Aus der Klinik

für Frauenheilkunde und Geburtshilfe

der Universität zu Lübeck

Direktor : Prof. Dr. med. K. Diedrich

Effekte des Gonadotropin-Releasing Hormon-Antagonisten Ganirelix

auf die cAMP-Produktion sowie die Steroidbiosynthese

humaner Granulosaluteinzellen

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck

-Aus der Medizinischen Fakultät-

Vorgelegt von

Eva-Maria Gürke

aus Fulda

Lübeck 2003

Angefertigt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Lübeck

1.Berichterstatter : Prof. Dr. med. Olaf Ortmann

2.Berichterstatter :Prof. Dr. med. Olaf Hiort

Tag der mündlichen Prüfung : 20.09.2004

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 20.09.2004

gez. Prof. Dr. med. Peter Dominiak

-Dekan der medizinischen Fakultät-

1

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 3

1.1 Die neuroendokrine Kontrolle der Reproduktion 3

1.1.1 Hypothalamus-Hypophysen-Ovar Achse 3

1.1.2 Die Steuerung der GnRH-Sekretion 4

1.1.3 Die Regulation des ovariellen Zyklus 5

1.1.4 Die ovarielle Steroidbiosynthese 7

1.2 Das Dekapeptid GnRH 9

1.3 Der GnRH-Rezeptor 10

1.3.1 Der hypophysäre GnRH-Rezeptor 11

1.3.2 Signaltransduktion des GnRH-Rezeptors 14

1.3.3 Die Expression des GnRH-Rezeptors 17

1.3.4 Der ovarielle GnRH-Rezeptor 18

1.3.5 Der GnRH II-Rezeptor 20

1.4 GnRH-Analoga 22

1.4.1 Wirkmechanismus und klinische Anwendung von GnRH-Agonisten 23

1.4.2 Wirkmechanismus und klinische Anwendung von GnRH-Antagonisten 25

1.4.2.1 Der GnRH-Antagonist Ganirelix 26

1.4.3 Einsatz von GnRH-Analoga in der Reproduktionsmedizin 28

1.5 Signaltransduktionsmechanismen im Ovar 30

2 Problemstellung 36

3 Material und Methoden 38

3.1 Stimulationsmethode 38

3.1.1 Das lange Protokoll 38

3.1.2 Das Lübecker Protokoll 39

3.2 Patientinnen 40

3.3 Zellgewinnung und-präparation 41

3.3.1 Die Follikelpunktion 41

3.3.2 Die Granulosazellpräparation 41

2

3.4 Experimente mit humanen Granulosaluteinzellen 43

3.4.1 Genereller Versuchsaufbau 43

3.4.2 Experimentelles Design 44

3.5 Steroidassays 47

3.6 cAMP-Radioimmunoassay 47

3.7 Datenpräsentation und Statistik 48

4 Ergebnisse 49

4.1 Patientinnencharakteristika 49

4.2 Effekte der in-vivo-Behandlung mit GnRH-Analoga

auf die Steroidbiosynthese kultivierter humaner Granulosaluteinzellen 49

4.3 Effekte der in-vitro-Behandlung von GnRH-Analoga

auf die Steroidbiosynthese kultivierter humaner Granulosaluteinzellen 53

4.4 Effekte der in-vitro-Gabe von GnRH-Analoga auf die

cAMP-Akkumulation kultivierter humaner Granulosaluteinzellen 56

5 Diskussion 59

5.1 Wirkung der GnRH-Analoga auf die Steroidbiosynthese 59

5.2 Wirkung der GnRH-Analoga auf die cAMP-Produktion 66

6 Zusammenfassung 70

7 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen 72

8 Literaturverzeichnis 74

9 Danksagung 93

10 Lebenslauf 94

3

1 Einleitung

1.1 Die neuroendokrine Kontrolle der Reproduktion

1.1.1 Hypothalamus-Hypophysen-Ovar Achse

Die Steuerung reproduktiver Funktionen unterliegt einem komplexen Regelkreissystem,

welches auf dem funktionellen Zusammenspiel zwischen Ovar, Adenohypophyse und

Hypothalamus basiert. Durch die permanente gegenseitige Kontrolle und Beeinflussung

aller beteiligten Zentren läßt sich eine perfekt aufeinander abgestimmte Steuerung

realisieren.

Knobil erläuterte zu Beginn der 80er Jahre in mehreren Arbeiten die zentrale Bedeutung

des Gonadotropin-Releasing Hormons (GnRH) für die physiologische Ovarialfunktion bei

Primaten (Knobil, 1980 und 1981). Es gilt als gesichert, daß Impulse aus höheren Zentren

des zentralen Nervensystems unter Mitbeteiligung von Neurotransmittern sowie

opioidähnlich wirkenden Peptiden die Freisetzung des GnRH steuern. Das in den

hypothalamischen Kerngebieten Nucleus arcuatus und Nucleus paraventricularis durch

sog. Neuroaxone synthetisierte Neuropeptid GnRH wird in einem pulsatilen

Sekretionsmodus im Abstand von Minuten bis wenigen Stunden freigesetzt (Knobil, 1990).

Den Pfortaderkreislauf der Hypophyse erreicht GnRH über den aus den Axonen der

hypothalamischen Neuronen gebildeten Tractus infundibularis, der den Hypophysenstiel

durchzieht und somit eine Verbindung zwischen Hypothalamus und Hypophyse herstellt

(Fink, 1988). Im Bereich des Hypophysenvorderlappens, der Adenohypophyse, bindet

GnRH an spezifische Rezeptoren. Dieser Vorgang bewirkt die Freisetzung der

Gonadotropine Luteinisierendes Hormon (LH) und Follikelstimulierendes Hormon (FSH)

aus den gonadotropen Zellen der Adenohypophyse. Die sezernierten Gonadotropine

fungieren als hormonale Botenstoffe in extrahypophysären Organen. Sie regulieren über

die Bindung an spezifische Rezeptoren die Funktion der Ovarien. Zu ihren Aufgaben

zählen die Steuerung des Gonadenwachstums und der Gametogenese

(Follikelreifung/Spermatogenese). Sie sind auch an der Bildung und Sekretion der in der

Nebennierenrinde produzierten Steroide mitbeteiligt (Counis und Justiz, 1991; Conn,

1994). Zusätzlich ist das Ovar in der Lage, die übergeordneten Zentren Hypothalamus und

Hypophyse zu beeinflussen. Durch die sowohl vom Follikel als auch vom Corpus luteum

4

sezernierten Hormonprodukte Östradiol und Progesteron werden diese im Sinne eines

positiven bzw. negativen Feedbackmechanismus reguliert. Auf dieser Rückkopplung

basiert der Verlauf der Gonadotropinsekretion während des normalen Menstruationszyklus

der Frau.

Gehirn

Hypothalamus

GnRH Inhibition

(Stimulation)

Adeno-

hypophyse

Östrogene FSH / LH

Gestagene (Stimulation)

(Inhibition +

Stimulation)

Ovar

Östrogene /

Gestagene

weibl. Geschlechtsorgane

(Mamma, Uterus, Vagina)

Abb. 1: Die Hypothalamus-Hypophysen-Ovar Achse

1.1.2 Die Steuerung der GnRH-Sekretion

Das Zusammenspiel der GnRH-Konzentration im hypothalamo-hypophysären

Portalkreislauf, die Frequenz der GnRH-Freisetzung und die Anzahl der GnRH-Rezeptoren

auf den gonadotropen Zellen des Hypophysenvorderlappens wirkt regulatorisch auf die

Sekretion des GnRH (Knobil 1981, 1990).

5

Die Freisetzung des GnRH erfolgt pusatil, d.h. in periodischen Abständen, durch einen

Impuls aus dem hypothalamischen Nucleus arcuatus. Der dort lokalisierte Impulsgeber

setzt sich aus der funktionellen Verschaltung verschiedener Bezirke zusammen, die in ihrer

Gesamtheit den sog. GnRH-Pulsgenerator bilden (Knobil, 1990; Stojilkovic et al., 1994).

Der Name dieser hypothalamischen Region beschreibt ihre Fähigkeit, durch synchron

erzeugte elektrophysiologische Aktivität den Stimulus für die Sekretion von GnRH zu

bilden (Knobil, 1990). Die Frequenz der GnRH-Freisetzung wird von einer Reihe

unterschiedlicher Faktoren beeinflußt. Die Steuerung der Impulsdauer wird vornehmlich

über den Serumspiegel der Sexualsteroidhormone reguliert: Während sie bei Frauen in der

Reproduktionphase aufgrund der Östradiolwirkung etwa 1-3 Minuten beträgt, ist sie in der

Postmenopause und nach Ovarektomie auf ca. 20 Minuten verlängert (Knobil, 1990). Auch

äußere Einflüsse bedingen die Pulsfrequenz: So ist sie aufgrund der Lichteinwirkung

tagsüber höher als während der Nacht (Rossmanith und Lauritzen, 1991). Desweiteren

unterscheiden sich die Abstände zwischen zwei Sekretionsimpulsen in den Phasen des

Menstruationszyklus: In der Follikelphase führt der überwiegende Östradioleinfluss alle

1-2 Stunden zu einer GnRH-Freisetzung, wohingegen die Pulsationen in der

progesterongeprägten Lutealphase nur etwa alle 2-5 Stunden erfolgen (Manesh und

Muldoon, 1987; Knobil, 1990). Hungerzustände (z.B. bei Anorexia nervosa), physischer

wie emotionaler Streß und starkes körperliches Training wirken sich hemmend auf die

GnRH-Sekretion aus (Knobil, 1990).

1.1.3 Die Regulation des ovariellen Zyklus

Der etwa 28 Tage umfassende Zyklus der geschlechtsreifen Frau kann in eine Follikel-und

eine Lutealphase unterteilt werden. In der Zyklusmitte um den 14. Tag findet der Eisprung

statt. In der Follikelphase bewirkt Östradiol zunächst eine Supression der

Gonadotropinausschüttung (negativer Feedback), welche aber mit zunehmender

Steroidhormonproduktion in einen stimulierenden Effekt umgewandelt wird (positiver

Feedback). Der Anstieg der Gonadotropinsekretion kulminiert in der Mitte des Zyklus im

sog. LH-Gipfel (LH-Peak), woraufhin die Ovulation induziert wird. Das vom Corpus

luteum in der zweiten Zyklusphase, der Lutealphase, sezernierte Progesteron wirkt

hemmmend auf die Gonadotropinausschüttung (negativer Feedback). Knobil erkannte

6

1980 den zyklischen Verlauf der Gonadotropinsekretion als essentielle Voraussetzung für

die Entwicklung befruchtungsfähiger Oozyten. Die beschriebenen Feedbackmechanismen

regulieren den Menstruationszyklus auf hypothalamischer sowie hypophysärer Ebene,

allerdings ist die direkte Beeinflussung der gonadotropen Zellen der Adenohypophyse von

zentraler Bedeutung für die Funktion des Regelkreises (Ortmann et al., 1988, 1989 a, 1989

b, 1990).

In der Follikelphase induziert FSH die Bildung von Östradiol aus Androgenen durch

aromatisierende Enzyme, stimuliert zusammen mit Östradiol die Ausbildung von FSH-

Rezeptoren und sorgt für eine gesteigerte Granulosazellproliferation. Ebenso unterstützt

eine verstärkte Angiogenese das Wachstum des Follikels. Aufgrund der ständig

zunehmenden Granulosazellzahl kommt es ab etwa dem 7. Zyklustag zu einem raschen

Anstieg des Östradiolspiegels, der unmittelbar vor der Ovulation sein Maximum erreicht.

Der präovulatorische LH-Anstieg wird durch Östradiolkonzentrationen jenseits eines

bestimmten Schwellenwertes ausgelöst. Dieser Wert liegt bei etwa 150 pg/ml und muß

über mindestens 36 Stunden aufrecht erhalten werden. Neben der ovulationsinduzierenden

Wirkung sorgt der mittzyklische LH-Gipfel (LH-Peak) auch für die Luteinisierung des

Leitfollikels. Damit führt er zu einer funktionellen und strukturellen Umwandlung der

Granulosa- und der Thekazellen, um wichtige Vorraussetzungen für eine mögliche

Konzeption und eine folgende Implantation zu schaffen. Essentieller Bestandteil der

Lutealphase ist die verstärkte Progesteronsekretion, die im Vergleich zur Follikelphase um

das 10-20-fache erhöht sein kann. Der Serumspiegel beträgt während der Follikelphase ca.

0,5-1 ng/ml, steigt jedoch in der Lutealphase auf Werte zwischen 10 und 20 ng/ml. Dieser

deutliche Progesteronanstieg beginnt bereits vor der Ovulation und ist mitverantwortlich

für den steilen präovulatorischen LH-Anstieg, welcher seinerseits die Empfindlichkeit der

Granulosa-und Thekazellen für LH steigert (Ortmann et al., 1989 a, 1989 b). Aufgrund der

Progesteronwirkung ist die hypothalamische GnRH-Ausschüttung während der

Lutealphase des Zyklus vermindert (Knobil, 1990).

Das kennzeichnende Phänomen in der Lutealphase ist die Bildung des Corpus luteum. Es

besteht aus eine Reihe verschiedener Zelltypen, die sich unter Progesteroneinfluß von

Granulosa-und Thekazellen ableiten. Unter der Einwirkung von FSH synthetisieren die

großen Luteinzellen Östradiol, die kleinen Luteinzellen unter dem Einfluß von LH

Progesteron und Androgene. Das Corpus luteum atrophiert nach etwa 10-12 Tagen zum

7

Corpus albicans, falls die anhaltende, auf eine Empfängnis folgende hormonelle

Stimulierung durch das humane Choriongonadotropin (HCG) ausbleibt. Das im

Trophoblast gebildete HCG, ein Hormon mit LH-ähnlicher Wirkung, stimuliert das Corpus

luteum gravidate zu einer vermehrten Steroidbiosynthese und wirkt damit dem nach

ausgebliebener Konzeption typischen prämenstruellen Abfall von Östradiol und

Progesteron entgegen. Tritt keine Konzeption ein, kommt es zur Lyse des Progesteron-

produzierenden Corpus luteum. Der damit abfallende Progesteronspiegel löst die

Menstruation aus.

Abb. 2: Sexualhormonspiegel im ovariellen Zyklus

1.1.4 Die ovarielle Steroidbiosynthese

Die Zwei Kompartiment-/ Zwei Hormon-Theorie

Im Ovar bilden Granulosa- und Theka-interna-Zellen zwei verschiedene

Funktionseinheiten, die jedoch im Bereich der Steroidbiosynthese eng miteinander

kooperieren. Räumlich durch eine Basallamina getrennt sind beide Zelltypen an der

Produktion der ovariellen Sexualsteroide beteiligt. Unter der Stimulation von FSH bilden

und sezernieren die Granulosazellen Steroidhormone, die Theka-interna-Zellen werden

durch LH zur Steroidproduktion und- ausschüttung angeregt. Dabei sind beide

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

0

100

200

300

LH [mIE/ml]

FSH [mIE/ml]

Östradiol

Progesteron

0

10

20

30

40

50

[pg/ml]

[ng/ml]

Zyklustag

Östrad

io

l

LH

/F

SH

/P

ro

ge

stero

n

8

Produktionsstätten voneinander abhängig, um einen reibungslosen Ablauf der Synthese

gewährleisten zu können. In den Theka-interna-Zellen werden durch LH-Induktion

Cholesterinester hydrolysiert, um in mehreren Zwischenschritten über Pregnenolon und

17α-OH-Pregnenolon Dehydroepiandrosteron zu erhalten. Aus diesem Ausgangsprodukt

entstehen die Androgene Androstendion und Testosteron. Da die Granulosazellen zur de

novo-Androgensynthese nicht in der Lage sind, diese aber die essentielle Vorstufe des

Östradiols darstellen, ist die Diffusion der Androgene aus der Thekazellschicht

erforderlich. In den Granulosazellen angelangt werden die Androgene mittels eines

speziellen Enzymsystemkomplexes - des Aromatase-Systems- in Östrogene überführt

(Gore-Langton et al., 1988; Adashi, 1991). Androstendion wird dabei entweder direkt

durch das Aromatase-System in das biologisch weniger aktive Östrogen Östron

umgewandelt oder zunächst über den durch die 17-β- Hydroxylase katalysierten

Zwischenschritt in Testosteron überführt. Unter Aromataseeinwirkung erfolgt anschließend

die Umwandlung von Testosteron in Östradiol.

9

Acetyl-CoA

Zwischenprodukte

Cholesterin

20, 22-

Desmolase

Pregnenolon Progesteron

17 α- 17 α-

Hydroxylase Hydroxylase

3 α -ol-

17 α-OH- Dehydro- 17 α-OH-

Pregnenolon genase/ Progesteron

17, 20- ∆ 4,5- Iso- 17, 20-

Desmolase merase Desmolase

Dehydroepi- Androstendion Östron

androsteron 17 β- Aromati-

Hydroxylase sierendes

Theca interna System

Testosteron Östradiol

Zona granulosa

Abb. 3: Die Zwei-Kompartiment-Theorie

Die Regulation der Steroidbiosynthese

In beiden Zellkompartimenten wird die Steroidbiosynthese via Feedback-Mechanismen

reguliert: Der von den Granulosazellen sezernierte Insulinähnliche Wachstumsfaktor-II

(insulin like growth factor-II [IGF-II]) wirkt in Kombination mit FSH verstärkend auf die

Aromataseproduktion. Ebenfalls durch FSH stimuliert fördert ein weiteres ovarielles

Enzym, das Inhibin, in Verbindung mit LH die Androgenproduktion in den Theka-interna-

Zellen. Somit führen bereits kleine Mengen von LH aufgrund der Wirkungsverstärkung

von Inhibin zu einer deutlich ansteigenden Androgensynthese. Die daraufhin sezernierten

und in das Granulosazellkompartiment diffundierten Androgene können außerdem

suffizient durch das IGF-I unterstützte Aromatase-System in Östradiol überführt werden

(Chappel und Howles, 1991).

1.2 Das Dekapeptid GnRH

10

Das native Gonadotropin-Releasing Hormon (GnRH) ist ein im Gebiet des

hypothalamischen Nucleus arcuatus gebildetes Dekapeptid. 1971 konnte das auch als

luteinisierendes Hormon-Releasing Hormon (LH-RH) bezeichnete Peptid von zwei

unabhängig voneinander arbeitenden Gruppen isoliert und charakterisiert werden (Burgus,

1971; Matsuo, 1971).

Das aus einer Sequenz von 10 Aminosäuren bestehende GnRH besitzt eine

Pyroglutaminsäure am N-terminalen Ende der Peptidkette und hat ein Molekulargewicht

von 1181 Dalton.

Die einzelnen Aminosäuren des GnRH-Moleküls haben unterschiedliche Funktionen, die

teilweise entschlüsselt werden konnten: Für die Rezeptorbindung und die räumliche

Struktur sind die Positionen 1, 6 und 10 verantwortlich. Die Positionen 2 und 3 spielen die

wesentliche Rolle bei der Regulation der Gonadotropinfreisetzung. Die enzymatische

Inaktivierung des Dekapeptids wird über die Position 6 vermittelt, indem sie den

Angriffspunkt für die Endopeptidase darstellt (Clayton und Catt, 1981).

11

pGlu-His-Trp-Ser-Ty-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Abb. 4: Aminosäuresequenz von GnRH

Die biologische Halbwertszeit von GnRH beträgt 2-10 Minuten und ist damit relativ kurz.

Dadurch ist der Hypothalamus in der Lage, GnRH pulsatil als Reaktion auf positive

Feedbackmechanismen zu sezernieren. Für die enzymatische Inaktivierung des

Dekapeptids sorgen spezifische Peptidasen. Die auf diesem Wege entstehenden

Abbauprodukte werden renal eliminiert.

