Inhoudsopgave

1 Introductie 3

2 Methodes 62.1 Celkweek en passaging-methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.2 Western Blot Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.3 PCR-methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.4 ELISA-methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

3 Resultaten 193.1 Celculturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193.2 Resultaten Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 203.3 Resultaten PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213.4 Resultaten ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

4 Discussie 27

5 Referenties 30

1

Epigenetic manipulation of the

inflammatory response of brain

macrophages

I. Beijert A. Brandsma M. Coenen M. EkkelE. Jutten H. Luiting F. van der Wal*

Y. Von Brucken FockMentor: H. Boddeke

Department of Neuroscience, section: Medical Physiology

*f.van.der.wal.4@student.rug.nl

Mentor group number: 3

Samenvatting

Microglia are brain macrophages which maintain brain homeostasis.Upon brain damage or infection microglia are activated and induce inflam-mation. Pro-inflammatory activation of microglia is mediated by epigene-tic processes. Most likely histone modification, particularly acetylation iscrucially involved. Histones are acetylated by histone acetylases (HATs)and deacetylated by histone deacetylases (HDACs). Recent research hasshown that HDAC inhibitors suppress the inflammatory effect of macrop-hages. Therefore, it could be that microglia are influenced likewise. Pos-sibly this anti-inflammatory mechanism could be of therapeutic relevancefor neurodegenerative diseases such as Alzheimers disease. As a measurefor pro-inflammatory microglia activation in vitro, the production of cyto-kines interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor α (TNF- α ) has beenused. Pro-inflammatory activation was induced in mouse microglia andthe mouse microglia cell line BV2 by the bacterial cell wall componentlipopolysaccharide (LPS; 100 ng/ml). HDAC inhibition was induced bytreatment with trichostatin-A (TSA; 30 nM). PCR was used to measurecytokine production at RNA level and ELISA measurements were doneto determine cytokine release. LPS induced a pro-inflammatory cytokine(IL-6 and TNF-α) production at RNA and protein level in both microgliaand BV2 cells. This effect was inhibited by pretreatment with HDACinhibitor (TSA). The results clearly show that the HDAC inhibitor TSAinhibits pro-inflammatory activation of microglia. Future experiments areneeded to investigate whether a similar effect is found in vivo. This wouldmake HDAC inhibitors possibly applicable for further clinical research.

2

1 Introductie

Het zenuwstelsel van het menselijk lichaam wordt onderverdeeld in het centralezenuwstelsel en het perifere zenuwstelsel. Gezamenlijk bestaat dit uit meerdan honderd miljard zenuwcellen, ook wel neuronen genoemd. Het centrale ze-nuwstelsel bestaat uit de hersenen en het ruggenmerg, waarin de neuronen (dezenuwcellen) worden ondersteund door zogenoemde gliacellen. Alle gliacellentezamen worden ook wel de neuroglia genoemd. De gliacellen ondersteunen deneuronen zowel metabool als mechanisch en kunnen een rol spelen bij de impul-soverdracht. Het aantal gliacellen is tien keer groter dan het aantal neuronen.De neuroglia zijn onder te verdelen in astrocyten, oligodendrocyten, microgliaen ependymcellen. Astrocyten spelen een rol bij de voeding van neuronen, zeprolifereren bij beschadiging van het zenuwstelsel (waarbij ze de lege ruimtesopvullen) en groeifactoren. Daarnaast hebben ze nog vele andere regulerendefuncties en ze kunnen onderverdeeld worden in fibreuze astrocyten, voorkomendin de witte stof en protoplasmatische astrocyten, met allerlei vertakte, korte uit-lopers. Op figuur 1 zijn fibreuze astrocyten te zien en op figuur 2, afbeeldingB protoplasmatische astrocyten, waarbij het pijltje wijst naar het hersenopper-vlak.

Figuur 1: Fibreuze astrocyten

Figuur 2: Protoplasmatische astrocyten, microgliacellen en oligodendrocyten

Oligodendrocyten zijn cellen die minder vaak voorkomen dan astrocyten. Zezijn kleiner dan astrocyten en ze zijn minder vertakt. Ze liggen in rijen tussenaxonbundels en dienen als isolatiemateriaal. Ze vormen myelineschedes doordat

3

uitlopers van de oligodendrocyten zich om de axonen wikkelen. Op figuur 2,afbeelding D zijn enkele oligodendrocyten zichtbaar. De microgliacellen (figuur2, afbeelding C) zijn kleine cellen met een ovale kern en kleine uitlopers die heren der verspreid in het centrale zenuwstelsel aanwezig zijn. Ze bevatten tal-rijke lysosomen en op het moment dat er celverval is ronden zij zich af, wordenbeweeglijk en gaan fagocyteren (opeten). Ze ruimen degenerende cellen op, enze scheiden ook allerlei ontstekingsmediatoren uit, zoals proteasen, cytokinen,chemokinen en oxidatieve radicalen.1 De microgliacellen zijn dus eigenlijk deafweercellen van het centrale zenuwstelsel. Activatie van macrofagen zoals demicrogliacellen kan leiden tot de productie van allerlei pro-inflammatoire enzy-men en afweereiwitten, die kunnen leiden tot chronische inflammatoire ziektes,zo liet een studie door Duitse onderzoekers zien dat microglia een rol spelen bijde ziekte van Alzheimer. 2

Microgliacelactivatie is over het algemeen ongungstig voor het hersenweefsel.De microgliacel kan ervoor kiezen om de zenuwcel te repareren of om de zenuwcelte doden en te fagocyteren. Bij het laatste komen er ontstekingsmediatoren vrijdie het weefsel rondom kunnen beschadigen. Dat is in hersenweefsel natuurlijkgeen gewenst gevolg. Een voorbeeld van een ongewenst gevolg is, zoals genoemd,de ziekte van Alzheimer.

Verminderen van deze ontsteking zou dus wellicht een positief effect kunnenhebben op neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer.

DNA in de chromosomen is gecondenseerd, het zit strak in elkaar gewikkeld.Een chromosoom is eigenlijk een DNA-molecuul in een verpakking die tiendui-zend keer kleiner is dan de oorspronkelijke DNA-lengte. Het gecondenseerdeDNA zit weer gewikkeld om nucleosomen, die weer uit histoneiwitten bestaan.Er ontstaat als het ware een kralenkettingstructuur. De histoneiwitten hebbenuiteinden die naar buiten gericht zijn. Als deze gemethyleerd worden (histonme-thylering), wordt de chromatine gecondenseerd. Gevolg is dat het DNA wordtuitgeschakeld.3

Histonacetylering is het proces waarbij een acetyl groep afsplitst van eenacetyl-CoA intermediair en vervolgens bindt aan de histonstaarten. Deze reac-tie wordt gekatalyseerd door de HATS, histon-acetyltransferases. Die bindingenzorgen als het ware voor een gerelaxeerde structuur van het chromatine en datzorgt voor een verhoogde binding van transcriptiefactoren aan DNA uit de kernen het verhoogt de kans op transcriptie. Deacetylering is het verwijderen vandeze acetylgroepen en dit wordt dan ook gedaan door HDACs. Dit verlaagtdus de transcriptie van bepaalde fragmenten DNA. De HDACs van zoogdie-ren worden onderverdeeld in klasse I, II en III HDACs.4 Figuur 3 geeft eenvereenvoudigde weergave van deze processen.

