Effekte von Stress durch Sojabohnenmehl im Futter auf das

Immunsystem von Regenbogenforellen

Dr. med. vet. Henrike Seibel

BLE gefördertesDrittmittelprojekt

Etablierung von chronischen Stressparametern auf mRNA Basis

aus Vollblut zur Tierwohleinschätzung bei Regenbogenforellen

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Erzeugung von Stress über Fütterung von nativen Sojabohnenmehl in steigenden Anteilen

Definition von Stress“… unspezifische Reaktion des Körpers auf jegliche Anforderung.” (Selye, 1973)

Stressorz.B.

Organismus

Reaktion

Äußere Anforderungsbedingung,

in deren Folge es zur Auslösung einer

Stressreaktion kommt

„… Zustand, in dem die körpereigene Homöostase bedroht ist, bzw. angenommen wird, dass sie bedroht ist.“ (Chrousos, 1998)

3

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Angeborenes Immunsystem(Entzündung, Abwehr)

Insult / NekrosePathogen „Gefahr“

„Pattern“ Erkennung

Antigen

Adaptives Immunsystem(Immunantwort, klonale

Expansion)

„Fremd“ Erkennung

Reparatur Immunität

Secombes et al. 2001; Tort et al. 2003; Lieschke und Trede 2009; Bayne und Gerwick 2001 u.v.m.

ZytokinKostimulation

Zytokine, T-ZellenAntikörper

Komplement

Kein Stress Geringer Stress Mittlerer Stress Hochgradiger Stress

Austausch des Fischmehlanteils (50% in Basaldiät) durch SBM:

0 % 33 % 66 % 100 %

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Fütterungsexperiment mit Sojabohnenmehl (SBM) - Modell für Fütterungsstress -

Anteil von SBM in der Ration:

0 % 16 % 33 % 50 %

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isonitrogene und isoenergetische Diät; energierestriktiv (Pellets)

Diät CD [%] SBM16 [%] SBM33 [%] SBM50 [%]Fischmehl 50,00 33,50 17,00 0,00Blutmehl 5,00 5,00 5,00 5,00Gelantine 3,00 3,00 3,00 3,00Sojabohnenmehl 0,00 16,40 33,00 50,00Erbsenprotein Isolate 6,50 6,50 6,50 6,50Weizengluten 7,00 10,59 14,05 17,25Weizenstärke 19,50 15,00 10,55 5,50Fischöl 8,00 8,55 9,05 10,03Vit / Mineralien 0,50 0,50 0,50 0,50

Bentonit 0,00 0,47 0,85 1,22

Calciumhydrogenphosphat 0,5 0,5 0,5 0,5Biolys 0,00 0,00 0,00 0,50

Fütterungsexperiment mit Sojabohnenmehl (SBM)- Futterformulierung -

CD = Kontrollgruppe

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Bedeutung Sojabohnenmehl in der Fischernährung

Produkte aus Sojabohnen (Glycine max L.) zurzeit am weitesten verbreitete Alternative für das kostenintensive Fischmehl

hoher Proteingehalt (44-48 %) niedriger Preis hohe Produktverfügbarkeit

Hoher Anteil an antinutritiven Faktoren (ANF), wie z.B. Saponine, Lectine, Phytinsäure

Alexis 1990; Chou et al. 2004; Merrifield et al. 2011

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“Entzündungs-Modell” Soja

Austausch von Fischmehl durch natives SBM resultiert in Entzündungen des hinteren Darmabschnitts bei Salmoniden

Bakke-McKellep et al. 2000; Krogdahl et al. 2000; Knudsen et al. 2007; Francis et al. 2001; Merrifield et al. 2011

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“Entzündungs-Modell” Soja

Austausch von Fischmehl durch SBM resultiert in Entzündungen des hinteren Darmabschnitts bei Salmoniden

Histologisch findet sich bspw.: Entzündungszellen Verkürzung der Darmzotten Verlust der supranukleären Vakuolisierung

Endozytose wird geblockt

Bakke-McKellep et al. 2000; Krogdahl et al. 2000; Knudsen et al. 2007; Francis et al. 2001; Merrifield et al. 2011

A normal B

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“Entzündungs-Modell” Soja

Austausch von Fischmehl durch SBM resultiert in Entzündungen des hinteren Darmabschnitts bei Salmoniden

Histologisch findet sich bspw.: Verlust der supranukleären Vakuolisierung Verkürzung der Darmzotten Vermehrung der Becherzellen

Endozytose wird geblockt

Durch diverse schädigende Auswirkungen der ANFs Immunsuppression mit erhöhten Risiko für Sekundärinfektionen

Was finden wir bei den Forellen?