Nach Sezernierung in das hypophysäre Pfortadersystem bindet es an spezifische

Rezeptoren, die von den gonadotropen Zellen der Adenohypophyse exprimiert werden.

Aufgrund von Sensibilisierung bzw. Desensibilisierung steuert GnRH die Zahl seiner

eigenen Rezeptoren, indem kontinuierliche GnRH-Spiegel über Transmitter vermittelte

Signaltransduktion zu einer Verringerung der Rezeptorzahl führen, dagegen die pusatile

Freisetzung von GnRH ein vermehrtes Rezeptorangebot zur Folge hat.

1.3 Der GnRH-Rezeptor

In der neuroendokrinen Kontrolle der Reproduktion stellt der Gonadotropin- Releasing

Hormon-(GnRH) Rezeptor eine zentrale Schaltstelle dar.

Durch die Bindung des im Hypothalamus gebildeten GnRH an seinen spezifischen

Rezeptor der gonadotropen Zellen im Hypophysenvorderlappen reguliert das GnRH die

Synthese und Freisetzung der Gonadotropine FSH und LH (Knobil, 1981).

Neben den gonadotropen Zellen der Adenohypophyse konnte die Genexpression des

GnRH-Rezeptors außerdem in verschiedenen extrahypophysären Geweben nachgewiesen

werden. So wird er in den Granulosazellen des Ovars, in den Leydig-Zellen des Hodens, in

Plazenta und Prostata, in hippokampalen Zellen sowie in den GnRH sezernierenden Zellen

des Hypothalamus exprimiert (Clayton und Catt, 1981; Ban et al., 1990; Kakar et al.,

1992).

12

1.3.1 Der hypophysäre GnRH-Rezeptor

Aufgrund seiner Bedeutung für die normale Reproduktionsfunktion sowie für

Therapieansätze benigner und maligner Prozesse ist der GnRH-Rezeptor hinsichtlich

seiner Ausbildungorte, der molekularbiologischen Struktur und seiner biochemischen

Eigenschaften eingehend untersucht worden.

Strukturaufklärung

Der humane GnRH-Rezeptor zählt zur Familie der G-(GTP-bindendes) Protein

gekoppelten Rezeptoren (Sealfon et al., 1997). Er ist somit seiner Primärstruktur nach ein

Glykoprotein mit charakteristischerweise sieben Transmembran-Domänen neben

extrazellulär gelegenen hydrophilen Anteilen. Allerdings fehlt das für andere G-Protein

gekoppelten Rezeptoren typische lange intrazelluläre Carboxylende. Dieser

Strukturbestandteil ist an der Desensibilisierung und reduzierten Synthese der Rezeptoren

beteiligt (Dohlmann et al., 1991).

Zunächst konnte ein muriner GnRH-Rezeptor-Klon isoliert werden, indem die messenger

RNA (mRNA) einer gonadotropen Zellinie von Mäusen (alpha-T3-1-Zellen) benutzt

wurde (Tsutsumi et al., 1992). Die isolierte komplementäre DNA (cDNA) des GnRH-

Rezeptors der Maus diente nun als Sonde für die Clonierung der cDNA verschiedener

anderer Spezies. So ergab sich mit Hilfe markierter Oligonukleotide und der

Polymerasekettenreaktion auf Grundlage der Mäusesequenz die cDNA der Ratte (Eidne et

al.,1992; Kaiser et al.,1992) und später dann auch die menschliche cDNA-Sequenz (Kakar

et al., 1992; Chi et al., 1993). Die bisher isolierten Säugetier-GnRH-Rezeptoren weisen ein

hohes Maß an Homologie bezüglich ihrer Sequenz auf. Unterschiedlich ist jedoch die

molekulare Größe. Die cDNA des Nagetier-GnRH-Rezeptors codiert für 327 Aminosäuren

(AS), die humane cDNA für 328 AS (Conn, 1994; Stojilkovic et al., 1994; Kaiser et al.,

1997). Das errechnete Molekulargewicht beträgt 37,684 (Stojilkovic et al., 1994).

Internalisierung

Im Anschluß an die Bindung des GnRH-Moleküls an seinen Rezeptor wird der gesamte

Ligand-Rezeptor-Komplex durch eine rezeptorvermittelte Endozytose in die Zelle

aufgenommen. Die Internalisierung ist jedoch nicht essentielle Voraussetzung für die

Sekretion der Gonadotropine, ebenso erfolgt die Desensibilisierung der Zelle für GnRH

13

unabhängig von der Internalisierung des Rezeptorkomplexes. Dort erfolgt daraufhin die

Dissoziation des Komplexes (Hopkins und Gregory, 1977; Naor et al., 1981; Suarez-

Quinan et al., 1986).

Abb. 5: Struktur des humanen GnRH-Rezeptors. Die bekannten Glykosilierungsorte

(Y), die PKC-assoziierten Phosphorylierungsstellen (∗) und die Cysteinreste in

den extrazellulär verlaufenden Rezeptoranteilen (t) sind markiert.

(Kakar et al, 1992)

Extrazellulärer Bereich

Intrazellulärer Bereich

14

Desensibilisierung des GnRH-Rezeptor

Ein wichtiger Aspekt im Wirkmechanismus der GnRH-Agonisten ist der

Desensibilisierungs-Prozeß des Rezeptors. Werden die gonadotropen Zellen der

Adenohypophyse ununterbrochen hohen Dosen des nativen GnRH ausgesetzt, verringert

sich die zelluläre Reaktion auf eine sich anschließende erneute Stimulation mit GnRH.

Dieses Phänomen, auch als homologe Desensibilisierung bezeichnet, führt zu einer

verminderten Ausschüttung von Gonadotropinen und ist damit als der primär wirksame

Effekt der GnRH-Agonisten anzusehen. Allerdings ist der genaue Funktionsmechanismus

der homologen Desensibilisierung noch nicht bekannt.

Viele der G-Protein gekoppelten Rezeptoren sind durch einen schnellen

Desensibilisierungsprozeß gekennzeichnet, der die Dissoziation des Rezeptors vom

gekoppelten Proteinkomplex mit der dadurch angestoßenen Signaltransduktionskaskade

beinhaltet (Hausdorff et al., 1990). Als hauptverantwortlich für das Anstoßen des

Desensibilisierungsprozesses haben sich neben dem Carboxylende auch die dritte

intrazellulär verlaufende Schleife der Rezeptoren gezeigt. Allerdings fehlen beide

Elemente in der Struktur des GnRH-Rezeptors (Kaiser et al., 1997, Sealfon et al., 1997).

Daher könnte eine Erklärung für die schnelle Desensibilisierung des GnRH-Rezeptors

durch GnRH in einer verminderten Mobilisation von Calciumionen begründet sein. So

konnte eine Arbeitsgruppe um Anderson 1995 nachweisen, daß weder die Rezeptoranzahl

noch die Entkopplung des Rezeptors vom Proteinkomplex eine wesentliche Rolle im

Desensibilisierungsprozeß zu übernehmen scheint. Dagegen stellten sie eine geringfügig

verminderte Produktion von Inositolposphat fest. Eine andere Forschergruppe wies später

eine über GnRH-vermittelte down regulation der Inositoltrisphosphat assoziierten

Rezeptoren sowie den Rückgang der durch GnRH ausgelösten Calciumionen-Mobilisation

nach (Willars et al., 2001).

Dagegen wird die auf einer längeren Einwirkzeit von GnRH basierende homologe

Desensibilisierung unter Einbeziehung der Proteinkinase C-Signaltransduktion reguliert.

Die Rückregulierung des raschen Calciumionen-Einstroms ist im direkten Vergleich zur

Produktion von Inositoltrisphophat sehr viel schneller steuerbar. Es ist bekannt, daß hohe

Dosen von GnRH oder eines GnRH-Agonisten zu einer Verminderung der Rezeptoranzahl

führen, ohne einen direkten Einfluß über eine Veränderung der Rezeptoraffinität

15

auszuüben. Daher könnte dieser Mechanismus zum Teil der Langzeitregulierung der

homologen Desensibilisierung zu Grunde liegen.

Abschließend ist festzuhalten, daß bekannterweise eine veränderte Anzahl von GnRH-

Rezeptoren unabhängig von einer veränderten Bereitschaft der gonadotropen Zelle der

Adenohypophyse, auf den GnRH-Stimulus zu reagieren, funktioniert. Deshalb ist davon

auszugehen, daß in den Desensibilisierungsprozeß am GnRH-Rezeptor mehrere

zusätzliche Mechanismen wie beispielsweise die Entleerung der gonadotropen

Rezeptorspeicher nach anhaltender Exposition mit einem GnRH-Agonisten involviert sind

(Conn and Crowley, 1991, Stojilkovic et al., 1994, Kaiser et al., 1997).

1.3.2 Signaltransduktion des GnRH-Rezeptors

Für die Steroidhormone Östradiol und Progesteron stellt die Plasmamembran kein

Hindernis dar. Sie überwinden mit Hilfe ihres hydrophoben Aufbaus die

Phospholipidschichten der Membran und binden an zytoplasmatische Rezeptoren.

Hydrophile Botenstoffe wie das Dekapeptid GnRH binden dagegen an Rezeptoren, welche

sich in der Zellmembran befinden, da es ihnen aufgrund ihrer biochemischen

Beschaffenheit nicht möglich ist, die hydrophoben Schichten der Zellmembran selbst zu

durchdringen. Der GnRH-Rezeptor löst nach der Bindung eines Liganden verschiedene

Signaltransduktionskaskaden aus. Über die an ihn gekoppelten G-Proteine aktiviert der

Rezeptor unterschiedliche Enzymsysteme, die zu einer vermehrten Bildung sog. ‘second

messenger’ führen. Diese zweiten Boten sind nun wiederum für die Aktivierung inaktiver

Enzyme verantwortlich. Am Ende dieser Regulierungskette steht das eigentliche Ziel der

Ligandenbindung: Eine verstärkte oder verminderte Transkriptionsaktivität bestimmter

Gene und damit die Induktion oder Repression der RNA-Synthese bzw. der

Proteinbiosynthese. Auf diesem Weg nimmt GnRH beispielsweise Einfluß auf die

hypophysäre Gonadotropinsynthese und -sekretion.

Die Bindung von GnRH an seinen Rezeptor resultiert in einer Konformationsänderung der

Rezeptoranteile. Dies ermöglicht eine Interaktion mit den assoziierten G-Proteinen, wobei

es zum Austausch eines Guaninnukleotids innerhalb der α-Untereinheit des jeweiligen G-

16

Proteins kommt. Eine damit zusammenhängende Neuordnung der G-Protein-

Untereinheiten sorgt für die Aktivierung zugeordneter Zwischenschritte.

Andere Effektorsysteme werden aktiviert, um die Bildung weiterer Substanzen als ‘second

messenger’ zu ermöglichen. Um eine optimale Synthese- und Sekretionsleistung der Zelle

zu gewährleisten, scheinen diese Kaskaden untereinander verknüpft zu sein (Conn, 1994;

Stojilkovic et al., 1994; McArdle und Counis, 1996).

Hsieh und Martin zeigten 1992 eine primäre Aktivierung der Phospholipase C (PLC) durch

einen bestimmten Teil der alpha-Untereinheit (G alpha q/11) des Rezeptors. Nachfolgend

hydrolisiert das membrangebundene Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PIP2).

Katalysator dieser Reaktion ist die Phospholipase C. Als Produkte der Hydrolyse entstehen

Inositol-1,4,5-Trisphosphat (InsP3) und Diazylglyzerol (DAG). Beide führen nun in ihrer

Aufgabe als ‘second messenger’ zur Aktivierung anderer Bestandteile der

Signaltransduktionskaskade (Hsieh und Martin, 1992). So bewirkt InsP3 eine rasche

Freisetzung von intrazellulär gespeicherten Ca 2+

-Ionen, welche hauptsächlich an der

frühen Zellantwort beteiligt sind (Conn et al., 1995). DAG sorgt auf den GnRH-Stimulus

hin durch die Aktivierung der Proteinkinase C für eine länger anhaltende Zellantwort

(Shah und Milligan, 1994; Stanislaus et al., 1997).

Unter den im Zusammenhang mit der GnRH-Rezeptor-Bindung aktivierten

Phospholipasen stellt die PLC die hauptsächlich involvierte Phospholipase dar, jedoch gibt

es Hinweise auf eine Mitbeteiligung der Phospholipasen A2 und -D sowie auch der

Mitogenaktivierten Protein-(MAP) Kinase (Stojilkovic et al., 1994; Sim et al., 1995).

Letztere führen sehr wahrscheinlich zu einem Anstieg der als second messenger

agierenden zyklischen Nukleotide cAMP und/oder cGMP (Conn et al., 1979). Die

zugrunde liegenden Mechanismen sind in ihrer Gesamtheit noch nicht vollständig

aufgeklärt. Durch eine Veränderung der Rezeptordichte an der Plasmamembran der

gonadotropen Zellen wird die Synthese sowie auch die Ausschüttung der Gonadotropine

gesteuert (Conn et al., 1995). Diesem Effekt liegen zu einem großen Teil

Regulationsvorgänge auf Ebene der Transkription zu Grunde (Bauer-Dantoin et al., 1993;

Brooks et al.,1993).

Ein wichtiger second messenger mit zentraler Funktion innerhalb vieler

Signaltransduktionswege ist das zyklische 3’, 5’-Adenosinmonophosphat (cAMP). Es wird

17

unter Einwirkung der Adenylatcyclase aus Adenosintriphosphat (ATP) gebildet, wobei die

Aktivierung der Adenylatcyclase wiederum durch eine Konformationsänderung der G-

Protein-Untereinheiten des Rezeptors bewirkt wird. Das synthetisierte cAMP überführt ein

weiteres intrazelluläres Regulator-Enzym, die Proteinkinase A (PKA) in seine aktive Form.

Die PKA unterstützt als Katalysator die Phosphorylierung unterschiedlicher

zytoplasmatischer und nukleärer Proteine. Das Ziel aller Zwischenschritte der cAMP-

gesteuerten Signaltransduktion ist ebenfalls die Ebene der Transkription. Dort beeinflußt

der ‘second messenger’ cAMP letztendlich das Ablesen bestimmter Gene über cAMP-

induzierte Promoterregionen (Sassone-Corsi, 1995).

GnRH-Rezeptor

G Protein

Aktivierung der Aktivierung der

Phospholipase C Adenylatcyclase

Hydrolyse des

Phosphatidylinositol-

4-5-biphosphonat (PIP2)

cAMP-Bildung

Bildung von Bildung von aus ATP

Inositol-1,4,5 Diacyl-

-trisphosphat glycerol

(INSP3) (DAG)

Mobilisierung Aktivierung Aktivierung der

intrazellulärer von Proteinkinase A

Ca2+

-Ionen Proteinkinase C

Phosphorylierung verschiedener

zytoplasmatischer und nukleärer Proteine

Regulierung der Zellantw ort durch

Steuerung der Genexpression auf

Transkriptionsebene

Abb. 6: Signaltransduktionswege am GnRH-Rezeptor

18

Auch für die Befehlsübermittlung am GnRH-Rezeptor scheint cAMP von großer

Bedeutung zu sein. So konnte unter Einwirkung von cAMP sowohl eine vermehrte

Genexpression und Synthese von Gonadotropinanteilen als auch eine stärkere Freisetzung

von FSH und LH gesehen werden (Ishizaka et al., 1993; Haisenleder et al., 1994).

Delahaye et al. zeigten in Insektenzellen, die mittels eines Baculovirus mit dem Ratten-

GnRH-Rezeptor transfiziert worden waren und diesen exprimierten, die Aktivierung der

Adenylatcyclase und einen raschen Anstieg der cAMP-Bildung in Anwesenheit von

GnRH. Ebenso kam es durch den GnRH-Stimulus zu einem dosisabhängigen Anstieg der

Inositoltrisphosphat-Produktion. Folglich scheint der Ratten-GnRH-Rezeptor die Fähigkeit

zu besitzen, beide Signaltransduktionskaskaden zu aktivieren (Delahaye et al., 1997).

In kultivierten Rattenhypophysenzellen gelang es, für cAMP und verwandte Substanzen

einen GnRH-ähnlichen Effekt nachzuweisen. Die Anzahl der GnRH-Rezeptoren stieg nach

Gabe der ‘second messenger’ deutlich an, eine vergleichbare Reaktion der gonadotropen

Zellen ist nach GnRH-Stimulation bekannt. Diese Beobachtungen legten die Vermutung

nahe, daß cAMP GnRH-typische Wirkungen imitieren und somit eine Rolle in der

Regulation des GnRH-Rezeptors spielen könnte (Young et al., 1984 und 1985). Dafür

spricht auch der Nachweis erhöhter cAMP-Spiegel in den gonadotropen Zellen nach

GnRH-Gabe (Borgeat et al., 1972; Bourne, 1988).

1.3.3 Die Expression des GnRH-Rezeptors

Des weiteren zeigten verschiedene Studien die bedeutende Rolle von GnRH innerhalb der

Regulation seiner eigenen Rezeptorzahl auf. Es konnte nachgewiesen werden, daß die

GnRH-Rezeptorzahl (Conn et al.,1995) und die Menge gebildeter GnRH-Rezeptor-mRNA

(Bauer-Dantoin et al., 1993; Brooks et al., 1993) während des Menstruationszyklus

biphasischen Veränderungen (up-bzw. down-regulation) unterworfen ist. Ebenso verändert

sich in diesem Zusammenhang die Ansprechbarkeit der gonadotropen Zellen in der

Hypophyse auf GnRH, was zu unterschiedlichen Gonadotropinspiegeln im Serum führt.

Diese Ergebnisse präsentieren den GnRH-Rezeptor als wichtiges Steuerungselement bei

der Ausschüttung der hypophysär gebildeten Hormone FSH und LH. Clayton

demonstrierte 1989 den direktem Einfluß von GnRH auf den mRNA-Spiegel seines

19

Rezeptors und somit auch auf die Syntheseleistung des GnRH-Rezeptors. Es konnte

gezeigt werden, daß die Rezeptordichte bei pulsatilem (episodischem) Stimulus durch

GnRH in niedriger Konzentration deutlich anstieg, allerdings das langandauernde

gleichmäßige Angebot eines GnRH-Agonisten zunächst zu einer Desensibilisierung der

Rezeptoren und später zu einem Abfall der Rezeptordichte führte (Marian et al., 1981;

Loumaye und Catt, 1982; Clayton, 1989). Übereinstimmend damit ergab sich auch für

exogen zugeführtes GnRH eine Verringerung des mRNA-Spiegels bei kontinuierlicher

Gabe und demgegenüber erhöhte Spiegel nach pulsatiler Applikation (Kakar et al., 1997).

Die Exprimierung des Rezeptorgens ist somit ein essentieller Regelmechanismus für die

Affinität des Plasmamembran-Rezeptors der gonadotropen Zellen.

1.3.4 Der ovarielle GnRH-Rezeptor

Außerhalb der hypothalamischen Kerngebiete konnte eine GnRH-Genexpression auch in

extrahypophysären Geweben verschiedener Säugetierspezies nachgewiesen werden. Hsueh

demonstrierte zu Beginn der 80er Jahre eine modulierende Wirkung für GnRH an Ovarien

von Ratten (Hsueh und Jones, 1981; Hsueh et al., 1984). In diesen Studien ergab sich eine

ambivalente Wirkungsweise für GnRH: Die basale Steroidbiosynthese wurde unter GnRH-

Wirkung stimuliert, die Gonadotropin-induzierte Steroidsyntheseleistung fiel ab.

Desweiteren fielen inhibitorische Effekte von GnRH und GnRH-Agonisten im Ovar auf.