4

Figuur 3: HDACs en HATS

Remming van deze HDACs (door middel van HDAC-remmers als sodiumbutylaat, benzamides en cyclische peptides) zorgt voor een een toename van ge-hyperacetyleerde nucleosomen in de meeste gebieden van het chromosoom, maarheeft slechts effect op een kleine subset van die genen. Het zorgt dus voor eentranscriptionele activatie van een aantal genen , maar zorgt daarbij voor onder-drukking van een gelijk of zelfs hoger aantal andere genen.5 De transcriptie zoudus af kunnen nemen door deze HDAC-remmers. Als gevolg daarvan zouden erminder cytokines geproduceerd kunnen worden waarna er dus een minder heftigeontstekingsreactie ontstaat. Dit effect is waargenomen in perifere macrofagen.6

In ons onderzoek bekijken we het effect van deze HDAC-remmers in microg-liacellen en onderzoeken we of de ontsteking afneemt door toediening van dezeHDAC-remmers.

5

2 Methodes

2.1 Celkweek en passaging-methode

Er worden in dit onderzoek gebruik gemaakt van cellen van het muizenbrein.De hersenen worden geısoleerd, fijngesneden en in suspensie gebracht. Eenprotease verbreekt hierbij de weefselverbindingen tussen de cellen. Zo krijgje individuele microglia cellen. Door het mengsel door een spuit te persen,wordt de suspensie gefilterd. Hierbij worden de microglia gescheiden van hetcelafval. Er worden twee soorten cellen gekweekt: microgliacellen en een reservelijn die lijkt op macrofagen. De cellen worden in een medium gebracht. Ditmedium is een voedingsbodem voor de cellen, want de cellen hebben voedingnodig om te kunnen profileren. Een medium bestaat uit een basaal en een meergespecialiseerd medium dat geschikt is voor bepaalde type cellen.

Het basale medium is ongeveer gelijk aan de interstitiele vloeistof omdatcellen hier goed in groeien. Het bevat onder andere de volgende componenten:

• Natriumchloride

• Aminozuren

• Suikers

• Vitaminen

• Groeifactoren

Het meer gespecialiseerde medium is een DMEM 30-2006 (Dulbeccos modi-fied eagles medium) compositie. Deze DMEM compositie bevat:

• 2,5 mM L-glutamine

• 15 mM HEPES

• 0,5 mM natriumperuviaat

• 1200 mg/L natrium bicarbonaat

De 30-2002 DMEM bevat:

• 4 mM L-glutamine

• 4500 mg/L glucose

• 1 mM natriumperuviaat

• 1500 mg/L natrium bicarbonaat

Het bicarbonaat wordt gebruikt als buffer omdat bicarbonaat de voornaamstebuffer in ons lichaam is. Dit is om de pH constant te houden. De pH heeft in-vloed op het celmetabolisme, eiwitsynthese en groei. De bicarbonaatbuffer gaatvolgens de onderstaande reactie:

HCO−3 +H+ ←→ H2CO3 ←→ CO2 +H20

6

Naast DMEM wordt een serum toegevoegd. Dit is een foetaal kalf serum (FCS).Dit serum voorziet het medium van groeifactoren en het blokkeert trypsine bijhet kweken. Trypsine is niet gunstig voor de cellen omdat het eiwitten afbreekt.

Om de pH van het serum goed in de gaten te houden, wordt een indicatortoegevoegd. Deze is van nature roze/oranje bij een pH van 7,0. Wanneer denutrienten door de cellen worden opgenomen, daalt de pH en wordt het mediumgeel. Het medium moet dan vervangen worden. Ook kan de indicator naarroze/paars en dit betekent dat het serum alkalisch is geworden. De cellen gaandan dood.

Zodra de cellen geısoleerd zijn, wordt er alleen nog gewerkt in een zoge-naamde flowkast, zie figuur 4. Hierin wordt steriele lucht geblazen zodat even-tuele verontreinigingen niet bij de celkweek kunnen komen. Voordat er in deflowkast gewerkt kan worden, moet alles worden gereinigd met 70% ethanol, ofdoor een vlam worden ontsmet.

Figuur 4: Flowkast

De celsuspensie wordt verspreid in een T-75 fles (zie figuur 5) waarin de cellengoed kunnen groeien in het medium. Een T-75 fles is een 75 cm2 grote kweekflesmet een dop.

Figuur 5: T-75 fles

Elke dag moet het medium worden vervangen, anders wordt het zuur. Dit wordtgedaan met een afzuigpipet. Hiermee zuig je het oude medium op, en breng jeeen nieuw medium aan. De cellen groeien in een incubator (zie figuur 6) bij 37graden Celsius, 5,0% CO2 en 100% luchtvochtigheid. Er wordt gewacht tot er80% confluentie is ontstaan. Dit houdt in dat het oppervlak voor 80% met cellenis bedekt. Dit is te zien onder de microscoop. De cellen moeten dan wordenverdeeld over nieuwe T-75 flessen, omdat er anders contactinhibitie optreedt en

7

de cellen doodgaan.

Figuur 6: Incubator

Het verdelen van de cellen over nieuwe flesjes wordt gedaan door eerst weer hetmedium eruit te zuigen afzuigpipet. Vervolgens wordt een bufferoplossing in deT-75 flessen ingespoten en een trypsine oplossing die verdund is met PBS enEDTA.

De trypsine wordt gebruikt om dode celresten en eiwitten te verwijderen. DePBS maakt cellen schoon en EDTA is een stof die calciumionen bindt. Dit alleszorgt ervoor dat de microgliacellen loslaten van de bodem van de T-75 fles. Deoverige cellen blijven vastzitten. Daarna worden de microgliacellen overgebrachtin zogenaamde Wells. Deze Wells worden dan in de incubator worden gezet ende cellen kunnen gaan groeien.

2.2 Western Blot Methode

Bij de Western Blot methode wordt aan de hand van bijvoorbeeld eiwitgewichten lading specifieke eiwitten gedetecteerd, hetzij semi-kwantitatief. Dit procesvindt plaats in een aantal stappen.

Vernietiging van celwandAls eerste wordt de celwand vernietigd door middel van een techniek waarbij ul-trasone geluidsgolven het membraan van de cel stukmaken. Hierdoor komen deeiwitten uit de cel vrij. Ze worden als het ware stuk geschud. Vervolgens vindter een proces plaats waardoor de eiwitten uit hun oorspronkelijke 3D-structuurworden geknipt en op deze manier geprepareerd worden om de geleiding in degel mogelijk te maken.

