Effekte skrotaler Hyperthermie auf die Perfusion sowie auf ... · welche aus der Arteria spermatica...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Effekte skrotaler Hyperthermie auf die Perfusion sowie auf histologische und immunhistochemische Merkmale

des caninen Hodens und Nebenhodens

INAUGURAL – DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

( Dr. med. vet. )

vorgelegt von

Annika Herr Hamburg

Hannover 2010

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel

Reproduktionsmedizinische Einheit der Kliniken

Klinik für Kleintiere

1. Gutachter: Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel

2. Gutachter: Prof. Dr. C. Pfarrer

Tag der mündlichen Prüfung: 20.05.2010

Meinen Eltern Meinem Freund

Frieda

1 Einleitung .............................................................................................9

2 Literaturübersicht..............................................................................11

2.1 Anatomie des Hundehodens.........................................................11

2.1.1 Morphologie..................................................................................................... 11

2.1.2 Blutgefäßversorgung der Hoden...................................................................... 13

2.1.3 Histologie des Hodens..................................................................................... 13

2.2 Spermatogenese, Spermiogenese und Keimepithelzyklus........16

2.3 Apoptose.........................................................................................17

2.3.1 Allgemein......................................................................................................... 17

2.3.2 Nachweisverfahren der Apoptose.................................................................... 20

2.3.3 Apoptose am Hoden........................................................................................ 21

2.4 Nekrose ...........................................................................................23

2.5 Degenerative Prozesse an den Hoden .........................................23

2.6 Proliferation am Hoden..................................................................24

2.6.1 Allgemein......................................................................................................... 24

2.6.2 Nachweisverfahren.......................................................................................... 24

2.7 Sonographie der Hoden.................................................................25

2.7.1 Technische Grundlagen................................................................................... 25

2.7.2 Dopplersonographie ........................................................................................ 25

2.7.3 Auswertung von Dopplerkurven....................................................................... 27

2.7.4 Zweidimensionale Sonographie der Hoden ..................................................... 28

2.7.5 Dopplersonographie der Hoden....................................................................... 29

2.7.6 Zweidimensionale Sonographie der Prostata .................................................. 29

2.8 Wärmeregulation am Hoden..........................................................30

2.9 Einfluss einer Hyperthermie auf das Hodengewebe...................31

3 Material und Methoden .....................................................................35

3.1 Tiere.................................................................................................35

3.2 Versuchsaufbau .............................................................................36

3.2.1 Vorlauf ............................................................................................................. 36

3.2.2 Wärmeapplikation............................................................................................ 37

3.2.3 Untersuchungen nach 48-stündiger Wärmeapplikation ................................... 38

3.3 Morphologische Untersuchung ....................................................39

3.4 Ultraschalluntersuchung ...............................................................40

3.5 Kastration und Aufbereitung der Hoden......................................40

3.6 Histologische und immunhistochemische Verfahren.................42

3.6.1 Hämalaun-Eosin Färbung................................................................................ 42

3.6.2 TUNEL - Verfahren.......................................................................................... 42

3.6.3 Immunhistologischer Nachweis der aktivierten Form der Caspase-3 .............. 42

3.6.4 Ki-67-Antigen................................................................................................... 43

3.7 Mikroskopische Auswertung ........................................................44

3.8 Statistische Auswertung ...............................................................45

4 Ergebnisse .........................................................................................46

4.1 Befunde der morphologischen Untersuchung............................46

4.2 Befunde der sonographischen Untersuchung ............................49

4.3 Histologische und immunhistochemische Befunde ...................56

4.3.1 Hoden.............................................................................................................. 56

4.3.2 Nebenhoden .................................................................................................... 73

5 Diskussion .........................................................................................81

5.1 Versuchsdurchführung..................................................................81

5.2 Morphologische Befunde ..............................................................82

5.3 Sonographische Befunde ................................................................................... 83

5.4 Histologische Befunde........................................................................................ 85

5.5 Schlussfolgerungen.......................................................................95

6 Zusammenfassung............................................................................96

7 Summary............................................................................................99

8 Literaturverzeichnis ........................................................................102

9 Anhang.............................................................................................114

9.1 Histologische und immunhistochemische Verfahren – Arbeitsprotokolle................................................................................114

9.2 Skrotale Wärmeapplikation und Aufbereitung der Hoden: Materialien, Chemikalien und Geräte ...............................................122

9.3 Verläufe der Skrotaltemperatur...................................................125

9.4 Alter und Gewicht der Rüden......................................................127

Abkürzungsverzeichnis

Ak = Antikörper

°C = Grad Celsius

c = Geschwindigkeit der Ultraschallwellen

ca. = circa

cm = Zentimeter

DNA = Desoxyribonucleic acid = Desoxyribonucleinsäure

DPV = diastolic peak velocity = diastolische Maximalgeschwindigkeit

EDV = enddiastolic velocity = enddiastolische Geschwindigkeit

evt. = eventuell

HE = Hämalaun-Eosin

kg = Kilogramm

m = Meter

min = Minute

ml = Milliliter

mm = Millimeter

MHz = Megahertz

μm = Mikrometer

PBS = phosphatgepufferte Natriumchlorid-Lösung

PCR = Polymerase Ketten Reaktion

PI = pulsatility index = Pulsatilitätsindex

RI = resistance index = Widerstandsindex

RNA = Ribonucleic acid

SPV = systolic peak velocity = systolische Maximalgeschwindigkeit

s = Sekunde

TAMAX = time averaged maximum velocity

= amplitudengewichtete mittlere Geschwindigkeit

TNF = Tumor Nekrose Faktor

TUNEL = TdT-mediated dUTP-biotin nick end labelling

v = relative Geschwindigkeit

z.B. = zum Beispiel

Einleitung

9

1 Einleitung

Die Bedeutung der Fruchtbarkeit ihrer Hunde rückt zunehmend in das Bewusstsein

der Hundezüchter. Züchten ist nicht mehr nur ein Hobby, sondern für viele Züchter

auch ein wirtschaftlicher Faktor. Aus diesem Grunde besteht zunehmendes Interesse

an einer umfassenden Fertilitätsdiagnostik auch bei Rüden.

Eine herabgesetzte Fruchtbarkeit kann unter Anderem auf einer zu geringen

Spermienproduktion in den Hoden bestehen. Degenerative Veränderungen des

spermienbildenen Hodenparenchyms entstehen in der Mehrzahl der Fälle ohne eine

akute klinische Symptomatik. Vielmehr kommt es häufig über eine aufsteigende

Infektion zu einer subakuten oder chronischen Orchitis mit schleichender,

fortschreitender Abnahme der Fruchtbarkeit bis zur Infertilität. Von anderen

Haustierarten ist bekannt, dass es aufgrund einer Hyperthermie zu einer akuten,

klinisch nicht apparenten Entzündung, jedoch in der Folge zu reversiblen oder

irreversiblen degenerativen Gewebeveränderungen kommen kann. So wurden bei

Ratten, Bullen, Hengsten und Lamas massive Effekte einer kurzzeitigen moderaten

Hyperthermie auf die Ejakulatbeschaffenheit sowie auf morphologische und

histologische Hodenparameter nachgewiesen (KHAN u. BROWN 2002; ALBRECHT

2006; SCHWEIZER 2006; SCHWALM et al. 2007).

Die Spermatogenese läuft beim Hund in 8 bis 10 Keimepithelzyklen ab (FOOTE et al.

1972; IBACH et al. 1976; SOARES et al. 2009). Es ist davon auszugehen, dass auch

unter physiologischen Bedingungen nicht alle Spermatogonien zu Spermien werden,

sondern viele dem programmierten Zelltod, der Apoptose unterworfen sind. Apoptose

kann durch verschiedene externe und interne Faktoren ausgelöst werden (MAJNO u.

JORIS 1995). So z.B. durch Erhöhung der Skrotaltemperatur. Eine weitere Form des

Zelluntergangs ist die Nekrose, die im Gegensatz zur Apoptose keinen genetisch

kontrollierten Prozess darstellt und häufig mit einer Entzündung einhergeht.

Einleitung

10

Ziel der vorliegenden Studie war es, den Einfluss einer kurzfristigen moderaten

skrotalen Hyperthermie auf Morphologie und gewebliche Beschaffenheit der Hoden

gesunder Beagle-Rüden zu untersuchen sowie deren Ausmaß und Reversibilität zu

erfassen.

Literaturübersicht

11

2 Literaturübersicht

2.1 Anatomie des Hundehodens

2.1.1 Morphologie

Die Hoden des Hundes liegen im Hodensack und sind kaudal im

Zwischenschenkelspalt sichtbar (GUTZSCHEBAUCH 1936). Üblicherweise befinden

sich die Hoden beim Hund nicht nebeneinander, sondern hintereinander

(GUTZSCHEBAUCH 1936) wobei sich der linke Hoden etwas weiter kaudal als der

rechte befindet (EVANS u. CHRISTENSEN 1993). Die Hoden werden auch als

samenbereitende Organe bezeichnet und damit funktionell von den Organen der

Spermienreifung und -speicherung unterschieden. Mit seiner ovalen Form besitzt der

Hoden eine Extremitas capitata (dem Nebenhodenkopf anliegend) sowie eine

Extremitas caudata (dem Nebenhodenschwanz anliegend). Der Bereich, der dem

Nebenhodenkörper anliegt wird als Margo epididymalis bezeichnet, die ihm

gegenüberliegende Seite als Margo liber. Die seitlichen Flächen des Hodens werden

als Facies lateralis und Facies medialis bezeichnet (GASSE 2004).

Die intraskrotale Lage der Hoden ist bei der überwiegenden Mehrzahl der Rüden

horizontal, wobei die Extremitas capitata leicht nach kranioventral geneigt und die

Extremitas caudata entsprechend nach kaudodorsal angehoben ist

(GUTZSCHEBAUCH 1936; GÜNZEL-APEL 1994).

Es besteht eine Korrelation zwischen der Hodengröße und dem Gewicht des Rüden

(GÜNZEL-APEL et al. 1994)

Die Nebenhoden werden unterteilt in Kopf, Körper und Schwanz (CORNWALL 2009).

Sie liegen den Hoden direkt an und sind am Margo epididymalis mit diesem

verwachsen (LIEBICH 2004). Der Nebenhodenkopf des Hundes besteht zum größten

Teil aus den 15-16 Ductuli efferentes (GASSE 2004), welche die Samenzellen aus

dem Rete testis in den Nebenhodenkopf befördern. Je nach Größe des Hundes sind

die Nebenhodenköpfe stecknadelkopf- bis erbsengroß. Der Nebenhodenkörper liegt

Literaturübersicht

12

dem Hoden strangförmig dorsolateral auf und mündet in den Nebenhodenschwanz.

Der den Nebenhodenkörper durchziehende Nebenhodenkanal liegt im Bereich des

Nebenhodenschwanzes in extrem stark aufgeknäuelter Form und dient als

Spermienreservoir, während Nebenhodenkopf und –körper primär der

Spermienreifung dienen (CORNWALL 2009). Die Größe des Nebenhodenschwanzes

variiert ebenfalls mit der Körpergröße des Hundes und ist linsen- bis haselnussgroß

(GÜNZEL-APEL et al. 1994). Die Form des Nebenhodenschwanzes kann kappen-,

halbkugel-, kugel- oder spitzkegelförmig sein. In der Regel ist der

Nebenhodenschwanz deutlich vom Hoden abgesetzt (GUTZSCHEBAUCH 1936).

Die Hoden sind von mehreren Häuten umgeben (GUTZSCHEBAUCH 1936). Ganz

außen befindet sich das Skrotum, welches anatomisch aus der Haut und der

Unterhaut (Tunica dartos), sowie der Fascia spermatica externa besteht. Die Tunica

dartos bildet ein kontraktiles Netz aus glatten Muskelzellen. Im Inneren wird das

Skrotum durch ein Septum unterteilt. In jedem dieser Hohlräume liegt ein Hoden,

umgeben vom Processus vaginalis. Dieser besteht aus der Fascia spermatica interna

und der Tunica vaginalis. Direkt dem Hoden anliegend hält die Tunica albuginea testis

durch ihre derbe Konsistenz den Hoden unter Druck. Die Tunica albuginea ist ca.

1 bis 2 mm dick, reich an Kollagenfasern und führt die Versorgungsgefäße in einer

Tunica vasculosa in sich. Außerhalb des Processus vaginalis liegt für jeden Hoden

separat der Musculus cremaster mit seiner Fascie. Außer dem Ligamentum scroti,

einem derben Bindegewebsband welches im distalen Bereich den Processus

vaginalis mit dem Skrotum verbindet, hat der Hoden keine feste Verbindung zum

Skrotum. Dieses wird lediglich durch lockeres Bindegewebe gefüllt. Die äußere Haut

des Skrotums ist dünn und wenig behaart, eine individuelle Pigmentierung wird

beobachtet. Auch sind zahlreiche Schweiß- und Talgdrüsen vorhanden

(GUTZSCHEBAUCH 1936; EVANS u. CHRISTENSEN 1993; GASSE 2004).

Literaturübersicht

13

2.1.2 Blutgefäßversorgung der Hoden

Die Blutgefäße im Hoden haben drei Hauptaufgaben, die Regulation der Temperatur

und des Blutdruckes und den Transport von Hormonen (SINOWATZ 2001). Der

Blutfluss zum Hoden erfolgt über die im Samenstrang verlaufende Arteria testicularis,

welche aus der Arteria spermatica interna entspringt (GUTZSCHEBAUCH 1936). Dort

ist sie, im Plexus pampiniformis, rankenförmig geschlängelt und tritt im weiteren

Verlauf an der Extremitas capitata in den Hoden ein. In diesem verläuft sie am Margo

epididymalis als so genannte Marginalarterie zur Extremitas caudata. An dieser

angekommen, teilt sie sich (als so genannte Zentripetalarterie) in einen medialen und

einen lateralen Ast auf, welche weitere Zweige in das zwischen den Lobuli des

Hodens befindliche Bindegewebe abgegeben. Im Mediastinum testis knäueln sich die

Arterien erneut auf und laufen als Zentrifugalarterien zurück in Richtung Hodenkapsel.

Der venöse Abfluss läuft zu einem geringen Teil über kleinere Venen, die dem Verlauf

der Ductuli efferentes folgen und schließlich die Extremitas capitata erreichen. Der

überwiegende Teil verläuft durch das Parenchym zur Hodenkapsel und bildet dort ein

Venennetz, welches an der Basis des Samenstrangs als Plexus pampiniformis vorliegt

(GUTZSCHEBAUCH 1936; SINOWATZ 2001). Durch diese speziell entwickelte Form

des Plexus wird eine große Austauschfläche zwischen Arterie und Vene gebildet.

Diese fördert den Wärmeaustausch und erleichtert die Diffusion (COULTER u.

KASTELIC 1994). Um die Fließgeschwindigkeit im Plexus herabzusetzen, sind

mehrere Anastomosen zwischen den einzelnen Venen ausgebildet (LIEBICH 2004).

2.1.3 Histologie des Hodens

Hoden Die dem Hoden direkt anliegende Tunica vasculosa liegt beim Hund und beim

Schafbock oberflächlich, bei Hengst und Eber in tieferen Schichten (SINOWATZ

2001; LIEBICH 2004). Zusätzlich enthält die Tunica albuginea, neben der Tunica

vasculosa, elastische und einzelne glatte Muskelzellen (MONTKOWSKI 1992;

LIEBICH 2004). Der Hoden wird komplett von ihr umschlossen und von aus ihr

Literaturübersicht

14

entlassenen Bindegewebstrabekeln durchzogen (MONTKOWSKI 1992; LIEBICH

2004). Durch diese Bindegewebssepten (Septula cortis) wird der Hoden in mehrere

Lobuli testis, mit den darin befindlichen stark geschlängelten Samenkanälchen (Tubuli

seminiferi convoluti oder contorti), unterteilt. Diese münden in einen gestreckten

Endabschnitt, die Tubuli seminiferi recti und vereinigen sich im Mediastinum zum Rete

testis (LIEBICH 2004). Das Mediastinum testis ist ein aus den Septula testis gebildeter

bindegewebiger Bereich, welcher beim Hund zentral im Hodenparenchym liegt und

den Hoden auf seiner gesamten Länge durchzieht (MONTKOWSKI 1992). Das Rete

testis liegt als Netzwerk im Mediastinum und ist von einer deutlichen Schicht

elastischer Fasern umgeben. In den Septula testis verlaufen größere Blut- und

Lymphgefäße sowie Nerven (MONTKOWSKI 1992). Am Hoden ist vor allem der

sympathische Anteil des vegetativen Nervensystems stark ausgebildet (SINOWATZ

2001). Die Tubuli seminiferi convoluti sind 50 bis 80 cm lang und im Durchschnitt 200

bis 300 μm breit (LIEBICH 2004). Sie bestehen aus Keim- und Stützzellen

(Sertolizellen). Beim Hund liegen die Sertolizellen direkt der Basalmembran der Tubuli

an, sowie vereinzelt zwischen den Spermatogonien (FORD 1969). Der Kern scheint

direkt an der Basalmembran zu kleben. Die Tubuli seminiferi convoluti werden außen

durch eine Basalmembran sowie durch lockeres Bindegewebe begrenzt, in welches

die hormonproduzierenden Leydigschen Zwischenzellen eingebettet sind (GASSE

2004). Die Leydigschen Zwischenzellen liegen sowohl solitär als auch in Gruppen im

Bereich des Rete testis oder an Lymphgefäßen (MONTKOWSKI 1992).

Die oben erwähnten Tubuli recti sind beim Hund, genau wie beim Bullen, noch mit

einem als Terminalsegment bezeichneten Abschnitt versehen. Hier ragen

Sertolizellgruppen keilförmig in das Lumen und behindern so ein Zurückfließen der

Samenzellen. Außerdem besitzen sie auch hier phagozytotische Fähigkeiten.

MONTKOWSKI (1992) unterteilt dieses Terminalsegment aufgrund der

Epithelbeschaffenheit in drei Abschnitte sowie eine endständige kelchartige

Erweiterung.

Das intertubuläre Segment besteht zum Einen aus den intertubulären Spalträumen

innerhalb eines Lobulus, welche beim Hund fast vollständig mit in Gruppen liegenden

Literaturübersicht

15

Leydigschen Zwischenzellen und von kleineren Blut- und Lymphgefäßen sowie von

elastischen Fasern ausgefüllt werden. Zum Anderen gibt es den Bereich, der aus der

Tunica albuginea einstrahlenden Bindegewebstrabekel. Hier befinden sich größere

Blut- und Lymphgefäße sowie Fibrozyten und mononukleäre Zellen und, wie in den

intertubulären Spalträumen, elastische Fasern und Leydigsche Zwischenzellen.

Nebenhoden Im Bereich des Nebenhodenkopfes befinden sich Kanälchen welche als Ductuli

efferentes testis, gesäumt mit glatten Muskelzellen zum Spermientransport, die Tunica

albuginea des Hodens durchbrechen.

Am Ende des Nebenhodenkopfes vereinigen sich diese, beim Hund nach LIEBICH

(2004) 15 bis 16 Kanälchen, zu dem Nebenhodenkanal, dem Ductus epididymidis

(GASSE 2004). Gesäumt ist dieser Gang von einem zweireihigen hochprismatischen

Epithel, welches ein ideales Milieu für die Spermienreifung schafft. Aus dem

Nebenhodenkanal entspringt der Samenleiter, Ductus deferens, in welchem die

Spermien während der Ejakulation durch die Kontraktion glatter Muskulatur zum

Beckenstück der Harnröhre befördert werden (GASSE 2004). Im Samenleiter befindet

sich zusätzlich ein mit Drüsengewebe ausgekleideter Abschnitt, die Pars glandularis

ductus deferentis.

REHM (2000) wertete HE-gefärbte präparierte Hoden von 50 einjährigen Beagle-

Rüden aus. Bei 30% der Rüden stellte er eine bilaterale, segmentale

Hypospermatogenese fest, welche sich in Form verkleinerter Keimzellen,

geschrumpfter Tubuli seminiferi contorti, Sertoli only, multinukleärer Riesenzellen und

geschwollener Spermatozyten manifestierte. Bei 20% der Beagle-Rüden im Alter von

6 bis 32 Monaten wiesen GOEDKEN et al. (2008) eine Hypospermie nach, davon bei

31,3% bilateral. Bei allen Rüden war ein multifokales Fehlen elongierter

Spermatozyten zu verzeichnen. Häufig traten Zelldebris, Riesenzellen und

geschwollene Spermatozyten auf. 75% der betroffenen Rüden waren sechs bis acht

Monate alt und demzufolge noch nicht geschlechtsreif. Über elf Monate alte Rüden

waren weniger als 10% betroffen. Bei 10% der Rüden wurden apoptotische Zellen in

Literaturübersicht

16

minimalem Umfang gefunden. Die multinukleären Riesenzellen waren bei 73,8% der

Rüden zu finden, davon 85% beidseits mit ein bis sechs Zellen pro Tubulus und

weniger als zehn Tubuli pro Hoden. Im Nebenhoden wurden nur eine multinukleäre

Riesenzelle und einige unreife Spermien gefunden.

2.2 Spermatogenese, Spermiogenese und Keimepithelzyklus

Im Rahmen der Spermatogenese entstehen aus den Spermatogonien haploide

Spermatiden, welche dann während der Spermiogenese zu morphologisch reifen

Spermien ausdifferenzieren. Dieser Prozess läuft zyklisch in den Tubuli seminiferi ab

(FORD 1969; SCHNORR u. KRESSIN 2001). Zunächst kommt es durch mitotische

Teilungen zur Vermehrung der Spermatogonien, gefolgt von einer Wachstumsphase,

die zur Entstehung von Spermatozyten 1. Ordnung führt. Durch Reduktion der

Chromosomenzahl entstehen Spermatozyten 2. Ordnung, welche ziemlich schnell

durch meiotische Teilung zu Spermatiden werden. Die haploiden Spermatiden gehen

nun zur Spermiogenese über, die in vier Schritten abläuft (FORD 1969;

MONTWKOWSKI 1992). In der Golgi-Phase wandern abgeschnürte Vesikel zum Kern

und bilden so eine akrosomale Vakuole. In der darauf folgenden Kappen-Phase

verdichtet sich die Vakuole zu einem Granulom, welches sich halbkugelförmig

ausbreitet und im weiteren Verlauf die Kopfkappe bildet. In der sich anschließenden

Akrosom-Phase kondensiert der Kern und nimmt eine längliche Gestalt an. Zusätzlich

verlagert sich das Zytoplasma hinter den Zellkern. Nachfolgend findet eine

Reifungsphase statt.

FOOTE und SWIERSTRA (1972) teilen den Keimepithelzyklus des Hundes in acht

Stadien ein, beginnend mit dem Zeitpunkt, an dem alle reifen Stadien in das Lumen

entlassen werden. Als Kriterien gelten sowohl die Kernform, als auch die Lage zur

Basalmembran. Insgesamt unterteilen sie A- und B-Spermatogonien, welche aber

nicht weiter klassifiziert werden. Die A-Spermatogonien zeigen sich in den Stadien

zwei bis fünf, in deren Verlauf sie zahlenmäßig zunehmen, die B-Spermatogonien in

den Stadien sechs bis acht. Anschließend folgt die Wandlung zu präleptotenen

Literaturübersicht

17

Spermatozyten 1. Ordnung, welche nach den vier Meiosestadien die zweite

Reifeteilung durchlaufen. In den ersten vier Stadien existieren zwei Zellgenerationen.

Die Dauer eines Keimepithelzyklus wird mit 13,6 Tagen angegeben. Insgesamt dauert

die Spermatogenese beim Hund acht bis neun Wochen und läuft dementsprechend in

vier bis fünf Zyklen ab.

Ebenfalls in acht Stadien, basierend auf dem Akrosomsystem, wird der

Keimepithelzyklus des Hundes von SOARES et al. (2009) eingeteilt. In dieser Studie

wurden zusätzlich Unterschiede zwischen einzelnen Rassen und Mischlingen

beleuchtet. Des Weiteren untersuchten sie anhand von intratestikulären Thymidin-

Injektionen die Dauer des Keimepithelzyklus. Die gefundenen Ergebnisse decken sich

mit denen von FOOTE und SWIERSTRA (1972). Die durchschnittliche Dauer eines

Zyklus wurde mit 13,7 Tagen angegeben. Einzig beim American Pitbull zeigte sich

eine durchschnittliche Dauer von 12,6 Tagen. Zwischen den anderen untersuchten

Rassen (Pinscher, Beagle, Pudel, Labrador und Mischlinge) wurden keine

Unterschiede entdeckt.