So blieb nach Behandlung mit einem GnRH-Agonisten die durch Gonadotropine

gesteuerte ovarielle Gewichtszunahme aus (Rippel und Johnson, 1976). Ebenso

unterdrückte die Gabe von GnRH-Agonisten die normale Follikelreifung (Ying und

Guillemin, 1979), wie auch die regulatorische Aktivität des LH in der Lutealphase ausblieb

(Clayton et al., 1979; Harwood et al., 1980). An isolierten Granulosazellkulturen von

Ratten zeigten Knecht et al. 1981, daß unter GnRH-Agonisten-Applikation sowohl die

Zahl der ovariellen Rezeptoren sinkt als auch die Produktion des second messenger cAMP

unterdrückt wird.

20

Diese und andere Effekte an Rattenovarien werden durch spezifische hochaffine

Rezeptoren vermittelt (Clayton et al., 1979; Harwood et al., 1980; Jones et al., 1980). Die

Konzentration dieser Rezeptoren ist während der Follikelphase höher als in der

Lutealphase des Zyklus und ihre Bindungsaffinität für GnRH steigt nach GnRH-

Stimulation an (Pieper et al., 1981). Die Interaktion zwischen GnRH und seinen Agonisten

auf der einen und dem spezifischen Rezeptor auf der anderen Seite ist ausführlich bei

Ratten und einigen anderen Säugetieren untersucht worden.

Der humane ovarielle GnRH-Rezeptor

Dagegen war bis vor kurzem über GnRH-assozierte Effekte im menschlichen Körper nur

relativ wenig bekannt. Eine geringe Zahl von Experimenten brachte uneinheitliche

Ergebnisse. Es wurde angenommen, daß GnRH im menschlichen Ovar sowohl autokrine

als auch parakrine Regulationsvorgänge steuert. Allerdings herrschte über die Existenz

spezifischer GnRH-Rezeptoren im humanen Ovar wie auch über ihr Vorkommen in den

verschiedenen ovariellen Kompartimenten lange Unklarheit.

Zunächst wurde das vollständige Fehlen spezifischer Bindungsstellen für GnRH im

menschlichen Ovar berichtet (Clayton und Huhtaniemi, 1982). Dann erbrachten Popkin et

al. 1983 und auch Bramley et al. 1985 den Nachweis von niedrigaffine Bindungsstellen im

Corpus luteum. Zum ersten Mal konnten GnRH-Rezeptoren im humanen Ovar 1989 mit

Hilfe der in-situ Autoradiographie dargestellt werden. In Granulosazellen des dominanten

Follikels fanden sich hochaffine Bindungsstellen (Latouche et al., 1989). Durch

Rezeptorassays wurden GnRH-Rezeptoren in bei Follikelpunktionen gewonnenen

Granulosaluteinzellen nachgewiesen. So konnte in humanen Granulosaluteinzellen , die bei

IVF-Zyklen ohne HMG-Stimulation gewonnen wurden, hohe Rezeptoraffinität bezüglich

des verwendeten GnRH-Agonisten demonstriert werden, dieselbe Arbeitsgruppe fand

jedoch im präovulatorischen Follikel keine Hinweise auf das Vorhandensein von

Bindungsstellen (Brus et al.,1997). Auch im Bezug auf die möglichen Effekte von GnRH-

Agonisten in menschlichen Ovarien sind widersprüchliche Ergebnisse beschrieben worden.

So beobachteten Casper et al. keinerlei Beeinflussung der Steroidbiosynthese nach

Applikation von GnRH-Agonisten (Casper et al., 1982, 1984). Dagegen wiesen Tureck et

al. 1982 in vitro inhibitorische Effekte auf die Steroidproduktion durch GnRH-Agonisten

nach. Sowohl stimulierende als auch hemmende Wirkung auf die Gonadotropine in

Abhängigkeit von der Konzentration des GnRH-Agonisten konnten gezeigt werden, wobei

21

niedrige Konzentrationen einen stimulatorischen Effekt nach sich zogen (Parinaud et al.,

1988). Für das Rattenovar konnte der Nachweis spezifischer GnRH-Rezeptoren bereits

erbracht (Hsueh und Schäfer, 1985) und die Transkription des GnRH-Gens dargestellt

werden (Oikawa et al., 1990; Goubau et al.,1992). Desgleichen ist die Regulation der

mRNA des GnRH-Rezeptors im Ovar der Ratte aufgedeckt worden (Olofsson et al., 1994;

Kakar et al., 1994).

Nach der Clonierung und Charakterisierung des menschlichen GnRH-Rezeptors durch

Kakar et al. 1992 wurde in einigen Studien das Vorhandensein der GnRH-Rezeptor mRNA

untersucht. Ohno et al. fanden GnRH-Rezeptor-mRNA in menschlichen epithelialen

Ovarialkarzinom-Zellen unter Verwendung der Reversen-Transkriptase

Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), waren aber nicht in der Lage, sie im gesunden Ovar

nachzuweisen (Ohno et al., 1993). Nachdem die komplementäre DNA (cDNA) des GnRH-

Rezeptors kloniert worden war, gelang es ebenfalls mithilfe der RT-PCR die Transkription

von mRNA des GnRH-Rezeptors in humanen Granulosaluteinzellen darzustellen (Kakar et

al., 1992; Peng et al., 1994, Minaretzis et al., 1995). Desgleichen gelang es mit Hilfe

molekularbiologischer Verfahren wie Northern Blot und RT-PCR, die Expression von

mRNA des GnRH-Rezeptors auch in anderen Organsystemen darzustellen. So zeigten sich

neben der Hypophyse auch in Gewebeproben von Ovarien bzw. Hoden, der Prostata und

der Brustdrüse Produkte in der PCR, die in ihrer Länge exakt der für den GnRH-Rezeptor

bestimmmten 800 Basenpaare entsprachen. Allerdings war die mRNA-Expression im

Hypophysengewebe am stärksten ausgeprägt (Kakar et al., 1992).

1.3.5 Der GnRH II-Rezeptor

GnRH stimuliert die hypophysäre Gonadotropinausschüttung und beeinflußt auf diesem

Wege auch die gonadale Funktion. Neben der seit längerem bekannten hypothalamischen

Form des GnRH (GnRH I: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2), das seine

Wirkung innerhalb der Reproduktion über einen spezifischen GnRH I-Rezeptor reguliert,

konnten in jüngster Zeit durch den Nachweis von strukturell abgewandelten Formen des

GnRH in Säugetieren 14 strukturähnliche Peptide dargestellt werden. Es fiel auf, daß bei

den meisten der untersuchten Wirbeltiere mehrere Formen von GnRH vorhanden waren

22

(Sherwood et al., 1993, Sealfon et al., 1997). Darüberhinaus konnte eine Form des GnRH,

welche ursprünglich aus Hypothalamuszellen des Huhns isoliert worden war, in

gleicherweise vom Fisch bis zum Menschen nachgewiesen werden (White et al., 1998). Im

Hinblick auf Studien, die sich mit der Struktur der GnRH-Gene beschäftigt haben, ist

davon auszugehen, daß dieses Peptid das Ergebnis aus einer frühen Genduplikation im

Rahmen der Evolution darstellt. Dieses aufgrund seines universellen Vorkommens als

GnRH II (pGlu-His-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH2) bezeichnete Peptid scheint

aufgrund seiner unveränderten Erhaltung im Verlauf der Evolution und der weiten

Verbeitung in unterschiedlichen Gewebearten eine bedeutende Funktion zu übernehmen.

So konnte zum Beispiel seine Beteiligung an der Regulierung spezifischer Kaliumkanäle

innerhalb sympathischer Ganglien und ebenso innerhalb der Stimulation sexueller

Erregung nachgewiesen werden (Maney et al., 1997).

Eine andere Arbeit beschreibt die Expression von vier unterschiedlichen GnRH-Formen

sowie eines GnRH-Rezeptors bei verschiedenen Säugetieren, dagegen konnten 13

unterschiedliche Formen von GnRH und eine Vielzahl von GnRH-Rezeptoren bei

mehreren anderen Wirbeltieren nachgewiesen werden (Neill, 2002). Mit Vollendung der

Sequenzierung des menschlichen Genoms ergab sich die Möglichkeit, das Vorkommen der

unterschiedlichen GnRH-Formen und –Rezeptoren innerhalb der Primaten genau zu

untersuchen. Dabei stellte sich heraus, daß von den bisher bei Säugetieren nachgewiesenen

vier unterschiedlichen Formen nur das schon länger bekannte GnRH I und das erstmalig

im Hühnerhypothalamus nachgewiesene GnRH II im menschlichen Genom identifiziert

werden konnten. Ferner wurden drei GnRH-Rezeptor Gene identifiziert: zum einen das

schon gut bekannte GnRH I-Rezeptor Gen auf Chromosom 4, zum zweiten das GnRH II-

Rezeptor Gen auf Chromosom 1 sowie zum dritten ein dem GnRH II Rezeptor Gen

homologes Gen auf Chromosom 14 (Neill, 2002). Allerdings gibt es Hinweise, die auf eine

übergeordnete Bedeutung des Gens auf Chromosom 1 gegenüber dem homologen Gen auf

Chromosom 14 hindeuten (van Biljon et al., 2002).

Der durch das Gen auf Chromosom 1 codierte ebenfalls G-Protein-gekoppelte Rezeptor

weist eine größere Übereinstimmung mit dem bei anderen Wirbeltieren gefundenen GnRH

II-Rezeptor auf als mit dem bekannten menschlichen GnRH I-Rezeptor (55% zu 39%

Übereinstimmung). Durch Verwendung der cDNA des GnRH II-Rezeptors aus der

Hypophyse von Menschenaffen konnte ein aus 379 Aminosäuren bestehender Rezeptor

dargestellt werden, der im Gegensatz zum GnRH I-Rezeptor eine terminale intrazelluläre

23

Carboxylgruppe aufweist. Dieser experimentell exprimierte GnRH II-Rezeptor zeigte sich

hochspezifisch für GnRH II. Auch konnte die Expression der GnRH II-Rezeptor mRNA

ubiquitär im menschlichen Gewebe nachgewiesen werden (Neill, 2002). Der GnRH II-

Rezeptor bindet wie auch der GnRH I-Rezeptor an die alpha q/11-Untereinheit des

assozierten G-Proteins und aktiviert ebenfalls spezifische Protein-Kinasen innerhalb der

Signaltransduktionskaskade. Allerdings unterscheidet er sich vom GnRH I-Rezeptor durch

Aktivierung anderer MAP-Kinasen im weiteren Verlauf der Signaltransduktion. Für den

GnRH II-Rezeptor ergibt sich insgesamt eine ausgedehntere Verbreitung im menschlichen

Gewebe als für den GnRH I-Rezeptor, überraschenderweise fand sich eine Exprimierung

des GnRH II-Rezeptors neben vielen Bereichen des Gehirns auch für die meisten

gonadotropen Zellen der Hypophyse. Daher könnte das parallele Vorkommen zwei

verschiedener GnRH-Rezeptoren auf den gonadotropen Zellen in Verbindung mit den

unterschiedlichen Effekten innerhalb der Signaltransduktion für eine unterschiedliche

Bedeutung beider GnRH Typen und ihrer Rezeptoren innerhalb der Reproduktion sprechen

(Millar et al., 2001).

1.4 GnRH-Analoga

Neben der Entdeckung und Erforschung der physiologischen Bedeutung sowie des

Wirkungsmechanismus von GnRH wurden auch die klinischen Anwendungsmöglichkeiten

überprüft. Allerdings spielt GnRH selbst im klinischen Alltag keine große Rolle, sondern

kommt nur bei wenigen Indikationen wie z.B. der hypothalamischen Amenorrhoe oder

dem Kallmann-Syndrom zum Einsatz. Der hypothalamischen Amenorrhoe liegt eine

verminderte oder gänzlich fehlende hypothalamische GnRH-Sekretion zu Grunde.

Synthese und Sekretion von FSH und LH bleiben daher weitgehend aus. Durch die

Substitution von GnRH wird der ursächliche Mangel behoben und normale Zyklen treten

ein. Ist der Maldescensus testis durch eine Störung auf hypothalamisch-hypophysärer

Ebene begründet, führt ebenfalls die GnRH-Gabe zum Therapieerfolg.

24

1.4.1 Wirkmechanismus und klinische Anwendung von GnRH-Agonisten

Von sehr viel größerer Bedeutung ist die Verwendung von GnRH-Agonisten. Nachdem die

Struktur des GnRH-Moleküls aufgeklärt und seine Synthese möglich war, konnte es im

Hinblick auf seinen therapeutischen Nutzen modifiziert werden. Die auf diesem Wege

synthetisierten Peptide ähneln ihrer Struktur nach dem nativen GnRH, allerdings besitzen

die GnRH-Agonisten eine deutlich verbesserte Bioverfügbarkeit sowie eine verlängerte

Wirkdauer. Eine 100-200fach höhere Rezeptoraffinität ergab sich aus einem Austausch der

Aminosäuren an den Positionen 6 und 10. Dadurch wurde der für das natürliche GnRH

typische rapide Enzymabbau verhindert, was zu einer weit besseren Bioverfügbarkeit der

GnRH-Agonisten und damit zu einer besseren Rezeptorbelegung führte. Bei

kontinuierlicher Applikation führen sie zu einer reversiblen Entkopplung der

Hypothalamus-Hypophysen-Ovar Achse, indem sie einen Abfall der GnRH-Rezeptoren

(down-Regulation) und eine Desensibilisierung der gonadotropen Adenohypophysenzellen

hervorrufen. Konsekutiv kommt es aufgrund der verringerten Gonadotropinbildung und-

sekretion zu einer Suppression der ovariellen Steroidbiosynthese. Daher liegt der

medizinische Nutzen der GnRH-Agonisten in der Therapie von sexualhormonabhängigen

Erkrankungen. Dort werden sie in der klinischen Routine eingesetzt.

Nach ihrer Applikation bewirken sie zunächst eine gesteigerte Gonadotropinfreisetzung

aus dem Hypophysenvorderlappen (sog. flare-up-Effekt). Gleichzeitig kommt es zu einer

transienten Vermehrung der membranständigen Rezeptoren der gonadotropen Zellen (sog.

up-Regulation). Die längerfristige Anwendung der GnRH-Agonisten führt jedoch aufgrund

der Internalisierung des Agonisten-Rezeptorkomplexes zu einer Abnahme der Rezeptoren-

dichte. Da die Zellen nicht in der Lage sind, den Rezeptorverlust mittels Neusynthese

schnell genug auszugleichen, bleibt die absolute Anzahl der Rezeptoren vermindert (sog.

down-Regulation). Vor der Supression der hypophysären Gonadotropinproduktion und-

sekretion liegt eine Phase der Stimulation, die etwa 12 Stunden nach der ersten Gabe

einsetzt. Dabei steigen die FSH-Konzentration im Serum auf ca. das Fünffache des

Ausgangswertes, die LH-Konzentration sogar auf das beinahe Zehnfache an. Ebenso

kommt es zu einer kurzfristigen Erhöhung des Östradiolwertes um das Vierfache der

Norm. Eine die Behandlung ermöglichende Suppression der Hypophyse setzt erst nach

einer Anwendungszeit von etwa 14 Tagen ein (Lemay et al., 1984).

25

Parallel dazu werden die Signaltransduktionswege der Zellen gehemmt (Conn und

Crowley, 1991). Als Folge der entstandenen Desensibilisierung sind die gonadotropen

Hypophysenzellen gegenüber dem nativen GnRH wie auch dem GnRH-Agonisten

refraktär. Desweiteren wird durch das Absinken der FSH-und LH-Spiegel im Serum die

ovarielle Steroidbiosynthese vermindert, was wiederum ein Ausbleiben der Follikelreifung

nach sich zieht. Die Serumspiegel des Östradiols liegen im postmenopausalen Bereich. Die

beschriebene Entkopplung der Hypophyse ist allerdings nach Beendigung der Therapie

vollständig reversibel, wobei sich die physiologische Zyklusfunktion nach durchschnittlich

sechs Wochen wieder etabliert hat (Gordon und Hodgen, 1993).

Im klinischen Alltag kommen GnRH-Agonisten bei Erkrankungen zum Einsatz, die eine

Suppression der hypophysären Gonadotropine erforden. Zum einen kann die

Unterdrückung der FSH- und LH-Sekretion, zum anderen aber auch der daraus

resultierende Sexualsteroidmangel zu therapeutischen Zwecken genutzt werden.

So sind im Bereich der gutartigen Erkrankungen vor allem der Einsatz bei Endometriose,

uterinen Myomen, Pubertas präcox, einigen Hypophysenadenomen und nicht zuletzt der

endogen Gonadotropinsuppression im Rahmen der kontrollierten ovariellen

Hyperstimulation zu nennen. Die Unterdrückung der Steroidhormonsynthese wird im

Bereich der Onkologie zur ablativen Therapie von Mamma-, Ovarial-, Endometrium- und

Prostatakarzinomen genutzt (Fekete et al., 1989; Emons et al., 1989; Pahwa et al., 1991;

Limonta et al., 1992).

Der therapeutisch erzeugte Östradiolmangel bringt einige unerwünschte Nebenwirkungen

mit sich, die dem Beschwerdebild der Postmenopause ähneln. Allerdings ist als

folgenschwerste Mangelerscheinung in der Langzeittherapie mit GnRH-Agonisten der

osteoporotisch bedingte Verlust der Knochenmasse anzusehen. Östrogene hemmen den

von den Osteoklasten ausgehenden Knochenabbau sowie die typischerweise unter

Östrogenmagel auftretende Kollagenolyse (Conn und Crowley, 1991).

26

1.4.2 Wirkmechanismus und klinische Anwendung von GnRH-Antagonisten

Die andere Substanzgruppe aus dem Formenkreis der GnRH-Analoga bilden die erst seit

wenigen Jahren zur Verfügung stehenden GnRH-Antagonisten. Diese konkurrieren im

Gegensatz zu den Agonisten mit dem nativen GnRH an den Rezeptorbindungsstellen und

führen so zu einer kompetitiven Hemmung der GnRH-Wirkung. Der supprimierende

Effekt auf die Gonadotropinausschüttung und damit auch auf die Steroidbiosynthese setzt

innerhalb von Stunden ein (Coy et al, 1982). Dagegen benötigen GnRH-Agonisten zum

Erreichen desselben Resultates 7-14 Tage (Lemay et al, 1984). Erste klinische

Untersuchungen mit GnRH-Antagonisten wurden im Rahmen der kontrollierten ovariellen

Hyperstimulation innerhalb der IVF-Therapie durchgeführt.

Der bei der Applikation von GnRH-Agonisten auftretende flare-up-Effekt ist ein

unerwünschter Anfangseffekt. Im Gegensatz dazu erzeugen die zeitgleich zur Entwicklung

der GnRH-Agonisten synthetisierten GnRH-Antagonisten eine sofortige Unterdrückung

der Gonadotropinproduktion ohne die unerwünschte vorherige Stimulation (Klingmüller et

al., 1993). Bereits wenige Stunden nach der Erstapplikation können im Serum stark

verminderte LH und FSH-Werte gemessen werden (Coy et al, 1982). Bei der Entwicklung

und frühen Erprobung der ersten GnRH-Antagonisten fielen allerdings eine Reihe von

unerwünschten Nebenwirkungen auf, die von leichten allergischen Reaktionen wie einer

Ödembildung in der Umgebung der Injektionsstelle bis hin zu schweren anaphylaktischen

Schockzuständen reichten (Schmidt et al., 1984). Diesen Reaktionen liegt mit hoher

Wahrscheinlichkeit ein systemisch histaminliberierender Effekt der GnRH-Antagonisten

im Anschluß an die Bindung von mit GnRH-Rezeptoren besetzten Mastzellen zugrunde

(Kiesel und Runnebaum, 1993). Ferner kam es in einigen Fällen eventuell aufgrund der

hydrophoben Eigenschaften der ersten Antagonisten zu einem Gelieren des Medikaments

nach der Applikation. Die klinische Erprobung im Rahmen der Phase III Studien wurde

erst mit der dritten Generation von GnRH-Antagonisten möglich, die bezüglich ihrer

Verträglichkeit und Bioverfügbarkeit entscheidend verbessert werden konnten.