Isolatie van eiwittenDe eiwitten worden geısoleerd uit het mengsel door middel van gel elektroforese,waarbij ze gescheiden kunnen worden door een verschil bijvoorbeeld molecu-laire grootte, elektrische lading of een combinatie van deze factoren, waarbij dithoofdzakelijk gebeurt door een verschil in moleculaire grootte. In ons geval ge-bruiken we polyacrylamide gels en buffers met natriumdodecylsulfaat, waarbij inacht genomen moet worden dat de eiwitten reeds zijn behandeld waardoor secun-daire en tertiaire structuren verdwenen zijn. De polyacrylamide gel zorgt ervoordat de eiwitten gedenatureerd blijven dus niet terugvallen in hun 3D-structuur.Ze worden vervolgens bedekt in het negatief geladen natriumdodecylsulfaat en

8

zullen vervolgens richting de positief geladen elektrode migreren. Kleinere, duslichtere eiwitten doen dit sneller, waardoor er een scheiding ontstaat op basisvan grootte en gewicht. Bij de gel elektroforese verplaatsen de eiwitten zichnaar de positieve pool, die onderaan zit, waar dus de negatief geladen molecu-len naartoe migreren. Hoe groter het molecuul, des te trager dit gaat. Deze gelbestaat uit de standaard acrylamidegel en de stacking gel. Deze stacking gel isbedoeld om de monsters mooi uit de slotjes te laten komen. Samenstellingenvan deze gel:

Acrylamide pH=8,8 Acrylamide pH=6,8Acrylamide 40% 4,7 ml 1,3 ml1,5M Tris HCL, pH 8,8 of 6,8 3,1 ml 2,5 mlWater 4,6 ml 6,1 ml10% SDS 0,1 ml 0,1 mlAPS 10% 62,5 µl 50 µlTEMED 6,25 µl 10 µl

Wanneer de gel basis is gemaakt, wordt de gel in een reservoir met bufferop-lossing gelegd, zie figuur 7. Ter hoogte van de negatieve pool wordt het mengselvan eiwitten dat gescheiden moet worden geınjecteerd, waarna er een spanningwordt aangelegd. In figuur 7 zijn deze zichtbaar als groene streepjes. Als je despanning in het reservoir laag laat, zullen de snelste moleculen zich volledig ba-nen door de gel. De eiwitoplossing is gekleurd en daardoor is zichtbaar waar desnelste eiwitten zich bevinden. De kleurstof is kleiner dan de kleinste eiwittenen zal daardoor als eerste aankomen bij de positieve zijde.

Figuur 7: De gel wordt in een reservoir met bufferoplossing geplaatst

9

In totaal zijn er 8 slotjes gebruikt, hieronder de verdeling:

Laan Inhoud1 Leeg2 Eiwitmarker3 Controlegroep primaire microglia4 Primaire microglia + HDAC-remmers5 Controlegroep cellijn microglia6 Cellijn microglia + HDAC-remmers7 Controlegroep cellijn macrofagen8 Cellijn macrofagen + HDAC-remmers

Vervolgens worden er verscheidene stoffen gebruikt om de moleculen zichtbaarte maken. De gescheiden eiwitten worden van de gel overgebracht op een ni-trocellulosemembraan waar ze aanhechten, dit wordt blotten genoemd. Hieraanworden gelabelde specifieke antilichamen toegevoegd zodat je kunt zien wanneerze aan het juiste eiwit gebonden zijn. Zie figuur 8.

Figuur 8: Western Blot transfer van scheidingsgel naar nitrocellulosemembraan.

Aflezen van de Western BlotIn ons onderzoek wordt resultaat gemeten aan incubatie van het western blotmet een substraat dat reageert met een enzym dat is gebonden aan een se-cundair antilichaam. Deze zijn fluorescent gelabeld. In ons onderzoek zoekenwij naar de Acetyl-H3 groep. Als deze dus gebonden wordt door een primairantilichaam en dit primaire antilichaam vervolgens gebonden wordt aan een se-cundair antilichaam met fluorescente eigenschappen zal dit eiwit oplichten bijdetectie door een fotosensor. Er zal dan een streep zichtbaar zijn op de WesternBlot en aan de hand van de eiwitmarker kun je het gewicht aflezen en daarmeehet soort eiwit, zie figuur 9.

10

Figuur 9: Voorbeeld van een Western Blot. Links is de eiwitmarker te zien, aande hand van deze marker zou je kunnen vaststellen of er een eiwit aanwezig isen in welke hoeveelheid.

2.3 PCR-methode

Toepassingen PCRPolymerase chain reaction (PRC) wordt gebruikt om vele kopieen te maken vanDNA. Het multificeren van het DNA kan verschillende doeleinden hebben, zoalshet aantonen van een stuk DNA of mRNA.

Werking PCRBij PCR wordt er DNA polymerase gebruikt om DNA templates te kopieren.Door herhaling van dit proces kunnen grote hoeveelheden van DNA gesynthe-tiseerd worden. De polymerase wordt begeleid door primers die binden aan hetbegin en einde van het te kopieren DNA. De primers zorgen voor het 3′ en 5′

begin voor de DNA polymerase zodat de replicatie kan beginnen. De nucleotidevolgorde van het begin en eind moeten bekend zijn om de benodigde primers teproduceren. Bij elke ronde van replicatie worden dubbel strengs DNA onafhan-kelijk gerepliceerd. Na vele rondes is het DNA exponentieel toegenomen, vaakloopt het aantal op tot in de miljoenen. PCR is zo gevoelig dat zelfs met eenenkele DNA streng dit proces mogelijk is.

Voorbereiding CellenBij een PCR zijn er cellen nodig om te onderzoeken. Deze cellen moeten nauw-keurig voorbereid worden. Voor het onderzoek zijn er BV2 cellen gebruikt. Ditis een cellijn die zeer lijkt op microgliacellen, maar verkorte uitlopers hebben.Dit onderzoek heeft 10 groepen die op verschillende manier zijn behandeld:

• 2x BV2

• 2x BV2 + LPS

• 2x BV2 + TSA

• 2x BV2 + LPS + TSA

• 2x Water

11

LPS is een stofje dat zeer lijkt op een bacteriewand en hierdoor een niet-specifieke afweerreactie veroorzaakt. TSA is een HDAC remmer. We verwachtendat deze de afweerreactie remt. Om te zorgen dat het DNA zich exponentieelkan vermeerden is er een PCR master mix noodzakelijk. Deze master mix bevatalle stoffen en enzymen om deze vermeerdering mogelijk te maken zodra hetproces van PCR wordt gestart. De master mix bestaat uit het volgende, aanelke groep wordt eenmaal deze mix toegevoegd.

