabilizacija homogenata 70 7.1.5 Obarjanje proteinov 71

7.1.5.1 Obarjanje proteinov z veliko ionsko jakostjo 71 7.1.5.2 Obarjanje proteinov z organskimi topili 72 7.1.5.3 Obarjanje proteinov v izoelektrični točki 72 7.1.5.4 Ireverzibilno obarjanje proteinov 73

7.1.6 Centrifugiranje 73 8.1.7 Koncentriranje in razsoljevanje raztopin proteinov 74

7.2 Eksperimentalno delo 75 7.2.1 Namen vaje 75 7.2.2 Uvod 75 7.2.3 Izvedba 76 7.2.4 Rezultati 78

8 Kromatografija 81 8.1 Splošen uvod 81

8.1.1 Gelska filtracija 81 8.1.1.1 Princip gelske filtracije 81 8.1.1.2 Parametri kromatografske separacije 82 8.1.1.3 Gelska filtracija proteinov 83

8.1.2 Ionska izmenjevalna kromatografija 83 8.1.3 Afinitetna kromatografija 85 8.1.4 Hidrofobna interakcijska kromatografija 85 8.1.5 Kromatografija z reverzno fazo 86

8.2 Eksperimentalno delo 86 8.2.1 Namen vaje 86 8.2.2 Osnove 86 8.2.2 Izvedba 86 8.2.4 Rezultati 88

9 Stabilnost proteinov 90 9.1 Splošen uvod 90

9.1.1 Ravnotežje med nativnim in denaturiranim stanjem 90 9.1.2 Določevanje razmerja med nativnim in denaturiranim stanjem 91

9.2 Eksperimentalno delo 94 9.2.1 Namen vaje 94 9.2.2 Osnove 94 9.2.3 Izvedba 95

9.2.3.1 Priprava proteina za denaturacijo 95 9.2.3.2 Merjenje fluorescence aromatskih aminokislin 95

9.2.4 Rezultati 95 9.2.4.1 Fluorescenca pri 380 nm 95 9.2.4.2 Fluorescenčni maksimum 96


10 Elektroforeza 99

10.1 Splošen uvod 99 10.1.2 Gelska elektroforeza 99

10.1.2.1 Agarozna elektroforeza 100 10.1.2.2 Poliakrilamidna gelska elektroforeza 101

10.1.2.2.1 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti NaDS 102 10.1.2.2.2 Nativna poliakrilamidna gelska elektroforeza 103 10.1.2.2.3 Izoelektrično fokusiranje 104 10.1.2.2.4 Dvodimenzionalna ali 2-D elektroforeza 104

10.1.3 Detekcija vzorcev po elektroforezi 104 10.1.3.1 Barvanje z barvilom Coomassie Brilliant Blue 105 10.1.3.2 Barvanje s srebrom 105 10.1.3.3 Barvanje s fluorescenčnimi barvili 105 10.1.3.4 Reverzibilno barvanje proteinov v poliakrilamidnih gelih z Zn2+ 106 10.1.3.5 Imunodetekcija proteinov ločenih na poliakrilamidnih gelih 106

10.2 Eksperimentalno delo 106 10.2.1 Namen vaje 106 10.2.2 Izvedba 106 10.2.3 Rezultati 107

11 Literatura 111

Abram V., Cigić B., Poklar Ulrih N., Skrt M. Eksperimentalna biokemija: za študente biotehnologije in živilske tehnologijeLjubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2006 1

1 Struktura proteinov

1.1 Splošen uvod

1.1.1 Aminokisline1.1.1.1 Lastnosti aminokislinAminokisline so osnovni gradniki proteinov. Vsi proteini so sestavljeni iz aminokislin, ki sokovalentno povezane s peptidnimi vezmi. V naravi najdemo več sto različnih aminokislin; toso organske spojine, ki imajo v svoji strukturi vsaj eno karboksilno skupino (organska kislina)in vsaj eno aminsko skupino (organska baza). Število aminokislin, ki sestavljajo proteine, jedejansko precej manjše. V pričujočem pregledu se bomo omejili le na 20 aminokislin, ki sokodirane v genetskem kodu vseh organizmov. Te aminokisline, ki jih imenujemo tudistandardne aminokisline, imajo neke skupne značilnosti.Vse so -aminokisline, kar pomeni, da sta na določen C-atom, ki ga imenujemo tudi centralniali -ogljikov atom, vezani tako aminska skupina, kakor tudi karboksilna skupina (slika 1.1).

Slika 1.1: Prostorski prikaz razporeditve skupin okoli kiralnega, centralnega C-atoma -aminokisline.

Z izjemo glicina (R = H) so na tetraedrični α-ogljikov atom preostalih standardnihaminokislin vezani štirje različni atomi oz. skupine, kar pomeni, da predstavlja α-ogljikkiralni center. Posledica tega je obstoj dveh stereoizomerov (enantiomerov), imenovanih D- inL- aminokislini. Izomera sta zrcalni sliki in sučeta ravnino linearno polarizirane svetlobe vnasprotno smer. Čeprav so v naravi poznani tako D- kot L- izomeri aminokislin, se v proteine,kot gradbene enote, vgrajujejo le L- izomeri.Za vse aminokisline razen prolina, ki ima na -ogljikov atom vezano sekundarno aminskoskupino, ki je del petčlenskega obroča, velja, da imajo na -ogljikov atom vezano primarnoaminsko skupino.pK1 vrednosti karboksilne skupine na -ogljikovem atomu različnih aminokislin se nahajajo vobmočju med pH 1,8 do 2,4, pK2 vrednosti aminske skupine na -ogljikovem atomu pa vobmočju od 8,2 do 11,0. To pomeni, da so pri fiziološkem pH vse aminokisline v ioniziraniobliki, saj imajo na α-ogljikovem atomu protonirano aminsko skupino ter deprotoniranokarboksilno skupino. Obliko aminokislin, ki ima istočasno negativno nabito karboksilnoskupino in protonirano aminsko skupino, imenujemo ion dvojček (zwitterion).

CR

COOHH3N

+

-


Razlike med posameznimi aminokislinami so posledica različnih stranskih verig. Stranskeverige se med seboj razlikujejo po velikosti, polarnosti, naboju in kemijski reaktivnosti. Nabojna stranski verigi je pogojen s kislinsko-baznimi lastnosti (pKR) dodatne aminske alikarboksilne skupine. Glede na določene strukturne značilnosti stranske verige lahkoaminokisline razdelimo v več skupin. Vrednosti za pKR in pI so povzete po “Principles ofBiochemistry” (Lehninger, 2005).

Preglednica 1.1: Razdelitev aminokislin v skupine

Aminokislina Strukturna formula Relativnamolekulskamasa, Mr

pKRstranskaveriga

pI

aminokisline z nepolarnimi stranskimi verigami

glicinGlyG

75 / 6,0

alaninAlaA

89 / 6,0

valinValV

117 / 6,0

levcinLeuL

131 / 6,0

izolevcinIleI

131 / 6,0

prolinProP

115 / 6,5

H C

NH3+

COO

H

CH3 C

NH3+

COO

H

CH C

NH3+

COO

H

CH3

CH3

CH2 C

NH3+

COO

HCH

CH3

CH3

CH C

NH3+

COO

HCH2CH3

CH3

CH2

CH2

CH2 NH2

+C COO

H


Nadaljevanje Preglednice 1.1: Razdelitev aminokislin v skupine


pKRstranskaveriga

pI

metioninMetM

149 / 5,7

fenilalaninPheF

165 / 5,5

triptofanTrpW

204 / 5,9

aminokisline s polarnimi, nenabitimi stranskimiverigami pri fiziološkem pH

serinSerS

105 / 5,7

cisteinCysC

121 8,2 5,0

treoninThrT

119 / 6,5

tirozinTyrY

181 10,1 5,7

CH2 C

NH3+

COO

H

NH

CH

C CH2 C

NH3+

COO

H

CH2 C

NH3+

COO

HOH

CH2 C

NH3+

COO

HSH

CH C

NH3+

COO

HCH3

OH

CH2 C

NH3+

COO

HOH

CH2 C

NH3+

COO

HCH2SCH3


Nadaljevanje Preglednice 1.1: Razdelitev aminokislin v skupine


pKRstranskaveriga

pI

asparaginAsnN

132 / 5,4

glutaminGlnQ

146 / 5,7

aminokisline s polarnimi, nabitimi stranskimiverigami pri fiziološkem pH

aspartatAspD 133 3,7 2,8

glutamatGluE 147 4,3 3,2

histidinHisH 155 6,0 7,6

lizinLysK 146 10,5 9,7

argininArgR 174 12,5 10,8

CH2 C

NH3+

COO

HC

NH2

O

CH2 C

NH3+

COO

HCH2C

NH2

O

CH2 C

NH3+

COO

HC

O

O

CH2 C

NH3+

COO

HCH2C

O

O

CH

NH+

CH

NH

C

NH3+

COO

HCH2

CH2 C

NH3+

COO

HCH2CH2CH2NH3+

CH2 C

NH3+

COO

HCH2CH2NHC

NH2

NH2+


Skupina I: aminokisline z nepolarnimi stranskimi verigamiV to skupino aminokislin uvrščamo naslednje aminokisline: glicin, alanin, valin, levcin,izolevcin, prolin, fenilalanin, metionin in triptofan. Alifatske ali aromatske stranske verige, kijim dajejo hidrofobni značaj, kemijsko niso posebno reaktivne. Za takšne aminokisline jeznačilno, da jih v proteinih, ki se v vodnih raztopinah zvijejo v točno določenotridimenzionalno strukturo, najpogosteje najdemo v njihovi notranjosti. Izjema gledepolarnosti sta delno glicin, ki nima alkilne ali aromatske stranske verige in je zato precejpolaren in zelo dobro topen v vodi, ter prolin, ki je zaradi togosti strukture mnogokrat namestih, kjer se polipeptidna veriga ukrivlja in je pogostokrat v polarnem okolju.

Skupina II: aminokisline s polarnimi, nenabitimi stranskimi verigami pri fiziološkem pHAminokisline, ki jih uvrščamo v drugo skupino so: serin, cistein, treonin, tirozin, asparagin inglutamin. Podrobnejši vpogled v njihove stranske verige nam razkrije širok spekterfunkcionalnih skupin. Njihova skupna značilnost je prisotnost heteroatoma (N, O ali S), ki ssvojim elektronskim parom omogoča nastanek vodikovih vezi z vodo ali s katero drugomolekulo. Tirozin je kljub polarni OH-skupini, zaradi aromatskega obroča relativno nepolarnaaminokislina, in je v vodi slabo topna, tako da bi jo lahko uvrstili tudi v prvo skupino. Doneke mere je izjema tudi aminokislina cistein, ki ima polarno SH skupino. Dva cisteina pamnogokrat tvorita disulfidno vez, ki prispeva k stabilizaciji proteina. Po takšni povezavi sepolarni značaj zelo zmanjša in z disulfidnim mostičkom povezana cisteina sta pogostokrat vnepolarni notranjosti proteina.

Skupina III: aminokisline s polarnimi, nabitimi stranskimi verigami pri fiziološkem pHAspartat, glutamat, histidin, lizin in arginin so aminokisline, ki jih uvrščamo v tretjo skupinoaminokislin. Njihove stranske verige imajo funkcionalne skupine s kislimi ali bazičnimilastnostmi. Pri fiziološkem pH bodo aminokisline, ki imajo dodatno karboksilno skupino(aspartat, glutamat), negativno nabite, saj bo ena molekula vsebovala eno protoniranoaminsko skupino in dve negativno nabiti karboksilni skupini. Obratno velja za lizin in arginin,ki sta pri teh pogojih pozitivno nabita. Na eno negativno nabito karboksilno skupino pridetadve protonirani aminski skupini. Imidazol, ki je sestavni del stranske skupine histidina in imapKR vrednost blizu fiziološkega pH, se v razmerah in vivo lahko nahaja v dveh ionskihoblikah. Pri fiziološkem pH bo prevladoval ion dvojček.

1.1.1.2 Določevanje aminokislinske sestavePoznavanje aminokislinske sestave določenega proteinskega vzorca je informacija, ki jepomembna tako z bazičnega kot tudi aplikativnega stališča. Iz aminokislinske sestave lahkodelno že sklepamo o lastnostih in strukturi proteinov, v večji meri pa na lastnosti manjšihpeptidov.Danes je določevanje aminokislinske sestave skoraj popolnoma avtomatiziran proces. Ročnopoteka le prvi del, ko je potrebno protein (ali zmes proteinov) z neznano sestavo hidrolizirati(pride do razcepa peptidnih vezi) v 6 mol/L HCl. Sama hidroliza poteka pri povišani


temperaturi (100o – 120oC) in v inertni atmosferi od 10 do 100 ur, odvisno od tega katereaminokisline želimo še posebej natančno določiti. Za določitev triptofana, ki se v 6mol/L HCl razgradi, je potrebno hidrolizo izvesti v močno alkalnem mediju.Po končani hidrolizi (imamo zmes aminokislin) je potrebno le te na določen načinmodificirati. Modifikacija je nujna zato, da v strukturo aminokisline vključimo nek kromofor(merimo absorbanco) ali fluorofor (merimo fluorescenco), ki nam bo po separacijiaminokislin olajšal njihovo detekcijo. Separacija modificiranih aminokislin največkrat potekana HPLC sistemu z uporabo ionsko izmenjevalne ali hidrofobne kromatografije. Posamezneaminokisline identificiramo s primerjavo retencijskih časov derivatov znanih aminokislin, skaterimi kolono predhodno umerimo. Z najbolj občutljivimi instrumenti je danes moč določitiaminokislinsko sestavo, če so posamezne aminokisline prisotne v pikomolarnih (pmol = 10-12

mol) količinah. V določenih primerih lahko pripravimo tudi hlapne derivate, ki jih natoanaliziramo s plinsko kromatografijo.

1.1.2 Proteini1.1.2.1 Primarna strukturaAminokisline v proteinih so povezane s peptidno vezjo (slika 1.2). Peptidna vez se tvori medaminsko skupino ene aminokisline in karboksilno skupino druge aminokisline. Pripovezovanju dveh aminokislin nastane dipeptid in molekula vode. Nastali dipeptid se lahkopoveže z novo aminokislino v tripeptid in tako naprej do dekapeptida. Produkte kovalentnegapovezovanja od 10 do 100 aminokislin imenujemo polipeptidi, polimere z nad 100 kovalentnopovezanimi aminokislinami pa proteini. V pogojih in vivo je proces biosinteze proteinov,kakor tudi njihove razgradnje, natančno reguliran. O tem si lahko več prebereš v različnihknjigah s področja biokemije in molekularne biologije. Poznavanje aminokislinskegazaporedja proteinov in peptidov je zelo pomembno, saj lahko iz pridobljenega podatkamnogokrat sklepamo o biološki funkciji proteina ter evolucijskem razvoju in povezanosti zdrugimi proteini.

Slika 1.2: Povezava dveh aminokislin s peptidno vezjo.

Kako določamo aminokislinsko zaporedje proteinov? Če je pri določevanju aminokislinskesestave potrebno protein na začetku popolnoma hidrolizirati, to ne velja za določevanjeaminokislinskega zaporedja. V določenih primerih je potrebno izvesti le delno hidrolizoproteina. V ta namen uporabljajo določene peptidaze, ki katalizirajo hidrolizo peptidnih vezile za določenimi aminokislinskimi ostanki, ali cianogen bromid, ki cepi peptidno vez za

NH3+

C

R1

HC

O

ONH3

+C

R2

HC

O

O

+ NH3+

C

R1

HCO

NH

CR2

HC

O

O+ OH2

Peptidna vez


metioninom. Dobljene peptide je nato potrebno kromatografsko ločiti in jim določitiaminokislinsko zaporedje.Začeti z aminskega konca (N-konec, ki ima prosto aminsko skupino) ali s karboksilnegakonca (C-konec, ki ima prosto karboksilno skupino)? Načeloma je to vseeno, vendar jekemizem določevanja z aminskega konca manj zahteven, tako da določevanjeaminokislinskega zaporedja danes poteka skoraj izključno z N-konca. Postopek, v katerem seizvaja cepitev samo ene aminokisline z N-konca se imenuje Edmanova razgradnja (poraziskovalcu, ki je razvil metodo) in temelji na reakciji fenilizotiocianata s prosto aminskoskupino na N-koncu proteina (slika 1.3).

Slika 1.3: Prikaz enega ciklusa Edmanove razgradnje. Derivatizacija in odcep prveaminokisline z N-konca peptida. Derivatizirano aminokislino kromatografsko identificiramo.Postopek lahko večkrat ponovimo in tako določimo zaporedje aminokislin v peptidu od N-konca do C-konca.

Pri določenih pogojih se le ta specifično veže na prosto aminsko skupino na N-koncu. Nato vrahlo kislem mediju pride do cepitve peptidne vezi med prvo aminokislino v zaporedju, ki jemodificirana, in naslednjo aminokislino. Po odcepitvi prve modificirane aminokisline se tvorifeniltiohidantoin, ki je cikličen derivat aminokisline. Le tega se potem nanese nakromatografsko kolono. S primerjavo retencijskih časov neznanega derivata aminokisline in

N C S + NH2 CH

R1CO

N CH

R3CO

HN C

H

R2CO

H

N CS

N CH

R1COH H

N CH

R3CO

HN C

H

R2CO

H

NC

CNC

OH R1

H

S+ N C

H

R3CO

HNH2 C

H

R2CO

Fenilizotiocianat

Derivatizirana N-terminalna aminokislina

Kromatografska identifikacija derivatizirane aminokisline

Derivatizacijanaslednjeaminokisline


derivatov znanih, standardnih aminokislin, je moč ugotoviti za katero aminokislino gre.Postopek derivatizacije in odcepljanje je mogoče nato večkrat ponoviti in na ta načinpridobiti informacijo o aminokislinskem zaporedju. Danes je ta postopek popolnomaavtomatiziran. V ta namen se uporablja naprava za določevanje aminokislinskega zaporedja.Pri optimalnih pogojih je mogoče narediti tudi 50 ciklusov (en ciklus = ena aminokislina,trajanje okoli 30 minut) zaporedno. Za sekvenco potrebujemo relativno malo proteina, saj jemeja detekcije v pikomolarnem območju. V zadnjem času se za določevanjeaminokislinskega zaporedja peptidov vse bolj uporablja tudi masna spektrometrija.Aminokislinsko zaporedje določenega proteina lahko izpeljemo tudi posredno iz zaporedjanukleotidov določenega gena. Tehnike za določanje zaporedij v DNA so bistveno hitrejše inbolj natančne od tehnik, s katerimi določamo zaporedje aminokislin v proteinih. Poleg tegalahko s tehnologijo rekombinantne DNA relativno enostavno in natančno pomnožimomolekule DNA, da pridobimo zadostne količine materiala za analizo. Tako danes praktično žepoznamo nukleotidno zaporedje človeškega genoma in posredno tudi odgovarjajočaaminokislinska zaporedja, tudi za tiste proteine o katerih funkciji ne vemo praktično nič.Določanje aminokislinskega zaporedja v proteinih na osnovi določenega zaporedja v DNA pavseeno ne bo nikoli popolnoma nadomestilo neposredne kemijske analize proteinov v njihoviaktivni obliki. Aminokislinsko zaporedje, ki ga izpeljemo iz nukleotidnega zaporedja, ustrezaproteinu, ki se sintetizira na osnovi genetske informacije. Pogosto pa se prvotna oblikaproteina nadalje modificira in pretvori v biološko aktivno obliko z odstranitvijo krajšihpeptidov ali z nastankom disulfidnih vezi ali pa s kemijskimi spremembami na nekaterihaminokislinskih ostankih.Lastnosti proteinov v največji meri definira tridimenzionalna struktura. Zvitje proteina vtridimenzionalno strukturo je pogojeno z aminokislinskim zaporedjem tega proteina. Sprimarno strukturo proteina je določen način zvitja proteina v strukturo, ki jo imenujemo tudinativna konformacija. Danes je poznanih že več kot 100 000 primarnih zaporedij različnihproteinov, vendar le približno 10 000 ustreznih tridimenzionalnih struktur, kar pomeni, dakljub razvijajoči se informacijski tehnologiji, zaradi kompleksnosti zgradbe proteinovpoznavanje primarne strukture ni dovolj, da bi lahko napovedali tridimenzionalno strukturonativnega proteina. Za ugotavljanje višjih ravni strukturne organiziranosti proteinov, kizajemajo prostorsko razporeditev aminokislin so na voljo različne eksperimentalne tehnike.

1.1.2.2 Sekundarna strukturaS sekundarno strukturo je definirana prostorska razporeditev s peptidno vezjo povezanihaminokislin, ki so blizu v primarni strukturi. Segmenti polipeptidne verige se pogostokratorganizirajo v določene strukturne elemente, ki so skupni vsem proteinom. Razlog zauniverzalnost tvorbe manjših urejenih segmentov je v minimumu energije, ki ga takšnaorganiziranost predstavlja. Če smo povedali, da so za primarno strukturo bistvene kovalentnepovezave aminokislin s peptidno vezjo, so za tvorbo elementov sekundarne strukture bistvenevodikove vezi med -N-H in -C=O skupinami polipeptidnega ogrodja. V proteinih stanajpogostejša elementa sekundarne strukture -vijačnica in -struktura. To, ali se bo določenaoblika sekundarne strukture tvorila, je v veliki meri odvisno tudi od interakcij med stranskimi


verigami aminokislin. Te interakcije so pomembne predvsem s stališča destabilizacijestrukture zaradi elektrostatskega odboja ali steričnih ovir.-vijačnica je valjasta struktura, kjer se polipeptidna vijačnica v desni smeri ovija okolinamišljene osi valja (slika 1.4). Zaradi zavojev se polipeptidna veriga precej skrči. Strukturostabilizirajo vodikove vezi, ki se vzpostavijo med N-H skupino aminokislinskega ostanka inC=O skupino ostanka, ki je nameščen štiri aminokislinske ostanke naprej v verigi (slika 1.4).Stranske verige štrlijo v zunanjost namišljenega valja in ne prispevajo k stabilizaciji zvodikovimi vezmi. Delež strukture, ki ustreza -vijačnici, se lahko pri različnih proteinihgiblje od nič do več kot petdeset odstotkov.

Slika 1.4: Na sliki je predstavljen peptid (vezavna domena imunoglobulina G, 1ZBD.pdb), kiima dva segmenta -vijačnice (spodaj in zgoraj). Z debelim tiskom je prikazan polipeptidniskelet, z drobnim tiskom pa stranske verige. Vidne so vodikove vezi (prekinjena črta) medvodikom amidne skupine (temno siva) in kisikovim atomom karbonilne skupine (črna).Ogljikovi atomi polipeptidnega skeleta so prikazani svetlo sivo.


Slika 1.5: Na sliki je predstavljen transmembranski protein (integralni membranski proteinporin, 1PRN.pdb), ki vsebuje samo elemente antiparalelne -strukture. Z debelim tiskom jeprikazan polipeptidni skelet, z drobnim tiskom pa stranske verige. Vidne so vodikove vezi(prekinjena črta) med vodikom amidne skupine (temno siva) in kisikovim atomom karbonilneskupine (črna). Ogljikovi atomi polipeptidnega skeleta so prikazani svetlo sivo.

V -strukturi je za razliko od -vijačnice polipeptidna veriga praktično popolnomaraztegnjena. Obstajata dve osnovni obliki -strukture, paralelna in antiparalelna.Antiparalelno -strukturo strukturo si najlažje predstavljamo tako, da iztegnjeno verigoupognemo. Del verige bo imel smer NC, drug del verige pa smer CN. Medaminokislinami polipeptidne verige, ki so si zdaj prostorsko skupaj, se vzpostavijo vodikovevezi med N-H skupinami in C=O skupinami polipeptidnega skeleta (slika 1.5). Pri paralelni-strukturi mora biti povezovalni del med segmentoma, ki se povežeta, dovolj velik, da selahko veriga obrne in imata oba enako smer polipeptidne verige.

1.1.2.3 Terciarna strukturaNativno konformacijo proteina in položaj vseh atomov polipeptidne verige v prostoruopišemo s terciarno strukturo. Če so za tvorbo elementov sekundarne strukture pomembnepredvsem vodikove vezi, so za tvorbo končne nativne konformacije proteina pomembnipraktično vsi tipi vezi. K stabilnosti vodotopnih proteinov največ prispevajo hidrofobneinterakcije med nepolarnimi stranskimi verigami aminokislin, ki se vzpostavijo v nepolarni


sredici. Nepolarne stranske verige namreč ne morejo tvoriti vodikovih vezi ali ionskihinterakcij z vodo, zato je termodinamsko najugodneje, da se ta izključi iz nepolarnega okolja.Podobni principi veljajo tudi pri tvorbi micelov v vodnih raztopinah lipidov. K stabilizacijinativne konformacije proteinov pomembno prispevajo tudi vodikove vezi med stranskimiverigami aminokislin ter ionske interakcije, posebej med nasprotno nabitimi skupinami vnotranjosti proteina, kjer bi presežek enega naboja lahko destabiliziral nativno strukturo, invan der Waalsove interakcije. Poleg številnih šibkih nekovalentnih vezi je pri določenihproteinih končna struktura stabilizirana s kovalentnimi disulfidnimi vezmi (slika 1.6). Pridisulfidni vezi se kovalentno povežeta dva cisteina, ki sta si prostorsko blizu v nativnemproteinu. V proteinih, ki nimajo cisteinov, oziroma ti niso v ugodni medsebojni poziciji, sedisulfidne vezi ne tvorijo.

Slika 1.6: Kovalentna disulfidna vez (-S-S-) se tvori med sulfhidrilnima skupinama (-SH)dveh cisteinov. Proces je encimsko kataliziran.

1.1.2.4 Kvartarna strukturaDoločen delež proteinov je sestavljen iz več polipeptidnih verig. To so oligomerni proteini.Posamezne polipeptidne verige imenujemo podenote. S kvartarno strukturo opisujemo, kakose podenote povezujejo med seboj in tvorijo oligomerne proteine. Z izrazom homotipičnastruktura opisujemo oligomerne proteine sestavljene iz enakih podenot; če so podenoterazlične, uporabljamo izraz heterotipične strukture. V povezovanje podenot so vključene ževse interakcije, ki smo jih omenili pri ravneh strukturne organiziranosti. Bistvene zapovezovanje podenot so največkrat hidrofobne interakcije, podobne tistim v notranjostizvitega proteina. V nekaterih oligomernih proteinih so podenote tudi kovalentno povezane zdisulfidnimi vezmi.

1.1.2.5 Določevanje višjih ravni strukturne organiziranosti proteinovStrukturo proteinov lahko določamo z nekaterimi spektrofotometričnimi metodami (cirkularnidikroizem, infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijo, fluorescenca), z nuklearnomagnetno resonanco in rentgensko difrakcijsko analizo.

N C CO

CH2

S

HH

SCH2

CNH H

CO

N C CO

CH2

SH

HH

SHCH2

CNH H

CO

disulfid-izomeraza


Absorpcijska spektroskopija v vidnem in UV delu spektra ni najbolj primerna za študijstrukture proteinov, saj ne moremo pridobiti niti podatkov o sekundarni strukturi. Ker staabsorpcijski maksimum in molarni absorpcijski koeficient aminokislin, ki absorbirajo vbližnjem UV delu spektra, odvisna od okolja v katerem je aminokislina, lahko to metodouporabimo za študij sprememb v strukturi proteinov.

Cirkularni dikroizemSekundarno strukturo proteinov v raztopini lahko precej bolje določimo s cirkularnimdikroizmom. Ta tehnika temelji na dejstvu, da so proteini kiralne molekule, sestavljene iz L-aminokislin in zato različno absorbirajo levo in desno cirkularno polarizirano svetlobo.Informacije o sekundarni strukturi dobimo pri valovnih dolžinah med 185 nm in 250 nm, kjerabsorbira peptidna vez. Razlika v absorbanci, ki je merjena količina, je odvisna od sekundarnestrukture proteina. Na osnovi diferencialnega spektra in primerjave s spektri proteinov zznano strukturo lahko sklepamo na delež posameznih elementov sekundarne strukture vmolekuli. Iz bližnjega UV spektra, okoli 280 nm, lahko sklepamo na okolje, v katerem senahajajo aromatske aminokisline in s tem pridobimo informacije o terciarni strukturi. Tehnikaje primerna tudi za študij stabilnosti proteinov in sprememb strukture v odvisnosti od vezaveligandov na molekulo proteina.

Infrardeča spektroskopija s Fourierjevo transformacijoZa študij sekundarne strukture proteinov se uporablja tudi infrardeča spektroskopija sFourierjevo transformacijo (FTIR). Pri tej tehniki merimo absorpcijo elektromagnetnegavalovanja v infrardečem delu spektra, ki je posledica različnih vibracijskih stanj. Tehnika seuporablja za študij interakcij in sprememb strukture proteinov ter za določevanje deleževsekundarne strukture.

FluorescencaAromatski aminokislini tirozin in triptofan, ki absorbirata v bližnjem UV območju nekaj pod300 nm, tudi oddajata del absorbirane svetlobe pri za 50 nm večjimi valovnimi dolžinami.Ta proces imenujemo fluorescenca. Valovna dolžina maksimuma emitirane svetlobe inintenziteta fluorescence, sta zelo odvisni od okolja, v katerem se nahajajo aromatskeaminokisline. Spremembe signala, ki so odvisne od spremenjenega okolja aromatskihaminokislin, so največkrat za velikostni razred večje od tistih, ki jih lahko zaznamo zmerjenjem absorbance. Aromatske aminokisline so nepolarne in največkrat v notranjostiproteina. V procesu denaturacije se izpostavijo topilu in polarnemu okolju, kar ima zaposledico premik fluorescenčnega maksimuma k večjim valovnim dolžinam in spremembo vintenziteti emitirane svetlobe. Tehnika je primerna za študij stabilnosti proteinov inmedmolekulskih interakcij. Če uporabimo različne fluorescenčne markerje (molekule, kifluorescirajo in jih kovalentno vežemo na proteine) lahko študiramo tudi okolje nekaterihdrugih aminokislin.


Jedrska magnetna resonancaNajpopolnejše podatke o strukturi proteinov lahko dobimo z jedrsko magnetno resonanco(NMR) in rentgensko difrakcijsko analizo. To sta praktično edini metodi, s katerima lahkodoločimo položaje atomov v molekuli proteinov in s tem tudi njihovo tridimenzionalnostrukturo. Z jedrsko magnetno resonanco določamo strukturo proteinov v raztopini. Tehnikatemelji na interakciji elektromagnetnega valovanja in jeder atomov z lihim številomnukleonov (protoni in nevtroni skupaj). Jedra so v odvisnosti od zgradbe molekule vrazličnem okolju, kar je osnova za razlike v signalih, ki jih dobimo kot rezultat meritve. Zobsežno računalniško analizo signalov lahko sestavimo tridimenzionalno sliko molekule,kateri želimo določiti strukturo. Prednost tehnike je ta, da določamo strukturo v naravnemokolju proteinov, v raztopini, ko so ti v aktivni obliki. Slabost pa predstavlja omejitevvelikosti, saj predstavlja določevanje strukture večjih proteinov velik problem in je povezanoz izjemno drago opremo.