Dagegen teilen IBACH et al. (1976) den Keimepithelzyklus des Hundes in zehn

Stadien ein. Sie beginnen mit der Verlagerung der Kopfkappe in Richtung

Basalmembran und unterteilen die Zellgruppen in A- (mehrere Generationen), I- und

B-Spermatogonien sowie in primäre und sekundäre Spermatozyten. Im Anschluss

daran entstehen die Spermatiden, welche einen runden oder gestreckten Kern

aufweisen. Die Entwicklungsrichtung läuft von der Basalmembran zum Lumen hin ab

(Ford 1969).

2.3 Apoptose

2.3.1 Allgemein

Unter Apoptose ist der aktive, programmierte Tod einer einzelnen Zelle zu verstehen

(KATAOKA u. TSURUO 1996). Sie funktioniert als Gegenspieler zur Mitose und ist für

die Aufrechterhaltung der Homöostase im Körper unerlässlich (ELMORE 2007).

Literaturübersicht

18

Entscheidend ist immer, dass der apoptotische Prozess unter genetischer Kontrolle

steht (MAJNO u. JORIS 1995).

Es existieren zwei mögliche Ursachen, die einen apoptotischen Prozess auslösen

können. Zum einen der genetisch programmierte Zelltod, welcher bei der embryonalen

Entwicklung greift und zum anderen eine durch äußere Reize (z.B. Strahlung,

Medikamente und Wärme) ausgelöste Apoptose (MAJNO u. JORIS 1995).

Initiiert werden kann die Apoptose über extrinsische und intrinsische Stimuli (NAGATA

1997). Eine wichtige Rolle spielen hierbei Noxen wie radioaktive Strahlung oder

Medikamente, die die DNA schädigen (KATAOKA u. TSURUO 1996).

Der extrinsische Weg läuft über eine Bindung von TNF und Fas-Ligand, beide

gehören zu den Zytokinen, an ihre spezifischen Rezeptoren (NAGATA 1997). Hierbei

kommt es zur Aktivierung über die Procaspase-8 zur Caspase-8 (SCHULTZ u.

HARRINGTON 2003).

Bei dem intrinsischen Weg steigt die Permeabilität der Mitochondrienmembran infolge

dessen das Membranpotential abnimmt. Dies hat zur Folge, dass es zum Austritt

verschiedener Proteine kommt, wie z.B. Cytochrom C, welches die Procaspase-9

aktiviert (NAGATA 1997; SCHULTZ u. HARRINGTON 2003; SINHA HIKIM et al.

2003). Der intrinsische Weg wird zum einen durch positive Faktoren (Strahlung,

Toxine, freie Radikale, Hitze), zum Anderen durch negative Faktoren, die über das

eigene Fehlen apoptotische Prozesse starten können (Hormone, Wachstumsfaktoren,

Zytokine), ausgelöst (ELMORE 2007).

Beide Wege führen zur Aktivierung der Effektorcaspasen, allen voran der Caspase-3,

welche von allen Initiatorcaspasen aktiviert werden kann. Alle Effektorcaspasen

aktivieren Endonukleasen, welche dann DNA-Brüche hervorrufen. Caspase-3 speziell

bewirkt die Spaltung des ICAD (Inhibitor of Caspase Activating DNA-ase), eines

Proteins, welches die DNA schützt. Zusätzlich wird eine DNA-Helicase gespalten,

welche die Chromatinkondensation bewirkt. Ferner werden von den Caspasen

Cytoskelettbestandteile gespalten, so dass die für die Apoptose typische

Zellschrumpfung stattfinden kann (FISCHER et al. 2003).

Literaturübersicht

19

Der dritte, auch von ELMORE (2007) erwähnte, Weg entspricht der von

MARTINVALET et al. (2005) beschriebenen Caspase unabhängigen Apoptose. Dabei

spielt das Granzym A eine entscheidende Rolle. Es bewirkt einen intrazellulären

Anstieg reaktiver Sauerstoffverbindungen sowie ein Absinken des Membranpotentials

der Mitochrondrien. Eingebracht in die Zelle wird das Granzym A über zytotoxische T-

Zellen und natürliche Killerzellen. Im weiteren Verlauf zeigt die betroffene Zelle viele

Merkmale der Apoptose, lediglich die äußere Mitochondrienmembran bleibt intakt, so

dass kein Cytochrom C austreten kann, und somit keine Caspasen aktiviert werden.

Dagegen kommt es zu einer Spaltung des sogenannten Set-Komplex, einem aus

mehreren Proteinen bestehenden Komplex, dessen Aufgabe im Schutz der DNA

besteht. Wird dieser Komplex gespalten, kommt es zu einer Aktivierung von DNAsen

die die DNA spalten. Im Unterschied zu den intrinsischen und extrinsischen Wegen

wird in diesem Fall die DNA einzelsträngig gespalten (MARTINVALET et al. 2005).

Einen Caspase-3 unabhängigen Weg des Zelltodes zeigen JÄHNICKE et al. (1998)

auf. Hierbei wurden MCF-Brustkrebszellen, welche aufgrund eines Gendefektes keine

Caspase-3 beinhalten, mit Tumor Nekrose Faktor behandelt. Auch diese Zellen

zeigten eine apoptotische Reaktion, allerdings ohne DNA-Fragmentation,

Zellschrumpfung oder Ausbildung des typischen „blebbings“ (Vorgang der

Ausstülpung von Plasma- und Kernmembran, welche weiter zu Vesikeln abgeschnürt

werden).

Zu Beginn des apoptotischen Prozesses kommt es zu einer Verringerung des

Zellvolumens mit anschließender Kondensation des Zellkerns (MAJNO u. JORIS

1995; KATAOKA u. TSURUO 1996). Letztere erfolgt als halbmondförmige

Ablagerung, der Margination des Chromatins (MAJNO u. JORIS 1995). Andere

Zellorganellen sind von diesem Prozess nicht betroffen (KATAOKA u. TSURUO

1996). Nach MAJNO und JORIS (1995) kann jedoch eine geringe Schwellung der

Mitochondrien auftreten, welche jedoch für den Ablauf der Apoptose nicht notwendig

ist. Nachdem die Zellmembran Blasen geschlagen hat („blebbing“), zerbricht der

Zellkern und es entsteht der apoptotische Restkörper (MAJNO u. JORIS 1995;

KATAOKA u. TSURUO 1996). Dieser wird komplett von neutrophilen Granulozyten

Literaturübersicht

20

phagozytiert (KATAOKA u. TSURUO 1996). Dagegen schreiben MAJNO und JORIS

(1995) sowie JACOBSON et al. (1997) die Phagozytose den Makrophagen und

benachbarten Zellen zu. Andererseits kann der apoptotische Restkörper auch als

freier apoptotischer Körper bestehen bleiben (MAJNO u. JORIS 1995). Eine

Entzündungsreaktion bleibt aus, da apoptotische Zellen eine so geringe Menge an

Chemo-Attraktanzien produzieren, dass keine Leukozyten angelockt werden.

Apoptose kann innerhalb von Minuten ablaufen (MAJNO u. JORIS 1995). In der

Agonie der Apoptose entlassen die Zellen viele Pseudopodien, es kommt zum

„budding“ (KERR u. HARMON 1991). Bei der Nekrose zeigen sich dagegen auch

Veränderungen am Zytoplasma in Form von Eosinophilie, Zusammenbruch der

Zellstrukturen und Fragmentation (MAJNO u. JORIS 1995).

2.3.2 Nachweisverfahren der Apoptose

Die üblichsten Verfahren für den Nachweis apoptotischer Zellen ist das TUNEL-

Verfahren (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling) und der Nachweis aktivierter

Caspase-3.

Bei dem TUNEL-Verfahren wird die Tatsache genutzt, dass es während der Apoptose

durch Endonukleasen zu einer DNA-Fragmentation kommt. Die frei werdenden Enden

werden im Laufe des Verfahrens durch das Enzym TdT (terminal deoxynucleotidyl

transferase) mit markierten Nukleotiden versehen, welche lichtmikroskopisch sichtbar

gemacht werden können (GAVRIELI et al. 1992). Apoptotische Zellen sind nur über

eine kurze Zeitspanne vorhanden. Von der Initiierung bis zur Elimination dauert es

maximal drei Stunden (GAVRIELI et al. 1992). Dabei ist nicht sicher, wie viele

Strangbrüche vorhanden sein müssen, um ein positives Ergebnis zu erzielen

(ELMORE 2007). Auch Zellen, welche nekrotisch sind, können sich gerade in der

DNA-Reparationsphase oder der Transkriptionsphase befinden und aufgrund dessen

ebenfalls positiv dargestellt werden.

Bei dem Caspase-3-Verfahren wird in einem immunhistochemischen Verfahren die

aktivierte Form der Caspase-3 im Gewebe nachgewiesen. Mittels eines spezifischen

Caspase-Markers können zytoplasmaständige Enzyme markiert und sichtbar gemacht

Literaturübersicht

21

werden. Allerdings ist eine Aktivierung von Caspasen nicht unbedingt mit Apoptose

gleichzusetzen. Hinzu kommt, dass die Caspasen oft nur in einem geringen

Zeitfenster darstellbar sind (ELMORE 2007).

Weitere mögliche Verfahren zur Erfassung apoptotischer Zellen stellen die

Elektronenmikroskopie und PCR-Assays dar.

2.3.3 Apoptose am Hoden

Am Hoden können folgende Faktoren Apoptose auslösen: Entzug oder Zugabe von

Wachstumsfaktoren oder Hormonen, eine veränderte Interaktion benachbarter Zellen

sowie DNA -Schädigung (zum Beispiel durch Strahlung) (DANSRANJAVIN 2000).

Beim Menschen zeigen ca. 8% der ausgewerteten Hodentubuli mit normaler

Spermatogenese mindestens eine apoptotische Zelle. Am häufigsten sind

Spermatozyten (63%) betroffen, doch können auch alle anderen

Spermatogenesestadien apoptotische Prozesse aufweisen. Im Keimepithelzyklus

dient die Apoptose dem Schutz vor geschädigten Zellen sowie fehlerhaften Mitose-

und Meiose-Produkten. Des weiteren kommt der Apoptose eine Bedeutung in der

Regulation der Zellhomöostase zu, da die Sertolizellen nur eine bestimmte Anzahl

Keimzellen versorgen können (DANSRANJAVIN 2000). 75% der Keimzellen sterben

während ihrer Entwicklung, vor allem in den frühen Stadien der Spermatogenese ab.

Bei Mäusen kam es nach vollständigem Testosteronentzug zu einer gesteigerten

Apoptoserate im Hoden (TROJANO et al. 1994). BILLIG et al. (1995) erzielten diesen

Effekt am Rattenhoden durch Entzug von Gonadotropinen. Betroffen waren jedoch

nur Tiere im Alter von 16 bis 32 Tagen. Bei erwachsenen Tieren zeigte sich,

unabhängig vom Gonadotropin-Entzug eine vermehrte DNA-Fragmentation in den

Stadien XII bis XIV des Keimepithelzyklus, während das Stadium VIII kaum betroffen

war. SINHA HIKIM et al. (2003) zeigten bei Ratten mit Hilfe eines

Testosteronimplantats eine Steigerung der Apoptose in den Stadien VII bis VIII,

welche in der Studie von BILLIG et al. (1995) eher die weniger betroffenen Stadien

darstellten.

Literaturübersicht

22

Nach 15-minütiger Erwärmung auf 42°C zeigten die Hoden adulter Ratten eine

erhöhte Apoptoserate. Diese trat in den Tagen 1 und 2 nach Wärmeapplikation vor

allem in den Stadien I bis IV und XII bis XIV auf. In den Stadien V bis VIII waren

dagegen nur geringe Veränderungen nachzuweisen. Am empfindlichsten zeigten sich

pachytäne Spermatozyten, frühe Spermatiden, diplotäne und sich teilende

Spermatozyten. Neun Tage nach der Wärmeapplikation waren schwere Schäden an

den Tubuli seminiferi contorti zu finden. Apoptotische Zellen wurden nur noch

vereinzelt nachgewiesen. 56 Tage nach der Wärmeapplikation hatte eine komplette

Regeneration stattgefunden (SINHA HIKIM et al. 2003). Durch Kombination des

Testosteronimplantats mit der kurzzeitigen Hitzeeinwirkung konnte nahezu eine

Azoospermie erzeugt werden. SINHA HIKIM et al. (2003) verdeutlichten durch ihre

Studie außerdem die Beteiligung von Mitochondrien durch den Nachweis von

ausgetretenem Cytochrom C und Caspasen. Zusätzlich zeigten sie anhand von

Knock-out Mäusen, dass der Weg der Apoptose über den FAS/FAS-Ligand Komplex

bei der hitzeinduzierten Apoptose am Hoden eine eher untergeordnete Rolle spielt.

Bei Lamas wurden nach einer vierwöchigen Erhöhung der Umgebungstemperatur auf

29°C 22 bis 30 TUNEL-positive Zellen pro 100 Tubuli festgestellt. Betroffen waren hier

vor allem primäre Spermatozyten. Diese Veränderungen waren im Vergleich zur

Kontrollgruppe allerdings nicht signifikant (SCHWALM et al. 2007).

KAWAKAMI et al. (2000) bestimmten die Anzahl apoptotischer Zellen bei vier Rüden

mit Azoospermie und bei drei Hunden mit normaler Ejakulatbeschaffenheit.

Durchschnittlich 3% der runden Spermatiden stellten sich mittels TUNEL-Verfahren

positiv dar. Drei Hunde mit Azoospermie wiesen in 3% der Leydigschen

Zwischenzellen DNA-Fragmentation auf. Sertolizellen konnten zu keinem Zeitpunkt

TUNEL-positiv dargestellt werden. In den Hoden der Hunde mit normaler

Ejakulatbeschaffenheit wurde keine Keimzellapoptose nachgewiesen.

Literaturübersicht

23

2.4 Nekrose

Im Gegensatz zur Apoptose ist die Nekrose kein genetisch kontrollierter sondern ein

energieunabhängiger Prozess, an dem die Zelle passiv beteiligt ist (ELMORE 2007).

Gekennzeichnet ist die Nekrose durch irreversible Veränderungen im Zellkern wie

Karyolysis, Pyknose und Karyorrhexis sowie durch Veränderungen im Zytoplasma in

Form von Kondensation, Eosinophilie und Fragmentation (MAJNO u. JORIS 1995).

Durch Störung der Ionenkanäle kommt es bei nekrotischen Prozessen zur

Verschiebung des osmotischen Gradienten und in der Folge dessen zu einem

Wassereinstrom in die Zelle. Die Zelle schwillt an und rupturiert. Dadurch werden

intrazelluläre Komponenten in die Umgebung freigesetzt und locken Immunzellen an,

die wiederum durch Zytokinproduktion einen entzündlichen Prozess bewirken

(SCHEIDEL 2000). Weiter treten vermehrt Zytoplasmavakuolen, zytoplasmatische

Bläschen sowie kondensierte, rupturierte oder geschwollene Mitochondrien auf

(ELMORE 2007). Eine Nekrose kann ebenfalls durch verschiedene intrinsische und

extrinsische Faktoren ausgelöst werden. Dauer und Stärke eines Stimulus sind

entscheidend dafür, ob die Zelle durch Nekrose oder Apoptose zu Grunde geht.

2.5 Degenerative Prozesse an den Hoden

Erkrankungen der Hoden, die mit Degenerationserscheinungen und verminderter

Ejakulatbeschaffenheit einhergehen können, haben verschiedenste Ursachen. In der

Bauchhöhle verbliebene Hoden sind gewöhnlich kleiner als skrotale Hoden und

weisen keine Spermatogenese auf. Solche Hoden besitzen eine erhöhte Neigung zur

tumorösen Entartung (WEISS u. KÄUFER-WEISS 2007). Akute degenerative und

atrophische Zustände sind häufig nur histologisch an hydropischer Degeneration,

Kernpyknosen, mehrkernigen Riesenzellen und Störungen der Samenzellbildung zu

erkennen. Als Ursachen kommen hier vor allem Traumata, akute oder chronische

entzündliche Prozesse, Infektionskrankheiten, klimatische Veränderungen und

Ernährungsfehler zum Tragen. Eine senile Hodenatrophie, also eine

Literaturübersicht

24

Altersdegeneration, geht in der Regel mit einer Lipofuszinablagerung einher, welche

den Hoden braun verfärbt.

2.6 Proliferation am Hoden

2.6.1 Allgemein

Aufgrund der verschiedenen gleichzeitig in den Tubuli ablaufenden

Spermatogenesestadien ist das Hodengewebe von ständigen Proliferationsprozessen

gekennzeichnet. Hierbei proliferieren in erster Linie die Spermatogonien welche sich

durch mitotische Teilung vermehren. In den anderen Stadien der Spermatogenese

erfolgen lediglich Umbauvorgänge bzw. meiotische Teilungen (MONTKOWSKI 1992).

Beim Bullen ist die Proliferation am stärksten in den Stadien fünf bis acht ausgeprägt,

wenn die B- Spermatogonien sich teilen. Sertolizellen können hingegen in keinem

Bereich mithilfe eines Proliferationsmarkers dargestellt werden (WROBEL et al. 1993).

Bei Lamas waren unter Kontrollbedingungen in 20,5% der Tubulusanschnitte keine

einzige positive Zelle zu finden. Durch vierwöchige Wärmeapplikation stieg der

Prozentsatz unmittelbar auf 54,3% an, um im Verlauf der darauf folgenden sechs

Wochen auf 11% abzufallen.

2.6.2 Nachweisverfahren

Proliferationsprozesse lassen sich mithilfe des Markers Ki-67 nachweisen

(SCHOLZEN u. GERDES 2000). Während der Ruhephase des Zellzyklus befindet

sich das Ki-67 Protein ausschließlich im Zellkern, weshalb es in diesem Stadium nicht

nachgewiesen werden kann.

Das Ki-67 Antigen eignet sich besonders gut zur Bestimmung der Proliferation, da es

ein größeres Zeitfenster bietet als andere immunhistochemische Verfahren wie z.B.

der Nachweis des PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) (WROBEL et al. 1993).

Literaturübersicht

25

2.7 Sonographie der Hoden

2.7.1 Technische Grundlagen

Bei der Ultraschalltechnik werden durch piezoelektrische Kristalle im Schallkopf

impulsartige Schallwellen (durch Ionenverschiebung im Kristall) erzeugt. Diese

werden nach Reflexion des betroffenen Gewebes vom Schallkopf wieder empfangen.

Ultraschallwellen liegen im Bereich von 20 kHz bis zehn MHz und sind für den

Menschen nicht hörbar (POULSEN NAUTRUP 2007). Sie werden im Ultraschallgerät

in Spannungssignale umgewandelt und als zweidimensionales Bild dargestellt (GIESE

1997). Es können nur senkrecht getroffene Grenzflächen sicher beurteilt werden

(POULSEN NAUTRUP 2007). Zwischen Schallkopf und Körperoberfläche befindliche

Luft verhindert eine Ultraschalldarstellung oder führt zu Artefakten. Aus diesem

Grunde sind sowohl die Entfernung des Haarkleides und als auch die Verwendung

eines Ultraschallgels unverzichtbar.

2.7.2 Dopplersonographie

Der so genannte Dopplereffekt ist ein Effekt, welcher die Änderung einer Frequenz

beschreibt, wenn sich Sender und Empfänger relativ aufeinander zu bewegen (GIESE

1997). Wichtig ist hierbei die Geschwindigkeit der Wellen (c) und die

Relativgeschwindigkeit (v) von Sender und Empfänger. Mithilfe dieses Effektes

können Blutströmungsgeschwindigkeit und Blutflussrate in peripheren Arterien

bestimmt werden. Reflektiert werden die eintretenden Ultraschallwellen hierbei von

den sich bewegenden Erythrozyten (GIESE 1997). Fließt das Blut auf den Schallkopf

zu, erscheinen die Wellen gestaucht (f1 > f0 und fd > f0). Definitionsgemäß wird

dieses Blut oberhalb der Nulllinie und rot dargestellt. Bei vom Ultraschallkopf weg

fließendem Blut werden die Schallwellen gedehnt (f1 < f0 und fd < f0). Diese

Blutflüsse werden unterhalb der Nulllinie und blau dargestellt (POULSEN NAUTRUP

2007). Die Kombination aus Dopplerverfahren und der zweidimensionalen

Literaturübersicht

26

Sonographie wird auch als Duplexsonographie bezeichnet. Sie ermöglicht die exakte

Zuordnung des Blutflusses zu bestimmten Strukturen.

Beim farbcodierten Dopplerverfahren werden die Messvolumina eher flächenhaft

abgebildet. Dieses Verfahren ist schnell und bietet als Einziges eine wirkliche

Kombination aus zweidimensionalem Ultraschallbild und Dopplerfunktion (POULSEN

NAUTRUP 2007).

Unterschieden wird hierbei zwischen dem kontinuierlichem Dopplerverfahren (CW) mit

zwei Piezokristallen (einen zum Senden, einen zum Empfangen), und dem gepulsten

Dopplerverfahren (PW) mit nur einem Kristall. Bei der gepulsten Dopplersonographie

besteht die Möglichkeit einer Winkelkorrektur, so dass auch in nicht exakt parallel

verlaufenden Gefäßen der Blutfluss gemessen werden kann (POULSEN NAUTRUP

2007). Bei der gepulsten Duplexsonographie wird zuerst die richtige Platzierung im

zweidimensionalen Bild geprüft und anschließend auf den Dopplerbetrieb

umgeschaltet.

Fehlerquellen ergeben sich bei der gepulsten Dopplersonographie sowie der

farbkodierten Dopplersonographie aus dem Aliasing-Phänomen und der Nyquist-

Frequenz (maximal eindeutig messbare Doppler-Shift).

Das Aliasing-Phänomen zeigt die Grenzen einer gepulsten Messung auf. Eine hohe

Beobachtungsfrequenz erlaubt auch eine präzise Angabe der Geschwindigkeit. Dazu

muss der Dopplershift etwas kleiner als die maximale Pulsrepetitionsrate gewählt

werden (POULSEN NAUTRUP 2007). Wird eine Blutströmung oberhalb der Nyquist-

Frequenz gemessen kommt es zum Aliasing-Phänomen und der Blutfluss wird,

obwohl er auf den Schallkopf zufließt, unterhalb der Nulllinien angezeigt.

Um diesem Phänomen vorzubeugen, können die Eindringtiefe oder die

Dopplerfrequenz verringert werden. Dabei sind eventuelle Einbußen der Abbildungen

zu beachten. Durch Verschiebung der Nulllinie kann ein Messbereich zu Lasten des

anderen verdoppelt werden. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit der Erhöhung der

Pulsrepetitionsrate mittels HPRF (high-puls-repetition-frequency) Dopplerverfahren.

Hierbei werden weitere Messvolumina eingerichtet, was allerdings wiederum zu einer

gewissen Ungenauigkeit führen kann (NEUERBURG-HEUSLER u. HENNERICI

1999).

Literaturübersicht

27

2.7.3 Auswertung von Dopplerkurven

Dopplerultraschallkurven können sowohl qualitativ als auch quantitativ ausgewertet

werden. Die qualitative Auswertung erfolgt über die Parameter Flussmuster,

Fließrichtung, Art der Strömung (laminar oder turbulent) sowie die

Geschwindigkeitsverteilung im Gefäß.

Zur quantitativen Auswertung werden verschiedene Geschwindigkeiten und Indizes

berechnet (TAYLOR u. HOLLAND 1990). Für die Bestimmung arterieller Blutflüsse

werden die systolische Maximalgeschwindigkeit (systolic peak velocity = SPV), die

diastolische Geschwindigkeit (diastolic peak velocity = DPV), die enddiastolische

Geschwindigkeit (enddiastolic peak velocity = EDV) und die amplitudengewichtete

mittlere Maximalgeschwindigkeit (time averaged maximum velocity = TAMAX)

gemessen. Als Indizes stehen der Pulsatilitätsindex (PI) und der Widerstandsindex

(RI) im Vordergrund.