• 2.5 µl 10x PCR buffer

• 1.5 µl 25 mM MgCl2

• 1.5 µ 10 µM primer mix (IL-6 en TNF-α)

• 0,25 µl 10 mM dNTPs

• 0.05 µl 5 U/µl Taq DNA polymerase

• 19.2 µl water

De totale mix heeft een volume van 25 µl. In totaal worden 5x een master mixgevormd met de IL-6 primer en 5x met een TNF–α primer. Op deze manierwordt er op verschillende manieren gekeken of de afweerreactie ook daadwer-kelijk plaatsvindt. Uiteindelijk worden dus de volgende mixen gevormd die ge-bruikt kunnen worden voor PCR door toevoeging van 1 µl van de verschillendeBV2 mixen:

• BV2 + MM (IL-6)

• BV2 + MM (IL-6) + LPS

• BV2 + MM (IL-6) + TSA

• BV2 + MM (IL-6) + LPS + TSA

• MM (IL-6) + Water

• BV2 + MM (TNF-α)

• BV2 + MM (TNF-α) + LPS

• BV2 + MM (TNF-α) + TSA

• BV2 + MM (TNF-α) + LPS + TSA

• MM (TNF-α) + Water

Na deze voorbereiding van de cellen kan vervolgens de voorbereiding van dePCR gestart worden.

Isolatie RNA

Stap 1: openbreken van de cel:Om de inhoud van de cel vrij te laten komen moet eerst de cel kapot wordengemaakt. Dit gaat door middel van ultrasone geluidgolven die het membraan

12

van de cel stukmaken, dit heet sonificatie. Door gedurende vijf seconde ultra-sone trillingen de oplossing in te sturen, wordt het celmembraan en daarmee decel kapot getrild.

Stap 2: Scheiden van celrestenDoor de oplossing te centrifugeren worden alle niet oplosbare zware deeltjes naarbeneden getrokken terwijl de oplosbare deeltjes en lichtere niet oplosbare deel-tjes blijven drijven. De waterige oplossing bevat het DNA, mRNA en eiwitten.Deze laag wordt gebruikt voor de volgende stappen.

Stap 3: Verwijderen EiwittenDe eiwitten worden gescheiden van het DNA en mRNA door middel van eenfenol, chloroform en isoamyl oplossing toe te voegen. DNA zal wederom in dewaterige oplossing blijven met het mRNA, terwijl de eiwitten neerslaan.

Stap 4: mRNA isoleren

Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)In dit onderzoek wordt gekeken naar de invloed van HDAC remmers op de aan-maak van cytokinen door Microgliacellen. De hoeveelheid cytokinen die wordengeproduceerd door Microgliacellen moet dus worden gemeten. In dit onderzoekzijn het aantal mRNA moleculen die voor cytokinen coderen in de cel gemeten.Eerst zijn de mRNA moleculen geısoleerd en daarna is er gekeken hoeveel vandeze mRNA moleculen die voor cytokinen coderen er aanwezig. De techniekdie hiervoor gebruikt is wordt reverse transcription polymerase chain reactiongenoemd.

Reverse TranscriptionHet mRNA molecuul is geısoleerd uit de cel. Dit mRNA molecuul moet nuworden omgeschreven tot complementary DNA (cDNA).

Stap 1: Hybridiseren met poly (t) primerAan het mRNA wordt een kleine oligonucleotide toegevoegd, die complementairis aan de poly-A staartaan het 3′ eind van het mRNA. Deze bindt aan de poly-A-staart. Deze kan vervolgens werken als primer voor het reverse transcriptase.

Stap 2: Maken van DNA-kopie van het RNA door middel van re-verse transcriptaseVanaf de primer wordt nu door reverse transcriptase een complementaire DNAstreng aan de RNA streng gebonden. Zo wordt er door het reverse transcriptaseeen DNA/RNA helix gevormd.

Stap 3: Bewerken van het RNA met RNase HEr wordt RNase H toegevoerd aan de DNA/RNA helix. Deze zorgt ervoor dater gaten ontstaan in het RNA molecuul. Er worden steeds meer stukjes RNAweggehaald, totdat er een enkelstreng DNA molecuul overblijft. De stukjes over-gebleven RNA op het DNA molecuul kunnen dienen als primer voor het DNAtranscriptase.

13

Stap 4: Synthetiseren van een complementaire DNA streng met be-hulp van DNA polymerase; RNA-fragmenten fungeren als primer.Door DNA polymerase wordt er langs de DNA streng een complementaire DNAstreng gemaakt. Dit zorgt ervoor dat er een dsDNA molecuul ontstaat. Metdit dsDNA molecuul kan PCR worden uitgevoerd. We zijn nu van een mRNAmolecuul naar een dsDNA molecuul gegaan. Dit wordt reverse transcriptasegenoemd.

Polymerase chain reactieHet dsDNA wordt vermenigvuldigd. Hier wordt gebruik gemaakt van de PCRtechniek.

Stap 1: Heat to separate strandsHet dsDNA moet eerst uit elkaar gaan zodat er 2 enkelstrengs DNA molecu-len ontstaan. Dit wordt bereikt door het dsDNA molecuul te verhitten tot 95graden Celsius. Dit zorgt ervoor dat de waterstofbruggen tussen de twee DNAstengs worden verbroken zodat er twee enkelstrengs DNA moleculen ontstaan.

Stap 2: Hybridization of primersNadat de strengen zijn gescheiden, wordt het DNA afgekoeld. Dit gebeurt in deaanwezigheid van een overschot aan twee primer DNA oligonucleotiden. Dezeprimers binden vervolgens aan complementaire gebieden van de twee DNA sten-gen.

Stap 3: DNA synthese vanaf de primerAan de mix van DNA en primers wordt DNA polymerase en de vier desoxy-ribosenucleoside trifosfaten toegevoerd. Dit zorgt ervoor dat er DNA wordtgesynthetiseerd, vanaf de twee primers.

De uitkomst is dus dat je van 1 dsDNA molecuul 2 dsDNA moleculen hebtgemaakt. Als de 3 stappen zijn verlopen kan de cyclus weer opnieuw beginnenbij stap 1. Bij de tweede cyclus wordt er uit 2 dsDNA moleculen 4 dsDNAmoleculen gemaakt. Bij de derde cyclus uit 4 dsDNA moleculen 8 dsDNA mo-leculen, etcetera.

In figuur 10 is te zien dat door de primers op een bepaalde plaats te latenhybridiseren, je kunt bepalen welk gedeelte van het DNA molecuul je wilt latendupliceren.

