Ejemplo de Protocolo
-
Upload
angelica-ramirez -
Category
Documents
-
view
223 -
download
0
description
Transcript of Ejemplo de Protocolo
TITULO
EFECTO PROTECTOR DE LOS ESTEROIDES NEUROACTIVOS
PROGESTERONA Y DEHIDROEPIANDROSTERONA EN LA
POBLACIÓN NEUROGLIAL DEL HIPOCAMPO DE RATAS MACHO
ADULTAS, AFECTADAS POR EL HACINAMIENTO Y EL RUIDO.
ÍNDICE PÁG.
RESUMEN 1
SUMMARY 2
ANTECEDENTES 3
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 18
HIPÓTESIS 19
OBJETIVO GENERAL 19
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 19
DISEÑO EXPERIMENTAL 20
MATERIALES Y MÉTODOS 23
ANÁLISIS ESTADÍSTICO 36
RESULTADOS 37
DISCUSIÓN DE RESULTADOS 58
CONCLUSIONES 70
PERSPECTIVAS 71
BIBLIOGRAFÍA 72
VII
INDICE DE FIGURAS Y GRÁFICAS PÁG.Fig. No. 1 Diagrama de flujo 25
Fig. No. 2 Campo de agujeros 29
Fig. No. 3 Laberinto Acuático de Morris 31
Fig. No. 4 Método de Conteo Puntual de Weibel. 35
Fig. No. 5 Recolección de la muestra urinaria. 37
Fig. No. 6 Implante Progesterona, Zona CA3 del Hipocampo 48
Fig. No. 7 Grupo Control, Zona CA1 del Hipocampo. 49
Fig. No. 8 Población Microglial en Zona DG del Hipocampo 54
Fig. no. 9 Transformación Microglial en Zona CA1 del Hipocampo 57
Gráf. No.1A Liberación de Implantes de Progesterona 38
Gráf. No.1B Liberación de Implantes de Dehidroepiandrosterona 38
Gráf. No.2A Niveles de Corticosterona en grupos co ntroles 39
Gráf. No.2B Niveles de Corticosterona en grupos de hacinamiento 40
Gráf. No.2C Niveles de Corticosterona en grupos de ruido 40
Gráf. No.3 Prueba de Morris. Cruces con la Platafo rma 43
Gráf. No.4 “Hole Board” (Campo de agujeros). Tiemp o en Zona Central 44
Gráf. No.5 Hole Board. Visitas Totales 45
Gráf. No.6A Población Astrocitaria en Zona CA1 del Hipocampo 47
Gráf. No.6B Población Astrocitaria en Zona CA3 del Hipocampo 47
Gráf. No.6C Población Astrocitaria en Zona DG del Hipocampo 47
Gráf. No.7A Transformación Astrocitaria en Zona CA1 del Hipocampo 51
Gráf. No.7B Transformación Astrocitaria en Zona CA3 del Hipocampo 51
Gráf. No.7C Transformación Astrocitaria en Zona DG del Hipocampo 51
Gráf. No.8A Población Microglial en Zona CA1 del Hipocampo 53
Gráf. No.8B Población Microglial en Zona CA3 del Hipocampo 53
Gráf. No.8C Población Microglial en Zona DG del Hi pocampo 53
Gráf. No.9A Transformación Microglial en Zona CA1 del Hipocampo 56
Gráf. No.9B Transformación Microglial en Zona CA3 del Hipocampo 56
Gráf. No. 9C Transformación Microglial en Zona DG del Hipocampo 56
VIII
RESUMEN
Antecedentes: El hipocampo es una estructura sensible al incremento de
glucocorticoides durante el estrés, el cual genera cambios bioquímicos y celulares en
esta estructura que afectan las funciones asociadas a ella, tales como la memoria
espacial y la conducta exploratoria. En este estudio hemos analizado la influencia de
los neuroesteroides progesterona (PROG) y dehidroepiandrosterona (DHEA) sobre los
efectos que el estrés por hacinamiento o ruido tienen sobre los niveles de
corticosterona (CORT), la población y transformación glial en el hipocampo, y sobre la
memoria espacial y la conducta exploratoria. Metodología: 90 ratas macho adultas
castradas fueron sometidas a estrés crónico por hacinamiento o ruido durante 10 días,
en presencia de implantes de liberación prolongada de PROG, DHEA ó vehículo
(VEHI). Los neuroesteroides liberados y la cantidad de CORT fueron analizados en
muestras de orina mediante cromatografía de líquidos de alta resolucion (HPLC). Se
realizó un análisis morfológico de población y transformación celular en el hipocampo
con microscopía de luz, utilizando anticuerpos dirigidos contra la proteína acídica
fibrilar glial (GFAP) para astrocitos y marcaje con isolectina-B4 para microglia.
Resultados: El incremento en los niveles de CORT debidos al estrés fue inhibido por la
PROG y DHEA liberadas por los implantes. La PROG previno el impedimento en la
habilidad de recordar claves espaciales para ubicar la plataforma en el laberinto de Morris
generados por el estrés. Ambas hormonas inhibieron el incremento en la actividad
exploratoria producido por el estrés, y DHEA incrementó el tiempo de permanencia en la
zona central del campo de agujeros. La PROG no produjo inhibición sobre las reducciones
del número y transformación morfológica astrocitaria y microglial generadas por el estrés.
La DHEA disminuyó estos efectos en las áreas analizadas, independientemente de las
condiciones de estrés. Conclusiones: Los esteroides liberados desde los implantes
hormonales disminuyeron los niveles de CORT, ejercieron efectos ansiolíticos; reflejados
en la conducta exploratoria y preservaron la memoria espacial, frente al estrés. Estos
esteroides tambien inhibieron la astrogliosis y reactividad microglial en las regiones
cerebrales analizadas de los animales estresados.
1
SUMMARY
Background: The hippocampus is a structure sensitive to high levels of glucocorticoids
during stress response, which generates biochemical and cellular alteration, and changes
in the related behavioral functions, such as the spatial memory and the exploratory
behavior. In this study, we analyzed the influence of the steroids progesterone (PROG) and
dehydroepiandrosterone (DHEA) on the stress-induced changes in the corticosterone
(CORT) level, number and reactivity of glial cells in the hippocampus, the spatial memory
and the exploratory behavior. Methods: 90 male adult castrated rats were exposed to
chonic stress by overcrowding and ultrasonic noise for 10 days. They were previously
implanted with PROG, DHEA or a vehicle (VEHI). Steroids and CORT levels were assesed
in the urine with high performance liquid chomatography (HPLC). The number and
reactivity of cells were measured with light microscopy morphologic analysis, using
antibodys against glial fibrilar acidic protein (GFAP) for astrocytes, and isolectine-B4 for
microglia. Results: The stress-induced rising CORT level was inhibited by PROG and
DHEA. PROG prevented the stress-induced spatial memory impairing in the Morris Water
Maze test. Both hormones inhibited the stress-induced enhancement of the exploratory
behavior in the Hole Board, but only DHEA incremented the time elapsed in the central
zone of this field. PROG had no effects on the stress-induced reduction in the number and
reactivity of astrocytes and microglia. DHEA caused the more notable effects on the
astrocytic and microglial populations decreasing and reactivity, wthitout a relation ship with
the kind of stress.
Conclusions: Steroides delivered from the hormonal implants caused a diminution of
the CORT levels, exerting an ansiolytic effect manifested by a modified exploratory
behaviour, and also maintained the spatial memory, against stress. Astrogliosis and
microglial reactivity were inhibited too by these steroids, in the examined brain regions
from the stressed animals.
2
ANTECEDENTES
Estrés y glucocorticoides.
El estrés se define como una condición en la cual un organismo enfrenta una
situación adversiva, la cual influye en su percepción o habilidad para controlar la
presencia o la intensidad de los estímulos adversos (Jeansok y Diamond, 2002). El
estrés activa el eje hipotálamo-pituitario-adrenal (HPA) liberando grandes cantidades
de glucocorticoides (GC´s), especialmente si el estímulo es de características crónicas
(McEwen, 2000).
Algunas funciones relacionadas con el hipocampo como son el aprendizaje, la
memoria y la conducta exploratoria, son modificadas por el estrés, mediante la
activación de glucoreceptores tipo I (mineraloreceptores) o tipo II (glucoreceptores)
localizados en esa área (Jeansok y Diamond, 2002). Por consiguiente, el estrés se
relaciona estrechamente con los cambios celulares en el hipocampo y en
consecuencia, con cambios conductuales asociados a este órgano cerebral.
El uso de diversos estímulos adversos sirven como modelo experimental para
generar la respuesta fisiológica de estrés. El ruido por ejemplo; ha sido ampliamente
utilizado para estudiar el comportamiento animal ante situaciones estresantes
(Mollenauer y cols., 1992), resulta de gran importancia su estudio debido a su impacto
creciente en las actividades cotidianas de los seres humanos (Cohen y Williamson,
1991), ya que al incrementar significativamente los niveles plasmáticos de GC´s
(Arcana y Navasivayam, 1999) o de la hormona ACTH (Van Raaij y col., 1997), induce
cambios importantes en la regulación hormonal de los individuos.
Los modelos experimentales con animales sometidos a estrés de tipo social se
han utilizado también con frecuencia. Estos modelos parecen ser una analogía mucho
más válida de la respuesta al estrés en los h umanos ya que representan situaciones
menos ajenas a nuestra especie (Henry y cols., 1993). Se usan por ejemplo, la
confrontación a jerarquías sociales, el hacinamiento, las vocalizaciones
3
ultrasónicas (USVs) como un tipo social de ruido, y los enfrentamientos o peleas con
otros individuos (Blanchard, 1991; Fokkema y col., 1995; McEwen, 2000).
Las vocalizaciones ultrasónicas (USVs) constituyen una especie de ruido social,
ya que son sonidos de alta frecuencia emitidos por los roedores ante diferentes
situaciones. Las USVs de distrés (18-24 KhZ), se han utilizado (producidas por
animales o por dispositivos electrónicos) para generar estrés en ratas (Blanchard y
col., 1991; Commissaris y col., 2000). También como factores sociales estresantes se
han evaluado las condiciones de alojamiento, tales como la mezcla de machos y
hembras en ratas (Klein y col., 1992), el aislamiento y el hacinamiento en ratones (Aioi
y col, 2001) y ratas (Boranic y col., 1982; Csermely y col., 1995).
El hacinamiento, es decir, la convivencia de varios individuos en un espacio
reducido es por su parte una variable útil en la in vestigación con modelos animales, ya
que se presenta con mucha frecuencia en diferentes comunidades, y en las personas
ha sido relacionado como un factor de riesgo para la esquizofrenia (Torrey y Yolken,
1998). En ratas sometidas a estas circunstancias, se ha observado un incremento en
los niveles de los neurotransmisores serotonina y noradrenalina (Boranic y col., 1982).
Sin embargo, para que el hacinamiento produzca efectos fisiológicos se requiere de un
tiempo de exposición prolongado. Csermely y col. (1995) observaron que un
hacinamiento de tres meses incrementaba la concentración intracelular de calcio, lo
cual constituye un marcador sensitivo de la homeostasis en las células vivas. Los
efectos de ambos factores fueron estudiados en una investigación a largo plazo (8 a 14
meses) en la que se analizó la influencia del ruido y el hacinamiento sobre el
aprendizaje y la memoria de ratas; la estimulación estresante incrementó estas
habilidades en sujetos de 10 a 12 meses de edad. Sin embargo, cuando los animales
envejecieron mostraron deterioro de estas habilidades (Bubna-Littitz y col, 1981). Estos
tipos de estrés han mostrado incrementos en los niveles de corticosterona (CORT),
siendo el GC más común en los roedores (Meerlo y col., 1999).
4
Asimismo, inducen hiperactividad del eje HPA (Ely y col., 1997), supresión de la
conducta exploratoria en las ratas (Meerlo y col., 1999), e inducen una remodelación
neuronal del área CA3 del hipocampo (McKittrick y c ol., 2000).
Efectos del estrés sobre las neuronas.
Los efectos nocivos del estrés sobre las neuronas hipocampales se deben a que
éstas células poseen abundantes receptores a esteroides adrenales, y particularmente
el hipocampo es sensible y muy vulnerable a los efectos del estrés (McEwen, 2000). El
estrés psicosocial y la inmovilización de los animales en espacios reducidos durante el
hacinamiento, producen atrofia después de 3-4 semanas, y resultan particularmente
afectadas las neuronas piramidales de la región CA3 del hipocampo. Sin embargo, el
proceso de atrofia puede bloquearse al inhibir la síntesis de esteroides adrenales y los
efectos citotóxicos de aminoácidos excitadores (Magarinos y col., 1997). Como
resultado del estrés repetitivo, el aná lisis de la ultraestructura de las fibras musgosas
terminales de neuronas de la región CA3 del hipocampo ha revelado una depleción de
las vesículas sinápticas. Así, las fibras musgosas parecen ser las responsables de
producir la atrofia en neuronas CA3, que afecta principalmente a las dendritas apicales,
y posiblemente produce un desensamblaje del citoesqueleto dendrítico (McEwen y
Magarinos, 1997). Con la atrofia de las dendritas apicales se produce déficit
cognoscitivo específico en el aprendizaje espacial y en la memoria (Magarinos y col.,
1997).
El hipocampo puede resultar afectado básicamente p or dos formas de
plasticidad estructural en respuesta al estrés; 1) atrofia de las dendritas apicales de la
zona CA3 y, 2) supresión de la neurogénesis en el giro dentado. Los glucocorticoides,
los aminoácidos excitatorios y lo s receptores NMDA (un sub-tipo de receptores a
glutamato) están implicados en estas d os formas de plasticidad, ambas son relevantes
para el funcionamiento del hipocampo humano frente a atrofia selectiva, acompañada
por deficiencias en la ejecución de la memoria declarativa episódica, espacial y
contextual (McEwen, 1999; Kuroda y McEwen, 1998).
5
Efectos del estrés sobre los astrocitos.
Las células de la microglia y los astrocitos desempeñan importantes funciones
durante el metabolismo normal del cerebro, entre otras funciones permiten mantener la
homeostasis, al actuar como reservorio de substancias precursoras de
neurotransmisores y como un sistema de depuración de productos del catabolismo
neuronal. Estas células contribuyen a la respuesta neuronal frente al estrés, y su
activación excesiva y prolongada se ha propuesto como una de las causas asociadas a
trastornos neurodegenerativos (McEwen, 2000).
La expresión estructural de la proteína acídica fibrilar glial (GFAP), determinante
de la motilidad y de la forma astrocitaria, es esencial para la interacción neurona-
astrocito, y depende principalmente de los niveles de corticosterona circulante, ya que
esta proteína no está tan relaci onada con otras hormonas adrenales (Zilles y col.,
1991). Su regulación es fundamental durante la plasticidad glial-neuronal en el proceso
adaptativo del sistema nervioso adulto, frente a las necesidades fisiológicas (Garcia-
Segura y col., 1996).
Los glucocorticoides ejercen influencias potentes in vivo e in vitro, sobre la
proliferación, maduración, diferenciación y funciones de los astrocitos (Aizenman y
Vellis, 1987; Kniss and Burry, 1985; Morale y col., 2001; Patel y col., 1983), y más de
10 tipos diferentes de isoformas de proteinas incluyendo la GFAP, resultan afectados
en los astrocitos por cambios en la CORT (Magnaghi y col., 2000; Nichols, 2003; O
´banion y col., 1994). Los efectos de la CORT sobre la expresión de GFAP no están
mediados únicamente por los mecanismos neuron ales, sino que también pueden
ejercerse a través de la acción directa sobre los receptores astrocitarios a la hormona
(Maurel y col., 2000), en especial por los glucoreceptores o receptores tipo II (Nichols y
col., 1990; Bohn y col., 1994; Crossin y col., 1997). Estas hormonas inhiben la
expresión de genes para GFAP (Crossing y col., 1997; Laping y col., 1994; Nichols y
col., 1990; O’callaghan y col., 1991), y se ha observado que la adrenalectomía produce
los efectos opuestos (Gould y col., 1992; Krugers y col., 1994). Los glucocorticoides
también pueden inhibir la síntesis de DNA en los
6
astrocitos y por lo tanto su proliferación (Alonso, 2001; Crossing, y cols 1997; Kniss,
1985), aunque este efecto puede ser reversible con PROG y DHEA (Crossin y col.,
1999). Adicionalmente, la CORT impide la capacidad de los astrocitos para retirar
aminoácidos excitatorios de las sinapsis, lo cual e xacerba el daño ocasionado por los
mismos (Chou, 1998; Virgin y col., 1991); dificulta el control que ejercen sobre la
homeostasis de sodio y potasio (Lian y Stringer, 2004), y reduce su actividad
fagocitaria (Roldan y col., 1997). Este papel inhibitorio es opuesto al encontrado en
algunos estudios in vitro, en los que se observa un incremento del mRNA de GFAP y
de la tasa de transcripción de la proteina (Melcangi y col., 1997; Rozovsky y col.,
1995), o incrementos en la proliferación de astrocitos (Deniselle y col., 1999). Asi
mismo, Maurel y col. (2000) han mostrado un incremento in vivo de la proteína GFAP
en el Núcleo Supra Quiasmático (SQN) y un decrement o de esta en el hipocampo
ante la exposición a glucocorticoides, lo que sugiere que, las respuestas de expresión
de GFAP pueden ser regionalmente específicas. Recientemente, en nuestro
laboratorio se ha encontrado evidencia de que la exposición subaguda al
glucocorticoide prednisona (PRED) por implante subcutáneo (González-Perez y col.,
2001) y por administración oral crónica (González-Castañeda y col., 2002) incrementó
la reactividad glial en varias regiones cerebrales. También se ha observado alta
reactividad astrocitaria en ratas ancianas (Björklund y col., 1985), lo cual puede estar
relacionado con procesos de envejecimiento cerebral asociado a la exposición
prolongada a glucocorticoides (McEwen, 2000).
La investigación del estrés psicológico y su impacto sobre las células
astrocitarias es escasa; la mayoría de los experimentos se han hecho in vivo o in vitro,
mediante la aplicación directa de GC´s. Sin embargo, recientemente Ritchie y col.
(2004), encontraron que el estrés crónico de ntensidad media redujo la
inmunoreactividad de GFAP en ratas en CA1 y CA3, y en el hilus del hipocampo.
Efectos del estrés sobre las células de la microglia.
Las células de la microglia representan la principal respuesta inmune cerebral,
ya que éstas responden al daño neuronal a través de diversos cambios en su
7
morfología que inducen una hiper-ramificación, estados reactivos y de macrófagos
cerebrales (Streit y col., 1999).
Aunque las celulas de la microglia poseen receptores para la hormona
liberadora de corticotropina (CRH), (Wang y col., 2002) y a CORT (Tanaka y col.,
1997) que participan de forma muy importante en el mecanismo de activación del
sistema HPA, el efecto directo de los glucocorticoides sobre la microglia ha sido poco
evaluado. Por ejemplo, se ha observado que la administración prolongada de CORT en
ratas adultas genera cambios en la proliferación de progenitores de oligodendrocitos
(Alonso, 2000) y más recientemente , se ha mostrado que la adrenalectomía (ADX)
genera una activación de la microglia que puede ser revertida con CORT (Moga y col.,
2005; Nichols y col., 2005). También han sido estudiados otros corticosteroides en
relación con las transformaciones de microglia. Por ejemplo: la dexametasona genera
cambios en la proliferación de la microglia ameboide en fetos de rata (Wang y col.,
1998). Además, se ha ob servado cambios morfológicos de la microglia con la
administración neonatal de cortisona, y respecto a la generación de isquemia (McRae y
col., 1996). En nuestro laboratorio, la administración crónica de prednisona produjo
cambios en la cantidad de microglia marcada en la corteza prefrontal, estriado e
hipocampo en grupos experimentales tratados con altas dosis del fármaco, en
comparación con el grupo control (Gonzalez-Castañeda y col., 2002).
La sobreactivación celular por el estrés crónico produce incrementos en los
niveles de glutamato, algunos estudios han mostrado activación microglial ante
incrementos de diferentes neurotransmisores (Streit y col., 1999), particularmente ante
la neurotoxicidad por exceso de glutamato (Gehmann y col., 1995) que desequilibra la
homeostasis celular, e incrementa las transformaciones citoplasmáticas de la microglia
(Gonzalez-Perez y c ol., 2001). Por último, los efectos de los corticosteroides sobre la
microglia no necesariamente son unidireccionales, pues se ha observado que pueden
actuar sobre éstas células gliales como estimulantes a través de mineraloreceptores, y
como inhibitorios a través de los glucorreceptores (Tanaka y col., 1997) y que la
exposición in vitro a Gc´s durante
8
24 h se relaciona con su inhibición, pero la exposición más prolongada resulta en
excitación.