Der PI ist unabhängig von dem Winkel der Arterie und von der Geschwindigkeit der

Trägerflüssigkeit (GOSLING u. KING 1974). Er wurde als Indikator für proximale

Stenosen etabliert.

Der Widerstandsindex (RI) (POURCELOT 1974) wurde zur Charakterisierung der

Arteria carotis communis etabliert. Er gibt eine Aussage über den Gefäßwiderstand

distal der Messstelle.

Ein weiterer Index, der A/B-Quotient (STUART et al. 1980) eignet sich besonders für

Arterien mit niedrigem peripheren Widerstand.

Literaturübersicht

28

Bei Arterien mit hohem peripheren Widerstand wird häufig der S/D-Quotient nach

DEEG u. WILD (1990) verwendet:

BIAGIOTTI et al. (2002) konnten bei Männern durch Messung von RI und SPV

zwischen obstruktiver und nicht obstruktiver Dysspermie unterscheiden. Hierbei

zeigten Männer mit nichtobstruktiver Dyspermie signifikant niedrigere Werte.

Bei Männern mit pathologischem Spermabefund fanden PINGGERA et al. (2008)

einen signifikanten Anstieg des RI im Vergleich zu einer gleichaltrigen Kontrollgruppe

mit Normospermie. Bei Vorliegen von Variozelen (Krampfadern im Venengeflecht des

Hodens) waren die Werte am höchsten. Dieses deckt sich mit den Untersuchungen

von BIAGIOTTI et al. (2002). Auch hier wiesen die Männer mit Variozelen die

höchsten Werte auf.

2.7.4 Zweidimensionale Sonographie der Hoden

Zur Sonographie der Hoden eignet sich besonders ein hochauflösender

Linearschallkopf (SEYREK-INTAS et al. 2010). Empfohlen wird die Verwendung einer

Vorlaufstrecke, z. B. der kontralaterale Hoden (LÜERSSEN u. JANTHUR 2007), sowie

das direkte Aufsetzen des Schallkopfes auf den zu untersuchenden Hoden (SEYREK-

INTAS et al. 2010). Die Sonographie der Hoden kann sowohl am stehenden, wie auch

am liegenden Tier durchgeführt werden (LÜERSSEN u. JANTHUR 2007). Der

physiologische Hoden ist gut umschrieben, oval, mit einer glatten Oberfläche. Eine

definierte Kapsel ist als dünne echoreiche Linie darstellbar (PUGH et al. 1990). Die

Echogenität sollte homogen, feinkörnig sein (BARR 1992; LÜERSSEN u. JANTHUR

2007; SEYREK-INTAS et al. 2010). Andere Quellen sprechen von grob-körnig (PUGH

et al. 1990). Im Zentrum des Hodens zeichnet sich eine echoreiche Linie, das

Mediastinum testis, ab (PUGH et al. 1990; BARR 1992; LÜERSSEN u. JANTHUR

2007). Der Nebenhoden stellt sich beim Hund etwas gröber als der Hoden dar und

Literaturübersicht

29

auch die Oberfläche kann etwas unregelmäßig erscheinen (BARR 1992; GÜNZEL-

APEL et al. 2001).

2.7.5 Dopplersonographie der Hoden

Am Hoden des Hundes zeigten sich im physiologischen Zustand ein monophasisches

Flussmuster sowie ein hoher diastolischer Blutfluss. Tumorös veränderte Hoden

weisen eine signifikante Zunahme der systolischen Maximalgeschwindigkeit und der

amplitudengewichteten mittleren Geschwindigkeit auf. Am Nebenhoden konnte kein

Blutfluss festgestellt werden (GÜNZEL-APEL et al. 2001). Eine Studie an 42 klinisch

geschlechtsgesunden Beagle-Rüden ergab in der Marginalarterie einen

durchschnittlichen PI von 0,78 und RI von 0,49 (GUMBSCH et al. 2002).

2.7.6 Zweidimensionale Sonographie der Prostata

Die Untersuchung der Prostata wird in Rückenlage oder seitlicher Lage durchgeführt.

Bei kurzen Untersuchungen ist auch eine Untersuchung am stehenden Tier möglich.

Der üblicherweise gewählte Konvexschallkopf (5 MHz) wird hierbei parapräputial,

leicht zum Becken hin gekippt, aufgesetzt (PRÜFER et al. 2007, SEYREK-INTAS et

al. 2010). Die Prostata befindet sich kaudal der Blase. Das Prostataparenchym zeigt

sich mittelechogen und ist beim jüngeren Hund fein gekörnt. Ältere Hunde zeigen eine

gröbere Körnung. Im Längsschnitt stellt sich die Prostata oval dar, im Querschnitt

zeigt sie aufgrund der Lappung eine Schmetterlingsform (GÜNZEL-APEL et al. 2001;

PRÜFER et al. 2007; SEYREK-INTAS 2010). Die Prostata sollte sich symmetrisch mit

weichen Grenzlinien darstellen (JOHNSTON et al. 1991). Die Länge der Prostata wird

definiert nach RUEL et al. (1998) als die längste die beiden Lappen teilende Strecke,

die Höhe als die maximale Strecke im 90° Winkel dazu. Eine Studie an 100 intakten

erwachsenen Hunden (die im Rahmen einer Impfung vorgestellt wurden) ergab eine

durchschnittliche Länge von 3,3 cm (± 0,9) sowie eine durchschnittliche Breite von

2,6 cm (± 0,7) (RUEL et al. 1998).

Literaturübersicht

30

2.8 Wärmeregulation am Hoden

Die Innentemperatur des Skrotums liegt bei Säugetieren 2 bis 7°C unter der

Körperkerntemperatur.

Bei adulten Ratten zeigte sich ein konstanter Temperaturgradient zwischen Hoden

und Rektum von 3 bis 5°C. Dieser wurde bei einem Anstieg der Rektaltemperatur

größer, da die Temperatur im Hoden sich nicht verändert (KORMANO 1967). Die

Adaptation männlicher Ratten an eine Umgebungstemperatur von 35°C führte zu

einer Herabsetzung der Befruchtungsraten, einhergehend mit Degeneration der

Hoden. Der Gradient zwischen Rektal- und Hodentemperatur blieb dabei aber

erhalten (SOD-MORIAH et al. 1974). Entscheidend ist also das Gleichgewicht

zwischen der über die Arteria testicularis eingebrachten Wärme und der durch

Stoffwechselvorgänge entstehenden Wärme sowie der über das Skrotum

abgegebenen Wärme.

An der Aufrechterhaltung der Skrotaltemperatur sind verschiedene Mechanismen

beteiligt (SETCHELL 1978a/b). Der Hauptmechanismus, die vom Körper produzierte

Wärme zu reduzieren, liegt im Gegenstromprinzip. Das Gegenstromprinzip funktioniert

aufgrund von Temperaturdifferenzen. Diese resultieren daraus, dass das venöse Blut

kälter ist als das arterielle Blut. Bestandteile des Gegenstromprinzips sind die stark

geknäuelte Arteria testicularis sowie der darum angeordnete Venenplexus, Plexus

pampiniformis, die zusammen als testicular vascular cone bezeichnet werden

(COULTER u. KASTELIC 1994). Da Arterie und Vene an vielen Stellen nur durch die

Gefäßwand begrenzt sind, kann ein effektiver Wärmeaustausch stattfinden. Ein

weiterer, wenn auch geringerer Anteil der Wärme wird über oberflächlich verlaufende

Arterien abgegeben (SETCHELL 1978a).

Die testikulären Blutgefäße sind sympathisch innerviert. Ein vermehrter Blutfluss

bewirkt immer auch, durch größere Abstrahlung der Wärme über oberflächliche

Arterien sowie eine verstärkte Evaporation, eine Kühlung des Hodengewebes

(SETCHELL 1978b). Zusätzlich kommt es durch den erhöhten Blutfluss auch zu

Literaturübersicht

31

einem stärkeren Verlust von Flüssigkeit, sowie vermehrter Schweißbildung am

Skrotum.

Durch Kontraktionen der Muskelanteile der Tunica dartos kann das Skrotum in Falten

gelegt und die Hoden hochgezogen und näher an die Bauchhöhle gebracht werden.

Neben dem Musculus cremaster, der als quergestreifter Muskel zu keiner lang

anhaltenden Kontraktion befähigt ist, sind die in die Skrotalhaut integrierten glatten

Muskelzellen beteiligt, welche über Katecholamine stimuliert werden (SETCHELL

1978a).

2.9 Einfluss einer Hyperthermie auf das Hodengewebe

Der Einfluss einer Hyperthermie auf den Hoden wurde bereits bei verschiedenen

Haustierarten untersucht. ALBRECHT (2006) erwärmte die Hoden von vier Bullen

über 48 Stunden um durchschnittlich 4,3°C durch Anbringen eines Suspensoriums.

24 Stunden nach Entfernung des Suspensoriums war eine Zunahme des Umfangs um

9%, des Volumens um 22% und der Länge und Breite um 7% zu verzeichnen. Auch

bei Hengsten, welche 48 Stunden ein Suspensorium trugen, führte der dadurch

erreichte Temperaturanstieg um 2 bis 3°C zu einer Verringerung der

Disulfidbindungen und der Chromatinstabilität, gemessen mittels sperm chromatin

structure assay (SCSA). Betroffen waren hier vor allem primäre Spermatozyten,

während sich bereits im Nebenhoden befindliche Spermien keinen Schaden nahmen

(LOVE u. KENNEY 1999). Dieses deckt sich mit Ergebnissen anderer Studien. So

bewirken die meisten Methoden zur Erwärmung der Hoden Schäden an den primären

Spermatozyten und den frühen Spermatiden. Einige Studien weisen aber auch Effekte

auf die Spermatogonien und die Sertolizellen nach (SETCHELL 2006). Ebenfalls bei

Bullen konnte nach 48 Stunden Erwärmung mittels Suspensorium Auswirkungen auf

die Samenqualität beobachtet werden. So kam es zwar nicht zu einer Veränderung

der Ejakulatmenge, wohl aber zu einer geringen Verschlechterung der Motilität sowie

zu massiven Schäden der Morphologie (VOGLER et al. 1993).

Literaturübersicht

32

Im Falle einer akuten Orchitis kommt es ebenfalls zu einer Hyperthermie am Hoden

(SINOWATZ 2001).

Diese Erkrankung führt innerhalb kürzester Zeit zu irreparablen Schäden am

Keimepithel mit erheblicher Beeinträchtigung der Samenbeschaffenheit. Auch

subakute und chronische Orchitiden können den Untergang des Keimepithels

bedingen. In experimentellen Studien zeigten sich die durch Wärmeapplikation

enstandenen Schäden oftmals als reversibel. In einigen Fällen aber zeigten sich nicht

zu unterschätzende Langzeiteffekte, welche die Fruchtbarkeit nachhaltig

einschränkten (SETCHELL 2006). Es existieren aber auch große individuelle

Schwankungen zwischen den einzelnen Rassen einer Tierart sowie einzelnen Tieren

einer Spezies.

Bei Lamas führte die vierwöchige Haltung in Wärmeställen bei 29°C zu einer

Abnahme der Spermienkonzentration, die ein bis vier Wochen nach Hitzeeinwirkung

am stärksten war. Gleichzeitig stieg der Anteil morphologisch abweichender Spermien

an. Ab der dritten Woche sank die Mortalität der Spermien bis zu einem Minimum von

20% in der achten Woche ab (SCHWALM et al. 2007).

Die mittlere Blutflussgeschwindigkeit fiel bei allen vier von ALBRECHT (2006)

untersuchten Bullen, z. T. biphasisch, ab. Die Werte normalisierten sich sehr

unterschiedlich. Nach initialem Abfall bei allen Bullen, zeigten zwei Bullen einen

weiteren kontinuierlichen Abfall bis Woche zwei mit anschließender Normalisierung in

Woche vier bzw. fünf. Bei einem Bullen normalisierte sich der Blutfluss zwischen

Woche zwei und vier mit leichten Schwankungen. Der letzte Bulle zeigte bis Woche

vier sehr niedrige Werte mit anschließendem Anstieg auf Ausgangsniveau in Woche

fünf. Keinen Einfluss auf den Blutfluss in der Arteria testicularis hat eine Kühlung des

Skrotums. Hier kam es lediglich zu einem reduzierten Blutfluss innerhalb der

Skrotalgefäße (GLODE et al. 1984).

Zur Darstellung der Ödematisierung eines einzelnen Hodens wurde sowohl von

ALBRECHT (2006) als auch SCHWEIZER (2006) die Ermittlung des Grauwertes

genutzt. So zeigten die vier Bullen von SCHWEIZER (2006) maximale Grauwerte in

Woche eins nach Wärmeapplikation. Ein Abfall auf Aufgangswerte erfolgte, mit einer

Ausnahme in Woche sechs, in den Wochen zwei bis vier. Bei drei Hengsten, welche

Literaturübersicht

33

eine Erwärmung der Hoden um durchschnittlich 2 bis 4°C mittels Suspensorium über

48 Stunden erfahren hatten, zeigten sich unterschiedliche Ergebnisse in der

Auswertung des mittleren Grauwertes. So zeigte ein Hengst kaum Veränderungen,

wohingegen ein anderer Hengst einen massiven Abfall direkt nach der

Wärmeapplikation mit anschließender Regeneration zeigte. Der dritte Hengst zeigte

ebenfalls einen massiven Abfall des Grauwertes direkt nach Wärmeapplikation mit

einem Anstieg auf Ausgangswert bis Woche sieben nach Wärmeapplikation.

HE gefärbte Hodengewebsschnitte von Lamas, nach vierwöchiger Haltung im

Wärmestall, wurden von SCHWALM et al. (2007) untersucht. Der Anteil vollständig

degenerierter Hodentubuli betrug in der Kontrollgruppe 5%, unmittelbar nach der

vierwöchigen Hyperthermie 40% und sank innerhalb der darauf folgenden zwei bis

sechs Wochen auf 10% ab. Der am häufigsten bei Hyperthermiestudien

dokumentierte Effekt des Zelluntergangs ist die Apoptose unter Beteiligung von

reaktiven Sauerstoffspezies, sowie dem Tumor supressor Gen p53 und der

Freisetzung von Cytochrom C (SETCHELL 2006).

So wurde auch die Apoptoserate von SCHWALM et al. (2007) mit Hilfe des TUNEL-

Verfahrens untersucht. In der Kontrollgruppe waren 22 bis 30 Zellen pro 100

Hodentubuli positiv. Es zeigten sich keine signifikanten Veränderungen gegenüber

den behandelten Tieren, welche drei, fünf, sieben und neun Wochen nach der

vierwöchigen Wärmephase kastriert wurden. Betroffen waren bei allen Tieren vor

allem primäre Spermatozyten. Insgesamt wurde postuliert, dass nicht eine

verminderte Apoptoserate sondern eine vermehrte Proliferation der Keimzellen wieder

eine Normalisierung der Spermaparameter bedingte.

Eine 45-minütige Erhöhung der Umgebungstemperatur auf 42°C führte bei Ratten zu

einem Anstieg TUNEL-positiver Zellen bis 15 Minuten nach Wärmeapplikation, gefolgt

von einer Abnahme. Betroffen waren vor allem die Typ A-Spermatogonien, während

die Spermatiden relativ resistent erschienen (KHAN u. BROWN 2002).

Mithilfe des Ki-67-Verfahrens stellten SCHWALM et al. (2007) die Proliferation im

Hoden dar. Hierbei wurde ein Quotient aus positiven Zellen gegenüber negativen

Zellen, bezogen auf zehn Hodentubuli aufgestellt. In 20,5% der Tubuli der

Kontrolltiere zeigten sich keine positiven Zellen. Dagegen stieg die Zahl auf 54,4%

Literaturübersicht

34

direkt nach der Hitzeeinwirkung, anschließend erfolgte ein langsamer Abfall auf 11,1%

sechs Wochen nach Hitzeeinwirkung.

Durch den Nachweis von Cytochrom C und Caspasen wurde eine Beteiligung der

Mitochrondrien an den apoptotischen Prozessen nachgewiesen (SINHA HIKIM et al.

2003). Auch zeigte sich in Hoden nach 20 Minuten bei 43°C mittels RNA-Extraktion

und PCR eine verminderte Anzahl DNA - reparierender Gene, sowie eine vermehrte

Anzahl apoptotischer Zellen und Hitzeschockproteine (ROCKETT et al. 2001).

Material und Methoden

35

3 Material und Methoden

Dieser Tierversuch wurde mit dem Aktenzeichen Tierversuchsnummer 08/1469

genehmigt.

3.1 Tiere

Für die Studie standen insgesamt zehn Beagle-Rüden im Alter von ein bis drei Jahren

(Durchschnitt zu Beginn der Studie 23,7 Monate) aus der

Reproduktionsmedizinischen Einheit der Kliniken, Klinik für Kleintiere mit einem

durchschnittlichen Gewicht von 14,8 kg zur Verfügung. Die Rüden wurden in Gruppen

von zwei bis drei Hunden in Außenzwingern mit Schutzhütten gehalten. Einmal täglich

wurden sie mit einer kommerziellen Mischung aus Feucht- und Trockenfutter gefüttert.

Wasser stand ad libitum zur Verfügung. Drei Tiere dienten als Kontrollgruppe; bei

sieben Hunden wurde ein- bzw. zweimalig eine skrotale Temperaturerhöhung

induziert. Alle Hunde befanden sich während des gesamten Studienzeitraumes in

einem guten Pflege- und Allgemeinzustand. Anhand andrologischer,

spermatologischer und mikroskopischer Parameter wurde bei allen Rüden klinische

und bakterielle Geschlechtsgesundheit sowie Normospermie diagnostiziert.


36

3.2 Versuchsaufbau

3.2.1 Vorlauf

Tabelle 1: Versuchsablauf Vorlauf (n = 10) Woche Morphologie Ultraschall Anzahl der Tiere

1 * * 10 2 * 10 3 * 10 4 * * 10

Kastration Kontrollgruppe (n = 3) Hyperthermie 1 (n = 7)

5 * * * * * * 7 6 * * 7 7 * * 7 8 * 7 9 * 7 10 * 7 11 * 7 12 * 7 13 * 7 14 * (n = 2) * 7

Kastration (n = 2) Hyperthermie 2 (n = 5)

15 * * * * * * 5 16 * * 5 17 * (n = 3) * * 5

Kastration Tag 10 nach 2. Hyperthermie (n = 3) 18 * * 2 19 * 2 20 * 2 21 * (n = 2) * 2

Kastration Tag 40 nach 2. Hyperthermie (n = 2)


37

Zu Beginn und am Ende einer vierwöchigen Vorlaufzeit wurden Hoden, Nebenhoden

und Prostata aller zehn Hunde morphologisch untersucht. Außerdem fand einmal pro

Woche eine Ultraschalluntersuchung statt. Die Rüden der Kontrollgruppe (n = 3)

wurden anschließend kastriert.

3.2.2 Wärmeapplikation

Bei den verbleibenden sieben Rüden wurde über einen Zeitraum von 48 Stunden eine

Temperaturerhöhung im Bereich des Skrotums erzeugt. Alle sechs Stunden wurden

die Rüden an der Leine zum Harn- und Kotabsatz auf eine Wiese geführt. Wasser

stand ad libitum zur Verfügung, gefüttert wurden die Hunde wie gewohnt einmal

täglich. Um eine kontinuierliche Wärmeapplikation zu gewährleisten, wurde den

Hunden ein Suspensorium angelegt. Dieses bestand aus einer äußeren wasser- und

luftundurchlässigen Schicht aus thermoplastischem Kautschuk (Ethylen-Propylen-

Dien-Kautschuk und Polypropylen, Fa. Engineering Technology Marketing GmbH,

Saalburg-Eversdorf) wie er zur Abdeckung für Türfeststeller im Automobil

Verwendung findet. Die zweite Schicht bestand aus Rolta Polsterwatte (Fa.

Tierärztebedarf J. Lenecke, Schortens) um das Skrotum gegen mechanische

Schädigungen zu schützen. Direkt dem Hodensack anliegend befand sich ein weiches

Babysöckchen, bestehend aus 60% Baumwolle, 20% Nylon, 19% Polyester und 1%

Elastane-Lycra (Fa. KiK Textilien und Non-Food GmbH, Bönen).

Das Suspensorium wurde mit Hilfe von vier gepolsterten Bändern (Abb. 1) an einem

handelsüblichen Geschirr befestigt, so dass ein sicherer Sitz gewährleistet war.


38

Abbildung 1: Suspensorium zur Erhöhung der Skrotaltemperatur bei Rüden

In das Suspensorium wurde ein Temperaturfühler (Fa. TFA Klima Logger, Dostmann

GmbH, Wertheim-Reicholtsheim) so eingearbeitet, dass er dem Skrotum unmittelbar

auflag. Das zugehörige Kabel wurde so am Geschirr befestigt, dass kein Zug auf den

Fühler entstehen konnte und dann über die Abdeckung der Box zum Sender geleitet.

Die Messstation gab ein Alarmsignal ab, sobald sich die Temperatur aus dem

vorgegebenen Temperaturbereich (36 bis 42°C) entfernte. Auf diese Weise konnte ein

evtl. Verrutschen des Fühlers oder des Suspensoriums sofort bemerkt und behoben

werden. Alle 60 Minuten wurde die aktuelle Skrotaltemperatur aufgezeichnet.

Während des gesamten 48-stündigen Zeitraums der Wärmeapplikation wurden die

Rüden lückenlos im Wechsel von zwei Personen beaufsichtigt. Falls erforderlich

wurde zusätzlich ein Halskragen aufgelegt um die Tiere am Benagen des

Suspensoriums sowie der Haltekonstruktionen und Temperaturkabel zu hindern.

3.2.3 Untersuchungen nach 48-stündiger Wärmeapplikation

Im Anschluss an die Wärmeapplikation wurden alle sieben Rüden über neun Wochen

folgenden Untersuchungen unterworfen: unmittelbar und 24 Stunden nach Entfernen

des Suspensoriums morphologische Untersuchung sowie Sonographie von Hoden

und Prostata und dopplersonographische Untersuchung der Hodenperfusion.


39

In den darauf folgenden drei Wochen wurden eine zweimalige sonographische

Untersuchung von Hoden und Prostata sowie dopplersonographische

Untersuchungen der Hodenperfusion in drei- bis viertägigen Abständen durchgeführt,

danach wurden eine sonographische Untersuchung von Hoden und Prostata sowie

dopplersonographische Untersuchung der Hodenperfusion pro Woche durchgeführt.

Am Ende der neun Wochen zusätzlich eine morphologische Untersuchung von Hoden

und Prostata. Danach wurden zwei Rüden kastriert. Bei den fünf verbleibenden

intakten Rüden fand eine zweite Hyperthermiephase, identisch zur ersten statt. Die

daran anschließenden Untersuchungen entsprachen der oben beschriebenen

Vorgehensweise. Drei Rüden wurden zehn Tage und zwei Rüden 40 Tage nach der

zweiten Wärmeapplikation kastriert.

3.3 Morphologische Untersuchung

Die morphologische Untersuchung der Genitalorgane erfolgte in der von GÜNZEL-

APEL (1994) beschriebenen Vorgehensweise. Die äußere Haut des Skrotums wurde

adspektorisch auf ihre Beschaffenheit und eventuelle Veränderungen untersucht.

Palpatorisch wurde die Verschieblichkeit der einzelnen Schichten gegeneinander und

gegen den Hoden geprüft. Der Skrotalumfang wurde mit Hilfe eines Maßbandes

gemessen. An den Hoden wurden folgende Parameter erfasst: adspektorisch

geschätzte Größe, mittels Schieblehre gemessene Länge und Breite, Lage, Form und

Konsistenz der Hoden. Die Nebenhodenanteile, Kopf, Körper und Schwanz, wurden

auf ihre Abgrenzbarkeit untersucht. Am Nebenhodenschwanz wurde zusätzlich die

Größe geschätzt und Form, Lage und Konsistenz bestimmt. Ferner wurden die

Samenstränge bezüglich der Verschieblichkeit der Schichten und die

Hodensacklymphknoten bezüglich ihrer Palpierbarkeit untersucht.

Bei der rektalen Palpation der Prostata wurden die Größe sowie Oberfläche, Lappung,

Schmerzhaftigkeit und Konsistenz beurteilt.

Die Untersuchung von Penis und Präputium erfolgt durch Adspektion und Palpation.