Rentgenska difrakcijska analizaStrukturo večjih proteinov lahko določimo le z rentgensko difrakcijsko analizo. V temprimeru ne določamo strukture proteinov v raztopini, ampak moramo protein, ki mu želimodoločiti strukturo, kristalizirati. Priprava proteinskih kristalov je lahko dolgotrajen innepredvidljiv proces. Ko kristal proteina pripravimo, ga izpostavimo izvoru rentgenstskihžarkov. Dobljena slika je posledica uklona in sipanja X-žarkov na elektronih posameznihatomov v kristalu. Nato je potrebno z računalniško analizo uklonskih kotov in značilnegavzorca, določiti elektronsko gostoto in posredno položaj atomov v molekuli. Pri obdelavipodatkov so lahko v veliko pomoč že določene strukture podobnih proteinov.

1.2 Eksperimentalno delo

1.2.1 Namen vajeNaučil se boš uporabljati program RASWIN za prikazovanje tridimenzionalnih strukturmakromolekul. Seznanil se boš z osnovnimi strukturnimi značilnostmi proteinov in DNA terna izbranih primerih spoznal, da sta struktura in funkcija makromolekul tesno povezani.

1.2.2 OsnoveTridimenzionalno strukturo makromolekul boš študiral s programom RASWIN. Zaogledovanje in študij makromolekul je na voljo več različnih programov. VerzijaRASWIN 2.6, ki jo bomo uporabljali na vajah, je eden najenostavnejših programov in galahko uporabljaš tudi na manj zmogljivih računalnikih. Ko zaženeš program in odprešustrezno datoteko, se pojavita dve okni. Eno okno je namenjeno opazovanju strukture, drugookno pa je komandna vrstica, v kateri s posebnimi ukazi izbereš posamezne dele molekul injim spreminjaš barvo. Najpomembnejši ukazi v komandni vrstici so select XXX, colour YYY,hbonds on/off, ssbonds on/off. Z oznako XXX je mišljen ustrezen del molekule, oznaka YYY


je izbrana barva v angleščini, z ukazoma hbonds on ali ssbonds on pa rišeš vodikove, oziromadisulfidne vezi. Vsak ukaz, ki ga napišeš, je potrebno potrditi s tipko ENTER.Ukaz »select« ima najširšo uporabo, saj z njim označimo določen segment molekule. Na voljoje veliko možnosti (helix, sheet, backone, sidechain, polar, hydrophobic, cys, cys25,sulphur...), nekatere med njimi so opisane spodaj v eksperimentalnem poteku. Če hočeš npr.označiti -vijačnico, napiši »select helix« ter stisni tipko ENTER. Ko izbereš določensegment molekule, je potrebno le tega pobarvati. To narediš tako, da vtipkaš npr. “colourgreen” in stisneš ENTER.V oknu, kjer je prikazana struktura, lahko s klikanjem spreminjate način prikaza izbranegadela molekule.

1.2.3 IzvedbaPrimarna struktura in aminokislinska sestava

Odpri datoteko NEUROPEPTIDE in ravnaj tako kot je opisano spodaj. Napiši select backbone in stisni enter; pod opcijo DISPLAY klikni STICKS (Oglej sistrukturo peptida in peptidno vez, s katero se povezujejo aminokisline med seboj.). Pod opcijo OPTIONS klikni LABELS, napiši select sidechain in stisni enter, pod opcijoDISPLAY klikni BALLS&STICKS (Ugotovi iz katerih aminokislin je peptid sestavljen!Razvrsti posamezne aminokisline glede na strukturo stranske verige v naslednje razrede:nepolarne, polarne nenabite, polarne kisle in polarne bazične.).

Sekundarna struktura Pod opcijo EDIT klikni SELECT ALL, napiši hbonds on in stisni enter (Poglej si položajvodikovih vezi v molekuli. Ugotovi ali v tvorbi vodikovih vezi sodelujejo stranske verige,ali skupine polipeptidnega ogrodja! Ali so vodikove vezi urejene?).

Zapri datoteko NEUROPEPTIDE in odpri datoteko datoteko LIZOCIM. Pod opcijo COLOURS klikni MONOCHROME, napiši select helix in stisni enter, napišicolour green in stisni enter, napiši hbonds on in stisni enter, pod opcijo DISPLAY klikniRIBBONS (Ugotovi koliko -vijačnic je v proteinu! Oglej si položaj vodikovih vezi, kistabilizirajo strukturo!). Napiši select sheet in stisni enter, napiši colour yellow in stisni enter, napiši hbonds on instisni enter, pod opcijo DISPLAY klikni RIBBONS (Ugotovi koliko elementov -struktureje v proteinu! Oglej si položaj vodikovih vezi, ki stabilizirajo sekundarno strukturo.).

Disulfidne vezi Pod opcijo EDIT klikni SELECT ALL, pod opcijo DISPLAY klikni WIREFRAME, podopcijo COLOURS klikni MONOCHROME, napiši hbonds off in stisni enter, napiši selectcys in stisni enter, napiši colour red in stisni enter, napiši select sulphur in stisni enter, napišicolour yellow in stisni enter, napiši ssbonds on in stisni enter, pod opcijo DISPLAY klikni


BALLS&STICKS (Ugotovi med katerimi aminokislinami se tvorijo disulfidne vezi! Kolikoje disulfidnih vezi v molekuli? Katera aminokislina poleg cisteina ima v svoji strukturižveplo?).

Lastnosti zvitja vodotopnih in membranskih proteinovZapri datoteko LIZOCIM in odpri datoteko PRION Pod opcijo COLOURS klikni MONOCHROME, napiši select polar in stisni enter, napišicolour blue in klikni enter, pod opcijo DISPLAY klikni SPACEFILL (Oglej si razporeditevpolarnih aminokislin. Ali so te bolj v notranjosti ali na površini proteina?). napiši select hydrophobic in stisni enter, napiši colour red in klikni enter, pod opcijoDISPLAY klikni SPACEFILL (Oglej si razporeditev nepolarnih aminokislin. Ali so te bolj vnotranjosti ali na površini proteina?).

Zapri datoteko PRION in odpri datoteko PORIN Pod opcijo COLOURS klikni MONOCHROME, napiši select polar in stisni enter, napišicolour blue in klikni enter, pod opcijo DISPLAY klikni SPACEFILL, napiši selecthydrophobic in stisni enter, napiši colour red in klikni enter, pod opcijo DISPLAY klikniSPACEFILL (Oglej si razporeditev polarnih in nepolarnih aminokislin! Kakšna je polarnostaminokislin, ki so na zunanjem obodu molekule? Kakšna je polarnost aminokislin, ki so vnotranjosti pore?).

Oligomerni proteiniZapri datoteko PORIN in odpri datoteko ANTIBODY Pod opcijo OPTIONS klikni HETERO ATOMS, pod opcijo COLOUR klikni CHAIN,napiši select sulphur in stisni enter, napiši colour yellow in stisni enter, pod opcijoDISPLAY klikni SPACEFILL (Iz koliko polipeptidnih verig je sestavljena ta molekula? Aliso verige kovalentno povezane? Kakšna je funkcija protiteles v organizmu?).

Zapri datoteko ANTIBODY in odpri datoteko UREAZA Pod opcijo COLOUR klikni CHAIN, napiši select sulphur in stisni enter, napiši colouryellow in stisni enter, pod opcijo DISPLAY klikni SPACEFILL (Iz koliko polipeptidnihverig je sestavljena ta molekula? Ali so verige kovalentno povezane?).

Prostetične skupineZapri datoteko UREAZA in odpri datoteko MIOGLOBIN Pod opcijo COLOURS klikni MONOCHROME, napiši select hetero in stisni enter, podopcijo COLOUR klikni CPK, pod opcijo DISPLAY klikni STICKS, napiši select iron instisni enter, pod opcijo COLOUR klikni CPK, pod opcijo DISPLAY klikni SPACEFILL,napiši select his64 in stisni enter, pod opcijo COLOUR klikni CPK, pod opcijo DISPLAYklikni STICKS, napiši select his93 in stisni enter, pod opcijo COLOUR klikni CPK, podopcijo DISPLAY klikni STICKS (Oglej si strukturo molekule! Kakšno funkcijo ima taprotein v organizmu? Kako je koordiniran železov ion? Kam se veže kisik?).


Aktivno mesto encimaZapri datoteko MIOGLOB in odpri datoteko KATEPSIN H Pod opcijo OPTIONS klikni HETERO ATOMS, pod opcijo COLOUR klikni CHAIN,napiši select thr83 in stisni enter, pod opcijo COLOUR klikni CPK, pod opcijo DISPLAYklikni STICKS, napiši select cys25 in stisni enter, pod opcijo COLOUR klikni CPK, podopcijo DISPLAY klikni STICKS (Oglej si aktivno mesto encima. Encim je aminopeptidza inkatalizira razcep peptidne vezi med prvo in drugo aminokislino na N-koncu proteinov.Razmisli kakšno vlogo ima pri tem manjša veriga.).

Vezava proteinov na molekulo DNAZapri datoteko KATEPSIN H in odpri datoteko 3CRO pod opcijo DISPLAY klikni WIREFRAME, pod opcijo COLOUR klikniMONOCHROME, napiši select dna in stisni enter, napiši hbonds on in stisni enter, podopcijo COLOUR klikni CPK, pod opcijo DISPLAY klikni STICKS (Oglej si kako jesestavljena molekula DNA. Kako je sestavljeno ogrodje posamezne verige? Kateri strukturnielementi so vključeni v povezovanje posameznih verig? Kako so verige povezane?). napiši select at in stisni enter, napiši colour green in stisni enter, napiši select cg in stisnienter, napiši colour yellow in stisni enter (Koliko vodikovih vezi je med adeninom intiminom? Koliko vodikovih vezi je med gvaninom in citozinom?). napiši select acidic in stisni enter, napiši colour blue in stisni enter, pod opcijo DISPLAYklikni STICKS, napiši select basic in stisni enter, napiši colour red in stisni enter, pod opcijoDISPLAY klikni STICKS (Kakšen naboj ima molekula DNA? Kakšen naboj imajoaminokisline, ki so v stiku z molekulo DNA?).

Oprema in programi Potrebuješ računalnik z operacijskim sistemom WINDOWS 95 ali več. Program RASWIN, ki ga uporabljaš na vaji, si lahko naložiš na stranihttp://www.umass.edu/microbio/rasmol/getras.htm#raswin. Na isti strani lahko najdeš tudiustrezne HELP datoteke. Na voljo je še mnogo drugih programov za opazovanje tridimenzionalnih struktur.Povezave do nekaterih lahko najdeš na strani http://www.rcsb.org/pdb/software-list.html#Modeling. Ustrezne datoteke v pdb. formatu lahko dobiš na strani http://www.rcsb.org/pdb.Strukture posameznih proteinov lahko iščeš po ključnih besedah in mnogih drugihparametrih. Datoteke, ki so največkrat velikosti nekaj 100 kb, si lahko naložiš na svojračunalnik.


BELEŽKE K VAJI


2 Določanje koncentracije proteinov

2.1 Splošen uvod

2.1.1 Absorpcija svetlobeAbsorpcija je proces, v katerem določena snov selektivno zadrži svetlobo določene valovnedolžine. To pomeni, da je intenziteta vpadne svetlobe večja od intenzitete prepuščene svetlobeskozi preiskovano snov.Vsak elementarni delec (ion, atom, molekula) ima na voljo določena energetska stanja. Stanjez najmanjšo energijo se imenuje osnovno stanje in v tem stanju je večina delcev. Ko foton zdoločeno energijo zadene delec, pride do prenosa energije s fotona na delec (absorpcija).Delec bo tako prešel v stanje z večjo energijo, ki ga imenujemo vzbujeno stanje. Energijafotona mora ustrezati energijski razliki med osnovnim stanjem in katerimkoli večjimenergetskim stanjem. Energija fotona je odvisna od valovne dožine in jo lahko izrazimo znaslednjo enačbo:

chhE

Pri vajah bomo merili absorpcijo svetlobe v UV in vidnem območju. Zmanjšanje intenzitetevpadne svetlobe v tem območju je posledica interakcije elektromagnetnega valovanja zelektroni v določeni snovi.

2.1.1.1 Absorpcija organskih molekulV primeru organskih molekul absorbirajo elektroni, ki so vključeni v kemijsko vez, terelektroni zunanjih orbital nekaterih atomov, ki niso vključeni v kemijsko vez. Valovnadolžina, pri kateri bodo molekule absorbirale svetlobo, je odvisna od tega, kako močno sovezani elektroni v tej snovi. Elektroni v enojnih vezeh ogljik/ogljik ali ogljik/vodik so takočvrsto vezani, da za prehod na višje energetsko stanje potrebujejo fotone z večjo energijo, kotpa jo imajo tisti z valovno dolžino 180 nm (manjša valovna dolžina ustreza večji energijifotona).Za razliko od elektronov v že omenjenih enojnih vezeh, elektroni v dvojnih in trojnih vezehniso tako močno vezani in lahko absorbirajo svetlobo pri valovnih dolžinah, ki so večje od180 nm. Podobno velja tudi za organske molekule, ki vsebujejo žveplo, brom in jod. Zunanjielektroni omenjenih elementov lahko absorbirajo svetlobo večje valovne dolžine kot elektroniv enojnih vezeh ogljik/ogljik.

2.1.1.2 Absorpcija s prenosom naboja (Charge-transfer absorbtion)Mnogo organskih in anorganskih kompleksov, je sestavljenih iz elektron-donorske skupine, kitvori kompleks skupaj z elektron-akceptorsko skupino. Kadar takšen produkt (kompleks)absorbira svetlobo, preide elektron z elektron donorske na elektron akceptorsko skupino.Vzbujeno stanje je neke vrste interna oksidoredukcija in se razlikuje od absorpcije organskega


kromoforja, kjer se elektron po ekscitaciji še vedno nahaja v molekulski orbitali, ki je skupnadvema ali več atomom. Za absorpcijo s prenosom naboja je značilna velika molarnaabsorptivnost (velik molarni absorpcijski koeficient), kar pomeni, da bodo spektroskopskemetode, kjer bo prišlo do te vrste absorpcije zelo občutljive (nizka bo meja detekcije).

2.1.1.3 Relaksacijski proces (znižanje energije vzbujenega stanja)Življenski čas vzbujenega stanja je relativno kratek, saj obstaja več mehanizmov, s katerimivzbujena molekula oziroma atom lahko odda energijo in na ta način preide v osnovno stanje.Najbolj pogosta sta interna konverzija in fluorescenca. Pri interni konverziji, ki jenajpogostejša oblika relaksacije, se energija absorbiranega fotona pretvori v kinetičnoenergijo molekul, kar se izraža kot povišana temperatura. Proces je relativno hiter, saj ježivljenska doba vzbujenega stanja največkrat krajša od 10-11 sekunde. Pri fluorescenci se zarazliko od interne konverzije le del energije vzbujenega stanja pretvori v toploto, del pa seemitira v obliki fotona z večjo valovno dolžino od absorbiranega (manjša energija).

2.1.2 Beer –Lambertov zakonMolekule ali le strukturne dele molekul, ki absorbirajo svetlobno energijo, imenujemokromofori. Če raztopino, v kateri so takšne molekule, presvetlimo s svetlobo valovne dolžinepri kateri le te absorbirajo, bo intenziteta prepuščene svetlobe manjša, kot če teh molekul nebi bilo. Z razmerjem med intenziteto prepuščene svetlobe (I) in intenziteto vpadne svetlobe(I0) definiramo delež prepuščene svetlobe, oziroma prepustnost ali transmitanco (T).Razmerje med I in I0 je odvisno od koncentracije kromoforjev v raztopini. Večja jekoncentracija kromoforjev, manjši bo delež prepuščene svetlobe (slika 2.1)

Slika 2.1: Shematski prikaz absorpcije svetlobe raztopin z različno koncentracijokromoforjev.

Transmitanca(T)

Absorbanca(A)

0,30 0,52

0,50 0,30

0,90 0,046

50 fotonov

I0

100 fotonov 30 fotonov

I0

100 fotonov

I0

100 fotonov 90 fotonov

I

I

I

50 fotonov


Matematično povezavo med intenziteto vpadne svetlobe Io in prepuščene svetlobe I terkoncentracijo kromoforjev v raztopini podajamo z Beer-Lambertovim zakonom. Količino, kije premosorazmerna s koncentracijo kromoforjev v raztopini, imenujemo absorbanca.Absorbanca je definirana kot negativni desetiški logaritem deleža prepuščene svetlobe.Absorbanca (A) je premosorazmerna s koncentracijo kromoforjev v raztopini (c), molarnimabsorpcijskim koeficientom kromoforja pri določeni valovni dolžini () ter dolžino optičnegažarka skozi raztopino (l). Pri zelo velikih koncentracijah ali pri zelo majhnih koncentracijahvzorca pride do odstopanja od Beer-Lambertovega zakona, zato moramo vzorce vednopripraviti tako, da je izmerjena absorbanca v območju linearne odvisnosti od koncentracije.Ponavadi pride do odstopanja od linearnosti predvsem pri večjih koncentracijah, pri izmerjenivrednosti absorbance 1 ali več.

lcII

IITA 0

0

logloglog

Izmerjena absorbanca (A) nima enot, koncentracijo (c) izražamo v enotah mol/L, molarniabsorpcijski koeficient (), izražamo v enotah L.mol-1.cm-1 in je odvisen od spojine priizbrani valovni dolžini. Dolžina optičnega žarka skozi raztopino vzorca pa je določena s širinokivete (l), ki jo izrazimo v centimetrih.Zgoraj napisana enačba velja le v primeru, če je v raztopini le ena vrsta absorbirajočihmolekul. Če pa imamo v raztopini več spojin, ki absorbirajo pri določeni valovni dolžini,potem je absorbanca takšne raztopine odvisna od absorbance posameznih spojin v raztopini:

...... ,,,,,,, lclclcAAAA zzyyxxzyxzmesi

Včasih imajo določene spojine v strukturo vključenih več neodvisnih kromoforjev. Čepoznamo molarne absorpcijske koeficiente teh kromoforjev lahko izračunamo molarniabsorpcijski koeficient spojine kot celote. Število posameznih kromoforjev pomnožimo znjihovim molarnim absorbcijskim koeficientom, seštejemo prispevke vseh kromoforjev indobimo molarni absorpcijski koeficient spojine kot celote.

...3,32,21,1, kromoforkromoforkromoforkromoforkromoforkromoforspojine nnn

Beer-Lambertov zakon


2.1.3 SpektrofotometerAbsorbanco vzorcev merimo s spektrofotometrom. Spektrofotometer je sestavljen iz virasvetlobe, monokromatorja, s katerim izberemo ozko območje valovnih dolžin, prostora,kamor vložimo kiveto z vzorcem (pri izbiri kivete moramo paziti, da material kivete neabsorbira v področju v katerem merimo absorbanco vzorca), detektorja, ki zazna prepuščenosvetlobo in jo pretvori v električni tok ter ojačevalca. Izmerjen signal se največkrat izpiše kotabsorbanca. Nekateri spektrofotometri omogočajo le izpis vrednosti absorbance pri določenivalovni dolžini, drugi spektrofotometri pa omogočajo tudi izpis absorpcijskega spektra vdefiniranem merjenem območju valovnih dolžin.

Slika 2.2: Shematski prikaz spektrofotometra.

2.1.4 Spektrofotometrične metode za določanje koncentracije proteinovV praksi uporabljamo največkrat VIS in UV absorpcijske spektroskopske metode. VISspektroskopijo uporabljamo za merjenje absorpcije snovi v vidnem območjuelektromagnetnega valovanja (od 400 do 800 nm) in jo včasih poimenujemo tudikolorimetrija. UV spektroskopijo uporabljamo za merjenje absorpcije snovi v ultravijoličnemdelu elektromagnetnega spektra ( od 200 do 400 nm). Pri obeh načinih merimo absorpcijoproteinov v raztopini, kot takšne v UV območju, če pa nastane obarvan produkt pa v vidnemdelu spektra.

2.1.4.1 Posredne, kolorimetrične metode določanja koncentracije proteinovSkupno vsem tem opisanim metodam je to, da k raztopini proteina ali proteinov dodamo nekreagent, ki tvori s proteini kompleks, ki absorbira v vidnem delu spektra. Po dodatku reagentak raztopini proteinov je nastali barvni kompleks s proteinom obstojen le določen čas, običajnonekaj deset minut. Protein, kateremu smo dodali reagent je po koncu analize neuporaben zanadaljnjo biokemijsko karakterizacijo, saj je denaturiran in kemijsko modificiran. Za meritevabsorbance v vidnem delu spektra lahko uporabljamo kvarčne kivete (ki so primerne tudi zameritev v UV območju) ali pa kivete za enkratno uporabo iz različnih plastičnih mas, ki neabsorbirajo v vidnem delu spektra.Pri posrednih kolorimetričnih metodah največkrat ne poznamo molarnega absorpcijskegakoeficienta nastalega kompleksa, zato je potrebno pripraviti umeritveno krivuljo z raztopino


proteinov znanih koncentracij, iz katere potem odčitamo koncentracijo proteinov v neznanemvzorcu. Pri odločitvi za določeno metodo moramo biti pozorni na občutljivost metode (mejadetekcije) in prisotnost spojin, ki so v vzorcu poleg proteina in lahko motijo analizo.

2.1.4.1.1 Biuretska metodaPo biuretski metodi dodamo k raztopini proteinov t.i. biuretski reagent, ki je alkalna raztopinakompleksiranih Cu2+ ionov. V alkalnem mediju nastane med Cu2+ ioni in proteinomvijoličasto obarvan kompleks, katerega absorpcijski maksimum je pri 540 nm. Raztopinibakrovih ionov je dodan kalij-natrijev tartrat, ki kompleksno veže Cu2+ ione v alkalnemmediju, ker bi se drugače oborili v netopen Cu(OH)2. Cu2+ ioni se tako iz tartratnegakompleksa vežejo oz. kompleksirajo na peptidno vez proteina, pri čemer nastane v času 20-30minut vijoličen kompleks. Po tem času izmerimo absorbanco Cu2+-proteinskega kompleksapri 540 nm.Pomanjkljivost metode je relativno majhna občutljivost, saj mora biti koncentracija proteinovv reakcijski mešanici največkrat večja od 0,2 mg/mL. Najmanjše količine proteinov, ki jih šelahko določimo so v območju nekaj sto mikrogramov, če upoštevamo, da meritev izvajamo vkivetah z volumnoma 1 mL ali 2,5 mL. Prednost te metode je, da proste aminokisline analizene motijo. Biuretsko reakcijo motijo Tris pufer, saharoza, NH4

+ ioni, primarni amini inglicerol.

Slika 2.3: Shematski prikaz kompleksa med Cu2+ iz biuretskega reagenta in proteinom.

2.1.4.1.2 Bradfordova metodaBradfordova metoda temelji na vezavi barvila Coomassie Brilliant Blue na protein. Barvilosamo lahko obstaja v štirih različnih ionskih oblikah. V kislem prevladujeta kationska rdeča inzelena oblika barvila, katerih absorpcijska maksimuma sta pri 470 in 650 nm. Anionskamodra oblika barvila, ki se v kisli raztopini veže na protein, ima absorpcijski maksimum pri590 nm. Barvilo se najverjetneje veže na stranske verige aminokislin arginina in lizina, vmanjši meri pa na stranske verige aromatskih aminokislin. Na arginin se veže do osemkratmočneje kot na ostale stranske verige naštetih aminokislin, kar pomeni, da morajo imetiproteini, katerim določamo koncentracijo, podobno aminokislinsko sestavo kot standardni


protein, da ne pride do prevelikih napak pri določanju koncentracije. Koncentracijo proteinadoločimo z merjenjem absorbance modrega barvnega proteinskega kompleksa pri 600 nm.Absorbanco kompleksa lahko merimo že po 5 minutah. Barvni kompleks je stabilen do 60minut. Standardna Bradfordova metoda je primerna za določanje koncentracije proteinov vobmočju nekaj deset g/mL, kar največkrat pomeni, da potrebujemo med 10 g in 100 gproteinov. S tako imenovano mikrometodo pa za določitev zadostujejo že 10-krat manjšekoncentracije proteinov, kar pomeni, da potrebujemo od 1 g do 10 g proteinov v vzorcu.Mogoče je največja pomanjkljivost te metode v zelo širokem nelinearnem območju odvisnostiabsorbance od koncentracije proteinov, še posebej pri večjih koncentracijah. To je tudiposledica prekrivanja absorpcijskih spektrov obeh ionskih oblik barvila. Nekatere spojinelahko znatno vplivajo na vezavo proteina z barvilom (npr. detergenti in amfoliti).Gvanidinijev hidroklorid in natrijev askorbat se vežeta s proteini, zato lahko v prisotnosti tehdveh spojin napačno določimo premajhno koncentracijo proteinov v vzorcu. Tudi izbiragovejega serumskega albumina za standardni protein ni najbolj primerna, ker daje le-ta zbarvilom zelo intenziven barvni kompleks, posledično pa napačno premajhno določitevkoličine proteina v vzorcu. Kot bolj primeren standard je vedno bolj v uporabi -globulin.

Slika 2.4: Anionska oblika barvila Coomassie Brilliant Blue.

Barvilo se veže na kvarčno steklo, zato je bolj primerna uporaba kivet iz polistirenskeplastične mase ali navadnega stekla.

2.1.4.1.3 Lowryjeva metodaTo je ena izmed kemijsko najmanj definiranih metod. Cu2+ ioni iz biuretskega reagenta se privezavi na peptidno vez reducirajo v Cu+ ione. Nastali Cu+ ter aromatski aminokislini tirozin intriptofan v proteinu so pomembni za redukcijo fosfomolibdovolframata (Folinov reagent) vmodri heteropolimolibden (Folin-Ciocalteau reakcija). Intenzivno modro obarvanje je odvisnood koncentracije proteinov pa tudi od vsebnosti tirozina in triptofana v proteinih. Za pravilenpotek reakcije je pomemben ustrezen pH, ki mora biti med 10 in 10,5. Folinov reagent je


relativno nestabilen v alkalnem mediju, zato je čas v katerem reagira, bistvenega pomena.Barvni kompleks je stabilen od 30 do 60 minut in v tem času tudi izmerimo absorbanconastalega kompleksa pri 750 nm. Metoda je primerna za določanje koncentracij proteinov vraztopini med 0,01 do 1,0 mg/mL, kar je za več kot velikostni razred bolje kot pri biuretskireakciji.Slabost te metode je v tem, da veliko snovi moti določevanje. To so npr. različni pufri (Tris),detergenti (Triton, Chaps, NaDS), sladkorji in nukleinske kisline. V večini primerov določimopremajhno koncentracijo proteinov v raztopini, lahko pa pride tudi do obarjanja.Pomanjkljivost metode je tudi, da ni linearna pri večjih koncentracijah proteinov.

2.1.4.1.4 Metoda z bikinhonsko kislino (BCA)Je podobna Lowryjevi metodi. Pri BCA metodi poteče redukcija Cu2+ ionov v alkalniraztopini v Cu+ ione, ki se nato kompleksno vežejo z bikinhonsko kislin. Nastane kompleksintenzivno vijolične barve z absorpcijskim maksimumom pri 562 nm. Po dodatku bikinhonskekisline je potrebno reakcijsko mešanico segrevati pri 60 C, saj pri višjih temperaturahpeptidna vez prispeva k intenziteti barvnega kompleksa, pri tem pa se poveča občutljivostmetode, hkrati pa zmanjša odvisnost od aminokislinske sestave proteinov (glej Lowryjevometodo). Prednost pred Lowryjevo metodo je, da je bikinhonska kislina bolj obstojna valkalnem od Folinovega reagenta, hkrati pa tudi manj snovi moti samo metodo. Tako na BCAmetodo ne vpliva večina pufrov, denaturanta kot sta urea in gvanidinijev hidroklorid tervečina detergentov. BCA kislina pa reagira z večino reducirajočih sladkorjev in s kelatorjibakrovih ionov (npr. EDTA). BCA metoda je primerna za določanje koncentracije proteinovv podobnem območju kot Lowryjeva metoda.

Slika 2.5: Strukturna formula natrijeve soli bikinhonske kisline.

2.1.4.2 Določanje koncentracije proteinov z UV absorpcijsko spektroskopijoPrednost določanja koncentracije proteinov z merjenjem absorbance v UV območju je, daproteinov po presvetlitvi z UV svetlobo kemijsko ne spremenimo in jih zato lahko uporabimoza nadaljnje analize. Proteini imajo v UV območju dva absorpcijska maksimuma, v bližnjemdelu UV spektra pri 280 nm ter v daljnjem delu UV spektra pri 190 nm (slika 2.6.).


Slika 2.6: Absorpcijski spekter raztopine govejega serumskega albumina.

Molarni absorpcijski koeficient povprečnega proteina v daljnem delu UV spektra je za več kotvelikostni razred večji od molarnega absorpcijskega koeficienta v bližnjem delu UV spektra.Molarni absorpcijski koeficienti nekaterih aminokislin pri različnih valovni dolžinah soprikazani v preglednici 2.1.

Preglednica 2.1: Molarni absorpcijski koefcienti () nekaterih aminokislin pri nevtralnem pH.(povzeto po Pace C.N. in sod., 1995; Campbell I.D. in Dwek R.A, 1984)

Aminokislina (nm) (mol-1dm3cm-1)

triptofan 280 (max)219 (max)

550047000

tirozin 280274 (max)222 (max)

149014008000

cistin 280250

125300

V daljnem delu UV spektra močno absorbira peptidna vez, ki ima absorpcijski vrh okoli190 nm. Zaradi težav, ki jih povzroča absorpcija kisika in šibkega izhodnega signala običajnihspektrofotometrov pri tej valovni dolžini, največkrat merimo absorbanco pri 205 nm, kjer paje vrednost absorbance za polovico manjša od absorbance pri 190 nm. K absorbanci vdaljnjem delu UV spektra prispevajo tudi stranske verige mnogih aminokislin. Pri 205 nm so


molarni absorpcijski koeficienti razvrščeni takole: Trp>Phe>Tyr>His>Cys>Met>Arg. V temobmočju močno absorbirajo svetlobo tudi mnogi pufri in npr. hem skupina, piridoksalneskupine. Za oceno koncentracije proteinov z merjenjem absorbance v tem UV območjumoramo proteine raztopiti v ali razredčiti s pufrom, ki v tem območju ne absorbira (npr. 0,1mol/L K2SO4 s 5 mmol/L K-fosfatnim pufrom s pH 7,0, Tris, amonijev sulfat, borat) ali pa z0,9 % NaCl. Izogibati se moramo ftalatnih, citratnih, sukcinatnih in acetatnih pufrov. Zaradinaštetih interferenc in pomanjkljivosti, merjenje absorbance v daljnjem UV delu največkrat niprimerno za določanje koncentracije proteinov. Svetlobo teh valovnih dolžin pa zaradi velikeobčutljivosti (velik molarni absorpcijski koeficient) pogostokrat uporabljamo za detekcijoproteinov in peptidov pri različnih kromatografskih metodah. Masno koncentracijo proteina vg/mL lahko ocenimo s spodnjo enačbo:

)(144 225215

)/( AAmlg

proteinov

K absorpcijskemu maksimumu proteinov v bližnjem delu UV spektra prispevajo aromatskeaminokisline v proteinih, predvsem tirozina in triptofana ter v manjši meri fenilalanin, indisulfidne vezi. Čeprav je število spojin, ki absorbirajo v tem območju precej manjše, ševedno precej spojin absorbira svetlobo teh valovnih dolžin. Nukleinske kisline so pogostokratspremljevalci proteinov v različnih ekstraktih. DNA ima tako pri 280 nm pri isti masnikoncentraciji 10x večjo absorbanco kot raztopina proteinov z enako masno koncentracijo.Kadar so v vzorcu prisotne nukleinske kisline, lahko masno koncentracijo proteinov v mg/mLocenimo z naslednjo enačbo:

260280

)/( 76,055,1 AAmlmg

proteinov

Za merjenje absorbance raztopin v UV območju največkrat uporabljamo kvarčne kivete. Zameritve v bližnjem delu UV spektra pa lahko uporabimo tudi kivete za enkratno uporabo izdoločenih plastičnih mas, ki ne absorbirajo svetlobe v tem delu spektra.