Aflezen resultaten PCRWanneer de PCR is voltooid moeten de resultaten nog afgelezen worden. Ditwordt gedaan door middel van elektroforese. De samples worden in wellengeınjecteerd van een agarose gel die in TAE is gekookt. Het doel van de elek-troforese is het scheiden van het DNA naar grootte. Hoe groter het DNA, hoemoeilijker het is om door de gel te bewegen. DNA is negatief geladen en zaldus naar het positieve punt worden getrokken. Daarnaast wordt er ook eenreferentie sample toegevoegd om af te kunnen lezen hoe groot de stukjes DNAzijn. Omdat het DNA niet zichtbaar is voor het oog, wordt er ook een oranjekleurstof aan elke sample toegevoegd zodat men kan zien of het sample ookjuist is geınjecteerd in de wel. Nadat de gel met de samples in een bad heeft

14

gelegen voor 45 minuten op 80 V wordt de gel uit het bad verwijderd en ineen ultraviolette scanner gelegd (Bio-rad). Op deze manier kan de intensiteitworden afgelezen van de bandjes DNA die zijn ontstaan en kunnen er conclusiesgevormd worden (zie figuur 11).

Figuur 10: PCR-methode

˙

15

Figuur 11: Gel elektroforese

2.4 ELISA-methode

In ons onderzoek gebruiken we ELISA voor het detecteren van de cytokines inhet medium waarin de cellen hebben gezeten. ELISA is een test waarbij macro-moleculaire stoffen zoals eiwitten kunnen worden gemeten waarbij we uitgaanvan het binden van antigeen aan antistoffen. In ons onderzoek beschikken weover een microtiterplaat waarin reeds een laag met ‘captured antibody′ aange-bracht was. In de wells willen we aantonen dat er cytokines geproduceerd zijnen dan wel in meer of mindere mate. We hebben de cellen uit de cellijn BV2 opvier verschillende methoden geprepareerd: er zijn niet behandelde cellen, metLPS behandelde cellen, met TSA behandelde cellen en cellen die behandeld zijnmet zowel TSA als LPS. Deze cellen hebben we vervolgens gefiltreerd en deoplossing die overbleef bevatte dus geen cellen meer maar bestond enkel uit hetmedium met daarin de eventueel vrijgekomen cytokines.

Overzicht van de microtiterplaat

TNF–α (pg/ml) CTRL LPS TSA TSA+LPS IL-6 (pg/ml)500 500250 250125 12562.5 62.531.3 31.315.6 15.60 0

Van de cytokines die we onderzoeken hebben we in de te onderzoeken wells

16

100 µl medium in de wells gepipetteerd. In ons onderzoek gebruikten we desandwich ELISA methode, die uit een aantal stappen bestaat.

• Eerst worden de wells gecoat met een antilichaam dat bindt aan de an-tistoffen die in de wells worden toegevoegd. In ons geval betreffen dezeantistoffen dus de stoffen TNF–α en IL-6, die in het medium worden toe-gevoegd aan de wells. Zie figuur 12.

Figuur 12: Capture antibody

• Deze antistoffen kunnen binden aan de antilichamen waarmee de plaatreeds gecoat is, waarna de plaat gewassen wordt. Zie figuur 13.

Figuur 13: Binden van antistoffen

• Een volgend specifiek antilichaam wordt toegevoegd, dit bindt aan hetantigeen of in ons geval de stofjes waar we naar op zoek zijn: TNF- α enIL-6. Dit verklaart de naam sandwich Elisa, waarbij de antistoffen als hetware tussen een sandwich (twee antilichamen) liggen Zie figuur 14.

Figuur 14: De sandwich structuur

• Vervolgens worden er secundaire antilichamen toegevoegd die aan het con-stante gedeelte van de antilichamen binden die als laatste toegevoegd zijn.Dit zijn enzym-gelinkte antilichamen. Dit is te zien als het donkergroenebolletje in figuur 15.

• De plaat wordt opnieuw gewassen zodat de ongebonden antilichaam-enzymenverwijderd worden.

17

Figuur 15: Toevoegen van secundaire antilichamen

• Vervolgens wordt er een chemische stof toegevoegd die omgezet wordt doorhet enzym dat aan het secundaire antilichaam vastzit, wat zorgt voor eenkleur, fluorescente of chemisch signaal. Zie figuur 16.

Figuur 16: Omzetten van chemische stof

De resultaten die uit ons onderzoek naar voren komen kunnen we aflezen middelseen fluorescence microplate reader. Dit apparaat meet de hoeveel cytokines inpicogrammen aan de hand van de totale fluorescentie die te zien is in de wells.Een voorbeeld van een dergelijke microplaatlezer is te zien in figuur 17.

Figuur 17: Microplaatlezer

18

3 Resultaten

3.1 Celculturen

In figuur 18 zijn onze verschillende celculturen weergegeven. Boven: de primairevorm van microgliacellen, hoewel deze cellen niet zo geramificeerd zijn als in hetbrein hebben deze cellen in kweek kleine uitlopers. Midden: Gekweekte vormvan microgliacellen, deze cellen zijn lijken op de primaire vorm van microgllia,maar hebben minder uitlopers. Onder: Macrofagen, deze cellen hebben eenvergelijkbare functie in het lichaam als microgliacellen in het brein. Deze cellenhebben een afgeronde vorm en dienen als controle van het onderzoek.

Figuur 18: Celculturen van microgliacellen en macrofagen, 100x vergroot ondereen Zeiss Axioskop 40 lichtmicroscoop, waarbij een 10x objectief gebruikt is.

19

3.2 Resultaten Western Blot

Western blot analyse van H3 acetylering in microglia cellen

Figuur 19: Resultaten Western Blot

Bij deze Western blot experimenten is gebruik gemaakt van primair gekweektemuizen microglia, RAW cellen (een muizen macrofaag cellijn) en BV2 cellen(een muizen microglia cellijn). Deze cellen zijn deels voorbehandeld met TSA(30nM). Na isolatie zijn de eiwitfracties op gel gebracht en na de electroforesegemarkeerd met een antilichaam tegen acetyl H3. Zoals al in de methode om-schrijving is beschreven, zullen alleen de bandjes op het membraan die acetylH3 bevatten een fluorescent signaal afgeven.

Primaire microglia cellen:Op de Western blot is te zien dat voor de controlegroep cellen, die niet zijnbehandeld met TSA, geen Acetyl H3 bandje te zien is. Dit betekent dat de H3histonen niet geacetyleerd zijn. Bij de microglia cellen die wel behandeld zijnmet TSA (30 nM) is wel een bandje te zien. Dit betekent dat deze histonen welgeacetyleerd zijn.

Microglia cellijn (BV2 cellen):Op de Western Blot is te zien dat de controlegroep, die niet is behandeld metTSA, een licht Acetyl H3 bandje te zien is. Dit bandje valt echter in het niet

20

bij het bandje van de behandelde groep, en dus is de controlegroep veel mindergeacetyleerd. Bij de microglial cellijn die wel behandeld is met TSA is wel eenbandje te zien. Dit betekent dat deze histonen wel geacetyleerd zijn.

Macrophage celline (RAW):Op de Western Blot is te zien dat de controlegroep, die niet is behandeld metTSA, een licht Acetyl H3 bandje te zien is. Dit bandje is echter veel lichter danhet bandje van de behandelde groep, en dus is de controlegroep veel mindergeacetyleerd. Bij de macrofaag cellijn die wel behandeld is met TSA is wel eenbandje te zien. Dit betekent dat deze histonen wel geacetyleerd zijn. De TotalH3 (17 kDa) is dezelfde Western Blot, maar dit keer gekleurd met een antili-chaam voor H3 histonen. Dit is onder de H3 Acetyl Western Blot gezet om aante geven hoeveel H3 histonen er in het proteıne isolaat zitten.