40

3.4 Ultraschalluntersuchung

Alle Ultraschalluntersuchungen wurden mit einem Gerät des Typs Logiq 5 Pro

(General Electrics Medical Systems, Solingen) durchgeführt.

Die Hunde wurden auf einer gepolsterten Unterlage in Seitenlage verbracht. Aufgrund

der guten Kooperation der Hunde war eine Sedation in keinem Fall erforderlich. Zur

besseren Ankopplung wurden der Hodensack und ein kleiner Bereich paramedian ca.

3 cm vom Penis entfernt geschoren und handelsübliches Ultraschallgel aufgetragen.

Die Hoden wurden nacheinander mit einem 12-MHz-Linearschallkopf untersucht. Die

Darstellung erfolgte im Real-time-Modus im Längs- und Querschnitt. Es wurde die

Echogenität und Homogenität des Hodenparenchyms beurteilt. Länge und Breite der

Hoden wurden am jeweils größten Durchmesser gemessen. Anschließend wurde

mittels Farbdoppler die Arteria marginalis im kranialen Hodenabschnitt und der

Blutfluss durch dreimalige Messung der systolischen Maximalgeschwindigkeit (SPV)

in cm/s, der Widerstandsindex (RI) und der Pulsatilitätindex (PI) ermittelt. Alle Bilder

wurden zur Dokumentation und zur Auswertung abgespeichert.

Von der Prostata wurde im zweidimensionalen Bild (5 MHz Konvexschallkopf) die

Parenchymbeschaffenheit beurteilt und die maximale Länge und Höhe jeweils

zweimal gemessen.

3.5 Kastration und Aufbereitung der Hoden

Die Kastration der Hunde fand zu den im Versuchsablauf (Tabelle 1) angegebenen

Zeitpunkten in der Klinik für Kleintiere der Tierärztlichen Hochschule Hannover statt.

Nach Einleitung der Narkose wurde der Bereich zwischen Penis und Skrotum rasiert

und mehrfach nach Standard der Klinik gewaschen und desinfiziert. Die Operation

erfolgte nach der in der Klinik üblichen Vorgehensweise. Direkt nach Entnahme der

Hoden wurden diese mittels scharfer Mikrotomklinge in drei Teile geschnitten und in

entsprechend beschriftete (Name des Rüden, Tag der Kastration, Hodenabschnitt)

Behälter mit 4% Formalinlösung gelegt.


41

Nach 24 Stunden wurden die Hoden aus dem Formalin entnommen und im Institut für

Pathologie in jeweils eine Scheibe pro Abschnitt geschnitten. Diese Proben wurden

anschließend in einen Gewebeeinbettungsautomaten (Hypercenter II, Shandon,

Frankfurt/Main) überführt. In dem Gerät wurden die Proben nach einstündiger Fixation

in 10%igem Formalin und Spülung mit Leitungswasser in einer aufsteigenden

Alkoholreihe (70%, 85%, 96%) dehydriert. Anschließend erfolgte die Entfernung des

Alkohols mittels Isopropanol und Essigsäure-Butylester.

Am nächsten Tag erfolgte die Einbettung mit Hilfe des Einbettsystems Tissue Tek

(Sakura, AT Zoeterwounde, Niederlande). Hierbei wurden die Präparate in 64°C

warmes Paraplast Plus® (Shandon, Frankfurt/Main) eingebettet und auf 5°C gekühlt.

Aus den Blöcken wurden mittels Rotationsmikrotom (Microm International GmbH,

Walldorf) 2 μm dicke Schnitte angefertigt und auf Superfrost® Plus Objektträger (Fa.

Menzel Gläser, Braunschweig) gezogen. Um gleichmäßige Präparate zu erhalten

wurden die Blöcke um ca. ¼ herunter geschnitten. Die darauf folgenden Schnitte

wurden der Untersuchung zugeführt. Vor dem unmittelbaren Aufziehen wurden die

Schnitte in ein Wasserbad mit Raumtemperatur überführt, anschließend folgte ein

zweites Wasserbad bei 40°C, um gestreckte gleichmäßige Schnitte zu gewährleisten.

Im weiteren Verlauf wurden die Schnitte im Wärmeschrank (Heraeus, Hanau) bei

70°C getrocknet. Insgesamt wurden pro Hund sechs Schnitte angefertigt, pro Hoden

je ein Schnitt aus dem kranialen, mittleren und kaudalen Segment.


42

3.6 Histologische und immunhistochemische Verfahren

3.6.1 Hämalaun-Eosin Färbung

Für die HE-Färbung wurde ein Färbautomat Leica 4040 (Leica Microsystems GmbH,

Wetzlar) genutzt. Dieser arbeitet nach einem standardisierten Protokoll (siehe 9.1).

Die Schnitte wurden entparaffiniert und anschließend mit Hämalaun und Eosin gefärbt

und im weiteren Verlauf mittels eines Eindeckautomaten (Promounter RCM 2000,

Medite Medizintechnik Burgdorf) mit Deckgläsern versehen.

3.6.2 TUNEL - Verfahren

Zur Darstellung apoptotischer Zellen wurde zum einen das TUNEL-Verfahren

angewandt. Hierfür kam das ApopTag® Plus Kit (Fa. Chemicon® International, Ltd.,

Hampshire, United Kingdom) zum Einsatz, welches die Aufbereitung der Schnitte in

mehreren Schritten und enzymatische Reaktionen mittels TdT-Enzymen beinhaltet

(siehe 9.1). Hierbei werden alle Zellen mit fragmentierter DNA im mikroskopischen

Bild braun dargestellt. Jede dieser verfärbten Zellen wird zusätzlich auf ihre

Morphologie untersucht. Ausgezählt wurden nur Zellen mit typischer pyknotischer

Morphologie. Als Positivkontrolle diente ein Präparat der Milchdrüse einer Ratte.

Folgeschnitte der zu untersuchende Gewebeschnitte wurden mit PBS anstelle der

working strenghth Tdt solution inkubiert und dienten so der Negativkontrolle.

3.6.3 Immunhistologischer Nachweis der aktivierten Form der Caspase-3

Zum Nachweis der aktivierten Caspase-3 wurde nach der ABC-Methode (siehe 9.1)

für formalinfixierte Paraffinmaterialien verfahren. Als Blockserum wurde ein

Ziegenserum verwandt. Dieses dient der Blockierung unspezifischer Bindungsstellen.

Als primärer Antikörper diente ein polyklonaler, vom Kaninchen stammender

Antikörper. Dieser ist gegen die p17 Untereinheit der aktivierten Caspase-3 gerichtet.


43

Als sekundärer Antikörper kam ein GAR-b (Goat-anti Rabbit, Ziege anti Kaninchen

Antikörper) zum Einsatz.

Aufgrund der beschleunigten Umwandlung von DAB (3,3`-Diaminobenzidin-

tetrahydrochloridihydrat) durch das Enzym Peroxidase entsteht an der Reaktionsstelle

ein präzipitierendes Farbprodukt, welches sich ablagert und im mikroskopischen Bild

braun darstellt.

Auch hier lief eine Positivkontrolle der Methode in Form eines Präparates einer

Hundemilz mit. Als Negativkontrollen dienten parallele Schnitte des zu

untersuchenden Gewebes welche mit 1:3000 in PBS mit 1% BSA verdünntem

Kaninchenserum anstelle des Primärantikörpers (Kaninchen anti Caspase-3) inkubiert

wurden.

3.6.4 Ki-67-Antigen

Für den Nachweis des Ki-67-Antigens kam der monoklonale Anti-Human Ki-67-

Antikörper Clone MIB-1 zum Einsatz. Dieser monoklonale Mausantikörper gilt als

Referenzantikörper für formalinfixierte Präparate. Die Reaktion läuft ebenfalls mit Hilfe

der ABC – Methode ab. Als zweiter Antikörper fand ein GAM-b (Goat-anti Mouse)

Verwendung (siehe 9.1). Zunächst werden hierbei antigene Vernetzungen gelöst und

mittels NHS (Natural Horse Serum) blockiert. Anschließend kann der spezifische

primäre Antikörper binden. Als weitere Komponente wird das mit einer Peroxidase

konjungierte Streptavidin hinzugegeben. Dieses kann nun mit Hilfe eines

peroxidasespezifischen Chromogens sichtbar gemacht werden. So wird das Antigen

über zwei Antikörperbrücken indirekt lokalisiert und sichtbar gemacht. Bei jeder

immunhistochemischen Reaktion lief ein Schnittpräparat eines Hundedarms als

Positivkontrolle mit. Für die Negativkontrolle wurden Schnitte des zu untersuchenden

Gewebes durch Weglassen des Primärantikörper mit geführt.


44

3.7 Mikroskopische Auswertung

Die mikroskopische Auswertung erfolgte mittels eines Standard-Binokular-

Lichtmikroskops (Carl-Zeiss, Oberkochen; Okular x10, Objektiv x16/x40). Hierbei

wurden die Schnitte meanderförmig durchgemustert. Dabei wurde zunächst der

Hodenbereich, anschließend der Nebenhodenbereich untersucht.

In der HE-Färbung wurden 50 nahezu runde Tubuli bei 40-facher Vergrößerung

ausgewertet. Zwischen den erfassten Tubuli wurden jeweils vier Gesichtsfelder frei

gelassen. Nach Durchmusterung des gesamten Schnittes wurde der Vorgang von der

anderen Seite her wiederholt, bis 50 verschiedene Tubuli ausgewertet waren. Im

Bereich der Nebenhoden wurden immer zwei Gesichtsfelder übersprungen und 25

Anschnitte ausgewertet.

In den Hoden wurden folgende Degenerationsanzeichen quantitativ erfasst:

A: verkleinerte Keimzellen E: geschwollene Spermatozyten

B: geschrumpfte Tubuli F: Zelldebris

C: Sertoli only G: verdickte Basalmembran

D: multinukleäre Riesenzellen H: vakuolig aufgelockertes Zytoplasma

Als Sertoli only klassifizierte Hodentubuli zeigen keine Keimzellen, sondern

ausschließlich Sertolizellen.

An den Nebenhoden wurde auf folgende Veränderungen geachtet:

a) unreife Spermien c) Zelldebris

b) vakuolig aufgelockertes Epithel d) keine Spermien im Lumen

Die für das TUNEL-Verfahren, Caspase-3-Nachweis und den Ki-67 Nachweis

präparierten Schnitte wurden auf zwei verschiedene Arten ausgewertet. Zum einen

erfolgte eine Durchmusterung analog zu den HE-gefärbten Schnitten. Ausgewertet

wurden ebenfalls 50 quer angeschnittene Tubuli bei 40facher Vergrößerung.


45

Die zweite Auswertung richtete sich an den Sertolizellen aus. In jedem zehnten

Gesichtsfeld wurden die quer angeschnittenen Tubuli bei zehnfacher Vergrößerung

aufgesucht und bei 40facher Vergrößerung begutachtet. Gezählt wurden pro Tubulus

die Anzahl der Sertolizellen und die Anzahl der positiven Zellen. Wurden im letzten

Tubulus 100 Sertolizellen überschritten, wurde dieser trotzdem komplett ausgewertet.

Im Nebenhodenbereich wurden insgesamt 25 Querschnitte auf die Anzahl positiver

Zellen untersucht. Positive Zellen waren anhand ihrer Braunfärbung zu erkennen.

3.8 Statistische Auswertung

Aufgrund der geringen Tierzahl war eine statistische Auswertung nicht möglich. Die

Auswertung erfolgte daher rein deskriptiv. Die Berechnung der Mittelwerte,

Standardabweichungen sowie Minima und Maxima und die Erstellung der Graphiken

erfolgte mit dem Programm Microsoft Excel®.

Die Auswertung erfolgte vergleichend zwischen den behandelten Tieren und der

Kontrollgruppe sowie der einzelnen Tiere vor und nach der Wärmeapplikation, immer

unter Berücksichtigung der Kastrationszeitpunkte sowie der Anzahl der

Wärmeapplikationen.

Ergebnisse

46

4 Ergebnisse

Alle für die Studie verwendeten Rüden waren während des gesamten

Untersuchungszeitraumes klinisch allgemein- und geschlechtsgesund.

Die Skrotaltemperatur betrug vor der Wärmeapplikation durchschnittlich 32,1°C

(28,4 - 35,2°C). Während der ersten 48-stündigen Hyperthermiephase (n = 7) wurde

diese Basaltemperatur um durchschnittlich 3,7°C auf 35,8°C (34,8 bis 41,6°C)

erhöht. Im Zuge der zweiten Hyperthermiephase (n = 5) wurde eine

Temperaturerhöhung um 3,8°C auf 35,9°C (34,0 bis 38,8°C) erreicht.

4.1 Befunde der morphologischen Untersuchung

Bei allen sieben Hunden zeigte sich direkt nach Abnahme des Suspensoriums eine

Ödematisierung des Skrotums. Bei sechs Hunden kam es zusätzlich zu einer

Rötung. Zwei Hunde zeigten leichte Scheuerstellen am Skrotum. Bereits 24 Stunden

nach Abnahme des Suspensoriums war die Ödematisierung fast vollständig

abgeklungen. Zu diesem Zeitpunkt war bei drei Hunden noch eine leichte Rötung der

Skrotalhaut zu verzeichnen. Die Scheuerstellen heilten innerhalb einer Woche ab.

Nach der zweiten Wärmeapplikation waren bei drei Hunden umschriebene,

geringgradig verdickte Bereiche der Skrotalhaut direkt nach Abnahme des

Suspensoriums zu erkennen.

Eine Zu- oder Abnahme der Hodendimensionen und des skrotalen Umfangs konnte

nach den Hyperthermiephasen nicht festgestellt werden (Abb. 2 und 3)

Ergebnisse

47

10,0

11,0

12,0

13,0

14,0

15,0

16,0cm

Hyperthermie 1 Hyperthermie 2

Abbildung 2: Mittlerer (±SD) Skrotalumfang (cm), vor und nach der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, T = Tag, SD = Standardabweichung

n=10 n=7 n=5 n=3 n=2

Vorlauf 9 Wochen 10. T 40. T

Ergebnisse

48

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0cm

Länge Breite


0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5cm

Länge BreiteHyperterthermie 1 Hyperthermie 2

Abbildung 3: Mittlere (±SD) Länge und Breite des a) linken und b) rechten Hodens, gemessen mittels Schieblehre, vor und nach der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie, n = Anzahl der Rüden, T = Tag, SD = Standardabweichung

n=10 n=7 n=5 n=3 n=2

Vorlauf 9 Wochen 10. T 40. T

n=10 n=7 n=5 n=3 n=2

Vorlauf 9 Wochen 10. T 40 T.

a)

b)

Ergebnisse

49

4.2 Befunde der sonographischen Untersuchung

Die im Ultraschall gemessenen Werte für die Hodenlänge waren im Mittel

geringgradig höher, die der Breite eher etwas niedriger als die mittels Schieblehre

erhobenen Befunde. Alle sonographisch beurteilten Parameter zeigten weder

innerhalb der Gruppen noch im Gruppenvergleich auffällige Unterschiede.

Nach der Wärmeapplikation waren keine Veränderungen der Hoden- und

Prostatadimensionen nachweisbar (Abb. 4).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0cm Kontrollgruppe n=3

Vorlauf n=7Nach 1. Hyperthermie n=7Nach 2. Hyperthermie n=5

Abbildung 4: Mittlere (±SD) Länge (L) und Breite (B) des linken (li) und rechten (re) Hodens (H), sowie der Länge (L) und Höhe (H) der Prostata (P) in der Kontrollgruppe, vor und nach der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Auch im zeitlichen Verlauf zeigten die Hoden- und Prostatadimensionen keine

deutlichen hyperthermiebedingten Schwankungen (Abb. 5 und 6). Alle messbaren

Abweichungen waren maximal im Millimeterbereich zu finden.

H li L H li B H re L H re B P L P H

Ergebnisse

50

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0cm

Länge BreiteHyperthermie 1 Hyperthermie 2

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0cm

Länge BreiteHyperthermie 1 Hyperthermie 2

Abbildung 5: Mittels Ultraschall gemessene mittlere (±SD) Länge und Breite des linken (a) und rechten (b) Hodens vor und nach der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

a)

n=10 n=7 n=5 n=2

Vorlauf 9 Wochen 10 Tage 40 Tage

b)

n=10 n=7 n=5 n=2


Ergebnisse

51

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0cm

Länge HöheHyperthermie 1 Hyperthermie 2

Abbildung 6: Mittels Ultraschall gemessene mittlere (±SD) Länge und Höhe der Prostata vor und nach der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Die Untersuchung der Hodenperfusion erbrachte für die systolische

Maximalgeschwindigkeit (SPV) eine sehr hohe Variationsbreite. Dies betraf sowohl

die Hoden eines Tieres (Vergleich links-rechts) als auch die einzelnen

Untersuchungstage. Lediglich ein leichter Anstieg nach der Wärmeapplikation auf die

winkelkorrigierten Werte war zu erkennen (Abb. 7). Die Kontrollgruppe zeigte

insgesamt niedrigere Werte.


n=10 n=7 n=5 n=2

Ergebnisse

52

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

m/s


0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

m/s


Abbildung 7: Mittlere (±SD) winkelkorrigierte systolische Maximal-geschwindigkeit (SPV) der A. marginalis am linken (a) und rechten (b) Hoden vor und nach der 1. und 2. sktoralen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

n = 10 n = 7 n = 5 n = 2

n = 10 n = 7 n = 5 n = 2


a)

b)


Ergebnisse

53

Der Mittelwertvergleich zwischen den einzelnen Gruppen zeigt ebenfalls einen nur

geringgradigen Anstieg der systolischen Maximalgeschwindigkeit unmittelbar nach

den Hyperthermiephasen an (Abb. 8).

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0m/s Kontrollgruppe n=3

Vorlauf n=7Nach 1. Hyperthermie n=7Nach 2. Hyperthermie n=5

Abbildung 8: Mittlere (±SD) winkelkorrigierte systolische Maximalgeschwindig-keit (SPV) der A. marginalis des rechten und linken Hodens vor und nach der 1. und 2. sktoralen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Der Pulsatilitätsindex (PI) und der Widerstandsindex (RI) variierten in ihrer

Ausprägung ebenfalls so stark, dass keine eindeutigen Auswirkungen der

Wärmeapplikation zu erkennen waren.

Dies wurde sowohl im zeitlichen Verlauf (Abb. 9) als auch im unmittelbaren Vergleich

nach den Wärmeapplikationen sichtbar (Abb. 10). Insgesamt waren beide Indizes in

der Kontrollgruppe niedriger als bei den Versuchstieren.

SPV links SPV rechts

Ergebnisse

54

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

PI RI


0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

PI RI


Abbildung 9: Mittlerer (±SD) Pulsatilitätsindex (PI) und Widerstandsindex (RI) am a) linken Hoden und b) rechten Hoden vor und nach der 1. und 2. sktoralen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

a)

b)

n = 10 n = 7 n = 5 n = 2

n = 10 n = 7 n = 5 n = 2



Ergebnisse

55

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8Kontrollgruppe n=3Vorlauf n=7Nach 1. Hyperthermie n=7Nach 2. Hyperthermie n=5

Abbildung 10: Mittlerer (±SD) Pulsatilitätsindex (PI) und Widerstandsindex (RI) am linken und rechten Hoden in der Kontrollgruppe, im Vorlauf sowie unmittelbar nach der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

PI links PI rechts RI links RI rechts

Ergebnisse

56

4.3 Histologische und immunhistochemische Befunde

Insgesamt waren nach Wärmeapplikation nur sehr geringe histologische und

immunhistochemische Veränderungen feststellbar.

4.3.1 Hoden

HE-gefärbte Präparate

In den HE-gefärbten Hodenschnitten fiel vor allem eine vakuolige Auflockerung auf

(Abb. 11). In der Kontrollgruppe waren durchschnittlich 3,2 Hodentubuli (2-5)

betroffen, während es neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation im Mittel 4,2

Hodentubuli (2-7) waren. Zehn Tage nach der zweiten Wärmeapplikation zeigten

durchschnittlich 4 Hodentubuli (1-8) vakuolige Veränderungen. 40 Tage nach zweiter

Wärmebehandlung waren mit 6,7 (3-11) die meisten Hodentubuli betroffen.

Ergebnisse

57

Abbildung 11: a) Vakuolig veränderte Zellen des Keimepithels eines Hundes 40 Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie (x200); b) unveränderte Hodentubuli eines Hundes der Kontrollgruppe (x100)

a)

b)

Ergebnisse

58

Auch das vermehrte Auftreten von Zelldebris in den Hodentubuli (Abb. 12) ließ einen

zeitlichen Zusammenhang mit der Wärmeapplikation erkennen. In der Kontrollgruppe

war der Anteil betroffener Tubuli mit durchschnittlich 1,9 (1-4) am geringsten. Neun

Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation war durchschnittlich die größte Anzahl

Tubuli betroffen (x̄ = 3,1; 1-6). Zehn Tage nach zweiter Wärmeapplikation zeigten

sich mit 2,0 (0-3) nahezu identische Werte gegenüber der Kontrollgruppe. 40 Tage

nach der zweiten Wärmeapplikation zeigte sich die durchschnittliche Anzahl an

Tubuli mit Zelldebris (x̄ = 2,9; 1-5) ähnlich wie neun Wochen nach einmaliger

Wärmeapplikation.

Abbildung 12: Zelldebris im Lumen eines Hodentubulus eines Hundes neun

Wochen nach einmaliger skrotaler Hyperthermie (x400)

Die übrigen erfassten Degenerationserscheinungen waren in allen Versuchsgruppen

nur vereinzelt nachweisbar (Abb. 13).

Ergebnisse

59

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

Anzahl betroffener Tubuli pro 50 Tubuli

Sertoli only

Multinukleäre Riesenzellen

Geschwollene Spermatozyten

Zelldebris

Verdickte Basalmembran

Vakuolig aufgelockertes Epithel

Abbildung 13: Mittlere Anzahl (±SD) der von verschiedenen Degenerations-erscheinungen betroffenen Hodentubuli in der Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 (n = 2) Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Apoptose positive Zellen (TUNEL-Verfahren)

Bezogen auf 100 Sertolizellen zeigte sich eine deutliche Zunahme der TUNEL-

positiven Zellen (Abb. 14) zehn und 40 Tage nach der zweiten Wärmeapplikation.

Dagegen lag in der Kontrollgruppe mit durchschnittlich 2,9 (0-8) und neun Wochen

nach einmaliger Wärmeapplikation mit 2,0 (0-4) TUNEL-positiven Zellen pro 100

Sertolizellen ein ähnliches Niveau vor. Zehn Tage nach zweiter Wärmeapplikation

stellten sich mit durchschnittlich 5,7 (3-10) und 40 Tage nach zweiter

Wärmeapplikation mit 6,7 (3-17) nahezu doppelt so viele Zellen TUNEL-positiv dar

(Abb. 15).

Kontrollgruppe 9 Wochen 10 Tage 40 Tage

Ergebnisse

60

Abbildung 14: a) Hodentubuli eines Hundes der Kontrollgruppe, eine einzelne TUNEL - positive Zelle (↑) in einem Tubulus (x100); b) vier TUNEL - positive Zellen (↑) in einem Hodentubulus eines Hundes zehn Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie (x400)

a)

b)

Ergebnisse

61

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

Anzahl TUNEL-positiver Zellen pro 100 Sertolizellen

Kontrollgruppe n=3

9 Wochen n=2

10 Tage n=3

40 Tage n=2

Abbildung 15: Anzahl TUNEL - positiver Zellen pro 100 Sertolizellen in der Kontrollgruppe, neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie sowie zehn und 40 Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Von dem Anstieg TUNEL-positiver Zellen war in erster Linie das Stadium vier des

Keimepithelzyklus nach FOOTE und SWIERSTRA (1972) betroffen (Abb. 16). Die

am meisten positiven Zellen waren primäre Spermatozyten und Spermatogonien.

