egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése
-
Upload
denton-mcdowell -
Category
Documents
-
view
40 -
download
1
description
Transcript of egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése
![Page 1: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/1.jpg)
A genotípus megváltozása nem mindig vezet a funkció (fenotípus) megváltozásához (silent=csendes mutációk, mutáció nem kódoló régióban)
A mutáció lehet: káros, semleges, előnyös
egy vagy néhány bázis:- cseréje- kiesése- beékelődése
A genotoxicitás szintjei
Kromoszóma típusú mutációk (szerkezeti, számbeli változás)
Pontmutációk
frame-shift, leolvasási keret eltolódása
silent, missense, nonsense
![Page 2: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/2.jpg)
- a mutagén fizikai vagy kémiai ágens, mely növeli a mutációk képződésének gyakoriságát
- indukált mutáció a mutagének által okozott változások a genetikai állományban
- a halálozások oka a civilizált világban 40%-ban rákos daganat
- a rákos megbetegedések közel 90%-át a környezetünket szennyező mutagének okozzák
- a mutagén vegyületek nagy része rákkeltő (karcinogén) is !!!!!!!!!!!!
- évente néhány ezer olyan vegyületet állítanak elő, amelyek korábban nem léteztek a Földön (gyógyszer alapanyagok, növény- vagy faanyagvédő szerek, élelmiszer-adalék, kozmetikum, háztartási vegyszer stb.)
- a mutagének és a karcinogének közötti szoros kapcsolat szükségessé teszi a környezetünkben lévő mutagén vegyületek kimutatását
Mutagén – Karcinogén
![Page 3: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/3.jpg)
okai :
- a bázisok alternatív formái (keto/enol, amino/imino tautomerizáció)
- a replikáció során a szálak elcsúszása következtében kisméretű inszerciók és deléciók keletkezése
- a DNS szerkezeti változásai (depurináció és deamináció, amelyek a bázisok párosodási tulajdonságait változtatják meg)
Spontán mutációk
![Page 4: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/4.jpg)
Normál bázispárosodás(keto és amino formák)
A citozin imino formája adeninnel, a timin enol formája pedig guaninnel képes H-híd kialakítására.
Az adenin imino formája citozinnal, a guanin enol formája pedig timinnel képes H-híd kialakítására.
A párosodási hiba a replikáció során az újonnan szintetizált szálban megmarad és állandósul
Tautomerizáció
![Page 5: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/5.jpg)
Indukált mutációk
külső okokból származó mutációk
vegyszerek számos módon okozhatnak mutációkat:
- bázis analógok a DNS-be beépülnek, de nem a megfelelő bázissal párosodnak
- alkiláló, deamináló szerek, oxidáló anyagok a DNS bázisok szerkezetét és párosodási tulajdonságait megváltoztatják
- interkaláló szerek a bázisok közé ékelődnek és nukleotid inszerciót vagy deléciót okoznak
![Page 6: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/6.jpg)
pl.
5-brómuracil (5BU) timin analógadeninnel és guaninnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz T-A>5BU-A>5BU-G>C-GC-G>5BU-G>5BU-A>T-A
2-aminopurin (2AP) adenin analóga timinen kívül citozinnal is (!) képes párosodnitranziciót okozT-A>T-2AP>C-2AP>C-G C-G>C-2AP>T-2AP>T-A
Bázis analógok
a természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz a kettős spirálba beépíti
![Page 7: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/7.jpg)
pl.etil-metánszulfonát (EMS)
főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja
a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez
a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre
Alkiláló szerek
alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják
![Page 8: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/8.jpg)
pl.salétromossava citozint, az adenint és a guanint támadja
citozin uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranziciót okoz
adenin hipoxantin, ami citozinnal párosodva T-A > C-G tranziciót eredményez
guanin xantin, ez elsősorban citozinnal, de kisebb mértékben timinnel is párosodva C-G > T-A tranziciót hoz létre
hidroxilamina citozin amino csoportját támadja, és hidroxilaminocitozin keletkezését okozzaa hidroxilaminocitozin adeninnel párosodik, és C-G > T-A tranziciót okoz
Deamináló szerek
a spontán deamináción kívül különböző vegyszerek is képesek a bázisok amin csoportjait támadni
![Page 9: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/9.jpg)
- általában gyűrűs vegyületek, melyek térkitöltése a bázispárokhoz hasonlít- a DNS kettős spirálban egymás melletti bázispár közé képesek beépülni- a beépülés a kettős spirál alakját torzítja, ami azután a replikáció során egy nukleotidkiesését vagy beépülést okozza