Efectos conductuales del estrés.
El aumento de corticosteroides inducido por el estrés produce deficiencias en el
aprendizaje y en la memoria (de Kloet y cols, 1999). En modelos con animales y en los
humanos, dependiendo de la intensidad y duración, el estrés produce alteraciones del
hipocampo y deficiencias en la memoria (Lupien y McEwen, 1997). Los corticosteroides
son responsables de esta relación, ya que a través de ellos los eventos estresantes
generan modificaciones sobre la estructura y la funcionalidad del hipocampo, como por
ejemplo, la atrofia de las dendritas apicales de las células piramidales de CA3, lo que
dificulta el aprendizaje espacial (Brown, y col., 1999).
Por ejemplo, se ha descrito que la corticotropina y los glucocorticoides facilitan la
memoria a dosis bajas, pero la impiden a dosis altas (McGaugh y cols, 1995). En
estudios con resonancia magnética de pacientes psiquiátricos y seniles en los que
existen anormalidades de corticosteroides se ha observado atrofia selectiva del
hipocampo, acompañada por deficiencias en la memoria declarativa (la capacidad
para recordar hechos o eventos con orden temporal), la memoria espacial (la
capacidad para recordar sitios específicos, recorridos y claves para guiarse en el
espacio) y la memoria contextual (la capacidad para recordar un conjunto de estímulos
como un evento espacial integrado) (McEwen, 2000).
La motivación para explorar ambientes ha sido otra de las consecuencias de la
alteración del eje HPA y del hipocampo, los receptores tipo I o MRs están relacionados
con el comportamiento exploratorio de nuevos ambientes y la conducta en laberintos
acuáticos, y los receptores tipo II e stán relacionados con efectos en la consolidación y
retención del comportamiento aprendido (Oitzl y col., 1994). Aunque ambos tippos de
receptores se activan con corticosteroides, los tipo I tienen mayor afinidad por ellos y
responden ante niveles normales de estas hormonas, mientras los tipo II se activan
principalmente ante el exceso de corticosteroides. Además, el
9
deterioro del funcionamiento hipocampal reduce el aprendizaje, la memoria espacial y
la habilidad para explorar adecuadamente el ambiente (Raber, 1998).
El hipocampo juega un papel importante en las respuestas ante estímulos
novedosos. Al afectarse esta estructura se reduce la tendencia del animal a explorar
flexiblemente su ambiente y perseveran en ellos comportamientos previamente
adquiridos. La incapacidad para reaccionar a estímulos, es debido a los receptores
MRs los cuales están relacionados con el proceso de selección de respuesta, y por
tanto determinan el patrón de conducta generado por un nuevo ambiente.
Se ha observado que los niveles disminuidos de CORT provocan un mayor
tiempo de recorrido de la zona central en un ambiente novedoso y un mayor tiempo de
permanencia en la misma, mientras que los niveles normales de CORT (ocupación de
MRs) resultan en menores niveles de este patrón de exploración (Oitzl y cols., 1994).
Sin embargo, un exceso de CORT (ocupación de MRs y GRs) los vuelve a incrementar.
Al bloquearse los MRs, vuelve a resultar disminución de la conducta exploratoria
central. En esta prueba, el bloqueo de GRs no tuvo efectos significativos sobre el
patrón de exploración, tampoco impidió la consolidación de la información espacial, ni
la adquisición y evocaciónde la información aprendida, en cambio; el bloqueo de MRs
produjo un patrón de búsqueda alterado, al parecer la función de MRs está involucrada
con la elección de la respuesta conductual. El bloqueo de ambos tipos de receptores
alteró la navegación para el aprendizaje de lugar (Oitzl y de Kloet, 1992). En general,
los estudios al respecto sugieren que los glucocorticoides, a través de sus receptores
MR tienen una gran influencia sobre la conducta exploratoria ante eventos novedosos
(de Kloet y col., 1999).
Como puede observarse, el efecto de los GC´s en la respuesta frente al estrés
es bastante amplia, esta activación hormonal interactúa de manera compleja a trávés
de neuronas y células gliales en el SNC con otro tipo de moléculas que han sido
denominadas neuroesteroides, los cuales pueden funcionar como anti-
glucocorticoides.
10
Origen y efectos de los neuroesteroides sobre el sistema nervioso.
Los neuroesteroides son compuestos sintetizados en el sistema nervioso central
y periférico, tanto en las neuronas como en las células gliales, a partir del colesterol o
de precursores esteroideos importados de fuentes periféricas (Baulieu y col., 2001). En
el sistema nervioso central (SNC) existe como fuente de ellos, una concentración
elevada de colesterol (Clemens y Weaver, 1985), independientemente de la actividad
sintética de glándulas endocrinas p eriféricas (Hu y col., 1987; Baulieu y Robel 1990;
Akwa y col., 1993a; Kabbadj y col., 1993).
La conversión de colesterol está catalizada por la enzima citocromo P450scc,
localizada en la membrana interna mitocondrial de los tejidos esteroidogénicos, y el
colesterol debe ser trasladado hasta el interior de la mitocondria para que pueda
sintetizarse la pregnenolona, -primera molécula en la síntesis de hormonas esteroides
(Costa y col., 1994; Brown y col., 1979). En diferentes estructuras sus concentraciones
pueden variar de acuerdo a circunstancias ambientales y comportamentales tales
como la presencia de estrés, reconocimiento sexual o agresividad (Baulieu y col.,
2001).
Los neuroesteroides actúan mediante el mecanismo cl ásico de acción de las
hormonas a través de receptores nucleares, modulando canales iónicos y actuando
sobre receptores en la membrana plasmática al GABA A, glicina y glutamato (Baulieu y
col., 2001; Majewska y col., 1986; Lambert y col., 1987; Puia y col., 1990; Akwa y col.,
1991; Wu y col., 1990; Wu y col., 1991; Majewska, 1992). También tienen una
influencia importante sobre los receptores sigma1 que modulan la movilización
intracelular y el flujo extracelular de calcio, asi como las respuestas mediadas por
NMDA, la liberación de acetilcolina y la alteraciónde sistemas monoaminérgicos. A
nivel comportamental, estos receptores están involu crados con el aprendizaje y la
memoria, la respuesta de estrés, la depresión, la neuroprotección y la
farmacodependencia (Maurice y col., 2001).
Los efectos regulatorios de los neuroesteroides sobre los receptores a
neurotransmisores constituyen un medio de comunicación vital entre el cerebro y el
11
resto del cuerpo; origen de numerosos fenómenos psico-fisiológicos. La síntesis
alterada de esteroides centralmente activos puede contribuir a defectos de la
neurotransmisión, causantes de diferentes trastornos (Majewska y col, 1986; Majewska
1992). En general, pero tambien de manera dependiente del contexto celular, las
formas ésteres de ácidos grasos de neuroesteroides ejercen efectos inhibitorios
mientras que sus derivados sulfatados efectos excitatorios (Baulieu y Robel 1990;
Akwa y col., 1993a; Kabbadj y col., 1993; Baulieu, 1981, 1991).
Han sido descritos numerosos neuroesteroides (Baulieu y Robel, 1990; Baulieu,
1991), pero los principales especies son compuestos polares (Garcia-Segura y col.,
1994), entre los más importantes están la pregnenol ona (PREG), progesterona
(PROG) y dehidroepiandrosterona (DHEA), -progenitores de muchos otros esteroides
(Baulieu, 1981).
La DHEA es un esteroide adrenal, su derivado hidrofílico sulfatado (DHEAS) es
el más abundante en la circulación sanguínea de hum anos y primates, y posee gran
actividad en los tejidos diana periféricos como las gónadas, donde sirve como
precursor para la formación de andrógenos y estrógenos (Ebeling y Koivisto, 1994;
Hennebold y Daynes, 1994; Luu y col., 1995). Además , la DHEA es conocida por sus
efectos funcionales en el SNC, incluyendo la estimulación de la memoria y el
aprendizaje, efectos neurotróficos y neuroprotectores (Wang y col., 2001).
Otro de los efectos benéficos de los esteroides, particularmente de la PROG, es
su capacidad para inhibir el desarrollo de edema cerebral tras isquemia (Olmos y col.,
1989; Naftolin y col 1993); reducen la permeabilidad de la barrera hemato-cerebral y
bloquean el transporte activo de sodio por capilares cerebrales in vitro (Koenig y col.,
1995; Betz y Coester, 1990a). PREG y DHEA son precursores de hormonas sexuales y
esteroides neuroprotectores, y los efectos de ambas pueden estar mediados
parcialmente por su conversión a testosterona y estradiol gracias a la enzima
aromatasa. Esta enzima es inducida en astrocitos reactivos luego de distintas formas
de lesiones neurodegenerativas, y resulta una producción local aumentada de
estradiol, que tiene propiedades neuroprotectoras (Veiga y col., 2003).
12
En términos generales, el sistema nervioso incrementa la producción de
esteroides como un mecanismo para bloquear condiciones neurodegenerativas. Este
mecanismo es el resultado de la interacción coordinada entre las neuronas y la glia.
Los esteroides producidos por la glia regulan la función sináptica, modulan la ansiedad,
la cognición, el sueño y el comportamiento, al mismo tiempo que ejercen
neuroprotección. Adicionalmente, las células gliales son diana de los esteroides y
regulan algunos de los efectos de estas moléculas sobre las neuronas, incluyendo la
supervivencia y regeneracón (Garcia-Ovejero y col., 2005).
Relación de los neuroesteroides con las células gli ales.
En el cerebro de la rata los astrocitos y oligodendrocitos sintetizan y
metabolizan neuroesteroides (Hu y col., 1987; Akwa y col., 1993b; Kabbadj y col.,
1993; Majewska, 1992; Kleinrok y col., 1994; Zwain y Yen, 1999). En el sistema
nervioso periférico (SNP) las células de Schwann también sintetizan pregnenolona,
independientemente de la edad y del sexo (Morfin y col., 1992).
La biosíntesis de neuroesteroides está regulada po r un complejo receptor
mitocondrial hetero-oligomérico, con sitios de reconocimiento de alta afinidad para las
carboxamidas de isoquinolina, las imidazopiridinas, benzodiacepinas y las 2-aril-
indolacetamidas (Morfin y col., 1992). Este complejo se expresa abundantemente en
las células gliales y tiene un ligando endógenoputativo, el péptido inhibidor de unión a
diazepam, que también es abundante en células gliales donde estimula la
esteroidogénesis (Morfin y col., 1992; Korneyev y col., 1993),
En general, los astrocitos parecen ser las células más importantes en la
expresión de esteroides en el SNC, en especial de PROG y DHEA (Zwain y Yen,
1999). Pueden liberar progesterona y una gran variedad de neuroesteroides a las
células vecinas, y ejercen un efecto modulador sobre el sistema nervioso -resultante
de las interacciones neurona-glia. La progesterona, participa de modo muy importante
en la plasticidad sináptica que ordinari amente se produce en el hipotálamo a través
del ciclo ovárico (Akwa y col., 1993b), y en modular la
13
reorganización del citoesqueleto astrocitario en respuesta a otras hormonas gonadales
(Pérez y col., 1993; Luquín y col., 1993).
Una vez liberados los neuroesteroides, estos afectan también el
comportamiento de las células gliales. Se ha observado por ejemplo un efecto
inhibitorio de la PROG y la DHEA sobre los astrocitos, ya que DHEA aplicada de
manera crónica y aguda impide el incremento en la expresión de GFAP, que
normalmente se produce por la denervación del bulbo olfatorio (Hoyk y col., 2004),
además in vitro, la DHEA disminuye la proliferación astroglial (Bolota y col., 1987). Sin
embargo, la administración del neuroesteroide a ratas recién nacidas, produjo un
incremento a largo plazo en el tamaño y la cantidad de astrocitos GFAP-
inmunoreactivos en el hipocampo, antes y después de la pubertad (Shirayama y col.,
2005). Por su parte, la PROG inhibió el crecimiento astrocitario in vitro (Jung y col.,
1992) y se observó inhibición de astrogliosis y déficit funcionales luego de lesiones
cerebrales (Djebaili y col., 2005), probablemente a través de sus acciones sobre la
respuesta de células inflamatorias (Grossman y col., 2004) gracias al efecto de varios
de sus metabolitos (Ciriza y col., 2004).
En cuanto a la microglia, la DHEA in vitro tuvo efectos inhibitorios sobre células
microgliales y su respuesta inmunológica (Wang y col., 2001), además, inhibió la
viabilidad celular de células de microglia, en proporción inversa a la cantidad de
glucosa en el medio de cultivo (Yang y cols., 2000). In vivo; la DHEA redujo la
activación microglial en el sistema dopaminérgico nigroestriado de ratas (Tomas-
Camardiel y col., 2001). Asimismo, se observó un efecto inhibitorio en algunas de las
proteínas sintetizadas, tales como el componente interferón gama de la respuesta
microglial (Bargers y col., 2000) y el factor de necrosis tumoral TNF en astrocitos y
microglia (Di Santo y col., 1996). Por su parte la PROG no inhibió las respuestas
inmunes de la microglia (Bruce-Keller y col., 2000), pero si impidió su transformación
(Fujita y col., 1996), sin embargo; en estudios anteriores se observó que la PROG no
tuvo efecto sobre cultivos mixtos de astrocitos y microglia, pero inhibió la proliferación
microglial en cultivos deestas células aisladas (Ganter y col.,
14
1992). Finalmente, DHEA y PROG redujeron la acumulación de tejido glial alrededor
de una lesión en el tejido nervioso (Garcia-Estrada y col., 1999).
Estrés y neuroesteroides.
El medio ambiente esteroideo del cerebro influencia su estructura y su función.
Asi pues, el estrés incrementa los niveles de glucocorticoides, y en diferentes regiones
cerebrales la concentración de neuroesteroides se modifica por su efecto (Majewska,
1992). La alteración en las concentraciones normales de neuroesteroides o de su
metabolismo provoca a su vez trastornos funcionales y tróficos en el sistema nervioso
(Baulieu EE. 1997, 1998; Robel y Baulieu, 1995).
En general, durante el estrés agudo puede observarse disminución de algunos
neuroesteroides, pero normalmente ocurre un aumento cuando el estrés es prolongado
(Obut y col., 2004). Además, puede suced er el efecto inverso, ya que algunos
neuroesteroides como la DHEA ejercen un efecto inhibidor sobre el incremento de
CORT producido por el estrés (Obut y col., 2002), en especial sobre el estrés crónico y
no el agudo (Obut y col., 2003).
El incremento de neuroesteroides debido al estrés ha sido observado en PREG
y PROG en la corteza e hipocampo de ratas ante la exposición a CO2
(Barbaccia y col., 1994; Shimada y col., 1998), en PREG y ALOP en la corteza frontal
de ratas expuestas a nado forzado (Vallee y col., 2000), en los niveles de PROG central
de crias ante la separación de la madre en ratas (Kehoe y col., 2000), en PREG pero no
de la DHEA ante estrés psicosocial (Shimada y Yago, 2000), y en los niveles generales
de neuroesteroides ante la combinación de estrés social crónico y choques eléctricos
(Serra y col., 2000).
Adicionalmente, las hormonas del eje HPA, CRH y ACTH incrementaron de
manera significativa los niveles de PREG y DHEA en el cerebro y sangre en ratas
(Torres y Ortega, 2003). Sin embargo, es posible encontrar también una relación
inversa entre los niveles de estrés y de neuroesteroides, ya que se ha observado que,
en ratas jóvenes recién destetadas sometidas a estrés por aislamiento social
15
durante 30 días, se produjo un decremento en la concentración de neuroesteroides en
plasma, corteza e hipocampo, al igual que un incremento en los niveles de CORT y
una disminución en la función de los receptores GABAA (Serra y col., 2000). Los
resultados opuestos pueden obedecer a la utilización de diferentes procedimientos
experimentales para la generación del estrés, sin embargo, lo más frecuente es la
relación del estrés con el aumento de neuroesteroides en el SNC.
En relación al estrés, la DHEA produce efectos neuroprotectivos al disminuir la
neurotoxicidad por análogos del glutamato y los cor ticoides, posiblemente actúa como
antiglucocorticoide (Herbert, 1998), pues se ha observado que protege las células
hipocampales en cultivo del daño inducido por estrés oxidativo (Bastianetto y col.,
1999), y del daño generado por la presencia de CORT (Kimonides y col., 1999) y
aminoácidos excitatorios (Kimonides y col., 1998) . El efecto anti glucocorticoide, se
infiere también de experimentos en los que la DHEA bloquea el incremento en la
actividad de la triptófano hidroxilasa en el mesencéfalo y corteza de ratas resultante del
estrés por ruido (Singh y col., 1994); antagoniza por ejemplo los efectos de la
inmovilización repetida sobre la pérdida de peso corporal, los niveles de GR´s en
glandulas adrenales y la generación de radicales libres (Hu y col., 2000) y provoca
efectos ansiolíticos en ratones, en el laberinto elevado en cruz (Melchior y Ritzmann
1994a). En contraposición, también se ha observado que aunque la DHEA fortaleció la
potenciación primaria hipocampal en ratas sin estrés, no tuvo este efecto benéfico en
ratas estresadas (Diamond y col., 1999).
Por su parte, la PROG tiene un papel ansiolítico ante diferentes situaciones de
estrés, el incremento en la expresión de mRNA para c-fos luego de estrés por
inmovilización fue menor en el hipocampo y corteza de ratas en proestro y estro, en
comparación con ratas en diestro y ratas machos, lo que sugiere que estas estructuras
son activadas diferencialmente por el estrés, dependiendo de los niveles de PROG
(Figueiredo y col., 2002). Además; la PROG inhibe de manera confiable las
consecuencias provocadas por la inmovilización, efecto que puede bloquearse por los
antagonistas de receptores a GABAA, (picrotoxina y bicuculina), pero no por el
antagonista de benzodiacepinas (flumazenil) (Reddy y Kulkarni, 1996).
16
A pesar de sus acciones ansiolíticas ante situaciones de estrés, también puede
generar efectos secundarios en individuos controles, esta hormona disminuyó el
consumo de alcohol en ratas estresadas por aislamiento social (Mediratta y col., 2003),
y en ausencia de estrés produjo un incremento del consumo total de líquidos.
Adicionalmente, la PROG inhibió la respuesta inmune humoral y celular frente a estrés
por inmovilización, pero por si misma suprimió esta respuesta en ratas no estresadas.
Este efecto compensatorio frente al estrés parece estar modulado por su acción sobre
receptores GABAA, pero su acción inmunosupresora requiere un mecanismo
alternativo en los sujetos no estresados (Mediratta y col., 2003).
En términos generales, el incremento en los niveles de neuroesteroides frente a
situaciones estresantes juega un papel importante en los mecanismos homeostáticos
que regulan la inhibición de los receptores GABAA durante la respuesta de estrés
(Higashi y col., 2005). Sin embargo; la disminución observada algunas veces en los
neuroesteroides por el estrés, puede deberse a una disminución en la actividad de el
eje HPA, como un mecanismo para reducir el incremento de GC´s (Serra y col., 2004).
17
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En los vertebrados, el estrés eleva los niveles séricos de glucocorticoides (GC
´s) y estimula el eje hipotálamo hipofisiario (HPA) causando efectos adversos sobre el
SN, evidenciados por una reorganización en las regiones que poseen una alta
densidad de receptores a glucocorticoides, como el hipocampo. Las alteraciones
cerebrales pueden ser transitorias o permanentes, según afecten cerebros inmaduros
o adultos respectivamente. Los efectos son más severos cuando suceden durante el
desarrollo cerebral temprano y el hipocampo resulta especialmente afectado, puesto
que éste forma parte del sistema de retroalimentación negativa hacia el eje HPA y está
estrechamente relacionado c on la conducta exploratoria, la memoria explícita,
episódica y la memoria espacial, las cuales se afectan notablemente.
Por lo anteriormente descrito; analizar la reactividad astrocitaria y microglial en el
hipocampo de ratas, como consecuencia de la exposición crónica a estrés por
hacinamiento o ruido y bajo la influencia protectora de neuroesteroides progenitores
(progesterona ó dehidroepiandrosterona), liberados desde implantes subcutáneos.
Es el motivo del presente estudio en el cual también se analizaran las manifestaciones
cognoscitivas; expresadas por la conducta exploratoria, memoria y aprendizaje
espacial.
18
HIPÓTESIS
Los neuroesteroides progenitores progesterona ó dehidroepiandrosterona ejercen
efectos neuroprotectores en el hipocampo de ratas estresadas por hacinamiento o
ruido, y estos efectos benéficos se manifiestan sobre la citoarquitectura glial y el
comportamiento de los animales.