3.3 Resultaten PCR

Cytokine transcriptie in primair gekweekte microglia: IL-6

Figuur 20: Cytokine transcriptie in primair gekweekte microglia: IL-6

Bij de controlegroep van de primair gekweekte microglia is te zien dat zonderbehandeling er geen transcriptie plaats vindt van IL-6 mRNA. Er is dan ooknauwelijks een bandje zichtbaar op het blot.

In de grafiek in figuur 20 is duidelijk zichtbaar dat vier uur behandeling metLPS (dosis) zorgt voor een grote verandering in het transcriptie level. Er is indeze vier uur na de behandeling dus heel veel IL-6 mRNA aangemaakt. Ookop het blot is dit goed te zien. Het bandje van LPS is heel licht en intens, watduidelijk maakt dat behandeling met LPS aanzet tot IL-6 mRNA stimulatie.

Wanneer de cellen worden behandeld met TSA gebeurt er niks, er vindt geenstimulatie van IL-6 plaats. Ook dit is te zien op het blot, het bandje is weernauwelijks zichtbaar en staat gelijk aan het bandje van de controlegroep waarook geen stimulatie van IL-6 MRNA plaats vond.

Bij voorbehandeling van TSA en daarna behandeling met LPS (TSA+LPS)is te zien dat TSA het effect van IL-6 sterk onderdrukt. Er vindt wel transcrip-tie plaats van IL-6 mRNA maar veel minder dan wanneer er alleen behandeld

21

wordt met LPS. Er is een licht bandje te zien.

Cytokine transcriptie in de primair gekweekte microglia: TNF- α

Figuur 21: Cytokine transcriptie in de primair gekweekte microglia: TNF-α

Bij de controlegroep van de primair gekweekte microglia in figuur 21 is te ziendat er zonder behandeling geen transcriptie plaats vindt van TNF-α mRNA.Er is dan ook nauwelijks een bandje zichtbaar op het blot. In de grafiek is hetduidelijk zichtbaar dat vier uur behandeling met LPS zorgt voor een grote ver-andering in het transcriptie level. Er is in deze vier uur na de behandeling dusheel veel TNF-α mRNA aangemaakt. Ook op het blot is dit goed te zien. Hetbandje van LPS is heel licht en intens, wat duidelijk maakt dat behandeling metLPS aanzet tot TNF-α mRNA stimulatie. Echter vindt er wel minder stimulatieplaats van TNF-α mRNA in verhouding tot IL-6 mRNA.

Wanneer de cellen worden behandeld met TSA gebeurt er niets, er vindtgeen stimulatie van TNF-α plaats. Ook dit is te zien op het blot, het bandje isnauwelijks zichtbaar en staat gelijk aan het bandje van de controlegroep waarook geen stimulatie van TNF-α MRNA plaats vond.

Bij voorbehandeling van TSA en daarna behandeling met LPS (TSA+LPS)is te zien dat TSA het effect van TNF-α onderdrukt. Er vindt wel transcriptieplaats van TNF-α mRNA maar veel minder dan wanneer er alleen behandeldwordt met LPS. Echter in verhouding met de afname van de transcriptie vanIL-6 bij TSA+LPS is de afname van de transcriptie van TNF-α hier wel minder.

Cytokine transcript profile in Microglial cell line (BV2): IL-6In deze grafiek (figuur 22) is te zien dat bij de transcriptie van IL-6 mRNAin BV2 cellen hetzelfde gebeurt als bij de transcriptie van IL-6 mRNA in deprimary microglial cultures. Echter is alles wel ietwat minder ‘sterk′. Er vindtminder transcriptie plaats van IL-6 mRNA bij stimulering met LPS in BV2 cel-len dan in de primary microglial cultures en ook is de afname van de transcriptiedoor TSA+LPS in verhouding minder bij de BV2 cellen.

22

Figuur 22: Cytokine transcript profile in Microglial cell line (BV2): IL-6

Cytokine transcript profile in Microglial cell line (BV2): TNF- α

Figuur 23: Cytokine transcript profile in Microglial cell line (BV2): TNF-α

In deze grafiek in figuur 23 is te zien dat bij de transcriptie van TNF-α mRNAin BV2 cellen hetzelfde gebeurt als bij de transcriptie van TNF-α mRNA in deprimary microglial cultures. Echter is alles hier ook ietwat minder ‘sterk′. Ervindt minder transcriptie plaats van TNF-α mRNA bij stimulering met LPS inBV2 cellen dan in de primary microglial cultures en ook is de afname van detranscriptie door TSA+LPS in verhouding minder bij de BV2 cellen.

23

3.4 Resultaten ELISA

In figuur 24 wordt in twee diagrammen de resultaten van de ELISA weergegeven.Links worden van LPS gestimuleerde primary microglial cultures de effecten vanTSA op de productie van TNF-α weergegeven. Het rechterdiagram geeft dezeeffecten weer op de productie van IL-6.

Figuur 24: Effect van TSA op LPS gemedieerde pro-inflammatoire vrijlating inprimaire microglia kweek

In de controlegroep van de primary microglial cultures is te zien dat er nauwelijksTNF-α geproduceerd is. Het aantal TNF-α pg/ml ligt bij de 0. Hetzelfde geldtvoor IL-6. In de controle groepen zijn dus geen cytokines gevormd door decellen.

Het medium van de cellen die gestimuleerd waren met LPS bevatte zeer veelcytokines. In ons experiment is 5000 Pg/ml TNFα geproduceerd en 240 Pg/mlIl-6.

Cellen die enkel gestimuleerd zijn met TSA hebben geen TNF-α of IL-6geproduceerd. Beide grafieken laten geen staaf zien en dit betekent 0 Pg/mlTNF-α en IL-6.

Wanneer de cellen gestimuleerd zijn met zowel LPS als TSA is er wel TNF-αgevormd, namelijk ongeveer 500 Pg/ml. Dit is sterk verminderd ten opzichtevan de cellen die enkel met LPS zijn gestimuleerd. Daar is de geproduceerdehoeveelheid TNF-α ongeveer 5000 Pg/ml.

Wanneer we kijken naar de geproduceerde hoeveelheid IL-6 zien we hetzelfde.Er is wel degelijk IL-6 gevormd, namelijk 80 Pg/ml, tegenover 240 Pg/ml Il-6wanneer de cellen enkel zijn gestimuleerd met LPS en geen TSA toegediendhebben gekregen.