Die Erklärung für den raschen Wirkungseintritt der Antagonisten liegt in ihrem völlig

anderen Funktionsprinzip. Sie konkurrieren mit dem natürlichen GnRH um die

Bindungsstellen an den spezifischen Rezeptoren der gonadotropen Zellen, besetzen diese

irrevesibel und unterbinden damit sowohl die Internalisierung als auch die

27

Signaltransduktionsmechanismen. Auf diese Weise führen sie zu einer kompetitiven

Hemmung der GnRH-Wirkung. Durch die exogene Zufuhr von GnRH bzw. seiner

Agonisten ist es möglich, die Hemmwirkung wieder aufzuheben. Da die GnRH-

Antagonisten eine klassische, d.h. den Grundlagen des Massenwirkungsgesetzes folgende

kompetitive Hemmung hervorrufen, ist die teilweise oder komplette Aufhebung der

antagonistischen Wirkung durch genaue Dosierung von GnRH gut steuerbar. So kann

beispielsweise unter der Behandlung mit GnRH-Antagonisten durch pulsatile Gabe von

GnRH ein Wiedereinsetzen des normalen Zyklus erreicht werden (Olivennes et al., 1994).

Auch können typische durch den Östrogenmangel bedingte Nebenwirkungen der

Agonistentherapie wie Hitzewallungen und Trockenheit der Vaginalschleimhaut

vermieden werden, indem durch exakte Dosisfindung des Antagonisten ein geringer

Östradiolspiegel im Serum beibehalten wird (Bouchard et al., 1990). Da es unter der

Behandlung mit GnRH-Antagonisten nicht wie bei agonistischer Therapie zu einer

Entspeicherung der Hypophysenzellen kommt, ist die normale Funktion der gonadotropen

Zellen innerhalb weniger Tage nach dem Absetzen der Substanzen wiederhergestellt.

1.4.2.1 Der GnRH-Antagonist Ganirelix

Für den in der vorliegenden Arbeit untersuchten GnRH-Antagonist Ganirelix liegen im

Gegensatz zu anderen Antagonisten der dritten Generation wie Nal-Glu, Antide und

Cetrorelix noch relativ wenige klinische Daten vor.

Ganirelixacetat (Antagon, Firma Organon, Oss, Niederlande) ist ein synthetisch

hergestelltes Dekapeptid. Es zählt zu den GnRH-Antagonisten der dritten Generation.

Daher war nun ein Einsatz im Rahmen klinischer Studien zur Erprobung des

therapeutischen Nutzens möglich. Wie alle Antagonisten des nativen Gonadotropin-

Releasing Hormons konkurriert es im Sinne einer kompetitiven Hemmung mit dem

körpereigenen GnRH am hypophysären GnRH-Rezeptor um die vorhandenen

Bindungsstellen. Dadurch ist Ganirelix in der Lage, die GnRH-Wirkung innerhalb des

Hypothalamus-Hypophysen-Ovar-Regelkreises zu blockieren. Es kommt zu einer

deutlichen Verminderung der LH- und FSH-Auschüttung, wobei Ganirelix eine stärkere

Unterdrückung der LH-Sekretion zur Folge hat.

28

pGlu1

-His2

-Trp3

-Ser4

-Tyr5

-Gly6

-Leu7

-Arg8

-Pro9

-Gly10

-NH2

Aminosäuresequenz von GnRH

pGlu1

-His2

-Trp3

-Ser4

-Tyr5

-D-Trp6

-Leu7

-Arg8

-Pro9

-Gly10

-NH2

Aminosäuresequenz des GnRH-Agonisten Triptorelin

Ac-D-Nal1

-DCpa2

-D-Pal3

-D-Ser4

-Tyr5

-D-hArg(Et2)6

-Leu7

-hArg(Et2)8

-Pro9

-D-

Ala10

-NH2

Aminosäuresequenz des GnRH-Antagonisten Ganirelix

Abb. 7: Aminosäuresequenzen von GnRH, Triptorelin und Ganirelix

Der therapeutische Nutzen der spezifisch antagonistischen Effekte ist in einigen frühen

klinischen Studien nachgewiesen worden. Denn obwohl sie bezüglich ihrer Indikationen

weitgehende Kongruenz mit den Einsatzgebieten der Agonisten zeigen, bieten sie doch

gewisse Vorteile. Gerade in der Behandlung von Krankheiten, die durch den initialen flare-

up Effekt der Agonisten negativ beeinflusst werden, hat der sofortige Suppressionseffekt

der Antagonisten günstige Auswirkungen. So könnte beispielsweise bei

sexualsteroidsensitiven Tumorerkrankungen eine zu Beginn der agonistischen Therapie

vermeintlich auftretende Tumorzellproliferation verhindert werden.

Große Bedeutung haben die GnRH-Antagonisten ebenfalls für die Behandlungsstrategien

innerhalb der Reproduktionsmedizin aufgrund ihres raschen Wirkungseintritts und ihrer

guten Dosierbarkeit.

29

1.4.3 Einsatz von GnRH-Analoga in der Reproduktionsmedizin

Zur Zeit stellt die Reproduktionsmedizin eines der wichtigen Einsatzfelder der GnRH-

Analoga dar. Sie werden in unterschiedlichen Therapieregimen mit dem Ziel der

kontrollierten ovariellen Hyperstimulation (controlled ovarian hyperstimulation [COH])

angewendet. Die COH bildet die Voraussetzung für die Durchführung der in-vitro-

Fertilisation (IVF) im Rahmen der Sterilitätsbehandlung. Da zur Durchführung der IVF

mehrere Oozyten bei einer Follikelpunktion gewonnen werden müssen, stellt die

Stimulation der Ovarien eine wesentliche Voraussetzung der Behandlung dar.

Ovarielle Stimulation

Über die Gabe von Gonadotropinen wird das Ovar zur Bildung mehrerer Follikel innerhalb

eines einzigen Zyklus angeregt. Zusätzlich werden GnRH-Analoga auf der Basis

verschiedener Therapieprotokolle appliziert. Ihre Aufgabe besteht in der hypophysären

Entkopplung aus dem Hypothalamus-Hypophyse-Ovar-Regelkreis, was eine

Unterdrückung der FSH-und LH-Produktion und -Ausschüttung zur Folge hat. Dadurch

sinken die Gonadotropinspiegel im Serum auf kaum nachweisbare Werte und lassen eine

exogen gesteuerte Stimulation und Ovulationsauslösung zu. Aufgrund dieses

Wirkmechanismus der GnRH-Analoga gelingt es, den für die Anwendung der IVF

schädlichen vorzeitigen LH-Anstieg zu verhindern. Tritt ein endogen ausgelöster LH-

Anstieg bei noch kleinem dominanten Follikel auf, kommt es zur vorzeitigen

Luteinisierung des Follikels und damit zu einer gestörten Eizellentwicklung. Die während

der Follikelpunktion gewonnenen Oozyten weisen als Folge der Luteinisierung eine

schlechtere Qualität auf, die sich im weiteren Ablauf der Behandlung negativ auf die

Fertilisierungs-und Implantationsrate sowie auf die Überlebensfähigkeit des Embryos

auswirkt (Stanger und Yovich, 1985; Loumaye, 1990). Analog dazu steigt die Abortrate

an. Das klassische Stimulationsschema mit alleiniger Gabe von humanem

Menopausengonadotropin (HMG) bzw. rekombinanten Gonadotropinen resultiert bei etwa

20% der Patientinnen in einem vorzeitigen LH-Peak, der zumeist durch Luteinisierung und

anschließender Follikelatresie den Abbruch der IVF-Therapie zur Folge hat (Diedrich et

al., 1994).

30

Die zunächst in die Behandlung eingeführten GnRH-Agonisten reduzierten die Rate der

vorzeitigen Therapieabbrüche aufgrund des zu frühen LH-Anstieg auf weniger als 2% der

Fälle, was sich auch in einer gesteigerten Erfolgsrate der IVF-Therapie widerspiegelte.

Einen Nachteil der Agonistenapplikation stellte allerdings die relativ lange

Verabreichungsdauer dar. Nach dem sog. langen Protokoll, das sich als optimale Form für

den Einsatz der GnRH-Agonisten etabliert hat, beginnt die agonistische Behandlung

aufgrund des initialen flare-up Effekts 14 Tage bevor mit der Gonadotropinstimulation

begonnen werden kann. Erst nach Ablauf dieser Behandlungszeit kann von einer völligen

Entkopplung der Hypophyse als Voraussetzung für den Beginn der exogenen

Gonadotropinzufuhr ausgegangen werden.

Mit der Entdeckung der GnRH-Antagonisten ergaben sich völlig neue Möglichkeiten in

der Sterilitätsbehandlung. Durch die Fähigkeit der Antagonisten, die Gonadotropinsynthese

und -sekretion innerhalb weniger Stunden zu supprimieren, konnte der

Behandlungszeitraum der Patientinnen deutlich verkürzt werden. Dies bedeutete auch eine

Verringerung der therapieassoziierten Belastung der Frauen und eine einfachere

medikamentöse Einstellung durch den behandelnden Arzt. Die im Laufe der letzten Jahre

in klinischen Studien eingesetzten GnRH-Antagonisten der dritten Generation Cetrorelix

und Ganirelix riefen keinerlei allergische Reaktionen hervor (Klingmüller et al., 1993;

Diedrich et al., 1994) und zeigten sich bezüglich der Fähigkeit, den vorzeitigen LH-

Anstieg zu verhindern, ebenso potent wie die schon länger etablierten Agonisten (Diedrich

et al., 1994; Albano et al., 1999; Rongières-Betrand et al., 1999). Innerhalb des langen

Protokolls erfolgt die Applikation des GnRH-Agonisten in Depotform einmalig in der

Dosierung 3,75 mg am 22. Tag des Zyklus, der dem Stimulationszyklus unmittelbar

vorausgeht. Dagegen wird der GnRH-Antagonist nach dem Lübecker Protokoll erst ab dem

7. Tag des Stimulationszyklus bis zur Ovulationsinduktion in der Dosierung von 0,25

mg/die (Felberbaum und Diedrich, 1999) gegeben.

Unter Einsatz der GnRH-Antagonisten innerhalb der IVF traten schwerere Formen eines

ovariellen Überstimulationssyndroms seltener auf als bei Anwendung des langen

Stimulationsprotokolls. In einer neueren Studie gelang es sogar durch eine Steigerung der

täglichen Ganirelix-Dosis ein bereits manifestes ovarielles Hyperstimulationssyndrom zu

beseitigen (de Jong et al., 1998).

31

Zusammenfassend läßt sich festhalten, daß die bisher untersuchten GnRH-Antagonisten

der dritten Generation ebenso potent einen unerwünschten vorzeitigen LH-Anstieg

unterdrücken wie die schon länger zu diesem Zweck eingesetzten GnRH-Agonisten. Damit

erhöht sich deutlich die Qualität der gewonnenen Eizellen und nachfolgend die

Fertilisationsrate wie auch die Schwangerschaftsrate im Vergleich zur alleinigen Gabe von

HMG. Somit können Agonisten wie auch Antagonisten im Bereich der

Reproduktionsmedizin gleichwertig eingesetzt werden, wobei GnRH-Antagonisten in der

Behandlung des ovariellen Überstimulationssynsdroms wahrscheinlich durch die geringere

Zahl antraler Follikel bessere Resultate erzielen.

1.5 Signaltransduktionsmechanismen im Ovar

Die in den gonadotropen Zellen der Adenohypophyse gebildeten Gonadotropine FSH und

LH steuern die Funktion der Gonaden. Sie binden als Proteohormone und damit hydrophile

Substanzen ebenfalls an Rezeptoren, die in der Zellmembran lokalisiert sind. Ihre

spezifischen Rezeptoren werden allerdings nur von besonderen Zellen, den sog. Zielzellen

(target cells) exprimiert (Leung und Steele, 1992). Wird ein Gonadotropinrezeptor im Ovar

durch den spezifischen Liganden besetzt, erfolgt im Rahmen der

Signaltransduktionskaskade zunächst die Aktivierung der Adenylatcyclase und daraufhin

die Bildung des ‘second messenger’ cAMP (Hunzicker-Dunne und Birnbaumer, 1985;

Richards et al., 1995). Ein Anstieg des intrazellulären cAMP-Spiegels hat die Aktivierung

der cAMP-abhängigen Proteinkinase A (PKA) zur Folge (Taylor et al., 1990; Meinkoth et

al., 1990), welche als Katalysator bei der Phosphorylierung anderer intrazellulärer

Substrate wirkt. Aufgrund dieses Mechanismus modulieren FSH und LH die Expression

gonadaler Gene (Tilly et al., 1992; Richards et al., 1995).

Ein Substrat, welches durch die PKA in den biochemisch aktiven Zustand überführt wird,

ist das cAMP-Antwort Element-Bindungs-Protein (cAMP response element binding

protein [CREB]) (Gonzalez et al., 1989). Dies ist ein über cAMP gesteuertes Protein,

welches regulatorische Aufgaben während des Transkriptionsvorgangs übernimmt. CREB

ist verantwortlich für die Umsetzung vieler cAMP-spezifischer Effekte innerhalb der Zelle.

Dabei bindet es an sog. cAMP-empfindliche Abschnitte der DNA (cAMP responsive DNA

elements [CRE]), auf denen sich die Loci der target-Gene befinden. Im Anschluß daran

32

kann es modulierend in die Transkription dieser Gene eingreifen. CREB vermittelt die

Expression cAMP-abhängiger Gene in verschiedenen Zellarten. Ebenso wird es durch

unterschiedliche Substrate in der Signalkette aktiviert. Im Ovar ist CREB beispielsweise an

der regulatorischen Wirkung der Gonadotropine FSH und LH auf die trankriptorische

Aktivität einiger ovarieller Enzym-Gene beteiligt (Richards et al., 1995). So bindet es im

Falle des Aromatase-Gens an cAMP-empfindliche DNA-Abschnitte, die Promotorregionen

für das genannte Gen enthalten. In kultivierten Ratten-Granulosazellen wird die

Transkription dieser Genabschnitte nach der Bindung des CREB durch cAMP induziert

(Fitzpatrick und Richards, 1994).

Abb. 8.a: Nach Bindung der Gonadotropine an den membranständigen Rezeptor

und der daraus resultierenden Konformationsänderung innerhalb des G-

Proteins kann GTP gebunden werden. Die GTP-aktivierte α-Untereinheit

des G-Proteins spaltet sich ab und lagert sich an der auf der

Membraninnenseite liegende Adenylatcyclase an. Diese wird dadurch

aktiviert und wandelt unter Abspaltung von P-P ATP in cAMP um.

LH/FSH

Rezeptor

Gγ β

GTP

G α

Adenylat-

cyclase

cAMP + PPi

ATP

Regulatorisches

Protein

KinaseR

R K

K

Nucleus

cAMP

33

Abb. 8.b: cAMP bindet nun an die Proteinkinase A, die aus zwei regulatorischen

Proteinen und zwei Kinasen besteht. Die regulatorischen Proteine

inaktivieren die Proteinkinase im Ruhezustand.

Abb. 8.c: Durch die Bindung von cAMP an die regulatorischen Einheiten werden

die A-Kinasen freigesetzt.

R

R

K

K

Nucleus

K

P

ZielgeneCRE

CREB

34

Abb. 8.d: Die A-Kinase diffundiert durch die Kernporen in das Kernplasma. Dort

befindet sich CREB (cAMP-response-element-binding-protein), welches

zunächst (in unphosphoryliertem Zustand) inaktiv ist. Die A-Kinase

phophoryliert CREB und überführt es damit in den aktiven Zustand..

Abb. 8.e: Das aktivierte CREB bindet an eine bestimmte DNA-Sequenz, das CRE

(cAMP-response-element).

CREB

Transkription

P

CREZielgene

CREB

CRE Zielgene

CBP

mRNA

P

35

Abb. 8.f: Im Anschluß wird an CREB das CBP (CREB-binding-protein) gebunden.

Dieses Protein leitet die Transkription der Zielgene (hier beispielsweise für

die Steroidbiosynthese) ein.

1996 untersuchten Mukherjee et al. die Expression der CREB-mRNA und des CREB

Proteins im Rattenovar und in isolierten Granulosazellen nach Behandlung mit

Gonadotropinen mit dem Ziel, näheren Aufschluß über die hormonabhängigen Schritte

innerhalb der Synthese des CREB Proteins zu erhalten. Um eventuelle Unterschiede in der

Regulation des CREB Proteins durch die Gonadotropine in verschiedenen Zellgruppen des

Ovars nachweisen zu können, wurde die genaue Lokalisation der CREB mRNA und des

CREB Proteins im Ovar detektiert sowie die Reaktion der aktivierten CREB-Form auf eine

Gonadotropinstimulation beobachtet.

Durch in situ-Hybridisierung, RNA-blot-Analyse und RT-PCR konnte gezeigt werden, daß

die mRNA des CREB Proteins in sämtlichen Kompartimenten des Ovars in geringer

Menge exprimiert wurde. Allerdings kam es zu keiner signifikanten Änderung der mRNA-

Spiegel unter Gonadotropin-Gabe. Im Gegensatz dazu reagierte das phosphorylierte und

damit in die aktive Form überführte CREB in den Granulosazellen mit einem transienten

drastischen Anstieg der mRNA-Transkription. Die verwendeten Granulosazellen hatten

entweder rekombinantes FSH (rFSH) in vitro erhalten oder stammten von in vivo mit

humanem Menopausen-Gonadotropin (HMG) vorbehandelten Frauen. Die zweite

Zellgruppe wurde in der Kultur mit humanem Choriongonadotropin (HCG) stimuliert. Die

Ergebnisse legten dar, daß beide Gonadotropine zu einem raschen Anstieg des aktivierten

36

CREB in den Granulosazellen führten. Sie übermitteln einige ihrer Effekte über die

Expression sog. Zielgene (target genes), wobei die direkt über cAMP gesteuerte

Phosphorylierung und Aktivierung des Regulatorproteins CREB eine zentrale Bedeutung

hat.

Generell vermittelt der ovarielle GnRH-Rezeptor seine intrazellulären Befehle über die

Aktivierung zweier Signaltransduktionwege: Phospholipase C und Inositolphosphat oder

Adenylatcyclase und cAMP. Der für die Aktivierung des cAMP-Signalweges

verantwortliche Teil des Rezeptors konnte auf der ersten intrazellulär verlaufenden

Schleife lokalisiert werden. Modifizierungen durch Aminosäurenaustausch besonders am

C-terminalen Ende dieses Rezeptoranteils führten zu einer drastischen Verminderung der

Adenylatcyclaseaktivität nach Gabe von GnRH. Dagegen zeigte sich der Phospholipase C-

Signalweg unabhängig von Veränderungen auf der ersten intrazellulär verlaufenden

Schleife des GnRH-Rezeptors (Arora et al., 1998).

Aufgrund der zentralen Bedeutung des second messenger cAMP für die

Postrezeptormechanismen am hypophysären wie auch am ovariellen GnRH-Rezeptor

beschäftigt sich die vorliegende Arbeit neben der Beobachtung der durch GnRH-Analoga

hevorgerufenen Effekte auf die ovarielle Steroidbiosynthese ebenfalls mit den GnRH-

Analoga spezifischen Wirkung auf die cAMP-Produktion humaner Granulosaluteinzellen.