OBJETIVO GENERAL
Analizar el efecto del estrés por hacinamiento o ruido sobre parametros
conductuales y sobre la citoarquitectura glial en ratas macho adultas.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1 Establecer los efectos del estrés por hacinamiento o ruido sobre el aprendizaje
espacial y la memoria de ratas adultas jóvenes, bajo la influencia
neuroprotectora de los esteroides neuroactivos progesterona ó
dehidroepiandrosterona.
2 Analizar los efectos del estrés en presencia y ausencia de neuroesteroides,
sobre la citoarquitectura glial de las zonas CA1, CA3 y DG del hipocampo de las
ratas.
19
DISEÑO EXPERIMENTAL
Sujetos de experimentación
Ratas macho Swiss-Wistar adultas con 2 meses de edad y 250 y 280 g de peso.
Grupos de estudio:
a) Grupo 1 (VEHI): ratas castradas con implante subcutáneo (sc) de un a cápsula
de silicona con aceite de sésamo (vehículo solo), (n =30).
b) Grupo 2 (PROG): ratas castradas con implante subcutáneo (sc) de un a cápsula
de silicona con progesterona (8 mg/rata), ( n =30) (Luquín-S y col., 1993).
c) Grupo 3 (DHEA): ratas castradas con implante subcutáneo (sc) de un a cápsula
de silicona con dehidroepiandrosterona, (8 mg/rata), (n=30).
Divididos en subgrupos de 10, los animales fueron sometidos a tres distintas
situaciones durante 10 días:
· Control (C): condiciones estándar de mantenimiento y ruido nor mal del bioterio
(30-40 dB).
· Hacinamiento (H): alojamiento en 45 cm2/rata en condiciones estándar de bioterio.
· Ruido (R): sometidas a estrés por ruido con tonos de ultrafrecuencia de 22 kHz
(USVs) y 80-90 dB de intensidad durante 8 h diarias.
20
· Descripción de variables:
a) Independientes:
Condición estresante (Hacinamiento o ruido).
Tipo de neuroesteroide liberado desde el implante subcutáneo (progesterona ó
dehidroepiandrosterona).
b) Dependientes:
Conducta exploratoria y memoria espacial.
Citoarquitectura de células gliales en las zonas CA1, CA3 y DG del hipocampo de
la rata.
Tipo de estudio:
Experimental
Longitudinal con cortes transversos
Cuantitativo.
21
Criterios de inclusión:
1. Ratas macho Swiss-Wistar con 2 meses de edad y 250-280 g de peso.
2. Ratas que se recuperaron satisfactoriamente de los procedimientos quirúrgicos
durante los experimentos.
Criterios de exclusión:
1. Animales que resultaron lesionados y/o que se infecten durante los diferentes
procesos experimentales.
Criterios de eliminación:
1. Cerebros que no se fijaron adecuadamente durante la perfusión intravascular.
2. Animales en los que se observó alguna patología durante el proceso de
perfusión.
3. Animales en los que no se localizó la cápsula de silicona en el espacio
subcutáneo dorsal, para la liberación prolongada del vehículo o los esteroides.
22
MATERIALES Y METODOS
Descripcion general del estudio.
Se utilizaron 90 ratas machos adultos Swiss-Wistar jóvenes con peso corporal
inicial de 250-289 g, mantenidas con ciclos de luz y oscuridad de 12:12 h, a 22 ± 3 °C
de temperatura, humedad relativa del ambiente entre 50 y 55%; alimentadas “ad
libitum” con dieta balanceada para roedores (Ralston-Rations USA) y agua potable. Se
utilizaron ratas macho para controlar las variaciones en los niveles de esteroides
generados por el ciclo reproductivo de las hembras. Las ratas fueron castradas para
evitar la interferencia de los esteroides gonadales sobre el experimento, ya que
muchos de ellos tienen la misma vía metabólica y pueden variar los niveles generados
por el implante. Se dejaron pasar 21 días post-castración antes de iniciar el estudio.
Ese día 21 se recolectó la orina total de 6 PM a 8 PM, para determinar los valores
basales de corticosterona, progesterona y DHEA mediante cromatografía de líquidos
(HPLC) (Fig. 1 del diseño experimental).
La totalidad de animales fueron distribuidos en grupos: Implante vehículo
(n=30), 2) implante de progesterona (n=30), 3) implante con DHEA (n=30). El vehículo
de difusión de las hormonas fue aceite de sésamo. En este se diluyeron las hormonas
(8 mg/rata). La mezcla se depositó en el nterior de cápsulas permeables de silicona
implantadas subcutáneamente (Gómez-Pinedo U. y col., 2001). El procedimiento
quirúrgico de implantación de las cáp sulas de silicona con vehículo o cada uno de los
esteroides se realizó bajo anestesia ligera por inhalación con cloroformo, tratando de
provocar el estrés mínimo a los animales (Gómez-Pinedo U. y col., 2001).
Divididos en grupos de 10, los animales fueron sometidos a tres distintas situaciones
durante 10 días.
1) Control: 10 ratas de cada tipo de implante estuvieron sometidas a en
condiciones de alojamiento de 240cm2/rata y con el ruido ambiental del
bioterio.
23
2) Hacinamiento: 10 ratas de cada tipo de implante fueron alojadas en una
misma jaula con un espacio de 45 cm2/rata y bajo las mismas condiciones
estándar de bioterio.
3) Ruido: 10 ratas de cada tipo de implante fueron sometidas a 8 h diarias
durante 10 días, a tonos de ultrafrecuencia de 22 kHz (USVs) y 80-90 dB de
intensidad. Un día antes y durante todo el periodo de estrés por ruido
Se recolectó para todos los grupos orina cada 48 h para la determinación de la
concentración de corticosterona por HPLC y los mismos esteroides con el método de
Juricksay y Telegdyde (2000) ligeramente modificado, para luego iniciar los estudios de
comportamiento.
Se determinó la ansiedad (comportamientos de autoprotección), excitabilidad
(cambios en los umbrales de respuesta motora ante la estimulación novedosa) y
conducta exploratoria (frecuencia y patrones de exploración del ambiente novedoso)
mediante la prueba del campo de agujeros durante un día (Hole-Board). Al día
siguiente se iniciaron los ensayos para determinar el aprendizaje espacial y la
retención de memoria, que duró 2 días utilizando elparadigma del laberinto acuático
modificado de Morris (Morris, 1984).
Posteriormente, los animales fueron inyectados con una dosis intra-peritoneal
(ip) subletal de pentobarbital sódico, y se hizo perfusión intracardíaca con
paraformaldehído para fijar su cerebro. Para ello, se hizo pasar solución salina
lavadora para eliminar el exceso de sangre, seguida por solución de paraformaldehído
al 4%. Posteriormente se realizó una craneotomía, se extrajeron los cerebros y se
colocaron en la misma solución fijadora durante 24 h. Se seleccionó el área del
hipocampo útil para los estu dios de microscopía, de la cual se tomó una sección la
cual fue procesada mediante latécnica histológica convencional (deshidratación,
aclaración) hasta su inclusión enparafina, a fin de obtener cortes de 20 µm de espesor.
Los cortes fueron destinados al procedimiento inmunocitoquímico con anticuerpos
dirigidos para la identificación de astrocitos (anticuerpos anti-GFAP), análisis
histoquímico de la microglia utilizando is olectina-B4 de Griffonia simplicifolia.
24
Diseño experimental
Castración
21días
Implantes
(8 mg hormona/implante)
n=30 VEHI n=30 PROG n=30 DHEA
7 7 7
día día día
Condiciones durante 10 días.
RECOLECCIÓN 10 controln= 30 10 hacinamientoDE ORINA
10 ruido
-70ºC
Prueba del campo de agujeros
Prueba del laberinto acuático de Morris
Perfusión
Análisis por Análisis de Análisis decromatografía citoarquitectura citoarquitectura
de líquidos microglial astrocitaria
Figura 1. Diseño experimental en diagrama de flujo.
25
Procedimientos quirúrgicos:
1. Castración:
Los animales fueron anestesiados por vía ip con pentobarbital sódico a una dosis
de 50 mg/kg de peso y se colocaron en decúbito dors al, en la zona de los conductos
deferentes se hizo una incisión lineal de 1 cm en la piel del escroto de cada testículo,
que se expulsó de su bolsa escrotal para liberar el epidídimo; se localizó el paquete
vascular y mediante hemostasia por trombosis se desprendió cada testículo. La herida
se cerró con 2 puntos de seda trenzada 3-0.
2. Implante subcutáneo de cápsulas de silicona.
21 días después de la castración los animales fueron anestesiados por inhalación
de cloroformo. Se afeitó el dorso y a nivel del espacio interescápulo-vertebral se hizo
una incisión cutánea longitudinal de 1 cm y bajo di sección roma con pinzas de
mosquito largas, (mediante movimientos repetidos de apertura y cierre) se formó un
túnel subcutáneo en el cual se colocó una cápsula d e silicona conteniendo el vehículo
o cada uno de los neuroesteroides disueltos en aceite de sésamo. La herida quirúrgica
fue cerrada mediante dos puntos separado s con seda 3-0. Al término del periodo de
prueba los animales fueron sacrificados por perfusión, asegurando la localización e
integridad del implante.
Las cápsulas de silicona fueron elaboradas con un t ubo semipermeable de silicona
(Sani-Tech) de 1.8 cm de longitud, 3.12 mm de diámetro interno y 3.92 mm de
diámetro externo, y rellenados con acite de sesa mo más los 8mg del esteroide
correspondiente, los extremos fueron sellados con pegamento de silicona de grado
médico (Medical Adhesive 8919). Con el propósito deasegurar la rápida liberación de
los neuroesteroides las cápsulas fueron preincubada s a 37º C en solución salina al
0.9% (sigma S-9625) con 0.01% de albúmina sérica bovina para lograr la saturación de
las paredes y bajo agitación suave durante 12 h.
26
Cromatografía de líquidos.
La cuantificación de los neuroesteroides corticosterona, progesterona y DHEA
se realizó a partir de los valores resultantes de una curva de estandarización con
niveles conocidos de estas hormonas disueltas en metanol, mediante determinación
cromatográfica de sus tiempos de retención y el áre a bajo la curva de sus respectivos
picos. El análisis de correlación de las concentraciones del estándar y el área bajo la
curva de los picos arrojados por el cr omatógrafo, permitió la determinación de una
línea del mejor ajuste con una ecuación lineal cuyos valores de pendiente y cruce con
el eje de las ordenadas sirvieron para convertir los valores del área bajo la curva de los
picos de las muestras, en valores de concentración expresados en ng/l. El
procedimiento de extracción y medición de los esteroides para cuantificación de la
corticosterona en orina se llevó a cabo siguiendo el procedimiento descrito por
Juricksay y Telegdyde (2000) modificado de la siguiente manera: se hizo pasar 1 ml de
la orina a través de un cartucho de extracción C18 (Waters Assoc., Milford, MA USA)
para retener los esteroides, estos fueron eluidos, es decir, extraídos del cartucho en
viales de vidrio con tapa recubierta de teflón utilizando 5 ml de metanol, este fue
evaporado mediante una corriente de nitrógeno en baño de 40-45 ºC y se agregó
tampón acetato pH 4.6. Esta solución se incubó con 50 l de la enzima glucoronidasa
de Helix Pomatia (Merck KGsA, Darmstadt, Germany) a 37 ºC durante 48 h. Una vez
completada la incubación esta solución nuevamente se pasó a través de cartuchos de
extracción C18 y los esteroides fueron nuevamente eluídos con 5 ml de metanol. Por
último se concentró el volumen bajo corriente de nitrógeno hasta 100 l. De esta
muestra se extrajeron 10 l que se introdujeron automáticamente a través de una
microi nyección, en el cromatógrafo de líquidos.
Se corrieron las muestras en una columna no polar (Altech) CP SIL 5CB de
30mm x 0.32 x 0.25 m, para aminas, hidrocarburos, pesticidas, fenoles y compuestos
sulfurados. La temperatura fue de 30 ºC, El tiempo total del corrimiento fue de 35 min.
27
Comportamiento animal.
1. Actividad exploratoria en el campo de agujeros:
Para evaluar la actividad exploratoria de un animal en un ambiente novedoso,
así como la excitabilidad y ansiedad se utilizo el campo de agujeros, el cual es un cubo
hueco de acrílico negro de 60x60x60 cm. 5 cm por encima del piso de la caja está una
plataforma (tabla de agujeros) con 36 aguj eros de 3.5 cm de diámetro, repartidos en
una matriz de 6x6 (ver fig.2). La tabla de agujeros está dividida por una línea
imaginaria en una sección periférica (la línea de agujeros del perímetro de la tabla), y
una central de 4x4 agujeros. Para iniciar la prueba, el animal se puso en el centro de la
tabla de agujeros y durante 10 min. fue video-filmado su comportamiento, para
posteriormente registrar los siguientes parámetros a través del software del analizador
RatMove (patente en trámite ):
---Tiempo en que el animal permanece en el área cen tral o en el área periférica de la
tabla,
- Tiempo total de movimiento e inmovilidad,
- Número de agujeros centrales, periféricos y totales visitados,
- Frecuencia relativa de visitas (número de visit as por minuto de movimiento).
- Distancia recorrida
- Velocidad promedio de la distancia recorrida
28
Fig. No.2 Campo de agujeros (Hole Board).
Se consideró visitado un agujero cuando la rata introdujo su cabeza hasta que
la superficie de la tabla le ocultó los ojos (Lordi y col, 2000). Todos los sujetos
realizaron la prueba el mismo día entre las 9:00 y las 11:00 h.
2. Laberinto acuático de Morris:
Para medir la capacidad del individuo para modificar su comportamiento, a partir
de la experiencia con estímulos espaciales se uso el laberinto de Morris el cual
consiste de una piscina circular con 180 cm. de diá metro y paredes con 37 cm. de
altura pintada de negro y dividida en cuatro cuadrantes imaginarios, ésta se llenó con
agua (20 ± 3 ºC), hasta una altura de 25 cm. y en su interior fue sumergida una
plataforma de escape cilíndrica de color negro con 12.5 cm. de diámetro y 22 cm. de
29
altura (invisible para la rata) y esta tuvo una ubicación fija en uno de los cuadrantes
durante todo el experimento (Fig. 3). La tarea consistió en que la rata debía nadar en el
laberinto hasta localizar la plataforma, las primeras veces por accidente; sin embargo,
en las sesiones posteriores debía reconocer su sitio de ubicación para poder
localizarla, en este caso; con la ayuda de indicadores visuales, a manera de claves
espaciales externas. Las funciones cerebrales implicadas para ejecutar esta tarea
dependen básicamente de la actividad hipocamp al.
Para este estudio se siguió la metodología descrita por de Quervain, Roozendaal
y McGaugh (1998) con ligeras modificaciones. Los experimentos están basados en dos
tipos de ensayos; uno de entrenamiento y otro de prueba. El ensayo de entrenamiento
consistió en depositar la rata en el agua desde uno de los cuatro sitios de partida de la
periferia (uno por cada cuadrante) y esperar hasta un máximo de 60 s para que
encontrara la plataforma. El tiempo desde que la rata fue depositada en el agua hasta
que localizó la plataforma fue considerado como latencia de escape y su latencia
máxima fue de 60 s , si una vez completado este tiempo no localizaba la plataforma
oculta se le guió hasta ella y allí se le dejó permanecer durante 20 s. Enseguida la rata
fue retirada, secada y se le dejó permanecer en la caja con los otros animales durante
30 s, mientras empezaba el siguiente ensayo, y así sucesivamente; hasta completar 8
ensayos consecutivos para cada rata ese mismo día, distribuyendo de manera
balanceada los sitios de partida entre los cuatro cuadrantes, de manera que cada rata
inició su navegación dos veces desde cada cuadrante, sin seguir un patrón ordenado.
Además de la latencia de escape, durante el entrenamiento fue registrado el tiempo
que la rata navegó en el cuadrante donde se encuentra la plataforma, en el cuadrante
opuesto, su velocidad y la distancia recorrida.
Para el ensayo de prueba fue retirada la plataforma y se introdujo a cada sujeto
una vez en la piscina, en un cuadrante lateral (ni el de la plataforma, ni el opuesto). Se
le permitió nadar durante 60 s. y fue retirado del laberinto. Fue registrado el tiempo
que la rata permaneció navegando en el cuadrante donde estuvo
30
la plataforma y en el cuadrante opuesto, la distancia recorrida y la velocidad promedio,
así como las veces que cruzó el sitio donde se encontraba la plataforma. La prueba se
llevó a acabo 24 h después del último ensayo de entrenamiento, entre las 7:00-10:00
am., fue videofilmada y posteriormente calificada por el sowftware de RatMove.
Diámetro 180 cm.
Plataforma
de escape
Profundidad Nivel de agua 25 cm.
37 cm
I III
II IV
Fig. No.3. Laberinto Acuatico de Morris.
31
Histología del Hipocampo
Los animales fueron anestesiados mediante una dosis subletal ip de
pentobarbital sódico (50 mg/kg). Se les practicó toracotomía amplia para exponer el
corazón, a nivel torácico se pinzó la arteria aorta descendente y después de seccionar
la aurícula derecha, a través del ventrículo izquierdo, bajo presión de una columna de
120 cm3 de agua y a temperatura corporal (37°C) se hizo pas ar durante tres min. 150
ml de una solución de lavado compuesta por 0.9% de cloruro de sodio con 10,000 UI
de heparina y 1 gr de procaína/litro.
Después de hacer pasar la solución de lavado, el cerebro fue perfundido con
200 ml de una solución de paraformaldehído al 4% en amortiguador fosfato 0.1M pH
7.3. Posteriormente se realizó la craneotomía y el cerebro se postfijó en la misma
solución fijadora por 24 h a 4 °C. Los tejidos fuer on deshidratados en una serie de
alcoholes de concentración creciente y posteriormente fueron incluidos en parafina
para realizar cortes coronales de 20 m.
Análisis inmunocitoquímico para cuantificar proliferación microglial yastrocitaria.
A fin de analizar los efectos del estrés y los neuroesteroides, sobre la citoarquitectura
glial de las zonas CA1, DG y CA3 del hipocampo de la rata, se realizaron los
siguientes procedimientos:
De los cerebros parafinados, provenientes de ratas sacrificadas al finalizar la
prueba de retención de memoria (20 días después de colocar los implantes) fueron
obtenidos cortes coronales seriales de 20 µm de espesor del hipocampo dorsal
comprendidos entre 4.0 y 7.0 mm anterior a lambda (Paxinos y Watson, 1982).
Para la prueba inmunocitoquímica, todos los anticuerpos (ac) fueron disueltos
en una solución tampón de fosfato salino (PBS) 0.1 M pH 7.3 con 1% de albúmina
32
sérica bovina y 0.2% de Tritón X-100. Esta misma solución fue utilizada para todos los
lavados del tejido que se hicieron después de cada etapa de incubación.
1. Cuantificación de la microglia.
Para la identificación de la microglia se utilizó solectinaI-B4 (griffonia
simplicifolia) acoplada con peroxidasa, en dilución de 10x10-4 mg/ml, disuelta en PBS
(1:100). Se inactivaron las peroxidasas endógenas mediante incubación de los cortes
en 10% de metanol disuelto en PBS, con 0.3% de H2O2 durante 20 min a temperatura
ambiente, luego los tejidos fueron lavados mediante cambios con PBS (2x5 min). Después se incubaron durante 10 min en una solución tampón catiónica (cloruro de calcio 0.1 mM, cloruro de magnesio 0.1 mM y cloruro de manganeso 0.1 mM). Los
tejidos fueron incubados con la isolectina-B4 durante 18-20 h a 4 ºC con movimientos
suaves y en la oscuridad. Al finalizar la incubación las preparaciones fueron lavadas en PBS (3x15 min). El revelado de la reacción se hizo mediante ncubación de los cortes
en una solución compuesta por 0.03% de 3´3-diaminobencidin (DAB), 0.1% de H2O2, y
sulfato de níquel al 1% durante 10-15 min para formar un precipitado visible de color purpura.
2. Análisis de la astrogliosis.
Para el marcaje de la proteína acídica fibrilar glial (GFAP), presente en los
astrocitos y que por lo tanto permite observarlos, el ac primario fue policlonal generado
en conejo contra GFAP de bovino (inmunógeno) en dilución 1:800, la incubación se
realizó durante una noche a 4°C, el ac secundario (ac de enlace) fueron IgG generadas
en cerdo contra IgG de conejo en dilución 1:250 y la incubación fue durante 2 h a
temperatura ambiente. Los tejidos luego fueron incubados en el complejo PAP de
conejo en dilución 1:250 durante 1.5 a 2 h a temperatura ambiente y en la oscuridad. El
producto de la reacción tisular se reveló con una solución de DAB-H2O2 al 0.07% y
0.1% respectivamente, durante 10-15 min (coloración marrón).