Ergebnisse

62

0

5

10

15

20

25

30

1 2 3 4 5 6 7 8

%

Abbildung 16: Prozentualer Anteil aller Tubuli mit TUNEL - positiven Zellen pro 100 Sertolizellen aufgeteilt nach den Stadien des Keimepithelzyklus über alle Gruppen zusammengefasst (Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 (n = 2) Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie)

Auch die Auswertung pro 50 Hodentubuli erbrachte die höchsten durchschnittlichen

Anteile TUNEL – positiver Zellen zehn Tage und 40 Tage nach der zweiten

Wärmeapplikation. In der Kontrollgruppe fanden sich im Mittel 3,9 (0-8) TUNEL –

positive Zellen pro 50 Hodentubuli. Allerdings war unter dieser Voraussetzung auch

neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation (x̄ = 6,9; 3-12) eine moderate

Zunahme zu verzeichnen. Zehn Tage (x̄ = 10; 4-16) und 40 Tage (x̄ = 8,8; 4-14) nach

zweiter Wärmeapplikation stellte sich ca. die doppelte Anzahl an Zellen TUNEL –

positiv dar (Abb. 17).

Ergebnisse

63

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

Anzahl TUNEL-positiver Zellen pro 50

Tubuli

Kontrollgruppe n=3

9 Wochen n=2

10 Tage n=3

40 Tage n=2

Abbildung 17: Anzahl TUNEL-positiver Zellen pro 50 Hodentubuli in der Kontrollgruppe, neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie sowie zehn und 40 Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Apoptose positive Zellen (Caspase-3-Nachweis)

Insgesamt war die Anzahl positiver Zellen im Caspase-3-Nachweis deutlich geringer

als nach Auswertung mit dem TUNEL-Verfahren.

Bezogen auf 100 Sertolizellen zeigte die Kontrollgruppe durchschnittlich 0,5 (0-2)

Caspase-3-positive Zellen (Abb. 18), während neun Wochen nach einmaliger

Hyperthermie mit 2,9 (0-6) die meisten positiven Zellen pro 100 Sertolizellen

detektiert wurden. Zehn Tage nach zweiter Wärmeapplikation waren durchschnittlich

1,1 (0-5) Caspase – 3 – positive Zellen pro 100 Sertolizellen zu finden. 40 Tage nach

der zweiten Wärmeapplikation lag eine ähnliche Situation wie neun Wochen nach

einmaliger Wärmeapplikation vor (x̄ = 2,2; 0-9) (Abb. 20).

Ergebnisse

64

Abbildung 18: a) Hodentubuli eines Kontrolltieres, keine Caspase - 3 - positive Zelle (x100); b) Hodentubuli eines Rüden neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie, drei Caspase - 3 - positive Zellen (↑) in einem Hodentubulus (x100)

a)

b)

Ergebnisse

65

Abbildung 19: Caspase-3-positive Zelle (↑) im Hodentubulus eines Hundes zehn Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie (x400)

Ergebnisse

66

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

Anzahl Caspase-3-positiver Zellen pro 100 Sertolizellen

Kontrollgruppe n=3

9 Wochen n=2

10 Tage n=3

40 Tage n=2

Abbildung 20: Anzahl Caspase-3-positiver Zellen pro 100 Sertolizellen in der Kontrollgruppe, neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie sowie zehn und 40 Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie

Die größte Anzahl Caspase-3-positiver Zellen fanden sich in den Stadien vier und

sechs des Keimepithelzyklus nach FOOTE und SWIERSTRA (1972) (Abb. 21),

betroffen waren wiederum Spermatogonien und primäre Spermatozyten.

Ergebnisse

67

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1 2 3 4 5 6 7 8

%

Abbildung 21: Prozentualer Anteil aller Tubuli mit Caspase-3-positiven Zellen pro 100 Sertolizellen aufgeteilt nach den Stadien des Keimepithelzyklus über alle Gruppen zusammengefasst (Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 (n = 2) Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie)

Bei der Auswertung pro 50 Hodentubuli war eine ähnliche Tendenz zu erkennen.

In der Kontrollgruppe war die Anzahl Caspase-3-positiver Zellen am geringsten

(x̄ = 0,9; 0-5). Neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation waren mit mehr als

doppelt so vielen Caspase-3-positiven Zellen (x̄ = 3,9; 0-7) im Vergleich zur

Kontrollgruppe, die meisten apoptotischen Zellen zu beobachten.

Zwischen den Tieren, die zehn Tage nach zweiter Wärmeapplikation (x̄ = 2,2; 0-17)

und denjenigen, die 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation (x̄ = 2,3; 0-6) kastriert

wurden, zeigte sich nur ein geringer Unterschied (Abb. 22).

Ergebnisse

68

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

Anzahl Caspase-3-positiver Zellen pro 50

Tubuli

Kontrollgruppe n=3

9 Wochen n=2

10 Tage n=3

40 Tage n=2

Abbildung 22: Anzahl Caspase -3 - positiver Zellen pro 50 Hodentubuli in der Kontrollgruppe, neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie sowie zehn und 40 Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Ergebnisse

69

Proliferierende Zellen im Ki-67-Antigen Nachweis

Einzig Ki-67 positive Spermatogonien wurden ausgezählt (Abb. 23).

In der Kontrollgruppe (x̄ = 118,6; 62-176) sowie 40 Tage nach zweiter

Wärmeapplikation (x̄ = 119,7; 74-172) zeigte sich die größte Anzahl an

proliferierenden Zellen pro 100 Sertolizellen (Abb. 24).

Zehn Tage nach der zweiten Wärmeapplikation (x̄ = 111,6; 38-228) war die

Proliferationsrate pro 100 Sertolizellen etwas geringer. Neun Wochen nach

einmaliger Wärmeapplikation (x̄ = 84,2; 56-120) hingegen war die geringste

Proliferation zu beobachten (Abb. 24).

Ergebnisse

70

Abbildung 23: a) Ki - 67 - positive Spermatogonien (↑) in den Hodentubuli eines Hundes zehn Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie (x100); b) einzelne Ki - 67 - positive Spermatogonien in dem Hodentubuli eines Hundes der Kontrollgruppe (x100); positiv erscheinende Spermatozyten wurden nicht mitgezählt

b)

a)

Ergebnisse

71

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

140,0

160,0

180,0

Anzahl Ki-67-positiver Zellen pro 100 Sertolizellen

Kontrollgruppe n=3

9 Wochen n=2

10 Tage n=3

40 Tage n=2

Abbildung 24: Anzahl Ki-67-positiver Zellen pro 100 Sertolizellen in der Kontrollgruppe, neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie sowie zehn und 40 Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Bei der Auszählung pro 50 Hodentubuli zeigte sich in der Kontrollgruppe die

niedrigste Anzahl proliferierender Zellen mit durchschnittlich 199,6 (110-302). Neun

Wochen nach einmaliger Hyperthermie fanden sich 231,1 (134-310) positive Zellen

pro 50 Hodentubuli, zehn Tage nach zweiter Wärmeapplikation 239,0 (120-350). Die

40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation gewonnenen Hoden zeigten mit 293,8 (110-

492) ungefähr die gleiche Proliferation wie die anderen Versuchsgruppen auf (Abb.

25).

Ergebnisse

72

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

350,0

400,0

Anzahl Ki-67-positiver Zellen pro 50 Tubuli Kontrollgruppe n=3

9 Wochen n=2

10 Tage n=3

40 Tage n=2

Abbildung 25: Anzahl Ki-67-positiver Zellen pro 50 Hodentubuli in der Kontrollgruppe, neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie sowie zehn und 40 Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Ergebnisse

73

4.3.2 Nebenhoden

HE – gefärbte Präparate

Im Bereich der Nebenhoden lag die Anzahl der Tubulusanschnitte mit vakuolig

aufgelockerten Tubulusepithelzellen (Abb. 26) auf einem höherem Niveau als in den

Hoden. Bei allen wärmebehandelten Tieren war die mittlere Anzahl (x̄ ) betroffener

Tubulusanschnitte pro 25 ausgezählter Tubulusanschnitte gegenüber der

Kontrollgruppe (x̄ = 2,4; 1-5) deutlich erhöht. So zeigten sich neun Wochen nach

einmaliger Wärmeapplikation durchschnittlich 12,7 (1-25) Tubulusanschnitte mit

vakuolig aufgelockerten Epithelzellen. Zehn Tage nach zweiter Wärmeapplikation

waren es 16,2 (1-25) und 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation 11,3 (0-25)

Tubulusanschnitte pro 25 ausgezählter Tubulusanschnitte (Abb. 27).

Ergebnisse

74

Abbildung 26: a) Vakuolig aufgelockerte Epithelzellen in einem Nebenhodentubulus eines Hundes zehn Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie (x100); b) Nebenhodentubulusanschnitt ohne vakuolig verändertes Epithel eines Hundes der Kontrollgruppe (x100)

b)

a)

Ergebnisse

75

Der Anteil zelldebrishaltiger Nebenhodentubulusanschnitte pro 25 ausgewertete

Tubulusanschnitte betrug in der Kontrollgruppe durchschnittlich 0,22 (0-1), neun

Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation 1,8 (0-4), zehn Tage nach zweiter

Wärmeapplikation 3,2 (1-13) und 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation 1,9 (0-7).

Ein weiteres Merkmal stellten die Nebenhodentubulusanschnitte ohne luminale

Spermien dar (Abb. 27). Im Vergleich zur Kontrollgruppe (x̄ = 1,9; 0-6) war die Anzahl

nach skrotaler Wärmeapplikation relativ einheitlich erhöht und betrug neun Wochen

nach einmaliger Wärmeapplikation im Mittel 5,2 (0-24), zehn Tage nach zweiter

Wärmeapplikation 4,8 (0-25) sowie 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation 4,8 (0-

25). Dagegen war die durchschnittliche Anzahl unreifer Spermien im Lumen der

Nebenhodentubulusanschnitte in der Kontrollgruppe mit 2,6 (0-8) höher als neun

Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation (x̄ = 1,6; 0-4), zehn Tage nach zweiter

Wärmeapplikation (x̄ = 1,2; 0-6) sowie 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation

(x̄ = 1,3; 0-3) (Abb. 28).

Abbildung 27: Nebenhodentubulus ohne Spermien (↑) eines Hundes neun Wochen nach einmaliger skrotaler Hyperthermie (x200)

Ergebnisse

76

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

Anzahl betroffener Tubuli pro 25

Tubulusanschnitte

unreife Spermien

vakuolig aufgelockertes Epithel

Zelldebris

keine Spermien im Lumen

Abbildung 28: Mittlere Anzahl (±SD) der von verschiedenen Degenerationserscheinungen betroffenen Nebenhodentubulusanschnitte in der Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 (n = 2) Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Apoptose positive Zellen (TUNEL-Verfahren)

Im Nebenhodenepithel zeigten sich in der Kontrollgruppe durchschnittlich 0,4 (0-2)

TUNEL-positive Zellen pro 25 ausgewertete Tubulusanschnitte. Neun Wochen nach

einmaliger Wärmeapplikation (x̄ = 3,8; 1-9) sowie zehn Tage nach zweiter

Wärmeapplikation (x̄ = 4; 0-10) konnte eine ca. 8-fach höhere Anzahl TUNEL-

positiver Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden. Dagegen

bestand zwischen der Kontrollgruppe und den Tieren, die 40 Tage nach zweiter

Wärmeapplikation (x̄ = 0,8; 0-4) kastriert wurden, kein nennenswerter Unterschied

(Abb. 29).


Ergebnisse

77

Auch im Nebenhodenstroma war eine Zunahme der TUNEL-positiven Zellen (um das

ca. 3-4-Fache) vor allem neun Wochen nach einmaliger und zehn Tage nach zweiter

Wärmeapplikation zu beobachten.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

Anzahl TUNEL-positiver Zellen pro 25

Tubulusanschnitte / Gesichtsfelder

Lumen Epithel

Stroma

Abbildung 29: Anzahl TUNEL - positiver Zellen pro 25 Nebenhodentubulus-anschnitte im Stroma, Epithel und Lumen in der Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2), sowie zehn (n = 3) und 40 Tage (n = 2) nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

Apoptose positive Zellen (Caspase-3-Nachweis)

Bei der Auswertung der Nebenhodentubulusanschnitte zeigten sich vor allem im

Nebenhodenepithel Caspase-3-positive Zellen. In der Kontrollgruppe (x̄ = 0,2; 0-1)


Ergebnisse

78

wurde nur eine geringe Anzahl Caspase-3-positiver Zellen gefunden. Auch neun

Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation (x̄ = 0,6; 0-2) lagen die Caspase-3-

positiven Zellen auf einem niedrigen Niveau. Lediglich zehn Tage nach zweiter

Wärmeapplikation war ein Anstieg der Caspase-3-positiven Zellen um das 8-Fache

bzw. 3-Fache auf durchschnittlich 1,6 positive Zellen pro 25 ausgezählte

Nebenhodentubulusanschnitte (0-10) zu verzeichnen. 40 Tage nach zweiter

Wärmeapplikation (x̄ = 0,2; 0-1) zeigte sich kein Unterschied im Vergleich zur

Kontrollgruppe (Abb. 30).

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

Anzahl Caspase-3-positiver Zellen pro 25

Tubulusanschnitte / Gesichtsfelder

Lumen Epithel

Stroma

Abbildung 30: Anzahl Caspase-3-positiver Zellen pro 25 Nebenhoden-tubulusanschnitte im Stroma, Epithel und Lumen in der Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 Tage (n = 2) nach der 2. zweiten skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung


Ergebnisse

79

Proliferierende Zellen im Ki – 67 – Antigen Nachweis

In den Nebenhoden wiesen in erster Linie die Epithelzellen eine verstärkte

Proliferation auf (Abb. 31). Die Proliferationsrate lag in der Kontrollgruppe bei

durchschnittlich 9,2 Zellen pro 25 ausgezählte Tubulusanschnitte und war neun

Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation um ca. die Hälfte reduziert (x̄ = 5,8; 0-

16). Zehn Tage (x̄ = 11,0; 1-30) bzw. 40 Tage (x̄ = 11,3; 0-44) nach zweiter

Wärmeapplikation waren die Resultate annähernd identisch und auch in Bezug zur

Kontrollgruppe nicht deutlich abweichend (Abb. 32).

Abbildung 31: Ki-67 - positive Zellen (↑) im Nebenhodentubulusepithel eines Hundes neun Wochen nach einmaliger skrotaler Hyperthermie (x400)

Ergebnisse

80

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

20,0

Anzahl Ki-67-positiver Zellen pro 25

Tubulusanschnitten / Gesichtsfeldern Stroma

Epithelial

Luminal

Abbildung 32: Anzahl Ki-67 - positiver Zellen pro 25 Nebenhoden-tubulusanschnitte im Stroma, Epithel und Lumen in der Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 Tage (n = 2) nach der zweiten skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung


Diskussion

81

5 Diskussion

5.1 Versuchsdurchführung

Wie bei Bullen, Hengsten und Ratten gezeigt wurde, kann eine moderate

Hyperthermie über einen Zeitraum von nur 48 Stunden oder eine kurzfristige

Hyperthermie bei Temperaturen um 40°C pathologische Veränderungen der Hoden

erzeugen (COULTER u. KASTELIC 1994; LOVE u. KENNEY 1999; KHAN u. BROWN

2002; WU 2005; ALBRECHT 2006; SCHWEIZER 2006; SCHWALM et al. 2007).

Aufgrund dessen wurde in der vorliegenden Studie ein Zeitraum von 48 Stunden für

die skrotale Wärmeapplikation gewählt. Mit Hilfe eines Suspensoriums wurde eine

moderate Temperaturerhöhung von durchschnittlich 3,8°C erzielt. In der ersten

Hyperthermiephase betrug die Durchschnittstemperatur 35,8°C (34,8-41,6°C), in der

zweiten Hyperthermiephase wurde eine durchschnittliche Temperatur von 35,9°C

(34,0-38,8°C) erreicht. Ein vergleichbarer Anstieg wurde auch bei Hengsten (34,7 bis

35,3°C bei SCHWEIZER 2006 und eine Erhöhung um 2-3°C bei LOVE u. KENNEY

1999) erreicht. Bei Bullen wurde über 48 Stunden eine durchschnittliche

Temperaturerhöhung um 3,9°C; 5,5°C; 6,3°C und 6,6°C erreicht (ALBRECHT 2006).

Aufgrund der kontinuierlichen Überwachung der Tiere konnte die Hyperthermie über

den gesamten 48-stündigen Versuchszeitraum relativ konstant gehalten werden.

Zusätzlich erwies sich das verwendete Temperaturmesssystem für die stündliche

Temperaturkontrolle und -dokumentation als geeignet. Das integrierte Alarmsystem

ermöglichte die sofortige Kontrolle und Korrektur des Sitzes des Suspensoriums.

Aufgrund der kleinen Tierzahlen pro Gruppe konnte lediglich eine deskriptive

statistische Auswertung erfolgen. Dies ist auch in den Studien von WU (2005),

ALBRECHT (2006) und SCHWEIZER (2006) der Fall.

Da die hier verwendeten Rüden ein regelmäßiges Handling gewohnt waren, verhielten

sie sich bei allen Untersuchungsmaßnahmen äußert kooperativ, so dass keine

Sedation erforderlich war. Die morphologische Untersuchung erfolgte nach der von

GÜNZEL-APEL (1994) beschriebene Vorgehensweise.

Diskussion

82

Die chirurgische Entfernung der Hoden wurde unter sorgfältiger Schonung des

Hodengewebes vor Quetschungen und anderweitigen Schädigungen durchgeführt.

Gleiches galt auch für die Aufteilung der Hoden in jeweils drei Segmente (kranial,

Mitte, kaudal) unmittelbar nach der Gonadektomie. Diese Dreiteilung der Hoden

wurde gewählt, um den Nebenhoden in seinen funktionellen Abschnitten

Nebenhodenkopf, -körper und -schwanz zu erfassen. Aufgrund der geringen Anzahl

TUNEL- und Caspase-3-positiver Zellen erfolgte die Auswertung insgesamt für den

gesamten Nebenhoden. Die Aufbereitung der Organe für die histologischen und

immunhistochemischen Untersuchungen fand unter exakter Einhaltung der

erforderlichen Arbeitsschritte statt. Zum Nachweis apoptotischer Zellen kamen zwei

verschiedene Verfahren (TUNEL-Verfahren und Caspase-3-Nachweis) zur

Anwendung, so dass nach den Empfehlungen von ELMORE (2007) eine möglichst

große Genauigkeit gewährleistet werden konnte.

Der Nachweis des Ki-67-Antigens hat sich zur Feststellung der Zellproliferation

aufgrund des im Vergleich zu anderen Verfahren größeren Zeitfensters bewährt

(WROBEL et al. 1993) und wurde deswegen in dieser Studie eingesetzt.

Die mikroskopische Auswertung mittels meanderförmiger Durchmusterung der

Gewebeschnitte erlaubte eine möglichst objektive Beurteilung, da jeder Bereich des

Schnittes erreicht wurde. Auch konnten durch „Überspringen“ einer bestimmten

Anzahl an Gesichtsfeldern Hodentubuli und Nebenhodentubulusanschnitte nach dem

Zufallsprinzip ausgewählt werden.

5.2 Morphologische Befunde

Bei der morphologischen Untersuchung zeigten die Rüden unmittelbar nach

Beendigung der skrotalen Hyperthermie eine auch bei Bullen und Hengsten

(ALBRECHT 2006; SCHWEIZER 2006) beschriebene Ödematisierung des Skrotums.

Diese verschwand innerhalb von 24 Stunden. Die bei sechs Hunden beobachtete

zusätzliche Rötung der Skrotalhaut beruhte wahrscheinlich auf der nicht vollständig

vermeidbaren Reibung des Suspensoriums am Skrotum. Diese kann zu einer

Diskussion

83

zusätzlichen lokalen Temperaturerhöhung infolge einer Reizung des Gewebes und

der Blutgefäße geführt haben. Da diese leichten Irritationen bei drei Hunden (Rüde: 5,

Kastration neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation; Rüde: 6, Kastration zehn

Tage nach zweiter Wärmeapplikation; Rüde: 10, Kastration 40 Tage nach zweiter

Wärmeapplikation) bereits nach 24 Stunden, bei den anderen drei Hunden (Rüde: 4,

Kastration neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation; Rüde: 7, Kastration zehn

Tage nach zweiter Wärmeapplikation; Rüde: 8, Kastration 10 Tage nach zweiter

Wärmeapplikation) wenige Tage später vollständig abgeklungen waren, sind

allenfalls geringfügige Effekte auf das Hodenparenchym zu erwarten. Dies gilt auch

für die bei zwei Hunden (Rüde: 4, Kastration neun Wochen nach einmaliger

Wärmeapplikation; Rüde: 8, Kastration zehn Tage nach zweiter Wärmeapplikation)

zusätzlich festgestellten Scheuerstellen mit punktuell stärkerer Reizung der

Skrotalhaut durch das Suspensorium. Trotz der subjektiv feststellbaren

Ödematisierung des Skrotums war nur eine geringe Zunahme des Skrotalumfanges

von 0,2 cm nachzuweisen. Als Grund für eine solche Zunahme in Anschluss an einen

Temperaturstimulus sieht ALBRECHT (2006) eine provozierte aseptische

Entzündungsreaktion. In dem Falle dieser Studie scheint es sich allerdings eher um

einen Prozess des Skrotums zu handeln, welches als Reaktion auf den

Temperaturstimulus Flüssigkeit eingelagert hat. Aufgrund der Tatsache, dass diese

Ödematisierung bereits nach 24 Stunden wieder normalisiert wurde ist von keiner

Auswirkung auf den Hoden auszugehen.

Alle weiteren morphologischen Parameter wiesen weder tendenzielle noch

spezifische Veränderungen im Zusammenhang mit der Hyperthermie auf.

5.3 Sonographische Befunde

Für die Ultraschalluntersuchungen wurden die in der Literatur als ideal bezeichneten

Bedingungen geschaffen (BARR 1992; LÜERSSEN u. JANTHUR 2007). So wurde bei

allen Rüden das Skrotum sowie zusätzlich ein Bereich paramedian des Penis

geschoren. Des Weiteren wurden durch eine weiche Unterlage, Ruhe und einen

Diskussion

84

abgedunkelten Raum die Untersuchungsbedingungen optimiert. Aufgrund der

Kooperationsbereitschaft der Hunde konnten alle Messungen in Ruhe und mit Sorgfalt

durchgeführt werden.

Auch die im Rahmen der Ultraschalluntersuchung gemessenen Parameter ließen

keine Veränderung mit klarem Bezug zur Wärmeapplikation erkennen.

Schwankungen zeigten sich sowohl im Vergleich der einzelnen Gruppen zur

Kontrollgruppe als auch innerhalb der einzelnen Gruppen im Vergleich vor und direkt

nach Wärmeapplikation. Ebenso wiesen die Dimensionen der Prostata keine auf die

skrotale Hyperthermie zurückzuführenden Veränderungen auf.

Die systolische Maximalgeschwindigkeit (SPV) war in allen Versuchsphasen von

starken inter- und intraindividuellen Schwankungen geprägt. Lediglich unmittelbar

nach den Hyperthermiephasen stieg die mittlere systolische Maximalgeschwindigkeit

in allen Versuchsgruppen gegenüber der Kontrollgruppe. Anschließend lagen die

Schwankungen im Bereich der Kontrollgruppe. ALBRECHT (2006) dagegen konnte

bei 4 Bullen, welche ebenfalls eine skrotale Hyperthermie mittels Suspensorium

erfahren haben, initial einen Abfall der Blutflußgeschwindigkeit in der Arteria

testicularis ein bis zwei Wochen nach Abnahme des Suspensoriums feststellen,

postuliert aber eine entzündungsbedingte Hyperämie während und direkt nach

Hyperthermie mittels Suspensorium. Anschließend kam es auch in dieser Studie zu

hohen individuellen Schwankungen. Gemessen wurde 30 Stunden nach Abnahme

des Suspensoriums, sodass diese vermutete entzündungsbedingte Hyperämie nicht

ganz ausgeschlossen werden konnte. Aus diesem Grunde wurde bei den Rüden

dieser Studie direkt nach Abnahme des Suspensoriums sowie nach 24 Stunden eine

sonographische Untersuchung durchgeführt. Ein anschließender Abfall der mittleren

systolischen Maximalgeschwindigkeit konnte nicht nachgewiesen werden. Ursache

hierfür könnten etwas geringere Temperaturerhöhungen gewesen sein. Aber auch

eine geringere Empfindlichkeit der Rüden könnte dem zugrunde liegen.

Bei Ratten hatte eine skrotale Temperaturerhöhung keinen Einfluss auf den

intratestikulären Blutfluss (GALIL u. SETCHELL 1988). Dasselbe wird für eine skrotale

Temperaturerniedrigung bei Hunden geltend gemacht (GLODE et al. 1984).