2.2.1 Namen vaje

Z biuretsko reakcijo ter z merjenjem absorbance aromatskih aminokislin boš določilkoncentracijo proteinov v vzorcu.


2.2.2 OsnoveKadar velja Beer-Lambertov zakon je absorbanca linearno odvisna od koncentracije proteinovv vzorcu. Linearno funkcijo opiše enačba premice: y=ax + b, grafično pa linearno odvisnost yod x narišemo kot je prikazano na sliki 2.7. Izmerjena absorbanca predstavlja vrednosti naordinati, na abscisi pa so predstavljene ustrezne koncentracije proteinov. Instrument predmeritvijo največkrat umerimo na nič z raztopino, v kateri so vsi reagenti razen proteina. To jetako imenovan slepi vzorec. Takrat gre premica, s katero prikažemo odvisnost absorbance odkoncentracije proteinov, skozi izhodišče koordinatnega sistema (b=0).

Slika 2.7: Prikaz linearne odvisnosti dveh količin.

Zaradi linearne odvisnosti absorbance od koncentracije lahko določamo koncentracijoproteinov tudi, če ne poznamo molarnega absorpcijskega koeficienta. Potrebno je le pripravitiraztopine z znanimi koncentracijami proteinov v prisotnosti biuretskega reagenta in jimizmeriti absorbanco. Vrednost absorbance pri določeni koncentraciji nanesemo na graf in natoob upoštevanju vseh točk narišemo umeritveno krivuljo (premico), ki gre skozi izhodiščekoordinatnega sistema. Na ta način dobimo naklon premice (vrednost a, slika 2.7.). Tovrednost lahko uporabimo za določanje koncentracije proteinov v vzorcu. Če pomerimoabsorbanco neznanega vzorca, kateremu smo dodali biuretski reagent in to vrednost delimo znaklonom premice, dobimo koncentracijo proteinov v kiveti, v kateri smo opravili meritev.Koncentracijo lahko določimo tudi grafično iz umeritvene krivulje, če ustrezni absorbanci zaneznani vzorec poiščemo vrednost na abscisi.Iz podatkov o aminokislinski sestavi proteina, kateremu boš določal koncentracijo zmerjenjem absorbance pri 280 nm, boš izračunal molarni absorpcijski koeficient. Ker kmolarnemu absorpcijskemu koeficinetu največ prispevata aminokislini tirozin in triptofan, bošprispevek disulfidnih vezi zanemaril in za izračun uporabil naslednji izraz:

tyrtrpproteina nncmmoldm

14905500)113(

,280

Y

XX1 X2

Y2

Y1naklon premice: (y2 - y1)/(x2 - x1)


Iz izračunanega podatka in znane molekulske mase proteina, ter izmerjene absorbance bošizračunal koncentracijo proteina v kiveti.

2.2.3 Izvedba2.2.3.1 Biuretska reakcijaPri izvedbi biuretske reakcije odpipetiraj v označene epruvete ustrezne volumne standardneraztopine proteinov ali vzorca, 0,9 % raztopine NaCl in biuretskega reagenta kot je razvidnoiz preglednice 2.2.4.1. Ko si dodal vse raztopine, zmes na vrtinčniku dobro premešaj inpočakaj 20-30 minut, da se razvije barva. Takrat pomeri absorbanco posameznih raztopin pri540 nm. Instrument najprej umeri na nič s slepim vzorcem (epruveta z oznako 1).

2.2.3.2 Merjenje absorbance pri 280 nmZa merjenje absorbance pri 280 nm odpipetiraj v označeno epruveto 0,7 mL vzorca in 2,0 mL0,9 % raztopine NaCl in premešaj na vrtinčniku. Absorbanco razredčenega vzorca lahkopomeriš takoj. Instrument predhodno umeriš na nič z 0,9 % raztopino NaCl.

2.2.4 Rezultati2.2.4.1 Biuretska reakcijaIzračunaj koncentracije proteinov v kiveti pri posameznih standardnih raztopinah in rezultatevpiši v preglednico (peti stolpec). V preglednico vpiši tudi izmerjene absorbance (šestistolpec). Nariši umeritveno krivuljo, kjer na ordinato nanašaš absorbance standardnihraztopin, na absciso pa koncentracijo proteinov. Iz umeritvene krivulje odčitaj koncentracijoproteinov za vzorec (Vz 540) v kiveti. Z upoštevanjem razredčitev izračunaj koncentracijoproteinov v nerazredčenem vzorcu.

Preglednica rezultatov 2.2.4.1

Oznakaepruvete

Volumen standarda skonc. proteinov5 mg/mL (mL)

Volumen 0,9 %NaCl (mL)

Volumenbiuretskegareagenta (mL)

Koncentracijaproteinov vkiveti (mg/mL)

A540

1 0 1,5 1,52 0,1 1,4 1,53 0,2 1,3 1,54 0,3 1,2 1,55 0,4 1,1 1,56 0,5 1,0 1,57 0,6 0,9 1,58 0,7 0,8 1,5

Oznakaepruvete

Volumenvzorca(mL)

Volumen0,9 % NaCl(mL)

Volumenbiuretskegareagenta (mL)

A540


Koncentracijaproteinov vnerazredčenemvzorcu (mg/mL)

Vz 540 0,5 1,0 1,5


2.2.4.2 Merjenje absorbance pri 280 nmIzračunaj molarni absorpcijski koeficient proteina. Iz podatkov o dolžini optične poti v kiveti,izračunanega molarnega absorpcijskega koeficienta ter izmerjene absorbance izračunaj masnokoncentracijo proteinov v kiveti. Pri izračunu koncentracije proteinov v vzorcu upoštevaj, dasi osnovni vzorec pred meritvijo razredčil z 0,9 % raztopino NaCl.


Oznakaepruvete

Volumen vzorca(mL)

Volumen0,9 % NaCl(mL)

A280


Koncentracijaproteinov vnerazredčenemvzorcu (mg/mL)

Vz 280 0,7 2,0

Reagenti goveji serumski albumin 0,9 % raztopina NaCl biuretski reagent (1,5 g CuSO4

. 5H2O + 6 g kalij-natrijevega tartrata, KNaC4H4O6.

4H2O, raztopi v 500 mL H2O, dodaj 300 mL 10 % raztopino NaOH in dopolni do 1 L zdestilirano vodo)

Pribormerilne pipete (1 mL, 2 mL), vrtinčnik, epruvete, kivete, spektrofotometer


BELEŽKE K VAJI


3 Vpliv pH, temperature in kofaktorjev na aktivnost -amilaze

3.1 Splošen uvod

3.1.1 EncimiPoglejmo si primer sladkorja, ki je v skodelici na mizi. Če pustimo sladkor na mizi, bo ostal vpraktično nespremenjeni obliki tudi po enem letu in več. Če pa zaužijemo žličko tegasladkorja, se bo po nekaj urah v telesu sladkor pretvoril v ogljikov dioksid in vodo. Kaj se jezgodilo?Očitno so v organizmu določene spojine, ki vplivajo na to, da se sladkor pretvori v ogljikovdioksid in vodo. Te spojine imenujemo encimi. Encimi so katalizatorji in pospešujejokemijske reakcije v živih organizmih, kar pomeni, da ne vplivajo na smer kemijske reakcije,ampak jo samo pospešijo. Strukturno so praktično vsi encimi proteini. Izjema so nekaterekatalitično aktivne molekule RNA.Določeni encimi lahko katalizirajo le določene reakcije v katerih pretvarjajo reaktante, ki jihimenujemo substrati, v produkte. Stopnja specifičnosti glede na substrat se razlikuje odencima do encima. Nekateri encimi katalizirajo le pretvorbo točno določenega substrata,medtem ko drugi lahko delujejo na vrsto strukturno podobnih substratov.Za vse kemijske reakcije velja, da potekajo hitreje z višanjem temperature.

A B

Slika 3.1: Energetski »profil« nekatalizirane (A) in encimsko katalizirane reakcije (B), G‡ jeaktivacijska energija

SUBSTRATPRODUKT

SUBSTRATPRODUKT

KATALIZIRANANEKATALIZIRANAREAKCIJA REAKCIJA

PRO

STA

ENTA

LPIJ

A,G

POTEK REAKCIJEPOTEK REAKCIJE


V splošnem velja, da sta temperatura in reakcijska hitrost povezani z Arrheniusovo enačbo.

k =Ae-G‡/RT

A je konstanta odvisna od snovi in je sorazmerna z verjetnostjo, da bo aktivacijskikompleks razpadel v produkt ,

G‡ je aktivacijska energija (energetska bariera), ki jo morajo doseči molekulereaktantov, da se pretvorijo v produkte,

R je plinska konstanta, T je temperatura (absolutna temperatura v kelvinih), k je hitrostna konstanta.

Iz enačbe je razvidno, da višja temperatura pomeni tudi večjo hitrost kemijske reakcije prienaki aktivacijski energiji. Pri povišani temperaturi je večja verjetnost, da reaktanti primedsebojnih trkih prejmejo zadosti energije, da preidejo iz osnovnega v prehodno stanje intako premagajo energetsko bariero na poti do produkta. Encimi delujejo tako, da zmanjšajoaktivacijsko energijo za določeno reakcijo (slika 3.1), kar pomeni, da imajo reaktanti dovoljenergije, da dosežejo prehodno stanje in premagajo energetsko bariero na poti do produktov,že pri nižji temperaturi.

3.1.2 Kako definiramo in izmerimo hitrost encimsko katalizirane reakcijeHitrost encimsko katalizirane reakcije je definirana kot hitrost vsake kemijske reakcije.Hitrost izrazimo kot spremembo koncentracije ene od snovi, ki se reakcije udeležuje, vdoločenem času. Za reakcijo tipa

A + B C + D

lahko hitrost (v) zapišemo kot:

v = -dA/dt = -dB/dt = dC/dt = dD/dt

Negativen predznak pri reaktantih A in B je potreben zato, ker se koncentracija le teh medreakcijo zmanjšuje. Če hočemo določiti hitrost neke reakcije je torej dovolj, da spremljamospremembo koncentracije le ene od snovi, ki se pretvarjajo v reakciji. V praksi največkratspremljamo spremembo koncentracijo enega od produktov, v določenih primerih pa tudikoncentracijo katerega od reaktantov. Obstaja mnogo različnih metod, s katerimi je mogočespremljati koncentracijo spojin, vse pa temeljijo na različni strukturi in posledično različnihfizikalno kemijskih lastnostih spojin. Na vajah bomo spremembo koncentracije največkratdoločali na osnovi Beer-Lambertovega zakona, kjer velja, da je koncentracija spojinepremosorazmerna z absorbanco (glej vajo 2).


Idealno je, če lahko spremembo koncentracije spremljamo praktično kontinuirno in izrazimohitrost kot tangeto na krivuljo spremembe koncentracije produkta na časovno enoto.Mnogokrat pa nimamo tehničnih možnosti, da bi reakcijo spremljali kontinuirno. Takrat seodločimo za prekinitev reakcije po določenem času, ko izmerimo koncentracijo nastalegaprodukta. Reakcijo lahko prekinemo tako, da denaturiramo encim ali dodamo inhibitor. Poprekinitvi reakcija ne poteka več, kar pomeni, da se koncentracija produktov in reaktantov poprekinitvi ne spreminja in jo lahko določimo tudi v daljšem obdobju po prekinitvi. Mnogokratje potrebno hkrati s prekinitvijo reakcije dodati spojino, ki reagira z enim od produktov.Derivatizacija je potrebna zato, da koncentracijo produkta lažje določimo.Prednost kontinuirnega merjenja je predvsem ta, da lahko iz grafa ocenimo, če je hitrostkonstantna ali pa se med reakcijo spreminja. V primeru, če se hitrost med reakcijo zmanjšuje(pomanjkanje substrata, inhibicija s produktom, denaturacija encima) in imamo samo enomeritev lahko zaradi tega določimo napačno hitrost reakcije (slika 3.2). Prekinitev reakcije podoločenem času in določanje reakcijske hitrosti iz le ene točke je smiselno in primerno izvestile takrat, če je hitrost v celotnem časovnem intervalu konstanta. Napakam se lahko izognemotako, da namesto meritve po enem samem času reakcijo prekinemo po različnih časih;narišemo krivuljo in če se ta ukrivlja, upoštevamo le začetno hitrost.

Slika 3.2: Pravilno določena začetna hitrost (naklon zgornje črtkane črte) ob upoštevanjuzačetnega naklona kontinuirne meritve (neprekinjena črta) ali nekaj prvih točkpridobljenih s pogostim vzorčenjem (X). Nepravilno določena začetna hitrost (naklonspodnje črtkane črte) ob upoštevanju le ene meritve ob času, ko je dejanska hitrost precejmanjša od začetne.

3.1.3 Vpliv temperature na hitrost encimsko kataliziranih reakcijKot smo že omenili je hitrost kemijskih reakcij funkcija temperature in encimsko kataliziranereakcije niso pri tem nobena izjema. Hitrost se pri večini encimskih reakcij poveča za 15 % -

00

X

X

X

X

X

XX

X

vzačetna-napačna

vzačetna-pravilna

Čas

Kon

cen t

raci

jap r

odu k

ta


25 % pri povišanju temperature za 1 oC, kar je relativno veliko in lahko privede do napak primerjenju encimske aktivnosti, če temperatura med meritvijo ni natančno regulirana.Hitrost encimsko kataliziranih reakcij pa narašča le do določene temperature (le ta je odvisnaod encima), saj pri višjih temperaturah protein izgubi svojo tridimenzionalno strukturo, sedenaturira, in s tem tudi biološko aktivnost. Za določene proteine izolirane iz arktičnih rib, kivečino časa preživijo v vodi, katere temperatura je nižja od 0 oC, je značilno, da izgubijonativno strukturo že pri temperaturah višjih od 6 oC. Drugo skrajnost predstavljajo encimiizolirani iz termofilnih bakterij in arhej, ki živijo v vročih vrelcih ali blizu podvodnihvulkanov in ohranijo biološko aktivnost tudi pri temperaturah nad 100 oC.

Slika 3.3: Shematičen prikaz hitrosti encimsko katalizirane reakcije v odvisnosti odtemperature.

Kot že omenjeno encimi pospešujejo kemijske reakcije tako, da zmanjšajo aktivacijskoenergijo, ki predstavlja razliko v energiji molekule v osnovnem stanju (substrat) inprehodnem stanju (energetska bariera, ki jo mora »premagati« substrat, da lahko preide vprodukt). Z denaturacijo encima se aktivacijska energija prej katalizirane reakcije dvigne naraven nekatalizirane reakcije, ki tako kljub povišani temperaturi poteka izredno počasi (vvečini primerov praktično ne poteka).OPOMBA:Pri eksotermnih reakcijah, kjer se sprošča toplota, povišana temperatura zmanjša ravnotežnokonstanto. Obratno velja za endotermne reakcije, kjer se toplota med reakcijo porablja in višjatemperatura pomeni tudi večjo ravnotežno konstanto.Za hitrost pa velja, da bo tudi v primeru eksotermne reakcije večja pri povišani temperaturi,nujen pogoj je seveda, da je temperatura zadosti nizka, da ne pomakne ravnotežja v smerireaktantov. Sama vrednost proste entalpije neke reakcije (ΔG; nujno je le, da je za določenoreakcijo negativna) pa ni merilo za njeno hitrost.

Temperatura

Hitr

ost r

eakc

ije

Tdenaturacije

Encim ima nativno strukturo; narašča s temperaturovreakcije

Encim je denaturiran = 0vreakcije


3.1.4 Vpliv pH na hitrost encimsko kataliziranih reakcijTako encimi, kot nekateri substrati, vsebujejo funkcionalne skupine, katerih naboj je odvisenod pH. Te kisle ali bazične skupine se lahko protonirajo in deprotonirajo. Sprememba nabojana stranskih verigah nekaterih aminokislin encima lahko vpliva na strukturo. Že manjšestrukturne spremembe v aktivnem mestu encima imajo lahko za posledico izgubo aktivnosti.Sprememba naboja na aminokislini, ki je direktno udeležena pri katalizi, bo imela enakučinek. pH vpliva tudi na stabilizirajoče ionske interakcije in vodikove vezi v proteinu, zatolahko encim pri neustreznem pH-ju izgubi nativno tridimenzionalno strukturo in s temkatalitično aktivnost. Ker so encimi po strukturi in sestavi zelo različni, se razlikujejo tudipogoji, pri katerih so le-ti aktivni. Nekateri encimi so lahko aktivni pri zelo nizkem alivisokem pH (npr. pepsin pri pH 1,5 ali določene bakterijske peptidaze pri pH 13), večina pajih je aktivna v območju od pH 5 do pH 9. Krivulja encimske aktivnosti v odvisnosti od pH-jaima praktično za vse encime zvonasto obliko (slika 3.4), saj velja, da pri ekstremnih pH-jihvedno pride do denaturacije in posledično izgube aktivnosti encimov.

Slika 3.4: Shematičen prikaz hitrosti encimsko katalizirane reakcije v odvisnosti od pH.

V primeru vpliva pH na aktivnost encima je potrebno razlikovati med pojmoma aktivnost instabilnost. Aktivnost in stabilnost največkrat sovpadata, vendar lahko v določenih primerihpride do razlik. Inaktivacija encimov s pH-jem je lahko posledica denaturacije encima, ki jepogostokrat ireverzibilna, ali pa spremenjenega naboja aminokislin v aktivnem mestu encima,ki po spremembi pH v optimalno območje pridobi aktivnost nazaj. Serinska peptidaza tripsin,je npr. aktivna samo v nevtralnem in šibko alkalnem pH-ju. V kislem, pri pH 3, encim ni

pH

Hitr

ost r

eakc

ije

Območje pH v katerem je encim aktiven

= 0vreakcije = 0vreakcije


aktiven, vendar je ravno v tem območju najbolj stabilen. Torej je ta pH primeren tako zadaljše shranjevanje encima (zaradi stabilnosti), kakor tudi za prekinitev encimske reakcije.

3.1.5 Vpliv kofaktorjev in aktivatorjev na aktivnost encimovKot smo že omenili so praktično vsi encimi proteini. Nekateri encimi so sestavljeni le izproteinskega dela. Mnogo encimov pa za pravilno delovanje poleg proteinskega delapotrebuje še drugo komponento, ki jo imenujemo kofaktor. Ta je lahko organska molekula,organokovinska molekula ali pa kovinski ion. Organske in organokovinske kofaktorjeimenujemo tudi koencimi. Za tiste koencime, ki so kovalentno vezani na proteinski delencima, se uporablja tudi izraz prostetična skupina. Sestavljeno aktivno molekulo, protein inkofaktor, imenujemo holoencim, z izrazom apoencim pa označimo le proteinski del, to jeholoencim brez kofaktorja. Mnogih kofaktorjev ali njihovih sestavnih delov človeškiorganizem ne more sintetizirati. Takšne organske molekule, ki so esencialne in jih moramozaužiti s hrano, imenujemo vitamini. Naš organizem lahko sintetizira določene kofaktorje(npr.: hem), velja pa tudi, da niso vsi vitamini sestavni deli kofaktorjev.Aktivnost nekaterih encimov pospešujejo določene spojine in ioni, ki jih ne uvrščamo medkofaktorje. Največkrat so to anioni, v prisotnosti katerih določeni encimi delujejo hitreje. Le tilahko vplivajo na strukturo in stabilnost proteinov, ali pa so sestavni del aktivnega mestaencimov. Primer takšnega iona je Cl- ion, ki je aktivator -amilaze in nekaterih peptidaz.


3.2.1 Namen vajeNa primeru pankreatične -amilaze boš spoznal, kako je hitrost encimsko kataliziranereakcije odvisna od temperature, pH in koncentracije aktivatorjev.

3.2.2 Osnove-amilaze so endoglikozidaze, encimi z relativno molekulsko maso okoli 50 000, ki cepijo(14) glikozidno vez znotraj verige daljših polisaharidov kot sta glikogen in škrob ternjunih razgradnih produktov. -amilaze ne morejo katalizirati hidrolize disaharida maltoze vdve molekuli glukoze. Nekatere -amilaze so aktivirane s Cl- ioni in/ali s Ca2+ ioni. pHoptimum večine -amilaz je v nevtralnem in rahlo kislem pH-ju.V človeškem organizmu je genetski zapis za dve zelo podobni -amilazi (izoencima), ena seizraža v celicah trebušne slinavke-pankreasa, druga pa v žlezah slinavkah v ustni votlini. Zarazliko od večine bakterijskih encimov, so -amilaze sesalcev aktivirane s kloridnimi ioni.Kloridni ion, ki je vezan blizu aktivnega mesta, poveča encimsko aktivnost ter povzročipremik optimalne aktivnosti iz rahlo kislega v nevtralni pH. Že pri temperaturah višjih od40 oC človeška -amilaza počasi izgublja aktivnost (denaturacija), pri 60 0oC ali več je procesdenaturacije končan že v nekaj sekundah.


Temperaturni optimumi so zelo različni in odvisni od strukture proteinov. Nekatere -amilazeizolirane iz hipertermofilnih arhej in bakterij so aktivne tudi pri temperaturah višjih od100 oC. Ti encimi so zelo uporabni v živilski industriji. Termostabilne -amilaze seuporabljajo v prvi fazi hidrolize škroba. Hidroliza največkrat poteka 90 minut pri temperaturi100 oC in pH 6. V največji meri nastanejo dekstrini z nekaj glukoznimi enotami. Dekstrine senaknadno razgradi z amiloglukozidazo, ki je eksoglikozidaza in katalizira hidrolizo (14)glikozidnih vezi od konca oligosaharidov, počasi pa tudi (16) glikozidne vezi na mestihrazvejanja. Končni produkt hidrolize je glukoza. Po končani hidrolizi največkrat izvedejo šepretvorbo glukoze v fruktozo, ki je dvakrat slajša od glukoze. V tem procesu uporabijo encimglukoza-izomerazo.Aktivnost -amilaze bomo pri vaji določali tako, da bomo spremljali koncentracijonerazgrajenega škroba v odvisnosti od časa hidrolize. Nerazgrajen škrob bomo detektirali zjodovico, ki tvori s škrobom temno modro obarvan adicijski produkt. Enako barvo dajo tudidekstrini z veliko molekulsko maso. Dekstrini s srednjo molekulsko maso se obarvajo zjodovico rdeče, medtem ko se dekstrini z majhno molekulsko maso ne obarvajo. Zapisali sibomo čas od začetka hidrolize do takrat, ko se je barva spremenila iz modre v rdečo rjavo.

3.2.3 IzvedbaVpliv temperaturePripravi si štiri pare epruvet (skupaj osem). V eno epruveto določenega para odpipetiraj 5 mLškrobovice, v drugo pa 0,5 mL raztopine -amilaze. Posamezne pare epruvet ločenotermostatiraj 5 minut na ledu, sobni temperaturi, 37 oC in 70 oC. Po končani inkubaciji prelijraztopino substrata (škrobovica) k encimu, dobro premešaj na vrtinčniku in reakcijskomešanico postavi nazaj v kopel z ustrezno temperaturo pri kateri določaš aktivnost. Steklenopalčko pomoči v reakcijsko zmes in kani kapljico, ki se je nabrala na koncu palčke, naporcelansko ploščico, kjer že imaš kapljico jodovice. Nato speri palčko z vodo in jo obriši. Sčisto in suho palčko zajemi novo kapljico iz reakcijske zmesi in jo kani na ploščo k drugikapljici jodovice. Postopek ponavljaj toliko časa, dokler se zmes jodovice in reakcijske zmesina plošči obarva temno modro. Ko opaziš, da se po dodatku kapljice reakcijske zmesijodovica obarva rdeče rjavo (ne spremeni barve v temno vijolično), si zapomni čas od začetkahidrolize. Če je ves škrob razgrajen, preveri še z nekaj ponovitvami. Če ne dobiš več temnomodrega obarvanja, si zapiši čas, ko se je prvič pojavilo rdeče rjavo obarvanje. Pri nekaterihpogojih hidroliza škroba ne bo potekla tudi po nekaj minutah, v teh primerih si zapiši, dareakcija ne poteče.

NAMIGI: Začni s sobno temperaturo, nato z ostalimi meritvami. Hitrost zajemanja kapljic prilagodi pričakovanjem o hitrosti encimske reakcije pri

določenih pogojih. Ne izklopi štoparice, ko se prvič pojavi rdeče rjava barva, ampak počakaj na potrditev.


Vpliv pHV štiri epruvete epruvete a, b, c in d odpipetiraj po 5 mL škrobovice. V epruveto a dodaj 0,5mL 0,1 mol/L HCl, v b dodaj 0,5 mL 0,005 mol/L ocetne kisline, v c 0,5 mL 0,1 mol/LNa2CO3 in d 0,5 mL vode. Izberi si eno od epruvet, v katero odpipetiraj 0,5 mL raztopine -amilaze. Dobro premešaj na vrtinčniku in določi čas pri katerem pride do hidrolize škroba.Postopaj enako kot v primeru, ko si določeval odvisnost hitrosti razgradnje od temperature.Čas v katerem je prišlo do hidrolize škroba, določi za vse štiri primere. Preden epruvetepomiješ, izmeri pH vrednosti reakcijskih zmesi. To narediš tako, da vsebino posamezneepruvete preliješ preko indikatorskega papirčka in si zapišeš pH.

Vpliv koncentracije kloridaPripravi si dve epruveti v katerih boš razredčil raztopino -amilaze. V prvo epruvetoodpipetiraj 0,5 mL raztopine -amilaze, ki si jo uporabljal za določevanje vpliva temperaturein pH-ja na hitrost reakcije, in 4,5 mL H2O, v drugo pa 0,5 mL raztopine -amilaze in 4,5 mL0,2 mol/L NaCl. Vsebino obeh epruvet dobro premešaj z vrtinčnikom.Za določevanje vpliva koncentracije kloridnih ionov na hitrost reakcije si označi in pripravidve epruveti. V obe odpipetiraj po 5 mL škrobovice. Nato odpipetiraj v eno od epruvet 0,5mL encima razredčenega z raztopino NaCl, dobro premešaj na vrtinčniku in z jodovico določičas, ko je prišlo do hidrolize škroba. Čas hidrolize škroba določi tudi za encim, ki je bilrazredčen z vodo.

3.2.4 RezultatiČas, v katerem je potekla hidroliza škroba pri posameznih pogojih si zapiši v preglednico.Izračunaj tudi vrednost 1/thidrolize, ki je sorazmerna s hitrostjo encimske reakcije. Nariši grafa,v katerih s stolpci ponazori odvisnost hitrosti encimsko katalizirane reakcije (1/thidrolize) odtemperature in pH.

Preglednica rezultatov 3.2.4

VPLIV TEMPERATURE VPLIV pH VPLIV Cl

T(oC)

thidrolize

(s)1/thidrolize

(s-1)pH thidrolize

(s)1/thidrolize

(s-1)Cl thidrolize

(s)1/thidrolize

(s-1)DANE

Reagenti raztopina -amilaze 1 % raztopina škroba


0,1 mol/L jodovica 0,1 mol/L HCl 0,005 mol/L CH3COOH 0,1 mol/L Na2CO3

0,2 mol/L NaCl destilirana H2O

PriborEpruvete, porcelanske ploščice, steklene palčke, štoparica, termostat, merilne in polnilnepipete, pH papir, kapalke, led, termometri, čase, kuhalnik, papirne brisače, vrtinčnik.


BELEŽKE K VAJI


4 KM kisle fosfataze

4.1 Splošen uvod

Pri prejšnji vaji smo ugotovili, da temperatura, pH, kofaktorji in aktivatorji vplivajo na hitrostencimsko kataliziranih reakcij. Kako pa je z vplivom koncentracije encima in substrata nareakcijsko hitrost?V tipični reakcijski zmesi je mnogo več molekul substrata kot molekul encima. To pomeni, dadelovanje ene molekule encima ne vpliva na delovanje druge molekule encima v raztopini, sajzaradi tega, ker je v raztopini mnogo večja koncentracija substrata, molekuli encima netekmujeta za vezavo in pretvorbo iste molekule substrata v produkt. Če koncentracijo encimapodvojimo, bo nastalo dvakrat več molekul produkta na časovno enoto, kar pomeni, da boreakcijska hitrost dvakratna. Hitrost encimsko katalizirane reakcije se torej linearno povečujes koncentracijo encima.Poglejmo si še vpliv koncentracije substrata na reakcijsko hitrost! Tudi v tem primerupredpostavimo, da sta molekuli encima zadosti narazen, da ne vplivata druga na drugo. Čezačnemo z majhno koncentracijo substrata bo tudi hitrost encimsko katalizirane reakcijemajhna. Z večanjem koncentracije substrata se hitrost reakcije seveda povečuje, saj encimlahko veže in pretvori več molekul substrata na časovno enoto. Toda ali gre tako vneskončnost? Ali se hitrost reakcije z večanjem koncentracije linearno povečuje? Spoznalboš, da temu ni tako. Znano je, da večina encimov lahko pretvori od 1 do 10 000 molekulsubstrata v produkt na sekundo. Čas, v katerem poteče vezava substrata, nastane aktivacijskikompleks in se tvori produkt, ni neskončno kratek. Predočimo si torej razmere, ko vse boljpovečujemo koncentracijo substrata. Encim je »polno zaseden« ves čas in koncentracijasubstrata v okolici encima ni več omejujoč faktor za večjo hitrost. Encim je dosegel svojmaksimum. Pretvori lahko določeno število molekul substrata na časovno enoto in nič več. Čev teh razmerah povečujemo koncentracijo substrata, to ne bo imelo nobenega vpliva več nareakcijsko hitrost. Pri velikih koncentracijah substrata je torej hitrost encimske reakcijepraktično neodvisna od koncentracije substrata. Krivulja, s katero opišemo odvisnostreakcijske hitrosti od koncentracije substrata, ima hiperbolično obliko. Pri majhnihkoncentracijah substrata je prirast hitrosti skoraj linearen, z večanjem koncentracije substrataje prirast hitrosti vse manjši in ta limitira proti maksimalni hitrosti, ki je odvisna od paraencim substrat in pogojev, pri katerih poteka reakcija. Zdaj pa si poglejmo izpeljavo enačbe skatero opišemo odvisnost hitrosti od koncentracije substrata in pomen posameznihparametrov v izpeljani enačbi.