33
Durante el estudio, los cortes de tejido fueron montados sobre portaobjetos y se
cubrieron con una película de “parafilm” para formar un lecho capilar que distribuya
uniformemente la solución y evite la evaporación. Finalmente los cortes se
deshidrataron en series crecientes de alcohol y se montaron con Entellan (Merck) para
su análisis con microscopía de luz.
1 Análisis de la reactividad glial.
1. Cuantificación estereológica de la población gli al.
Para la cuantificación del número de células gliales en las estructuras
hipocampales se utilizó el método del fraccionador óptico modificado de West, (1999).
El conteo fue ejecutado en uno sólo de los hemisferios del hipocampo. Cada 40 cortes
(factor 1 = número de cortes entre muestr eo f1=40). Se muestrearon campos de
observación con un área de 61900 m² (área de campo) en el analizador óptico Leica
Q5001W (Leica Imaging Systems, Ltd. Cambridge, UK) conectado al microscopio de
luz. De esta área se contaron las cé lulas de un área de 22500 m² (área de conteo).
Cada área de campo inicial fue al eatoriamente seleccionada y el tamaño del
desplazamiento de un área de campo a otra se determinó por movimientos de x=150
m, y=150 m. La fracción contabilizada será entonces un factor f2 = área de campo/área de conteo.También es necesario tener en cuenta la altura del disector del
microscopio hdis = 15m para obtener un tercer factor f3 = ancho del corte/hdis. Se
obtuvo entonces la sumatoria de células contadas ΣC, y se multiplicó por los tres
factores fraccionados f1, f2 y f3 (Ntotal= ΣC f1 f2 f3) para obtener el número estimado de
células por área en uno de los h emisferios.
2. Análisis de transformación citoplasmática astrocitaria.
Se analizaron 400 células por área cerebral para c ada grupo con ayuda de
una rejilla estereológica según el método de conteo puntual de Weibel (1979).
34
Dibujada en el analizador de imágenes, la rejilla c onsistió en cinco círculos
concéntricos con 90 m de separación entre ellos. Se fijó el núcleo de la célula en el
centro de los anillos, y se contaron los cruces que sus prolongaciones (en un solo
plano de foco) tengan con los anillos, en la medida en que sean continuas (Fig. 4).
Cuando la prolongación citoplasmática se interrumpe, se realiza el conteo hasta dicha
interrupción.
Fig. No. 4. Método de conteo puntual de Weibel (Rejilla de Weibel).
35
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados obtenidos de las diferentes técnicas cuantitativas fueron
analizados con la prueba estadística de ANOVA de doble vía para comparar todos los
grupos entre sí, seguida de la prueba de Tukey para las comparaciones post-hoc de
los valores de medias, con un nivel de confianza de p<0.05 para definir como
significativas las diferencias. Adicionalmente, aquellas variables dependientes que
mostraron una interacción significativa entre los factores analizados, fueron sometidas
a pruebas t de Student entre pares de medias para analizar más específicamente los
cambios significativos. Dado el alto número de combinacione s de parejas entre
grupos para las comparaciones t post-hoc, se tomó como nivel de significancia un
p<0.01 para esta última prueba.
36
RESULTADOS
Liberación de las hormonas en los implantes
La liberación de las hormonas contenidas en los implantes subcutáneos fue
determinada a través de cromatografía líquida de alta precisión (HPLC) para
progesterona (PROG) y dehidroepiandrosterona (DHEA) en muestras de orina
recolectadas cada 24 h durante 10 días (Fig. 5). Los resultados de PROG indican que
hubo una liberación constante y estable de la hormona a niveles muy superiores
comparada con los niveles de grupos con implante DHEA o vehículo (VEHI) (Ver gráf.
1A). El análisis estadístico mostró un fuerte impacto del factor Implante p=0.000 y el
factor de grupo p=0.000, (p≤0.001), el cual no fue observado para la interacción
(p=0.002). De manera similar, la cuantificación de DHEA arrojó niveles muy superiores
de esta hormona en los grupos implantados con la misma, en comparación con los
grupos implantados con PROG o VEHI (gráf. 1B). Igualmente, la significancia del
impacto del factor implante fue bastante alta p=0.000 y el factor grupo p=0.000 y la
interacción no tuvo impacto significativo p=0.002 (p≤0.001).
Figura 5. Recolección de la muestra urinaria
37
A PROGESTERO NA .CP Implante = 0.000HP
Grupo = 0.000RP
500 Vehiculo Interacción= 0.002
400
Urin
aria
300de
Pro
gest
eron
a
200
ng/u
l
100
0
0 2 4 6 8 10
Tiempo (días)
B VEHIDHEA
Implante = 0.000CID Grupo = 0.000
500 HID Interacción= 0.002RID
400
Urin
aria 300
200
DH
EA
ng/u
l de 100
0
-100
0 2 4 6 8 10
Tiempo (días)
Gráfica No.1. Niveles urinarios de hormonas de losimplantes utilizados, a lo largo de los días de estrés. El eje Y indica los niveles urinarios de la hormona en ng/ul, y el eje X los días durante los cuales se llevó a cabo la exposición al estrés. Los resultados indican niveles estables de liberación de PROG (A) y DHEA (B), significativamen te superiores en comparación con los grupos con implantes vehículo quienes mostraron cantidades insignificantes de la hormona respectiva. Los nombres de los grupos están abreviados según e l tipo de condición estresante y el tipo de implante*. Las barras indican el intervalo de confianza del 99%.
* CIV: Control Implante Vehículo; CIP: Control Implante Progesterona; CID: Control Implante DHEA; HIV: Hacinamiento Implante Vehículo; HIP: Hacinamiento Implante Progesterona; HID: Hacinamiento Implante DHEA; RIV: Ruido Implante Vehículo; RIP: Ruido Implante Progesterona; RID: Ruido Implante DHEA.
38
Cuantificación de los niveles de corticosterona uri narios.
La corticosterona (CORT) urinaria fue cuantificada con HPLC para evidenciar
los niveles de estrés de cada uno de los grupos. El factor de grupo mostró un impacto
significativo p=0.000 (p≤0.001) en todos los días de estrés, lo cual demuestra la
efectividad de los estímulos estresantes. En los grupos control no se dieron diferencias
significativas entre los diferentes tipos de implante, p=0.999 lo cual indica que los
grupos sin estrés mantuvieron niveles basales de CORT independientemente del tipo
de implante subcutáneo utilizado en ellos (gráfica 2A). En contraste, en los grupos de
hacinamiento fue posible observar como el grupo VEHI mostró un incremento de los
niveles de CORT en los días 8 y 10 que fue prevenido por los implantes hormonales en
los otros dos grupos PROG y DHEA, los cuales mantuvieron niveles basales de CORT
(gráf. 2 B y 2C). En el análisis estadístico se observó que los niveles de CORT fueron
significativamente superiores en el grupo de hacinamiento con implante VEHI en
comparación con PROG y DHEA, y significativamente superiores que los grupos
control en los días 8 y 10 (p≤0.001).
A Control500
CIVCIP
ng/u
l 400 CID
Urin
aria
300
Cor
ticos
tero
na
200
100
0
0 2 4 6 8 10Tiempo (días)
Gráfica No. 2A. Niveles urinarios de CORT a lo largo de los días de estrés. Los grupos control
(grupos no estresados) no mostraron diferencias significativas en sus niveles de CORT a pesar
de los diferentes implantes. El eje Y muestra los niveles de CORT urinaria expresados en ng/ul, y el
eje X los días durante los cuales se llevó a cabo la exposición al estrés.
39
B Hacinamiento500
HIV
ng/u
l 400HIPHID
Urin
aria
300* *
Cor
ticos
tero
na
200
100
0
0 2 4 6 8 10Dias
Gráfica No. 2B. Niveles urinarios de CORT a lo largo de los días de estrés en los grupos de
hacinamiento. Se observan niveles basales de CORT en grupos implantados con PROG y DHEA
en comparación con el grupo implantado con VEH I, en el cual el hacinamiento generó un
incremento significativo de CORT a partir del día 8. El eje Y muestra los niveles de CORT urinaria
expresados en ng/ul, y el eje X los días durante los cuales se llevó a cabo la exposición al estrés .
C Ruido500 RIV *
RIPRID
ng/u
l 400 * *
Urin
aria
300 **
Cor
ticos
tero
na
200
100
0
0 2 4 6 8 10Dias
Gráfica No. 2C. Niveles urinarios de CORT a lo largo de los días de estrés en los grupos sometidos a ruido. El grupo implantado con VEHI mostró un incremento inmediato de los niveles de CORT que se mantuvo constante. En contraste, para los grupos implantados con PROG y DHEA se observó un retardo en dicho incremen to y una disminución de los niveles de CORT hacia el final del periodo de estrés. El eje Y muestra los niveles de CORT urinaria expresados en ng/ul, y el eje X los días durante los cuales se llevó a cabo la exposición al estrés.Las barras indican el intervalo de confianza del 95%.
CIV: Control Implante Vehículo; CIP: Control Implante Progesterona; CID: Control Implante DHEA; HIV: Hacinamiento
Implante Vehículo; HIP: Hacinamiento Implante Progesterona; HID: Hacinamiento Implante DHEA; RIV: Ruido Implante
Vehículo; RIP: Ruido Implante Progesterona; RID: Ruido Implante DHEA.
40
De manera similar, de acuerdo al análisis post-hoc para el factor de implante, en
los grupos de ruido se observó un incremento de CORT en el grupo VEHI en
comparación con los grupos con hormonas PROG y DHEA los días 0 y 10 (p≤0.001).
Esto indica que los implantes hormonales retrasaron el incremento de CORT, que se
produjo a partir del día 2, y que redujeron los niveles del glucocorticoide hacia el final
del periodo de estrés en el día 10. El mismo anális is para el factor de grupo, mostró
que estos niveles de CORT eran significativamente superiores para los grupos de ruido
comparación con los grupos controles los días 4, 6 y 8 (p≤0.001), y en comparación
con los grupos de hacinamiento los días 2, 4 y 6 (p≤0.001).
Laberinto Acuático de Morris.
Con esta prueba se evaluaron las habilidades en el comportamiento de las ratas
con respecto al aprendizaje espacial durante la fase de entrenamiento y la memoria
espacial, es decir su capacidad para retener el aprendizaje, durante la fase de prueba.
El entrenamiento
Durante la fase de entrenamiento de todos los grupos independientemente del
tipo de implante y la condición estresante a la que fueron sometidos, mostraron una
ejecución similar en la que se observaron curvas de aprendizaje apropiadas para el
desempeño de la prueba en cuanto a su latencia de escape, tiempo de nado en el
cuadrante de la plataforma y en el cuadrante opuesto. No se encontraron diferencias
significativas en cuanto a las medidas de distancia recorrida y velocidad promedio. La
ausencia de impacto de los factores de grupo e implante, así como de la interacción
entre los mismos, sugiere que las condiciones estresantes y los implantes no tuvieron
un efecto importante sobre el aprendizaje espacial.
41
La prueba
En la fase de prueba, se encontraron efectos importantes del factor de implante
y de la interacción de ambos factores (Gráfica 3). La prueba post-hoc mostró que en
términos generales el efecto del factor implante es atribuible a que los grupos con
progesterona tuvieron medias significativamente superiores a VEHI (p≤0.001) y DHEA
(p≤0.001). Las comparaciones directas entre los grupos independientes efectuadas a
través de la prueba t mostraron que los grupos con implante VEHI expuestos a
hacinamiento y ruido, tuvieron un decremento en su capacidad de consolidación de
memoria espacial en situaciones de estrés, en comparación con los individuos del
grupo control (p≤0.001), evidenciada por una menor cantidad de cruces con el área
donde se encon traba la plataforma durante el entrenamiento. Sin embargo, los grupos
con PROG en las mismas situaciones de estrés, mantuvieron un puntaje de cruces con
la plataforma similar al del control, que fue significativamente superior al de los grupos
con el mismo tipo de estrés pero con implante VEHI. Esto sugiere un efecto protector
de PROG sobre las alteraciones de la memoria espacial que puede producir el estrés,
ya que además no se observaron efectos de PROG sobre el grupo control en
comparación con VEHI.
Los grupos estresados expuestos a DHEA por el contrario, mostraron puntajes
similares a los de VEHI, es decir, que la hormona no tuvo un efecto sobre su
capacidad para recordar la ubicación de la plataforma; pero además, la DHEA
disminuyó esta habilidad en los sujetos en condiciones de control, es decir que por si
sola tuvo un efecto inhibitorio sobre la memoria espacial (gráf. 3).
42
Prueba de MorrisCruces con la plataforma
3,0Control Grupo p=0.002Hacinamiento Implante p=0.000Ruido Interacción p=0.001
2,5
* *
2,0
Frec
uenc
ia * *
1,5 * *
1,0*
*0,5 *
0,0
VEHI PROG DHEA
Gráfica 3. Frecuencia de cruces con el área de la plataforma durante la fase de prueba delLaberinto Acuático de Morris.El estrés deterioró la ejecución de los grupos H y R con implante VEHI. Esta situación fue impedida con el implante P ROG, que mejoró la ejecución en las situaciones de estrés sin afectar la del grupo control. DHEA disminuyó los puntajes basales del grupo control y no mostró efectos sobre los grupos estresados en comparación con VEHI. El eje Y muestra la frecuencia absoluta de ocasiones en las que durante la fase de prueba, las ratas pasaron por el lugar donde previamente se encontraba la plataforma. El eje X muestra los grupos sometidos a distintos tipos de estrés e implantes hormonales. Las barras señalan el error estándar.
Campo de agujeros.
Los puntajes que evalúan excitabilidad (tiempo de m ovilidad e inmovilidad) no
mostraron diferencias entre los tipos de estrés o de implante, al igual que la distancia
recorrida y la velocidad promedio. Sin embargo, si se observaron alteraciones en los
niveles de ansiedad en cuanto al tiempo en la zona central y en los patrones de
exploración medidos con las visitas totales.
43
Para su protección, los roedores tienen la tendencia a permanecer en la
periferia y salir poco hacia el centro de los espacios que exploran, de manera que el
tiempo en áreas centrales es considerado un indicad or de ansiedad ya que los
animales tranquilos tienden a explorar más estos es pacios.
Los resultados indican que las situaciones de estrés tuvieron poco o ningún
efecto sobre el tiempo que los grupos pasaron en el área central (gráf. 4), como se
puede inferir por el bajo impacto del factor de grupo. Por otra parte el factor implante
tuvo un impacto significativo (p=0.016) para el cual, el análisis post-hoc mostró que
DHEA tuvo tiempos significativamente superiores a progesterona y control (p<0.001).
Esto indica que los implantes DHEA generaron probablemente un estado ansiolítico lo
suficientemente potente como para permitir a los sujetos un mayor tiempo de recorrido
en el área central en comparación con aquellos con implante VEHI y PROG.
Hole BoardTiempo en zona central
160Control Grupo: p= 0.196Hacinamiento Implante: p= 0.016
Interacción: p= 0.682Ruido140
120 *
Seg
undo
s
100
80
60
40
20
0VEHI PROG DHEA
Gráfica No. 4. Tiempo que pasaron las ratas en la z ona central de la tabla de agujeros. Las situaciones de estrés no mostraron un efecto importante sobre la ansiedad evaluada por el tiempo de estancia de las ratas en la zona central. Sin embargo, para el factor implante, los grupos con PROG mostraron niveles similares a los VEHI, mientras que aquellos con DHEA mostraron menores niveles de ansiedad al recorrer por más tiempo el centro de la tabla. El eje Y muestra el tiempo en segundos que las ratas pasaron el área central. El eje X muestra los grupos sometidos a distintos tipos de estrés e implantes hormonales.Las barras muestran el error estándar.
44
En cuanto a los patrones de exploración, cada uno de los factores por separado
no tuvo un impacto significativo, sin embargo se pudo observar en la interacción una
significancia limítrofe (p=0.069) (gráf. 5). El post-hoc con la prueba t, mostró que el
ruido, pero no el hacinamiento en la condición VEHI, incrementó el número de visitas
totales en comparación con el control. Este incremento fue disminuido de manera
limítrofe (p=0.055) por PROG y de manera significativa (p0.01) por DHEA.
Hole BoardVisitas totales
60 Control Grupo: p= 0.650Implante: p= 0.467
Hacinamiento Interacción: p= 0.069Ruido
50
40
Frec
uenc
ia
30
20
10
0VEHI PROG DHEA
Gráfica No. 5. Frecuencia de visitas totales en la Tabla de Agujeros. Las situaciones de estrés
mostraron una tendencia al incremento de las visitas totales en los grupos con VEHI,
especialmente para ruido. Esta tendencia se vio inhibida por DHEA y probablemente por PROG.
El eje Y muestra la frecuencia absoluta de visitas totales, mientras que el eje X muestra los grupos
sometidos a distintos tipos de estrés e implantes hormonales.Las barras indican el error estándar.
45
Análisis celular
Población astrocitaria
El número de astrocitos inmunorreactivos para GFAP fue registrado con el
método del fraccionador óptico (West, 1999) en el hipocampo Zonas CA1, CA3 y DG.
El efecto más obvio es la reducción del número de a strocitos inmunrreactivos a
anti-GFAP en los grupos implantados con DHEA en todas las áreas analizadas (gráf.
6A), y por este motivo el efecto del factor implante fue significativo en cada una de
ellas (p≤0.001). Adicionalmente, CA3 (p≤0.001) y GD (p≤0.05) mostraron un impacto
significativo del factor grupo (gráf. 6B y 6C), pero solo CA3 tuvo una interacción
importante entre los dos factores (p≤0.001). La prueba de Tukey para el CA3, señaló
que la influencia del factor grupo estaba determinada por una disminución en el
número de células inmunorreactivas (fig 6) en los grupos de hacinamiento (p≤0.05) y
ruido (p≤0.001). En los sujetos con implantes de VEHI, (fig. 7) los cambios generados
por las condiciones de estrés por hacinamiento mostraron una disminución en el
número de células microgliales.
46
Población Astrocitaria en Zona de CA1 del hipocampo
400 Control
Hacinamiento Grupo p = 0.889Ruido Implante p = 0.000
Interacción p = 0.762
300*
c é l u l a s
200
N o . d e
100
** ** **
0
VEHI PROG DHEA
Población Astrocitaria en Zona CA3 del Hipocampo
400 Control Grupo p = 0.000Hacinamiento Implante p = 0.000Ruido Interacción p = 0.000
300* ***
c é l u l a
200
N o . d e
100
** ** **
0
VEHI PROG DHEA
Población Astrocitaria en Zona GD del Hipocampo
Control
Hacinamiento140 Ruido Grupo p = 0.025
**Implante p = 0.000
120*
Interacción p = 0.151
100
lula
s
80
. de
cé
60
N o
40
20 ** ** **
0
VEHI PROG DHEA
Gráfica No. 6. Total de astrocitos estimados por
hemisferio con el método del fraccionador óptico. El
eje Y muestra la frecuencia absoluta de células
contabilizadas, mientras que el eje X muestra los
grupos sometidos a distintos tipos de estrés e
implantes hormonales. En todas las áreas analizadas se observó una fuerte reducción del número de células inmunorreactivas para GFAP con el implante de DHEA. A: en CA1 sólo el factor implante tuvo un efecto importante debido a la reducción en DHEA. B: en CA3 el factor grupo señala una reducción del número de astrocitos en los grupos estresados, específicamente para hacinamiento en la condición VEHI, sin embargo en la condición DHEA, ambos grupos estresados manifestaron esta reducción. C:
en DG tal disminución se presentó exclusivamente
mpara el estrés por hacinamiento. Las barras indican el
error estándar.
47
A B
Figura No. 6.
A) Implante PROG Grupo Control (40X). Zona CA3 del Hipocampo.
B) Implante PROG Grupo Hacinamiento (40X) Zona CA3 del Hipocampo. Mostró Cuna reducción en la población astrocitariacomparada con el grupo control y el grupode ruido.
C) Implante PROG Grupo Ruido (40X).Zona CA3 del Hipocampo. Mostró unareducción astrocitaria en comparación conel grupo control.
48
20 µm 20 µm
**
* **
***
* * * *
**
**
**
** A B
Figura 7. Imágenes de microscopia de luz para recue nto de la población microglial.