Diskussion

85

5.4 Histologische Befunde

Hoden Die HE-Färbung wurde als Übersichtsfärbung genutzt. Die Gewebeschnitte wurden

auf die von GOEDKEN et al. (2008) beschriebenen Degenerationserscheinungen

(verkleinerte Keimzellen, geschrumpfte Tubuli, „Sertoli only“, multinukleäre

Riesenzellen, geschwollene Spermatozyten, Zelldebris und verdickte Basalmembran)

untersucht. Zusätzlich wurde das Merkmal „vakuolig aufgelockertes Zytolasma“

untersucht. Aufgrund des Alters der in dieser Studie verwendeten Beagle-Rüden von

durchschnittlich 23,7 Monaten zu Studienbeginn zeigten sich bei allen Tieren nur

geringe Degenerationserscheinungen. Alle in dieser Studie untersuchten Hunde

zeigten adulte Spermatogenese, wie sie bei FORD (1969) beschrieben ist. REHM

(2000) stellte bei 30% der untersuchten Beagle–Rüden im Alter von 13 Monaten eine

bilaterale segmentale Hypospermatogenese fest. GOEDKEN et al. (2008) dagegen

beobachteten bei 20% eine verringerte Spermatogenese, 75% dieser Tiere waren

sechs bis acht Monate alt. In diesem Alter sieht FORD (1969) erst eine beginnende

Spermatogenese, sodass derartige Befunde nicht auf Degeneration sondern auf das

junge Alter zurückzuführen sind. Befunde dieser Art waren bei keinem der in der

vorliegenden Studie verwendeten Beagle-Rüden festzustellen. Als Zeichen der

Degeneration wurden lediglich vereinzelte Hodentubuli mit Zelldebris und

multinukleären Riesenzellen nachgewiesen. GOEDKEN et al. (2008) nutze genau wie

REHM (2000) für toxikologische Studien gezüchtete Beagle-Rüden, allerdings aus

verschiedenen Laboren. Auch wenn diese bisher an keinem Versuche teilnahmen

scheint es doch in dieser Zuchtlinie, evt. erblich bedingte, zu stärkeren pathologischen

Veränderungen im Hodenepithel zu kommen, da es bei keinem in dieser Studie

verwendeten Rüden zu so starken histologischen Abweichungen kam. Zusätzlich zu

den oben beschriebenen Degenerationserscheinungen war in den

Hodentubulusepithelzellen eine vakuolige Auflockerung zu verzeichnen. Im Vergleich

zur Kontrollgruppe war die Anzahl der betroffenen Hodentubuli bei den 40 Tage nach

zweiter Wärmeapplikation kastrierten Tieren auf das Doppelte erhöht (Kontrollgruppe:

x̄ = 3,2 ± 0,9; 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation x̄ = 6,7 ± 2,2). Die vermehrte

Diskussion

86

Bildung zytoplasmatischer Bläschen kann für eine vakuolige Degeneration der Zellen

sprechen. Hierbei kommt es durch Verschiebung des Ionensystems der Zelle zu

einem vermehrten Flüssigkeitseinstrom. Diese vermehrte Flüssigkeit sammelt sich in

den erweiterten Zisternen des endoplasmatischen Retikulums oder des

Grundplasmas (SANDERSLEBEN et al. 1989). Der Prozess ist reversibel, kann aber

auch in nekrotische Prozesse übergehen. Eine vermehrte Bildung zytoplasmatischer

Bläschen wird grundsätzlich als Merkmal nekrotischer Prozesse angesehen

(ELMORE 2007). Zu bedenke wäre also, dass in der vorliegenden Studie bereits eine

einmalige Wärmeapplikation zu einer Verschiebung des Ionensystems führte, welche

noch nach neun Wochen feststellbar war. Die Bildung von Vakuolen wird aber auch

als charakteristisch für Hitzestress angesehen (MOORE 1924; DAVIS u. FIRLIT

1966). YIN et al. (1997) postuliert, dass Vakuolen sich immer im Anschluss an

apoptotische Prozesse bilden. So konnte bei experimentellem Kryptorchismus an

adulten Mäusen eine Korrelation zwischen Vakuolen und vermehrter DNA-

Fragmentation festgestellt werden (YIN et al. 1997). Auch zehn Tage nach einer

zweiten Wärmeapplikation zeigte sich eine ähnliche Anzahl Tubuli mit vakuoliger

Degeneration. 40 Tage nach der zweiten Wärmeapplikation erhöhte sich die Anzahl

der Tubuli mit vakuoliger Degeneration um ein Drittel. Ein gesetzter Wärmestimulus

wirkt sich also nachhaltig auf die Ionenbilanz der Hodentubuluszellen aus oder aber

bewirkt verstärkt Keimzellverluste über apoptotische Prozesse. Da auch in der

Kontrollgruppe eine geringe Anzahl an Hodentubuli mit vakuoliger Auflockerung zu

verzeichnen war, ist trotz größtmöglicher Sorgfalt im Umgang mit den Hoden eine

Artefaktbildung nicht vollständig auszuschließen. Aufgrund der Tatsache, dass bei

allen wärmebehandelten Tieren eine quantitative Zunahme der Hodentubuli mit

vakuoliger Degeneration eintrat, ist ein Effekt durch die Wärmeapplikation durchaus

zu vermuten. Diese Langzeiteffekte einer lokalen Hyperthermie sind möglicherweise

auch auf eine Schädigung der Sertolizellen zurückzuführen (SETCHELL 2006), oder

aber resultieren in einer verminderte Repopulation der apoptotischen Zellen.

Entsprechend waren bei den 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation kastrierten

Tieren mehr Hodentubuli mit Zelldebris feststellbar als bei den Kontrolltieren

(Kontrollgruppe x̄ = 1,9 ± 0,8; 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation x̄ = 2,9 ± 1,3),

Diskussion

87

was bedeuten würde, dass eine Zunahme vakuoliger, nekrotischer oder apoptotischer

Zellen zu einem Anstieg an Zelldebris führen kann. Hierbei ist zu bedenken, dass

gebildete apoptotische Restkörper phagozytiert werden oder im Gewebe bestehen

bleiben (MAJNO u. JORIS 1995). Dies könnten eine mögliche Ursache für das

vermehrte Auftreten von Zelledebris sein. Auch nekrotischen Zellen zerbrechen

(MAJNO u. JORIS 1995; ELMORE 2007) und könnten so ursächlich für den in dieser

Studie nachgewiesenen Zelldebris sein.

Bei der Auswertung der apoptotischen Zellen war die Anzahl der TUNEL-positiven

Zellen höher als die Anzahl aktivierter Caspase-3-positiver Zellen. Dies ist anhand der

Prinzipien der einzelnen Verfahren zu erklären. So wird im TUNEL-Verfahren

einzelsträngige DNA nachgewiesen, die auch bei nekrotischen Zellen vorkommen

kann. Mit dem Caspase-3-Verfahren wird spezifisch aktivierte Caspase-3

nachgewiesen, welche ausschließlich bei apoptotischen Prozessen auftritt (ELMORE

2007).

Im Einzelnen zeigten sich in der Auszählung pro 100 Sertolizellen im TUNEL-

Verfahren deutlich mehr positive Zellen bei allen wärmebehandelten Tieren als in der

Kontrollgruppe (x̄ = 2,9 0-8). Die größte Anzahl positiver Zellen wurde im basalen

Bereich der Hodentubuli gefunden und betraf somit die frühen

Spermatogenesestadien, vor allem primäre Spermatozyten und Spermatogonien.

Dies deckt sich mit den Ergebnissen anderer Studien (KHAN u. BRWON 2002;

SCHWALM et al. 2007). Das am häufigsten betroffene Stadium des Keimepithelzyklus

war das Stadium vier nach FOOTE und SWIERSTRA (1972), in welchem sich an der

Basalmembran Sertolizellen und Typ A Spermatogonien sowie weiter luminal

elongierte Spermatiden in Gruppen befinden. Neun Wochen nach einmaliger

Wärmeapplikation konnten durchschnittlich lediglich 2,0 (0-4) TUNEL-positive Zellen

pro 100 Sertolizellen, ähnlich der Kontrollgruppe, identifiziert werden. Nach der

zweiten Wärmeapplikation stieg die Anzahl der positiven Zellen auf einen fast dreifach

erhöhten Wert an (Tag 10: x̄ = 5,7 (3-10); Tag 40: x̄ = 6,7 (3-17)). Zu bedenken ist hier

jedoch, dass nicht nur eine zweite Hyperthermiephase stattgefunden hat, sondern

auch der Zeitraum zwischen Wärmeapplikation und Kastration deutlich geringer war.

Diskussion

88

Eine Regeneration auch nach zweiter Wärmeapplikation kann also mit den gewählten

Kastrationszeitpunkten nicht ausgeschlossen werden. Um eine Aussage

diesbezüglich treffen zu können, müsste die Anzahl TUNEL-positiver Zellen in einer

weiteren Gruppe mit Kastration neun Wochen nach zweiter Wärmeapplikation

bestimmt werden.

Mit dem Caspase-3-Nachweis wurden neun Wochen nach einmaliger

Wärmeapplikation (x̄ = 2,9; 0-6) fünfmal so viele positive Zellen pro 100 Sertolizellen

wie in der Kontrollgruppe (x̄ = 0,5; 0-2) identifiziert. Am häufigsten waren hier Tubuli

des Stadiums sechs des Keimepithelzyklus nach FOOTE und SWIERSTRA (1972)

betroffen, welches durch viele Gruppen von Typ B Spermatogonien und elongierten

Spermatiden gekennzeichnet ist. An der Basalmembran finden sich vor allem

Sertolizellen sowie Typ B Spermatogonien und vereinzelte Typ A Spermatogonien.

Auch in dem Caspase-3-Nachweis waren in dieser Studie vor allem primäre

Spermatozyten und Spermatogonien betroffen. Zehn Tage nach zweiter

Wärmeapplikation (x̄ = 1,1; 0-5) fanden sich mehr Hodentubuli mit Caspase-3 -

positiven Zellen als in der Kontrollgruppe, jedoch weniger als neun Wochen nach

einmaliger Wärmeapplikation. 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation (x̄ = 2,2; 0-9)

lag eine ähnliche Situation wie neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation vor.

Der gesetzte Wärmestimulus erhöht demnach die Apoptoserate in den Zellen der

Hodentubuli so nachhaltig, dass eine vermehrte Aktivität der Caspase-3 auch zeitlich

versetzt nachzuweisen ist.

Bei der Auswertung pro 50 Hodentubuli war die gleiche Tendenz zu erkennen. Auch

hier wiesen alle Tiere, bei denen eine skrotale Hyperthermie erzeugt worden war, eine

erhöhte Anzahl apoptotischer Zellen auf. Im TUNEL-Verfahren trat dieser Effekt

zeitlich näher zum gesetzten Wärmestimulus auf. So betrug die Anzahl TUNEL-

positiver Zellen pro 50 Hodentubuli neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation

mit 6,9 ± 2,8 etwa das Doppelte der Kontrollgruppe (3,9 ± 2,2). Zehn Tage (10,0 ± 3,3)

und 40 Tage nach der zweiten Hyperthermie (8,8 ± 5,5) waren die Werte sogar höher.

Diskussion

89

Auch die Anzahl Caspase-3-positiver Zellen pro 50 Hodentubuli stieg neun Wochen

nach der ersten Wärmeapplikation deutlich um das Vierfache der Kontrollgruppe (x̄ =

0,9 ± 1,3), auf 3,9 ± 2,5 an. Nach der zweiten Wärmeapplikation war die Anzahl

Caspase-3-positiver Zellen etwa doppelt so hoch wie in der Kontrollgruppe (Tag 10:

2,2 ± 4,0; Tag 40: 2,2 ± 1,6).

Demnach waren sowohl bei der Auswertung pro 100 Sertolizellen als auch pro 50

Hodentubuli jeweils zehn und 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation vermehrt

TUNEL-positive Zellen zu identifizieren, während neun Wochen nach einmaliger

Wärmeapplikation deutlich mehr Caspase-3-positive Zellen als in den anderen

Gruppen zu verzeichnen waren. Es ist davon auszugehen, dass dieser Befund auch

bei den Tieren vorlag die einer zweiten skrotalen Hyperthermie unterworfen wurden.

Eine einmalige Wärmeapplikation führte zu einer Erhöhung der Apoptoserate, welche

noch nach einem vollständigen Spermatogenesezyklus nachweisbar war. Dagegen

kam es nach der zweiten Wärmeapplikation möglicherweise aufgrund der

potenzierten Schädigung zu nekrotischer Prozessen und zu einem vermehrten

Untergang von Zellen. Die im Vergleich zu den Caspase-3-positiven Zellen absolut

größere Anzahl TUNEL-positiver Zellen schließt nekrotische Zellen mit ein

(MARTINVALET et al. 2005) und unterstützt hiermit die oben genannte These. Nicht

auszuschließen ist allerdings, dass generell kurz nach Wärmeapplikation eher

nekrotische Prozesse stattfinden. Da jedoch zehn bzw. 40 Tage nach erster

Wärmeapplikation keine Kastrationen durchgeführt wurden, kann diesbezüglich keine

Aussage getroffen werden. Auch denkbar wäre es, dass es aufgrund vermehrter

apoptotischer Prozesse zeitlich nah zu dem Temperaturstimulus zu einer vermehrten

Vakuolenbildung kommt. Diese entstehen in Korrelation zu apoptotischen Zellen (YIN

et al. 1997) und liegen in den Bereichen der Hodentubuli in denen vorher die

apoptotischen Zellen lagen. Neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation kann

es bereits zu einer Rebesiedelung dieser Bereiche mit neuen Keimzellen gekommen

sein.

Beide Auswertungsverfahren (pro 100 Sertolizellen und pro 50 Hodentubuli) wurden

auch in anderen Studien angewandt (SINHA HIKIM et al. 2003; SCHWALM et al.

Diskussion

90

2007). Die Auswertung pro 50 Tubuli ist als genauere Methode zu beurteilen, da die

Auszählung apoptotischer Zellen pro 100 Sertolizellen, bedingt durch die variable

Anzahl an Sertolizellen pro Hodentubulus, eine sehr unterschiedliche Anzahl an

Hodentubuli berücksichtigt.

Bei Ratten kam es bereits nach 15-minütiger Erwärmung im Wasserbad bei 42°C zu

einem deutlicher Anstieg TUNEL-positiver Zellen im Hodengewebe (SINHA HIKIM et

al. 2003). Neun Tage nach diesem Hitzestimulus wiesen die Hodentubuli zwar

weiterhin schwere Schäden auf, die Anzahl TUNEL-positiver Zellen war jedoch

rückläufig. In der vorliegenden Studie waren dagegen auch neun Wochen nach einem

moderateren, jedoch länger andauernden Wärmestimulus deutlich mehr TUNEL-

positive Zellen nachweisbar als bei den Kontrolltieren die keine Hyperthermie erfahren

hatten. Eine vollständige Regeneration war bei den Ratten 56 Tage nach gesetztem

Wärmestimulus zu verzeichnen (SINHA HIKIM et al. 2003). Auch KHAN und BROWN

(2002) wiesen bei Ratten unter identischen Hyperthermiebedingungen einen Anstieg

TUNEL-positiver Zellen nach, der jedoch bereits 15 Stunden nach dem gesetzten

Hitzestimulus wieder absank. Bei Lamas, welche vier Wochen bei 29°C in einem

Klimastall gehalten wurden, waren trotz schlechterer Ejakulatbeschaffenheit keine

signifikanten Unterschiede in der Anzahl TUNEL-positiver Zellen drei Wochen nach

Ende der Wärmeapplikation nachweisbar. So scheinen die Veränderungen des

Spermas nicht die Folge einer erhöhten Apoptoserate gewesen zu sein. An

kryptorchiden Hunden im Alter von ein bis zwei Jahren konnte gezeigt werden, dass

die Spermatogenese umso schwerwiegender gestört ist, je weiter der betroffene

Hoden vom Skrotum entfernt liegt (inguinal, abdominal) und je höher demzufolge

seine Umgebungstemperatur ist (VERONESI et al. 2009). Auswirkungen auf den

kontralateralen skrotalen Hoden konnten bei keinem der zehn untersuchten Hunde

nachgewiesen werden.

Ein kurzfristiger, massiver Wärmestimulus scheint also einen größeren Effekt

auszulösen als eine moderate, über einen längeren, aber dennoch überschaubaren

Diskussion

91

Zeitraum bestehende Hyperthermie. Eine Regeneration des Keimepithels nach

Schädigung durch Wärmeeinwirkung scheint aber in allen Fällen möglich.

Die Auswertung der Proliferation im Hodengewebe brachte für beide

Auswertmethoden unterschiedliche Ergebnisse. So zeigte sich nach Auswertung von

50 Tubuli die geringste Proliferation in der Kontrollgruppe (x̄ = 199,6; 110-302)

wohingegen alle Versuchgruppen nahezu identische Ergebnisse brachten. So nahm

die Proliferation bei allen Versuchstieren um ca. 15% im Vergleich zur Kontrollgruppe

zu. Neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation zeigten sich pro 50 Tubuli 199,6

Ki-67 positive Spermatogonien (110-302), zehn Tage nach zweiter Wärmeapplikation

239 (120-350) und 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation 239,8 (110-492).

Demnach scheint eine moderate Hyperthermie die Proliferation anzuregen. Spekulativ

bleibt, ob es unmittelbar im Anschluss an die Wärmeapplikation zu einem initialen

Abfall der Vermehrung von Spermatogonien kommt. Eine verstärkte Proliferation

sechs Wochen nach einem gesetzten Temperaturstimulus konnte auch bei Lamas

beobachtet werden (SCHWALM et al. 2007). Die verstärkt proliferierenden

Spermatogonien gleichen so die hauptsächlich geschädigten Spermatozyten aus und

bewirken eine Regeneration des Hodengewebes.

Nach Auszählung von 100 Sertolizellen zeigte sich ein anderes Ergebnis. Neun

Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation war eine verminderte Proliferation (x̄ =

84,2; 56-120) zu beobachten, während die Kontrollgruppe (x̄ = 118,6; 62-176) eine

nahezu identische Anzahl Ki-67 positiver Spermatogonien wie die zehn Tage (x̄ =

111,6; 38-228) und 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation (x̄ = 119,7; 74-172)

kastrierten Tiere aufwies. Aufgrund der sehr variablen Anzahl an ausgezählter Tubuli

bei dieser Methode scheint es sich eher um einen Methodenfehler zu handeln. Es ist

davon auszugehen, dass die oben beschriebene verstärkte Proliferation der

Versuchsgruppen eher den durch den Temperaturstimulus gesetzte Effekt

widerspiegelt.

Diskussion

92

Nebenhoden In den Nebenhoden war bei allen wärmebehandelten Tieren die Anzahl der

Tubulusanschnitte mit aufgelockerten Epithelzellen um das Fünf- bis Siebenfache

gegenüber der Kontrollgruppe x̄ = 2,4 (1-5) erhöht. So zeigten die Tiere neun Wochen

nach einmaliger Wärmeapplikation im Durchschnitt 12,7 (1-25), zehn Tage nach

zweiter Wärmeapplikation 16,2 (1-25) und 40 Tage nach zweiter Wärmeapplikation

11,3 (0-25) Tubulusanschnitte mit vakuolig aufgelockertem Epithel. Demnach scheint

das Nebenhodenepithel sensibler auf einen Wärmestimulus zu reagieren als das

Hodentubulusepithel. Dabei kommt es offensichtlich innerhalb kurzer Zeit zur

Zellschädigung, welche dann über mehrere Wochen nachweisbar bleibt. Eine erhöhte

Anzahl vakuoliger Epithelzellen korrelierte auch im Bereich der Nebenhoden mit einer

vermehrten Anzahl von Tubulusanschnitten mit Zelldebris. Somit scheint der gesetzte

Wärmestimulus auch hier über eine vakuolige Degeneration zur Zellnekrose zu führen

(ELMORE 2007), oder eine vermehrte Anzahl apoptotischer Zellen war vorhanden

(YIN 1997), welche sich in der vermehrten Anzahl an zelldebrishaltigen

Tubulusanschnitten widerspiegelt. PERA et al. (1996) untersuchten die Auswirkung

einer Temperatur von 37°C auf spezische mRNA (CD52/CE5; codiert für ein

spezifisches spermienbindendes sekretorisches Protein) caniner

Nebenhodenepithelzellen in einer Zellkultur. Hierbei ließ sich nach fünf Tagen, im

Vergleich zur Kultur bei 33°C, keine spezifische mRNA mehr nachweisen. Auch bei

zwei unilateralen Kryptorchiden Hunden wurde im abdominalen Hoden kaum

spezifische mRNA nachgewiesen. Dies führt zu der Annahme, dass evt. noch im

Hoden gebildete Spermien nicht mehr im Nebenhoden überlebensfähig sind, da durch

den Temperaturstimulus die Proteinbildung der Tubulusepithelien gestört wurde. Auch

diese abgestorbenen Spermien können zu der vermehrten Bildung von Zelldebris

beitragen. 10 Tage nach zweiter Wärmeapplikation zeigten sich die meisten

zelldebrishaltigen Nebenhodentubulusanschnitte was die These der gestörten

Nebenhodenpassage stützt.

Insgesamt waren bei allen wärmebehandelten Tieren mehr spermienfreie

Tubulusanschnitte nachweisbar als bei den Kontrolltieren. Da jedoch keine

eindeutigen Hinweise auf eine Spermatogenesestörung in Form von verkleinerten

Diskussion

93

Keimzellen, geschrumpften Tubuli, Sertoli only, geschwollenen Spermatozyten und

verdickter Basalmembran in den Hodentubuli vorlagen, ist eine diesbezügliche

Ursache nicht eindeutig abzuleiten. Eine mögliche Ursache ist jedoch die, durch

apoptotische Prozesse, geringgradig verminderte Spermatogenese. VERONESI et al.

(2009) konnten bei keinem der zehn untersuchten kryptorchiden Rüden Spermien in

dem Nebenhoden des jeweils betroffenen Hodens nachweisen. In der Gruppe der 20

Kontrolltiere mit skrotalen Hoden zeigten insgesamt nur drei Nebenhoden diesen

Befund, sodass dieser Effekt durchaus als hyperthermiebedingte Veränderung zu

werten ist.

Apoptotische Zellen waren vor allem im Nebenhodenepithel nachweisbar. Es bestand

kein Unterschied zwischen Nebenhodenkopf, -körper und -schwanz. Neun Wochen

nach einmaliger Wärmeapplikation zeigte sich eine erhöhte Anzahl apoptotischer

Zellen sowohl mit dem TUNEL-Verfahren als auch dem Caspase-3-Nachweis. Mit

beiden Nachweisverfahren wurden zehn Tage nach der zweiten Hyperthermie mit

einer jeweiligen durchschnittlichen Erhöhung um das Achtfache im Vergleich zur

Kontrollgruppe die meisten positiven Zellen pro 25 ausgezählte Tubulusanschnitte

dargestellt. 40 Tage nach der zweiten Wärmeapplikation war eine Abnahme der

positiven Zellen zu verzeichnen. Auch im Bereich der Nebenhoden scheint es also

einen durch die Wärmeapplikation bedingten Effekt auf den Energiehaushalt der

Epithelzellen zu geben. Da die Auswirkung einer erhöhten Temperatur auf die

Apoptoserate des Nebenhodens bisher nicht an Hunden oder anderen Tierarten

untersucht wurde bleibt es zu vermuten, dass Epithel und Stroma getrennt von Lumen

betrachtet werden müssen. Im Lumen befinden sich die Spermien. Diese zeigten in

beiden Verfahren zur Bestimmung von Apoptosen eine erhöhte Rate, im Nachweis

aktivierter Caspase-3 noch deutlicher, als beim Nachweis von DNA-Brüchen. So

scheinen auch die Spermien im Nebenhoden nicht vor einer Hitzeeinwirkung

geschützt, was mit der These der gestörten Proteinsynthese im Nebenhodenepithel

korreliert (YIN 1997). Wärmeeinwirkung und andere Noxen, wie oxidativer Stress,

führen zu einer Fehlerhaften Proteinfaltung im Nebenhodenepithel (CORNWALL

2009). Diese fehlgefalteten Proteine können toxisch auf die Spermien einwirken.