37

2 Problemstellung

Die vorliegende Arbeit untersucht die potenzielle Beeinflussung der ovariellen

Steroidbiosynthese sowie der Signaltransduktionsmechanismen durch GnRH-Analoga. Die

genaue Erforschung dieser Zusammenhänge ist von klinischer Relevanz, da bei

therapeutischem Einsatz von GnRH-Agonisten und GnRH-Antagonisten unphysiologisch

hohe Konzentrationen dieser Substanzen im systemischen Kreislauf vorliegen. So könnten

über die Bindung an spezifische GnRH-Rezeptoren im Ovar eventuell Einflüsse auf die

Sexualhormonbiosynthese und die Follikelreifung ausgelöst werden. Gerade für die noch

relativ junge Substanzgruppe der GnRH-Antagonisten liegen bezüglich ihrer Wirkung auf

das Ovar bisher wenige Erkenntnisse vor. In klinischen Studien wurden GnRH-

Antagonisten bezüglich ihrer Fähigkeit untersucht, den vorzeitigen LH-Anstieg innerhalb

der kontrollierten ovariellen Hyperstimulation zu unterdrücken. Es stellte sich heraus, daß

GnRH-Antagonisten ebenso wirksam und effektiv zur Verhinderung des vorzeitigen LH-

Anstieges im Rahmen der IVF-Therapie einzusetzen sind wie die schon länger für den

klinischen Alltag zugelassenen agonistisch wirkenden Präparate. Bei der Vermeidung des

ovariellen Überstimulationssyndroms scheinen die Antagonisten sogar überlegen zu sein.

Die wenigen bisher publizierten klinisch-experimentellen Studien zur Wirkungsweise

verschiedener GnRH-Antagonisten stimmen bezüglich ihrer Effekte auf die

Gonadotropinsekretion überein. Allerdings bestehen kontroverse Ansichten über die

Funktion der GnRH-Antagonisten am Ovar. Kultivierte humane Granulosaluteinzellen, die

von antagonistisch vorbehandelten Frauen stammten, wiesen bezüglich ihrer

Progesteronakkumulation keinen signifikanten Unterschied zu Zellen der Kontrollgruppe

auf. Lediglich die Aromataseaktivität war innerhalb der ersten 6 Stunden der Kulturzeit in

den Zellen etwas niedriger, die von in vivo mit einem GnRH-Antagonisten behandelten

Frauen gewonnen worden waren (Minaretzis et al., 1995). Ebenso konnte in einer anderen

Studie unter in vitro-Bedingungen keine statistisch signifikante Differenz in der

Steroidhormonproduktion humaner Granulosaluteinzellen nach in vivo antagonistischer

bzw. agonistischer Behandlung nachgewiesen werden. Es fiel jedoch nach

Gonadotropinstimulation ein früheres Einsetzen der Hormonproduktion in der

antagonistisch vorbehandelten Zellgruppe auf (Lin et al., 1999). Übereinstimmend konnte

in einer neueren Arbeit gezeigt werden, daß der GnRH-Antagonist Cetrorelix sowohl unter

in vivo- wie auch in vitro-Bedingungen keine signifikant nachweisbaren Effekte auf die

38

native oder die HCG-stimulierte Streoidhormonsynthese humaner Granulosaluteinzellen

hat (Weiss et al., 2001). Über eine direkte Beeinflussung der ovariellen Hormonproduktion

durch den GnRH-Antagonisten Ganirelix sowie eines möglichen Effekts von Ganirelix auf

die cAMP-Synthese liegen bisher noch keine gesicherten Erkenntnisse vor.

Im ersten Teil dieser Arbeit wird deshalb ein möglicher Effekt des GnRH-Antagonisten

Ganirelix auf die ovarielle Steroidbiosynthese geprüft. Zum Vergleich dienen dabei die

bereits genauer erforschten Wirkungen von GnRH-Agonisten. Die für die Untersuchungen

kultivierten Granulosaluteinzellen stammen von Patientinnen, die im Rahmen einer IVF-

Therapie nach verschiedenen Protokollen zur kontrollierten ovariellen Hyperstimulation

behandelt wurden. Sie erhielten entweder den GnRH-Antagonisten Ganirelix nach dem

sog. Lübecker Protokoll oder den GnRH-Agonisten Triptorelin nach dem langen Protokoll.

Um die Möglichkeit auszuschließen, daß ein Ausbleiben von GnRH-Analoga assoziierten

Wirkungen auf einer zu geringen Konzentration der Proteohormone nach in vivo-

Applikation der Substanzen basieren könnte, wurden parallel Versuche mit in vitro-Gabe

von Ganirelix bzw. Triptorelin durchgeführt.

Desweiteren haben zurückliegende Experimente die Vermutung nahegelegt, daß GnRH

selbst die Synthese seines eigenen Rezeptors reguliert. Dabei nutzt es vor allem den Weg

der Signaltransduktion über den ‘second messenger’ cAMP, um direkten Einfluß auf die

Expression der GnRH-Rezeptor-mRNA und damit auf die Zahl der Rezeptoren ausüben zu

können (Lin und Conn, 1998 und 1999). GnRH selbst und seine Analoga binden an

spezifische GnRH-Rezeptoren, deren Genexpression auch in ovariellen

Granulosaluteinzellen nachgewiesen werden konnte (Minaretzis et al., 1995). Aufgrund der

wichtigen Bedeutung von cAMP in der Signalvermittlung auf zellulärer Ebene wurde im

zweiten Teil dieser Arbeit überprüft, ob der GnRH-Antagonist Ganirelix die cAMP-

Bildung humaner Granulosaluteinzellen beeinflußt.

39

3 Material und Methoden

3.1 Stimulationsmethode

3.1.1 Das lange Protokoll

Das lange Protokoll ist das weltweit am weitesten verbreitete Stimulationsregime für die

IVF (Rjiosk et al., 1996). Das angestrebte Ziel stellt die Synchronisation der

Follikelreifung dar. Durch die Gabe eines GnRH-Agonisten vor Beginn der Stimulation

mit humanem Menopausen Gonadotropin (HMG) wird eine vollständige Desensitisierung

der Hypophyse angestrebt. Um dies zu erreichen, erhalten die Patientinnen in der Mitte der

Lutealphase des Vorzyklus, d.h. am 22. Zyklustag 3,75 mg eines GnRH-Agonisten (z.B.

Triptorelin) zur subkutanen Injektion. Nach 14 Tagen sollte die Hypothalamus-

Hypophysen-Achse entkoppelt sein. Eine Basissonographie wird durchgeführt zum

Ausschluß von Ovarialzysten, die durch den sogenannten flare-up Effekt während der

Behandlung mit einem GnRH-Agonisten entstehen können. Nun erfolgt die Stimulation

durch die gestaffelte Gabe von je 2 Ampullen HMG an den ersten vier Tagen des Zyklus

und 3 Ampullen täglich an den weiteren 4 Tagen. Sobald die Östradiolwerte kontinuierlich

ansteigen, kann die HMG-Dosierung beibehalten werden. Über Blutentnahmen wird die

Entwicklung des Hormonstatus überwacht. Wenn die Patientin sich noch nicht in der

aktiven Phase befindet, wird die HMG-Dosis individuell gesteigert.

Ab dem 8. Tag des Zyklus werden neben der Bestimmung der LH- und Östradiolwerte im

Serum auch transvaginal-sonographische Untersuchungen der Ovarien durchgeführt, um

die Größe der einzelnen Follikel zu messen. Bei einem Durchmesser des führenden

Follikels von ca. 18 mm und Östradiolwerten von 300-400 pg/ml pro Follikel > 17 mm

wird die Ovulation mittels Gabe von 10.000 IU humanem Choriongonadotropin (HCG)

intramuskulär induziert. 36 Stunden später erfolgt die transvaginal-sonographisch

gesteuerte Follikelpunktion.

Nach Durchführung der IVF bzw. der intrazytoplasmatischen Spermatozoeninjektion

(ICSI) findet der Embryonentransfer (ET) 48 Stunden später statt. Zur Unterstützung der

Lutealphase werden am 2., 5. und 8.Tag nach der Follikelpunktion 2500 bzw. 5000 IU

HCG verabreicht oder Progesteron täglich über 14 Tage gegeben.

40

10.000 IE HCG

Follikelpunktion

GnRH-Agonist Embryotransfer

HMG / FSH

Lutealphasen

unterstützung

22. 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Tag

Follikulometrie (mm) 10 14 18

Abb.9: Das lange Protokoll

3.1.2 Das Lübecker Protokoll

Das sogenannte Lübecker Protokoll wurde von Diedrich und seiner Arbeitsgruppe

entwickelt und basiert auf der kompetitiven Antagonisierung des nativen GnRH durch

einen synthetisch hergestellten GnRH-Antagonisten (Diedrich et al., 1994).

Ab dem 2. Zyklustag erhalten die Patientinnen täglich 2 Ampullen HMG zur Stimulation.

Zusätzlich werden vom 7. Zyklustag an 0,25 mg/die des GnRH-Antagonisten subkutan

verabreicht. Die relativ späte Gabe des GnRH-Antagonisten wird dadurch ermöglicht, daß

es nicht wie bei Gabe eines GnRH-Agonisten zunächst zum sog. Flare-up Effekt kommt,

sondern durch die direkt kompetitive Wirkung des GnRH-Antagonisten am Rezeptor eine

Suppression der körpereigenen GnRH-Wirkung bereits nach einigen Stunden auftritt.

Aufgrund seiner besseren Steuerbarkeit muß der GnRH-Antagonist erst bei drohender

Gefahr eines vorzeitigen LH-Anstieges gegeben werden. Ab dem 8. Zyklustag erfolgen

analog zum langen Protokoll transvaginal-sonographische Follikulometrie sowie

Östradiolbestimmungen, wobei die Ergebnisse der Untersuchungen eine exakte Anpassung

der HMG-Dosis ermöglichen. Die Kriterien für eine Ovulationsauslösung durch Gabe von

10.000 IU HCG entsprechen denen des langen Protokolls. Ebenso identisch verlaufen die

41

Durchführung der transvaginalen Follikelpunktion, des IVF bzw. ICSI, der

Embryonentransfer sowie die hormonelle Unterstützung der Lutealphase.

10.000 IE HCG

Follikelpunktion

Embryotransfer

Ganirelix

HMG / FSH

Lutealphasen

unterstützung

Tag 0 2 4 6 8 10 12 14 16

Follikulometrie (mm) 10 14 18

Abb. 10: Das Lübecker Protokoll

3.2 Patientinnen

Für den ersten Teil der Experimente, an deren Ende die Messung der

Steroidbiosyntheseleistung humaner Granulosaluteinzellen stand, wurden Zellkulturen aus

den bei Follikelpunktionen gewonnenen Zellen von insgesamt 41 Patientinnen angelegt.

Von diesen Frauen erhielten 34 eine in-vitro Fertilisations (IVF)- Behandlung mit

intrazytoplasmatischer Spermatozoen-Injektion (ICSI) aufgrund von männlicher

Subfertilität, bei 7 wurde konventionelles IVF wegen tubarer Sterilität durchgeführt.

Im Rahmen der IVF-Therapie kamen bei oben genannten Patientinnen zwei verschiedene

Behandlungsprotokolle zur Anwendung. Eine Gruppe (n=21) wurde im Rahmen des

etablierten langen Protokolls behandelt und erhielt den GnRH-Agonisten Triptorelin zur

Suppression der endogenen LH-Ausschüttung vor Stimulation mit HMG. Die zweite

Gruppe (n=20) wurde nach dem sog. Lübecker Protokoll stimuliert und bekam zusätzlich

42

zu HMG den GnRH-Antagonisten Ganirelix. Die Patientinnen innerhalb dieser Gruppe

wurden im Rahmen einer klinischen Studie behandelt.

Im zweiten Teil der Experimente wurde wiederum mit humanen Granulosazellen

gearbeitet, allerdings stand hier nicht die Steroidhormonbiosynthese, sondern die cAMP-

Produktion der Zellen im Vordergrund. Alle Patientinnen dieses Kollektivs (n=7) sind

gleich behandelt worden. Sie hatten nach dem langen Protokoll Triptorelin und HMG

sowie zum Auslösen der Ovulation HCG erhalten.

3.3 Zellgewinnung und-präparation

3.3.1. Die Follikelpunktion

Die transvaginal durchgeführte Follikelpunktion unter sonographischer Sicht stellt zur Zeit

die Methode der Wahl zur Oozytengewinnung in der Reproduktionsmedizin dar. Das

Verfahren wurde Mitte der 80er Jahre etabliert und seither ständig modifiziert und

optimiert. Bei diesem zumeist in Vollnarkose oder Analgosedierung durchgeführten

Eingriff wird unter transvaginal-sonographischer Darstellung des jeweiligen Ovars eine

Punktionsnadel durch das hintere Scheidengewölbe zum abgebildeten Follikel

vorgeschoben und dieser abpunktiert. Die dabei anfallende Follikelflüssigkeit beträgt pro

Punktat ca. 5-10 ml. Jeder Follikel wird einzeln abpunktiert und die Flüssigkeit gesammelt

(Rabe et al., 1997).

3.3.2 Granulosaluteinzellpräparation

Die bei den Follikelpunktionen gewonnene Follikelflüssigkeit wurde nach Entnahme der

Oozyten zunächst bei 900 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, der entstehende Überstand

dekantiert und das verbliebene Pellet mit PBS-Dulbecco ohne Ca2+

und Mg2+

(Firma

Biochrom, Berlin, Deutschland) suspendiert. Nach Sammlung aller suspendierten

Flüssigkeiten in einem Röhrchen erfolgte nochmals eine zehnminütige Zentrifugation bei

43

ebenfalls 900 rpm. Auch dieser Überstand wurde dekantiert, das Pellet mit PBS

suspendiert und auf 5 ml Ficoll (Biotech, Uppsala, Schweden) aufgetragen.

Um eine Phasentrennung zu erreichen, folgte nun eine Zentrifugation über 20 Minuten bei

1200 rpm. Aus der mittleren der sich ergebenden drei Phasen wurden die

Granulosaluteinzellen mittels einer Glaspipette entnommen und in 10 ml PBS eingebracht.

Nach gründlicher Vermischung der Zellen mit der Pufferlösung wurde die Suspension

durch ein Zellsieb mit einer Durchlaßgröße von maximal 100 µm gegeben, um

Verunreinigungen zu beseitigen. Eine weitere Zentrifugation bei 900 rpm schloß sich an,

der Überstand wurde wiederum dekantiert und die zurückbleibenden Zellen mit 5ml

Inkubationsmedium suspendiert. Das Inkubationsmedium setzte sich aus 90% Nutrient

Mixture Ham`s F10 (Gibco, Paisley, Schottland), 10% fetalem Kälberserum (Firma

Biochrom) und 1% Penicillin/Streptomycin (Sigma, St.Louis, USA) zusammen.

50 µl der Zellen/Medium-Suspension wurden mit der gleichen Menge Trypanblau (Sigma)

vermischt und die angefärbten Zellen mittels einer Neubauerzählkammer bezüglich ihrer

Vitalität geprüft und anschließend ausgezählt. Die Vitalität der Zellen lag stets > 90%.

Nach Auszählung der Zellen wurde die gut durchmischte Zellen/Medium-Suspension mit

Inkubationsmedium verdünnt, um eine Zellkonzentration von 100.000 Zellen/ml zu

erhalten. Es erfolgte die Zugabe von Testosteron in der Konzentration 5 µmol/l als

Aromatasesubstrat. Dies ist notwendig, da die Granulosazellen zur de novo-

Androgensynthese nicht in der Lage sind, sondern erst nach Diffusion der in den

Thekazellen gebildeten Androgene in die Granulosazellen diese aromatisieren, so daß

Östrogene entstehen. Schließlich wurden die suspendierten Zellen auf einer 24-well-Platte

(1ml/well, Greiner, Frickenhausen, Deutschland) ausgesät und bei 37°C unter 5% CO2

inkubiert.

44

Schema der Granulosaluteinzellpräparation

1. Zweimalige Zentrifugation der gewonnenen Follikelflüssigkeit,

jeweils im Anschluß Resuspension in PBS-Puffer

2. Zur Phasenauftrennung Zentrifugation auf Ficoll

3. Isolierung der Granulosaluteinzellen durch Abpipettieren der

mittleren Phase

4. Eine weitere Resuspension mit PBS und Zentrifugation zum Auswaschen

der Zellen

5. Anschließende Resuspension mit vorgewärmtem Inkubationsmedium

und Zellzählung

6. Verdünnung des Zell-Mediumgemischs auf 100.000 Zellen/ml Medium

und Aussaat der Zellen nach Testosteronapplikation auf 24-well-Kulturplatte

3.4 Experimente mit humanen Granulosaluteinzellen

3.4.1 Genereller Versuchsaufbau

Zur Untersuchung der Fragestellungen wurden kultivierte humane Granulosaluteinzellen

verwendet, die während der Follikelpunktionen im Ablauf der IVF-Therapie behandelter

Patientinnen gewonnen werden konnten. Diese Vorgehensweise eröffnete zweierlei

Vorteile: Zum einen waren die Zellen durch die routinemäßige Durchführung der IVF-

Therapie relativ leicht verfügbar, zum anderen konnte so der in vivo Einfluß von GnRH-

Analoga an den nachfolgend inkubierten Zellen geprüft werden.

Im Versuchsteil A lag das Augenmerk auf einer potentiellen Beeinflussung der in

kultivierten humanen Granulosaluteinzellen ablaufenden Steroidhormonbiosynthese durch

den GnRH-Antagonist Ganirelix. Nach der Zellpräparation wurden die Kulturen unter den

45

bereits erwähnten Bedingungen bis zu 72 Stunden inkubiert. In 24-stündigen Intervallen

erfolgte ein Mediumwechsel, wobei im jeweils abgezogenen Medium die Basalsekretion

von Östradiol und Progesteron gemessen wurde.

Bei der Untersuchung des Einflusses von GnRH-Analoga auf die ovarielle

Signaltransduktion im Versuchsteil B verliefen Zellgewinnung und-präparation identisch

zu den Steroidbiosyntheseversuchen, alle verwendeten Follikelpunktate stammten von in

gleicher Weise mit dem GnRH-Agonisten Triptorelin und HMG vorbehandelten Frauen.

Ziel dieser Versuchsreihe war die Messung der totalen cAMP-Produktion durch die

Granulosaluteinzellen während einer 48-stündigen Inkubationszeit. Dabei war dem

Medium entweder Ganirelix in der Konzentration von 1 nM, Triptorelin in gleicher

Konzentration oder kein GnRH-Analogon zugesetzt worden. Außerdem wurden die basale

Steroidbiosyntheseleistung in Versuchsteil A bzw. die basale cAMP-Bildung der Zellen im

Versuchsteil B mit der Syntheserate unter Gonadotropinstimulation verglichen, da ein

unterschiedlicher Effekt der GnRH-Analoga-Behandlung auf beide Sekretionsformen nicht

auszuschließen war.

3.4.2 Experimentelles Design

Die erste Experimentenreihe innerhalb des Versuchsteils A zeigte, daß eine in vivo-

Behandlung mit GnRH-Analoga im Rahmen der IVF-Therapie keinen signifikanten Effekt

auf die Steroidbiosynthese von kultivierten humanen Granulosaluteinzellen hatte. Um zu

prüfen, ob diese Beobachtung auf geringe GnRH-Analoga-Konzentration in den Kulturen

nach der in-vivo-Applikation der Substanzen zurückzuführen war, wurde den Zellkulturen

in einer weiteren Reihe von Experimenten entweder Ganirelix-haltiges oder Triptorelin-

haltiges Medium zugesetzt. Dabei betrug die Konzentration des GnRH-Antagonisten bzw.