pl.proflavinakridin sárgaetidium-bromiddioxin
Interkaláló vegyületek
![Page 10: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/10.jpg)
többféle, nemzetközileg elfogadott tesztrendszer:
• bakteriális tesztek (Salmonella typhimurium, Esherichia coli)
• eukarióta egysejtűek (pl. Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans)élesztőgomba penészgomba
• rovarok (ecetmuslica Drosophila melanogaster)
• növények (lóbab, árpa, vöröshagyma)
• gerincessejt-vonalak (humán és egyéb emlős sejtvonalak)
• in vivo (egér, hörcsög, patkány)
A genotoxicitás mérése
![Page 11: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/11.jpg)
Alternatív = in vitro genotoxicitási tesztek
- állatkísérletek számának csökkentése
- gyors (short term study)
- költséghatékony
Végpontok:
• pontmutáció
• DNS törés
• repair (DNS szintézis NEM az S fázisban)
• kromoszóma aberrációk
![Page 12: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/12.jpg)
- a fajok nemzedékről nemzedékre mutatott állandósága arra utal, hogy a mutációk bekövetkezése ritka esemény
- a valóságban azonban a megfigyelhetőnél jóval több mutáció keletkezik
- mivel leggyakoribbak a recesszív mutációk, a legtöbb új mutáció észlelését a dominancia megakadályozza
- az új mutációk észlelése ezért a legegyszerűbb a haploid szervezetekben- diploidokban a mutációk kimutatására speciális rendszerek szükségesek
- a mutációk gyakorisága alacsony, ezért mutánsokat nagy egyedszámú populációból kell tudni kimutatni
Mutációk detektálása
![Page 13: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/13.jpg)
Bakteriális reverz mutagenitási teszt
Kidolgozója, Bruce Ames után AMES teszt
Validált (OECD Guideline 471)
Pontmutációk észlelésére alkalmas
Salmonella typhimurium
apatogén, mutáns törzseinek használatán alapul
his- mutánsainak reverzióját figyelik a tesztelendő vegyületek hatására
his-Hisztidin bioszintézisére képtelen
Csak hisztidint tartalmazó tápközegben életképes
his+Hisztidint szintetizál
Hisztidinmentes tápközegben életképes
Reverzió = back mutáció
Nagy populációban bekövetkező ritka mutációs esemény detektálására alkalmas
![Page 14: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/14.jpg)
phosphoribosyl pyrophosphate
Hisztidin bioszintézis
![Page 15: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/15.jpg)
A teszttörzsek jellegzetességei
Különböző típusú his mutációkat tartalmaznak, ezért a mutáció reverziója történhet:• bázispár szubsztitúcióval• frame-shift segítségével különböző hatásmechanizmusú mutagén vegyületek mutathatók ki, azaz információt nyújt agenotoxikus anyagok által előidézett mutációk típusáról
A tesztelő törzsek hibásak az:
excíziós repairben uvr (érzékenyebb kimutatás, epigenetikus ártalmak)
LPS kialakításában rfa (lipopoliszacharid bioszintézis, sejtfelszín), a vizsgálandó anyag könnyebben jut be a sejtbe a sejtfalon át
![Page 16: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/16.jpg)
Salmonella baktériumok által képzett telepek
![Page 17: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/17.jpg)
A kísérlet kivitelezése I.
S9 – patkány májából készült enzimkivonatS9-et adagolva modellezni lehet az emlősökben lezajló enzimatikus reakciókat, így a bakteriális
géntoxikológiai tesztekből következtethetünk a szennyezőanyagok magasabb rendű szervezetekre gyakorolt hatására
![Page 18: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/18.jpg)
A kísérlet kivitelezése II.
![Page 19: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/19.jpg)
Egy vegyületre akkor mondjuk, hogy Ames-tesztben nem mutagén, amennyiben legalább 4 törzsön – TA98, TA100, TA1535, TA97 és/vagy TA1537 – bizonyította önmagában vagy S-9-es aktiválás utáni hatástalanságát.
Egyetlen törzsön mért pozitív teszt esetén is mutagén a minősítés.
Az eredmények értékelése
![Page 20: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/20.jpg)
Továbbfejlesztett Ames teszt
96 lukú mikrotitráló lemezen6 törzzsel (TAMix) végezhető egyszerre
pH indikátor festék a tápközegben (brómkrezol lila)
A hisztidinmentes tápközegben szaporodó (revertált) baktériumok savasítják a tápközeget
![Page 21: egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése](https://reader035.fdocuments.net/reader035/viewer/2022062408/5681368e550346895d9e1835/html5/thumbnails/21.jpg)
RadarScreen
Saccharomyces cerevisiae
Transzgenikus élesztőtörzs:
DNS fragmentációra aktiválódó promoter+riporter gén