4.1.1 Izpeljava Michaelis-Mentenove enačbeModel, s katerim lahko opišemo odvisnost reakcijske hitrosti od koncentracije substrata zavečino encimov, sta leta 1913 predlagala biokemika Leonor Michaelis in Maud Menten.


Osnovna predpostavka modela je, da tvorita encim in substrat specifičen kompleks, ki jeintermediat na poti od substrata do produkta. Shema reakcije izgleda takole:

V tej enačbi E predstavlja encim, S substrat, ES je kompleks med encimom in substratom, Pprodukt, medtem ko so k1, k2, k3 in k4 konstante hitrosti reakcij.Izpeljana enačba, s katero opišemo odvisnost reakcijske hitrosti (v) od koncentracije substratav končni fazi izgleda takole:

Vidimo, da so v enačbi nekatere spremenljivke, ki v reakcijski shemi ne nastopajo, kakor tudi,da določenih spremenljivk, ki nastopajo v reakcijski shemi v končni enačbi ni. Na kakšennačin je bila torej zgornja enačba izpeljana?Za izpeljavo enačbe v takšni obliki so najprej potrebne nekatere poenostavitve:Koncentracija substrata je mnogo večja od koncentracije encima. To pomeni, da je delež

substrata, ki je vezan z encimom praktično zanemarljiv v primerjavi s skupno količinosubstrata.

Ker govorimo o začetni hitrosti encimske reakcije, lahko predpostavimo, da je koncentracijaprodukta tedaj tako majhna, da povratna reakcija, nastanek ES iz P in E, praktično nepoteka.

Najpočasnejša stopnja v reakciji je razpad kompleksa ES na encim in produkt.Koncentracija kompleksa encim-substrat se med reakcijo ne spreminja, oziroma je v

dinamičnem ravnotežju s substratom in produktom.

Izpeljavo začnemo tako, da definiramo hitrost nastanka produkta. Ker je najpočasnejšastopnja celotne reakcije razpad kompleksa ES na encim in produkt, je začetna hitrostencimske reakcije (nastanek produkta) odvisna le od koncentracije kompleksa ES in konstantek3.

E+S ES E + Pk1

k2

k3

k4

v = k3 [ET][S]

[S] +

(k2 + k3)

k1

KM = Vmax =k3[ET](k2 + k3)

k1

Vmax

[S]

[S] + KM

v =

; ;

Če v prvi enačbi nadomestimo posamezne izraze dobimo;


Zdaj je potrebno definirati koncentracijo kompleksa ES. Najprej definiramo hitrost nastankakompleksa ES ter hitrost razpada kompleksa ES.

S preureditvijo enačbe dobimo:

Na tej stopnji definiramo novo konstanto – KM (Michaelis-Mentenova konstanta).

Vstavimo KM v enačbo in dobimo:

Na začetku smo že definirali, da je koncentracija prostega substrata skoraj enaka koncentracijiskupnega substrata, saj je le majhen del vezan v kompleks z encimom. Ker pa je encimamnogo manj kot substrata, ne moremo zanemariti deleža encima, ki je vezan s substratom.Zato definiramo skupno koncentracijo encima [ET], ki je vsota koncentracij prostega encima[E] in tistega, ki je vezan v kompleksu s substratom [ES].

[ET] = [E] + [ES]

[ES] =[E][S]

(k2+k3)/k1

KM =k2+k3

k1

[ES] =[E][S]

KM

dPt

= v = k3[ES]

hitrost nastanka kompleksa ES = k1[E][S] + k4[E][P]

hitrost razpada kompleksa ES = k2[ES] + k3[ES]

k1[E][S] (k2 + k3)[ES]=

Člen, ki vsebuje koncentracijo produkta zanemarimo,ker predpostavimo, da je ta skoraj enaka nič.

Ker privzamemo, da se koncentracija kompleksa ES ne spreminja, je hitrost nastanka kompleksaenaka hitrosti razpada tega kompleksa.


Koncentracijo prostega encima lahko zapišemo tudi kot razliko med skupno koncentracijo inkoncentracijo encima, ki je vezan v kompleksu. Takrat se enačba za koncentracijo kompleksazapiše:

Iz te enačbe izrazimo koncentracijo kompleksa ES, saj je le-ta sorazmerna reakcijski hitrosti.Zgornjo enačbo lahko zapišemo tudi na naslednji način:

Zdaj lahko izraz za koncentracijo kompleksa encim substrat vstavimo v enačbo, s katero smodefinirali hitrost encimske reakcije (hitrost nastanka produkta).

V primeru, ko je koncentracija substrata zelo velika, postane kvocient enak 1. Takrat jedosežena tudi maksimalna hitrost encimske reakcije.

v(c ) = k3ET = Vmax

Zdaj lahko zapišemo tudi končno obliko tako imenovane Michaelis-Mentenove enačbe

Michaelis-Mentenova enačba zelo dobro opisuje eksperimentalne rezultate za večinoencimsko kataliziranih reakcij.

4.1.2 Razlaga in pomen parametrov KM, Vmax in kcat/KM

Michaelis-Mentenova konstanta, KM

Iz Michaelis-Mentenove enačbe lahko vidimo, kako se spreminja reakcijska hitrost pri zelomajhnih in zelo velikih koncentracijah substrata. Ko govorimo o veliki in majhnikoncentraciji substrata, se to vedno nanaša na primerjavo s konstanto KM, ki ima enake enotekot S, torej mol/L. To kar je za nek par encim substrat velika koncentracija substrata, je zadrug par encim substrat lahko majhna koncentracija substrata. V splošnem pa velja, da so KM

[ES] =KM

([ET - [ES])[S]

[ES] = [ET][S]

[S] +KM

Vmax

[S][S] +KM

v =

v = k3 [ET][S]

[S] + KM


vrednosti za večino parov encim substrat v mol/L in mmol/L območju. Poglejmo kako je vprimeru, če je koncentracija substrata mnogo manjša od KM. Takrat lahko člen S vimenovalcu enačbe zanemarimo in dobimo, da je hitrost encimske reakcije linearno odvisnaod koncentracije substrata (v [S]). Drugo skrajnost predstavljajo zelo velike koncentracijesubstrata, takrat zanemarimo KM v imenovalcu: Koncentraciji substrata v števcu inimenovalcu se pokrajšata, kar pomeni, da je takrat hitrost encimske reakcije maksimalna in jeneodvisna od koncentracije substrata (dv/d[S] = 0).Kakšen pa je pravzaprav pomen konstante KM? Ena od predpostavk, s katero smo izpeljaliMichaelis-Mentenovo enačbo je bila, da je hitrost razpada kompleksa encim-substrat naprodukt in prost encim »ozko grlo« celotne reakcije. Kar z drugimi besedami pomeni, da jekonstanta hitrosti reakcije k3 najmanjša. V primeru, ko je k3 << k2 in k1, se zapis enačbe za KM

poenostavi na izraz:

Disociacijska konstanta kompleksa ES v encim in substrat je v tem primeru enaka Michaelis-Mentenovi konstanti (Kdis = KM).

Velika konstanta Kdis pomeni, da je ravnotežje bolj pomaknjeno v smeri reaktantov kot pa vsmeri reakcijskega kompleksa. V tem primeru, ko sta Kdis, oziroma KM, velika ima encimrelativno majhno afiniteto za substrat, kar pomeni, da je potrebna velika koncentracijasubstrata, da bo velik delež encima v kompleksu s substratom [ES]. Obratno pa majhnavrednost KM pomeni, da se substrat izjemno močno veže na encim in bo maksimalna hitrostdosežena že pri majhni koncentraciji substrata.Omenili smo že, da ima KM enote koncentracije. Pa si poglejmo, katero koncentracijosubstrata KM pravzaprav predstavlja. Če vstavimo v Michaelis-Mentenovo enačbo namesto[S] kar KM, dobimo izraz:

KM je torej tista koncentracija substrata, pri kateri je začetna hitrost encimsko kataliziranereakcije (V) enaka polovici maksimalne hitrosti (Vmax), oziroma tista koncentracija substrata,ko je v časovnem povprečju 50 % aktivnih mest molekul encima zasedenih s substratom.Krivulja, s katero opišemo odvisnost hitrosti od koncentracije substrata je prikazana na sliki(4.1).

KM =k2

k1

Kdis =[E][S][ES] =

k2

k1= KM

v =Vmax

2; velja takrat, ko je [S] = KM


Slika 4.1: Michaelis-Mentenov diagram.

Maksimalna hitrost encimske reakcije, Vmax

Maksimalna hitrost encimske reakcije je enaka produktu konstante hitrosti razpada kompleksaES in skupni koncentraciji encima.

Vmax = k3[ET] = kcat[ET]

Konstanta k3, ki je vključena v enačbo, se imenuje tudi katalitična konstanta (kcat) alipretvorbeno število (ang. turnover number). Konstanta kcat nam pove največje število molekulsubstrata, ki jih ena molekula encima pretvori v produkt v enoti časa. Vrednost Vmax jedosežena takrat, ko je encim popolnoma zaseden s substratom. kcat je seveda odvisna od paraencim-substrat in od ostalih pogojev, pri katerih poteka reakcija.

Katalitična učinkovitost, kcat/KM

Če nekako posplošimo, so učinkoviti tisti encimi, ki lahko pretvorijo mnogo molekulsubstrata na časovno enoto (velika kcat) ter tisti encimi, ki imajo veliko afiniteto za substrat(majhna KM). Težko torej rečemo kateri parameter je bolj pomemben, zato katalitičnoučinkovitost encima najbolje opišemo s kvocientom kcat/KM. V praksi velja, da ta kvocient nemore biti večji od 109 L/mol/s, saj je to z difuzijo pogojena največja hitrost srečevanja encimain substrata v raztopini.

K M

V max

V max/2

Csubstrata (mol/L)

v reakcije (mol x L-1 x s-1)



4.2.1 Namen vajeSpoznal boš, kako je hitrost encimsko katalizirane reakcije odvisna od koncentracijesubstrata. Izmeril in izračunal boš hitrosti encimsko katalizirane hidrolize pri različnihkoncentracijah p-nitrofenilfosfata. Iz pridobljenih podatkov boš narisal Michaelis-Mentenovdiagram, iz katerega boš ocenil maksimalno hitrost encimsko katalizirane reakcije (Vmax) inkoncentracijo substrata, pri kateri je dosežena polovica maksimalne hitrosti (KM).

4.2.2 OsnoveEncim, kateremu boš določil Michaelis-Mentenovo konstanto, KM, je kisla fosfataza (EC3. 1. 3. 2.), izolirana iz pšeničnih kalčkov. Kisla fosfataza katalizira hidrolizo estrovortofosforjeve kisline in spada v skupino hidrolaz. Encim katalizira odcep fosfata iz različnihsubstratov, kot so ATP, glukoza-6-fosfat, glicerol-2,3-bisfosfat. Je zelo razširjen encim in senahaja v rastlinah, živalih in mikroorganizmih. Kisla fosfataza se izraža v pšeničnih kalčkih vveč izoencimskih oblikah, ki imajo relativno molekulsko maso okoli 55 000. Optimalen pH zahidrolizo estrov je za različne izoencime med pH 4 in pH 5,5. Aktivnost kisle fosfataze jeodvisna od koncentracije določenih ionov. Encim je inhibiran s fluoridnimi ioni ter sproduktom hidrolize, s fosfatom. Kationi kot je npr. Mg2+ pa so aktivatorji nekaterih kislihfosfataz.Potrebne podatke za določitev KM kisle fosftataze dobiš tako, da spektrofotometrično določiškoncentracijo p-nitrofenola, ki se sprosti pri hidrolizi dinatrijeve soli p-nitrofenilfosfata pri pH5,7 in 37 oC, ki po dodatku KOH preide v rumeno obarvan p-nitrofenolatni anion (slika 4.2).

O

NO2

PO3Na2

+ +H2O Na2HPO4

OH

NO2

OH

NO2 NO2

O-

+ H+

Slika 4.2: Prikaz nastanka p-nitrofenolatnega aniona.


Bazo dodamo zato, da denaturiramo encim in prekinemo reakcijo ter hkrati olajšamodetekcijo produkta. Molarni absorpcijski koeficient p-nitrofenolatnega aniona pri 405 nmznaša 18,8103 Lmol-1cm-1. Po dodatku baze izmerimo absorbanco vzorca. Večja kot jekoncentracija p-nitrofenolata po določenem času hidrolize, večja je hitrost encimskokatalizirane reakcije. Ker substrat tudi sam počasi hidrolizira, pri čemer nastaja p-nitrofenol,je potrebno posebej izmeriti absorbanco raztopin substrata določene koncentracije brezdodatka encima. Izmerjeno absorbanco za slepi vzorec nato odštejemo od absorbanceustreznega vzorca substrata, katerega smo hidrolizirali z encimom. Iz razlike absorbanc zuporabo Beer Lambertovega zakona izračunamo koncentracijo p-nitrofenola v molL-1, ki jeprodukt encimske hidrolize. Hitrost encimsko katalizirane reakcije (molL-1min-1)izračunamo tako, da koncentracijo produkta delimo s časom hidrolize.

4.2.3 IzvedbaPriprava raztopin z različnimi koncentracijami substrataKer bomo spremljali hitrost encimske reakcije pri različnih koncentracijah substrata, jepotrebno najprej pripraviti različne razredčitve substrata. Pripravi in označi si devet epruvet.V vsako epruveto odpipetiraj različne volumne raztopine substrata (p-nitrofenilfosfat) skoncentracijo 0,05 mol/L in destilirano vodo. Posamezne epruvete dobro premešaj in jihshrani.

Preglednica priprave raztopin z različnimi koncentracijami substrata

Epruvete A B C D E F G H IVsubst. (mL)

0 0,025 0,050 0,100 0,250 0,500 1,000 2,500 5,000VH2O (mL)

5,000 4,975 4,950 4,900 4,750 4,500 4,000 2,500 0


Encimska hidroliza substrataV označene epruvete (1-9) odpipetiraj acetatni pufer, raztopino MgCl2, ustrezno razredčensubstrat (A1, B2, C3,...) in vodo. Z acetatnim pufrom zagotovimo ustrezen pH zadelovanje encima, raztopino magnezijevega klorida dodamo zato, ker vsebuje Mg2+ ione, kiso aktivatorji kisle fosfataze. Posamezne epruvete prenesi v termostatirano kopel in jihnajmanj 5 minut inkubiraj pri 37 oC. Po končani inkubaciji dodajaj v posamezne epruvete v30 sekundnih intervalih raztopino encima, dobro premešaj z vrtinčnikom in prenesi nazaj vkopel. Po točno petih minutah, prekini reakcijo z dodatkom 2,5 mL raztopine KOH skoncentracijo 0,5 mol/L. Epruvete dobro premešaj z vrtinčnikom in jih odloži na stojalo polegkopeli. Raztopine, v katerih je potekla hidroliza se obarvajo rumeno. Vsebine epruvet rahlopomotnijo, saj se obori slabo topen Mg(OH)2. Da se oborina hitreje posede, epruvete za nekajsekund centrifugiramo. Bistro raztopino prelij v kiveto in izmeri absorbanco pri 405 nm.Spektrofotometer predhodno umeri na nič z raztopino, ki je v prvi epruveti (slepi vzorec).

Preglednica izvedbe encimske hidrolize substrata

Epruvete 1 2 3 4 5 6 7 8 9

VNaCH3COO (mL)0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

VMgCl2 (mL)0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Vrazred. substr. (mL)0,5 A 0,5 B 0,5 C 0,5 D 0,5 E 0,5 F 0,5 G 0,5 H 0,5 I

VH2O (mL)2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7 2,7

Vencima (mL)0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8

VKOH (mL)2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

Neencimska hidroliza substrata (slepi vzorec)Pri izvedbi eksperimenta in meritvah za neencimsko hidrolizo postopaš popolnoma enako kotz ustreznimi vzorci. Edina razlika je, da v postopku raztopino encima nadomestiš z destiliranovodo. Tako namesto 2,7 mL destilirane vode dodaš 3,5 mL destilirane vode.

Inkubiraj najmanj 5 min pri 37 oC;nato v 30 sekundnih intervalih dodaj

Hidroliza poteka točno 5 min pri 37 oC;nato v 30 sekundnih intervalih dodaj


4.2.4 RezultatiZa posamezne epruvete izračunaj koncentracijo substrata v reakcijski zmesi takoj po dodatkuencima. Pri tem upoštevaj, da je volumen reakcijske zmesi 5 mL. Iz razlike v absorbanci medencimsko in neencimsko hidrolizo izračunaj koncentracijo produkta v epruveti po dodatkuKOH. Nato izračunaj množino produkta, ki nastane med hidrolizo. Pri tem upoštevaj, da jevolumen po dodatku KOH 7,5 mL. Iz znane množine nastalega produkta in volumna vkaterem je potekala reakcija (5 mL) izračunaj koncentracijo produkta v reakcijski zmesi tikpreden si prekinil reakcijo. Začetno hitrost encimske reakcije pri posamezni koncentracijisubstrata izračunaš tako, da koncentracijo produkta v reakcijski zmesi tik preden si prekinilreakcijo, deliš s časom hidrolize (5 min). Izračunane podatke za posamezne meritve vnesi vspodnjo preglednico.Nariši Michaelis-Mentenov diagram s katerim prikažeš odvisnost začetne hitrosti encimskereakcije od koncentracije substrata. Iz diagrama oceni vrednosti KM in Vmax.


Epruvete 1 2 3 4 5 6 7 8 9

csubstrata po dodatku encima (molL-1)

Avz - Asl

cprod. po dodatku KOH (molL-1)

nprod. v epruveti (mol)

cprod. pred dodatkom KOH (molL-1)

vreakcije (molL-1min-1)

KM =Vmax =

Reagenti 0,05 mol/L raztopina dinatrijeve soli p-nitrofenilfosfata 1 mol/L natrijev acetat, pH 5,7 0,1 mol/L raztopina MgCl2

raztopina kisle fosfataze (2,5 mg v 10 mL 1 mol/L natrijev acetat, pH 5,7) 0,5 mol/L KOH

Priborepruvete, termostat, 1 in 5 mL merilne pipete, avtomatske pipete, centrifugirke, centrifugaCentric 322B, spektrofotometer


BELEŽKE K VAJI


5 Kvantitativno določanje glikogena v živalskih tkivih

5.1 Splošen uvod

5.1.1 Struktura in funkcija glikogenaGlikogen je ogljikov hidrat. Je polimer sestavljen samo iz molekul glukoze, ki so povezane z(14) in z (16) glikozidnimi vezmi. Linearni del predstavljajo molekule glukozepovezane z (14) glikozidnimi vezmi, razvejanja pa omogoča (16)-glikozidna vez navsakih 8 do 12 glukoznih enot (slika 5.1). Ne glede na to kako velika je molekula glikogena,ima le-ta le en reducirajoči konec (prosta C1-OH skupina), vsi ostali konci pa sonereducirajoči. Glikogen je bolj razvejan polisaharid kot amilopektin (komponenta škroba). Vživalskih organizmih je glikogen glavni rezervni polisaharid. V živalskih organizmih senahaja v vseh celicah, največ ga je v jetrnih in mišičnih celicah. Vsebnost glikogena je večja vjetrnih celicah (do 10 % vlažne mase) kot v mišičnih celicah (do 2 % vlažne mase), vendar jezaradi večje mase mišic v teh več glikogena. Glikogen v mišičnih celicah ima relativnomolekulsko maso okrog 106, v jetrnih celicah pa tudi do 16 . 106 (do 105 glukoznih enot),vendar je kljub temu topen v vodi. V celicah je glikogen v granulah, v katerih so močnohidratizirane molekule tega polisaharida. Glikogen je rezervni polisaharid tudi v nekaterihkvasovkah in bakterijah.

Slika 5.1: Shematski prikaz dela strukture molekule glikogena.

Molarna koncentracija glikogena v jetrnih celicah je zelo majhna (okoli 0,01 mol/L), vendarvelika razvejanost molekule glikogena omogoča hitro prilagajanje organizma na povečanopotrebo po glukozi, saj se z iste molekule istočasno lahko odceplja več molekul glukoze.Prednost shranjevanja glukoze v obliki glikogena je tudi ta, da slednji ne prispeva k povišaniosmolarnosti (ima majhno molarno koncentracijo) znotrajceličnega okolja. Shranjevanjeproste glukoze, bi zelo povečalo osmolarnost, kar bi povzročilo vdor molekul vode v celice inposledično poškodbo celic.

nereducirajočikonec (16)-glikozidna vez

(14)-glikozidna vez


5.1.2 Metabolizem glikogenaOrganizem vzdržuje koncentracijo glukoze v krvi tako z razgradnjo kot s sintezo glikogena.Temu je namenjena predvsem regulacija razgradnje in sinteze glikogena v jetrih. Jetrniglikogen predstavlja rezervoar glukoze za potrebe organizma, ko je raven glukoze v krvimajhna (med obroki in pri stradanju). Velik potrošnik glukoze v organizmu so nevroni vmožganih, kjer je glukoza najpomembnejše “gorivo”. Glikogen v jetrih se izrabi že v 12 do24 urah, če vmes ne zaužijemo hrane, ki vsebuje ogljikove hidrate.V mišicah pa je ta proces reguliran predvsem za energijske potrebe samih mišic in necelotnega organizma. Pri veliki mišični aktivnosti se zaloga glikogena v mišicah lahko izčrpaže prej kot v eni uri. Sproščena glukoza iz glikogena predstavlja vir energije tudi prianaerobnih pogojih.Razgradnja glikogena poteka v več stopnjah: Encim glikogen-fosforilaza katalizira hidrolizo(14) glikozidnih vezi do četrte glukoze od mesta razvejanja. Klestilnii encim nato v prvistopnji katalizira prenos glukoznih enot s krajših na daljše verige in v drugi stopnji hidrolizo(16) glikozidne vezi na mestu razvejanja. Fosfoglukomutaza katalizira izomerizacijoglukoza-1-fosfata v glukoza-6-fosfat, ki se lahko vključi v metabolizem ogljikovih hidratov.Sinteza glikogena se prične z encimsko katalizirano vezavo glukoza-1-fosfata z UTP, pričemer nastane UDP-glukoza. Encim tirozin-glukoziltransferaza katalizira prenos glukoze izUDP-glukoze na OH skupino določenega tirozinskega ostanka proteina glikogenina.Glikogenin nato avtokatalitično poveže še 7 glukoznih enot z (14) glikozidno vezjo, kitako predstavljajo osnovo za nastanek glikogena. Nato encim glikogen-sintaza katalizirapovezovanje glukoz v linearno verigo glikogena, encim amilo-(1,41,6)-transglikozilaza paomogoči nastanek razvejitve z vezavo glukoze z (16) glikozidno vezjo. Povezavametabolizma glukoze in glikogena je predstavljena na sliki 5.2.

glukoza v krvi

Pi

Pi

fosforilaza in-1,6-glukozidaza

fosfoglukomutaza

glicerol (iz maščob)aminokisline (iz beljakovin)laktat (iz mišičnega tkiva)

glukoneogeneza

glukoza-6-fosfataza

H2O

glikogenoliza

JETRNI GLIKOGEN(glukoza)n

glukoza-6-fosfat

glukoza-1-fosfat

Slika 5.2: Povezava metabolizma glukoze in glikogena.

fosfoglukomutaza(citosol)

glukoza-6-fosfataza(citosol)

glikogen-fosforilaza(citosol)



5.2.1 Namen vajeDoločil boš masni delež glikogena v jetrih stradane in hranjene podgane.

5.2.2 OsnoveČe želimo določiti vsebnost glikogena v določenem tkivu, je potrebno tkivo najprej razkrojiti,da glikogen preide v raztopino. To lahko naredimo v močno alkalnem mediju ob segrevanju,pri čemer pride do hidrolize membranskih lipidov in sproščanja vsebine celic v raztopino.Glikozidne vezi v glikogenu so v močno alkalnem relativno stabilne, medtem, ko pri tehpogojih pride do hidrolize estrskih vezi v nukleinskih kislinah in hidrolize peptidnih vezi vproteinih. Glikogen lahko iz alkalne raztopine oborimo s spremembo polarnosti raztopine. Čevodni raztopini primešamo etanol, se polarnost topila zmanjša in glikogen, ki je zelo polarnamolekula, se pri teh pogojih izloči iz raztopine. Oborjeni glikogen po centrifugiranjuraztopimo v destilirani vodi in ga uporabimo za nadaljnje analize.Ena od metod za določanje glikogena je reakcija z antronom v koncentrirani kislini. Čeraztopino glikogena prenesemo v koncentrirano žveplovo kislino, poteče v kislem hidrolizaglikozidnih vezi v glikogenu in nastane glukoza. Monosaharidi v koncentrirani kislini nisoobstojni. Poleg hidrolize glikogena sledi tudi dehidracija sproščene glukoze, pri tem nastane5-hidroksimetilfurfural. Ta reagira z antronom, ki smo ga dodali skupaj z žveplovo kislino.Pri tem nastane zelenomodro obarvan produkt. Absorbanca nastalega produkta pri 620 nm jepremosorazmerna s koncentracijo glikogena, oziroma glukoze v raztopini.Molarnega absorpcijskega koeficienta nastalega produkta ne poznamo, zato si moramopomagati s standardno raztopino glukoze ali glikogena. Metoda je zelo podobna umeritvenikrivulji, razlika je ta, da izmerimo absorbanco nastalega produkta le pri eni koncentracijiglukoze, kar pomeni, da je metoda manj natančna. Povezavo absorbance in koncentracije takopri standardni raztopini kot pri vzorcu opišemo z Beer-Lambertovim zakonom.

lM

Ast

glukozest

stst

,620,620 lM

Avz

glukozevz

vzvz

,620,620

Če merimo pri enakih pogojih, v enaki kiveti in obakrat računamo z masno koncentracijoglukoze velja, da je:

620, st = 620, vz; Mst = Mvz; l = l

Če enačbi delimo, dobimo naslednji izraz:

glukozevz

glukozest

vz

st

AA

,620

,620


Iz katerega lahko izrazimo masno koncentracijo vzorca glikogena izraženega kot glukoza vkiveti.

glukozest

st

vz

glukozevz AA

,620

,620

Če hočemo izračunati masno koncentracijo glikogena v vzorcu, je potrebno upoštevatikorekcijski faktor, ker molekulski masi glukoze in glukoznega ostanka v glikogenu nistaenaki. Relativna molekulska masa glukoze je 180, glukoznega ostanka pa 162 (odcepi sevoda). Za raztopino v kateri je potekla hidroliza glikogena velja, da je molarna koncentracijav glikogenu vezanih glukoznih enot enaka molarni koncentraciji sproščenih molekul glukozepo hidrolizi. Povezava med masno koncentracijo glukoze in masno koncentracijo glukoznihostankov v glikogenu je naslednja:

glukozevzglikogenaenoteglukozne

glukoze

glukozevz

glikogenavz

glikogenuvenoteglukozne

glikogenavz

glukoze

glukozevz MMMM

9,0

Drug možen način razgradnje glikogenskih molekul, ki ga na vajah ne bomo izvajali, jekataliziran z encimom amiloglukozidazo. Pri tem se sprostijo molekule glukoze. V prisotnostiATP in encima heksokinaze poteče fosforilacija glukoze in nastane glukoza-6-fosfat. Encimglukoza-6-fosfat-dehidrogenaza, ki ga dodamo v reakcijsko mešanico, katalizira oksidacijoglukoze-6-fosfata do laktona, hkrati pa poteče redukcija NADP+ do NADPH, ki gaspektrofotometrično določamo pri 340 nm. Absorbanca raztopine pri 340 nm jepremosorazmerna s koncentracijo glikogena, oziroma glukoze v raztopini.

5.2.3 IzvedbaPriprava vzorcevOdtehtaj 1 g podganjih jeter ter jih prenesi v centrifugirko. Nato dodaj 3 mL 30 % KOH insegrevaj s kroglico pokrito centrifugirko 30 do 60 minut pri 100 0C, oziroma dokler tkivo nerazpade in ne dobiš rdeče opalescentne suspenzije. Prvih 5 minut suspenzijo mešaj s steklenopalčko, kasneje jo samo občasno dobro premešaj. Po končanem segrevanju raztopino ohladina ledu, dodaj 6 mL 95 % etanola in 0,5 mL nasičene raztopine (NH4)2SO4. Vse dobropremešaj in segrej v vreli vodni kopeli. Tik preden raztopina zavre, odstavi epruveto, davsebina ne prekipi. Nato ohladi centrifugirke v ledeni vodi, centrifugiraj 5 minut pri 3000min-1 in speri oborino dvakrat s 3 mL 95 % etanola. Končno oborino raztopi v destilirani vodiin sicer glikogen iz jeter stradane podgane v 10 mL, iz hranjene pa v 50 mL merilni bučki.


Določanje glikogena z antronskim reagentomPravo območje koncentracije vzorca hranjene podgane dosežeš tako, da ga v epruvetirazredčiš na petkratni volumen (0,2 mL vzorca iz bučke dodaš 0,8 mL destilirane vode).Vzorca stradane podgane ni potrebno redčiti. K 1 mL ustrezno pripravljenega vzorca, ki gapredhodno preneseš v ledeno kopel, počasi dodajaš 5 mL antronskega reagenta. Po nekajsekundah vsebino premešaj z vrtinčnikom.Podobno postopaj s standardno raztopino glukoze, kjer 1 mL raztopine s koncentracijoglukoze 50 g/mL , ki je v ledeni kopeli, počasi dodajaš 5 mL antronskega reagenta. Po nekajsekundah vsebino premešaj z vrtinčnikom. Slepi vzorec pripraviš na enak način, le da imašnamesto raztopine glukoze 1 mL destilirane vode.Vse tri epruvete nato hkrati prenesi v vrelo vodno kopel, kjer jih segrevaj 10 minut. Nato jihhitro ohladi in izmeri absorbanco pri 620 nm. Instrument predhodno umeri na nič s slepimvzorcem.

5.2.4 RezultatiIzmeri absorbanco nastalega produkta in vrednosti vpiši v preglednico. Izračunaj masnokoncentracijo glukoze v kiveti za standardno raztopino in vrednosti vpiši v preglednico.Izračunaj masno koncetracijo glikogena v kiveti za vzorec. Upoštevaj razredčitev in izračunajmasno koncentracijo glikogena v bučki. Upoštevaj volumen bučke in izračunaj masoglikogena v bučki, ki je enaka masi glikogena v zatehti. Izračunaj masni delež glikogena vjetrih hranjene in stradane podgane.


A620nm glikogena v

kiveti

(mg/mL)

glikogena v

bučki

(mg/mL)

Vbučke

(mL)mglikogena v

bučki (mg)mjeter

(mg)glikogena v

jetrih (%)

stradanapodganahranjenapodgana

A620nm glukoze v kiveti

(mg/mL)standardnaraztopina

Reagenti 30 % KOH 95 % etanol (NH4)2SO4, nasičena raztopina


standardna raztopina glukoze: 0,05 mg/mL; svežo raztopino glukoze pripravi tako, daosnovno raztopino s koncentracijo glukoze = 1 mg/mL ustrezno razredčiš z destiliranovodo

0,2 % raztopina antrona v koncentrirani H2SO4; uporabljaj sveže pripravljeno raztopino

Priborcentrifugirke, steklene palčke, kroglice, pipete (1 mL, 5 mL, 10 mL), merilne bučke (10mL, 50 mL), kivete, centrifuga Centric 322B, spektrofotometer, filtrni papir, celičnina,posoda z ledom.