La imagen muestra el número celular por campo en un aumento de 20x en cortes coronales de
20 µm. El * corresponde a la densidad poblacional. A) Se muestra un corte coronal del grupo
control con implante de VEHI en la zona CA1 del hipocampo, el cual presenta un número
abundante de células de microglia con grandes prolongaciones citoplasmáticas, esta
morfología es indicativa de que las células se encontraban en reposo. B) Se muestra la zona
CA1 del hipocampo del grupo de animales estresados por hacinamiento, e implantados con
aceite de sésamo contenido en la cápsula de silicon a (VEHI) resultó un número disminuido de
células de microglia con pocas prolongaciones citoplasmáticas, -morfología indicativa de que
las células sufrieron un proceso de desramificación por haberse activado.
49
La Transformación Astrocitaria
La transformación astrocitaria fue evaluada mediante el conteo del total de
cruces de las prolongaciones continuas de los astrocitos con los círculos concéntricos
de la rejilla de Método de Conteo Puntual de Weibel, en las mismas estructuras
cerebrales.
*Los resultados muestran una tendencia común en la q ue ambos factores,
grupo e implante, así como la interacción entre ambos, mostraron un impacto
significativo (p≤0.001) en cada una de las áreas analizadas (gráf. 7 ).
En términos generales lo que puede observarse del impacto de ambos factores
y la interacción, es una tendencia generalizada para las tres áreas analizadas en la
que DHEA produjo una disminución de la reactividad astrocitaria en todas las
condiciones experimentales de estrés (p≤0.001), pero especialmente en la condición
de ruido. Por su parte, la progesterona no tuvo un efecto significativo sobre la
reactividad de los astrocitos expuestos a situaciones de estrés, sin embargo
decrementó de manera importante la misma variable en el grupo control, dejándolo a
la par con el nivel de los grupos estresados (p≤0.001).
50
A Transformación Astrocitaria en
Zona CA1del Hipocampo
8 ControlHacinamiento Grupo = 0.000 7
Implante = 0.000Ruido Interacción=0.000
6
6
Inte
rsec
cion
es * 5* *
44
3
de *
No.
22
****1
0 0
Vehículo PROG DHEA
B Transformación Astrocitaria enZona CA3 del Hipocampo
ControlGrupo = 0.000
Hacinamiento Implante = 0.000
Ruido Interacción=0.000
* * *
*
**
**
Vehículo PROG DHEA
C Transformación Astrocitaria enZona DG del Hipocampo.
8 Control Grupo = 0.000Hacinamiento Implante = 0.000Ruido Interacción= 0.000
inte
rsec
cion
es
6
* *
4
*
No.
de
2**
**
0
Vehículo PROG DHEA
Gráfica No. 7. Transformación de las
prolongaciones astrocitarias. El eje Y muestra la
media de la frecuencia de cruces con los círculos
concéntricos de la rejilla de Webel por célula,
mientras que el eje X muestra los grupos
sometidos a distintos tipos de estrés e implante
hormonal. Se observa una influencia significativa de los factores de grupo e implante, así como de la interacción entre ambos. La DHEA disminuyó las prolongaciones astrocitarias en todas las áreas analizadas, mientras que la progesterona las redujo en la situación control y no tuvo efecto en las situaciones de estrés. Las barras indican el error
estándar.
51
Población microglial
El número de células de microglia inmunorreactivas para anti-Isolectina B4
también fue contado con el método del fraccionador óptico (West, 1999) en el
hipocampo (CA1, CA3 y DG).
Los resultados mostraron que las células de microglia en aquellos grupos
implantados con DHEA tuvieron una inhibición en el metabolismo de las
glucoproteinas que pertenecen al glucocalix de la menbrana de las celulas microgliales
lo que no nos permite tener una inmunorreactividad para anti-Isolectina B4, por lo cual
no fue posible observalas en los cortes de los cerebros en los grupos implantados con
DHEA y por ello no se indican en las gráficas ni se incluyeron en el análisis estadístico,
pues sesgarían fuertemente el peso del factor implante.
Para el resto de los sujetos, el factor de grupo tuvo un efecto significativo en
todas las zonas analizadas, ya que los sujetos sometidos a estrés por hacinamiento
mostraron una reducción en el número de células de microglia inmunorreactivas.
Según el análisis post-hoc, esta tendencia fue esta dísticamente significativa para
todas las zonas (p≤0.05) en el caso del estrés por hacinamiento, pero no en el caso de
ruido, con excepción de DG en donde el grupo de ruido también sufrió un decremento
significativo (p≤0.05) (gráf. 8), (fig. 8).
Por su parte, el factor de implante, solo tuvo una influencia limítrofe en CA1
(p=0.067), lo cual se deriva de un incremento en la cantidad de células observadas en
los grupos con progesterona al compararlos con los grupos vehículo. Sin embargo, en
las demás áreas (CA3 y DG) este efecto no fue estadísticamente significativo. La
influencia principal de este fenómeno parece obedecer al incremento de la reactividad
celular del grupo control bajo el implante de progesterona. Ninguna de las áreas
analizadas tuvo una interacción signif icativa entre factores, aunque CA1 tuvo un nivel
limítrofe (p=0.079).
En términos generales lo que puede observarse es una tendencia al
decremento de la reactividad astrocitaria bajo la condición VEHI para el grupo de
52
hacinamiento, pero no para el de ruido (con excepción del DG). Esta relación entre las
diferentes condiciones de estrés parece mantenerse en los grupos con PROG, pero en
niveles más altos, sobre todo para el grupo control.
Población Microglial en Zona CA1del Hipocampo
18
* Grupo p = 0.004Control
16Implante p = 0.067
Hacinamiento Interacción p = 0.079Ruido
14
de c
élul
as
12
10 **
8
N o
.
6 *
4
2**
0
VEHI PROG
Población Microglial en Zona CA3 del Hipocampo
18Control
*Grupo p = 0.023
16 Hacinamiento Implante p = 0.602Ruido Interacción p = 0.400
14
de c
élul
as
12
10 **
8N
o .
6 **
4 *
2
0
VEHI PROG
Población Microglíal en Zona DG del Hipocampo
8Grupo p = 0.016ControlImplante p = 0.395Hacinamiento Interacción p= 0.277
Ruido
6
célu
las
4**
No.
de
**
2
**
0
VEHI PROG
Gráfica No. 8. Total de microglia estimada por
hemisferio. El eje Y muestra la frecuencia absoluta
de células contabilizadas, mientras que el eje X
muestra los grupos sometidos a distintos tipos de
estrés e implante hormonal. Se observa una tendencia generalizada en la que para el factor de grupo, la condición de hacinamiento decrementó de manera significativa el número de células contabilizadas. Por su parte el impacto del factor implante se debe en su mayor parte al incremento que produjo PROG sobre las células contabilizadas en el grupo control en comparación con VEHI . Las barras
indican el error estándar.
53
A B
CFigura 8.Población Microglial en Zona DG del Hipocampo.A) Grupo Control Implante Vehículo (40X). Zona DG del Hipocampo. Ratas no estresadas.
B) Grupo Control Hacinamiento (40X). Zona DG del Hipocampo. El factor Hacinamiento disminuyó la población microglial.
C) Grupo Control Ruido (40X). Zona DG del Hipocampo. El factor Ruido ocasiona una reducción muy importante en la población microglial.
54
Transformación microglial
La transformación microglial fue evaluada mediante el conteo del total de cruces
de las prolongaciones continuas de la microglia con los círculos concéntricos de la
rejilla de Método de Conteo Puntual de Weibel, en las mismas estructuras cerebrales.
Puede observarse en la gráfica 9 que todas las estr ucturas evaluadas
mostraron un impacto significativo del factor grupo. En términos generales las
condiciones estresantes mostraron una reducción significativa (p≤0.001) en la
transformación microglial comparadas con el control, de manera que la inhibición fue
más pronunciada en el grupo de hacinamiento que en el grupo de ruido en todas las
áreas (p ≤0.001). El factor implante sólo tuvo una influencia importante en CA3 y en
DG y de manera general esto parece deberse al incremento en la transformación
microglial mostrado por el grupo control bajo la influencia del implante VEHI.
En todas las estructuras cerebrales analizadas la interacción entre los dos
factores resultó significativa, lo cual permitió el análisis t de pares específicos de
grupos. De esta manera pudo observarse que el las condiciones estresantes generaron
una reducción de la transformación microglial en comparación con el grupo control bajo
la influencia del implante VEHI. Este efecto fue observado de manera significativa en
todas las áreas del hipocam po para la condición de hacinamiento, pero únicamente en
CA1 para la condic ión de ruido. Por su parte los grupos estresados implantados con
progesterona, tuvieron también una reducción significativa en comparación con su
propio control PROG, similar a la reducción observada para los grupos estresados en
la condición VEHI. El impacto más importante bajo la influencia de la progesterona fue
el incremento de la transformación microglial en la condición control para todas las
áreas (ver fig. 9).
55
A Transformación Microglial enZona CA1del Hipocampo
16 Control Grupo: p= 0.000Hacinamiento Implante: p= 0.107
14 Ruido Interacción: p=0.004
de In
tera
ccio
nes
12
10 * *
8 * *
6
No.
4
2
0
VEHI PROG
B Transformación Microglial enZona CA3 del Hipocampo
16Control
Grupo: p= 0.000Implante: p= 0.027
Hacinamiento14
Interacción: p=0.000Ruido
mic
rogl
ia 12
10*
de
8 *
Inte
rsec
ción *
6
4
2
0
VEHI PROG
C Transformación Microglial enZona DG del Hipocampo
16Control
Grupo: p= 0.000Implante: p= 0.017
14Hacinamiento Interacción: p=0.000Ruido
de m
icro
glia 12
10
8 * *
Inte
rsec
ción
6
4
2
0
VEHI PROG
Gráfica No. 9. Transformación de las
prolongaciones microgliales. El eje Y muestra la
media de la frecuencia de cruces con los círculos
concéntricos de la rejilla de Webel por célula,
mientras que el eje X muestra los grupos
sometidos a distintos tipos de estrés e implante
hormonal. Se observa una reducción de la
transformación en todas las áreas en los grupos estresados bajo la influencia del implante VEHI y PROG, especialmente en la condición de hacinamiento. Además, la PROG incrementó de manera significativa la transformación microglial exclusivamente en ausencia de estrés, en todas las áreas analizadas. Las barras indican el error estándar.
56
A B
Figura 9.CTransformación Microglial en Zona CA1
del Hipocampo.A) Grupo Control Implante Progesterona(100X). Zona CA1 del Hipocampo. ElImplantedePROG aumentalatransformación microglial.
B) Grupo Hacinamiento Implante Progesterona (100X). Zona CA1 del Hipocampo. El Hacinamiento disminuyó la transformación microglial.
C) Grupo Ruido Implante Progesterona (100X). Zona CA1 del Hipocampo. El Ruido disminuyó la transformación microglial .
57
DISCUSIÓN
Liberación desde los implantes.
Los implantes hormonales utilizados produjeron un grado de liberación
constante y suprafisiológico a través del experimento (aproximadamente entre 300 y
400 ng/ul de orina). Así mismo, el grado de liberación fue casi el mismo para los dos
tipos de implante, lo cual apoya la confiabilidad del método.Los niveles de cada
implante, al parecer no se vieron afectados en gran medida por las condiciones de
estrés, ya que no hubo diferencias importantes en los niveles de liberación de las dos
hormonas ante hacinamiento y ruido. Esto podría indicar que las condiciones
estresantes no tuvieron un impacto importante sobre los niveles urinarios de los
neuroesteroides, sin embargo, dado que el grado de liberación fue claramente
suprafisiológico, es posible que la influencia del incremento de CORT generado por la
respuesta biológica de estrés no alcance la potencia necesaria para modificar la dosis
generada por los implantes.
Intensidad del estrés.
Tal como se había reportado previamente en otros estudios similares con ruido
por USVs (Commissaris y cols., 2000) y hacinamiento en ratas (Csermely y cols.,
1995), las condiciones experimentales generaron una respuesta de estrés, aunque en
este trabajo estuvo medido por una clara elevación de los niveles de CORT, y se
produjo en un tiempo mucho más corto, qu e siguió diferente curso temporal,
dependiente de cada situación experimental. Por esta razón se puede afirmar que el
modelo de estrés social seleccionado para este estudio fue el adecuado para alcanzar
los fines propuestos; inducir la elevación moderada, -pero sostenida de CORT, para
analizar los efectos de este incremento sobre la integridad celular del hipocampo y su
manifestación sobre habilidades cognoscitivas. La cuantificación de este parámetro
permitió comprobar la validez de las condiciones estresantes creadas artificialmente y
constituyó un indicador confiable de la potencia
58
del estrés y de la activación del eje HPA al igual que en otros estudios (Bhatnagar y
Vining, 2003).
En la situación de control, puede observarse que en ausencia de estrés, no
hubo cambios importantes en los niveles de CORT para cualquiera de los tipos de
implante. Esto significa que PROG y DHEA no tuvieron un efecto importante sobre los
niveles basales de CORT, y que las condiciones de alojamiento se relacionaron con
niveles normales de activación del eje HPA. Esta diferencia puede estar relacionada
con el hecho de que los efectos antiglucocorticoides de estos neuroesteroides se
encuentran relacionados con la modulación de receptores gabaérgicos, los cuales se
ven especialmente afectados ante el incremento de glucocorticoides y la activación de
receptores tipo II (Higashi y col., 2005).
En los animales sometidos al hacinamiento se produjo un incremento lento y
paulatino de los niveles de CORT de aquellos con implante VEHI, de manera que en el
octavo día de estrés, mostraron una elevación significativa con respecto a los controles sin
estrés y a los animales hacinados bajo la influencia de PROG y DHEA. Esto sugiere que
los dos neuroesteroides, ejercieron un rol inhibitorio sobre el incremento de CORT
producido por el hacinamiento, lo cual se encuentra en coherencia con otros experimentos
que demuestran el papel anti-glucocorticoide de ambos (Herbert, 1998; HIgashi y col.,
2005; Hu y col., 2000; Kimonides y col., 1999; Mediratta y col., 2003). El incremento de
CORT por hacinamiento, también ha sido mostrado previamente en diferentes especies
animales (Boranic y cols., 1982; Hessing y cols., 1993; Csermely y cols., 1995; Aioi, 2001),
aunque tales efectos por lo general requieren de un tiempo de hacinamiento más
prolongado (Csermely y cols., 1995 ; Hessing y cols., 1993).
En los grupos sometidos a ruido se observó una rápida elevación de los niveles
de CORT en las ratas con implante VEHI, lo cual se encuentra en coherencia con otros
estudios en los que las USVs funcionan como un estímulo estresante potente
(Blanchard y cols., 1991; Commissaris y cols., 2000). Esta elevación alcanzó su nivel
máximo en el día 2 y se mantuvo estable a lo largo de todo el tiempo de exposición al
estrés. En los grupos implantados con PROG o DHEA se produjo también un
59
incremento en los niveles de CORT, pero este fue diferente de la elevación del grupo
VEHI en dos aspectos básicos: 1. El incremento fue más lento, de manera que puede
observarse un retraso de esta respuesta. 2. Esta elevación fue revertida hacia el final
de la exposición al estrés. Como se mencionó anteriormente, este efecto de inhibición
de los niveles de CORT es ya conocido, en especial en circunstancias en las que e
glucocorticoide se encuentra lo suficientemente elevado como para activar recptores
tipo II (Higashi y col., 2005; Hu y col., 2000; Kimonides y col., 1999; Mediratta y col.,
2003). Este patrón de elevación de la respuesta deCORT en los grupos PROG y
DHEA, en el que se observa un retraso, una elevación pronunciada y una reversión de
los niveles del glucocorticoide pudiera explicarse por el hecho de que los
neuroesteroides implantados mantienen una regulación de incrementos fisiológicos
moderados de CORT como se observó en la respuesta de la hormona ante el
hacinamiento, a través de la regulación de receptores gabaérgicos que pueden inhibir
el eje HPA. Sin embargo, una vez superado un umbral de activación, se pierde la
capacidad de regulación y se da vía libre al incremento. Una vez presente la activación
del eje HPA pueden dispararse los mecanismos de autorregulación que tiene este
sistema de respuesta al estrés, de manera que el efecto conjunto de esta estrategia
adicionada a la presencia de los neuroesteroides anti-glucocorticoides, puede tener un
resultado sinérgico que finalmente termine por inhibir el incremento de CORT.
Por otra parte, la mayor potencia del estrés por ruido puede explicarse con base
en el carácter unimodal de esta estimulación aversiva, ya que la vía auditiva constituye
una herramienta fundamental para la supervivencia de roedores y posee una vía
neuronal muy específica con niveles de habituación muy bajos, dada su importancia
adaptativa. Lo anterior ha sido demostrado en experimentos con roedores, en los que
las USVs artificiales pueden desencadenar comportamientos de defensa (Beckett y
cols, 1996) similares a los inducidos por estimulación química o eléctrica en la
sustancia gris periacueductal (carreras, saltos y congelamiento), y el colículo superior
(estrechamente relacionado con la función auditiva) (Savvas y cols, 2000). Además, en
ratas el colículo inferior parece estar relacionado con la conducta de defensa, pues su
estimulación genera incrementos en la locomoción, exaltación y saltos, así como
60
incrementos en la presión sanguínea y la frecuencia cardíaca. (Commissaris y col,
2000; Brandao y cols., 1994; Maisonette y cols., 1996). De otro lado, el hacinamiento
provoca estímulos polimodales con la intervención de diferentes vías sensoriales
inespecíficas, lo que puede facilitar su enfrentamiento a nivel fisiológico y
comportamental. Posiblemente la herencia filogenética haya conferido a los roedores la
capacidad para desdencadenar respuestas fisiológicas dirigidas a minimizar o abolir
sus manifestaciones orgánicas frente al estrés por hacinamiento cuando no está
comprometida su supervivencia, mientras que la respuesta será diferente cuando el
hacinamiento se acompaña por restricción de agua yalimento, suciedad de la cama y
los enfrentamientos para establecer jerarquías, así; en el primer caso solo resulta una
alteración moderada de la respuesta fisiológica. Además, aunque el hacinamiento es
un estímulo utilizado con frecuencia, se ha visto que entre otros diferentes tipos de
estrés; hacinamiento, aislamiento, inmovilización y nado forzado, los dos últimos
provocaron mayores efectos adversos, lo cual cuestionó la capacidad estresante de los
dos primeros (Nagaraja y Jeganathan, 1999), o al menos sugiere que los estímulos
estresantes de características sociales pueden provocar efectos más sutiles y difíciles
de detectar.
Es importante señalar que en este estudio se recolectó la orina de un modo
distinto a como regularmente se hace en otros estudios de comportamiento o de
nutrición. En este experimento los sujetos se mantuvieron juntos todo el tiempo, - para
evitar el sesgo que hubiera podido resultar por el aislamiento en jaulas metabólicas
individuales que tienen un dispositivo en el fondo para recolectar las heces y la orina
por separado, por lo que así puede calcularse la cantidad de alimento ingerida. Dadas
las condiciones experimentales propuestas para este estudio no fue posible utilizar las
referidas jaulas, el que se haya realizado la recolección conjunta de las muestras de
orina podría explicar la variabilidad intraensayo observada, ya que la determinación de
los niveles de CORT se hizo a partir de mezclas de orina provenientes de distintos
animales.
61
En nuestro conocimiento, este es el primer estudio en reportar una inhibición in
vivo por parte de implantes hormonales de PROG y DHEA sobre los niveles de CORT
generados por estrés de características sociales.
Memoria espacial.
El laberinto acuático de Morris es una de las prueb as más usadas para evaluar el
aprendizaje y la memoria espacial en roedores. Este tipo de memoria, por su relación
con el hipocampo, constituye una analogía del sistema de memoria declarativa tan
importante para los humanos. En general, intenta detectar alteraciones en el
aprendizaje, es decir durante la fase de entrenamiento, para evaluar la función
mnemónica de adquisición del hipocampo; y cambios en la memoria, durante la fase
de prueba, con el fin de medir la función de consolidación.
Los hallazgos de este estudio revelaron un déficit en los procesos de
consolidación o memoria espacial, ya que las diferencias se observaron durante la fase
de prueba, mientras que en la fase de entrenamiento, los sujetos de los diferentes tipos
de implante y condiciones de estrés mostraron los mismos niveles de aprendizaje. Esto
significa que los procesos de memoria de trabajo en el hipocampo no se vieron
afectados por las manipulaciones experimentales. En cambio, el proceso de
consolidación evaluado al día siguiente con la prueba del laberinto de Morris, mostró
un impacto significativo en el número de cruces con la plataforma para el factor de
implante y el factor de interacción.