-Agonisten 1 nM. Alle hierfür verwendeten Granulosaluteinzellen stammten von zuvor mit

dem GnRH-Agonisten Triptorelin stimulierten Frauen. Dies war möglich, da wir zeigen

konnten, daß der GnRH-Agonist die Steroidsynthese der Zellen nicht beeinflusste. Nach

Anlegen der Kulturen wurde ein Teil der Zellen mit nM Ganirelix-haltigem Medium und

eine andere Gruppe von Zellen mit Kontrollmedium inkubiert. Das weitere Vorgehen war

identisch zum in vivo-Versuchsmodell. Alle 24 Stunden wurde das Medium abgesaugt und

die darin enthaltene Basalsekretion von Östradiol und Progesteron gemessen. Für eine

46

Gruppe der inkubierten Zellen folgte eine 6-stündige Stimulation mit 5 IU HCG/ml, analog

dazu erfolgte die Bestimmung der Basalsekretion nicht stimulierter Zellen. Die

Bestimmung der basalen sowie der stimulierten Steroidhormonsynthese erfolgte mittels

eines enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA).

Für die Serie von Experimenten zur Beobachtung der second messenger cAMP Bildung

unter Einfluß von GnRH-Analoga im Rahmen des Versuchsteil B wurden ebenfalls

Granulosaluteinzellen aus den Follikelpunktaten von Patientinnen verwendet, die sich im

Rahmen einer IVF-Therapie in Behandlung befanden. Alle Patientinnen waren in gleicher

Weise mit dem GnRH-Agonisten Triptorelin und HMG nach dem langen Protokoll

vorbehandelt. Die Zellgewinnung und -präparation wurden analog zu den

vorausgegangenen Experimenten durchgeführt, deren Untersuchungsschwerpunkt die

Steroidbiosyntheseleistung unter GnRH-Analoga Einfluß war. Die präparierten Zellen

wurden durch Hinzugabe des vorbereiteten Mediums auf eine Konzentration von 100.000

Zellen/ml verdünnt und im Anschluß auf eine 24-well-Platte (1 ml/well) ausgesät. Eine

Inkubation über Nacht bei 37 °C und 5% CO2

schloß sich an. Dieser Schritt ermöglichte

den Ausgleich eines eventuellen Effektes auf die Zellen durch den GnRH-Agonisten und

HMG in vivo während der kontrollierten ovariellen Stimulation. Nach einem

Mediumwechsel wurden die Zellen für 48 Stunden inkubiert, wobei dem Medium

entweder Ganirelix in der Konzentration 1 nM oder Triptorelin in gleicher Konzentration

zugesetzt wurde. Eine dritte Zellgruppe erhielt zur Inkubation Medium ohne Zusatz von

GnRH-Analoga. Während der letzten 6 Stunden der Inkubationszeit wurde die Hälfte der

kultivierten Zellen mit 5 IU HCG stimuliert. Da die Konzentrationen der GnRH-Analoga

im Medium nicht verändert werden sollten, wurde auf einen Wechsel des Mediums vor der

HCG-Stimulation verzichtet. Nach Ablauf der 48-stündigen Inkubationszeit wurden die

Zellmembranen durch kräftiges Pipettieren unter Addition von 20 µl einer 10%igen

Dodecyltrimethyl-Ammonium-Bromid-Lösung zerstört. Die komplette Lyse aller

Zellpopulationen konnte nach Zusatz von Tryptanblau unter mikroskopischer Einstellung

der einzelnen wells nachgewiesen werden. Die Konzentration des auf diese Weise

extrahierten cAMP wurde unter Einsatz eines Radioimmunoassays gemessen (siehe 3.5).

47

+6h HCG Kontrolle

+6h ohne Stimulation

Ganirelix

+6h HCG

+6h ohne Stimulation

+6h HCG

+6h ohne Stimulation

0 24 48 72 Inkubationszeit (h)

Abb. 11: Aufbau Versuch A-in vivo-Modell

+6h HCG Kontrolle

+6h ohne Stimulation

Ganirelix

+6h HCG

+6h ohne Stimulation

+6h HCG

+6h ohne Stimulation

0 24 48 72 Inkubationszeit (h)

Abb. 12: Aufbau Versuch A-in vitro-Modell

Kontrollmedium

Zugabe v. 1nM Triptorelin zum Medium

Zugabe v. 1nM Ganirelix zum Medium

Kontrollmedium +6h

Zugabe v. 1nM Triptorelin zum Medium +6h HCG Stimulation

Zugabe v. 1nM Ganirelix zum Medium +6h

0 24 48 Inkubationszeit (h)

48

Abb. 13: Aufbau Versuch B

3.5 Steroidassays

Die Messung der Steroidhormone Östradiol und Progesteron erfolgte durch einen ELISA

(SR-1 von der Firma Serono, Freiburg, Deutschland) im Hormonlabor der

Universitätsfrauenklinik zu Lübeck. Das Nachweisprinzip beruht beim ELISA auf der

photometrischen Darstellung einer enzym- bzw. fluorchrommarkierten Proteinbindung.

Dabei wird zunächst mit Hilfe von Trennmitteln Östradiol bzw. Progesteron aus seiner

Bindung an Trägerproteine freigesetzt. Anschließend bindet ein Fluorescein-markierter

polyklonaler Anti-Östradiol-Antikörper bzw. Anti-Progesteron-Antikörper (aus

Kaninchenserum) das freie Sexualsteroid, welches in dieser Form durch Photometrie

quantitativ bestimmt werden kann.

Östradiol Progesteron

Meßbereich: 5-3000 pg/ml 0,2-40 ng/ml

Intraassay-

Variationskoeffizient: 10,7 % (210±22 pg/ml) 9,7 % (8,6±0,84 ng/ml)

Interassay-

Variationskoeffizient: 10,3 % (237±24 pg/ml) 12,3 % (5,4±0,66 ng/ml)

Sensitivität 5 pg/ml 0,2 ng/ml

Tabelle 1: Meßbereiche und Variationskoeffizienten der Steroidassays

3.6 cAMP-Radioimmunoassay

Der quantitative Nachweis der second messenger cAMP-Produktion in den angelegten

Zellkulturen wurde durch einen Radioimmunoassay (Biotrak cAMP Scintillation

Proximity Assay [SPA] System der Firma Amersham Pharmacia Biotech,

Buckinghamshire, England) im Isotopenlabor der Medizinischen Universität zu Lübeck

geführt. Der Assay basiert auf der konkurrierenden Bindung zwischen unmarkiertem

cAMP und einer festgelegten Menge an mit 125

I-markiertem cAMP an einer begrenzten

Zahl von Bindungstellen auf einem für cAMP spezifischen Antikörper. Da sowohl die

49

Menge des Antikörper als auch die des radioaktiv-markierten Liganden bekannt ist,

spiegelt die Anzahl des vom Antikörper gebundenen radioaktiv-markierten cAMP

umgekehrt proportional die Konzentration des hinzugefügten nicht radioaktiv-markierten

cAMP wieder. Zum Nachweis des an den Antikörper gebundenen cAMP wird ein zweiter

Antikörper hinzugegeben, der das bereits gebundene 125

I-markierte cAMP durch

Fluormikrosphären immobilisiert. Die bei diesem Vorgang zerfallenden

Fluormikrosphären erzeugen Licht, das mit Hilfe eines β-Szintillation-Zählers gemessen

wird. Dadurch kann indirekt ein Rückschluß auf die Menge an gebundenem radioaktiv-

markiertem cAMP gezogen werden. Die Konzentration des unmarkierten cAMP erhält

man durch Extrapolieren einer Standardkurve, die zuvor aus Verdünnungen bekannter

cAMP-Konzentrationen erstellt wurde.

Meßbereich: 0,2-12,8 pmol/Röhrchen (66-4214 pg/ Röhrchen)

Intraassay-Variationskoeffizient: 5,6 % (6,4 pmol/ Röhrchen)

Interassay-Variationskoeffizient: 10,5 % (1,7 pmol/ Röhrchen)

Sensitivität: 78 fmol/tube (26 pg/ Röhrchen)

Tabelle 2: Meßbereich und Variationskoeffizienten des cAMP-Radioimmunoassay

3.7 Datenpräsentation und Statistik

Die Daten der Experimente wurden bei den Versuchen zur Steroidhormon-Basalsekretion

als Absolutwerte angegeben. Die Ergebnisse der mit HCG-stimulierten Zellkulturen

wurden in % des Basalwertes angegeben. Dabei wurde der Basalwert als 100% definiert.

Ebenfalls in Absolutwerten aufgeführt sind die Resultate der totalen cAMP-Produktion.

Die Abbildungen zeigen Mittelwerte und Standardfehler [x + standard error of the mean

(SEM)] von 11-20 Experimenten. Die Unterschiede zwischen den einzelnen

Behandlungsgruppen wurde durch den Mann-Whitney U-Test bzw. bei mehr als zwei

Behandlungsgruppen durch eine Varianzanalyse mit anschließendem Newman-Keuls -Test

geprüft. Es wurden aufgrund der großen Anzahl von Testzeitpunkten für die Abbildungen

repräsentative Daten ausgewählt.

50

4 Ergebnisse

4.1 Patientinnencharakteristik

Das Patientinnenalter reichte von 21 bis 41 Jahre, im Durchschnitt 33,2 Jahre. Die am Tage

der Ovulationsinduktion durch HCG-Gabe gemessenen Serumöstradiolwerte lagen im

Durchschnitt bei 1374 pg/ml. Es ergab sich eine durchschnittliche Zellausbeute von etwa

1.825.000 Zellen/ml. Von den 41 Frauen des Versuchsteils A erhielten 34 eine IVF-

Behandlung mit ICSI aufgrund von männlicher Subfertilität, bei 7 Frauen wurde ein

konventionelles IVF wegen tubarer Sterilität durchgeführt. In den Versuchsteil B wurden

insgesamt 10 Frauen aufgenommen, wobei sich 7 aufgrund männlicher Subfertilität und 3

wegen tubarer Sterilität der Therapie unterzogen.

4.2 Effekte der in-vivo-Behandlung mit GnRH-Analoga auf die Steroidbiosynthese

kultivierter humaner Granulosaluteinzellen

Bei der Auswertung der Meßergebnisse für die Syntheseleistung von Progesteron und

Östradiol richtete sich das Augenmerk zunächst auf die möglichen Effekte der GnRH-

Analoga auf die basale Akkumulation der beiden Sexualsteroide. Im Laufe der 72-

stündigen Kulturzeit stieg die Akkumulation der Steroidhormone stetig an. Dabei ließ sich

zu keinem der verschieden Zeitpunkte ein signifikanter Einfluß auf die Hormonproduktion

der kultivierten Zellen erkennen, die von in vivo mit Ganirelix behandelten Patientinnen

stammten (Verweis auf Abb. 14 und 15). Als Kontrolle dienten die Zellkulturen von

Patientinnen, welche zuvor den GnRH-Agonisten Triptorelin erhalten hatten. Dies war

möglich, da sich in früheren Experimenten herausgestellt hatte, daß Triptorelin keinen

signifikanten Einfluß auf die Steroidbiosynthese humaner Granulosaluteinzellen hat. Die

Progesteronauschüttung zeigte sich in den Zellen tendenziell etwas niedriger, die durch

Follikelpunktionen von Frauen gewonnen worden waren, welche in vivo den GnRH-

Antagonisten Ganirelix erhalten hatten. Ein ähnlicher Effekt im Bezug auf die

Östradiolproduktion ließ sich nicht nachweisen.

51

Die Hormonsyntheseleistung unter der Stimulation mit 5 IU HCG über 6 Stunden wurde

ebenfalls nicht signifikant durch Gabe von GnRH-Analoga beeinflußt ( Abb. 14 und 15,

unterer Graph). Innerhalb der ersten 48 Stunden der Inkubationszeit wiesen die Zellen der

in vivo mit Ganirelix behandelten Frauen eine minimal stärkere Progesteron- und

Östradiolsynthese unter HCG-Stimulation auf als die korrespondierenden Zellkulturen der

Patientinnen, die eine agonistische Behandlung erhalten hatten. Nach 72-stündiger

Kulturdauer zeigte sich ein gegenteiliger Effekt; die Produktionsleistung beider

Steroidhormone war in den aus antagonistischer Behandlung stammenden Zellen

geringfügig schwächer als die Hormonsynthese in den Zellkulturen von agonistisch

behandelten Frauen (Abb. 14 und 15, unterer Graph). Beide Effekte lagen allerdings nicht

im Bereich statistischer Signifikanz.

52

Abb. 14: Effekte der in vivo-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die basale

und HCG-stimulierte Progesteronausschüttung (P) kultivierter humaner

Granulosaluteinzellen. Die Zellen stammen von Patientinnen, die mit

Triptorelin oder Ganirelix vorbehandelt wurden. Die

Progesteronakkumulation wurde in 24-stündigen Intervallen gemessen

(oberer Graph). Die HCG-Stimulation wurde alle 24 Stunden für je 6

Stunden durchgeführt (unterer Graph). Repräsentative Daten von 20

Versuchen sind abgebildet (x+SEM).

24h 48h 72h

0

100

200

300

Triptorelin

Ganirelix

Kulturdauer

P[%

d

er B

asa

lse

kre

tio

n]

24h 48h 72h

0

100

200

Triptorelin

Ganirelix

Kulturdauer

P [n

g/m

l]

53

Abb. 15: Effekte der in vivo-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die basale

und HCG-stimulierte Östradiolausschüttung (E) kultivierter humaner

Granulosaluteinzellen. Die Zellen stammen von Patientinnen, die mit

Triptorelin oder Ganirelix vorbehandelt wurden. Die

Östradiolakkumulation wurde in 24-stündigen Intervallen gemessen

(oberer Graph). Die HCG-Stimulation wurde alle 24 Stunden für je 6

Stunden durchgeführt (unterer Graph). Repräsentative Daten von 20

Versuchen sind abgebildet (x+SEM).

24h 48h 72h

0

1000

2000

Triptorelin

Ganirelix

Kulturdauer

E [p

g/m

l]

24h 48h 72h

0

50

100

150

Triptorelin

Ganirelix

Kulturdauer

E [%

de

r B

as

alse

kre

tio

n]

54

4.3 Effekte der in vitro-Behandlung mit Ganirelix auf die Steroidbiosynthese kultivierter

humaner Granulosaluteinzellen

Nachdem in einer Reihe von Experimenten das Verhalten der Granulosaluteinzellen auf

die in vivo-Behandlung mit GnRH-Analoga untersucht worden war, wurde in weiteren

Versuchen ein möglicher Effekt von Ganirelix auf die Steroidbiosynthese nach in vitro-

Behandlung geprüft. Ergebnisse aus früheren Experimenten hatten gezeigt, daß eine in

vivo-Behandlung mit dem GnRH-Agonisten Triptorelin keinen signifikanten Einfluß auf

die Steroidhormonproduktion der Zellen mit sich brachte. Daher konnten nun derartig

vorbehandelte Zellen für die weiteren Untersuchungen verwendet werden. Bezüglich der

basalen Progesteron-und Östradiolakkumulation waren in der 72 Stunden lang

durchgeführten Kulturzeit keine signifikanten Unterschiede zwischen den Zellen, deren

Medium Ganirelix in der Konzentration 1nM enthielt, und den mit Kontrollmedium

inkubierten Zellen festzustellen (Abb. 16 und 17, oberer Graph). Die gemessenen Werte

für die Östradiolakkumulation unter in vitro-Gabe von Ganirelix waren nach 48 Stunden

sowie nach 72 Stunden Inkubationszeit sogar nahezu identisch mit den für die

Kontrollgruppe ermittelten Werten.

Auch für die Hormonproduktion unter HCG-Stimulation konnte kein signifikanter Effekt

auf die Granulosaluteinzellen durch in vitro-Gabe des GnRH-Antagonisten nachgewiesen

werden. Dabei wurde ein Teil der Zellen ebenfalls mit 5 IU HCG für 6 Stunden stimuliert

(Abb. 16 und 17, unterer Graph). In den ersten 48 Stunden der Inkubationszeit lagen

sowohl die stimulierte Progesteron- als auch die stimulierte Östradiolausschüttung etwas

über der Hormonsekretion der im Kontrollmedium kultivierten Zellen. Ebenso wie schon

in den Experimenten zum Einfluß der in vivo-Applikation von GnRH-Analoga

beschrieben, ergaben sich für die Steroidbiosyntheseleistung der in vitro antagonistisch

behandelten Zellen nach 72 stündiger Kulturzeit geringfügig kleinere Meßwerte als für die

Produktionsleistung der Zellen in der Kontrollgruppe (Abb. 16 und 17, unterer Graph).

Auch diese Beobachtungen waren allerdings nicht signifikant.

55

Abb. 16: Effekte der in vitro-Behandlung mit Ganirelix auf die basale und HCG-

stimulierte Progesteronausschüttung (P) kultivierter humaner

Granulosaluteinzellen. Die Zellen stammen von Patientinnen, die mit

Triptorelin behandelt wurden. Unter direkter Applikation von Ganirelix in

das Kulturmedium wurde die Progesteronakkumulation in 24-stündigen

Intervallen gemessen, als Kontrolle diente die in vitro Gabe von Triptorelin

(oberer Graph). Die HCG-Stimulation wurde alle 24 Stunden für je 6

Stunden durchgeführt (unterer Graph). Repräsentative Daten von 20

Versuchen sind abgebildet (x+SEM).

24 h 48 h 72 h

0

50

100

150

Kontrolle

Ganirelix

Kulturdauer

P[n

g/m

l]

24 h 48 h 72 h

0

100

200

300

Kontrolle

Ganirelix

Kulturdauer

P[%

d

er B

asa

lse

kre

tio

n]

56

Abb. 17: Effekte der in vitro-Behandlung mit Ganirelix auf die basale und HCG-

stimulierte Östradiolausschüttung (E) kultivierter humaner

Granulosaluteinzellen. Die Zellen stammen von Patientinnen, die mit

Triptorelin behandelt wurden. Unter direkter Applikation von Ganirelix in

das Kulturmedium wurde die Östradiolakkumulation in 24-stündigen

Intervallen gemessen, als Kontrolle diente die in vitro Gabe von Triptorelin

(oberer Graph). Die HCG-Stimulation wurde alle 24 Stunden für je 6

Stunden durchgeführt (unterer Graph). Repräsentative Daten von 20

Versuchen sind abgebildet (x+SEM).

24 h 48 h 72 h

0

2500

5000

7500

10000

Kontrolle

Ganirelix

Kulturdauer

E [p

g/m

l]

24 48 72

0

100

200

Kontrolle

Ganirelix

Kulturdauer

E[%

d

er B

asalsek

re

tio

n]

57

4.4 Effekte der in vitro-Gabe von GnRH-Analoga auf die cAMP-Akkumulation

kultivierter

humaner Granulosaluteinzellen

Aufgrund der bereits beschriebenen zentralen Bedeutung des ‘second messenger’ cAMP

für die Signaltransduktion innerhalb der Steuerung von ovarieller Steroidhormonsynthese-

und sekretion lag es nah, auch einen eventuellen Einfluß der GnRH-Analoga auf die

cAMP-Produktion von Granulosaluteinzellen zu untersuchen. Die für 48 Stunden

inkubierten Zellen stammten von Patientinnen, die ausschließlich mit dem GnRH-

Agonisten Triptorelin und HMG vorbehandelt waren. In früheren Studien konnte bewiesen

werden, daß eine derartige Behandlung keinen Effekt auf die Steroidbiosynthese der Zellen

hat. Daher bestand die Möglichkeit, diese Zellen für die Untersuchung der oben genannten

Fragestellung zu verwenden. Weder die Zellkulturen, deren Medium den GnRH-

Antagonisten Ganirelix in der Konzentration 1 nM enthielt, noch die Zellen, in deren

Medium der GnRH-Agonist Triptorelin in gleicher Konzentration appliziert worden war,

zeigten signifikante Unterschiede in ihrer totalen cAMP-Akkumulation verglichen mit

einer unbehandelten Kontrollgruppe über 48 Stunden Inkubationszeit (Abb. 18).