Als we kijken naar de productie van TNF-α is het verschil tussen de cellengestimuleerd met LPS en die met LPS en TSA groter dan wanneer we dit ver-

24

schil bekijken bij de productie van IL-6. Uit bovenstaande grafieken blijkt dathet blootstellen van primary microglial cultures aan LPS de productie van deontstekingsmediatoren TNF-α en IL-6 stimuleert. De productie van deze ont-stekingsmediatoren werd geremd door de toediening van TSA. Dit remmendeeffect werd sterker waargenomen bij de productie van TNF-α. De twee diagram-

Figuur 25: Het effect van TSA op LPS gemedieerde pro inflammatoire vrijlatingin microglia cel lijn BV2

men in figuur 25 laten de resultaten zien van de ELISA in de microglial cell lineBV2. Links worden van LPS gestimuleerde cellen de effecten van TSA op deproductie van TNF-α weergegeven. Het rechterdiagram geeft deze effecten weerop de productie van IL-6.

De resultaten in de microglial cell line BV2 laten hetzelfde patroon zien alsde resultaten van de ELISA van de primary microglial cultures.

In de controlegroep, waarbij geen LPS of TSA werd toegediend, is een kleinehoeveelheid TNF-α geproduceerd. Deze hoeveelheid is zeer klein en ligt dichtbijde 0 Pg/ml. Productie van de cytokine Il-6 werd helemaal niet waargenomen.Wanneer de cellen werden gestimuleerd met LPS had dit een sterk effect op decytokine productie. 7900 Pg/ml TNF-α werd gevormd en 525 Pg/ml IL-6.

Stimulatie van de cellen met enkel TSA had geen effect op de productie vanzowel TNF-α en IL-6. Beide grafieken laten waarden zien van 0 Pg/ml.

Cellen gestimuleerd met LPS en TSA produceerden 3500 Pg/ml TNF-α. Ditis meer dan de helft minder dan wanneer zij niet waren gestimuleerd met TSA.

Het verschil hierin bij de productie van IL-6 is groter. Cellen die enkelgestimuleerd waren met LPS produceerden 530 Pg/ml Il-6 tegenover 80 Pg/mlIl-6 wanneer zij zowel met LPS als met TSA waren gestimuleerd.

Uit deze grafieken kunnen we concluderen dat het blootstellen van microglialcell line BV2 aan LPS de productie van de ontstekingsmediatoren TNF-α enIL-6 stimuleert. Het toedienen van TSA aan deze cellen remt deze productie vanmediatoren wel degelijk. De productie van IL-6 wordt hierbij meer gereduceerddan de productie van TNF-α. Uit beide experimenten, zowel het experimentmet de primary microglial cultures als het experiment met de microglial cellline BV2, blijkt dat TSA een remmende werking heeft op de productie vande ontstekingsmediatoren TNF-alpha en IL-6 van cellen die gestimuleerd zijnmet LPS. Bij de primary microglial cultures is deze remmende werking op de

25

productie van TNF-α sterker dan bij de productie van IL-6. Bij de microglialcell line BV2 waren de uitkomsten juist andersom. Hierbij werd de productievan IL-6 juist meer geremd door het TSA dan de productie van TNF-α.

26

4 Discussie

Microglia zijn de cellen die in ons onderzoek centraal stonden. Deze cellen zijnde macrofagen van de hersenen. Zodra er lichaamsvreemde stoffen hun micromi-lieu binnenkomen ronden ze zich af en gaan ze de indringers te lijf door middelvan fagocytose. De uitlopers van de microglia trekken zich dan in en als ercellen defect zijn kiezen zij ervoor om deze te regenereren of degenereren. Mi-crogliacellen lijken zoals gezegd op macrofagen, dus ze scheiden bij deze reactiecytokines uit. Echter, hersenweefsel dat aangetast wordt door de ontsteking dievolgt op de activatie van de microgliacellen regenereert moeilijk. Zo krijg jedus al snel een reactie die uiteindelijk voor meer schade zorgt dan het geval zouzijn als er geen cytokines zouden worden uitgescheiden. Bij neurodegeneratieveziekten zoals Alzheimer is dit het geval. Neuronen raken hierbij beschadigd doorde cytokines die worden uitgescheiden, waarna men vergeetachtig kan worden,persoonlijkheidsveranderingen kan doormaken of er verlies van spraak optreedt.7

HDACs (histone-deacetylases) zijn enzymen die een rol spelen bij het ver-wijderen van acetylgroepen van histonstaarten. Dit proces heet deacetylering.Dit zorgt voor een verlaagde transcriptie van bepaalde fragmenten DNA. Uitonderzoek is gebleken dat het remmen van deze HDACs kan zorgen voor eenverminderde productie van cytokines, waarna er een minder heftige ontstekings-reactie ontstaat. Dit lijkt enigszins tegenstrijdig, want op het moment dat deHDACs geremd worden, gaat de transcriptie van fragmenten DNA omhoog. Ge-voelsmatig lijkt het dan logisch dat de productie van cytokines door de cel ookomhoog gaat. Echter, door deze verhoogde transcriptie kunnen er ook factorenextra worden geproduceerd die juist de aanmaak van cytokines remmen, waar-door er per saldo toch een lagere uitscheiding van cytokines mogelijk is. In onsonderzoek bekijken we het effect van deze HDAC-remmers op microgliacellen enkijken we of de ontsteking afneemt door toediening van deze HDAC-remmers.

Het onderzoek is opgedeeld in een aantal stappen. Voor het detecteren vaneiwitten, mRNA en cytokines hebben we drie verschillende methodes gebruikt.Daarvoor hadden we verschillende cellijnen nodig. Eenvoudig gezegd haddenwe de beschikking over drie celculturen:

• Primaire microglia

• Cellijn microglia (BV2)

• Cellijn macrofagen (RAW)

Bij de Western Blot methode waren we op zoek naar de acetyl-H3 (histon 3)groep in deze cellijnen. Al deze celtypes hebben we zowel behandeld als nietbehandeld met HDAC-remmers. Wat we verwachten te zien, was dat er acety-lering optreedt in de cellen die behandeld zijn met de HDAC-remmers, omdatdaar de deacetylering wordt geremd. De Western Blot-methode wordt gebruiktom eiwitten op eiwitgewicht en lading te selecteren en is dus geschikt om dezeacetylgroepen te detecteren.

Vervolgens hebben we door middel van de RT-PCR techniek gekeken of erook mRNA werd aangemaakt voor cytokines op het moment dat cellen werdenvoorbehandeld met LPS, en of deze cytokineaanmaak ook onderdrukt werd als ereen HDAC-remmer als TSA werd toegevoegd. Hierbij is specifiek gekeken naarmRNA van de cytokines IL-6 en TNF-α en de transcriptie van de cytokines in

27

de primaire microglia en de microglia cellijn (BV2). Bij deze methode hebbenwe dus de transcriptie van cytokines op mRNA-niveau in kaart gebracht.