El resultado observado es que las ratas VEHI expuestas a las condiciones
estresantes mostraron una disminución en el número de cruces con el lugar de la
plataforma durante el nado, es decir, que recordaban menos el lugar que aprendieron
el día anterior durante el entrenamiento. Muchos estudios demuestran que el estrés
produce déficit en la memoria y el aprendizaje espacial (Lupien y McEwen, 1997;
McEwen y cols, 1998; Raber, 1998; de Kloet y cols, 1999; McEwen, 1999; de Kloet,
2000; McEwen, 2000), y los resultados aquí observados resultan coherentes con los
62
efectos sobre la memoria espacial por parte de otras manipulaciones experimentales
similares, como el estrés social crónico durante 21 días (Ma y cols., 2000), el
hacinamiento en Drosophila (Barth y Heisenberg, 1997), ruido de 105 dB en ratas
(Arnsten y Goldman-Rakic, 1998) y ruido grabado de tráfico en humanos (Belojevic y
cols., 1992).
Por el contrario, en la condición de PROG, los grupos expuestos a las situaciones
estresantes no mostraron una ejecución distinta a las ratas control, lo que sugiere que
este neuroesteroide ejerció un efecto benéfico o protector sobre los procesos de
consolidación de memoria en el hipocampo que se ven afectados por el estrés por
hacinamiento o ruido por USVs. Como se mencionó anteriormente, la PROG ha
mostrado un efecto ansiolítico en diferentes situaciones experimentales de estrés
(Figueiredo y col., 2002; Mediratta y col., 2003), y en este estudio decrementó de
manera significativa los niveles de CORT. Por lo tanto, su efecto protector sobre la
ejecución en la prueba de memoria espacial del Laberinto Acuático de Morris, puede
relacionarse con su papel anti-glucocorticoide y su impacto en la reducción de los
niveles de CORT.
De otro lado, en los sujetos expuestos a DHEA, los grupos estresados no
mostraron cambios significativos en comparación con la condición VEHI, mientras que
el grupo control tuvo una reducción importante en el número de cruces con la
plataforma. Esto sugiere que la DHEA, a pesar de generar una inhibición sobre los
niveles de CORT, no tiene un efecto protector sobre la memoria en el hipocampo
afectado por hacinamiento o ruido ultrasónico, y además, que ante la ausencia de
estrés, genera un decremento en la habilidad de memoria espacial, efecto que además
debe ser independiente de los niveles de CORT, pues estos se vieron ihibidos en los
sujetos con implante de DHEA. Diamond y col., (1999) encontraron algo similar, al
observar que la DHEA no potencializaba los cambios electrofisiológicos necesarios
para la memoria espacial en el hipocampo de ratas sometidas a estrés, sin embargo,
contrario a los resultados del presente experimento, este mismo estudio mostró que en
la situación sin estrés, la DHEA si promovió dichaactividad electrofisiológica.
63
Aunque en general la DHEA se ha relacionado con el aumento de la memoria y
el aprendizaje (Wang y col., 2001), Wolf y col., (1998) encontraron un decremento en la
ejecución de pruebas de memoria declarativa (función hipocampal) en humanos, lo
cual contradice también la idea de un efecto directo anticorticoide o antiestrés sobre las
funciones de memoria mediadas por el hipocampo. Además, Breuer y cols., (2002)
encontraron que en mujeres ancianas los niveles de DHEA tenían una relación inversa
con las habilidades cognoscitivas en diferentes test de memoria, lo que sugiere que
este tipo de hormonas pueden tener un efecto distinto que en las poblaciones jóvenes,
tal vez en relación a un mecanismo relacionado con estrés. Por último, los efectos de
los neuroesteroides en lo re ferente a aprendizaje y memoria en respuesta al estrés se
extienden a áreas como la li beración de acetilcolina y la alteración de sistemas
monoaminérgicos (Maurice y col., 2001) los cuales pueden tener un efecto importante,
pero que no fueron evaluadas en este estudio.
Conducta exploratoria.
El campo de agujeros fue diseñado para medir la conducta exploratoria de ratas y
ratones. La parte central del campo de agujeros funciona de manera similar al área
central de la prueba de campo abierto; en ella las ratas con mayor ansiedad prefieren
la zona periférica a la central, al parecer con el propósito de resguardarse, aunque este
comportamiento también puede indicar un déficit de atención (Lordi y cols., 2000). Por
lo tanto, para este estudio era de esperarse que los animales efectuaran una menor
cantidad de visitas centrales, en comparación con las periféricas, lo cual depende de
las situaciones previas a las que hayan estado expuestos. Por otro lado, el tiempo de
movilidad refleja la excitabilidad de los individuos, variable que puede verse afectada
por los niveles de estrés (de Kloet y cols., 2000).
En este estudio, los puntajes obtenidos para tiempo de movilidad e inmovilidad,
visitas centrales y periféricas, así como distancia y velocidad del recorrido, no
mostraron diferencias significativas entre ellas. Sin embargo, los grupos con implante
64
DHEA pasaron una mayor cantidad de tiempo en el áre a central de la tabla de agujeros en
comparacón con las ratas VEHI y PROG. Este incremento se asocia normalmente a
estados ansiolíticos, pero en este caso no puede atribuirse la causa a dicha variable, ya
que el bajo impacto del factor grupo y de la interacción, hacen este efecto independientede
las condiciones de estrés, además, el grupo de PROG también mostró niveles reducidos
de CORT, y sin embargo los sujetos no incrementaron el tiempo de permanencia en la
zona central. Una explicación alternativa tiene que ver con sistemas de atención a
estimulación novedosa, proceso también asociado con el hipocampo. Lordi y cols, (2000)
sugieren que la disminución del tiempo en la zona central, puede estar en relación con un
decremento en los niveles de atención, mientras que Wolf y col., (1998) encontraron que la
DHEA potencia las tareas relacionadas con la atención. Es entonces posible suponer que
la DHEA haya incrementado los procesos atencionales que dirigen la conducta
exploratoria, de manera que las ratas pasaran una mayor cantidad de tiempo en el área
central. Sin em bargo, habría que sugerir, que este efecto se limita a factores atencionales,
pues la conducta exploratoria, es decir el número de agujerso visitados, en el área central
y periférica fue igualmente distribuída en todas las situaciones estresantes y los diferentes
implantes.
También se observaron diferencias importantes en la cantidad de visitas totales. El
ruido, pero no el hacinamiento, incrementó de manera significativa la cantidad de visitas
totales y este efecto fue revertido por la PROG y la DHEA. Este efecto no puede atribuirse
a un componente motor, ya que los tiempos de movilidad e inmovilidad fueron iguales para
todas las ratas. Por el contrario, puede decirse que está relacionado con un factor de
estrés, ya que las ratas bajo condiciones de ruido tuvieron niveles de CORT más altos en
comparación con las de hacinamiento. En la mayoría de estudios de estrés, se ha
reportado disminución de la conducta exploratoria tanto con el uso de modelos de estrés
agudo y no social (Boranic y cols., 1982; Hessing y cols., 1993; Csermely y cols., 1995;
Takeda y cols., 1999; Tsuji y cols., 2000; Adamec, 2001; Aioi, 2001), como con diferentes
modelos de estrés social en distintas especies (Manuck y cols., 1991; Heinrichs y cols.,
1994; Boissy y cols., 1998; Meerlo y cols., 1999; Habib y cols., 2000; McCabe, 2000;
Kovach y cols., 2001). Sin embargo, un estudio de Osborn
65
y col. (1998), mostró un incremento de la exploración en ratas sometidas a tratamiento
con CORT.
Es necesario aclarar, que la mayoría de estos experimentos evaluan la
exploración utilizando el laberinto elevado en cruz y el laberinto de campo abierto, los
cuales miden principalmente niveles de ansiedad, y no la conducta exploratoria por si
misma. Es probable que la diferencia en estos resultados se deba a que el campo de
agujeros evalúa un rango de dimensiones más amplio y ofrece un ambiente novedoso
más enriquecido que las otras pruebas. Aunque el ca mpo de agujeros no había sido
hasta ahora probado para evaluar el efecto de la CORT sobre la conducta exploratoria,
es posible observar que en otros intentos por medir el comportamiento exploratorio en
circunstancias diferentes, como la exposición a un ambiente novedoso con ratas
desconocidas, la CORT generó un incremento en el nivel de exploración (Haller y col.,
1997). Por este motivo, el efecto inhibitorio de la PROG y la DHEA puede entonces
atribuirse a sus efectos ansiolíticos a través de la reducción de los niveles de CORT, al
menos en lo que respecta a la conducta exploratoria.
Astrocitos
El efecto más evidente en las células astrocitaria s fue la fuerte inhibición que
ejerció la DHEA sobre la población y la transformación de los astrocitos en todas las
condciones experimentales y en todas las áreas anal izadas. Tal efecto inhibitorio de la
DHEA sobre la proliferación astrocitaria y la expresión de GFAP ha sido previamente
reportado in vitro (Bolota y col., 1987) e in vivo (Hoyk y col., 2004), de manera que los
presentes resultados encajan en el marco experimental que relaciona la DHEA con las
células astrocitarias.
En la población astrocitaria de CA3 y DG, asi como en la transformación
astrocitaria de CA1, CA3 y DG, pudo observarse un impacto significativo del factor
grupo, pues con el implante VEHI, la cantidad de astrocitos registrados fue menor en
las condiciones de estrés, en comparación con el control. Aunque un papel excitatorio
de la CORT sobre los astrocitos haya sido descrito en algunos experimentos in vitro
66
(Rozovsky y col., 1995; Melgani y col., 1997) e in vivo (Bjorklund y col., 1985), la
mayoría de la evidencia experimental se encuentra en coherencia con el presente
estudio, en cuanto a que la CORT tiene efectos inhibitorios sobre las células
astrocitarias (Crossing y col., 1997; Laping y col., 1994; Nichols y col., 1990;
O’callaghan y col., 1991), particularmente con la implementación de estrés crónico de
intensidad media (Rithcie y col., 2004) y de manera específica para el hipocampo
(Maurel y col., 2000).
Ante los efectos inhibitorios del estrés, la PROG no mostró un efecto protector,
lo cual contradice los resultados de (Crossing y cols., 1999), quienes revirtieron con
PROG y DHEA la inhibición astrocitaria producida con CORT. A pesar de haber logrado
una reducción de los niveles de CORT, en este estduio la PROG no impidió la
inhibición astrocitaria, esto sugiere que la inhibición de las células astrocitarias en el
grupo de PROG puede estar asociada a su efecto directo sobre los astrocitos, pues
ellos son los principales productores de PROG en el SNC (Zwain y Yen, 1999) y se ha
demostrado que la hormona tiene un efecto inhibitorio sobre la proliferación y la
transformación de estas células (Jung y col., 1992; Ciriza y col., 2004; Grossman y col.,
2004; Dhebaili y col., 2005). También podría suponerse que el efecto de la inhibición
esta relacionado con la interacción entre PROG y los niveles del glucocorticoide que se
alcanzaron previamente a la reducción por parte de la progesterona, ya que algunos
estudios in vitro que estudiaron los efectos de CORT y PROG sobre cultivos de
astrocitos han reportado que el resultado puede ser totalmente opuesto dependiendo
de la cantidad, densidad y tipo de células presentes, y por lo tanto se hipotetiza que la
presencia de células con receptores a las hormonas, que compiten por los ligandos
presentes, pueden determinar en que dirección reaccionan los astrocitos (Bohn y col.,
1994; Rozovsky y col., 1995).
Finalmente, fue posible observar que además de la falta de protección, la PROG
mostró decrementos importantes en la transformaciónde los astrocitos en condiciones
control, esta alteración de la PROG podria ser explicada por el impacto inhibitorio que
67
tiene la hormona sobre los astrocitos, descrito anteriormente, y ha sido objeto de
reportes similares, por parte de otros experimentos en los cuales el grupo control tuvo
efectos secundarios (Mediratta y col., 2003).
Microglia.
De manera similar a lo observado en los astrocitos, la DHEA inhibió la
inmunorreactividad de astrocitos en el hipocampo en todas las condiciones
experimentales de estrés. Las células contabilizadas fueron tan pocas que se decidió
excluirlas del análisis estadísitico por el sesgo q ue podrían producir. La inhibición de
DHEA sobre las células de microglia también ha sido demostrada in vitro (Yang y col.,
2000; Wang y col., 2001) e in vivo (Tomas-Camardiel y col., 2001).
De manera general, en las ratas con implate VEHI, pudo observarse una
reducción significativa de la reactividad y la población microglial en el grupo de
hacinamiento, esto sugiere un efecto inhibitorio de los corticosteroides sobre la
población y transformación microglial, que ha sidoobservado en otros estudios (Wang y
col., 1998; Moga y col., 2005; Nichols y col., 2005). No existe evidencia experimental
directa que permita explicar el hecho de que los sujetos expuestos a ruido con altos
niveles de CORT no mostraron una inhibición de la reacción microglial. Sin embargo,
con base en experimentos en los que se ha observado un rol excitatorio de los
corticosteroides sobre la microglia (Tanaka y cols., 1997; Gonzalez-Perez y col., 2001;
Gonzalez’Castaneda y col., 2002) es posible hipotetizar que el elevado nivel de
corticosteroides haya generado paralelamente un desequilibrio sobre el medio ambiente
neuronal y que la microglia se haya activado en consecuencia para compensar tal
efecto, de manera que al ser evaluada, el decremento inicial queda compensado y no
se observan cambios aparentes. Asi mismo (Brooke y Sapolsky 2002), han reportado
también efectos bidireccionales de los glucocorticoides sobre la reacción microglial;
inhibición para estrés agudo yexcitación para estrés crónico. Estos resultados sugieren
que los niveles de estrés generados por el hacinamiento tuvieron un rol inhibitorio sobre
la población y la transformación microglial del hipocampo,
68
mientras que el alto nivel de estrés generado por ruido pudo haber estimulado las
células microgliales y compensado el efecto.
La inhibición de la microglia observada en el hacinamiento de VEHI, no fue
revertida con el implante de PROG. A pesar de que la hormona disminuyó los niveles
de CORT, las células microgliales no mostraron cambios en su respuesta de inhibición.
Aunque el impacto del factor implante fue significativo solo de manera limítrofe para
algunas de las áreas evaluada, este resultado puede obedecer al efecto directo que
tiene la PROG sobre la microglia, pues ha sido reportada la inhibición de esta hormona
sobre la transformación microglial (Ganter y col., 1992; Fujita y col., 1996; Garcia-
Estrada y col., 1999).
69
CONCLUSIONES
Actividad gonadal.
- Los neuroesteroides progesterona y dehidroepiandosterona inhibieron el
incremento de corticosterona en ratas, después de 10 días de estrés por hacinamiento
o ruido ultrasónico.
- El ruido resultó el factor estresante más potente.
Comportamiento.
- La progesterona ejerció efectos neuroprotectores frente a las alteraciones en la
memoria espacial, generadas por el estrés en las ratas mostrando efectos ansiolíticos;
reflejados en la conducta exploratoria.
- Por el contrario, la dehidroepiandrosterona no mostró efectos benéficos en las ratas
estresadas y en las controles disminuyó la habilidad de memoria espacial.
Análisis Celular.
- La progesterona y la DHEA inhibierón la poblacióny reactividad astrocitaria, en las
regiones cerebrales analizadas de los animales estresados.
- En los animales con la influencia de progesterona se observó una población
microglial disminuida en todas las regiones analizadas del cerebro de ratas estresadas
por hacinamiento, sin variación de la morfología.
70
PERSPECTIVAS Y LIMITACIONES
Un vez concluido este trabajo se propone continuar con la línea de investigación,
utilizando estresores a temprana edad en roedores castrados e intactos,
(aproximadamente de un mes) como el ruido ultrasónico, hacinamiento o la presencia
de un predador, y aplicar después de esto pruebas de comportamiento para evaluar
aprendizaje y memoria espacial, así como citoarquitectura glial y neuronal (al 50% de
los animales de experimentación). Después de un mes, volver a someter a los mismos
estresores al resto de la población experimental, así como a las mismas pruebas para
evaluar la respuesta a la exposición temprana del estrés.
Con lo anterior podemos plantear un modelo experimental para el estudio de las
consecuencias de estrés en la población infantil que continuamente se ve sometida a
diferentes tipos de estresores (principalmente ruido y hacinamiento) en etapas muy
tempranas de su vida y que posteriormente pueden modificar su capacidad
cognocitiva.
Una de las limitaciones en este trabajo, fue no haber podido identificar la
microglia en los grupos de animales que fueron implantados con DHEA, en donde se
utilizaron diferentes marcadores, entre ellos; anticuerpos monoclonales anti-OX-42,
receptor de complemento C3Rbi para marcar selectivamente las células de la microglia
entre todas las otras células gliales del SNC, consiste en la utilización de este Ac, -
antagonista del CR3, (Flaris 1993). Este Ac es utilizado para identificar alteraciones en
la distribución y morfología de las células de microglia, después de una lesión cerebral,
en el caso de daño isquémico,estos Ac OX-42 identifican una condición
inmunorreactiva de células de microglia morfológicamente transformadas, que se
observan bastante arborizadas y sus procesos son semejantes a los que típicamente
se distinguen en la microglia en reposo, (McRae 1998). Después de modificar la
concentración del Ac primario, y el tratamiento previo desenmascararte no resultaron lo
efectos esperados, ya que no se observó ningún tipo de marcaje.
71
BIBLIOGRAFIA
1. Adamec R. 2001. Does long term potentiation in periacqueductal gray (PAG)
mediate lasting changes in rodent anxiety-like behavior (ALB) produced by
predator stress?--Effects of low frequency stimulation (LFS) of PAG on place
preference and changes in ALB produced by predator stress. Behav Brain Res
120: 111-35.
2. Aioi A, Okuda M, Matsui M, Tonogaito H, Hamada K. 2001. Effect of high
population density enviroment on skin barrier function in mice. J Dermatol Sci
25: 189-197.
3. Aizenman Y, De Vellis J. 1987. Synergistic action of thyroid hormone, insulin
and hydrocortisone on astrocyte differentiation. Brain Res 414: 301-308.
4. Akwa Y, Young J, Kabbadj K, Sancho MJ, Zucman D, Vourch’ HC, Jung-Testas
I, Hu Z, Legoascone C, Jo DH. 1991. Neurosteroids: biosynthesis, metabolism
and function of pregnenolone and dehydroepiandrosterone in the brain. J Steroid
Biochem Mol Biol 40: 71.
5. Akwa Y, Sananes N, Gouezou M, Robel P, Baulieu E, Legoascogne C. 1993a.
Astrocytes and neurosteroids: metabolism of pregnenolone and
dehydroepiandrosterone. Regulation by cell density. J Cell Biol 121: 135.
6. Akwa Y, Schumacher M, Jung-Testas I, Baulieu EE. 1993b. Neurosteroids in rat
sciatic nerves and Schwann cells. C.R. Acad. Sci. Paris (Sciences de la Vie)
316: 410.
7. Alho H, Fremeau RT, Tiedge H, Wilcox J, Bovolin P, Brosius J, Roberts JL,
Costa E. 1988. Diazepam binding inhibitor gene expression: location in brain
and peripheral tissues of rat. Proc Natl Acad Sci USA 85: 7018.
72
8. Alonso G. 2000. Prolonged corticosterone treatment of adult rats inhibits the
proliferation of oligodendrocite progenitors present thoughout white and gray
matter regions of the brain. Glia 31: 219-231.
9. Alonso G. 2001. Proliferation of progenitor cells in the adult rat brain correlates
with the presence of vimentin-expressing astrocytes. Glia. Jun;34(4):253-66.
10. Arcana R, Navasivayam A. 1999. The effect of acute noise stress on neutrophil
functions. Indian J Physiol Pharmacol 43: 491-495
11. Arnsten AF, Goldman-Rakic PS. 1998. Noise stress impairs prefrontal cortical
cognitive function in monkeys: evidence for a hyperdopaminergic mechanism.
Arch Gen Psychiatry 55: 362-8.
12. Barbaccia ML, Roscetti G, Trabucchi M, Cuccheddu T, Concas A, Biggio G.
1994. Neurosteroids in the brain of handling-habituated and naive rats: effect of
CO2 inhalation. Eur J Pharmacol 261:317.
13. Barger SW, Chavis JA, Drew PD. 2000. Dehydroepiandrosterone inhibits
microglial nitric oxide production in a stimulus-specific manner. J Neurosci Res.
Nov 15;62 (4):503-9.
14. Barth M, Heisenberg M. 1997. Vision affects mushoom bodies and central
complex in Drosophila melanogaster. Learn Mem 4: 219
15. Bastianetto S, Ramassamy C, Poirier J, Quirion R. 1999.
Dehydroepiandrosterone (DHEA) protects hippocampal cells from oxidative
stress-induced damage. Brain Res Mol Brain Res. Mar 20; 66(1-2):35-41.
16. Baulieu EE. 1981. Steroid hormones in the brain: several mechanisms? En
Steroid Hormone Regulation of the Brain (ed. FuxJ K., Gustafsson J.A. and
Wettenberg L.). Pergamon Press, Oxford.