Auch die in den letzten 6 Stunden durchgeführte Stimulation mit 5 IU HCG erbrachte

keine signifikante Beeinflussung der cAMP-Produktion. Als Basalwert wurde die cAMP-

Bildung einer Kontrollgruppe eingesetzt, die weder GnRH-Agonisten noch -Antagonisten

erhalten hatte (Abb.19 B). Ebenso ergaben sich bezüglich der cAMP-Bildung von

Granulosaluteinzellen unter Stimulation ähnliche Werte wie für die unstimulierten

Kulturen (Abb. 19 A und B).

Die in vitro agonistisch behandelten Zellen erreichten sowohl mit als auch ohne HCG-

Stimulation prozentual etwas höhere Werte für die cAMP-Produktion als die in vitro mit

Ganirelix behandelten Zellen (Abb. 19 A und B). Dieser Effekt war jedoch zu gering

ausgeprägt, als daß der Nachweis einer statistischen Signifikanz zu führen gewesen wäre.

58

Abb. 18: Absolute cAMP-Produktion kultivierter humaner Granulosaluteinzellen in

48 Stunden.

Die Zellen wurden mit 1nmolar Ganirelix bzw. 1nmolar Triptorelin

behandelt oder blieben unbehhandelt (oberer Graph). In den letzten 6

Stunden der Kulturzeit wurde ein Teil der Zellen mit 5 IU HCG stimuliert

(unterer Graph). Alle Zellen stammen von Patientinnen, die mit Triptorelin

und HMG vorbehandelt wurden. Es ist ein repräsentatives Experiment von

insgesamt sieben Versuchen abgebildet (x+SEM).

Ohne Stimulation

unbehandelt 48 h Gani 48 h Tripto

0

10

20

30

pm

ol/m

l cA

MP

5U hCG

unbehandelt 48 h Gani 48 h Tripto

0

100

200

300

pm

ol/m

l cA

MP

Keine Stimulation

5 IU hCG

59

Abb. 19: Basale cAMP-Produktion (A) bzw. cAMP-Produktion unter HCG

Stimulation (B) für 6 Stunden.

Alle kultivierten Zellen stammen von Patientinnen, die mit dem GnRH-

Agonisten Triptorelin sowie HMG vorbehandelt wurden. Repräsentative

Daten von sieben Experimenten sind abgebildet (x+SEM).

Ohne Stimulation

Kontrolle Ganirelix Triptorelin

0

50

100

150

% d

er K

on

tro

lle

5U hCG

Kontrolle Ganirelix Triptorelin

0

50

100

150

% der K

ontro

lle

A

B

Keine Stimulation

5 IU hCG

60

5 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit werden erstmalig ausführliche Untersuchungen zu den

möglichen Effekten des GnRH-Antagonisten Ganirelix auf die Steroidbiosynthese

humaner Granulosaluteinzellen präsentiert. Zusätzlich wurden im in vitro-Modell die

Wirkungen von GnRH-Analoga auf die Akkumulation des second messenger cAMP in

Granulosaluteinzellen untersucht. Auch unter variierenden Behandlungsschemata konnte

keinerlei signifikante Beeinflussung der Steroidhormonproduktion sowie der cAMP-

Bildung durch den Einsatz der GnRH-Analoga festgestellt werden.

5.1 Wirkungen von GnRH-Analoga auf die Steroidbiosynthese

Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche legen dar, daß der GnRH-

Antagonist Ganirelix nach einer in vivo-Verabreichung keine signifikanten Effekte auf die

Steroidbiosynthese humaner Granulosaluteinzellen hervorruft. Da in früheren

Experimenten ebenfalls keine signifikante Beeinflussung der Hormonproduktion im

Anschluß an eine in vivo Applikation des GnRH-Agonisten Triptorelin nachgewiesen

werden konnte, kamen Granulosaluteinzellen von zuvor mit Triptorelin behandelten

Frauen als Kontrollgruppe zum Einsatz. Die Zellen der in vivo antagonistisch stimulierten

Frauen zeigten bezüglich der basalen Hormonsynthese geringfügig niedrigere Meßwerte

für Progesteron und Östradiol als die parallel beobachtete Kontrollgrupppe. Allerdings

erreichten die Ergebnisse nicht den Bereich statistischer Signifikanz. Unter sechsstündiger

HCG-Stimulation fanden sich für beide Sexualsteroide übereinstimmende Tendenzen. Die

gonadotropinstimulierte Östrogen- wie auch die Progesteronsynthese der antagonistisch

vorbehandelten Zellen lag nach 24-stündiger Kulturzeit über der Syntheserate der

agonistisch behandelten Gruppe. Nach 48 sowie 72 Stunden zeigten sich wiederum

übereinstimmend für beide Hormone eine geringere Produktionsleistung im antagonistisch

vorbehandelten Zellkollektiv. Auch diese Differenzen waren nicht signifikant.

61

Eine mögliche Erklärung für die gemachten Beobachtungen könnte eine zu geringe

Konzentration der GnRH-Analoga im Kulturmedium während der Inkubationsphase sein.

Daher wurden in weiteren Versuchen zur Überprüfung dieser Hypothese die GnRH-

Analoga in 1 nM Konzentration direkt dem Kulturmedium zugegeben. Jedoch ergab sich

auch für die in vitro-Applikation der Substanzen keinerlei Hinweis auf eine signifikante

Beeinflussung der ovariellen Hormonproduktion. Sowohl die basale Östradiol- bzw.

Progesteron-Akkumulation wie auch die Hormonsekretion unter HCG-Stimulation zeigten

keine relevanten Unterschiede nach Gabe des GnRH-Antagonisten im Vergleich zur

Kontrolle.

Eine direkte Einflussnahme der GnRH-Analoga hat das Vorhandensein spezifischer

GnRH-Rezeptoren zur Voraussetzung. Die Expression von GnRH-Rezeptoren im

Nagetierovar gilt mittlerweile als sichergestellt (Gore-Langton et al., 1981; Clayton und

Catt, 1981; Pieper et al., 1981; Huesh et al., 1984). Demgegenüber gibt es

widersprüchliche Erkenntnisse über ein Vorkommen spezifischer GnRH-Rezeptoren im

menschlichen Ovar. Zwar konnten Clayton und Huhtaniemi 1982 keine spezifische GnRH-

Bindung im Corpus luteum nachweisen, aber mittels in situ-Autoradiographie gelang es

einer französischen Arbeitsgruppe 1989 hochaffine Bindungsstellen in Granulosazellen des

dominanten Follikels darzustellen (Latouche et al., 1989). Zuvor waren niedrigaffine

Bindungsstellen im humanen Corpus luteum nachgewiesen worden (Bramley et al., 1985).

In einer jüngeren Studie waren Brus et al. 1997 durch die Verwendung von Rezeptorassays

in der Lage, GnRH-Rezeptoren in via Follikelpunktionen gewonnenen

Granulosaluteinzellen zu dokumentieren. Da die Rezeptordarstellung in präovulatorischen

Follikeln nicht glückte, ist davon auszugehen, daß es in humanen Granulosazellen erst im

Anschluß an den mittzyklischen LH-Gipfel zur Ausprägung von GnRH-Rezeptoren

kommt.

Nachdem die Klonierung und Charakterisierung des humanen GnRH-Rezeptors gelungen

war (Kakar et al., 1992), wurden vermehrt Versuche unternommen, die GnRH-Rezeptor

mRNA zur Darstellung zu bringen. Unter Verwendung der Reverse Transkriptase-

Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), wodurch die mRNA zunächst in DNA

umgeschrieben und anschließend mittels der PCR amplifiziert werden konnte, wurde die

Detektierung der GnRH-Rezeptor mRNA im humanen Ovar möglich (Kakar et al., 1994;

Peng et al., 1994).

62

Minaretzis et al. beschrieben daraufhin die unterschiedliche Expression der GnRH-

Rezeptor mRNA in Zusammenhang mit verschiedenen Stadien des Menstruationszyklus

(Minaretzis et al., 1995). Auch im humanen Corpus luteum gelang es durch in-situ-

Hybridisierung eine sehr schwach ausgeprägte Expression aufzuzeigen (Fraser et al.,

1996). Als besonders aufschlußreich erwies sich eine Veröffentlichung von Peng et al. aus

dem Jahre 1994, in der erstmalig die Expression der GnRH- und GnRH-Rezeptor mRNA

in humanen Granulosaluteinzellen belegt werden konnte. Ferner wurde die direkte

Steuerfunktion von GnRH auf die mRNA-Spiegel und damit die Syntheseleistung seines

eigenen Rezeptors offenbart. Es zeigte sich, daß die Anwesenheit des Gonadotropin-

Releasing Hormons zu einer gesteigerten Expression der mRNA seines Rezeptors führte,

wohingegen HCG die mRNA-Spiegel abfallen ließ. Diese Beobachtungen verdeutlichen

die Rolle des GnRH als autokriner und auch parakriner Regulator im menschlichen Ovar.

Der Nachweis von GnRH-Rezeptoren in menschlichen Granulosaluteinzellen legt die

Vermutung nah, daß sie GnRH-gesteuerte Regulationsvorgänge innerhalb der Zellen

vermitteln. Allerdings ist die Konzentration des hypothalamisch gebildeten GnRH im

peripheren Kreislauf so gering, daß eine Aktivierung der ovariellen GnRH-Rezeptoren

eher unwahrscheinlich ist. Die Anwendung von GnRH-Analoga im Rahmen einer

kontrollierten ovariellen Hyperstimulation führt dagegen zu weit höheren Konzentrationen

der Substanzen im Serum, wodurch die Aktivierung der Rezeptoren möglich wird. Im

Gegensatz zu den wenigen bislang veröffentlichten Untersuchungen über eine mögliche

direkte Einflußnahme der GnRH-Antagonisten auf das menschliche Ovar liegen eine

Vielzahl von Berichten bezüglich agonistischer Effekte auf die ovarielle

Steroidbiosynthese vor. Einige Studien befassten sich mit den Auswirkungen einer in vivo-

Applikation agonistischer Präparate auf die ovarielle Steroidbiosynthese kultivierter

Granulosaluteinzellen. Dabei fand sich übereinstimmend eine verminderte

Progesteronproduktion der agonistisch vorbehandelten Zellen, wobei verschiedene COH-

Regime sowie unterschiedliche GnRH-Agonisten eingesetzt wurden (Hamori et al., 1992;

Dirnfeld et al., 1993).

Dagegen liegen deutlich mehr Veröffentlichungen zum direkten Einfluß von GnRH-

Agonisten auf die ovarielle Hormonproduktion vor. So postulierten Casper et al. für GnRH

selbst wie auch für einen GnRH-Agonisten keinen direkten Einfluß auf humane

63

Granulosazellen aus präovulatorischen Follikeln, da sie keine inhibitorische Wirkung auf

die Steroidbildung aufwiesen (Casper et al., 1982). Des weiteren war es Fabbri et al. 1996

nicht möglich, einen Effekt des GnRH-Agonisten Leuprorelin auf die Östradiolbildung

humaner präovulatorischer Granulosazellen zu demonstrieren. Die Zellen hatten

Leuprorelin in verschiedenen Konzentrationen über eine Kulturdauer von 24 bis zu 72

Stunden erhalten, jedoch unterschieden sich die für das jeweilige Inkubationsintervall

gemessenen Östradiolwerte nicht signifikant von den zum Vergleich herangezogenen

basalen Akkumulationswerten. Dagegen konnte ein deutlicher Anstieg der

Östradiolproduktion in Granulosazellen beobachtet werden, die zuvor FSH in vitro

erhalten hatten (Fabbri et al., 1996). Eine andere Studie deckte den Zusammenhang

zwischen der agonistischen Wirkung auf die Steroidbiosynthese humaner Granulosazellen

und dem Grad der Follikelreifung auf. Unter Zugabe eines GnRH-Agonisten zum

Kulturmedium unterschieden sich die basale und gonadotropinstimulierte

Progesteronsekretion kultivierter humaner Granulosazellen der frühen bzw. mittleren

Follikelphase signifikant von der Hormonproduktion der Zellen, die in der späten

Follikelphase kultiviert worden waren (Olsson et al., 1990).

Die Mehrheit der Studien, die sich mit direkten Wirkungen von GnRH und seinen Analoga

auf die Hormonsynthese präovulatorischer Granulosazellen beschäftigt haben, weist auf

eine inhibitorische Wirkung der GnRH-Analoga auf die Hormonproduktion hin (Tureck et

al., 1982; Bussenot et al., 1993; Uemura et al., 1994). Diese Ergebnisse überraschen, da

mittlerweile das Fehlen von ovariellen GnRH-Rezeptoren während der Follikelphase

nachgewiesen werden konnte (Brus et al., 1997). Für Granulosaluteinzellen, die von

Frauen innerhalb der IVF-Therapie gewonnen wurden, ergaben sich für die basale sowie

die gonadotropinstimulierte Steroidbiosynthese neben stimulatorischen und inhibitorischen

auch keinerlei Effekte nach GnRH-Agonisten-Applikation. Eine französische

Arbeitsgruppe belegte die dosisabhängige Wirkung des Agonisten Buserelin auf die

Sexualsteroidsynthese kultivierter präovulatorischer Granulosazellen. Die Zugabe von

Buserelin in der Konzentration 1 ng/ml in das Kulturmedium hatte einen Anstieg der

Östradiol- und Progesteronsekretion zur Folge. Dagegen war ein vergleichbarer Effekt bei

höheren Konzentrationen nicht mehr nachweisbar (Parinaud et al., 1988). Guerrero et al.

fanden 1993 eine gesteigerte Progesteronproduktion nach agonistischer in vitro-

Stimulation, die Östradiolsynthese aber zeigte sich vermindert. Dieselbe Gruppe beschrieb

eine verminderte Progesteronproduktion bei in vivo agonistisch vorbehandelten Corpus

64

luteum-Zellen von Ratten sowie eine Verringerung der lutealen LH-Rezeptorzahl nach 48-

stündiger Inkubationszeit in Anwesenheit des Agonisten. Diese inhibitorischen Wirkungen

könnten eine Erklärung für den relativ hohen Verbrauch an Gonadotropinen zur Erzeugung

der kontrollierten ovariellen Hyperstimulation sein (Guerreo et al., 1993). Eine andere

Studie wies eine direkte Inhibition der ovariellen Steroidbiosynthese durch GnRH-

Agonisten sowohl im in vitro-Modell als auch unter in vivo Bedingungen nach (Uemura et

al., 1994). Im gleichen Jahr beschrieb Gaetje eine dosisabhängige Verminderung der

Progesteron- und Östradiolsekretion humaner Granulosaluteinzellen nach Addition von

GnRH oder eines GnRH-Agonisten in das Kulturmedium (Gaetje, 1994). Dagegen führte

der Einsatz des GnRH-Agonisten Leuprorelin an kultivierten humanen

Granulosaluteinzellen und Thekazellen in vitro weder zu einer Steigerung noch zu einer

Verminderung der Östradiol-und Progesteronwerte bzw. der Androstendionproduktion.

Allerdings reagierten die Zellen auf die Gabe von HCG mit einem deutlichen Anstieg

beider Sexualhormonspiegel (Frederick et al., 1991). Eine 1992 veröffentlichte Studie

vermutete sogar das völlige Fehlen von ovariellen GnRH-Rezeptoren, da die

Progesteronssynthese der kultivierten humanen Granulosazellen keine Unterschiede

aufwies, nachdem die Zellen neben GnRH auch FSH, LH und cAMP zur Stimulation

erhalten hatten (Torok et al., 1992). Interessanterweise scheinen die GnRH-Agonisten

Buserelin und Leuprorelin eine stimulierende Wirkung auf die ovarielle

Östradiolproduktion zu haben, wohingegen GnRH selbst sowie der GnRH Agonist

Triptorelin keinerlei aktive Rolle im Hinblick auf die Steroidbiosynthese erkennen lassen

(Bussenot et al., 1993).

Über die Wirkungsweise von GnRH-Antagonisten am menschliche Ovar gibt es bisher nur

sehr wenige Informationen. Neben den hier vorgetragenen Ergebnissen liegen wenige

Veröffentlichungen vor, die in ihren Beobachtungen differieren. In einer Studie, die dieser

Fragestellung nachging, wurden Granulosaluteinzellkulturen von Patientinnen angelegt,

welche mit dem Ziel einer kontrollierten ovariellen Hyperstimulation in vivo entweder den

GnRH-Agonisten Leuprorelin oder den Antagonisten Nal-Glu erhalten hatten. Die sich

anschließende Messung der Steroidsyntheseleistung ergab keine Unterschiede zwischen

beiden Zellgruppen für die basale Progesteronakkumulation und die Progesteronproduktion

nach Gonadotropinstimulation. Allerdings waren in der antagonistisch vorbehandelten

65

Zellgruppe signifikant niedrigere Östradiolwerte und eine geringere Aromatasaktivität

innerhalb der ersten 6 Stunden der Kulturzeit nachweisbar (Minaretzis et al., 1995).

Dagegen fanden Lin et al. 1999 in einer ähnlich angelegten Studie, wobei zur ovariellen

Stimulation der Agonist Buserelin und der Antagonist Cetrorelix verwendet worden waren,

keine Differenzen für die basale Progesteron- und Östradiolakkumulation nach 48-

stündiger Inkubationszeit. Allerdings fiel eine früher einsetzende Reaktion und eine stärker

ausgeprägte Ansprechbarkeit der antagonistisch vorbehandelten Granulosaluteinzellen auf

den Reiz der Gonadotropinstimulation auf, die eventuell mit der sehr viel kürzeren

Applikationsdauer des GnRH-Antagonisten in vivo zu erklären ist. Als mögliche Gründe

für die uneinheitlichen Ergebnisse beider Studien sind zum einen der Einsatz

unterschiedlicher GnRH-Analoga, zum anderen aber ebenso die verschiedenartigen

Gegebenheiten während der Kulturphase (Addition von Testosteron bzw. cAMP mit und

ohne HCG-Zusatz in das Kulturmedium durch Lin et al.) zu nennen. Ferner ist auch die

deutlich größere Fallzahl der neueren Studie zu berücksichtigen (25 Patientinnen vs. 12

Patientinnen in der ersten Untersuchung).

In einer aktuellen Studie wurden die Konzentrationen von Östradiol, Progesteron und

Testosteron in der Follikelflüssigkeit von Frauen gemessen, die im Rahmen der COH

entweder mit einem Agonisten oder dem GnRH-Antagonisten Cetrorelix vorbehandelt

wurden. Es fiel auf, daß die durchschnittliche Östradiolkonzentration der

Follikelflüssigkeit signifikant niedriger in der Gruppe der antagonistisch behandelten

Frauen war. Dieses Ergebnis korrelierte mit den durchschnittlich gemessenen

Serumöstradiolkonzentrationen in beiden Gruppen. Allerdings fanden sich keine

signifikanten Unterschiede für die Progesteron- und Testosteronkonzentrationen in der

Follikelflüssigkeit nach agonistischer und antagonistischer Behandlung. Des weiteren war

der Quotient aus Östradiol- und Testosteronkonzentration bei der antagonistisch

vorbehandelten Gruppe deutlich reduziert, dagegen ergaben sich für den

Progesteron/Testosteron-Quotienten und den Östradiol/Progesteron-Quotienten keine

signifikanten Unterschiede. Aufgrund ihrer Beobachtungen vermutete diese

Forschergruppe, daß die Behandlung mit GnRH-Antagonisten im Rahmen der COH einen

Effekt auf die follikuläre Steroidhormonproduktion haben könnte (Garcia-Velasco et al.,

2001).