OPOMBAZa izvedbo vaje je bilo potrebno rediti in usmrtiti nekaj podgan, za kar smo tudi pridobilidovoljenje ustrezne etične komisije. Živali so bile pred usmrtitvijo omamljene, da niso trpele.


BELEŽKE K VAJI


6 Izolacija in karakterizacija molekul DNA

6.1 Splošen uvodMolekula DNA, ki je nosilka dedne informacije v celici, je polimer sestavljen izdeoksiribonukleotidnih monomernih enot. Vsak monomer je sestavljen iz treh segmentov:dušikova organska baza, pentoza in fosfat. Molekule DNA tvorijo štiri različnideoksiribonukleotidi, ki se s fosfoestrskimi vezmi povezujejo v polimere z več deset milijonimonomernih enot. Štirje deoksiribonukleotidi se razlikujejo le v organski bazi, ki je lahkoadenin, timin, gvanin ali citozin, vsi pa vsebujejo eno fosfatno skupino in deoksiribozo(preglednica 6.1).

Preglednica 6.1: Vsak nukleotid, ki je sestavni del molekul DNA in RNA, je zgrajen izorganske baze, pentoze in fosfata

ORGANSKE BAZE OGLJIKOVI HIDRATI FOSFAT

ADENIN (DNA in RNA)

GVANIN (DNA in RNA)

-D-DEOKSIRIBOZA(DNA)

FOSFAT (DNA in RNA)

CITOZIN (DNA in RNA)

TIMIN (DNA)

-D-RIBOZA(RNA)

URACIL (RNA)

NC

N

CCC N

CN

NH2

H

HH

3 2

1O

4 H

H

H

OH

CH25

H

OH

H

OH

OH P

O

O

O

NC

N

CCC N

CN

O

H

HNH2

H

NC

NCC

CNH2

HO

H

H

3 2

1O

4 H

OH

H

OH

CH25

H

OH

H

OH

NC

NCC

CO

HO

CH3H

H

NC

NCC

CO

HO

HH

H

PENTOZI


Slika 6.1: Struktura ribonukleotida, ki vsebuje organsko bazo adenin. Na ribozo je lahkovezana ena fosfatna skupina (AMP), dve fosfatni skupini (ADP) ali tri fosfatne skupine(ATP).

6.1.1 Struktura molekul DNA Posamezne deoksiribonukleotidne enote se povezujejo v polimere na enak način. Fosfat, ki jevezan na 5’ koncu, se vedno poveže z OH skupino na 3‘ koncu “sosednjega”deoksiribonukleotida. To je tudi edina možna povezava, saj ima ciklična oblika deoksiribozele 3 proste OH skupine, dve pa sta pri deoksiribonukleotidu že zasedeni. Na mestu 1’ je N-glikozidna vez z organsko bazo, na mestu 5’ pa je vezan fosfat. Posamezendeoksiribonukleotidni monomer polimerne molekule DNA kot že omenjeno sestavljajo trijesegmenti. Zanimivo je pogledati, koliko kovalentnih vezi tvorijo posamezni segmentideoksiribonukleotidne enote v polimeru. S slike (slike 6.2 ) je razvidno, da ima deoksiribozatri kovalentne povezave (organska baza na mestu 1’, “lasten fosfat” na mestu 5’ , in fosfat“sosednjega” deoksiribonukleotida na mestu 3’ ), fosfat dve kovalentni povezavi (vezava namesto 5’ “lastne” deoksiriboze in vezava na mesto 3’ “sosednje” deoksiriboze) in organskabaza le eno kovalentno povezavo (N-glikozidna vez na 1’ koncu “lastne” deoksiriboze). Iznaštetega je popolnoma jasno, da organske baze niso vpletene v polimerne povezavo, saj bibile za to potrebni najmanj 2 kovalentni povezavi. Ogrodje polimerne molekule DNA torejsestavljata deoksiriboza in fosfat, ki sta izmenično povezani s fosfodisterskimi vezmi,organska baza pa je kot nekakšen privesek “obešena” na deoksiribozo. Imeti mora torejkakšno drugo funkcijo. Če pogledamo strukturo štirih organskih baz opazimo, da vsevsebujejo primarno aminsko skupino, imajo v purinskem ali pirimidinskem obroču vezan

adenozin-5'-monofosfat (AMP)

adenozin-5'-difosfat (ADP)

adenozin-5'-trifosfat (ATP)

anhidridna vez estrska vez

N-glikozidna vez

O P

O

O

O P

O

O

O

3 2

1O

4 H

OH

H

OH

CH2

5

H H

OP

O

O

N

NC

N

CCC

CN

NH2

HH

'

' '

' '


dušik, vse razen adenina pa tudi keto skupino (C=O). Za takšne funkcionalne skupine oziromastrukturne elemente je značilno, da lahko tvorijo vodikove vezi.

Slika 6.2: Povezovanje deoksiribonukleotidov v polinukleotidno verigo z dvemafosfoestrskima vezema preko 3’ in 5’ OH skupin deoksiriboze. V procesu polimerizacije sevgrajujoči nukleotidi preko fosfata zaestrijo z OH skupino na C3 atomu deoksiribozezadnjega nukleotida v že sintetizirani verigi.

Predstavljajmo si enoverižne molekule DNA v vodni raztopini. Tvorile se bodo številnevodikove vezi: z vodo, znotraj lastne molekule, z drugimi molekulami. Kaj se bo zgodilo vprimeru, če imamo v raztopini takšne molekule DNA, kjer bo možno maksimalno številovodikovih vezi med dvema molekulama? Takšne molekule se bodo seveda povezovala medseboj, saj bo to energetsko ugodno, še posebej zato, ker so organske baze relativno nepolarnein ni najbolj ugodno, če so izpostavljene polarnemu topilu. V primeru tesne povezave medbazami ne bo nobenega prostora več za molekule vode in nepolarne organske baze se bodomočno povezovale s hidrofobnimi interkacijami, kar bo poleg vodikovih vezi zelo

O P

O

O

O

O P

O

O

O

3 2

1O

4 H

H

H

CH2

5

H

BAZA

H

3 2

1O

4 H

H

H

CH2

5

H

BAZA

H

O P

O

O

O

3 2

1O

4 H

H

H

O

CH2

5

H

BAZA

H

3' in 5'fosfodiesterskivezi

smer rasti polinukleotidne verigev procesu polimerizacije molekule DNA

NUKLEOTID 1

NUKLEOTID 2

NUKLEOTID 3

'

'

'

'

'

'

'

'

'

'

'

'

'

'

'


stabiliziralo strukturo, kjer sta dve verigi DNA tesno skupaj. Takšni molekuli DNA, kjer jemožno maksimalno število vodikovih vezi imenujemo komplementarni verigi. To, kateri bazisi morata stati nasproti, da bo prišlo do optimalne tvorbe vodikovih vezi, je seveda odvisno odstrukture, oziroma od razporeditve proton donorskih in proton akceptorskih skupinposamezne baze. Optimalna razporeditev je dosežena takrat, ko si na verigah stojita nasprotiadenin (A) in timin (T), oziroma gvanin (G) in citozin (C) (slika 6.3.). Pri tem ni važno katerabaza je na določeni verigi, možna je tako povezava C-G kot tudi povezava G-C. Ko sepovežeta bazna para A in T, se vedno tvorita dve vodikovi vezi, v primeru povezave G in Cpa se tvorijo tri vodikove vezi. Iz naštetega torej sledi, da morata biti na komplementarnihverigah, na mestu kjer je na eni verigi baza G na drugi verigi nujno C, in če je na eni verigi nadoločenem mestu T, mora biti na drugi zagotovo A. Razvidno je, da je že na eni verigi zadostiinformacij za nukleotidno zaporedje druge verige. To dejstvo predstavlja osnovo za rast inrazmoževanje celic, saj lahko v procesu podvojevanja DNA iz ene dvoverižne molekulenastaneta dve popolnoma enaki dvoverižni molekuli DNA.

Slika 6.3. Med bazama adenin in timin na nasprotni strani dvojne vijačnice se vzpostavita dvevodikovi vezi (zgoraj), med bazama gvanim in citozin pa tri vodikove vezi (spodaj).

Dvoverižna molekula DNA ima določeno tridimenzionalno strukturo, ki je seveda odvisna odlastnosti gradnikov. Polarna fosfat in deoksiriboza, sta izpostavljena vodi, nepolarne baze paso usmerjene v notranjost molekule, stran od vode. Optimalna razporeditev je takšna, da DNAprivzame vijačno strukturo, saj se na ta način zmanjša razdalja med bazami, ki so naloženeena vrh druge (urejene kot stopnice v spiralnem stopnišču), in ojačajo hidrofobne interakcije.

deoksiriboza

NC

N

CCCN

CN

N

HH

H H

deoksiriboza

fosfat

fosfat

deoksiriboza

deoksiriboza

fosfat

fosfat

NC

CCN

CO

CH3

O

H

H

NC

N

CCCN

CN

O

HN

H

H

H

CN

CNC

CH

O

HN

H

H


DNA ima torej obliko dvojne vijačnice, ki ima lahko različne konformacije (strukture).Največkrat se DNA nahaja v obliki B (B-DNA), ki je tudi prevladujoča nativna konformacijav celici. Za to strukturo je značilno, da so pari baz praktično pravokotni na os dvojnevijačnice. V dolžini enega zavoja se nahaja 10,5 baznih parov. Poznani sta tudi A-DNA, ki setvori pri določenih pogojih kot je majhna vlažnost, in Z-DNA, za katero je značilno, da ima zarazliko od A-DNA in B-DNA, ki imata desno vijačnico, levo vijačnico.

6.1.2 Stabilnost molekul DNAKromosomska DNA je zelo velika molekula in jo je zaradi tega težko izolirati v intaktni,nepoškodovani obliki. Za izolacijo visokomolekularne DNA se uporablja več postopkov, vkaterih ločimo DNA od RNA in proteinov. Pri izboru postopka je potrebno poznati vplivrazličnih fizikalnih in kemijskih dejavnikov ter encimov na stabilnost DNA in občutljivostvezi v molekuli.V postopkih izolacije moramo paziti na pH, saj so vodikove vezi med komplementarnimibazami obstojne le med pH 4 in pH 10. Hidroliza kovalentnih estrskih vezi med deoksiribozoin fosfatom znotraj posamezne verige poteče, če je pH manjši od 3 in višji od 12. Prekinejo selahko tudi N-glikozidne vezi med purinskimi bazami (adenin in gvanin) in ribozo. Dohidrolize teh vezi pride, če je pH manjši od 3.Višanje temperature negativno vpliva na vodikove vezi in hidrofobne interakcije med bazamina komplementarnih verigah. Pri povišani temperaturi se te vezi prekinejo in DNA sedenaturira. Temperaturo, pri kateri je 50 % molekul DNA v denaturirani obliki, imenujemotemperatura tališča in jo označimo s Tm. Tm večine molekul DNA je pri fizioloških pogojih vobmočju od 80 oC do 90 oC in je odvisna od nukleotidne sestave. Molekule DNA z večjimdeležem baznih parov G-C (tri vodikove vezi) se denaturirajo pri višji temperaturi. Tm sepoveča tudi v okolju z veliko ionsko jakostjo, saj so v tem primeru vodikove vezi močnejše inzmanjša se elektrostatski odboj med negativno nabitimi fosfatnimi skupinami. Fosfoestrskevezi in N-glikozidne so pri fiziološkem pH stabilne pri temperaturi vrelišča vode prinormalnem zračnem tlaku.Več različnih encimov lahko razgradi DNA. Če hočemo izolirati DNA v intaktni obliki, jepotrebno inhibirati te encime. Največje poškodbe lahko povzročijo deoksiribonukleaze, kikatalizirajo hidrolizo fosfoestrskih vezi med nukleotidi. Ti encimi so prisotni v vseh tkivih inpotrebujejo za aktivnost Mg2+ ione, ki so kofaktorji deoksiribonukleaz.Zaradi izjemne dolžine v primerjavi s širino molekule, je DNA zelo krhka in občutljiva namehanske poškodbe. Predvsem strižne sile, ki nastopajo pri nekaterih načinihhomogenizacije, lahko poškodujejo molekulo DNA. Posledica mehanskih poškodb jepredvsem krajšanje dolgoverižne DNA, ki je posledica cepitve fosfoestrskih vezi. Tepoškodbe največkrat ne vplivajo na parjenje baz in sekundarno strukturo DNA.

6.1.3 Postopki izolacije molekul DNAObstaja več postopkov izolacije iz različnih tkiv, vsem pa je skupno to, da je glavni namenizolacije dobiti intaktno DNA v čim bolj čisti obliki.


6.1.3.1 Sproščanje DNA iz celicPrva faza izolacije navadno vključuje različne tehnike homogenizacije v primeru večceličnihorganizmov oziroma metode, s katerimi razbijemo celično steno, če jo organizmi imajo. Kotkivo homogeniziramo, moramo paziti, da ne poškodujemo molekul DNA. Za rastlinska tkivaje zelo primerno zamrzovanje v tekočem dušiku in drobljenje krhkega tkiva v terilnici.Uporabimo lahko tudi hipoosmotske pufre, v katerih dosežemo, da celica nabrekne in poči. Zaizolacijo iz bakterijskih celic je priporočljivo uporabiti lizocim, ki katalizira hidrolizoglikozidnih vezi peptidoglikanske celične stene. Pufri morajo v začetnih fazah izolacijevsebovati tudi citratne ione ali EDTA, ki kompleksno vežejo dvovalentne katione (Mg2+,Ca2+, Mn2+). Pomembna je predvsem vezava ionov magnezija in mangana, ki sta kofaktorjadeoksiribonuklaz. V primeru vezave v kelatni kompleks, je koncentracija prostih kationov vraztopini, ki bi se lahko vezali na deoksiribonukleazo, tako majhna, da je ta neaktivna in DNAostane nepoškodovana.

6.1.3.2 Deproteinizacija DNADruga faza izolacije vključuje različne tehnike s katerimi oslabimo interakcije med DNA inproteini, na katere je vezana. Največkrat se uporablja NaDS, anionski detergent, ki raztopifosfolipidno membrano, hkrati pa denaturira veliko večino proteinov, vključno zdeoksiribonukleazo in histoni na katere je vezana DNA. Negativno nabit NaDS se veže nahistone, ki imajo zelo velik delež bazičnih aminokislin, in tako oslabi interakcije z negativnonabito DNA (fosfatne skupine). Ionske interakcije med DNA ter histoni in bazičnimipoliamini (spermin, spermidin), ki se ravno tako vežejo na DNA, še dodatno oslabimo spovišano ionsko jakostjo, če dodamo NaCl ali NaClO4, in z alkalnim pH-jem. Za odstranitevproteinov lahko uporabimo tudi določene peptidaze (proteinaza K), ki so aktivne pri majhnikoncentraciji NaDS.Iz kompleksne mešanice različnih molekul in ionov je zdaj potrebno izolirati DNA. Delnoočiščeno DNA dobimo že, če mešanico centrifugiramo. Denaturirani proteini se posedejo,topna DNA pa ostane v supernatantu. Bolj čisto DNA dobimo, če dodamo organski topili kotsta kloroform in izoamilalkohol v razmerju 24:1. Ti dve organski topli se ne mešata z vodo,zato se vzpostavi fazna meja med gostejšo organsko in redkejšo vodno fazo. Na fazni meji sepo centrifugiranju izločijo denaturirani in z organskimi topili oborjeni proteini, v organskofazo se ekstrahirajo nepolarni lipidi, v vodni fazi pa ostane raztopljena DNA.

6.1.3.3 Obarjanje DNAPolarno DNA lahko iz vodne raztopine izločimo in oborimo z dodatkom manj polarnegatopila (etanol), ki se meša z vodo. Oborjeno, viskozno DNA lahko navijemo na steklenopalčko. V primeru, če želimo zelo čisto DNA, lahko postopek odstranjevanja proteinov zorganski topili in obarjanja DNA z etanolom večkrat ponovimo. Včasih je potrebno odstranititudi RNA. To najlažje dosežemo, če jo v začetnih fazah izolacije razgradimo z dodatkomribonukleaze.



6.2.1 Namen vajeIz telečjega priželjca boš izoliral DNA. Spoznal boš pomen posameznih stopenj v postopkuizolacije. Seznanil se boš s pojmom denaturacija DNA in ugotovil, kako je struktura dvojnevijačnice odvisna od pH in temperature.

6.2.2 UvodNa vaji bomo izvedli skrajšan postopek izolacije DNA iz telečjega priželjca. Najprej bomopriželjc homogenizirali v ustreznem pufru in s centrifugiranjem ločili jedra od vodotopnihproteinov in RNA. Sediment, v katerem so jedra in ostanki celic, bomo raztopili v pufru, kivsebuje detergent in NaCl. Z detergentom bomo raztopili jedrno membrano in denaturiralihistone. Z veliko koncentracijo NaCl bomo še dodatno oslabili ionske interakcije med DNAin histoni. Po centrifugiranju bo DNA v supernatantu. Dodali bomo etanol in oborili DNA terjo navili na stekleno palčko. Izolirano DNA bomo dokazali z difenilaminskim reagentom, ki zdeoksiribozo, sestavnim delom DNA, tvori modro obarvan produkt.Vzporedno z izolacijo DNA bomo določali tudi vpliv temperature in pH na strukturo lososoveDNA. Merili bomo absorbanco raztopine DNA pri 260 nm pri različnih temeperaturah in pH-jih. Ker imajo organske baze, ki so v stiku s topilom večji molarni absorpcijski koeficient, boimela enoverižna DNA večjo absorbanco kot dvoverižna. Narisali bomo graf odvisnostiabsorbance od temperature in pH ter določili temperaturo tališča DNA.

6.2.3 Izvedba6.2.3.1 Izolacija DNAHomogeniziranje telečjega timusa in ločevanje DNA od vodotopnih proteinov in RNA0,5 g telečjega timusa razreži na drobne koščke in prenesi v steklen homogenizer z rotirajočimteflonskim batom. Dodaj 10 mL citratnega pufra in homogeniziraj na ledu 3 minute.Homogenizat prelij v centrifugirke in centrifugiraj v laboratorijski centrifugi 5 minut pri3500 min-1. Supernatant odlij, sediment pa še dvakrat speri s citratnim pufrom. Po vsakemspiranju centrifugiraj 5 minut pri 3500 min-1.Raztapljanje jedrne membrane in denaturacija histonov ter sprostitev DNA v raztopinoSediment po tretjem centrifugiranju prenesi v steklen homogenizer in dodaj 25 mL citratnegapufra, ki vsebuje detergent NaDS. Zmes homogeniziraj na ledu 1 minuto, da raztopiš čvrstooborino. Zmes občasno premešaj in pusti stati 30 minut na sobni temperaturi. Raztopinapostane zaradi sproščene DNA zelo viskozna. Nato dodaj 3 mL nasičene raztopine NaCl(5,4 mol/L), dobro premešaj s palčko in pusti 5-10 minut na ledu. Ohlajeno zmes centrifugiraj20 minut pri 3500 min-1.Obarjanje DNAPo centrifugiranju se zmes loči v dve fazi. Zgornja bistra faza vsebuje raztopljeno DNA,spodnja motna faza pa vsebuje poleg DNA še denaturirane proteine. Zgornjo bistro fazo


previdno prelij v čašo. Vanjo počasi ob stalnem vrtenju steklene palčke vlivaj dvojni volumenmočno ohlajenega 96 % etanola. DNA je v etanolu netopna in se izloči v obliki želatinozneoborine, ki jo naviješ na palčko.Dokazna reakcija za deoksiribozo v DNAIzolirano DNA raztopi v epruveti s 3 mL citratnega pufra. V drugo epruveto odpipetiraj 1mlraztopine DNA in 2 mL difenilaminskega reagenta. Reakcijsko mešanico segrevaj 10 minut vvreli vodi, da se pojavi modra barva, ki nastane zaradi reakcije difenilamina z deoksiribozo. Stem posredno dokažemo, da smo izolirali DNA.

6.2.3.2 Denaturacija DNAVpliv pH na stabilnost dvojne vijačnicePripravi 5 epruvet in jih označi. V vsako epruveto odpipetiraj 1,5 mL ustreznega pufra zrazličnim pH-jem. Nato v vsako epruveto odpipetiraj 1,5 mL raztopine lososove DNA.Inkubiraj na sobni temperaturi najmanj 5 minut, nato izmeri absorbanco pri 260 nm.Instrument predhodno umeri na 0 z destilirano vodo.

Vpliv temperature na strukturo dvojne vijačnicePripravi 5 epruvet in jih označi. V vsako epruveto odpipetiraj 1,5 mL pufra s pH 7. Nato vvsako epruveto odpipetiraj 1,5 mL raztopine lososove DNA. Posamezne epruvete inkubiraj 5minut na temperaturah 40 oC, 60 oC, 70 oC, 80 oC in 100 oC. Po končanem segrevanjuepruvete takoj prenesi na led. Ko se raztopine ohladijo, pomeri absorbanco pri 260 nm.

6.2.4 RezultatiIzpolni spodnji preglednici ter nariši grafa s katerima predstaviš odvisnost absorbance od pH-ja in temperature dentauracije. Iz grafa za temperaturno odvisnost določi temperaturo tališčaDNA.


pH 2 pH 4 pH 7 pH 10 pH 12 20 oC 60 oC 80 oC 100 oCA260

Reagenti: telečji timus citratni pufer: 0,015 mol/L raztopina natrijevega citrata z 0,15 mol/L NaCl) NaDS reagent (4 % raztopina natrijevega dodecilsulfata v 45 % etanolu) SSC + NaDS reagent (50 mL SSC reagenta + 5,6 mL NaDS reagenta) NaCl, trden 96 % etanol, ledenomrzel pufri pH 2 (0,25 mol/L fosfat), pH 4 (0,25 mol/L acetat), pH 7 (0,25 mol/L fosfat); pH

10 (0,25 mol/L karbonat) in pH 12 (0,25 mol/L fosfat)


lososova DNA s koncentracijo 100 g/mL raztopljena v 0,005 mol/L Tris-u pH 7 in0,1 mol/L NaCl

difenilaminski reagent; uporabi vedno sveže pripravljeno raztopino iz 10 g difenilaminav 1 L konc. CH3COOH in dodaj 25 mL konc. H2SO4

Priborškarje, pincete, homogenizator, centrifugirke, laboratorijska centrifuga Centric 322B, čaše,steklene palčke, pipete (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL), merilni valji, led, termostatiranekopeli


BELEŽKE K VAJI


7 Izolacija kisle fosfataze iz pšeničnih kalčkov

7.1 Splošen uvod

Biokemiki opisujejo procese znotraj živega bitja na ravni molekul. Da bi spoznali lastnosti instrukturo posameznih spojin, je potrebno te izolirati iz celic v katerih je še na tisoče drugihspojin. Eno od osnovnih vlog v celici imajo različni proteini. Postopki izolacije proteinov soše posebej zahtevni, saj je biološka funkcija proteinov pogojena z njihovo tridimenzionalnostrukturo, ki jo med izolacijo ne smemo porušiti. V pričujočem poglavju so predstavljenerazlične tehnike ekstrakcije proteinov iz biološkega materiala, metode, ki jih uporabljamo zakoncentriranje, tehnike, s katerimi odstranimo nizkomolekulske snovi iz raztopin proteinov innačine, s katerimi ugotovimo, ali smo s postopki izolacije uspeli očistiti določen protein.

7.1.1 Detekcija proteinovPreden pristopimo k izolaciji določenega proteina moramo imeti vsaj eno metodo s katerolahko določimo koncentracijo določenega proteina v mešanici različnih proteinov. Osnovninamen izolacije je čim bolje očistiti protein. Seveda v vsaki stopnji izolacije izgubimo nekajproteina, vendar je to kompromis, ki ga moramo sprejeti. Nekaj proteina bomo izgubili,vendar bo ta v vsaki naslednji stopnji bolj čist. V dosedanjem poteku vaj smo že spoznali,kako se določa koncentracijo vseh proteinov. Uporabimo lahko različne metode, ki so opisanev drugi vaji. Kako pa določimo vsebnost tistega proteina, ki ga želimo izolirati? To jerelativno enostavno, če je ta protein encim. Takrat je smiselno izbrati metodo, ki temelji namerjenu aktivnosti tega encima. Čim več produkta bo nastalo pri določenih pogojih, večja jekoncentracija encima v vzorcu. Če pa ne poznamo biološke vloge proteina, ki ga želimoizolirati, oziroma ta ni encim, moramo izbrati druge metode za spremljanje prisotnostiproteina med izolacijo. Čistost proteinov lahko spremljamo še z različnimi imunološkimi inelektroforetskimi tehnikami (glej 10. vajo).

7.1.2 Vir proteina Predpostavimo, da želimo izolirati določen protein iz večceličnega organizma. Seveda velja,da imajo vse somatske celice tega organizma enak dedni material in vsebujejo gen za protein,ki ga želimo izolirati. To, da vse celice vsebujejo ta gen, pa še ni zadosten pogoj, da bo v vsehtkivih in organih prišlo do ekspresije, oziroma izražanja gena in sinteze proteina. Nekateriproteini se res izražajo v vseh celicah organizma. Za mnoge pa velja, da je njihovo izražanjetkivno, oziroma časovno pogojeno. Nekateri proteini se lahko izražajo le v začetnih fazahrazvoja organizma, oziroma le v določeni organih. Ko pristopimo k izolaciji, moramo torejizbrati tkivo, ki vsebuje zadostno koncentracijo željenega proteina. Inzulin bomo sevedaizolirali iz slinavke in ne iz krvi, kjer je njegovo koncentracija precej manjša. Obratno boseveda veljalo za hemoglobin, kjer je kri zagotovo najboljša izbira. Pri tem katero tkivo aliorgan izberemo je potrebno upoštevati še nekatere druge kriterije. Če je v določenem organu


velika koncentracija spojin, ki inhibirajo aktivnost proteina, ki ga želimo izolirati, oziroma garazgrajujejo, to tkivo kljub relativno veliki koncentraciji proteina ne bo najbolj primerno zaizolacijo. Zanemariti pa ne smemo niti etičnih kriterijev ter odpornosti tkiva na začetnestopnje homogenizacije. Kožo npr. mnogo težje homogeniziramo kot različne notranjeorgane. Delo s človeškimi tkivi zahteva veliko previdnost in posebna dovoljenja, zato bomo vprimeru, če izolacija humanega proteina ni nujen pogoj za uspeh našega dela, morda izbraliorgane kakšnega drugega sesalca.

7.1.3 HomogenizacijaPotem, ko smo izbrali izhodni material za izolacijo, lahko pristopimo k homogenizaciji tkiva.Homogenizacija je postopek, kjer z različnimi tehnikami razbijemo organe in tkiva naposamezne celice, ki jim nato razbijemo celične membrane in stene, če jih imajo, da seznotrajcelična vsebina sprosti. V nekaterih redkih primerih tkiva ni potrebno homogenizirati.To velja za tiste proteine, ki jih celice izločajo v gojišče (različni mikroorganizmi) ali vtelesne tekočine (slina, limfa, kri).

Kakšne tehnike homogenizacije poznamo?Celice lahko mehansko zdrobimo s tolkačem v možnarju, dodamo abrazivno snov kot jepesek; homogeniziramo z rotirajočim teflonskim batom v stekleni epruveti ali z mešali znožki.Pogostokrat izkoristimo lastnost, da se pri zmrzovanju v celici tvorijo kristali vode, kipoškodujejo membrano. Uporablja se tudi zamrzovanje v tekočem dušiku, kjer celicepostanejo zelo krhke in jih lahko mehansko zdrobimo.Izkoristimo lahko ozmotski šok. Če živalske celice prenesemo v vodo, bodo le te zaradirazlike v koncentraciji topljencev nabreknile in počile. Ta metoda ni primerna za bakterijskein rastlinske celice, ki jih obdaja še celična stena.Za homogenizacijo lahko uporabimo tudi ultrazvok, kjer z vibracijami poškodujemo celičnomembrano. Homogeniziramo lahko tudi s spremembami tlaka, kjer v posebni komoristisnemo tkivo do nekaj 100 atmosfer, nato hitro odpremo ventil in celice zaradi ekspanzijeplinov popokajo.Za porušenje strukture membran lahko uporabimo tudi razne detergente, ki raztapljajo celičnomembrano. Uporabljeni detergenti seveda ne smejo vplivati na strukturo proteinov.Oviro, ki jo pri homogenizaciji predstavljajo celične stene, lahko odstranimo z uporaborazličnih encimov, ki le to razgradijo. Pogostokrat se uporabi lizocim, ki katalizira hidrolizodoločenih glikozidnih vezi v peptidoglikanih celične stene nekaterih bakterij.

7.1.4 Stabilizacija homogenataProteini so v celici v okolju z ustreznim pH, temperaturo, ionsko jakostjo, polarnostjo inoksidoredukcijskim potencialom. Ko celice homogeniziramo, se te razmere drastičnospremenijo, zato je potrebno z dodatkom določenih snovi in kontrolo fizikalnih parametrovzagotoviti takšne razmere, da bo protein, ki ga želimo izolirati, ohranil nativno strukturo inbiološko aktivnost.


pH v celici je reguliran z naravnimi pufri kot je fosfatni pufer. Ker se proteini največkratireverzibilno denaturirajo pri ekstremnih pH vrednostih, je potrebno tkivo homogenizirati vustreznem pufru. Največkrat uporabljamo fosfatni in Tris pufer, ki sta uporabna pri fiziološkihpH vrednostih (pH okoli 7).Aktivnost in stabilnost določenih proteinov je mnogokrat pogojena z določenimi ioni inionsko jakostjo, zato dodajamo v pufre za ekstrakcijo tudi različne soli. Na drugi strani imamomembranske proteine, katerih naravno okolje je relativno nepolarno. Če hočemo pristopiti kizolaciji teh proteinov, moramo dodati v ekstrakcijski pufer detergente ali organska topila, sajse v zelo polarnem okolju membranski proteini lahko denaturirajo.Določeni ioni težkih kovin kot so Ag+, Cu2+, Pb2+ in Hg2+ lahko destabilizirajo strukturoproteinov in vplivajo na aktivnost, posebej tistih proteinov, ki imajo proste tiolne skupine(cistein). Takrat lahko dodamo v ekstrakcijski pufer EDTA, ki veže dvovalentne katione.Dodatek EDTA ima lahko še en pozitiven učinek, saj z njim inhibiramo delovanjemetalopeptidaz, ki potrebujejo kovinske ione za kofaktorje. Mnogokrat se v ekstrakcijskepufre dodaja tudi inhibitorje ostalih peptidaz. Ta »koktejl« v veliki meri zavre encimskoaktivnost peptidaz, ki bi drugače lahko razgradile iskani protein na manjše peptide.Oksidoredukcijski potencial je zelo pomemben za zvitje določenih encimov in tvorbodisulfidnih povezav, ki stabilizirajo proteine. V celici je ta natančno reguliran z reducirano inoksidirano obliko glutationa. Ker se te razmere pri homogenizaciji zaradi zračnega kisikaporušijo, v ekstrakcijske pufre pogostokrat dodamo reducente kot so cistein, ditiotreitol in 2-merkaptoetanol. Ustrezen oksidoredukcijski potencial je zelo pomemben tudi za encime, kjerje aminokislinski ostanek cisteina vključen v katalitični mehanizem (npr. cisteinskepeptidaze).Seveda ne smemo pozabiti na temperaturo, ki mora biti v večini primerov čim nižja. Samohomogenizacijo in vse nadaljnje postopke izolacije je najbolje izpeljati pri temperaturi okoli0 oC. Razloga za to sta predvsem dva. Z nizko temperaturo preprečimo denaturacijoproteinov, hkrati pa z nižanjem temperature upočasnimo encimske reakcije, ki bi lahkoprivedele do modifikacije in hidrolize proteina, ki ga želimo izolirati.