73
17. Baulieu EE, Robel P. 1990. Neurosteroids: a new brain function? J Steroid
Biochem Mol Biol 37: 395.
18. Baulieu EE. 1991. Neurosteroids: a new function in the brain. Biol Cell 71: 3.
19. Baulieu EE. 1998. Neurosteroids: a novel functions of the brain. Neurosteroids
are synthetized in the central and peripheral nervous system.
Psychoneuroendocrinology 23:963-87.
20. Baulieu EE, Robel P, Schumacher M. 2001. Neurosteroids: beginning of the
story. Int Rev Neurobiol.; 46:1-32.
21. Beckett SR, Aspley S, Graham M, Marsden CA. 1996. Pharmacological
manipulation of ultrasound induced defence behaviour in the rat.
Psychopharmacology 127: 4384-4390.
22. Belojevic G, Ohstrom E, Rylander R. 1992. Effects of noise on mental
performance with regard to subjective noise sensitivity. Int Arch Occup Environ
Health 64: 293
23. Ben-Nathan D, Lachmi B, Lustig S, Feuerstein G. 1991. Protection by
dehydroepiandrosterone in mice infected with viral encephalitis. Arch Virol 120:
263.
24. Betz AL, Coester HC. 1990. Effect of steroid therapy on ischaemic brain oedema
and blood to brain sodium transport. Acta Neurochir Suppl Wien 51: 256.
25. Bhatnagar S, Vining C. 2003. Facilitation of hypothalamic-pituitary-adrenal
responses to novel stress following repeated social stress using the
resident/intruder paradigm. Horm Behav 43: 158-65.
26. Björklund H, Eriksdotter-Nilsson M, Dahl D, Ros e G, Hoffer B, Olson L. 1985.
Image analysis of GFA-positive astrocytes from adolescence to senescence.
74
Exp Brain Res 58: 163¯170.
27. Blanchard RJ, Blanchard DC, Agullana R, Weiss SM. 1991. Twenty-two Khz
larm cries to presentation of a predator, by laboratory rats living in visible burrow
systems. PhisioL Behav 50: 5967-5972. 1991.
28. Bohn MC, O'Banion MK, Young DA, Giuliano R, Hussain S, Dean DO,
Cunningham LA. 1994. In vitro studies of glucocorticoid effects on neurons and
astrocytes. Ann N Y Acad Sci. Nov 30; 746:243-58; discussion 258-9, 289-93.
29. Boissy A, Terlouw C, LE Neindre P. 1998. Presence of cues from stressed
conspecifics increases reactivity to aversive events in cattle: evidence for the
existence of alarm substances in urine. Physiol Behav 63: 489
30. Bologa L, Sharma J, Roberts E. 1987. Dehydroepiandrosterone and its sulfated
derivative reduce neuronal death and enhance astrocytic differentiation in brain
cell cultures. J. Neurosci. Res. 17: 225.
31. Boranic M, Pericic D, Radacic M, Poljak-Blazi M, Sverko V, Miljenovic G. 1982.
Immunological and neuroendocrine responses of rats to prolonged or repeated
stress. Biomed Pharmacoter 36: 23-28.
32. Brandao ML, Cardosa SH, Melo LL, Motta V, Coimbra NC. 1994. Neural
substrate of defensive behavior in the midbrain tectum. Neurosci Biobehavi R
18: 339-346.
33. Breuer B, Martucci C, Wallenstein S, Likourezos A, Libow LS, Peterson A,
Zumoff B. 2002. Relationship of endogenous levels of sex hormones to cognition
and depression in frail, elderly women. Am J Geriatr Psychiatry. May-Jun;
10(3):311-20.
34. Brooke SM, Sapolsky RM. 2002. Glucocorticoid exacerbation of gp120
neurotoxicity: role of microglia. Exp Neurol. Sep; 177(1):151-8.
75
35. Brown ES, Rush AJ, McEwen BS. 1999. Hippocampal remodeling and damage
by corticosteroids: Implications for mood disorders. Neuropsychopharmacol 21:
474-484.
36. Brown MS, Kovanen PT, Goldstein JL. 1979. Receptor-mediated uptake of
lipoprotein-cholesterol and its utilization for steroid synthesis in the adrenal
cortex. Recent Prog Horm Res 35: 215.
37. Bruce-Keller AJ, Keeling JL, Keller JN, Huang FF, Camondola S, Mattson MP.
2000. Antiinflammatory effects of estrogen on microglial activation.
Endocrinology. Oct;141(10):3646-56.
38. Bubna-Littitz H, Hofecker G, Kment A, Niedermül er H. 1981. Gerontological pilot
study on learning ability and memory in the stressed rat. Aktuel Gerontol 11: 28-
31.
39. Chou YC. 1998. Corticosterone exacerbates cyanide-induced cell death in
hippocampal cultures: role of astrocytes. Neurochem Int. Mar; 32(3):219-26.
40. Ciriza I, Azcoitia I, Garcia-Segura LM. 2004. Reduced progesterone metabolites
protect rat hippocampal neurones from kainic acid excitotoxicity in vivo. J
Neuroendocrinol. Jan; 16(1):58-63.
41. Clemens LG, Weaver DR. 1985. Structure and biosynthesis of gonadal steroids.
En "Handbook of behavioral neurobiology" 7: 185. (Normand Adler, ed.). Plenum
Press, New York.
42. Cohen S, Williamson GM. 1991. Stress and infectious disease in humans.
Psychological Bulletin 1: 5-24.
43. Commissaris RL, Palmer A, Neophytou S, Graham M, Beckett S, Marsden CA.
2000. Acoustically elicited behaviours in Lister hooded and Wistar rats. Physiol
Behav 68: 521-531.
76
44. Costa E, Auta J, Guidotti A, Korneyev A, Romeo E. 1994. The pharmacology of
neurosteroidogenesis. J. Steroid. Biochem Mol Biol 49: 385.
45. Crossin KL, Tai MH, Krushel LA, Mauro VP, Edelman GM. 1997. Glucocorticoid
receptor pathways are involved in the inhibition of astrocyte proliferation. Proc
Natl Acad Sci U S A. Mar 18;94(6):2687-92.
46. Crossing KL, Tai MH, Krushel LA, Mauro VP, Edelman GM. 1997. Glucocorticoid
receptor pathways are involved in the inhibition of astrocyte proliferation. Proc
Natl Acad Sci USA 94: 2687-2692.
47. Csermely P, Pénzes I, Tóth S. 1995. Chonic overcrowding decreases
cytoplasmic free calcium levels in T lymphocytes of aged CBA/CA mice.
Experientia 51: 10976-10979.
48. de Kloet ER, Oitzl MS, Joëls M. 1999. Stress an d cognition: are corticosteroids
good or bad boys? Trends Neurosci 22: 422-426.
49. de Kloet ER, Van Acker SABE, Sibug RM, Oitzl MS, Meijer OC, Rahmouni K, De
Jong W. 2000. Brain mineralocorticoid receptors and centrally regulated
functions. Kidney Int 57: 1329
50. de Quervain DJF, Roozendaal B, Mcgaugh JL. 1998. Stress and glucocorticoids
impair retrieval of long-term spatial memory. Nature 394: 787-790.
51. Deniselle MC, Lavista-Llanos S, Ferrini MG, Lima AE, Roldan AG, De Nicola AF.
1999. In vitro differences between astrocytes of control and wobbler mice spinal
cord. Neurochem Res. Dec; 24(12):1535-41.
52. Di Santo E, Foddi MC, Ricciardi-Castagnoli P, Mennini T, Ghezzi P. 1996.
DHEAS inhibits TNF production in monocytes, astrocytes and microglial cells.
Neuroimmunomodulation. Sep-Oct; 3(5):285-8.
77
53. Diamond DM, Fleshner M, Rose GM. 1999. The enhancement of hippocampal
primed burst potentiation by dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS) is
blocked by psychological stress. Stress. Dec; 3(2):107-21.
54. Djebaili M, Guo Q, Pettus EH, Hoffman SW, Stein DG. 2005. The neurosteroids
progesterone and allopregnanolone reduce cell death, gliosis, and functional
deficits after traumatic brain injury in rats. J Neurotrauma. Jan; 22(1):106-18.
55. Ebeling P, Koivisto VA. 1994. Physiological importance of
dehydroepiandrosterone. Lancet 343(9811): 1479.
56. Ely D, Caplea A, Dunphy G, Smith D. 1997. Physiological and neuroendocrine
correlates of social position in normotensive and hypertensive rat colonies.
Acta physiol Scand Suppl 640: 92-5.
57. Figueiredo HF, Dolgas CM, Herman JP. 2002. Stress activation of cortex and
hippocampus is modulated by sex and stage of estrus. Endocrinology. Jul;
143(7):2534-40.
58. Flaris NA, Densmore TL, Molleston MC, Hickey WF. 1993. Characterization of
microglia and macrophages in the central nervous system of rats: definition of
the differential expression of molecules using standard and novel monoclonal
antibodies in normal CNS and in four models of parenchymal reaction. Glia 7:34-
40.
59. Fokkema DS, Koolhaas JM, Gugten JV. 1995. Individual Characteristics Of
Behaviour, Blood Pressure, And Adrenal Hormones In Colony Rats. Physiol
Behav 57: 857-62.
60. Fujita H, Tanaka J, Toku K, Tateishi N, Suzuki Y, Matsuda S, Sakanaka M,
Maeda N. 1996. Effects of GM-CSF and ordinary supplements on the
ramification of microglia in culture: a morphometrical study. Glia. Dec;18(4):269-
81.
78
61. Ganter S, Northoff H, Mannel D, Gebicke-Harter PJ. 1992. Growth control of
cultured microglia. J Neurosci Res. Oct; 33(2):218-30.
62. Garcia-Estrada J, Luquin S, Fernandez AM, Garcia-Segura LM. 1999.
Dehydroepiandrosterone, pregnenolone and sex steroids down-regulate reactive
astroglia in the male rat brain after a penetrating brain injury. Int J Dev Neurosci.
Apr; 17(2):145-51.
63. Garcia-Ovejero D, Azcoitia I, Doncarlos LL, Melcangi RC, Garcia-Segura LM.
2005. Glia-neuron crosstalk in the neuroprotective mechanisms of sex steroid
hormones. Brain Res Rev. Apr; 48(2):273-86. Epub Jan 15.
64. Garcia-Segura LM, Luquin S, Parducz A, Naftolin F. 1994. Gonadal hormone
regulation of glial fibrillary acidic protein immunoreactivity and glial ultrastructure
in the rat neuroendocrine hypothalamus. Glia 10: 59-63.
65. Garcia-Segura LM, Chowen JA, Naftolin F. 1996. Endocrine glia: roles of glial
cells in the brain actions of steroid and thyroid hormones and in the regulation of
hormone secretion. Front Neuroendocrinol 17: 180-211.
66. Gehmann J, Matsumoto Y, Kreutzberg GW. 1995. Microglia: intrinsic
immunoeffector cell of the brain. Brain Res Rev 20: 269-87.
67. Givalois L, Arancibia S, Alonso G, Tapia-Arancibia L. 2004. Expression of brain-
derived neurotrophic factor and its receptors in the median eminence cells with
sensitivity to stress. Endocrinology. 2004 Oct; 145(10):4737-47.
68. Gómez-Pinedo U, López-Dellamary F, Mora-Galindo J, Bañuelos-Pineda J,
Chávez-Delgado E, Macias-Islas M, Martinez-Contrera s A, González-Pérez O,
Garzón P, Luquín S, Navarro-Ruiz A, García-Estrada J. 2001. Utilización de
prótesis de quitosana y silicona en la regeneración del nervio ciático
axotomizado de ratas. Arch neurocien, 6(4): 184-193.
79
69. González-Castañeda R, González-Pérez O, Garcia- Estrada J, Luquín S,
Ramos-Remus C. 2002. Deterioro cognitivo y daño cerebral inducido por
prednisona. Rev Mex Reumatol 17: 44.
70. González-Pérez O, Ramos-Remus C, Garcia-Estrada J, Luquín S. 2001.
Prednisone induces anxiety and glial cerebral changes in rats. J Reumatol 28:
2529-2534.
71. Gould E, Cameron HA, Daniels DC, Wooley CS, McEwen BS. 1992. Adrenal
hormones suppress cell division in the adult rat dentate gyrus. J Neurosci 12:
3642-3650.
72. Grossman KJ, Goss CW, Stein DG. 2004. Effects of progesterone on the
inflammatory response to brain injury in the rat. Brain Res. 15;1008(1):29-39.
73. Gubba EM, Fawcett JW, Herbert J. 2004. The effects of corticosterone and
dehydroepiandrosterone on neurotrophic factor mRNA expression in primary
hippocampal and astrocyte cultures. Brain Res Mol . Aug 23; 127(1-2):48-59.
74. Habib KE, Weld KP, Rice KC, Pushkas J, Champoux M, Listwak S, Webster EL,
Atkinson AJ, Schulkin J, Contoreggi C, Chousos GP, Mccann SM, Suomi SJ,
Higley JD, Gold PW. 2000. Oral administration of a corticotropin-releasing
hormone receptor antagonist significantly attenuates behavioral, neuroendocrine,
and autonomic responses to stress in primates. Proc Natl Acad Sci USA 97:
6079-84.
75. Haller J, Halasz J, Makara GB, Kurk MR. 1998. Acute effects of glucocorticoids:
behavioral and pharmacological perspectives. Neurosci Biobiehav.; 23: 337-344.
76. Heinrichs SC, Menzaghi F, Pich EM, Baldwin HA, Rassnick S, Britton KT, Koob
GF. 1994. Anti-stress action of a corticotropin-releasing factor antagonist on
behavioral reactivity to stressors of varying type and intensity.
80
Neuropsychopharmacology 11: 179-86.
77. Hennebold JD, Daynes RA. 1994. Regulation of macrophage
dehydroepiandrosterone sulfate metabolism by inflammatory cytokines.
Endocrinology 135: 67.
78. Henry JP, Liu Y, Nadra WE, Qian C, Mormede P, Lemaire V. 1993.
Psychosocial stress can induce chonic hypertension in normotensive strains of
rats. Hypertension 21, 714-23.
79. Herbert J. 1998. Neurosteroids, brain damage, and mental illness. Exp Gerontol
33: 713
80. Higashi T, Takido N, Shimada K. 2005. Studies on neurosteroids XVII. Analysis
of stress-induced changes in neurosteroid levels in rat brains using liquid
chomatography-electron capture atmospheric pressure chemical ionization-mass
spectrometry. Steroids. Jan;70(1):1-11
81. Hoyk Z, Parducz A, Garcia-Segura LM. 2004. Dehydroepiandrosterone
regulates astroglia reaction to denervation of olfactory glomeruli. Glia. Nov 15;48
(3):207-16.
82. Hu Y, Cardounel A, Gursoy E, Anderson P, Kalimi M. 2000. Anti-stress effects of
dehydroepiandrosterone: protection of rats against repeated immobilization
stress-induced weight loss, glucocorticoid receptor production, and lipid
peroxidation. Biochem Pharmacol. Apr 1;59(7):753-62.
83. Hu Z Y, Bourreau E, Jung-Testas I, Robel P, Baulieu E. 1987. Neurosteroids:
oligodendrocyte mitochondria convert cholesterol to pregnenolone. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 84:8215.
84. Imai H, Nishimura T, Sadamatsu M, Liu Y, Kabuto M, Kato N. 2001. Type II
glucocorticoid receptors are involved in neuronal death and astrocyte activation
induced by trimethyltin in the rat hippocampus. Exp Neurol. Sep;171(1):22-8.
81
85. Jeansok J. Kim & David M. Diamond. 2002. The stressed Hippocampus,
Synaptic Plasticity and Lost Memories. Nature Reviews Neuroscience 3: 453-
462.
86. Jung-Testas I, Renoir M, Bugnard H, Greene GL, Baulieu EE. 1992.
Demonstration of steroid hormone receptors and steroid action in primary
cultures of rat glial cells. J Steroid Biochem Mol Biol. Mar;41(3-8):621-31.
87. Juricksay S. Telegdy E. 2000. Urinary steroids in women with androgenic
alopecia. Clinical Biochemistry 33: 97-101.
88. Kabbadj K, El-Etr M, Baulieu EE, Robel P. 1993. Pregnenolone metabolism in
rodent embryonic neurons and astrocytes. Glia 7: 170.
89. Kehoe P, Mallinson K, McCormick CM, Frye CA. 2000. Central allopregnanolone
is increased in rat pups in response to repeated, short episodes of neonatal
isolation. Brain Res Rev. Nov 30; 124 (1-2):133-6.
90. Kimonides VG, Khatibi NH, Svendsen CN, Sofroniew MV, Herbert J. 1998.
Dehydroepiandrosterone (DHEA) and DHEA-sulfate (DHEAS) protect
hippocampal neurons against excitatory amino acid-induced neurotoxicity. Proc
Natl Acad Sci U S A. Feb 17;95(4):1852-7.
91. Kimonides VG, Spillantini MG, Sofroniew MV, Fawcett JW, Herbert J. 1999.
Dehydroepiandrosterone antagonizes the neurotoxic effects of corticosterone
and translocation of stress-activated protein kinase 3 in hippocampal primary
cultures. Neuroscience. Mar;89(2):429-36.
92. Kipper-Galperin M, Galilly R, Danenberg HD, Brenner T. 1999.
Dehydroepiandrosterone selectively inhibits production of tumor necrosis factor
alpha and interleukin-6 [correction of interlukin-6] in astrocytes. Int J Rev
Neurosci. Dec;17(8):765-75.
82
93. Klein F, Lemaire V, Sandi C, Vitiello S, Van Der Logt J, Laurent PE, 1992.
Prolonged increase of corticosterone secretion by chonic social stress does not
necessarily impair immune functions. Life Sci 50: 723-731.
94. Kleinrok Z, Sieklucka Dziuba M. 1994. Androgens and the brain. Ginekol Plo. 65:
45.
95. Kniss DA, Burry RW. 1985. Glucocorticoid hormones inhibit DNA synthesis in
glial cells cultured in chemically defined medium. Exp Cell Res 161: 29-40.
96. Koenig HL, Schumacer M, Ferzaz B, Thi AN, Ressouches A, Guennoun R, Jung
Testas I, Robel P, Akwa Y, Baulieu EE. 1995. Progesterone synthesis and
myelin formation by Schwann cells. Science 268(5216): 1500.
97. Korneyev A, Pan BS, Polo A, Romeo E, Guidotti A, Costa E. 1993. Stimulation
of brain pregnenolone synthesis by mitochondrial diazepam binding inhibitor
receptor ligands in vivo. J Neurochem 61: 1515.
98. Krugers HJ, Medema RM, Postema F, Korf J. 1994. Induction of glial fibrillary
acidic protein immunoreactivity in the rat dentate gyrus after adrenalectomy:
comparison with neurodegenerative changes using silver impregnation.
Hippocampus. Jun;4(3):307-14.
99. Kuratsune H, Yamaguti K, Sawada M, Kodate S, Machii T, Kanakura Y, Kitani
T. 1998. Dehydroepiandrosterone sulfate deficiency in chonic fatigue
syndrome. Int J Mol Med 1:143.
100. Kuroda Y, McEwen BS. 1998. Effect of chonic restraint stress and tianeptine on
growth factors, growth-associated protein-43 and microtubule-associated protein
2 mRNA expression in the rat hippocampus. Brain Res Mol 59:35
101. Lambert JJ, Peters J, Cottrell A. 1987. Actions of synthetic and endogenous
steroids on the GABA (A) receptor. Trends Pharmacol Sci 8: 224.
83
102. Laping NJ, Teter B, Nichols NE, Rozovsky I, Finch CE. 1994. Glial fibrillary
acidic protein: regulations by hormones, cytokines, and growth factors. Brain
Pathol 1: 259-275.
103. Lian XY, Stringer JL. 2004. Astrocytes contribute to regulation of extracellular
calcium and potassium in the rat cerebral cortex during spreading depression.
Brain Res. Jun 25;1012(1-2):177-84.
104. Lordi B, Patin V, Protais P, Mellier D, Caston J. 2000. Chonic stress in pregnant
rats: effects on growth rate anxiety and memory capabilities of the offspring. Int J
Psychophysiol 37: 195-205.
105. Lupien SJ, McEwen BS. 1997. The acute effects of corticosteroids on cognition:
integration of animal and human model studies. Brain Res Rev 24: 1-27.
106. Luquín-S, Naftolin F, Garcia-Segura LM. 1993. Natural fluctuation and gonadal
hormone regulation of astrocyte immunoreactivity in dentate gyrus. J. Neurobiol.
24: 913.