Bij de derde methode, de ELISA, hebben we daadwerkelijk gekeken naarde eiwitten, te weten TNF-α en IL-6, die uitgescheiden waren in het mediumvan de primaire microglia en de BV2 cellijn. Met deze methode, een zogehetensandwich-methode, is het mogelijk cytokines zoals TNF-α en IL-6 te detecterendoor middel van antilichamen die binden aan de betreffende cytokines.

Mochten al deze drie methodes erop wijzen dat een HDAC-remmer alsTrichostatin-A zorgt voor..

• Een verhoogde histonacetylering in microglia

• Lagere hoeveelheden mRNA voor cytokines in geactiveerde microglia

• Lagere hoeveelheden cytokines uitgescheiden door geactiveerde microglia

.. dan is het dus aannemelijk dat een HDAC-remmer als Trichostatin-A deaanmaak van cytokines als IL-6 en TNF- onderdrukt. Zoals in de resultaten tezien is, is dit ook het geval.

Helaas is bij ons onderzoek de macrofagencellijn verloren gegaan. In deWestern Blot hebben we nog gebruik gemaakt van deze cellijn, maar de RT-PCR en de ELISA hebben we enkel met de primaire microglia cultuur en demicroglia cellijn uitgevoerd. Dit gaf ons de verwachte resultaten, maar dezekonden we helaas niet vergelijken met de RAW-lijn.

Uit het onderzoek zijn geen resultaten die afwijken van onze verwachtingennaar voren gekomen. Uit de onderzoeksmethodes is gebleken dat (voorbehan-delde) cellen na stimulatie met LPS verhoogde hoeveelheden cytokines uitschei-den en dat dit na toediening van TSA (drastisch) verminderd is.

De methodes Western Blot, RT-PCR en ELISA hebben we slechts een keeruitgevoerd. We hebben alle experimenten wel gedaan met verschillende cellijnen,maar het zou misschien kunnen dat de resultaten die wij hebben verkregen uitons onderzoek met de cellijn microglia BV2 voor een andere cellijn microgliaanders zijn. Daarvoor hadden we dus meerdere cellijnen kunnen gebruiken.

Statistisch gezien hadden we beter elk experiment een X aantal keer kunnendoen en vervolgens bekijken of de resultaten met elkaar overeenkomen. Toch zijnde resultaten wel overtuigend, aangezien uit elke methode blijkt dat er gebeurtwat wij verwacht hadden.

De cytokines die in onze methodes werden gedetecteerd (of het mRNA daar-van) waren de cytokines IL-6 en TNF-α. Van deze cytokines werd de aanmaakonderdrukt. Maar dit zijn niet de enige cytokines die uitgescheiden worden doormicroglia, sterker nog, er worden talloze cytokines uitgescheiden door microg-lia die wij niet mee hebben genomen in ons onderzoek. Cytokines die wordenuitgescheiden door microglia, die we in ons onderzoek niet meegenomen hebbenen waar we in een vervolgonderzoek eventueel naar zouden kunnen zoeken zijn:IL-3, IL-6, IL-8. IP-10, MCP-1, MDC, MIP-2, RANTES, TNF-β, MIP-3-β,etcetera.8 Dat de aanmaak van IL-6 en TNF-α wordt onderdrukt wil nog nietmeteen zeggen dat de aanmaak van al die andere cytokines ook wordt onder-drukt. Dit zou dus een goede reden voor vervolgonderzoek kunnen zijn.

De HDAC-remmer in ons onderzoek betrof TSA, oftewel Trichostatin-A.Dit is slechts een HDAC-remmer, terwijl er meerdere selectieve HDAC-remmersbeschreven worden in de literatuur. Wat neurodegeneratieve ziekten betreft

28

is het aantal remmers wat gelimiteerd. Inderdaad is TSA (trichostatin-A) demeest gebruikte HDAC-remmer in experimenten, maar het is niet de enige.Andere HDAC-inhibitors zijn SD (sodium butyrate), PB (phenyl butyrate),VPA (valproınezuur) en vorinostat, die allen bekend staan om het vermogenom de bloed-hersenbarriere te penetreren.9 In vervolgonderzoeken zou je dusnaast TSA ook deze HDAC-remmers kunnen gebruiken.

Daarbij hebben we getest met microglia die uit muizenhersenen afkomstigzijn. De vraag is of deze microglia dezelfde eigenschappen hebben als microgliauit onze hersenen. Stel dat de HDAC-remmers een heel ander effect op mensen-hersenen hebben, is ons onderzoek dan nog wel zo representatief? Je zou dusvervolgonderzoek kunnen doen met menselijke microglia en indien je daar soort-gelijke resultaten vindt als in dit onderzoek heeft dat meer betekenis voor debestrijding van neurondegeneratieve ziekten. Of dit ethisch gezien een haalbareoptie is, is een tweede.

Verder wordt er nu enkel gekeken naar microglia in vitro. Hoewel ze welin condities worden gehouden die ervoor zorgen dat ze kunnen overleven endie daarmee wel wat overeenkomsten vertonen als in vivo, zou dit onderzoekrepresentatiever zijn als het onderzoek werkelijk gedaan wordt in vivo. In dehersenen bindt bijvoorbeeld het isoquinoline PK11195 aan de bindingsplaatsPBBS op microglia, maar alleen indien deze microglia geactiveerd zijn, dus nietals deze in ruste zijn. Als dit PK11195 gelabeld wordt met koolstof-11, kun jedoor middel van beeldvormende technieken als PET inflammatoire en neurode-generatieve ziekten in kaart brengen. 10 Door middel van deze of soortgelijketechnieken zou je wellicht de aanmaak en uitscheiding van cytokines in vivo inkaart kunnen brengen, eerst op niveau van proefdieren en later, als dat mogelijkis, in mensen.

29

5 Referenties

1. L.C. Junqueira en J. Carneiro, Functionele Histologie, elfde druk, 2010:hoofdstuk 9: zenuwweefsel.

2. Lev Osherovich, Managing microglia in Alzheimers, april 2010, online ge-publiceerd

3. Alberts et al., Essential Cell Biology, 3e druk, 2010: hoofdstuk 5: DNAand Chromosomes en hoofdstuk 8: Control of Gene Expression

4. N. Sengupta en E. Seto, Regulation of histone deacetylase activities, sep-tember 2004. Uit Journal of Cellular Biochemistry

5. D.M. Vigushin en R.C. Coombes, Targeted histone deacetylase inhibitionfor cancer therapy, maart 2004. Uit Current Cancer Drug Targets

6. W. Chong et Al, Anti-inflammatory properties of histone deacetylase in-hibitors: a mechanistic study, februari 2012

7. Internationale stichting Alzheimer onderzoek, http://www.alzheimer.nl,Symptomen van Alzheimer

8. U.K. Hanisch et al. Glia, Microglia as a source and target of cytokines,oktober 2002

9. E. Hahnen et al., Histone deacetylase inhibitors: possible implications forneurodegenerative disorders, 2008

10. R.B. Banati, Visualising microglial activation in vivo, november 2002

30