7.1.5 Obarjanje proteinovNajvečkrat uporabljena prva stopnja v izolaciji je obarjanje proteinov, ki jih potem raztopimov manjšem volumnu. Obarjanje lahko dosežemo s povišano koncentracijo soli, z dodatkomorganskih topil ali z ustreznim pH-jem kjer je topnost proteina najmanjša.

7.1.5.1 Obarjanje proteinov z veliko ionsko jakostjoTopnost proteinov v vodnih raztopinah je zelo odvisna od vrste in koncentracije soli oziromaod ionske jakosti raztopine. V splošnem velja, da pri majhnih koncentracijah soli topnostproteinov z višanjem koncentracije narašča. Do pojava, ki ga imenujemo vsoljevane pride, kermanjše koncentracije ionov v raztopini zmanjšajo privlačne ionske interakcije med nasprotnonabiti skupinami proteinskih molekul in s tem preprečijo povezovanje v večje skupke ter takoizboljšajo topnost. Pri večjih ionskih jakostih soli se zadeva obrne. Ioni soli in proteinizačnejo tekmovati za vodo v raztopini, kar privede do tega, da se solvatacijski plašč okoli


proteinov vse bolj tanjša. Proteini, ki so bili v primeru manjše ionske jakosti raztopine obdaniz veliko molekulami vode, se niso mogli povezovati med sabo. Zdaj, ko je solvatacijski ovojtanjši, se lahko začnejo proteini povezovati med sabo v večje agregate. Pojav imenujemoizsoljevanje. Bistvene za tvorbo agregatov so interakcije s hidrofobnimi, oziroma nepolarnimipovršinami proteinov. Proteini, ki imajo na površini več nepolarnih aminokislin se izsolijo primanjši ionski jakosti. Razlike v topnosti proteinov, ki so posledica razlik v hidrofobnostipovršine proteinov, lahko izkoristimo za selektivno, frakcionirno obarjanje. Za obarjanjeuporabljamo največkrat amonijev sulfat. Omenjena sol je primerna predvsem zato, ker jedobro topna pri nizkih temperaturah, kjer obarjamo proteine. Z obarjanjem pri nizkihtemperaturah zmanjšamo denaturacijo proteinov. Prednost amonijevega sulfata je tudi nizkacena čiste soli, majhna topilna entalpija (pri raztapljanju se sprošča malo toplote) in dejstvo,da ta sol celo stabilizira strukturo proteinov. Nekateri, kationi in anioni (Ca2+, Mg2+, I-, ClO4

-

,...), ki jih imenujemo kaotropni ioni, niso primerni za obarjanje, saj se neposredno vežejo naproteine in jih denaturirajo.

7.1.5.2 Obarjanje proteinov z organskimi topiliProteine lahko obarjamo tudi z vodotopnimi organskimi topili kot so aceton, metanol alietanol. Slabost obarjanja z organskimi topili je, da je stopnja denaturacije mnogo večja kot priobarjanju z amonijevim sulfatom in je zato primerna le za nekatere proteine. Obarjanjeproteinov v mešanici organskih topil in vode je posledica dejstva, da organsko topilo zmanjšadielektrično konstanto topila. Posledica so močnejše privlačne sile med nasprotno nabitimideli molekul. Ker je solvatacijski ovoj, ki ga tvori voda okoli proteinov, zaradi manjšeaktivnosti vode tanjši, se lahko proteini povezujejo z nasprotno nabitimi površinami vagregate, ki se posedejo na dno. Če velja za obarjanje z amonijevim sulfatom, da se bodonajprej oborili bolj hidrofobni proteini, pri obarjanju z organskimi topili velja, da se najprej(že pri manjšem deležu organskega topila) obarjajo proteini z bolj polarno površino.Nekaterih proteinov, kot so transmembranski proteini, z organskimi proteini sploh ne moremooboriti, saj so zaradi hidrofobne površine relativno dobro topni v nepolarnih topilih. Proteineje možno obarjati tudi z neionskimi polimeri kot je polietilenglikol. Z izborom polimerov zrazlično molekulsko maso lahko dosežemo selektivno obarjanje proteinov glede namolekulsko maso, kar je največja prednost te metode.

7.1.5.3 Obarjanje proteinov v izoelektrični točkiProteini so sestavljeni iz aminokislin, ki imajo na stranskih verigah lahko kisle ali bazičneskupine. Površinski naboj proteina je seveda odvisen od pH-ja v katerem se ta nahaja. Čenižamo pH, se nekatere skupine lahko protonirajo (povečuje se pozitiven naboj), z višanjempH pa oddajajo protone (povečuje se negativen naboj). Celoten površinski naboj proteina jevsota vseh posameznih pozitivnih in negativnih nabojev. Z izborom ustreznega pH lahkodosežemo, da je neto naboj proteina na površini enak nič. To pH vrednost imenujemoizolektrična točka. Različni proteini imajo zaradi različne aminokislinske sestave različneizolektrične točke. Topnost proteinov v izoelektrični točki je najmanjša, kar je posledica


dejstva, da ni odboja med enako nabitimi deli površin molekul. Obarjanje v izoelektrični točkinajvečkrat kombiniramo z obarjanjem pri veliki ionski jakosti.

7.1.5.4 Ireverzibilno obarjanje proteinovZgoraj omenjene tehnike so primerne za reverzibilno obarjanje proteinov, ko le ti ohranijotridimenzionalno strukturo in aktivnost. Večkrat pa lahko uporabimo tehnike ireverzibilnegaobarjanja, kjer porušimo strukturo proteinov. Ireverzibilno obarjanje lahko uporabimo tudi vkombinaciji z reverzibilnim obarjanjem. Za primer vzemimo nek protein, ki je termično zelostabilen do 70 oC. To lastnost lahko izkoristimo tako, da mešanico proteinov segrejemo dotemperature 65 oC, ko se bo večina drugih proteinov denaturirala. Takšni raztopini potemdodamo amonijev sulfat, da se proteini, vključno s tistim, ki ga želimo izolirati, oborijo. Konastalo oborino raztopimo v pufru, bodo v raztopino prešli le tisti proteini, ki zaradidenaturacije niso izgubili nativne strukture. Primer ireverzibilnega obarjanja je nenazadnjetudi termična obdelava živil, npr. jajca, kjer denaturiramo proteine, da jih v prebavnem traktulažje razgradimo.Včasih je potrebno proteine kvantitativno izločiti iz raztopine, da bi lahko analizirali kakšnodrugo komponento. Takrat lahko uporabimo različna organska topila ali triklorocetno kislino.Posebej temeljito je obarjanje s triklorocetno kislino, saj v tem primeru ostanejo v raztopini lemanjši peptidi in proste aminokisline. Z velikimi koncentracijimi kislin in baz skoraj vednodenaturiramo proteine, vendar so lahko ti v nekaterih primerih relativno dobro topni, kljubdenaturiranemu stanju, zato to ni najbolj primerna tehnika za kvantitativno obarjanje. Prikoncentracijah kislin in baz s koncentracijo nekaj mol/L, pride pri povišani temperaturi že dohidrolize peptidnih vezi, kar izkoriščamo, ko želimo določiti aminokislinsko sestavoproteinov.

7.1.6 CentrifugiranjeCentrifuga je nepogrešljiv pripomoček pri izolaciji. S centrifugiranjem pospešimosedimentacijo oborjenih proteinov, z diferencialnim centrifugiranjem lahko izoliramoposamezne organele, posebne ultracentrifuge pa lahko uporabimo za karakterizacijomakromolekul. Tehnika centrifugiranja temelji na dejstvu, da se delci z različno gostoto,obliko in velikostjo različno hitro posedajo, ko na njih deluje centrifugalna sila. Medsedimentacijo delujejo na delce sile, ki so lahko nekaj stotisočkrat večje od zemeljskegagravitacijskega pospeška (g). Sila, ki deluje na delce v centrifugi je definirana kot:

F = m2r

F predstavlja centrifugalno silo, m maso delca na katerega deluje sila, r je razdalja delca odcentra rotacije in kotna hitrost (rd/s). Produkt 2r imenujemo tudi relativna centrifugalnasila (ang. RCF) in je odvisen tako od kotne hitrosti, kakor tudi od razdalje delca od središčavrtenja. RCF je tisti parameter, ki ga moramo poznati in nastaviti preden začnemocentrifugirati določen vzorec. Hitrost, s katero se delci gibljejo proti dnu centrifugirke,


imenujemo sedimentacijska hitrost. Definirana je kot premik molekul (dx) v smericentrifugalne sile na enoto časa (dt) in je sorazmerna pospešku centrifugalne sile.

v =dxdt

s r2

Sedimentacijski koeficient (s) je odvisen od makromolekule in se izraža s Svedbergovimienotami (1 S = 10-13 sekund). Vrednost sedimentacijskega koeficienta narašča z molekulskomaso in velikostjo molekule oziroma delca, odvisna pa je tudi od oblike. Po končanemcentrifugiranju dobimo pogostokrat bistro raztopino, ki jo imenujemo supernatant, na dnuostane sediment, oziroma oborina, imenovana tudi pelet.

7.1.7 Koncentriranje in razsoljevanje raztopin proteinovV procesu izolacije proteinov se pogostokrat zgodi, da želimo skoncentrirati določen vzorecna manjši volumen, odstraniti manjše molekule in ione, ali preprosto zamenjati pufer. Vtakšnih primerih lahko uporabimo tehnike dialize in ultrafiltracije.Dializa je primerna pri zamenjavi pufra in za razsoljevanje. Metoda temelji na uporabiporozne membrane, ki zadržuje molekule, ki so večje od por, medtem ko manjše neoviranoprehajajo skozi membrano. Dializna membrana je v obliki črevesa, ki ga napolnimo zvzorcem in na obeh koncih prevežemo ali kako drugače zatesnimo. Tako napolnjeno črevoprenesemo v večji volumen topila s katerim želimo zamenjati obstoječo raztopino. Razmerjemed volumnom tekočine v črevesu in topilom, proti kateremu dializiramo je največkrat vobmočju 1:100 do 1:1000. Zaradi difuzije bodo manjše molekule in ioni prosto prehajali skozipore in sčasoma bo koncentracija manjših molekul in ionov znotraj črevesa enakakoncentraciji zunanje raztopine. Ravnotežje je doseženo šele po daljšem času, zato jesmiselno difuzijo pospešiti z mešanjem in vsakih nekaj ur zamenjati dializni pufer, dapospešimo izmenjavo topljencev, ki lahko prehajajo skozi pore membrane.Ultrafiltracija je podobna dializi, saj tudi tu manjše molekule in ioni prehajajo skozimembrano. Osnovna razlika med dializo in ultrafiltracijo je, da je dializa pasiven proces,medtem ko pri ultrafiltraciji delujemo s silo na raztopino vzorca. Največkrat scentrifugiranjem ali z uvajanjem plina (dušika) nad raztopino. Skozi pore v membrani prehajatopilo in manjše molekule ter ioni. Proteini se vse bolj koncentrirajo, saj zaradi velikosti nemorejo prehajati skozi membrano. Po končani ultrafiltraciji lahko uporabimo skoncentriranvzorec, ali pa ga razredčimo z novim topilom. Postopek po potrebi lahko večkrat ponovimo.Danes ultrafiltracija vse bolj izpodriva dializo in pridobiva tudi širšo tehnološko uporabnost.Slabost ultrafiltracije je, da potrebujemo opremo, medtem ko ta pri dializi ni potrebna.Proteinske vzorce je mogoče skoncentrirati tudi tako, da odparimo topilo. Najbolj primernatehnika je liofilizacija, ki temelji na odparevanju pri nizkih temperaturah in majhnem tlaku.Odparevanje pri višjih temperaturah za proteine ni sprejemljivo, saj se ti denaturirajo.



7.2.1 Namen vajeNamen vaje je, da se seznaniš z nekaterimi osnovami in tehnikami čiščenja proteinov ter skoličinami kot so aktivnost, specifična aktivost in stopnja očiščenja, ki jih boš po končani vajiiz eksperimentalnih podatkov tudi izračunal.

7.2.2UvodV okviru vaje boš izvedel nekatere začetne stopnje v procesu izolacije kisle fosfataze. Onekaterih osnovnih značilnostih encima si lahko prebereš v četrti vaji. Encim boš izoliral izpšeničnih kalčkov. Koncentracijo encima v posameznih frakcijah boš določil z merjenemaktivnosti. Koncentracijo vseh proteinov boš določal z biuretsko reakcijo, ki si jo spoznal žepri drugi vaji. Proteine boš najprej ekstrahiral iz kalčkov z destilirano vodo. Določen deležekstrahiranih proteinov, vključno s kislo fosfatazo, boš oboril z amonijevim sulfatom. Vzorecboš med postopkom tudi termično obdelal pri temperaturi, kjer je kisla fosfataza še stabilna,precej drugih proteinov pa se denaturira. Na osnovi zbranih meritev boš izračunal specifičnoaktivnost v surovem ekstraktu in po končani izolaciji, ter določil stopnjo očiščenja.

Enota encimske aktivnosti (U)Ena enota encimske aktivnosti (1 U) je definirana kot tista množina encima, ki pretvori1 mol substrata v 1 minuti pri določenih pogojih. Ti pogoji se od encima do encimarazlikujejo; zajemajo pa parametre kot so temperatura, pH, koncentracija substrata, volumenreakcijske zmesi in trajanje reakcije. Ko določamo aktivnost encima, se moramo natančnodržati teh pogojev, saj le to zagotavlja primerljivost rezultatov. Uporablja se tudi novejšaenota za encimsko aktivnost: katal (okrajšano kat). To je tista množina encima, ki pretvori1 mol substrata v 1 sekundi (1 kat = 6107 U).

Aktivnost (U/mL)S pojmom aktivnost podajamo koliko enot encimske aktivnosti vsebuje 1 mL raztopinenekega encima. Predpostavi, da si določal encimsko aktivnost nekega vzorca. V reakcijskozmes si odpipetiral 0,3 mL raztopine vzorca in določil, da je po 5 minutah nastalo 18 molproduktov. V reakcijski zmesi je torej 3,6 U encimske aktivnosti. Ker si v test odpipetiral 0,3mL raztopine encima pomeni, da je aktivnost encima v vzorcu 12 U/mL. Včasih je smiselnopodajati tudi skupno aktivnost nekega vzorca. V tem primeru aktivnost, ki smo jo določili zanek vzorec, pomnožimo s skupnim volumnom vzorca.

Specifična aktivnostSpecifična aktivnost je količina, s katero opišemo čistost nekega proteina. Specifičnaaktivnost je kvocient med aktivnostjo (U/mL), s katero določamo vsebnost encima, ki gaželimo izolirati, in koncentracijo vseh proteinov (mg/mL) v nekem vzorcu. Specifičnaaktivnost ima enote U/mg.


Stopnja očiščenjaS stopnjo očiščenja podamo razmerje med specifičnima aktivnostima raztopin po in preddoločeno stopnjo izolacije. Stopnja očiščenja je brezdimenzijska količina in nam povekolikokrat je protein, ki ga želimo izolirati bolj čist po določeni stopnji izolacije. Če je stopnjaočiščenja večja od ena pomeni, da imamo po izolaciji bolj čist encim. Velika stopnjaočiščenja ne pomeni nujno, da pri izolaciji nismo imeli velikih izgub. Pove nam le, da smouspeli povečati kvocient med koncentracijo encima, ki ga želimo izolirati, in vsemi drugimi šeprisotnimi proteini.

7.2.3 IzvedbaEkstrakcija proteinov iz pšeničnih kalčkov in priprava bistre raztopine s centrifugiranjem10 g kalčkov drobno nasekljaj, prelij s 40 mL hladne vode in mešaj na ledu okoli 30 minut, dase izlužijo vodotopni proteini. Po končani ekstrakciji prelij ekstrakt preko vate, da odstranišsesekljane lističe. Filtrat prenesi v centrifugirke in centrifugiraj 10 minut pri 8500 min-1. Pokončanem centrifugiranju prelij filtrat (S-1) v merilni valj in izmeri ter zapiši volumen. Zaraditega, da oborina ne pade v supernatant, raztopino iz centrifugirke vedno prelivaš prekooborine, in ne tako, da je oborina nad tekočino. 2 mL od skupnega volumna prenesi vepruveto in shrani na ledu za nadaljnjo analizo.

Obarjanje proteinov z amonijeveim sulfatom in segrevanjem20 mL centrifugiranega filtrata prelij v 200 mililitrsko čašo in postavi na ledeno kopel. Natona ledeni kopeli počasi ob mešanju dodajaj 26,5 mL nasičene raztopine amonijevega sulfata(dodajanje naj traja okoli 5 minut). Po končanem dodajanju prestavi čašo v vročo vodo.Suspenzijo počasi mešaj s termometrom, dokler ne doseže temperature 60 oC. Takrat čašoprestavi na sobno temperaturo za točno 2 minuti (ne več!). Nato čašo prestavi v ledeno kopelin počasi mešaj s termometrom. Ko se ohladi, vsebino kvantitativno prenesi v dvecentrifugirki in centrifugiraj 10 minut pri 8500 min-1.

Raztapljanje z amonijevim sulfatom oborjenih proteinovPo končanem centrifugiranju kvantitativno odlij supernatant (bistra raztopina). Oborino vvsaki centrifugirki resuspendiraj v 3 mL hladne destilirane vode. Reverzibilno oborjeniproteini se raztopijo, denaturirani proteini pa ostanejo v oborini. Suspenzijo centrifugiraj 10minut pri 11000 min-1. Po končanem centrifugiranju je kisla fosfataza v raztopini (S-2), ki jo spipeto preneseš v merilni valj, izmeriš in zapišeš volumen. 2 mL od skupnega volumnaprenesi v epruveto in shrani na ledu za nadaljnjo analizo.

Določanje aktivnosti kisle fosfatazePripravi 3 epruvete in jih označi. V vsako od treh epruvet odpipetiraj: 0,5 mL acetatnega pufra pH 5,7 s koncentracijo 1 mol/L 0,5 mL MgCl2 s koncentracijo 0,1 mol/L 0,5 mL p-nitrofenilfosfata s koncentracijo 0,005 mol/L 3,3 mL destilirane vode.


Epruvete dobro premešaj in termostatiraj 5 minut pri 37 oC. V posamezne epruvete dodaj v 30sekundih intervalih 0,2 mL supernatanta S-1, 0,2 mL supernatanta S-2 in 0,2 mL destiliranevode. Vsako epruveto dobro premešaj z vrtinčnikom in takoj postavi nazaj v termostatiranokopel. Po točno petih minutah prekini reakcijo z dodatkom 2,5 mL raztopine KOH skoncentracijo 0,5 mol/L. Epruvete dobro premešaj z vrtinčnikom in jih odloži na stojalo polegkopeli. Vsebina epruvete rahlo zmotni, saj se obori slabo topen Mg(OH)2. Da se oborinahitreje posede, epruvete za nekaj sekund centrifugiramo. Bistro raztopino prelij v kiveto inizmeri absorbanco pri 405 nm. Spektrofotometer predhodno umeri na 0 z raztopino, v katerosi namesto supernatanta dodal vodo. Iz izmerjene absorbance izračunaj koncentracijo p-nitrofenola na enak način kot pri vaji določanje KM kisle fosfataze. Upoštevaj, da je volumenpo dodatku KOH 7,5 mL, in izračunaj množino nastalega p-nitrofenola. Deli množinosproščenega produkta v mol s trajanjem reakcije (5 min), da dobiš število enot encimskeaktivnosti v testu. Aktivnost encima v ekstraktu izračunaš tako, da število enot encimskeaktivnosti, deliš z volumnom vzorca supernatanta (0,2 mL), ki si ga dodal v test.

Določanje koncentracije vseh proteinovKoncentracijo proteinov v posameznih vzorcih supernatantov določi z biuretsko reakcijo. Zaumeritveno krivuljo pripravi standardne raztopine govejega serumskega albumina različnihkoncentracij kot je opisano v preglednici. Po dodatku biuretskega reagenta raztopino dobropremešaj, počakaj 30 minut in nato izmeri absorbanco pri 540 nm. Spektrofotometerpredhodno umeri na 0 z raztopino, v kateri sta samo biuretski reagent in voda. Iz dobljenihabsorbanc standardnih raztopin in koncentracije albumina v posameznih raztopinah narišiumeritveno krivuljo.

Preglednica priprave umeritvene krivulje za koncentracijo proteinov

Reagenti Številka epruvete1 2 3 4 5

A (mL) 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00B (mL) 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00C (mL) 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00prot v kiveti

(mg/mL)0 0,125 0,25 0,375 0,5

A540

A standardni raztopina govejega serumskega albumina ( = 2,5 mg/mL)B destilirana vodaC biuretski reagent


Meritve pri katerih določaš vsebnost proteinov v posameznih frakcijah (S-1 in S-2) izvajaštako, da 1 mL vzorca dodaš 4 mL biuretskega reagenta in dobro premešaš. Po 30 minutahizmeri absorbanco pri 540 nm. Iz umeritvene krivulje, ki si jo pripravil s standardnimiraztopinami, odčitaj neznani koncentraciji proteinov v kiveti. Pri izračunu koncentracijeproteinov v vzorcih S-1 in S-2 upoštevaj, da si pred meritvijo 1 mL vzorca razredčil s 4 mLbiuretskega reagenta.

7.2.4 RezultatiIzračunaj posamezne količine ter vpiši vrednosti v preglednico!


S-1 S-2Volumen (mL) 20Kisla fosfataza A405

cprodukta v epruveti po dodatku KOH

(molL-1) nprodukta v epruveti po dodatku KOH

(mol) nprodukta / t

(molmin-1) = 1U aktivnost v vzorcu(UmL-1) skupna aktivnost v vzorcu(U)

Proteini A540

v testu (mgmL-1) v vzorcu (mgmL-1) skupni proteini v vzorcu(mg)

Specifična aktivnost (Umg-1)Stopnja očiščenja 1


Reagenti pšenični kalčki destilirana voda nasičena raztopina (NH4)2SO4, pH 5,5 natrijev acetat pH 5,7 s koncentracijo 1 mol/L MgCl2 s koncentracijo 0,1 mol/L p-nitrofenilfosfata s koncentracijo 0,005 mol/L biuretski reagent (glej 2. vajo) KOH s koncentracijo 0,5 mol/L

Priborčaše, merilni valji, merilne pipete, avtomatske pipete, centrifuga Yanetzki T-24, centrifugaCentric 322B, steklene palčke, epruvete, termostat, led, kuhalnik, štoparica, spektrofotometer,vrtinčnik

Primer izračuna (!! Podatki, se ne ujemajo z eksperimentom!!)AktivnostPopolnoma hipotetično predpostavimo, da si po postopku opisanem v skripta, izmeril za S-1absorbanco pri 405 nm zaradi nastalega p-nitrofenola (405 =18 800 Lmol-1cm-1), ki imavrednost 0,25. Vstavi vrednost v enačbo za izračun koncentracije in dobimo, da jekoncentracija produkta v kiveti 1,3310-5 mol/L. Ker je volumen reakcijske zmesi po dodatkuKOH enak 7,5 mL, to ustreza množini 110-7 mol produkta. Ker je test trajal 5 minut topomeni, da je v eni minuti nastalo 210-8 mol produkta, kar ustreza 0,02 U (1U encima pripogojih testa pretvori 10-6 mola substrata v produkt na minuto). Ker smo v test dodali le 0,2mL vzorca, to pomeni, da je v enem mililitru petkrat toliko enot encimske aktivnosti 0,1 U/mL. Skupna aktivnost (imamo npr 35 mL S-1) pa je 3,5 U.Koncentracija proteinovZa določanje si vzel 1 mL supernatanta S-1 in 4 mL biuretskega reagenta. Iz umeritvenekrivulje odčitaš, da imaš v reakcijski mešanici 0,5 mg/mL proteina. Ker smo za test vzeli1 mL supernatanta in 4 mL biuretskega reagenta, je v supernatantu 5x večja koncentracijaproteinov (2,5 mg/mL). V vseh 35 mL imamo tako skupaj 87,5 mg proteinov.


BELEŽKE K VAJI


8 Kromatografija

8.1 Splošen uvod

Kromatografske metode so vse metode pri katerih se snov porazdeli med dve fazi, stacionarnofazo in mobilno fazo. Do porazdelitve snovi med obema fazama pride zaradi različne topnostiv stacionarni in mobilni fazi. Porazdelitev snovi med obema fazama količinsko določimo sporazdelitvenim (ang. distribution) kvocientom, Kd, ki predstavlja razmerje med množinosnovi v stacionarni fazi in mobilni fazi. Porazdelitveni kvocient je značilen za določen sistempri določeni temperaturi in za določeno snov. Snovi z enakimi porazdelitvenimi kvocienti nemoremo ločiti.Stacionarna faza je lahko trdna ali tekoča, mobilna faza pa tekočina ali plin. Mobilna faza segiblje preko ali skozi stacionarno fazo. Če s stacionarno fazo napolnimo kolono oz. steklenocevko, govorimo o kolonski kromatografiji. Glede na naravo interakcij snovi s stacionarnofazo lahko kromatografske metode delimo v širšem smislu na: Adsorpcijsko kromatografijo. Pri tej metodi se snovi, ki jih ločujemo, različno močnoadsorbirajo na stacionarno fazo in nato desorbirajo z mobilno fazo. Porazdelitveno kromatografijo. Pri tej metodi gre za ločevanje snovi na osnovi razlik vtopnosti med stacionarno fazo in mobilno fazo. V ožjem smislu v to vrsto kromatografijeuvrščamo plinsko kromatografijo. Ionsko izmenjevalno kromatografijo. S to kromatografijo se ločujejo snovi na osnovirazlične afinitete do nabitih skupin na stacionarni fazi. Izločitveno kromatografijo. Tu se snovi ločujejo na osnovi razlik v velikosti molekul.Primer tovrstne kromatografije je gelska kromatografija ali gelska filtracija, ki je edina vrstakromatografije, kjer separacija ne temelji na interakciji analita s stacionarno fazo. Afinitetno kromatografijo. Pri tej kromatografski metodi se snovi ločujejo na osnovirazlične biološke afinitete do snovi, ki je vezana na nosilec.

Zavedati se moramo, da se snovi pri nobeni vrsti kromatografije ne ločujejo le na osnovienega principa. Določena stopnja adsorpcije snovi na nosilec nastopi pri vseh vrstahkromatografij.

8.1.1 Gelska Filtracija8.1.1.1 Princip gelske filtracijeGelsko filtracijo pogostokrat imenujemo tudi gelska izključitvena kromatografija. Jekromatografska metoda, s katero ločujemo spojine glede na velikost. Ločujemo lahkoproteine, nukleinske kisline, ogljikove hidrate, kakor tudi vse ostale spojine, ki se razlikujejopo velikosti. Poleg ločevanja različno velikih molekul v preparativne namene lahko gelskofiltracijo uporabimo za določanje molekulske mase spojin in kvantitativno analizomedmolekulskih interakcij.Metoda se precej razlikuje od drugih kromatografij, saj za razliko od ostalih tehnik osnova zaločevanje ni interakcija spojine z mobilno in stacionarno fazo. Pri gelski filtraciji sestavljajo


stacionarno fazo kroglice gela, ki so bolj ali manj zamrežene (imajo večje ali manjše pore).Kroglice so hidratizirane in suha snov (polisaharidi, ki tvorijo mrežo) predstavlja le manjši delvlažne mase gela. S hidratiziranim gelom napolnjena kolona vsebuje tako hidratiziranekroglice gela kot tudi topilo, ki zapolnjuje prostor med in v kroglicah gela. Ko na takšnokolono nanesemo raztopino spojin, ki se razlikujejo v velikosti, ter skozi kolono vzpostavimopretok mobilne faze, spojine začnejo potovati proti izhodu iz kolone. Hitrost potovanja spojinskozi kolono se bo razlikovala glede na njihovo velikost. Velike spojine ne bodo moglevstopiti v mobilno fazo, ki je znotraj zamreženih kroglic gela. Manjše spojine bodo imele navoljo večji volumen, saj bodo lahko prehajale tako v prostor med kroglicami, kakor tudi vkroglice gela. Posledica tega bo, da bo hitrost potovanja večjih molekul precej večja kotmanjših molekul, ki bodo lahko prehajale v kroglice gela.Predpostavimo ekstremen primer, ko imamo zmes dveh spojin, kjer je spojina A tako velika,da ne pride v nobeno kroglico gela, medtem ko spojina B preide v vse kroglice gela. Volumenkolone napolnjene z gelom je npr. 30 mL, kar hkrati predstavlja celoten volumen mobilnefaze. Od tega je volumen tekočine med kroglicami gela 10 mL, volumen mobilne faze vkroglicah gela pa 20 mL. Če na takšno kolono nanesemo zmes spojin A in B ter priključimopretok mobilne faze, se bo spojina A iz kolone izločila že pri 10 mL mobilne faze, medtem kose bo spojina B izločila, ko bo skozi kolono preteklo 30 mL mobilne faze. V praksi zadeveniso črno bele, temveč lahko spojine bolj ali manj prehajajo v tekočino znotraj kroglic gela,kar pomeni, da lahko glede na različno velikost spojine pričakujemo, da se bo ta izločila pridoločenem volumnu med 10 in 30 mL. Pri koloni kot je opisana zgoraj se nobena spojina nemore izločiti prej kot v 10 mL in, če ni privlačnih interakcij med stacionarno fazo in analitom,tudi ne pri volumnih, ki so večji od 30 mL.

8.1.1.2 Parametri kromatografske separacijePri gelski kromatografiji lahko definiramo določene parametre, s katerimi opišemokromatografsko kolono in analizirano spojino.V0 Prosti ali “void“ volumen je volumen med kroglicami gela v koloni, ki ga zapolnjuje

mobilna faza. Eksperimentalno ta volumen največkrat določimo s pomočjo izrednovelike molekule kot je modri dekstran (relativna molekulska masa 2106).

Vt Skupni ali “total” volumen stebrička gela v koloni. To je volumen stebrička gela. Pritem volumnu se izločijo zelo majhne molekule. Če imamo stekleno valjasto kolonolahko skupni volumen enostavno določimo tako, da površino kolone na prerezupomnožimo z višino stebrička gela ( (notranji premer)2 (višina gela) = Vt)

Ve Elucijski volumen za določeno spojino je tisti volumen mobilne faze, pri katerem se taizloči iz kolone.