107. Luu The V, Dufort I, Paquet N, Reimnitz G. Labrie F. 1995. Structural
characterization and expression of the human dehydroepiandrosterone
sulfotransferase gene. DNA Cell Biol 14, 511.
108. Ma Q, Wang J, Yang ZH, Liv HT, Chao FH. 2000. Effects of chonic stress on the
learning and memory ability and hippocampal LTP in rats. Zhongguo Ying Yong
Sheng Li Xue Za Zhi 16: 318
109. Magarinos AM, Verdugo JM, McEwen BS. 1997. Chonic stress alters synaptic
terminal structure in hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA 94:14002
110. Magnaghi V, Riva MA, Cavarretta I, Martini L, Melcangi RC. 2000.
Corticosteroids regulate the gene expression of FGF-1 and FGF-2 in cultured rat
astrocytes. J Mol Neurosci. Aug;15(1):11-8.
84
111. Maisonnette SS, Kawasaki MC, Coimbra NC, Brandao ML. 1996. Effects of
lesions of amygdaloid nuclei and subtantia nigra on aversive responses induced
by electrical stimulation of the inferior coliculus. Brain Res Bull. 40(2):93-8.
112. Majewska MD, Harrison NL, Schwartz RD, Barker JL, Paul SM. 1986. Steroid
hormone metabolites are barbiturate-like modulators of the GABA receptor.
Science 232: 1004.
113. Majewska MD. 1992. Neurosteroids: endogenous bimodal modulators of the
GABA receptor. Mechanisms of action and physiological significance. Prog
Neurobiol 38: 379.
114. Mastrocola R, Aragno M, Betteto S, Brignardello E, Catalano MG, Danni O,
Boccuzzi G. 2003. Pro-oxidant effect of dehydroepiandrosterone in rats is
mediated by PPAR activation. Life Sci. Jun 6;73(3):289-99.
115. Maurel D, Sage D, Mekaouche M, Bosler O. 2000.Glucocorticoids up-regulate
the expression of glial fibrillary acidic protein in the rat suprachiasmatic nucleus.
Glia. Feb 1;29(3):212-21.
116. Maurice T, Urani A, Phan VL, Romieu P. 2001. The interaction between
neuroactive steroids and the sigma1 receptor function: behavioral consequences
and therapeutic opportunities. Brain Res Rev. Nov;37(1-3):116-32.
117. McEwen BS, Magarinos AM. 1997. Stress effects on morphology and function of
the hippocampus. Ann NY Acad Sci 821:271
118. McEwen BS, Weiss JM, Schwartz LS. 1998. Selective retention of corticosterone
by limbic structures in rat brain. Nature 220: 911
119. McEwen BS. 1999. Stress and hippocampal plasticity. Annu Rev Neurosci
22:105
85
120. McEwen BS. 2000. Effects of adverse experiences for Brain structure and
function. Biol Psychiat 48: 721-731.
121. McGaugh JL, Cahill L, Parent MB, Mesches MH, Coleman-Mesches K, Salinas
JA. 1995. Involvement of the amygdala in the regulation of memory storage.
McGaugh, James L. (Ed), Bermudez-Rattoni, Federico (Ed), (1995). Plasticity in
the central nervous system: Learning and memory. (pp. 17-39). Mahwah, NJ,
USA: Erlbaum.
122. McCabe PM, Sheridan JF, Weiss JM, Kaplan JP, Natelson BH, Pare WP. 2000.
Animal models of disease. Physiol Beha,;68: 501-7.
123. McKittrick CR, Magarinos AM, Blanchard DC. 2000. Chonic social stress
reduces dendritic arbors in CA3 of hippocampus and decreases binding to
serotonin transporter sites. Synapse 36: 85-94.
124. McRae A, Bona E, Hagberg H. 1996. Microglia-astrocyte interactions after
cortisona treatment in a neonatal hypoxia-ischemia model. Brain Res Rev 94:
144-51
125. McRae A, Ling EA, Schubert P, Rudolphi K. 1998. Properties of activated
microglia and pharmacologic interference by propentofylline. Alzheimer Assoc
Disord 12:15-20.
126. Mediratta PK, Bhatia J, Tewary S, Katyal V, Mahajan P, Sharma KK. 2003.
Attenuation of the effect of progesterone and 4'-chlordiazepam on stress-
induced immune responses by bicuculline. Indian J Physiol Pharmacol. Jul;
47(3):288-96.
127. Mediratta PK, Mahajan P, Sharma KK, Bhandari R, Dubey SP. 2003.
Involvement of GABA-A receptor chloride channel complex in isolation stress-
induced free choice ethanol consumption in rats. Indian J Exp Biol. Jan;41(1):47-
52.
86
128. Meerlo P, Sgoifo A, De Boer SF, Koolhaas, JM. 1999. Long-Lasting
Consequences of a Social Conflict in Rats: Behavior During the Interaction
Predicts Subsequent Changes in Daily Rhythms of Heart Rate, Temperature,
and Activity. Behav Neurosci 113: 1283–90.
129. Melcangi RC, Magnaghi V, Cavarretta I, Riva MA, Martini L. 1997. Corticosteroid
effects on gene expression of myelin basic protein in oligodendrocytes and of
glial fibrillary acidic protein in type 1 astrocytes. J Neuroendocrinol. Oct;
9(10):729-33.
130. Melchior CL, Ritzmann RF. 1994a. Dehydroepiandrosterone is an anxiolytic in
mice on the plus maze. Pharmacol Biochem Behav 47:437
131. Melchior CL, Ritzmann RF. 1994b. Pregnenolone and pregnenolone sulfate,
alone and with ethanol, in mice on the plus-maze. Pharmacol Biochem Behav
48:893
132. Moga MM, Dempah D, Zhou D. 2005. Annexin 7-immunoreactive microglia in
the hippocampus of control and adrenalectomized rats. Neurosci Lett. May 20-
27;380(1-2):42-7.
133. Mollenauer S, Bryson R, Robison M. Phillips C. 1992. Noise avoidance in the
C57BL/6J mouse. Anim Learn Behav 20: 25-32.
134. Morale MC, Gallo F, Tirolo C, Testa N, Caniglia S, Marletta N, Spina-Ppirreññp.
V-. Avola R, Caucci F, Tomasi P, Delitalia G, Barden N, Marchetti B. 2001.
Neuroendocrine-immune (NEI) cirtuitry from neuron-glial interactions to function:
focus on gender and HAPA-HPG interactions on early programming of the NEI
system. Immunol Cell Biol 79: 400-417.
135. Morfin R, Young J, Corpechot C, Egestad B, Sjovall J, Baulieu EE. 1992.
Neurosteroids: pregnenolone in human sciatic nerves. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 89, 6790.
87
136. Morris RGM. 1984. Developmet of water-maze procedure for studying spatial
learning in the rat. J. of Neurosciencie Methods, 11: 47.
137. Naftolin F, Leranth C, Perez J, Garcia-Segura LM. 1993. Estrogen induces
synaptic plasticity in adult primate neurons. Neuroendocrinology 57: 935.
138. Nichols NR, Osterburg HH, Masters JN, Millar S, Finch CE. 1990. Messenger
RNA for glial fibrillary acidic protein is decreased in rat brain following acute and
chonic corticosterone treatment. Mol Brain Res 7: 1-7.
139. Nichols NR. 2003. Ndrg2, a novel gene regulated by adrenal steroids and
antidepressants, is highly expressed in astrocytes. Ann NY Acad Sci. Dec;
1007:349-56.
140. Nichols NR, Agolley D, Zieba M, Bye N. 2005. Glucocorticoid regulation of glial
responses during hippocampal neurodegeneration and regeneration. Brain Res
Rev. Apr; 48(2):287-301.
141. Nie W, Zhang ZY, Zhou JH. 2001. Correlation between mitochondrial membrane
potential and neurotoxic effect of corticosterone on primary cultured
hippocampal cells. Sheng Li Xue Bao. Dec; 53(6):469-72.
142. O’Callaghan JP, Brinton RE., McEwen BS. 1991. Glucocorticoids regulate the
synthesis of glial fibrillary acidic protein in intact and adrenalectomized rats but
do not affect its expression following brain injury. J Neurochem 57: 860-869.
143. O'Banion MK, Young DA, Bohn MC. 1994. Corticosterone-responsive mRNAs in
primary rat astrocytes. Brain Res Mol. Mar; 22(1-4):57-68.
144. Obut TA, Ovsiukova MV, Cherkasova OP. 2002. Effect of
dehydroepiandrosterone sulfate on stress reactivity: mu-opioid mechanism.
Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova. Dec;88(12):1578-84.
88
145. Obut TA, Ovsyukova MV, Cherkasova OP. 2003. Stress-limiting effect of
dehydroepiandrosterone sulfate and its mechanism. Bull Exp Biol Med. Mar;
135(3):231-3.
146. Obut TA, Ovsyukova MV, Cherkasova OP. 2004. Ratio between the contents of
11-dehydrocorticosterone and corticosterone after acute and repeated stress:
effect of dehydroepiandrosterone sulfate. Bull Exp Biol Med. Aug; 138(2): 137-9.
147. Oitzl MS, de Kloet ER. 1992. Selective corticosteroid-antagonists modulate
specific aspects of spatial orientation learning. Behav Neurosci 106: 62-71.
148. Oitzl MS, Fluttert M, de Kloet ER. 1994. The effect of corticosterone on reactivity
to spatial novelty is mediated by central mineralocorticosteroid receptors. Eur J
Neurosci 6:1072-1079.
149. O'Keefe J. 1990. A computational theory of the cognitive map. Prog Brain Res
83: 301-312.
150. Olmos G, Naftolin F, Perez J, Tranque PA, Garcia-Segura LM. 1989. Synaptic
remodeling in the rat arcuate nucleus during the estrous cycle. Neuroscience
32: 663.
151. Osborn JA, Kim CK, Steiger J, Weinberg J. 1998. Prenatal ethanol exposure
differentially alters behavior in males and females on the elevated plus maze.
Alcohol Clin Exp Res. May;22(3):685
152. Patel AJ, Hunt A, Tahourdin CSM. 1983. Regulation of in vivo glutamine
synthetase activity by glucocorticoids in the developing rat brain. Rev Brain Res
10: 83-91.
153. Paul SM, Purdy RH. 1992. Neuroactive steroids. FASEB J 6:2311.
89
154. Paxinos G. & Watson C. 1982. The rat Brain in Stereotaxic Coordinates.
Academic Press, New York.
155. Puia G, Santi MR, Vicini S, Pritchett DB, Purdy RH, Paul SM, Seeburg PH,
Costa E. 1990. Neurosteroids act on recombinant GABA (A) receptors. Neuron
4: 759.
156. Raber J. 1998. Detrimental effects of chonic hypothalamic-pituitary-adrenal axis
activation. From obesity to memory deficits. Mol Neurobiol 18: 1-22.
157. Reddy DS, Kulkarni SK. 1996. Role of GABA (A) and mitochondrial diazepam
binding inhibitor receptors in the anti-stress activity of neurosteroids in mice.
Psychopharmacology (Berl) 128:280
158. Reddy DS, Kulkarni SK. 1997. Differential anxiolytic effects of neurosteroids in
the mirrored chamber behavior test in mice. Brain Res 752:61
159. Reddy DS, Kaur G, Kulkarni SK. 1998. Sigma (sigma1) receptor mediated anti-
depressant-like effects of neurosteroids in the Porsolt forced swim test.
Neuroreport 9:3069
160. Ritchie LJ, de Butte M, Pappas BA. 2004. Chonic mild stress exacerbates the
effects of permanent bilateral common carotid artery occlusion on CA1 neurons.
Brain Res. Jul 16;1014(1-2):228-35.
161. Robel P, Baulieu EE. 1995. Neurosteroids: biosynthesis and function. Crit Rev
Neurobiol 9:383-94
162. Roldan A, Gogg S, Ferrini M, Schillaci R, de Nicola AF. 1997. Glucocorticoid
regulation of in vitro astrocyte phagocytosis. Biocell. Apr;21(1):83-9.
163. Rolls ET. 2000. Memory systems in the brain. Annu Rev Psychol 51: 599-630.
90
164. Rozovsky I, Laping NJ, Krohn K, Teter B, O'Callaghan JP, Finch CE. 1995.
Transcriptional regulation of glial fibrillary acidic protein by corticosterone in rat
astrocytes in vitro is influenced by the duration of time in culture and by
astrocyte-neuron interactions. Endocrinology. May; 136(5):2066-73.
165. Savvas IN, Graham M, Williams J, Aspley S, Mardsen CA, Beckett SRG. 2000.
Strain differences to the effects of aversive frequency ultrasound on behavior
and brain topography of c-fos expression in the rat. Brain Res 854: 158-164.
166. Serra M, Pisu MG, Littera M, Papi G, Sanna E, Tuveri F, Usala L, Purdy RH,
Biggio G. 2000. Social isolation-induced decreases in both the abundance of
neuroactive steroids and GABA(A) receptor function in rat brain. J Neurochem.
Aug; 75(2):732-40.
167. Serra M, Pisu MG, Floris I, Floris S, Cannas E, Mossa A, Trapani G, Latrofa A,
Purdy RH, Biggio G. 2004. Social isolation increases the response of peripheral
benzodiazepine receptors in the rat. Neurochem Int. Jul;45(1):141-8.
168. Shimada K, Mukai Y. 1998. Studies on neurosteroids. VII. Determination of
pregnenolone and its 3-stearate in rat brains using high-performance liquid
chomatography-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry.
J Chomatogr Biomed Sci Appl 7:14-15
169. Shimada K, Yago K. 2000. Studies on neurosteroids X. Determination of
pregnenolone and dehydroepiandrosterone in rat brains using gas
chomatography-mass spectrometry-mass spectrometry. J Chomatogr Sci.
Jan;38(1):6-10.
170. Shirayama Y, Muneoka KT, Iwata M, Ishida H, Hazama G, Kawahara R. 2005.
Pregnenolone and dehydroepiandrosterone administration in neonatal rats alters
the immunoreactivity of hippocampal synapsin I, neuropeptide Y and glial
fibrillary acidic protein at post-puberty. Neuroscience.; 133(1):147-57.
91
171. Singh VB, Kalimi M, Phan TH, Boadle-Biber MC. 1994. Intracranial
dehydroepiandrosterone blocks the activation of tryptophan hydroxylase in
response to acute sound stress. Mol Cell Neurosci. Apr;5(2):176-81.
172. Streit WJ, Walter SA, Pennel NA. 1999. Reactive Microgliosis. Progress in
Neurobiology 57; 563-81.
173. Takeda H, Tsuji M, Matsumiya T. 1998. Changes in head-dipping behavior in the
hole-board test reflect the anxiogenic and/or anxiolytic state in mice. Eur J
Pharmacol 350: 21-9.
174. Tanaka J, Fujita H, Matsuda S, Toku K, Sakanaka M, Maeda N. 1997.
Glucocorticoid- and mineralocorticoid receptors in microglial cells: the two
receptors mediate differential effects of corticosteroids. Glia. May;20(1):23-37.
175. Tomas-Camardiel M, Sanchez-Hidalgo MC, Sanchez Del Pino MJ, Navarro A,
Machado A, Cano J. 2002. Comparative study of the neuroprotective effect of
dehydroepiandrosterone and 17beta-estradiol against 1-methyl-4-
phenylpyridium toxicity on rat striatum. Neuroscience.;109(3):569-84.
176. Tomasevic G, Kamme F, Wieloch T. 1998. Changes in proliferating cell nuclear
antigen, a protein involved in DNA repair, in vulnerable hippocampal neurons
following global cerebral ischemia. Mol Brain Res 60: 168-176.
177. Torres JM, Ortega E. 2003. DHEA, PREG and their sulphate derivatives on
plasma and brain after CRH and ACTH administration. Neurochem Res.
Aug;28(8):1187-91.
178. Torrey EF, Yolken RH. 1998. Is household crowding a risk factor for
schizophenia?. Schizoph Res 29: 12-13.
179. Tranque PA, Suarez I, Olmos G, Fernandez B, Garcia-Segura LM. 1987.
Estradiol-inducede redistribution of glial fibrillary acidic protein immunoreactivity
in the rat brain. Brain Res 406: 348.
92
180. Tsuji M, Takeda H, Matsumiya T. 2000. Different effects of 5-HT1A receptor
agonists and benzodiazepine anxiolytics on the emotional state of naive and
stressed mice: a study using the hole-board test. Psychopharmacology (Berl)
152: 157-66.
181. Tunez I, Munoz MC, Montilla P. 2005. Treatment with Dehydroepiandrosterone
Prevents Oxidative Stress Induced by 3-Nitropropionic Acid in Synaptosomes.
Pharmacology. Feb 28;74(3):113-118.
182. Vallee M, Rivera JD, Koob GF, Purdy RH, Fitzgerald RL. 2000. Quantification of
neurosteroids in rat plasma and brain following swim stress and
allopregnanolone administration using negative chemical ionization gas
chomatography/mass spectrometry. Anal Biochem. Dec 1; 287(1):153-66.
183. Van Raaij MT, Dobbe CJ, Elvers B, Timmerman A, Schenk E, Oortigiesen M,
Wiegant VM. 1997. Hormonal status and neuroendocrine response to a novel
heterotypic stressor involving subchonic noise exposure. Neuroendocrinology
65: 200-209.
184. Veiga S, Garcia-Segura LM, Azcoitia I. 2003. Neuroprotection by the steroids
pregnenolone and dehydroepiandrosterone is mediated by the enzyme
aromatase. J Neurobiol. Sep 15;56(4):398-406.
185. Virgin CE Jr, Ha TP, Packan DR, Tombaugh GC, Yang SH, Horner HC,
Sapolsky RM. 1991. Glucocorticoids inhibit glucose transport and glutamate
uptake in hippocampal astrocytes: implications for glucocorticoid neurotoxicity. J
Neurochem. Oct;57(4):1422-8.
186. Wang CC, Wu CH, Sheih JY, Wen CY, Ling EA. 1998 Efects of dexamethasone
on antigen expressions and proliferation of ameboid microglial cells in fetal rat
brain. J Hirnforsh 39: 207-16
93
187. Wang MJ, Huang HM, Chen HL, Kuo JS, Jeng KC. 2001.
Dehydroepiandrosterone inhibits lipopolysaccharide-induced nitric oxide
production in Bv-2 microglia. J Neurochem. May;77(3):830-8.
188. Wang W, Ji P, Riopelle RJ, Dow KE. 2002. Functional expression of
corticotropin-releasing hormone (CRH) receptor 1 in cultured rat microglia. J
Neurochem. Jan;80(2):287-94.
189. Weibel ER. 1979. Stereological methods for biological morphometry: Vol. 1:
Practical Methods for Biological Morphometry. London: Academic Press.
190. West MJ. 1999. Stereological methods for estimating the total number of
neurons ond synapses: issues of precision and bias. TINS 22: 51-61.
191. Wolf OT, Kudielka BM, Hellhammer DH, Hellhammer J, Kirschbaum C. 1998.
Opposing effects of DHEA replacement in elderly subjects on declarative
memory and attention after exposure to a laboratory stressor.
Psychoneuroendocrinology. Aug;23 (6):617
192. Wu F, Gibbs TT, Farb DH. 1990. Inverse modulation of gamma-aminobutyric
acid and glycine-induced currents by progesterone. Mol. Pharmacol. 37: 597.
193. Wu F, Gibbs TT, Farb DH. 1991. Pregnenolone sulfate: a positive allosteric
modulator at the N-methyl-D-aspartate receptor. Mol Pharmacol 40:333.
194. Yamamoto T, Yamanaka T, Matsunaga T. 1998. Effects of the neurosteroid
dehydroepiandrosterone sulfate on medial vestibular nucleus neurons. Acta
Otolaryngol (Stockh) 118:185.
195. Yang NC, Jeng KC, Ho WM, Chou SJ, Hu ML. 2000. DHEA inhibits cell growth
and induces apoptosis in BV-2 cells and the effects are inversely associated with
glucose concentration in the medium. J Steroid Biochem Mol Biol. Dec 15; 75(2-
3):159-66.
94
196. Zilles K, Hajos F, Kalman M, Schleicher A. 1991. Mapping of glial fibrillary acidic
protein immunoreactivity in the rat, forebrebrain and mesencephalon by
computerized image analysis. J Comp Neurol 308: 340-355.
197. Zwain IH, Yen SS. 1999. Dehydroepiandrosterone: biosynthesis and metabolism
in the brain. Endocrinology. Feb; 140(2):880-7.
198. Zwain IH, Yen SS. 1999. Neurosteroidogenesis in astrocytes, oligodendrocytes,
and neurons of cerebral cortex of rat brain. Endocrinology. Aug; 140(8):3843-52.
95