Diskussion

94

SCHWEIZER (2006) bewirkte mittels moderaten skrotalen Hyperthermie über 48

Stunden an Hengsten eine verminderte mittlere Geschwindigkeit der Spermien. Diese

führt sie auf gestörte Entwicklungsprozesse während der Nebenhodenpassage

zurück. ALBRECHT (2006) postuliert ebenfalls eine Schädigung der Spermien

während der Nebenhodepassage bei Wärmeapplikation. Hier reduzierte sich die

Vorwärtsmotilität.

Auch das Nebenhodenstroma scheint von der Erwärmung betroffen zu sein, auch hier

konnte mit beiden Detektionsverfahren (TUNEL und Caspase-3-Nachweis) bei allen

wärmebehandelten Rüden mehr positive Zellen, wenn auch in geringer Anzahl, als bei

den Kontrolltieren (TUNEL-Verfahren: x̄ = 0,4 ± 0,6; Caspase-3-Nachweis: x̄ = 0)

identifiziert werden.

Die Proliferationsrate im Nebenhodenepithel neun Wochen nach einmaliger

Wärmeapplikation (= 5,8 ± 4,8) war um 36,7% geringer als in der Kontrollgruppe

(= 9,2 ± 5,8). Sowohl zehn (= 11,0 ± 8,3) als auch 40 Tage nach zweimaliger

Wärmeapplikation (= 11,3 ± 12,9) stieg die Proliferationsrate deutlich im Vergleich zu

neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation an. Auch im Vergleich zur

Kontrollgruppe war ein geringer Anstieg zu verzeichnen. Das durch die

Wärmeapplikation geschädigte Epithel scheint also durch vermehrte Proliferation den

Effekt auszugleichen.

In den Nebenhodenlumen zeigte sich neun Wochen nach einmaliger

Wärmeapplikation (reduziert um 45,2%) sowie zehn Tage nach zweimaliger

Wärmeapplikation (reduziert um 58,2%) eine verminderte Proliferationsrate. 40 Tage

nach zweimaliger Wärmeapplikation war die Proliferationsrate lediglich um 19 %

reduziert. Fraglich bleibt, welche Zellen im Nebenhodenlumen proliferativen

Prozessen unterliegen können. Da hier hauptsächlich Spermien zu erwarten sind

kann eine Auszählung falsch positiver Zellen, welche eigentlich nicht mehr

proliferieren können, nicht ausgeschlossen werden.

Diskussion

95

Analog zu der Verteilung im Nebenhodenlumen zeigte sich auch im

Nebenhodenstroma eine im Vergleich zur Kontrollgruppe (= 3,2 ± 1,8) vermehrte

Proliferation zehn (= 4,2 ± 3,8) und 40 Tage nach zweimaliger Wärmeapplikation (=

3,8 ± 3,5), während neun Wochen nach einmaliger Wärmeapplikation (= 2,8 ± 1,6) die

Werte auf dem Niveau der Kontrollgruppe blieben. Auch die Zellen des

Nebenhodenstromas reagieren dementsprechend auf einen Hitzestimulus mit

kompensatorisch gesteigerter Proliferation.

5.5 Schlussfolgerungen

1. Die Hoden von Hunden scheinen im Vergleich zu den Gonaden von Hengsten und

Bullen weniger empfindlich auf einen moderaten Wärmestimulus zu reagieren.

2. Eine moderate Erwärmung der Hoden über 48 Stunden scheint keine irreversiblen

Schäden zu verursachen und demzufolge die Fruchtbarkeit nicht nachhaltig zu

beeinflussen.

3. Die Regeneration der durch skrotale Hyperthermie bedingten Schäden des

Hodengewebes ist nach einem Spermatogenesezyklus nicht vollständig

abgeschlossen.

Zusammenfassung

96

6 Zusammenfassung

Annika Herr: Effekte skrotaler Hyperthermie auf die Perfusion sowie auf histologische und immunhistochemische Merkmale des caninen Hodens und Nebenhodens

Ziel der vorliegenden Studie war es, die Empfindlichkeit des caninen Hodens und

Nebenhodens auf einen moderaten 48-stündigen Temperaturstimulus zu prüfen.

Hierzu wurden die Hoden von sieben Hunden mit Hilfe eines Suspensoriums,

bestehend aus einem äußeren Gehäuse aus thermoplastischem Kautschuk, einer

Babysocke und Watte, umgeben. Es wurde eine Temperaturerhöhung um

durchschnittlich 3,7°C auf 35,8°C in der ersten Hyperthermiephase sowie um 3,8°C

auf 35,9°C in der zweiten Hyperthermiephase erreicht.

Während einer vierwöchigen Kontrollperiode wurden zweimalig eine morphologische

Untersuchung sowie einmal wöchentlich eine farbkodierte dopplersonographische

Untersuchung (Messung der SPV, des RI und des PI) durchgeführt. Im Anschluss an

den Temperaturstimulus wurde die Untersuchungsfrequenz erhöht. Die Kontrolltiere

wurden nach vier Wochen kastriert. Bei 2 Tieren erfolgte die Kastration neun Wochen

nach einmaliger Wärmeapplikation, sowie bei 3 und 2 Rüden zehn bzw. 40 Tage nach

einer zweiten Wärmeapplikation. Drei weitere Hunde wurde als Kontrolltiere keinem

skrotalen Temperaturstimulus ausgesetzt. Bei diesen Tieren erfolgt eine Kastration

nach 4 Wochen.

Die Hoden und Nebenhoden wurden in drei Segmente (kranial, Mitte, kaudal)

unterteilt und in Formalin (4%) fixiert. Nach der histologischen Aufbereitung der

Organe in Paraffinblöcke wurden diese auf 2 μm Dicke geschnitten und für

histologische und immunhistochemische Untersuchungen gefärbt. Als Verfahren

kamen die HE-Färbung, das TUNEL-Verfahren, der Nachweis aktivierter Caspase-3

und der Nachweis des Ki-67 Antigens zur Anwendung.

Zusammenfassung

97

Unmittelbar nach Entfernung des Suspensoriums war über einen Zeitraum von

maximal 24 Stunden eine leichte Ödematisierung des Skrotums feststellbar. Einige

Hunde zeigten zusätzlich Rötung und Scheuerstellen. Alle morphologischen Hoden-

und Nebenhodenparameter wiesen in Bezug auf die Wärmeapplikation keine

Veränderungen auf.

Aufgrund der gemessenen physiologischen intra- und interindividuellen Variabilität

des Blutflusses mittels Dopplersonographie ließ sich keine dem Temperaturstimulus

zuzuordnende Veränderung nachweisen. Dies gilt sowohl für die SPV als auch für den

RI und PI.

In den HE-gefärbten Hodenpräparaten waren mit Ausnahme einzelner

Tubulusepithelzellen mit vakuoliger Degeneration und Hodentubuli mit Zelldebris

keine degenerativen Gewebeveränderungen mit Bezug zur skrotalen Hyperthermie

zu finden. Die vakuolige Degeneration stellt möglicherweise eine reversible

Schädigung des Keimepithels durch den Temperaturstimulus dar, welche aber auch

zur Nekrose einzelnen Zellen führen kann.

Die beiden zur Darstellung von apoptotischen Zellen verwendeten Verfahren, TUNEL

und Nachweis der aktivierten Caspase-3, lieferten unterschiedliche Ergebnisse mit

einer klaren Tendenz vermehrt positiver Zellen bei behandelten Tieren im Gegensatz

zur Kontrollgruppe. Auch die beiden verwendeten Auszählmethoden (pro 100

Sertolizellen und pro 50 Hodentubuli) lieferten nicht ganz übereinstimmende

Ergebnisse. Der Auswertung pro 50 Hodentubuli ist der Vorzug zu geben, da diese

genauer definierte Voraussetzungen bietet als die Auswertung pro 100 Sertolizellen.

Generell scheint es, dass ein einmaliger Temperaturstimulus neun Wochen nach

diesem immer noch eine vermehrte Anzahl apoptotischer Zellen hervorbringt, es aber

nach einem zweiten Stimulus eher zu nekrotischen Veränderungen im Keimepithel

des Hundehodens kommt. Auch im Nebenhodenbereich zeigten sich hauptsächlich

vakuolige Veränderungen, hier vor allem im Nebenhodentubulusepithel.

Zusammenfassung

98

Mithilfe der Ki-67-Methode konnte ebenfalls gezeigt werden, dass eine Auszählung

pro 50 Tubuli und pro 100 Sertolizellen unterschiedliche Ergebnisse liefert. So stieg in

der Auswertung pro 50 Tubuli die Proliferation kompensatorisch bei allen

wärmebehandelten Tieren im Gegensatz zur Kontrollgruppe an. Nach Auszählung von

100 Sertolizellen hingegen zeigte sich eine reduzierte Proliferation neun Wochen nach

einmaliger Wärmeappliaktion.

Zusammenfassend konnte festgestellt werden, dass die Hoden und Nebenhoden des

Hundes einen moderaten Temperaturstimulus während einer Periode von 48 Stunden

ohne makromorphologische Auffälligkeiten im Bereich der Hoden kompensieren. Es

kommt weder zu einer Schwellung noch zu von der Norm anweichenden Befunden

hinsichtlich Lage, Form und Konsistenz. Auf histologischer Ebene zeigten sich

reversiblen Veränderungen sowohl der Hoden, als auch der Nebenhoden.

Summary

99

7 Summary

Annika Herr: Effects of scrotal hyperthermia on the blood flow and on histological and immunohistochemical characteristics of the canine testis and epididymidis. The aim of the present study was to evaluate the effect of a mild hyperthermia

induction for a period of 48 hours on the canine testis and epididymidis. Therefore,

testes of seven dogs were heated using a jockstrap which resulted in an increase of

the temperature up to 35.8°C in the first period respectively up to 35.9°C in the second

period of hyperthermia.

For four weeks, all dogs underwent a control period in which ultrasound was

performed once a week. The parameters measured included systolic peak velocity

(SPV), resistance index (RI), and pulsatility index (PI). Morphological examinations of

the testes were performed twice within these four weeks. After this control period the

first hyperthermia of the testes was induced in the seven dogs. In the following nine

weeks ultrasound and morphological examinations were performed more frequently.

At the end of this period two of the seven dogs were castrated. The residual five dogs

underwent a second period of hyperthermia induction (48 hours) and were castrated

after ten (three dogs) and 40 days (two dogs), respectively.

Additionally, a control group of three dogs was castrated after four weeks without

undergoing any period of hyperthermia.

Immediately after castration the testes and epididymidis were dissected into three

pieces (cranial, midst, caudal) and fixed in formalin (4%). DNA fragmentation during

apoptosis was identified by TUNEL method and apoptotic cells were detected

immunohistochemically by activated caspase-3. Furthermore, H.E. staining was used

to identify signs of degeneration in the tissue. Proliferation was determined by the Ki-

67 method.

Summary

100

Immediately after removal of the jockstrap a mild scrotal edema was detected for a

time period of maximum 24 hours. Additionally, some dogs showed redness and

excoriation. Morphological parameters of testis and epididymidis did not reveal any

changes due to hyperthermia induction.

Based on the detection of physiological intra- and interindividual variability of blood

flow by dopplersonography a temperature-depending change in SPV, RI, and PI could

not be verified.

HE-staining of the testis revealed dead cell material and cells with vacuoles. All other

signs of degeneration were barely found. This leads to the assumption that those cells

underwent vacuolic degeneration which can finally end up in necrosis.

An increase of apoptotic cells was found in the testes of the seven dogs using TUNEL

and caspase-3. The highest amount of caspase-3 positive cells was found nine weeks

after the first period of hyperthermia, whereas more TUNEL-positive cells were found

ten and 40 days after the second period of hyperthermia. Thus, following the second

period of hyperthermia more cells died due to necrosis rather than apoptosis.

Furthermore, the counting of apoptotic cells per seminiferous tubules seemed to be

more reliable than counting per sertoli cells.

Using the Ki-67 method it could be shown that counting cells per 50 tubules

respectively per 100 sertoli cells revealed divergent results. Counting per 50 tubules

showed an increase in proliferating spermatogonia in all animals with induced

hyperthermia. After counting per 100 sertoli cells the control group and all animals

which underwent hyperthermia twice showed nearly identical results whereas the

dogs castrated nine weeks after one period of hyperthermia showed a decreased

proliferation.

The results of the present study demonstrate that dogs tolerate a mild heat stimulus

over a period of 48 hours without any changes in the scrotal morphology and

perfusion. In contrast to this, certain signs of histological changes including an

Summary

101

increase of apoptotic cells as well as a decrease of the proliferation rate were evident.

Those histological changes seem to be reversible.

Literaturverzeichnis

102

8 Literaturverzeichnis

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Anhang

114

9 Anhang

9.1 Histologische und immunhistochemische Verfahren –

Arbeitsprotokolle

4% gepuffertes Formalin: Ansatz für 2 x 2,5 Liter:

4250 ml Aqua dest.

25,95 g Na2HPO4 2 H2O

20,00 g NaH2PO4 H2O

50 ml 1 M NaOH

550 ml 37% Formalin

ins Aqua dest. beide Natriumphosphate und die Natronlauge geben, die Phosphate

müssen durch Rühren aufgelöst werden, dann das Formalin zugeben, mischen und

den pH-Wert überprüfen (in der Regel stimmt 7).

Entwässerung im Gewebeeinbettungsautomaten (Hypercenter II, Shandon, Frankfurt) Nachfixierung für 1 Stunde in 10%igem Formalin, spülen mit Leitungswasser,

dehydrieren in aufsteigender Alkoholreihe (70%, 85%, 96%), entfernen des Alkohols

mit Isopropanol und Essigsäure-n-Butylester

Hämalaun-Eosin (HE)-Färbung Das Entparaffinisieren der Schnitte erfolgt in einer absteigenden Alkoholreihe,

beginnend mit

Xylol (3x je) 5 Min., Isopropanol 5 Min., dann 96%iges, 70%iges und 50%iges

Ethanol je 2-3 Min., dann Aqua dest., anschließend erfolgt die Färbung

15 Min. in Hämalaun nach P. Mayer,

10 Min. bläuen in Leitungswasser und in Aqua dest. spülen,

1 Min. in 1%igem Eosin nach Zugabe von 1 Tropfen Eisessig pro Küvette und wieder

in Aqua dest. spülen.

Anhang

115

Darauf folgt ein Entwässern in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70% - 96%ige 2-3

min), Isopropanol 5 Min., Xylol (3x je) 5 Min.

Abschließend erfolgt das Eindecken in Roti-Histokitt (Eindeckmittel Rotihisto-Kitt, Fa.

Roth C. GmbH).

Lösungen für die HE-Färbung Hämalaun nach P. Mayer:

1g Hämatoxylin in 100 ml Aqua dest. lösen,

0,2 g Natriumjodat,

50 g chemisch reines Kalialaun (Kaliumaluminiumsulfat-12-sulfat) dazugeben und

erwärmen;

nach dem Erkalten: 50 g Chloralhydrat und 1 g kristalline Zitronensäure dazugeben,

kalt lösen; filtrieren.

Eosin:

0,1 % in Aqua dest. lösen;

Nach dem Erkalten filtrieren;

Zum Färben auf 100 ml 1% iges Eosin 2 Tropfen Eisessig geben.

Durchführung der TUNEL-Reaktion Der Nachweis TUNEL-positiver Zellen erfolgte mittels ApopTag®Plus (Firma

Appligene Oncur, Heidelberg)

1. Entparaffinisieren der Schnitte in einer absteigenden Alkoholreihe von Roticlear

(2x je 10min, bei Raumtemperatur) über Isopropanol, 96%iges, 70%iges,

50%iges Ethanol, je 5 Minuten bei Raumtemperatur

2. Einmaliges Spülen der Schnitte in PBS1 für je 5 Minuten bei Raumtemperatur

unter ständigem Rühren,

Ansetzen der Endverdünnung von Proteinase K (20µg/ml)2

Anhang

116

3. Objekträger abtrocknen und Schnitte mit Fettstift umranden; bei vielen

Schnitten diese mit PBS abdecken oder in feuchter Kammer lagern, bis alle

Schnitte umrandet sind

4. Unter Umständen zuerst PBS von den Schnitten abschütteln, andauen mit

Proteinase K-Lösung (20µg/ml) für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer

feuchten Kammer

Enzym-Substrat-Lösung (Working-Strength-TdT-Solution)3 ansetzen und bis

zum Gebrauch auf Eis lagern, Stop-Wash-Puffer4 in einer Küvette ansetzen

5. Herausnehmen der Schnitte aus der feuchten Kammer und Umsetzen in eine

Küvette. Viermaliges Spülen in Aqua dest. für je 2 min bei Raumtemperatur

unter ständigem Rühren

6. Hemmung der endogenen Peroxidasen mit 2% H2O2 in PBS für 5 Minuten bei

Raumtemperatur unter ständigem Rühren,

7. zweimaliges Spülen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten bei Raumtemperatur

unter ständigem Rühren.

8. Abtrocknen der Objektträger und Verbringen der Schnitte in eine feuchte

Kammer. Auftragen von 75µl Equilibritation Puffer/Schnitt für 15 Sekunden-30

Minuten (10 Minuten) bei Raumtemperatur

9. Überschuss an Equilibration Puffer abschütteln und Objekträger vorsichtig

abtrocknen, umbetten in eine vorgewärmte feuchte Kammer

54µl Working-Strength-TdT-Solution/Schnitt auftragen und mit CoverSlip

abdecken, Inkubation für 60 Minuten bei 37°C im Brutschrank

Küvette mit Stop-Wash-Puffer ins Wasserbad setzen und vorwärmen

10. Entfernen der CoverSlips (Lagerung in A.dest.)

Schnitte in die vorgewärmte Küvette mit Stop-Wash-Puffer stellen, im

Wasserbad für 30 Minuten bei 37°C unter ständiger Bewegung inkubieren

11. Dreimaliges spülen der Schnitte in PBS für je 5min bei Raumtemperatur unter

ständigem Rühren; Reinigung der CoverSlips für Schritt 12

12. Abtrocknen der Objektträger und Verbringen der Schnitte in eine feuchte

Kammer. Auftragen von 55µl Anti-Digoxigenin-Peroxidase/Schnitt für 30

Minuten bei Raumtemperatur unter Abdeckung mit CoverSlips

Anhang

117

13. Herausnehmen der Schnitte aus der feuchten Kammer und Umsetzen in eine

Küvette; viermaliges Spülen der Schnitte in PBS für je 2 Minuten bei

Raumtemperatur unter ständigem Rühren

14. Inkubation mit der DAB-Gebrauchslösung5 in einer Küvette für 5 Minuten bei

Raumtemperatur unter ständigem Rühren

15. Dreimaliges Spülen der Schnitte in PBS für je 5 Minuten bei Raumtemperatur

unter ständigem Rühren

16. Kurzes Eintauchen der Schnitte in Aqua dest.

17. Gegenfärben in Hämalaun nach Meyer für 5 Minuten bis 15 Sekunden bei

Raumtemperatur

18. Bläuen der Schnitte in Leitungswasser für 5 Minuten bei Raumtemperatur

19. Entwässern der Schnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe von Ethanol

50%ig, 70%ig und 96%ig bis zum Isopropanol (je 1 Minute bei

Raumtemperatur), anschließend 2x in Xylol für je 5 Minuten bei

Raumtemperatur

20. Eindecken der Schnitte

1PBS: 40g NaCl und 8,8g NaH2PO4 auf 5 ml Aqua dest.; pH auf 7,0-7,1 einstellen 2Proteinase K-Lösung: 4µl Stammlösung und 1996 µl Verdaupuffer = 2ml Proteinase

K-Lösung, für ca. 20 Schnitte

Proteinase K-Stammlösung (10µg/µl bzw. 10mg/ml): 100mg Proteinase K mit 2ml

Tris-HCl (1M, pH 8,0) sowie 20µl CaCl2 (0,1 M) ad 10ml DEPC-H2O steril ansetzen

und bei -20°C lagern

Verdaupuffer: 5ml Tris-HCl (1M, pH 8,0), EDTA (0,5M, pH 8,0), Tween 20 ad 100ml

DEPC-H2O, autoklavieren und bei 4°C lagern 3Enzym-Subtrat-Lösung (Working-Strength-TdT-Solution): 38µl Reaktions-Puffer und

16µl TdT-Enzyme = 54µl/Schnitt

760µl Reaktionspuffer und 320µl TdT-Enzyme = 1080µl/20Schnitte 4Stop-Wash-Puffer: 1ml Stop-Wash-Konzentrat und 34ml Aqua dest. = 35ml Stop-

Wash-Puffer

5ml Stop-Wash-Konzentrat und 170ml Aqua dest. = 175ml Stop-Wash-Puffer

Anhang

118

5DAB: Diaminobenzidin-Tetrahydrochloruidihydrat

Stammlösung: 100mg 3,3´DAB (Fluka, Schweiz) in 50ml PBS-Puffer unter

Lichtausschluss lösen; Lösung 20 Minuten rühren und bei -2°C lagern

Gebrauchslösung: 50ml DAB-Stammlösung in 150ml PBS (pH 7,2) lösen und durch

zwei Filterpapiere filtrieren, anschließend Zugabe von 2ml 3% H2O2-Lösung

Endkonzentration 0,05% DAB

Durchführung der Caspase-Methode Nachweis von Caspase-positiven Zellen erfolgt mittels der ABC-Methode

1. 2μm dicke Schnitte auf Superfrost® Plus Objektträger (Menzel-Gläser GmbH &

Co KG) aufziehen, anschließend Deparaffinisierung und Rehydration mittels

Xylol 3x 5 Minuten; Isopropanol 5 Minuten; Ethanol 96% 3 Minuten

2. Hemmung der endogenen Peroxidase für 30 Minuten in Methanol mit 0,5%

H2O2 3ml Perhydrol und 197ml 85% Methanol

3. 3x je 5 Minuten spülen in PBS1, dabei langsam rühren

4. Demarkierung mittels Erwärmung über 20 Minuten in Citratpuffer2 (in der

Mikrowelle)

5. Wiederholtes dreimaliges Spülen in PBS, dabei langsam rühren

6. Verbringen der Schnitte in Coverplates (Thermo Electron GmbH), überschichtet

mit inaktivem Ziegen Normalserum in PBS als Blockserum. Inkubation 20

Minuten bei Raumtemperatur

7. 1. Antikörper: in Coverplates Caspase 3 1:200 in PBS mit 1% BSA; jeweils eine

negativ Kontrolle mitlaufen lassen. Inkubation über Nacht bei 4°C im

Kühlschrank

8. 3x 5 Minuten spülen in PBS

9. 2.Antikörper in Coverplates: überschichten mit GAR-b (Goat-anti-Rabbit) 1:200

in PBS, Vector BA-1000; Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur


11. ABC: in Coverplates. ABC-Reagenz (Vector Laboratories Inc.) einfüllen;

Ansatz: 1ml PBS vorlegen, 15μl Reagenz A zufügen und gut schütteln, dann

Anhang

119

15μl Reagenz B dazu pipettieren und schütteln; 30 Minuten vor Gebrauch

ansetzen; Inkubation 20 Minuten bei Raumtemperatur


13. DAB3: Enzymhistochemische Reaktion: 0,1g DAB auf 200ml PBS und 2ml 3%

H2O2

14. Spülen in PBS und Verbringen in Leitungswasser, insgesamt 15 Minuten

15. Schwache Gegenfärbung, etwa 20 Sekunden bis 5 Minuten in Hämalaun nach

Mayer; anschließend 10-15 Minuten bläuen unter fließendem Leitungswasser

16. Aufsteigende Alkoholreihe bis Essigsäure-N-Butylester. 50%-96% Ethanol je 2-

3 Minuten

Isopropanol 5 Minuten

Xylol 1-2 Minuten

Anschließend eindecken

1PBS: 40g NaCl und 8,8g NaH2PO4 auf 5ml Aqua dest.; pH auf 7,0-7,1 einstellen 2Citratpuffer: 2,1g Citronensäuremonohydrat ad 1000ml Aqua dest., pH-Wert mit 1N

NaOH auf 6,0 einstellen 3DAB: Diaminobenzidin-Tetrahydrochlordihydrat



Gebrauchslösung: 50ml DAB-Stammlösung in 150ml PBS (pH 7,2) lösen und

durch zwei Filterpapiere filtrieren, anschließend Zugabe von 2ml 3% H2O2-

Lösung


Anhang

120

Durchführung der Ki-67-Reaktion Nachweis von Ki-67 positiven Zellen erfolgt ebenfalls mittels der ABC-Methode