Kd Porazdelitveni koeficient je količina, s katero najbolje opišemo potovanje spojineskozi gel, saj je neodvisen od dimenzij kolone. Ve ni najprimernejša količina za tanamen, saj je odvisen od dimenzij kolone. Na vrednost Kd vplivajo lastnostianalizirane spojine in stopnja zamreženosti gela. Kd lahko zajame vse vrednosti med 0in 1. Zelo velike spojine bodo imele Kd blizu 0, zelo majhne pa vrednosti blizu 1.


KV VV Vde 0

t 0

8.1.1.3 Gelska filtracija proteinovNa področju biokemije se gelska filtracija največ uporablja za ločevanje proteinov povelikosti.Velikost proteinov in elucijski volumen sta tesno povezana z njihovo molekulskomaso. V splošnem velja, da večja kot je molekulska masa, večji je protein in manjši jeelucijski volumen. Za večino globularnih vodotopnih proteinov velja, da je elucijski volumenobratno sorazmeren z logaritmom relativne molekulske mase proteina:

)log(1

R

e MV

Do odstopanja prihaja pri tistih proteinih, ki imajo bolj podolgovato obliko, in se izločijo primanjšem volumnu, kot pa bi ga pripisali njihovi molekulski masi. Včasih prihaja do odstopanjtudi zato, ker ne moremo popolnoma preprečiti interakcij med proteinom in stacionarno fazo,kar ima za posledico večji elucijski volumen kot pa ustreza molekulski masi proteina.Interakcije med proteinom in stacionarno fazo lahko zmanjšamo, če delamo gelsko filtracijo vpufrih (mobilna faza), ki vsebujejo raztopino NaCl s koncentracijo okoli 200 mmol/L.Če hočemo z gelsko filtracijo oceniti molekulsko maso neznanega proteina, je potrebnokolono umeriti tako, da proteinom z znano molekulsko maso določimo elucijske volumne. Naosnovi poznanih elucijskih volumnov standardov potem določimo molekulsko maso proteina.Elucijski volumen je dejansko odvisen od premera hidratiziranega proteina. Zato imajodenaturirani proteini, ki imajo strukturo naključnega klopčiča, mnogo manjši elucijskivolumen kot proteini enake molekulske mase z nativno strukturo.Za ločevanje proteinov in drugih molekul lahko uporabljamo gele različne zamreženosti. Čeje naš interes, da bi ločevali predvsem molekule z manjšo molekulsko maso, bomo uporabiligele z večjo stopnjo zamreženja. Za ločevanje proteinov v območju velikih molekulskih maspa bomo uporabili manj zamrežene gele. Seveda bodo tisti geli, ki imajo dobro ločljivostspojin z velikimi molekulskimi masami manj uporabni za ločevanje manjših molekul inobratno.Morda je največja slabost gelske kromatografije majhna ločljivost analiziranih molekul, sajzaradi veliki difuzije le redko dobimo lepo ločene kromatografske vrhove. Ločljivost prigelski kromatografiji lahko izboljšamo tako, da uporabljamo dolge in ozke kolone (višina gelanaj bi bila vsaj 20-40 krat večja od premera kolone) ter nanašamo volumsko majhne količinevzorca (volumen kolone naj bo vsaj 30-100 krat večji od volumna vzorca, ki ga nanašamo nakolono.). Za kolikor toliko dobro ločbo naj volumen nanosa ne bi presegal 5 % volumna gela.

8.1.2 Ionska izmenjevalna kromatografijaIonska izmenjevalna kromatografija je ena najbolj razširjenih metod kolonske kromatografije,ki se uporablja v analizne in preparativne namene. Zelo pogosto to metodo uporabljamo vzačetnih izolacijskih postopkih proteinov. Zaradi svojih lastnosti je ionska izmenjevalnakromatografija primerna tudi za koncentriranje določenega proteina. Ionsko izmenjavalno


kromatografijo lahko izvajamo kot kolonsko kromatografijo, na monolitnih kolonah ali namembranah. Princip ionsko izmenjevalne kromatografije je interakcija nabitih delcev vmobilni fazi (pufer in vzorec) z nasprotno nabitimi funkcionalnimi skupinami, ki so vezane nanosilec (agaroza, celuloza, dekstran, ipd), na ionsko izmenjevalni matriks. Nabiti delci vmobilni fazi so pufrske soli in nabiti aminokislinski ostanki proteinov v vzorcu. Neto nabojproteina je odvisen od pH vrednosti raztopine, v kateri je protein raztopljen. Bolj kisla jeraztopina, več aminokislinskih ostankov v proteinu bo pozitivno nabitih in bolj bazična jeraztopina, več aminokislinskih ostankov bo negativno nabitih. Izolektrična točka proteina paje tista vrednost pH, pri kateri je neto naboj proteina enak nič. Te lastnosti proteinov sopomembne pri ločevanju proteinov z ionsko izmenjevalno kromatografijo, kjer vezava inelucija proteinov temelji na kompeticiji med nabiti skupinami proteinov in ioni v pufru znasprotno nabitimi skupinami, vezanimi na nosilec, matriks. Večja kot je koncentracija soli vpufru mobilne faze, večja je kompeticija ionov pufrske soli z nabitimi proteini, zato bodo ževezani proteini na funkcionalne skupine nosilca ionskega izmenjavalca, lažje disociirali sfunkcionalnih skupin na nosilcu.Ionski izmenjevalec pred nanosom vzorca na kolono speremo s pufrom z majhnokoncentracijo soli (majhno ionsko jakostjo). Na ta način omogočimo proteinskemu vzorcu, dase zaradi manjše kompeticije enako nabitih ionov pufrskih soli, lažje veže na nasprotno nabitefunkcionalne skupine vezane na nosilec. Z večanjem koncentracije soli v pufru mobilne fazepa postane kompeticija večja in vezani proteini disociirajo, pri nižji koncentraciji solidisociirajo šibkeje vezani proteini, pri višji koncentraciji soli pa močneje vezani proteini.Ionske izmenjevalce lahko razdelimo na kationske in anionske. Kationski ionski izmenjevalciimajo na površini stacionarne faze negativni naboj in se uporabljajo za vezavo proteinov,katerih neto naboj je pri dani pH vrednosti raztopine pozitiven. Spomnimo se, da imajoproteini neto pozitiven naboj pri pH vrednostih manjših od izoelektrične točke.Anionski izmenjevalci imajo na površini stacionarne faze pozitiven naboj in se uporabljajo zavezavo proteinov, katerih neto naboj je pri dani pH vrednosti negativen. Spomnimo se, daimajo proteini neto negativen naboj pri pH vrednostih višjih od izoelektrične točke. Navezavo nabitega proteina na ionski izmenjevalec pa vpliva tudi lokalni naboj proteina.Ionske izmenjevalce razdelimo lahko tudi na močne in šibke. Močni ionski izmenjevalciobdržijo svoj naboj v zelo širokem območju pH vrednosti ali so popolnoma ionizirani vširokem območju pH vrednosti, šibki ionski izmenjevalci pa v ožjem območju pH vrednosti.Glede na lastnosti proteina, ki ga želimo izolirati, izberemo primeren ionski izmenjevalec.Ionski izmenjevalec moramo pred nanosom vzorca na kolono pripraviti oz. spirati z začetnimpufrom, katerega ionska jakost mora biti zadosti nizka, da ne prepreči vezave proteina naizmenjevalec in take pH vrednosti, ki se vsaj za eno enoto razlikuje od izoelektrične točkeproteina. V začetnem pufru naj bi bil pripravljen tudi vzorec, ki ga bomo nanesli na ionskiizmenjevalec. Proteini pa morajo biti v tem pufru stabilni. Za spiranje z začetnim pufrom jepotrebna količina začetnega pufra v vrednosti trikratne količine volumna izmenjevalca.Elucija proteinov z ionskega izmenjevalca lahko poteka izokratsko (uporabimo mobilno fazoene vrednosti ionske jakosti), stopenjsko (ionska jakost mobilne faze se stopenjsko povečuje)ali gradientno (ionska jakost mobilne faze se zvezno povečuje).


Preglednica 8.1: Ionsko izmenjevalne skupine, vezane na stacionarno fazo

Tip ionskegaizmenjevalca

funkcionalna skupina, vezana nastacionarno fazo

ime skupine jakost pH območje, vkaterem izmenjevalecobdrži naboj

-O-CH2-COO- karboksimetilna (CM) šibek 6,0-10,0kationski-CH2-CH2-CH2-SO3

- sulfopropilna (SP) močan 4,0-13,0-O-CH2-CH2-N+H(CH2-CH3)2 dietilaminoetilna (DEAE) šibek 2,0-9,0anionski-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 kvartarna amino (Q) močan 2,0-12,0

8.1.3 Afinitetna kromatografijaAfinitetna kromatografija temelji na specifičnih interakcijah bioloških molekul z drugimimolekulami. Če eno od komponent kovalentno vežemo na stacionarno fazo, se bo pri nanosubiomolekule, ki se specifično veže na ligand stacionarne faze, le-ta adsorbirala. Interakcije, skaterimi sta ligand in molekula, ki jo želimo izolirati, povezana, so lahko ionske, hidrofobneali vodikove. Stacionarna faza mora biti hidrofilna in nenabita, da ne pride do nespecifičnihionskih interakcij vzorca s stacionarno fazo. Običajno je stacionarna faza agaroza, lahko patudi poliakrilamid in silikagel. Na stacionarno fazo najprej imobiliziramo ligand, torejmolekulo, s katero izolirana molekula specifično reagira. Nato na kolono nanesemo vzorec.Na ligande se bo specifično vezala tarčna molekula, vse ostale molekule pa se bodo izločile izkolone, ker se sploh ne bodo vezale na ligand. Nato na ligand vezane tarčne molekuleeluiramo iz kolone tako, da prekinemo vezi med ligandom in tarčno molekulo s spremembopH, ionske jakosti, dielektrične konstante ali temperature. Imunoafinitetna kromatografija jezelo specifična oblika afinitetne kromatografije. V tem primeru je na stacionarno fazo vfunkciji liganda vezano protitelo nekega antigena, ki ga želimo izolirati ali obratno.Afinitetna kromatografija z imobilizacijo kovinskih ionov je metoda, pri kateri je stacionarnafaza tako modificirana, da kelira nekatere kovinske ione, ki imajo določeno afiniteto vezaveza določene skupine v peptidih in proteinih.

Preglednica 8.2: Primeri ligandov vezanih na nosilec za afinitetno kromatografijo

Ligand Tarčna molekulakalmodulin nekatere peptidazepolimiksin endotoksiniheparin lipoproteini, DNA, RNAprotein A protitelesa

8.1.4 Hidrofobna interakcijska kromatografijaOsnova ločevanja biomolekul s hidrofobno interakcijsko kromatografijo je, da se v okolju zvisoko koncentracijo soli biomolekule vežejo s hidrofobnimi interakcijami na nepolarneligande, ki so vezani na nosilec. V topilu z visoko ionsko jakostjo se izpostavljene hidrofobnepovršine proteinske molekule vežejo na hidrofobni ligand (fenilna, butilna, oktilna skupina),


ki je vezan na nosilec (npr. prečno zamrežena agaroza). Vezane proteine eluiramo s kolone zmobilno fazo, v kateri se koncentracija soli zvezno zmanjšuje.

8.1.5 Kromatografija z reverzno fazoBolj kot hidrofobna interakcijska kromatografija je znana kromatografija z reverzno fazo. S tometodo kromatografije lahko na osnovi hidrofobnih reakcij biomolekule, predvsem peptidovin proteinov, s stacionarno fazo ločujemo biomolekule, ki so strukturno skoraj identične.Stacionarna faza (nosilec in nanj vezani ligandi) je v tem primeru nepolarna in hidrofobna. Zaelucijo proteinov uporabljamo mobilno fazo sestavljeno iz različnih delov vode in mešaniceorganskih topil (metanol, izopropanol ali acetonitril). Začetna sestava mobilne faze je boljpolarna, potem pa se za elucijo hidrofobno vezanih peptidov ali proteinov uporablja vednomanj polarna mobilna faza, koncentracija organskih topil v mobilni fazi narašča. Z večanjemkoncentracije organskih topil v mobilni fazi dosežemo, da se eluirajo proteini, ki so nastacionarno fazo vezani z vedno močnejšimi hidrofobnimi interakcijami, pri čemer pa se vsplošnem zmanjšuje velikost neto naboja, stopnja ionizacije in afiniteta vezave proteina zvodikovimi vezmi.Stacionarna faza mora biti nepolarna in hidrofobna. Za kromatografijo z reverzno fazo seuporablja silikagel ali polistirendivinil benzen (PSDVB). Ligandi, ki so vezani na nosilec solahko šibko nepolarni do zelo hidrofobni: trimetilna, butilna (C4), oktilna (C8), oktadecilna(C18) skupina.

8.2 Eksperimentalno delo8.2.1 Namen vajeNamen vaje je, da se spoznaš z gelsko filtracijo, s pripravo kolone, s principom ločevanjaspojin na koloni, njihovo detekcijo po eluciji s kolone ter z računanjem parametrov kolone inločevanih spojin.

8.2.2 OsnovePri vaji boš z gelsko filtracijo ločeval zmes hidratiziranih kobaltovih ionov in hemoglobina.Tako hidratizirani kobaltovi ioni kot hemoglobin absorbirajo svetlobo v vidnem delu spektra,zato boš ločevanje na koloni lahko tudi vizualno spremljal. Mobilno fazo, ki bo tekla skozikolono in spirala ločevani spojini, boš lovil v epruvete (frakcije). Posameznim frakcijam bošizmeril absorbanco pri 555 nm.

8.2.2 IzvedbaV stekleno kolono, ki je zaprta s stiščkom in vpeta na stojalo, nalij destilirano vodo do višine2 centimetrov. Na dno kolone stlači manjši košček vate, ki bo predstavljal sito, da gel ne bouhajal iz kolone. V kolono previdno prelij v mobilni fazi suspendiran gel in počakaj, da se taposede. Ko se gel posede, počasi odpri stišček, da sprostiš pretok mobilne faze skozi kolono.Pretok mobilne faze nad kolono naj ne bo večji od ene kapljice na sekundo. Pazi, da se kolonane zasuši, saj mora biti nad stacionarno fazo vedno nekaj mobilne faze. Če višina posedenega


gela predstavlja manj kot tri četrtine višine kolone, je potrebno dodati mankajoči gelsuspendiran v mobilni fazi. Ob morebitnem dodatku suspendiranega gela vsebino narahlopremešaj s stekleno palčko in počakaj, da se gel posede.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

0 0 0,1 0,2 0,1 0 0 0,2 0,5 0,1 0 0 0 0,1 0,5 0,2 0,1 0 0

Slika 8.1: Shematičen prikaz poteka gelske filtracije. S kolone se najprej eluirajo večjiproteini (največji protein na sliki ne zaide v nobeno kroglico, ker je njegov Ve = Vo), na koncupa najmanjšiKo se gel dokončno posede, ponovno odpri stišček in pusti, da odteče praktično vsa mobilnafaza nad stacionarno fazo. Nato stišček zapri in na kolono s kapalko počasi ob steni nanesi

posameznim frakcijamizmerimo absorbanconpr. pri 280 nm

število frakcij in izmerjeneabsorbance v frakcijahpovežemo v kromatogram

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

število frakcij

abso

rban

ca p

ri 28

0 nm


vzorec. Ko vzorec naneseš, počasi odpri stišček in počakaj, da vzorec ponikne v gel. Zapristišček in pod kolono podstavi stojalo z epruvetami, ki so označene s številkami. Nad gel natoprevidno nanesi mobilno fazo. To delaj počasi in previdno, da se poseden gel ne dvigne.Ko je nad stacionarno fazo nekaj centimetrov visoka plast mobilne faze, počasi odpri stišček,da bo pretok mobilne faze skozi kolono manjši od 1 kapljice na sekundo. Mobilno fazo, ki seeluira s kolone, zbiraj v epruvete. Ko se v posamezno epruveto eluirajo 4 mL, podstavinaslednjo prazno epruveto. Pretok mobilne faze skozi kolono vzdržuj tako, da s kapalkododajaš mobilno fazo. Pazi, da se kolona med analizo ne zasuši. Frakcije zbiraš toliko časa,dokler se s kolone ne sperejo kobaltovi ioni. Ko je kromatografija končana, posameznimfrakcijam izmeri absorbanco pri 555 nm. Nanos vzorca in potek ločevanja različno velikihspojin je predstavljen na sliki 8.1.

8.2.4 RezultatiIzmerjene absorbance posameznih frakcij vnesi v preglednico. Pri posamezni frakcijiizračunaj tudi skupen volumen mobilne faze, ki se je eluiral od nanosa vzorca naprej. Narišikromatogram kjer na absciso nanašaš ustrezne volumne, na ordinato pa absorbanceposameznih frakcij. Na kromatogramu določi elucijski volumen hidratiziranih kobaltovihionov in hemoglobina. Elucijski volumen spojine je v tisti frakciji, kjer se izloči maksimalnakoncentracija spojine.Izmeri dimenzije kolone in izračunaj Vt. Predpostavi, da je Vt = 3Vo in izračunajporazdeliveni koeficient za hemoglobin in kobaltove ione.


frakcija 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14V (mL)A555

frakcija 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28V (mL)A555

Reagenti- 0,9 % ratopina NaCl- 5 M raztopina CoCl2

- raztopina hemoglobina s koncentracijo 2 mg/mL- Sehpadex G-25 medium

Pribor400 mL čaše, 25 mL merilni valj, 5 mL merilne pipete, pincete, steklene palčke, epruvete,steklene kolone 2x32 cm, spektrofotometer


BELEŽKE K VAJI


9 Stabilnost proteinov

9.1 Splošen uvod

Razlika med prosto entalpijo denaturiranega stanja in nativne tridimenzionalne strukturetipičnega proteina je največkrat v območju 20-60 kJ/mol, kar ustreza energiji enega do dvehmolov vodikovih vezi. Če pomislimo, da je znotraj nativnega proteina na stotine vodikovihvezi, mnogo hidrofobnih in ionskih interakcij, lahko zaključimo, da je razlika med prostoentalpijo nativnega in denaturiranega stanja relativno majhna. K stabilnosti proteina največprispevajo že omenjene vezi, na drugi strani pa je entropijski faktor (merilo urejenosti - večjaje urejenost, manjša je stabilnost), ki prispeva k stabilizaciji denaturiranega stanja. Že manjšespremembe v temperaturi, pH, koncentraciji določenih ionov in spojin, ki destabilizirajostrukturo, lahko zaradi majhne stabilizacije nativne strukture privedejo do stanja, kjer imadenaturiran protein manjšo energijo kot nativen protein. Takrat se protein denaturira. Porušitase sekundarna in terciarna struktura proteina ter kvartarna, če jo protein ima. Primarnastruktura proteina se v procesu denaturacije ne poruši. Denaturiran protein ima strukturonaključnega klobčiča in nima značilne in definirane tridimenzionalne strukture. Ker se vprocesu denaturacije poruši tridimenzionalna struktura proteinov, le ti izgubijo aktivnost.

9.1.1 Ravnotežje med nativnim in denaturiranim stanjemProces denaturacije lahko poenostavljeno zapišemo v enostopenjski obliki, kot prehod mednativnim in denaturiranim stanjem.

Kvocient med aktivnostjo produktov in reaktantov (največkrat lahko kvocient aktivnostipoenostavimo na kvocient koncentracij) zapišemo kot ravnotežno konstanto.

ND

N

Drav

aaK

Koncentracijo proteina v nativnem, N, in denaturiranem, D, stanju lahko izrazimo sskupno koncentracijo proteina, co, kot N = cofN = co(1-fD) in D = cofD. Pri čemer fN in fD

predstavljata delež molekul proteina v nativnem in denaturiranem stanju. Ravnotežnokonstanto lahko torej zapišemo tudi drugače.

)-(1)-(1 D

D

Do

Dorav f

ffc

fcNDK

N Ddenaturacijarenaturacija


Prosto entalpijo denaturacije proteina lahko izračunamo, če poznamo vrednost ravnotežnekonstante pri pogojih, pri katerih želimo določiti spremembo standardne proste entalpije

denaturacije.o

DNG

predstavlja spremembo standardne proste entalpije denaturacije

(razlika med standardno prosto entalpijo denaturiranega in nativnega stanja), R je splošnaplinska konstanta in T temperatura.

)-(1lnln

D

Drav f

fRTKRTG o

DN

Predstavljajmo si, da želimo določiti, kakšna je prosta entalpija denaturacije za določenprotein v vodnem pufru pri sobni temperaturi. Poznamo temperaturo in vrednost splošneplinske konstante, ne poznamo pa razmerja med deležem molekul, ki so denaturirane inmolekulami, ki imajo nativno strukturo, saj so skoraj vse molekule v nativni obliki. Deleždenaturiranih proteinov je tako majhen, da ga praktično z nobeno metodo ne moremo določiti.Kako si lahko pomagamo?

9.1.2 Določevanje razmerja med nativnim in denaturiranim stanjemStabilnost proteinov največkrat določamo tako, da raztopini proteinov dodajamo različnekaotropne snovi kot sta sečnina in gvanidinijev hidroklorid, ki destabilizirata proteine, ali papovišujemo temperaturo. Z vsakim dodatkom kaotropne snovi ali s povišanjem temperature,se stabilnost nativne oblike proteina zmanjša. Razmerje med denaturirano in nativno oblikoproteina je posledično vse večje. Dokler je to razmerje v območju 1:100 oziroma manjšeskoraj zagotovo ne moremo zaznati deleža denaturirane oblike, saj bo ta v okvirueksperimentalne napake.Ko se razmerje z višanjem koncentracije denaturanta ali temperature bliža 1:10 pa že lahkodoločimo delež proteina, ki je denaturiran. Z nadaljnim povečevanjem koncentracijedenaturanta ali temperature dosežemo pogoje, pri katerih je razmerje med nativno indenaturirano obliko proteina enako ena. Takrat je sprememba standardne proste entalpijedenaturacije enaka 0 (ln 1 = 0). Ko še naprej povečujemo koncentracijo ali višamotemperaturo, prične prevladovati denaturirana oblika. Dokler je razmerje med denaturirano innativno obliko proteina še v območju okoli 10:1 še lahko določimo delež nativne oblike. Privečjih koncentracijah denaturanta ali temperaturah je razmerje večje in delež nativne oblikebo v okviru eksperimentalne napake. Ravnotežno konstanto lahko torej določimo le vrelativno ozkem območju koncentracije denaturanta.


Slika 9.1: Delež denaturiranega proteina, oziroma nativnega proteina, lahko eksperimentalnodoločimo le v ozkem intervalu koncentracij denaturanta (omejen s črtkanima črtama), ki sonekaj večje ali manjše od koncentracije, pri kateri je vrednost ravnotežne konstante enaka 1.

Pri koncentracijah denaturanta, ki so znotraj območja črtkanih črt (slika 9.1), lahko določimodelež denaturiranih molekul in delež molekul, ki so v nativni konformaciji. Za tekoncentracije denaturanta izračunamo spremembo standardne proste entalpije denaturacijeproteina, ki je večja od 0 pri koncentracijah denaturanta, kjer prevladuje nativna oblikaproteina in manjša od 0 pri tistih koncentracijah denaturanta, kjer prevladuje denaturiranaoblika proteina. Nato narišemo graf, kjer na os X nanašamo koncentracijo sečnine, na os Y pavrednost proste entalpije denaturacije pri določeni koncentraciji denaturanta. V primeru, če

gre za enostavno eno-stopenjsko denaturacijo, je vrednosto

DNG

linearno odvisna od

koncentracije denaturanta. Eksperimentalne podatke smo lahko pridobili le v ozkemkoncentracijskem območju, kjer sta v značajnem deležu prisotni tako nativna kot denaturiranaoblika proteina. Če želimo določiti kakšna je sprememba standardne proste entalpijedenaturacije proteina v puferni raztopini brez denaturanta (stabilnost proteina), je potrebno

izračunanoo

DNG

pri koncentracijah denaturanta v območju prehoda ekstrapolirati na

koncetracijo denaturanta, ki je enaka 0. Vrednost, ki jo odčitamo na osi Y, jeo

DNG

za

merjen protein v določenem pufru brez denaturanta in temperaturi, pri kateri smo izvajalimeritev (slika 9.2.).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

koncentracija denaturanta

dele

ž de

natu

riran

ega

prot

eina

(%)


Slika 9. 2: Določitev vrednosti proste entalpije denaturacije proteina v pufru brez denaturantaz ekstrapolacijo. Eksperimentalne podatke lahko pridobimo le v ozkem koncentracijskemintervalu denaturanta (med črtkanima črtama), kjer sta v signifikantnem deležu prisotni takonativna kot denaturirana oblika proteina.

Zaenkrat smo si pogledali kako lahko določimo standardno prosto entalpijo, če poznamorazmerje med denaturiranim in nativnim proteinom pri določenih pogojih. Kako pa lahkoeksperimentalno določimo delež nativne in denaturirane oblike? Kot smo že omenili(glej 1. vajo) lahko spremembe strukture proteinov zaznamo z različnimi spektroskopskimitehnikami, kot so cirkularni dikroizem, fluorescenca in absorbanca. Če je protein, kateremudoločamo stabilnost encim, lahko določamo delež nativne strukture tudi z merjenjemaktivnosti encima pri določenih pogojih, saj izguba nativne strukture pomeni tudi izguboaktivnosti.Predpostavimo, da hočemo določiti entalpijo stabilizacije nativnega stanja proteina skaotropno snovjo kot je sečnina. Poglejmo primer, ko določamo hkrati aktivnost encima inmerimo absorbanco triptofana. Tako aktivnost kot tudi molarni absorpcijski koeficienttriptofana in posledično absorbanca sta odvisna od strukture proteina. Pripravimo si raztopinoproteina v več različnih koncentracijah sečnine, počakajmo nekaj minut, da se vzpostaviravnotežje, nakar pri vsaki koncentraciji denaturanta izmerimo triptofansko absorbanco inizmerimo aktivnost. Nato narišemo graf, kjer predstavimo odvisnost absorbance in aktivnostiproteina od koncentracije denaturanta (slika 9.3.). V območju, kjer je znatna koncentracijadenaturirane in nativne oblike, se signal (triptofanska absorbanca, aktivnost) že pri majhnispremembi koncentracije denaturanta zelo spremeni. Graf ima precej podobno obliko kot tisti,ki ga dobimo pri kislinsko bazni titraciji, kjer se pH okoli ekvivalentne točke zelo spremeni.Podobnost ni naključna, saj je pH logaritemska funkcija koncentracije oksonijevih ionov.


stan

dard

na p

rost

a en

talp

ija

00

standardna prosta entalpija denaturacijeproteina v pufru brez denaturanta


Razmerje med nativno in denaturirano obliko proteina, s katero je definiran signal pridenaturaciji se ravno tako logaritemsko spreminja s koncentracijo denaturanta. Za razliko odkislinsko baznih titracij pa se signal lahko linearno spreminja v območju, kjer prevladujetapraktično le nativna in denaturirana oblika proteina. V tem primeru delež nativne indenaturirane oblike proteina določimo kot je prikazano na sliki 9.3.

Slika 9.3: Določitev razmerja med denaturiranim in nativnim proteinom pri določenikoncentraciji denaturanta (črtkana črta).


9.2.1 Namen vajeDoloči delež nativnega in denaturiranega govejega -kimotripsinogena A pri različnihkoncentracijah sečnine in izračunaj prosto entalpijo stabilizacije nativnega stanja proteina.

9.2.2 OsnoveKimotripsinogen je neaktivna prekurzorska oblika serinske peptidaze kimotripsin. V procesuaktivacije s tripsinom in že aktiviranim kimotripsinom nastane zrela oblika encima, ki jesestavljena iz treh polipeptidnih verig. Nastali kimotrispin katalizira hidrolizo peptidne vezina mestih, kjer so aromatske aminokisline (fenilalanin, tirozin in triptofan) in aminokisline zvelikimi nepolarnimi stranskimi verigami.Delež nativnega kimotripsinogena pri različnih koncentracijah denaturanta bomo določali sfluorescenco. Kimotripsinogen bomo raztopili v različnih koncentracijah sečnine in vzorcevzbujali pri 280 nm, kjer absorbirajo aromatske aminokisline proteina. Za vsak vzorec bomo


mer

jen

sign

al

0

43 % denaturiranega proteina

57 % nativnega proteina


posneli spekter emitirane svetlobe, izmerili fluorescenco pri 380 nm in določili valovnodolžino, pri kateri je fluorescencenčni maksimum. Pričakujemo, da se bo zaradi denaturacijeproteina in s tem povezane spremembe okolja aromatskih aminokislin (izpostavljene bodobolj polarnemu okolju), fluorescenčni maksimum pomaknil k večjim valovnim dolžinam.Posledično se bo z denaturacijo povečala tudi fluorescenca pri valovni dolžini 380 nm, ki jevečja od fluorescenčnega maksimuma nativnega proteina.

9.2.3 Izvedba9.2.3.1 Priprava proteina za denaturacijoVsaka skupina si pripravi dve epruveti. V vsako od epruvet odpipetiraj 2,7 mL raztopinesečnine z določeno koncentracijo. V prvo epruveto, ki bo predstavljala referenčno raztopinobrez proteina, odpipetiraj 0,3 mL acetatnega pufra s pH 4. V drugo epruveto, v kateri bokimotripsinogen, odpipetiraj 0,3 mL kimotripsinogena s koncentracijo 0,25 mg/mL vacetatnem pufru s pH 4. Vsebino obeh epruvet dobro premešaj in pusti 30 minut na sobnitemperaturi, da se vzpostavi ravnotežje med nativno in denaturirano obliko proteina.

9.2.3.2 Merjenje fluorescence aromatskih aminokislinPri vsaki koncentraciji sečnine pomeri fluorescenčni spekter referenčne raztopine in vzorcakimotripsinogena med 300 nm in 400 nm, ki ga dobiš po vzbujanju aromatskih aminokislinpri 280 nm. Od spektra emitirane svetlobe vzorca odštej spekter emitirane svetlobe referenčneraztopine. V izračunanem spektru, ki predstavlja fluorescenco kimotripsinogena, poiščifluorescenčni maksimum in si zapiši vrednost fluorescence pri 380 nm.