Bakke-McKellep et al. 2000; Krogdahl et al. 2000; Knudsen et al. 2007; Francis et al. 2001; Merrifield et al. 2011

nach 4 Wochen

nach 8 Wochen

Cortisol und Kondition

V0 InitialbeprobungCD KontrolldiätSBM Sojabohnenmehl16, 33, 50 Anteile SBM

Scheinbar konnte Stress durch SBM Verwendung erzeugt werden

Signifikanter Abfall im Wachstum bei 50%SBM (SGR 0,44 ± 0,21 %*d-1)

Nach 8 Wochen scheinbar weniger Cortisol bei 16%SBM als in

Kontrollgruppe

0

5

10

15

20

25

30

35

Cor

tisol

[ng/

mL]

Durchfall

Durchfall

V0 CD 16% SBM 33% SBM 50% SBM

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Durchfall

Molekularbiologie

Fluidigm Biomark HD-Systemund Aria MX qPCR System

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Verschiedene Immun- und Entzündungsmarker, Gene der akuten Phase Reaktion und andere „Marker-Gene“auf mRNA Expressionsunterschiede zwischen den Gruppen getestet

Toll like Rezeptoren

(versch.)

NOS2

SAA

SOD1

TCRB

PSMB7

IL1b, IL4, 6, 10,12, 22

MAPK Pathway

Gene

MPO

C3, C5, C7FGL2

Forellen spez. CC

und viele mehr!

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„Eine entzündliche Reaktion ist die charakteristische Manifestation des angeborenen

Immunsystems“ (Lieschke und Trede 2009)

Angeborenes Immunsystem(Entzündung, Abwehr)

Insult

„Pattern“ Erkennung

Reparatur

ZytokinKostimulation

Komplement

Toll-Like-RezeptorenMAP3K1

g-Typ Lyozym

MyeloperoxidaseSerum Amyloid A

Adaptives Immunsystem(Immunantwort, klonale

Expansion)

Immunglobulin MZytokine, T-Zellen

Antikörper

Uncoupling Protein 2

14

Entzündungsparameter (Bsp.)

p=0,029

Myeloperoxidase (MPO) Wichtiges Enzym von

neutrophilen Granulozyten Reguliert Entzündungsreaktionen

p=0,079

Serum Amyloid A (SAA) Bestandteil der Akuten Phase

Reaktion Rekrutiert Immunzellen

Fazit: keine Entzündung in 16%SBM Gruppe

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p=0,073

Lysozym g-Typ 1 (LYG1) Von Monozyten und

Makrophagen sezerniert Direkte antibakterielle Wirkung Fungiert als Akute-Phase Protein

MAP-Kinase (MAP3K) Signaltransduktionsweg Beteiligt an Zelldifferentierung,

Zellwachstum und Apoptose

Fazit: „aktiviertes“ angeborenes Immunsystem bei 16% SBM

p=0,040

Angeborenes Immunsystem

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Toll Like Rezeptor 3 Erkennt Pathogen-assoziierte

Moleküle (PAMPs) Induziert angeborene Immunantwort

p=0,014

Angeborenes Immunsystem

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Adaptives Immunsystem

Immunglobulin M (IgM) Erster Antikörper bei Insult Aktiviert das Komplementsystem

Marker für nicht spezifische zytotoxische Zellen

Marker für B-Zellen

p=0,055

Antikörperwechsel zu bspw. IgT, IgD

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Energiehaushalt auf Zellebene

p=0,014

Uncoupling Protein 2 (UCP2) Indikator für metabolische Reaktionen Mitochondrales Anionen Carrier Gen Entkoppelt die Atmungskette Wird von Makrophagen und Lymphozyten ausgeschüttet

Zusammenfassung

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Zu viel (50%) SBM führt zu Entzündungserscheinungen im Darm 16%SBM zeigt histologisch die beste Darmgesundheit von allen

Gruppen Klassische Entzündungsmarker bei 16%SBM wie Kontrolle

(MPO) oder geringer (SAA) 33%SBM leichte Entzündungserscheinungen ohne

„überschießende“ immunologische Reaktion 16%SBM scheint auf eine Art „ausgleichende“ Funktion auf

Stressreaktionen und das Immunsystem zu haben: Cortisol scheint geringer als Kontrolle nach 8 Wochen Lysozym und MAPK3 aktiv während TLR3 und IgM reduziert Metabolische Reaktionen (USP2) deutlich herunterreguliert

Fazit: vielleicht ist ein bisschen „Stress“ durch SBM förderlich?

Viele offene Fragen Es wurden nur bestimmte Konzentrationen SBM untersucht

Welches ist die optimale Menge an SBM, damit sich ein“ausgleichender” Effekt einstellt?

Wie lange hält der Effekt an?

Wie sind die tatsächlichen zeitlichen Dynamiken? Welche Gene spielen noch eine Rolle?

“Bei Fischen hängt die Immunkompetenz mehr vom Gewicht als vomAlter ab.” (Tort et al. 2003) Größeneffekte müssen bei der Auswertung berücksichtigt

werden

Es wird eine größere Stichprobe benötigt, um Standardabweichungen zu minieren

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Carsten Schulz Alexander Rebl, Tom Goldammer und Team (FBN Dummerstorf)Kati Schlachter Stephanie C. Hornburg und Frederick Kaiser Jonas Müller Laura Schynawa

Michael Schlachter, Claudia Torno und alle anderen Kollegen der GMA

Herzlichen Dank!

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Dr. Henrike Seibelseibel@gma-buesum.de