1. 2μm dicke Schnitte auf Superfrost® Plus Objektträger (Menzel-Gläser GmbH &

Co KG) aufziehen, anschließend Deparaffinisierung und Rehydration mittels

Xylol 3x 5 Minuten; Isopropanol 5 Minuten; Ethanol 96% 3 Minuten

2. Hemmung der endogenen Peroxidase für 30 Minuten in Methanol mit 0,5%

H2O2 3ml Perhydrol und 197ml 85% Methanol

3. 3x je 5 Minuten spülen in PBS1, dabei langsam rühren

4. Demarkierung mittels Erwärmung über 20min in Citratpuffer2 (in der Mikrowelle)

5. Wiederholtes dreimaliges Spülen in PBS, dabei langsam rühren

6. Verbringen der Schnitte in Coverplates (Thermo Electron GmbH), überschichtet

mit inaktivem Ziegen Normalserum in PBS als Blockserum. Inkubation 20

Minuten bei Raumtemperatur

7. 1. Antikörper: in Coverplates Mouse-Anti-Human-Ki 67-Antigen, Klon MIB-1 (

Dako Diagnostika, Hamburg) 1:100 in PBS mit 1% BSA; jeweils eine negativ

Kontrolle mitlaufen lassen. Inkubation über Nacht bei 4°C im Kühlschrank


9. 2.Antikörper in Coverplates: überschichten mit GAM-b (Goat-anti-Mouse) 1:200

in PBS, Vector BA-9000; Inkubation 30 Minuten bei Raumtemperatur


11. ABC: in Coverplates. ABC-Reagenz (Vector Laboratories Inc.) einfüllen;

Ansatz: 1ml PBS vorlegen, 15μl Reagenz A zufügen und gut schütteln, dann

15μl Reagenz B dazu pipettieren und schütteln; 30 Minuten vor Gebrauch

ansetzen; Inkubation 20 Minuten bei Raumtemperatur


13. DAB3: Enzymhistochemische Reaktion: 0,1g DAB auf 200ml PBS und 2ml 3%

H2O2

14. Spülen in PBS und verbringen in Leitungswasser, insgesamt 15 Minuten

15. Schwache Gegenfärbung, etwa 20 Sekunden bis 5 Minuten in Hämalaun nach

Mayer; anschließend 10-15min bläuen unter fließendem Leitungswasser

16. Aufsteigende Alkoholreihe bis Essigsäure N Butylester.

Anhang

121

50%-96% Ethanol je 2-3 Minuten

Isopropanol 5 Minuten

Xylol 1-2 Minuten

Anschließend eindecken

1PBS: 40g NaCl und 8,8g NaH2PO4 auf 5ml Aqua dest.; pH auf 7,0-7,1 einstellen 2Citratpuffer: 2,1g Citronensäuremonohydrat ad 1000ml Aqua dest., pH-Wert mit 1N

NaOH auf 6,0 einstellen 3DAB: Diaminobenzidin-Tetrahydrochlordihydrat



Gebrauchslösung: 50ml DAB-Stammlösung in 150ml PBS (pH 7,2) lösen und durch

zwei Filterpapiere filtrieren, anschließend Zugabe von 2ml 3% H2O2-Lösung


Anhang

122

9.2 Skrotale Wärmeapplikation und Aufbereitung der Hoden:

Materialien, Chemikalien und Geräte

Bezugsquelle Material

Dr. Fritz Buschhaus ETM (Engineering Technologie Marketing GmBH Schönbrunn 180, 07929 Saalburg-Ebersdors

Thermoplastischer Kautschuk, Verschnitt aus

EPDM (Ethylen-Propylen-Dien-Kautschuk)

und PP Polyprolylen

KiK Textilien und Non-Food GmbH Siemensstraße 21, 59199 Bönen

Babysöckchen: 60% Baumwolle, 20% Nylon,

19% Polyester, 1% Elastane-Lycra

Tierärztebedarf J. Lenecke GmbH & Co.KG Mentestraße 12a, 26419 Schortens

Halskragen Buster, clic collar 25cm

Vaseline Favodent

Handschuhe Nobaglove®-Latex

Ultraschallgel

Rolta Polsterwatte

Yatego GmbH Technologiezentrum Leopoldstr. 1 D-78112 St. Georgen

TFA Klima Logger

Thermo-Hygro-Station

Kat.-Nr. 30.3015

Wirtschaftgenossenschaft deutscher Tierärzte eG Siemensstraße 14, 30827 Garbsen

Brustgeschirr

Anhang

123

Bezugsquelle Material A. Krüss Optronic GmbH, Hamburg

Binocular Mikroskop, MBL 2000

Bauknecht Hausgeräte Mikrowelle, MWS 2924

Carl Roth GmbH Karlsruhe

Citronensäure-Monohydrat, 3958.1

Chloralhydrat

Essigsäure-n-butylester, 4600.4

Hämalaunlösung nach Mayer, T865.1

Hämatoxylin, 3816.2

Natriumjodat p.a.

Roti®-Histokit, 6638.1

Roticlear®, A538.3

Cell Signaling Danvers, USA

Caspase 3-Antikörper, polyclonal Kaninchen-

anti-Caspase 3, 9661

Chemicon® International Ltd. Hampshire, UK

ApopTag®Plus Peroxidase In Situ Apoptosis

Detection Kit, S7101

Engelbrecht Edermünde

Chromalaun-Gelantine beschichtete

Objekträger

Fluka Chemika Buchs, Schweiz

Diaminobenzidin-Tetrahydrochloriddihydrat,

DAB, 32750

Gesellschaft für Labortechnik Burgwedel

Warmwasserbad für paraffinierte

Gewebeschnitte

Heraeus GmbH Hanau

Wärmeschrank 5042

IKA-Werke GmbH & Co.KG, Staufen

Magnetrührer, Typ REO

Leica Microsystems Nussloch GmbH Nussloch

Färbegerät Leica, ST 4040

Anhang

124

Medite Medizintechnik Burgdorf

Objekträger-Eindeckautomat Promounter,

RCM 2000

Menzel-Gläser, Glasaufbereitungswerke GmbH & Co KG Braunschweig

Superfrost®Plus Objekträger, 041300

Merck KGaA Darmstadt

Wasserstoffperoxid 30% H2O2 (Perhydrol®),

107209

Microm International GmbH Walldorf

Rotationsmikrotom

Quartett Immundiagnostica und Biotechnologie GmbH Berlin

Citratpuffer-Konzentrat, pH 6,0

Sigma-Aldrich Chemie GmbH Taufkirchen

Bovines Serumalbumin (BSA), A-3059

3,3´-Diaminobenzidin.tetrahydrochlorid Dihydrat

purum (DAB), p.a., 32750

Kaninchenserum, PK 4505

Thermo Electron GmbH Dreieich

Shandon CoverplatesTM, 72110013

Shandon Sequnenza®-Slide racks, 7331017

Paraplast Plus®

Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA, USA Über Biologo Kronshagen

ABC-Reagenz, PK 6100

W. Knittel Glasbearbeitungs GmbH Braunschweig

Deckgläser 24x50mm

Anhang

125

9.3 Verläufe der Skrotaltemperatur

1. Hyperthermie n=7

Stunde 4 5 6 7 8 9 10 1 35,0 35,6 35,5 36,1 35,1 35,9 35,7 2 35,0 35,0 37,2 35,7 35,0 35,2 35,1 3 35,7 34,8 36,6 35,0 35,6 35,2 35,1 4 36,8 35,1 36,1 35,3 35,7 35,4 36,1 5 35,6 35,5 35,8 35,7 35,0 36,0 35,6 6 35,1 35,5 35,6 35,6 34,9 36,6 35,1 7 35,6 35,3 35,6 35,7 35,2 36,1 35,2 8 35,7 35,7 35,6 35,0 35,6 35,4 35,7 9 34,9 35,7 35,0 34,9 36,6 35,3 35,2 10 34,9 35,0 36,2 35,3 36,8 35,4 35,8 11 35,4 35,7 36,1 35,9 36,3 35,4 36,5 12 35,5 36,0 35,5 35,5 36,3 35,2 36,0 13 35,4 35,0 35,7 35,3 36,7 35,3 35,9 14 35,8 34,9 36,1 35,2 36,3 35,1 35,1 15 36,0 34,8 35,9 34,9 36,6 35,1 35,3 16 35,7 35,4 35,4 35,6 36,6 35,3 35,1 17 35,4 34,9 35,8 35,6 36,6 35,8 35,0 18 34,8 36,0 36,0 35,2 35,7 35,6 34,9 19 35,6 35,5 35,6 35,4 35,3 35,0 35,2 20 35,8 34,9 35,6 35,5 35,1 36,2 35,0 21 35,7 35,4 35,7 35,6 35,3 36,7 35,1 22 35,1 35,6 34,8 35,8 35,8 36,1 35,6 23 35,6 35,2 35,3 36,4 36,6 35,9 35,8 24 35,0 35,1 34,9 36,0 36,0 35,4 35,6 25 35,4 35,3 35,4 35,6 35,4 35,7 35,2 26 34,8 35,6 35,6 35,3 35,5 36,6 35,2 27 35,3 35,7 35,7 35,0 36,7 35,5 35,6 28 35,1 36,0 35,1 35,7 37,0 35,6 35,3 29 35,0 35,5 35,3 36,0 37,3 35,3 34,9 30 35,7 35,5 35,4 36,1 37,2 36,1 36,5 31 35,2 35,9 35,7 36,4 37,2 36,2 35,7 32 35,8 35,5 34,9 35,5 36,7 36,7 35,1 33 34,8 35,6 34,9 36,1 36,9 36,5 35,1 34 35,0 35,8 35,8 36,0 37,4 36,1 36,2 35 34,9 35,7 36,0 35,6 37,3 35,4 35,2 36 35,5 35,9 36,1 35,5 35,4 35,5 35,1 37 36,0 36,6 36,4 36,2 36,0 35,2 35,6 38 34,8 37,9 35,7 35,9 35,5 34,9 35,1 39 35,4 39,4 35,8 35,6 35,1 35,4 35,1 40 35,4 39,3 35,3 35,2 35,2 35,3 35,0 41 35,3 39,0 35,3 35,0 35,2 35,3 35,9 42 36,4 39,6 34,9 35,8 35,4 36,0 35,0 43 37,3 40,1 34,8 36,1 35,3 35,1 35,4

Anhang

126

44 37,2 38,5 36,5 35,8 35,0 35,7 37,8 45 37,1 39,9 36,3 35,6 35,6 35,7 35,6 46 37,5 39,0 36,2 36,2 36,7 36,1 36,5 47 37,8 39,5 36,2 35,9 36,8 35,6 35,2 48 37,9 41,6 36,4 36,0 37,0 35,1 35,7

MW 35,8 Min 34,8 Max 41,6 SD 0,9

2. Hyperthermie n= 5

Stunde 6 7 8 9 10 1 35,3 35,9 35,1 35,0 34,0 2 37,0 35,8 36,0 36,1 36,7 3 36,6 35,4 35,6 35,7 36,2 4 36,2 35,3 35,7 35,7 35,8 5 35,8 35,7 35,9 35,4 36,2 6 35,6 35,6 35,5 35,3 37,0 7 35,6 35,7 35,2 35,5 36,3 8 35,6 35,9 36,0 35,4 35,9 9 35,8 35,4 36,6 35,6 36,0

10 36,2 35,3 36,8 35,4 35,7 11 36,1 35,9 36,3 35,3 35,4 12 35,5 35,9 36,3 35,3 35,5 13 35,7 35,3 36,7 35,0 36,2 14 36,1 35,2 36,3 35,4 36,3 15 35,9 34,9 36,6 35,0 36,0 16 35,4 35,6 37,0 35,2 36,1 17 35,8 35,6 36,6 35,7 36,0 18 36,0 36,0 35,7 35,1 36,5 19 35,6 35,7 35,3 35,3 35,9 20 35,6 35,5 35,1 35,6 36,1 21 35,7 35,6 35,3 35,7 36,0 22 35,0 35,8 35,8 35,8 35,9 23 35,3 36,4 36,6 36,0 35,6 24 35,0 36,0 36,3 36,2 35,9 25 35,9 36,1 35,4 36,8 35,8 26 35,6 35,3 35,5 36,4 35,6 27 35,7 35,5 37,0 37,1 35,4 28 35,1 35,7 38,8 37,0 36,5 29 35,3 36,0 37,3 36,1 35,4 30 35,4 36,1 37,2 35,9 35,3 31 35,7 36,4 37,2 35,0 35,1

Anhang

127

32 35,4 35,5 36,7 35,3 36,7 33 35,2 36,1 36,9 35,5 36,3 34 35,8 36,0 37,4 35,6 36,2 35 36,0 35,6 38,0 35,8 36,4 36 36,1 35,5 35,4 35,7 36,1 37 36,4 36,2 36,0 35,7 37,0 38 35,7 35,9 35,5 35,4 36,9 39 35,8 35,6 35,2 35,8 36,3 40 35,3 35,6 35,2 35,5 36,1 41 35,3 35,7 35,2 35,6 35,9 42 34,9 36,3 35,4 35,4 35,7 43 35,8 36,1 35,3 35,3 35,8 44 36,5 35,8 35,8 35,5 35,9 45 36,3 35,6 35,6 35,6 35,8 46 36,2 36,2 36,7 35,7 35,6 47 36,2 36,7 36,8 36,0 35,8 48 36,4 36,0 37,0 36,1 35,8

MW 35,9 Min 34,0 Max 38,8 SD 0,6

9.4 Alter und Gewicht der Rüden

Hund Alter zu Beginn der Studie Durchschnittsgewicht über den Studienzeitraum 1 11 Monate 15,4 kg 2 11 Monate 16,0 kg 3 11 Monate 15,8 kg 4 21 Monate 14,7 kg 5 38 Monate 14,0 kg 6 40 Monate 16,0 kg 7 40 Monate 14,5 kg 8 20 Monate 13,6 kg 9 20 Monate 14,7 kg 10 21 Monate 13,9 kg

Anhang

128

Abbildungen Abbildung 1: Suspensorium zur Erhöhung der Skrotaltemperatur bei Rüden .......... 38

Abbildung 2: Mittlerer (±SD) Skrotalumfang (cm), vor und nach der 1. und 2.

skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, T = Tag, SD = Standardabweichung

................................................................................................................................. 47

Abbildung 3: Mittlere (±SD) Länge und Breite des a) linken und b) rechten Hodens,

gemessen mittels Schieblehre, vor und nach der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie, n

= Anzahl der Rüden, T = Tag, SD = Standardabweichung....................................... 48

Abbildung 4: Mittlere (±SD) Länge (L) und Breite (B) des linken (li) und rechten (re)

Hodens (H), sowie der Länge (L) und Höhe (H) der Prostata (P) in der

Kontrollgruppe, vor und nach der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der

Rüden, SD = Standardabweichung .......................................................................... 49

Abbildung 5: Mittels Ultraschall gemessene mittlere (±SD) Länge und Breite des

linken (a) und rechten (b) Hodens vor und nach der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie;

n = Anzahl der Rüden, SD = Standartabweichung ................................................... 50

Abbildung 6: Mittels Ultraschall gemessene mittlere (±SD) Länge und Höhe der

Prostata vor und nach der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden,

SD = Standardabweichung....................................................................................... 51

Abbildung 7: Mittlere (±SD) winkelkorrigierte systolische Maximalgeschwindigkeit

(SPV) der A. marginalis am linken (a) und rechten (b) Hoden vor und nach der 1. und

2. sktoralen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung ....... 52

Abbildung 8: Mittlere (±SD) winkelkorrigierte systolische Maximalgeschwindig-keit

(SPV) der A. marginalis des rechten und linken Hodens vor und nach der 1. und 2.

sktoralen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung ........... 53

Abbildung 9: Mittlerer (±SD) Pulsatilitätsindex (PI) und Widerstandsindex (RI) am a)

linken Hoden und b) rechten Hoden vor und nach der 1. und 2. sktoralen

Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung........................... 54

Abbildung 10: Mittlerer (±SD) Pulsatilitätsindex (PI) und Widerstandsindex (RI) am

linken und rechten Hoden in der Kontrollgruppe, im Vorlauf sowie unmittelbar nach

der 1. und 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD =

Standardabweichung................................................................................................ 55

Anhang

129

Abbildung 11: a) Vakuolig veränderte Zellen des Keimepithels eines Hundes 40 Tage

nach der 2. skrotalen Hyperthermie (x200); b) unveränderte Hodentubuli eines

Hundes der Kontrollgruppe (x100)............................................................................ 57

Abbildung 12: Zelldebris im Lumen eines Hodentubulus eines Hundes neun Wochen

nach einmaliger skrotaler Hyperthermie (x400) ........................................................ 58

Abbildung 13: Mittlere Anzahl (±SD) der von verschiedenen Degenerations-

erscheinungen betroffenen Hodentubuli in der Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen

nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 (n = 2) Tage

nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD =


Abbildung 14: a) Hodentubuli eines Hundes der Kontrollgruppe, eine einzelne

TUNEL - positive Zelle (↑) in einem Tubulus (x100); b) vier TUNEL - positive Zellen

(↑) in einem Hodentubulus eines Hundes zehn Tage nach der 2. skrotalen

Hyperthermie (x400)................................................................................................. 60

Abbildung 15: Anzahl TUNEL - positiver Zellen pro 100 Sertolizellen in der

Kontrollgruppe, neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie sowie zehn und 40

Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD =


Abbildung 16: Prozentualer Anteil aller Tubuli mit TUNEL - positiven Zellen pro 100

Sertolizellen aufgeteilt nach den Stadien des Keimepithelzyklus über alle Gruppen

zusammengefasst (Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der 1. skrotalen

Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 (n = 2) Tage nach der 2. skrotalen

Hyperthermie)........................................................................................................... 62

Abbildung 17: Anzahl TUNEL-positiver Zellen pro 50 Hodentubuli in der




Abbildung 18: a) Hodentubuli eines Kontrolltieres, keine Caspase - 3 - positive Zelle

(x100); b) Hodentubuli eines Rüden neun Wochen nach der 1. skrotalen

Hyperthermie, drei Caspase - 3 - positive Zellen (↑) in einem Hodentubulus (x100) 64

Anhang

130

Abbildung 19: Caspase-3-positive Zelle (↑) im Hodentubulus eines Hundes zehn

Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie (x400) ..................................................... 65

Abbildung 20: Anzahl Caspase-3-positiver Zellen pro 100 Sertolizellen in der


Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie ................................................................ 66

Abbildung 21: Prozentualer Anteil aller Tubuli mit Caspase-3-positiven Zellen pro 100

Sertolizellen aufgeteilt nach den Stadien des Keimepithelzyklus über alle Gruppen

zusammengefasst (Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der 1. skrotalen

Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 (n = 2) Tage nach der 2. skrotalen

Hyperthermie)........................................................................................................... 67

Abbildung 22: Anzahl Caspase -3 - positiver Zellen pro 50 Hodentubuli in der




Abbildung 23: a) Ki - 67 - positive Spermatogonien (↑) in den Hodentubuli eines

Hundes zehn Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie (x100); b) einzelne Ki - 67 -

positive Spermatogonien in dem Hodentubuli eines Hundes der Kontrollgruppe

(x100); positiv erscheinende Spermatozyten wurden nicht mitgezählt ..................... 70

Abbildung 24: Anzahl Ki-67-positiver Zellen pro 100 Sertolizellen in der




Abbildung 25: Anzahl Ki-67-positiver Zellen pro 50 Hodentubuli in der Kontrollgruppe,

neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie sowie zehn und 40 Tage nach der

2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung ....... 72

Abbildung 26: a) Vakuolig aufgelockerte Epithelzellen in einem Nebenhodentubulus

eines Hundes zehn Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie (x100); b)

Nebenhodentubulusanschnitt ohne vakuolig verändertes Epithel eines Hundes der

Kontrollgruppe (x100) ............................................................................................... 74

Abbildung 27: Nebenhodentubulus ohne Spermien (↑) eines Hundes neun Wochen

nach einmaliger skrotaler Hyperthermie (x200) ........................................................ 75

Anhang

131

Abbildung 28: Mittlere Anzahl (±SD) der von verschiedenen

Degenerationserscheinungen betroffenen Nebenhodentubulusanschnitte in der

Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2)

sowie zehn (n = 3) und 40 (n = 2) Tage nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n =

Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung ........................................................ 76

Abbildung 29: Anzahl TUNEL - positiver Zellen pro 25 Nebenhodentubulus-

anschnitte im Stroma, Epithel und Lumen in der Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen

nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2), sowie zehn (n = 3) und 40 Tage (n = 2)

nach der 2. skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD =


Abbildung 30: Anzahl Caspase-3-positiver Zellen pro 25 Nebenhoden-

tubulusanschnitte im Stroma, Epithel und Lumen in der Kontrollgruppe (n = 3), neun

Wochen nach der 1. skrotalen Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 Tage

(n = 2) nach der 2. zweiten skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD =


Abbildung 31: Ki-67 - positive Zellen (↑) im Nebenhodentubulusepithel eines Hundes

neun Wochen nach einmaliger skrotaler Hyperthermie (x400) ................................. 79

Abbildung 32: Anzahl Ki-67 - positiver Zellen pro 25 Nebenhoden-tubulusanschnitte

im Stroma, Epithel und Lumen in der Kontrollgruppe (n = 3), neun Wochen nach der

1. skrotalen Hyperthermie (n = 2) sowie zehn (n = 3) und 40 Tage (n = 2) nach der

zweiten skrotalen Hyperthermie; n = Anzahl der Rüden, SD = Standardabweichung

................................................................................................................................. 80

Tabellen Tabelle 1: Versuchsablauf 34

Anhang

132

Danksagung Frau Prof. Dr. A.-R. Günzel-Apel danke ich für die Überlassung dieses interessanten

Themas, sowie für die Möglichkeit die Routinesprechstunde im Bereich

Rreproduktionsmedizin kennen zu lernen. Ebenfalls vielen Dank an Frau Prof.

Pfarrer die mir ganz zum Schluss mit Rat und Tat zur Seite stand und trotz der

knappen Zeit an mich geglaubt hat.

Vielen Dank auch an Christine für die Zusammenarbeit und den Spaß den wir trotz

48 Stunden Kälte zusammen hatten. Ebenso vielen Dank an Caro, dass sie die

Arbeit mit mir durchgeboxt hat. Danke auch an den Rest des Reproteams für die Zeit

mit Keksen, Süßigkeiten und dem ein oder anderen Späßchen zwischen den

Terminen.

Herrn Prof. Dr. A. Beinecke danke ich für die Unterstützung und Beratung in allen

histologischen Fragen. Außerdem vielen Dank an B. Buck und P. Grünig für die tolle

Unterstützung und Hilfe bei der Bearbeitung der Proben, bis sie dann endlich alle

geschnitten und gefärbt waren.

Einen außerordentlichen Dank auch an Daniel für die Nerven, dass 2 Jahre

durchzustehen und mir trotzdem noch zu helfen und mich so zu nehmen wie ich bin.

Weiteren Dank verdienen alle meine Hannover-Mädels, denn ohne diesen Rückhalt

wäre schon das Studium eine Qual gewesen und die Doktorarbeit erst Recht! Special

thanks an die Recherche-Königin Nina!!!!

Auch einen Dank verdient hat meine fröhliche durch geknallte Frieda, die doch in

Zeiten der Krise mehr als einmal meine Laune aufgehellt hat.

Ebenfalls einen Dank an meine Chefin Ulrike für die Unterstützung und die häufige

Nachsicht, wenn ich mal wieder gestresst und mit den Nerven am Ende war, sowie

für das großzügige, auch kurzfristige, Freistellen zu mehr als einer Gelegenheit.

Anhang

133

Und last but not least vielen Dank an meine gesamte Familie, besonders meine

Eltern, die mir erst das Studium und die Arbeit ermöglicht haben und dass sowohl mit

finanzieller Unterstützung, aber auch mit der noch um einiges wichtigeren

moralischen und seelischen Unterstützung!!!!!!!!!

Effekte skrotaler Hyperthermie auf die Perfusion sowie auf ... · welche aus der Arteria spermatica...

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