9.2.4 Rezultati9.2.4.1 Fluorescenca pri 380 nmV preglednico vpiši vrednosti fluorescence pri 380 nm. Nariši graf, kjer na ordinato nanašašizmerjeno fluorescenco pri 380 nm, na absciso pa koncentracijo sečnine, pri kateri si izmerilemitirano svetlobo. Iz narisane denaturacijske krivulje grafično določi razmerje meddenaturiranim in nativnim encimom pri tistih koncentracijah denaturanta, kjer sta v značajnemdeležu obe obliki encima (glej sliko 9.3).Izračunaj standardno prosto entalpijo denaturacije pri posameznih koncentracijah denaturantav območju prehoda, za katere si predhodno določil razmerje med nativno in denaturiranoobliko (na termometru odčitaj temperaturo pri kateri si opravil meritev). Iz pridobljenihpodatkov nariši graf, kjer na ordinato nanašaš izračunano prosto entalpijo denaturacije, naabsciso pa koncentracije denaturanta, pri katerih si izvajal meritev (glej sliko 9.2). Vrednostiproste entalpije denaturacije, ki si jih določil za območje prehoda ekstrapoliraj nakoncentracijo denaturanta, ki je enaka nič. Vrednost, ki jo odčitaš na ordinati, ko jekoncentracija denaturanta enaka nič, je prosta entalpija denaturacije v pufru brez denaturanta.



koncentracija sečnine (mol/L)0 2 4 4,4 4,8 5,2 5,6 5,8 6 6,2 6,5 7 7,5 8

380

refvzFl

DN /o

DNG

o

DNG

9.2.4.2 Fluorescenčni maksimumV preglednico vpiši valovno dolžino fluorescenčnaga maksimuma po vzbujanju pri 280 nm.Nariši graf, kjer na ordinato nanašaš valovno dolžino fluorescenčnega maksimuma, na abscisopa koncentracijo sečnine, pri kateri si izvajal meritev. Na podoben način kot pri točki 9.2.4.1.določi razmerje med nativno in denaturirano obliko proteina ter izračunaj standardno prostoentalpijo denaturacije pri posamezni koncentraciji sečnine. Nariši tudi graf odvisnosti prosteentalpije denaturacije v odvisnosti od koncentracije denaturanta in grafično določi prostoentalpijo denaturacije v topilu brez denaturanta.


koncentracija sečnine (mol/L)0 2 4 4,4 4,8 5,2 5,6 5,8 6 6,2 6,5 7 7,5 8

)(max. nmFl DN /

o

DNG

o

DNG

Reagenti- goveji kimotripsinogen- sečnina- 100 mmol/L acetatni pufer pH 4- deionizirana voda


Priborepruvete, vrtinčnik, avtomatske pipete (5 mL, 1 mL), nastavki za pipete, termometer, kvarčnekivete za spektrofluorimeter, spektrofluorimeter, milimeterski papir


BELEŽKE K VAJI


10 Elektroforeza

10.1 Splošen uvod

Elektroforeza je analitska metoda s katero ločujemo biomolekule po naboju in/ali velikosti velektričnem polju. Ločevanje poteka na inertnem nosilcu. Večina bioloških molekul, kot soaminokisline, peptidi, proteini, nukleotidi in nukleinske kisline, imajo funkcionalne skupine znabojem in so v raztopini pri določeni vrednosti pH pozitivno ali negativno nabite.Elektroforezne metode uporabljamo za kvalitativno karakterizacijo spojine ali mešanicespojin in za kontrolo čistosti ter za kvantitativne analize in v preparativne namene.Elektroforezne metode so uporabne za vse spojine, delce ali celo celice, torej za zvrsti, kinosijo naboj. Pri elektroforezi se delci z nabojem pod vplivom električnega polja premikajoproti nasprotno nabiti elektrodi. Na hitrost potovanje spojine v električnem polju vplivajonaboj spojine, velikost, masa in oblika. Spojine z različnimi lastnostmi bodo potovale različnohitro. Hitrost potovanja molekul (v) z nabojem v električnem polju je premosorazmernoodvisna od neto naboja molekule (z) in jakosti električnega toka (E) ter obratno sorazmernaviskoznosti () in Stokesovem polmeru nabite molekule (r):

rzEv

6

Hitrost potovanja spojine v eletričnem polju lahko definiramo tudi z elektroforetskomobilnostjo, u, ki predstavlja razmerje med hitrostjo potovanja nabite molekule z jakostjoelektričnega polja. Elektroforetska mobilnost spojine je odvisna od pK vrednosti skupin znabojem in velikosti spojine. Na elektroforetsko mobilnost vplivajo sestava, koncentracija inpH pufra, temperatura, jakost električnega polja in narava nosilca. Elektroforezo lahkoizvajamo v raztopini ali z inertnim nosilcem. Pri elektroforezi v raztopinah je ločevanje spojinin delcev z nabojem slabše zaradi difuzije, konvekcijskih tokov in mešanja vzorcev. Boljšeločevanje nabitih spojin v električnem polju dosežemo z ločevanjem spojin na inertnemnosilcu. Kot nosilce lahko uporabljamo kromatografski papir, celulozni acetat, tanke plastisilikagela ali aluminijevega oksida. Najpogosteje se uporabljajo agarozni in poliakrilamidnigeli.

10.1.2 Gelska elektroforezaBolj podrobno bomo opisali gelsko elektroforezo z ločevanjem na agaroznem inpoliakrilamidnem gelu. Oba gela imata mrežasto strukturo s številnimi porami, skozi katere sepod vplivom električnega polja prebijajo molekule. Ti geli se uporabljajo predvsem zaločevanje nukleinskih kislin, proteinov in peptidov.


10.1.2.1 Agarozna elektroforezaAgarozna elektroforeza se uporablja za ločevanje zelo velikih molekul kot so npr. nukleinskekisline velikosti 50 do 30 000 baznih parov in kromosomov. Gelski nosilec je agaroza,polisaharid iz rdečih alg. Dimenzije por v agaroznih gelih so odvisne od koncentracijeagaroze. Priprava elektroforeznega gela poteka tako, da ustrezno zatehtano količino agarozeraztopimo v vreli vodi, še toplo raztopino pa vlijemo v kadičko za pripravo gelov. Medprocesom ohlajanja se tvorijo dvojne vijačnice polisaharida, ki se lateralno povezujejo vrelativno debele filamente. Velikost por, ki pri tem nastanejo, ni povsem definirana.Agarozna elektroforeza poteka ponavadi horizontalno, pri čemer je agarozni gel potopljen vpufru. Molekule DNA so negativno nabite in v električnem polju potujejo proti pozitivnonabiti elektrodi, anodi. Potek elektroforeze spremljamo z modrim barvilom bromfenolmodro,ki ga dodamo raztopini vzorca. Barvilo potuje hitreje od samih molekul DNA. Uporabni statudi barvili Orange G in Xylene Cyanole FF. Ko pride barvilo do roba gela ali že izstopi izgela, končamo elektroforezo. Molekule DNA same po sebi niso obarvane, zato jih po končanielektroforezi detektiramo na gelu tako, da gel potopimo v raztopimo primernega barvila kot jefluorescenčno barvilo etidijev bromid ali SYBR Green, ki pod UV lučko oddajata svetlobo.Barvili se vrineta(interkalirata) med bazne pare DNA. Z BARVILOM ETIDIJEV BROMIDMORAMO DELATI ZELO PREVIDNO, KER JE ZELO MUTAGEN. Z etidijevimbromidom lahko detektiramo do 50 ng nukleinskih kislin, barvilo SYBR Green pa je še boljobčutljivo in manj mutageno.

Slika 10.2: Strukturne formule barvil bromfenolmodro (A), SYBR Green (B), etidijevbromid (C).

Elektroforezno ločbo dokumentiramo lahko s fotografiranjem gela. Dokumentirano slikoelektroforeze poimenujemo elektroforegram.

D N A m a r k e r j i p l a z m id r a z r e z a n p la z m i d

ž e p e k

Slika 10.2: Aparatura za agarozno elektroforezo(levo) in shematski prikaz elektroforegrama.

A B C


10.1.2.2 Poliakrilamidna gelska elektroforeza (PAGE)Poliakrilamidno gelsko elektroforezo uporabljamo predvsem za ločevanje proteinov, zadoločanje nukleotidnega zaporedja DNA in druge elektroforezne analize DNA. Vzorce priPAGE nanašamo na poliakrilamidni gel, ki nastane pri radikalski reakciji polimerizacijeakrilamida in zamreženja z bisakrilamidom. Katalizator reakcije je amonijev persulfat,iniciator reakcije pa N,N,N',N'-tetrametiletilendiamin ali okrajšano TEMED. TEMEDkatalizira reakcijo nastanka prostih radikalov iz amonijevega persulfata, prosti radikali pakatalizirajo polimerizacijo akrilamida. Zamreženost gelov ali velikost por v gelu je definiranas skupno (totalno,T) koncentracijo akrilamida in bisakrilamida izraženo v %T in dodatno še zdeležem bisakrilamida (% C), s katerim se prečno povezujejo linearne polimerne verigeakrilamida:

100)idbisakrilamakrilamid(

)idbisakrilam(C%

100100

)idbisakrilamakrilamid(T%

gg

mLg

Hitrost polimerizacije lahko povečamo z večjo količino TEMED-a in/ali amonijevegapersulfata.Na hitrost polimerizacije vpliva tudi temperatura, pri kateri poteka polimerizacija terprisotnost kisika. Kisik in nizke temperature zavirajo polimerizacijo.PAGE lahko poteka vertikalno ali horizontalno. Horizontalna PAGE poteka ponavadi zaanalizo DNA vzorcev, vertikalna PAGE pa za analizo proteinskih vzorcev. Lahko izvajamodiskontinuirno ali kontinuirno elektroforezo. Pri diskontinuirni elektroforezi uporabljamo dvagela: ločevalni gel, v katerem pride do ločevanja proteinov in zbiralni ali koncentracijski gel,ki ga vlijemo nad ločevalni gel in v katerega nanesemo vzorce. Vzorci se v zbiralnem geluskoncentrirajo na meji med zbiralnim in ločevalnim gelom in se v tem gelu ne ločujejo. Pufraza pripravo ločevalnega in koncentracijskega gela sta različna. Koncentracija akrilamida vločevalnem gelu je večja od koncentracije akrilamida v koncentracijskem gelu, kjer je le tanajveč 5 % T. Pri kontinuirni PAGE pa je pufer za pripravo gela enak pufru, v katerem potekaelektroforeza.


Slika 10.3: Aparatura za vertikalno poliakrilamidno gelsko elektroforezo za mini gele.

Za elektroforezno separacijo proteinov obstaja več vrst izvedbe poliakrilamidne gelskeelektroforeze.

10.1.2.2.1 Poliakrilamidna gelska elektroforeza v prisotnosti natrijevega dodecilsulfata(NaDS- PAGE, angl. sodium dodecil sulphate, SDS-PAGE)Za ločevanje proteinov se največkrat uporablja diskontinuirna NaDS-PAGE po Laemmliju.NaDS je anionski detergent, ki se nespecifično veže na proteine in jih denaturira, ohranijo pase kovalentne vezi, tako peptidne kot tudi disulfidne vezi. Približno 1,4 g NaDS se veže na 1 gproteinov. Molekule NaDS s svojimi hidrofobnimi repi tvorijo micelom podobne strukture nakatere se veže denaturiran protein. NaDS s svojim negativnim nabojem popolnoma zamaskiranaboj same proteinske molekule.

Slika 10.4: Anionski detergent natrijev dodecilsulfat..


Disulfidne vezi proteinov reduciramo z ditiotreitolom (DTT) ali -merkaptoetanolom. DTT jemočnejši reducent od -merkaptoetanola in manj toksičen.

Slika 10.5: β-merkaptoetanol (A), ditiotreitol (B) in redukcija disulfidnih vezi v molekuliproteina (C).

Proteini se pri NaDS-PAGE ločujejo v zamreženem gelu le zaradi razlik v velikosti(molekulski masi), saj je razmerje med velikostjo molekule, ki vpliva na mobilnost innabojem zaradi vezanega NaDS pri veliki večini proteinov konstantno. Metoda je uporabna zadoločanje molekulske mase ločenih proteinov. Pri večini elektroforeznih pogojev je logaritemmolekulske mase proteinov obratno sorazmerno odvisen od relativne elektroforetskegibljivosti (Rf) proteinov. Tako lahko pri danih pogojih eksperimenta s pomočjo standardnihproteinov določimo molekulsko maso danega proteina v gelu.

Slika 10.6: Prikaz umeritvene krivulje logaritemske vrednosti molekulskih mas od relativneelektroforetske gibljivosti standardnih proteinov.

10.1.2.2.2 Nativna poliakrilamidna gelska elektroforezaŽe iz naslova lahko ugotovimo, da pri tej elektroforezni metodi proteini ohranijo svojonativno strukturo in so biološko aktivni. Nativna PAGE poteka zelo podobno kot NaDS-PAGE, le da v raztopini gela in vzorcev ni prisoten natrijev dodecil sulfat in ni reducentov.Pri nativni PAGE je zelo pomemben naboj proteinov. pH elektroforeznega pufra je pri nativniPAGE običajno nad 8, saj je pri tej pH vrednosti večina proteinov negativno nabitih, in bodo

log MR

Rf (razdalja proteina/razdalja barvila)

A B

C


potovali proti anodi. Proteini se pri nativni PAGE ločujejo po naboju, velikosti in obliki.Velik protein z velikim neto nabojem se pri nativni PAGE lahko premika enako kot manjšiprotein z manjšim neto nabojem. To pomeni, da z nativno PAGE ne moremo pridobitipodatkov o molekulski masi niti o izoelektrični točki proteinov.

10.1.2.2.3 Izoelektrično fokusiranjeIzoelektrično fokusiranje je elektroforezna metoda, pri kateri se proteini ločujejo glede naizoelektrično točko, pI. Izoelektrična točka je vrednost pH, pri kateri je neto naboj proteinaenak nič. Proteini so pozitivno nabiti pri pH vrednostih pod njihovo izoelektrično točko innegativno nabiti pri pH vrednostih nad izoelektrično točko.Pri tehniki izolektričnega fokusiranja je potrebno pred nanosom vzorca ustvariti v gelu pHgradient. Le tega ustvarimo s pomočjo amfolitov. Amfoliti so spojine, ki so v raztopini lahkonegativno ali pozitivno nabite odvisno od vrednosti pH. Amfolite vmešamo v raztopino zapripravo gela. Ko poliakrilamidni gel polimerizira in gel priključimo na napetost, bodoamfoliti z najnižjo pI vrednostjo potovali proti anodi in amfoliti z najvišjo vrednostjo pI protikatodi. Preostali amfoliti se bodo razporedili v električnem polju nekje med obemaelektrodama, na mestih, kjer bo njihov neto naboj nič. Takrat je njihova elektroforeznagibljivost enaka nič. Na ta način je ustvarjen linearni gradient pH. Proteini se v gradientu pHpremikajo proti delu gela, v katerem je vrednost pH enaka njihovi izoelektrični točki.Izolektrično fokusiranje poteka horizontalno. Lahko poteka na nativni ali denaturacijski način.Pri izoelektričnem fokusiranju je pomemben čas, ki ga damo na razpolago vzorcu, da dosežepI vrednost. Proteini dosežejo izoelektrično točko v gelu ne glede na mesto nanosa.

10.1.2.2.4 Dvodimenzionalna ali 2-D elektroforezaV grobem rečeno je 2-D elektroforeza kombinacija izoelektričnega fokusiranja (IEF),ločevanja v prvi dimenziji in NaDS-PAGE, ločevanja po velikosti, ki poteka v drugidimenziji. Je zelo uporabna metoda za ločevanje kompleksnih mešanic proteinov iz celic, tkivin drugih bioloških materialov. Ločevanje glede na izoelektrično točko poteka po nanosuvzorca na imobiliziran pH gradientni strip (IPG) ali v gelih vlitih v cevke. Z IPG stripi potekaIEF horizontalno, v drugem primeru pa vertikalno. Po končani IEF, prenesemo IPG stripe aligele nad poliakrilamidni gel za ločevanje po molekulski masi. 2-D elektroforeza je ena izmedosnovnih metod analize proteinov v proteomiki.

10.1.3 Detekcija vzorcev po elektroforeziProteine ali DNA med ločevanjem v gelih ne vidimo, ker molekule niso obarvane. Ločeneproteinske ali DNA molekule lahko zaznamo z barvanjem v gelih. Detekcija proteinov poelektroforezi je lahko nespecifična ali specifična. Nespecifična detekcija pomeni, daobarvamo vse proteine, specifična pa da obarvamo ali drugače detektiramo en protein aliskupino proteinov, npr. glikoproteinov. Obstaja veliko različnih barvil, opisali bomo le nekajosnovnih barvil.


10.1.3.1 Barvanje z barvilom Coomassie Brilliant BlueAnionska oblika barvila Coomassie Brilliant Blue se v kislem mediju veže na protoniraneaminske skupine v proteinih, preferenčno na aminske skupine lizina in asparagina. Nastalibarvni kompleks je intenzivno modre barve. Intenziteta barvnega kompleksa barvila s proteinije odvisna od količine proteina v gelu. Interakcija barvila s proteini je elektrostatska inreverzibilna pod določenimi pogoji. Z barvilom Coomassie Brillinat Blue lahko zaznamo tudinanogramske količine proteina v gelu. Barvilo lahko uporabljamo za detekcijo proteinov vpoliakrilamidnih ali agaroznih gelih. Danes je na razpolago več komercialnih variant barvilaCoomassie Brilliant Blue, ki se med seboj razlikujejo po občutljivosti, času barvanja,obarvanju ozadja, itd. Gel za določen čas potopimo v raztopino barvila in ko so proteini vidni,speremo nevezano barvilo.

10.1.3.2 Barvanje s srebromBarvanje s srebrom je približno stokrat bolj občutljiva metoda za detekcijo proteinov kot jebarvanje s Coomassie Brilliant Blue, vendar pa je bolj zahtevna in nespecifična za proteine. Ssrebrom lahko detektiramo tudi molekule DNA, RNA, polisaharide, lipide.Pri barvanju s srebrom moramo biti zelo natančni. Postopek barvanja proteinov v gelu ssrebrom je ponavadi sestavljen iz več stopenj, pri katerih moramo biti zelo natančni gledečasa izvedbe posamezne stopnje, čistosti kemikalij ter vode za pripravo raztopin.Princip barvanja proteinov ali drugih omenjenih spojin s srebrom je redukcija srebrovihionov, Ag+, s proteini ali drugimi molekulami do netopnega elementarnega srebra. Na gelutakšno oborino vidimo kot rjavo obarvanje. Obstaja veliko različic protokolov barvanja ssrebrom. Nekateri so tako prirejeni, da zaznavamo tudi do 0,25 ng količine proteinov in sonamenjeni za nadaljnjo analizo z masno spektroskopijo.

10.1.3.3 Barvanje s fluorescenčnimi barviliMehanizem vezave fluorescenčnih barvil na proteine še ni povsem razjasnjen. Fluorescenčnabarvila kot so Nile Red in skupina barvil iz družine SYPRO, naj bi se vezala na hidrofobendel detergenta SDS, ki obdaja proteine v gelu. Zato naj bi bil ta način barvanja proteinov vgelu manj odvisen od same vrste proteinov. Po vezavi barvila na proteine v gelu, gelpresvetlimo z UV-svetlobo, emitirano svetlobo pa detektiramo s fotografiranjem napolaroidnem filmu ali s fluorescenčnim skenerjem. Valovna dolžina emitirane svetlobeomenjenih fluorescenčnih barvil je v vidnem območju. Občutljivost barvanja sfluorescenčnimi barvili je enaka barvanju s srebrom, le-da so fluorescenčna barvila boljspecifična. Barvila SYPRO Orange in SYPRO Red se npr. ne vežeta na nukleinske kisline inlipopolisaharide, lipide, Nile Red pa se veže na lipide.Obstajajo fluorescenčna barvila, ki detektirajo le glikoproteine ali fosfolirirane proteine.Slabost fluorescenčnih barvil za detekcijo proteinov je visoka cena in oprema za vizualizacijoobarvanih proteinov.


10.1.3.4 Reverzibilno barvanje proteinov v poliakrilamidnih gelih z Zn2+

Največja razlika med reverzibilnim barvanjem z Zn2+ in zgoraj omenjenimi metodamabarvanja proteinov v gelih je v tem, da z Zn2+ ne obarvamo proteinov v gelu, temveč delegela, v katerem se ne nahajajo proteini. Metoda temelji na tvorbi netopnega kompleksa medZn2+ in imidazolom, s katerim predhodno prepojimo gel. Do obarjanja ne pride na mestih, kjerse nahajajo proteini, ki kompleksno vežejo Zn2+ in preprečijo nastanek netopnega produkta zimidazolom. Občutljivost metode je primerljiva z barvanjem s srebrom. Metoda je primernaza barvanje proteinov, ki jih nato še naprej analiziramo s prenosom na membrane ali z masnospektrometrijo.

10.1.3.5 Imunodetekcija proteinov ločenih na poliakrilamidnih gelihTo je analizna metoda, pri kateri želimo identificirati določen protein v vzorcu s pomočjoprotititeles, ki so specifična za iskani protein. Praktično se analiza izvede tako, da proteine, kismo jih predhodno ločili na poliakrilamidnem gelu, prenesemo na membrano (prenosWestern). Membrano inkubiramo v prisotnosti primarnih protiteles, ki se vežejo na proteine.Označene protein nato lahko na različne načine detektiramo. Ponavadi membrano inkubiramoše v sekundarnem protitelesu, katerega antigen je primarno protitelo. Na sekundarno protiteloje največkrat vezan biotin ali reporterski encim. V primeru vezanega reporterskega encima nasekundarno protitelo, dodamo še substrat za encim. Nastali produkt je največkrat obarvan,lahko pa tudi fluorescira. V prvem primeru nastane na mestu označenega proteina barvna lisana membrani, v drugem primeru pa emitirano svetlobo detektiramo s fotografskim filmom.


10.2.1 Namen vajeAnaliziraj raztopino jajčnega beljaka s poliakrilamidno gelsko elektroforezo v prisotnostinatrijevega dodecilsulfata.

10.2.2 IzvedbaV epruveto zmešaj vse sestavine za ločevalni gel, razplini v ultrazvočni kopeli in nato dodaj50 µL 10 % (m/v) amonijevega persulfata (APS) in 5 µL TEMED-a. Previdno premešaj in spipeto takoj prenesi raztopino ločevalnega gela med stekleni plošči kalupov za pripravogelov. Po vlitju raztopine ločevalnega gela takoj nanesi deionizirano H2O, da preprečiš stikkisika z monomerno raztopino. Kisik namreč zavira polimerizacijo monomerne raztopine.Polimerizacija mini gelov poteče v 45 min do ene ure.Po končani polimerizaciji ločevalnega gela, pripravi monomerno raztopino za zbiralni geltako, da zmešaš vse sestavine po navodilih iz preglednice za pripravo gelov razen raztopineAPS in TEMED-a. Raztopino razplini in tik pred vlitjem dodaj 50 µL 10 % (m/v) APS in5 µL TEMED-a. Pred vlitjem pa vodo nad ločevalnim gelom odlij in s filter papirjem posušikapljice med stekli kalupa. Po vlitju zbiralnega gela previdno vstavi glavniček. Pri tem pazi,


da ne bo nobenih mehurčkov pod zobmi glavnička. Zbiralni gel polimerizira v 45 min do eneure.Po končani polimerizaciji zbiralnega gela previdno odstrani glavniček in nastale žepke speri zelektroforeznim pufrom. Po navodilih asistenta prenesi vlite gele v elektroforezno kadičko inv katodni del vlij elektroforezni pufer.V posamezne žepke zbiralnega gela nanesi po 15 µL vzorcev, ki si jih pripravil na naslednjinačin:

20-kratno razredči jajčni beljak in ga uporabi za pripravo vzorcev od a) do g), ki jih bošnanesel v žepke poliakrilamidnega gela.a) K 100 µL pripravljene raztopine beljaka dodaj 100 µL pufra za nanos vzorca, ki vsebuje

NaDS in reducent( β-merkaptoetanol). Tako pripravljen vzorec segrevaj 5 min na 95 ºC.b) K 100 µL pripravljene raztopine beljaka dodaj 100 µL pufra za nanos vzorca, ki vsebuje

le NaDS, ne pa tudi reducenta.c) Pripravljeno razredčeno raztopino beljaka segrej pri 80 ºC in centrifugiraj. Odvzemi

100 µL supernatanta ter dodaj 100 µL pufra za nanos vzorca, ki vsebuje NaDS inreducent. Tako pripravljen vzorec segrevaj 5 min pri 95 ºC.

d) Pripravljeni raztopini beljaka dodaj 120 mAU Alkalaze (subtilisin Carlsberg) na gramproteinov tako. Po 5 minutah razredči reakcijsko mešanico s pufrom za nanos vzorca, kivsebuje NaDS in reducent ter segrevaj 5 min pri 95 ºC.

e) Pripravljeni raztopini beljaka dodaj 120 mAU Alkalaze na gram proteinov tako. Po30 minutah razredči reakcijsko mešanico s pufrom za nanos vzorca, ki vsebuje NaDS inreducent ter segrevaj 5 min pri 95 ºC.

f) 100 µL raztopine, ki vsebuje 120 mAU Alkalaze, razredči sos pufrom za nanos vzorca, kivsebuje NaDS in reducent ter segrevaj 5 min pri 95 ºC.

g) K 10 µL raztopine standardov za NaDS-PAGE dodaj 10 µL pufra za nanos vzorca, kivsebuje NaDS in reducent. Tako pripravljen vzorec segrevaj 5 min pri 95 ºC.

V anodni del vlij 1x elektroforezni pufer. Elektroforezno aparaturo priključi na električni tokvrednosti 35 mA/gel. Električni tok naj bo tekom elektroforeze konstanten. Hitrostelektroforeze lahko spremljaš s potovanjem barvila bromfenol modro. Ko barvilo izstopi izgela, izključi električni tok.Po končani elektroforezi gel speri z dvakrat destilirano vodo in gel 15 min stresaj vpripravljeni raztopini za fiksiranje proteinov in nato še 2 uri v pripravljeni raztopini barvilaCoomassie Brilliant Blue. Po barvanju potopi gel v raztopino za razbarvanje ozadja na gelu instresaj dokler se ozadje na gelu ne razbarva. Gel je nato pripravljen za fotografiranje.

10.2.3 RezultatiRezultat podaj v obliki slike elektroforegrama in komentiraj potek ločevanja proteinov vraztopinah jajčnega beljaka, ki so bile pripravljene na različne načine.


Reagenti

Pufer za nanos vzorca:sestavina količina10 % (m/v) SDS 4,0 mLGlicerol 2,0 mL0,5 mol/L Tris-HCl, pH 6,8 2,5 mL-merkaptoetanol 2-5 %(v/v)0,1 % (m/v) bromfenol modro 1,0 mLdeionizirana H2O do 10 mL

Pufer za ločevalni gel: 1,5 mol/L Tris-HCl, pH 8,8sestavina količinaTris 27,23 gdeionizirana H2O 80 mLs 6 mol/L HCl uravnaj pH na vrednost 8,8deionizirana H2O do 100 mL

Pufer za zbiralni gel: 0,5 mol/L Tris-HCl, pH 6,8sestavina količinaTris 6,0 gdH2O 60 mLs 6 mol/L HCl uravnaj pH na vrednost 6,8deionizirana H2O do 100 mL

Amonijev persulfat,APS: 10 % APSsestavina količinaAPS 100 mgdeionizirana H2O do 1 mLRaztopino pripravi tik pred vlitjem gela

10x elektroforezni pufer, pH 8,3sestavina količinaTris 30,3 gGlicin 144,0 gSDS 10,0 gdeionizirana H2O do 1000 mLNe uravnavaj pH vrednosti raztopini!Pred elektroforezo razredči 50 mL 10xelektroforeznega pufra s 450 mL deionizirane H2O


Priprava gelov: pripravi 10 mL monomerne raztopine akrilamida in bisakrilamida tako, dazmešaš vse sestavine po navodilih iz preglednice razen raztopine APS in TEMED-a:Zamreženjegela % T

deioniziranaH2O (mL)

30 % T raztopinaakrilamida/bisakrilmida(mL)

pufer 10 % (m/v)SDS

4 (za zbiralni gel) 6,1 1,3 2,5 mL0,5 mol/L Tris-HCl, pH 6,8

0,1

10 (za ločevalnigel)

ali

4,1 3,3 2,5 mL1,5 mol/L Tris-HCl, pH 8,8

0,1

12 (za ločevalnigel)

3,4 4,0 2,5 mL1,5 mol/L Tris-HCl, pH 8,8

0,1

Priprava raztopine za fiksiranje proteinov v gelu: 25 % (v/v) izopropanol in 10 % (v/v)ocetna kislinasestavina količinaizopropanol 250 mLocetna kislina 100 mLdeionizirana H2O do 1000 mL

Priprava raztopine barvila Coomassie Brilliant Blue: 0,06 % (m/v) Coomassie Brilliant Blue,10 % (v/v) ocetna kislinasestavina količinaCoomassie Brilliant Blue 0,6 mgocetna kislina 100 mLdeionizirana H2O do 1000 mL

Priprava raztopine za razbarvanje ozadja na gelu: 7 % (v/v) ocetna kislina, 5 % (v/v) metanolSestavina Količinaocetna kislina 70 mLmetanol 50 mLdeionizirana H2O do 1000 mL

PriborMini Protean III elektroforezna celica, termostatirana kopel, električni napajalnik, čaše,kuhalnik, epruvete, 100 mL merilni valj, avtomatske pipete.


BELEŽKE K VAJI


11 Literatura

Boyer R. 2005. Temelji biokemije. Ljubljana, Študentska založba: 634 str.

Boyer R. 2000. Modern experimental biochemistry. 3rd ed. San Francisco, AddisonWesley Longaman: 475 str.

Campbell I.D. and Dwek R.A. 1984. Biological Spectroscopy. Menlo Park, Benjamin-Cummings, str.70.

Cunico R.L., Gooding K.M., Wehr T. 1998. Basic HPLC and CE of biomolecules. 1st ed.Richmond, Bay Bioanalytical Laboratory: 388 str.

Cutler P. (ed)., 2004. Methods in molecular biology: Protein purification protocols.2nd ed. Totowa, Humana Press: 484 str.

Protein electrophoresis applications guide. 1994. San Francisco, Hoefer ScientificInstruments: 106 str.

Kuhelj R. 2003. Biokemija v praksi: načela in tehnike. 3.izd. Ljubljana, Univerza vLjubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Katedra za kemijo: 146 str.

Makovec T. 1999. Biokemija I - navodila za vaje. Ljubljana, Univerza v Ljubljani,Medicinska fakulteta: 204 str.

Pace C.N., Vajdos F., Fee L., Grimsly G., Gray T. 1995. How to measure and predict themolar absorption coefficient of a protein. Protein Science, 4: 2411-2423.

Poklar N., Vesnaver G., Lapajne S. 1994. Denaturation behavior of alpha-chymotrypsinogen-A in urea and alkylurea solutions – Fluorescence studies. Journal ofProtein Chemistry, 13, 3:323-331

Sayle R.1996. RasWin 2.6: RW32B2A.exeAmherst, University of Massachusettshttp://www.umass.edu/microbio/rasmol/getras.htm#raswin (28.2. 2006): software

Sepčić K., Anderluh G., Turk T., Maček P. 1997. Biokemijski praktikum. 4. izd.Ljubljana, Študentska založba: 182 str.

Westermeier R. 1997. Electrophoresis in practice. 2nd ed. Weinheim, VCH: 331 str.

EKSPERIMENTALNA BIOKEMIJA - bf.uni-lj.si · Abram V., Cigić B., Poklar Ulrih N., Skrt M....

Documents

Transcript of EKSPERIMENTALNA BIOKEMIJA - bf.uni-lj.si · Abram V., Cigić B., Poklar Ulrih N., Skrt M....