In den hier dargelegten Untersuchungen hatte der verwendete Antagonist Ganirelix weder

nach in vivo- noch unter in vitro-Applikation einen Einfluß auf die basale und die HCG-

66

stimulierte Östradiol- bzw. Progesteronproduktion von humanen Granulosaluteinzellen.

Wenn also den bisherigen Studien zufolge GnRH als parakriner und autokriner Regulator

mit inhibitorischer Wirkung am Ovar fungiert, ist bei kultivierten Granulosaluteinzellen,

die von antagonistisch stimulierten Frauen stammen, in vitro ein Anstieg der

Steroidhormonproduktion zu erwarten. Die hier präsentierten Daten schließen diese

Reaktion nicht aus, das es durch die große Menge an exogen zugeführten Gonadotropinen

im Verlauf der COH zu einer Minderexpression der GnRH-Rezeptoren im Ovar kommen

könnte (Peng et al., 1994).

Andererseits muß man davon ausgehen, daß es nach 48-stündiger Inkubationszeit zu einer

Normalisierung der Rezeptorexpression gekommen ist. Um einen eventuell zu kurz

angelegten Beobachtungszeitraum ausschließen zu können, wurde die Inkubationszeit der

Granulosaluteinzellkulturen in den vorliegenden Untersuchungen auf 72 Stunden

ausgedehnt. Aber auch nach dieser Zeit zeigt der GnRH-Antagonist keinerlei Effekt auf die

Steroidbiosynthese. In humanen Granulosaluteinzellen, die bei IVF-Zyklen ohne HMG-

Stimulation gewonnen worden waren, wurde eine hohe Rezeptoraffinität für den

verwendeten GnRH-Agonisten Buserelin nachgewiesen. Ebenso konnte von derselben

Arbeitsgruppe gezeigt werden, daß ovarielle GnRH-Rezeptoren den GnRH-Antagonisten

Antide spezifisch binden (Brus et al., 1997). Da ein anderer GnRH-Antagonist an diese

GnRH-Rezeptoren binden konnte, bindet wahrscheinlich auch der hier verwendete

Antagonist Ganirelix. Wenn Granulosaluteinzellen GnRH-Rezeptoren exprimieren, so

müssen diese aber nicht ausschließlich über GnRH und seine Analoga die

Steroidbiosynthese steuern. Von Ovarial-und Endometriumkarzinomzellen ist bekannt, daß

eine Aktivierung ihrer GnRH-Rezeptoren durch GnRH oder -Analoga zur einer

Wachstumshemmung führt. Außerdem kommt es nach Aktivierung des GnRH-Rezeptor zu

einer Verminderung der Zellteilungsaktivität und nicht wie beim hypophysären Rezeptor

zu einer Induktion der Phospholipase C-abhängigen Signaltransduktionskaskade (Emons et

al., 1996 und 1997). Folglich schließt die fehlende Beeinflussung der ovariellen

Steroidbiosynthese durch Ganirelix in der vorliegenden Arbeit generelle Reaktionen im

Ovar auf GnRH-Antagonisten nicht aus.

Demnach sind weiterführende Untersuchungen nötig, um die Wirkungsweise der GnRH-

Antagonisten im Ovar vollständig aufklären zu können. Dies gilt besonders in der Frage

der Auswirkungen verschiedener Behandlungsprotokolle. Jedoch kann anhand der

67

Resultate im Rahmen der vorliegenden Arbeit, eine Beeinflussung der ovariellen

Steroidbiosynthese durch den GnRH-Antagonisten Ganirelix nicht nachgewiesen werden

(Weiss et al., 2001).

68

5.2 Wirkungen der GnRH-Analoga auf die cAMP-Produktion

Der intrazellulär agierende second messenger cAMP spielt eine zentrale Rolle innerhalb

der rezeptorgesteuerten Signaltransduktionswege im menschlichen Ovar (Leung und

Steele, 1992; Zeleznik, 2001). Er ist in seiner Funktion als Bindeglied zwischen einem

extrazellulären Stimulus und den daraus resultierenden intrazellulären

Regulationsmechanismen auch am Prozeß der Steroidbiosynthese im Ovar beteiligt

(Amsterdam et al., 1994; Mukherjee et al., 1996; Thomson, 1998; Conti, 2002). Folglich

standen im zweiten Teil dieser Studie die Auswirkungen der in vitro-Applikation von

GnRH-Analoga auf die cAMP-Produktion kultivierter humaner Granulosaluteinzellen im

Vordergrund.

Die im Anschluß an die Experimente mittels Radioimmunoassay durchgeführte

Bestimmung der zellulären cAMP-Produktion ergab für die basale cAMP-Bildung keine

signifikante Differenz zwischen der antagonistisch bzw. agonistisch behandelten Zell- und

der Kontrollgruppe. Nach sechsstündiger Gonadotropinstimulation zeigte sich ebenso kein

Effekt auf die cAMP-Produktion. Alle Zellen reagierten mit einer deutlichen Steigerung

der cAMP-Bildung auf das applizierte HCG, allerdings ließen die Gruppen untereinander

keine signifikanten Kontraste im Bezug auf die HCG-stimulierte cAMP-Bildung erkennen.

Die vorgenannten Ergebnisse machen zum einen deutlich, daß der GnRH-Antagonist

Ganirelix bei in vitro-Applikation keinen Effekt auf die basale cAMP-Bildung humaner

Granulosaluteinzellen ausübt. Zum anderen wird die HCG-stimulierte cAMP-

Akkumulation durch die Anwesenheit des Antagonisten ebenfalls nicht beeinflusst. Somit

ist davon auszugehen, daß der physiologische Ablauf der Signaltransduktion im Anschluß

an seine Aktivierung durch die Gonadotropine nicht durch die Anwesenheit von GnRH-

Analoga gestört wird. Bereits seit den frühen achtziger Jahren ist bekannt, daß die

Gonadotropine LH und FSH ihre regulatorischen Aufgaben im Ovar über eine Steuerung

der cAMP-assozierten Postrezeptormechanismen erreichen (Knecht et al., 1981; Nimrod,

1981). Daher wurden schon frühzeitig die Zusammenhänge zwischen Gonadotropinspiegel

und second messenger Akkumulation untersucht. Ein für diese Fragestellung besonders

geeignetes Modell stellt die Granulosazellkultur dar. Die unter relativ geringem Aufwand

verfügbaren Granulosazellen eignen sich besonders gut für die Erforschung des

Zusammenspiels der beteiligten Faktoren. In mehreren voneinander unabhängig

69

durchgeführten Studien wurden in Gegenwart von Gonadotropinen eine vermehrte second

messenger-Produktion und eine gesteigerte Steroidbiosynthese in Granulosazellen erfaßt.

Knecht et al. dokumentierten bereits 1981 in einer über 48 Stunden angelegten

Granulosazellkultur unter Zugabe von FSH eine deutlich gesteigerte cAMP- bzw. cGMP-

Akkumulation. Zugleich war die Progesteronproduktion der Zellen erhöht. Derselbe

gonadotropinassoziierte Effekt wurde in anderen Untersuchungen vergleichbaren Aufbaus

nachgewiesen (Nimrod, 1981; Ranta et al., 1982).

Parallel dazu stellte die Analyse der GnRH-spezifischen Wirkungen auf die ovarielle

Signaltransduktion einen weiteren Forschungsschwerpunkt dar. Die Ergebnisse aus

mehreren Studien legten die Vermutung nahe, daß GnRH durch eine Suppression der

gonadotropinvermittelten cAMP-Bildung die Steroidbiosynthese in den Granulosazellen

hemmen könnte. In Experimenten ergab sich sowohl für kultivierte Granulosazellen vom

Schwein als auch für Granulosazellen der Ratte eine Verminderung der

gonadotropinvermittelten cAMP-Akkumulation, nachdem den Kulturen GnRH oder ein

GnRH-Agonist zugegeben worden war. Der hemmende Effekt erstreckte sich ebenso auf

den Bereich der Steroidbiosynthese (Knecht et al., 1981; Ranta et al., 1983). In einer

Rattengranulosazellkultur hatte die in vitro-Applikation eines GnRH-Agonisten eine

Hemmung der Adenylatcyclaseaktivität und eine verstärkte Mobilisierung von

Phosphodiesterasen zur Folge. Der antigonadale Effekt des GnRH bzw. der GnRH-

Agonisten scheint somit auf der additiven Wirkung aus einer verminderten Bildungsrate

und einem gleichzeitig forciertem Abbau von cAMP zu beruhen (Knecht und Catt, 1981).

Ranta et al. testeten den in vivo-Effekt eines GnRH-Agonisten an Granulosazellen, die

zuvor hypophysektomierten Ratten entnommen worden waren. Sie entdeckten, daß die

Fähigkeit des Agonisten zur Inhibition der Adenylatcyclase im Zusammenhang mit einem

Verlust spezifischer FSH-Bindungsstellen stand (Ranta et al., 1983).

Im Bezug auf die Aktivierung ovarieller Postrezeptormechanismen unterscheidet sich

GnRH jedoch von den Gonadotropinen, deren Bindung an den Granulosazellrezeptor mit

der Aktivierung der Proteinkinase A und damit dem second messenger cAMP assoziiert

ist. Demgegenüber ist GnRH in der Lage, mehrere unterschiedliche

Signaltransduktionskaskaden zu aktivieren. Neben einer Stimulierung der Proteinkinase C-

abhängigen Enzyminduktion in Rattengranulosazellen (Naor und Yavin, 1982; Wang et al.,

70

1992) führte die Aktivierung des GnRH-Rezeptors in humanen Granulosazellen auch zu

einem erhöhten Ca2+

-Einstrom in die Zelle (Hori et al., 1998). Bei vergleichenden

Experimenten fielen nach in vitro-Stimulation mit einem GnRH-Analogon bzw. nach LH-

Applikation unterschiedliche Reaktionen kultivierter Ratten-Granulosazellen auf. Im

Anschluß an eine GnRH-Stimulation der Zellen konnte keine Veränderungen der cAMP-

Bildungsrate entdeckt werden (Hillensjo und LeMaire, 1980). Daher wurde angenommen,

daß das Gonadotropin-Releasing Hormon und seine Analoga ähnliche Reaktionen wie

Gonadotropine während der ovariellen Follikulogenese hervorrufen können, zur

Durchführung ihre Aufgaben jedoch unterschiedliche Mediatoren nutzen (Dekel et al.,

1985).

Allerdings ist in einer neueren Studie auf bestimmte posttranslationale Modifikationen bei

extrahypophysären GnRH-Rezeptoren hingewiesen worden. So führte in einigen Ovarial-

und Endometriumkarzinom-Zellreihen die Aktivierung des GnRH-Rezeptors nicht wie

beim hypophysären GnRH-Rezeptor zur Hydrolyse von Phosphoinositoltrisphosphat durch

die Phospholipase C (Emons et al., 1997). Aufgrund dieser Beobachtungen ist davon

auszugehen, daß auch im menschlichen Ovar alternative Funktionsformen des GnRH-

Rezeptors vorkommen könnten. Eine direkte Wirkung von GnRH bzw. GnRH-Agonisten

auf die Produktion des second messenger cAMP war dagegen bereits in früheren Studien

aufgefallen. In kultivierten Granulosazellen der Ratte führte die Applikation von GnRH

oder einem -Agonisten zu verringerten cAMP-Spiegeln, wofür einerseits eine verringerte

Adenylatcyclaseaktivität, andererseits ein verstärkter Abbau von cAMP verantwortlich

waren. Somit erklärt sich der in vitro nachweisbare antigonadale Effekt von GnRH und -

Analoga in Granulosazellen durch eine verminderte Reaktion des cAMP auf den

gonadotropinvermittelten Stimulus (Knecht et al., 1981; Knecht und Catt, 1981).

Um noch genauere Aussagen über die Funktionsmechanismen von GnRH und analogen

Substanzen innerhalb der intrazellulären Befehlsübermittlung im menschlichen Ovar

treffen zu können, müsen jedoch weitere Untersuchungen abgewartet werden. Deshalb ist

es wichtig festzuhalten, daß auf dem Boden der aktuellen Experimente dieser Arbeit kein

Anhalt für eine Beeinflussung der cAMP-Produktion humaner Granulosaluteinzellen durch

GnRH-Agonisten oder -Antagonisten besteht. Weder der hier verwendete GnRH-

Antagonist Ganirelix noch der GnRH-Agonist Triptorelin waren nach in vitro-Gabe in der

71

Lage, auf die basale oder HCG-stimulierte cAMP-Akkumulation humaner

Granulosaluteinzellen in signifikanter Weise einzuwirken (Demirel et al., 2000). Damit

konnte ebenfalls gezeigt werden, daß die gonadotropinabhängige Induktion der

intrazellulären Signaltransduktionskette weder durch agonistische noch durch

antagonistische Stimulation der Zellen gestört wird.

72

6 Zusammenfassung

GnRH-Agonisten werden seit vielen Jahren im klinischen Alltag eingesetzt. Im Bereich der

Sterilitätsbehandlung nutzt man ihre Fähigkeit, die endogene Gonadotropinsekretion zu

supprimieren, zur Durchführung der In-Vitro-Fertilisationstherapie. In klinischen Studien

konnte gezeigt werden, daß GnRH-Antagonisten ebenfalls in der Lage sind, den

unerwünschten frühzeitig einsetzenden LH-Anstieg im Rahmen der kontrollierten

ovariellen Hyperstimulation zu vermeiden.

Da neben den GnRH-spezifischen Rezeptoren der Adenohypophyse auch GnRH-

Rezeptoren im Ovar vorhanden sind, geht diese Arbeit der Frage nach, ob der GnRH-

Antagonist Ganirelix Einfluß auf die Steroidbiosynthese humaner Granulosaluteinzellen

hat. Aufgrund der besonderen Bedeutung des second messenger cAMP innerhalb der

Signaltransduktionswege der Granulosazellen wurde im weiteren auch die Wirkungen von

Ganirelix und eines GnRH-Agonisten auf die cAMP-Produktion humaner

Granulosaluteinzellen untersucht. Die kultivierten Granulosaluteinzellen stammten von

Patientinnen, die im Rahmen einer kontrollierten ovariellen Überstimulation entweder den

Antagonisten Ganirelix oder den Agonisten Triptorelin erhalten hatten. Neben der basalen

wurde auch die gonadotropinstimulierte Östradiol-und Progesteronbildung bestimmt. Es

zeigte sich, daß die antagonistisch vorbehandelten Zellen keinen Unterschied im Bezug auf

die Steroidsyntheserate zur Kontrollgruppe aufwiesen. Dies galt für die unstimulierte wie

auch für die Hormonproduktion nach Gonadotropinstimulation. Um eine eventuell zu

geringe Konzentration der Substanzen in der Kultur ausschließen zu können, wurde in

weiteren Versuchen das Verhalten der Zellen nach direkter Applikation der GnRH-

Analoga in das Kulturmedium getestet. Auch hier konnten keinerlei Anhaltspunkte für eine

Einflußnahme des GnRH-Antagonisten Ganirelix auf die Steroidbiosynthese gefunden

werden.

Für die Experimente zur Untersuchung der cAMP-Produktion wurden

Granulosaluteinzellen von Frauen gesammelt, welche alle in vivo mit dem Agonisten

Triptorelin stimuliert worden waren. Die kultivierten Zellen erhielten entweder Ganirelix

oder Triptorelin im Medium oder nur das Kulturmedium. Des weiteren wurde die Hälfte

der Zellen einer Gonadotropinstimulation unterzogen. Die im Anschluß an die

73

Inkubationszeit durchgeführte Messung der cAMP-Akkumulation ergab auch hier keine

signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen bezüglich der basalen cAMP-

Bildung und der cAMP-Produktion nach Gonadotropinstimulus.

Die aufgeführten Ergebnisse machen deutlich, daß der GnRH-Antagonist Ganirelix keinen

Einfluß auf die ovarielle Steroidbiosynthese hat. Ferner konnten keine Veränderungen der

intrazellulären Postrezeptormechanismen durch GnRH-Analoga Behandlung festgestellt

werden. Daher erscheint ein negativer Effekt des Antagonisten im Rahmen der IVF-

Therapie unwahrscheinlich.

74

7 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen

Abbildung 1: Die Hypothalamus-Hypophysen-Ovar Achse...............................................4

Abbildung 2: Sexualhormonspiegel im ovariellen Zyklus...................................................7

Abbildung 3: Die Zwei-Kompartiment-Theorie................................................................8

Abbildung 4: Aminosäuresequenz von GnRH.................................................................10

Abbildung 5: Struktur des humanen GnRH-Rezeptors....................................................12

Abbildung 6: Signaltransduktionswege am GnRH-Rezeptor...........................................16

Abbildung 7: Aminosäuresequenz von GnRH, Triptorelin und Ganirelix im

Vergleich.....27

Abbildung 8: Schema zur Signaltransduktionskaskade am GnRH-Rezeptor...............31-34

Abbildund 9: Das Lange Protokoll.................................................................................39

Abbildung 10: Das Lübecker Protokoll...........................................................................40

Abbildung 11: Aufbau Versuch A-in vivo-Modell...........................................................46

Abbildung 12: Aufbau Versuch A-in vitro-Modell..........................................................46

Abbildung 13: Aufbau Versuch B...................................................................................46

Abbildung 14: Effekte der in vivo-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die

basale und HCG-stimulierte Progesteronausschüttung kultivierter

humaner Granulosaluteinzellen..................................................................51

Abbildung 15: Effekte der in vivo-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die

basale und HCG-stimulierte Östradiolausschüttung kultivierter

humaner Granulosaluteinzellen..................................................................52

Abbildung 16: Effekte der in vitro-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die

basale und HCG-stimulierte Progesteronausschüttung kultivierter

humaner Granulosaluteinzellen..................................................................54

Abbildung 17: Effekte der in vitro-Behandlung mit Triptorelin und Ganirelix auf die

basale und HCG-stimulierte Östradiolausschüttung kultivierter

humaner Granulosaluteinzellen..................................................................55

Abbildung 18: Absolute cAMP-Produktion kultivierter humaner Granulosalutein-

zellen in 48 Stunden..................................................................................57

Abbildung 19: Basale cAMP-Produktion bzw. HCG-stimulierte cAMP-Produktion

über 6 Stunden..........................................................................................58

75

Tabelle 1: Meßbereiche und Variationskoeffizienten der Steroidassays............................47

Tabelle 2: Meßbereiche und Variationskoeffizienten des cAMP-

Radioimmunoassay........48

76

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8 Danksagung

Meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Olaf Ortmann danke ich sehr für die Vergabe der

Arbeit, die umfangreiche Anleitung und für eine konstante konstruktive Zusammenarbeit.

Dem Betreuer meiner Doktorarbeit, Herrn Dr. Jürgen Weiss, gilt mein besonderer Dank für

seine unermüdliche Unterstützung sowohl während der Durchführung des praktischen

Teils der Arbeit als auch während der Überarbeitung der schriftlichen Abfassung.

Ein großes Dankeschön auch an Frau Rita Sturm und Herrn Stephan Polack, die mich mit

großer Geduld und unermüdlichem Engagement in die Welt der wissenschaftlichen

Laborarbeit aufnahmen.

Auch danke ich meinem Mann Martin, ohne dessen technische und moralische

Unterstützung Fertigstellung und Layout der Arbeit nicht geglückt wären.

Vor allem aber möchte ich meinen Eltern danken, die mir durch ihre großzügige

Unterstützung mein Studium und diese Doktorarbeit ermöglicht haben.

96

10 Lebenslauf

Angaben zur Person

Name: Eva-Maria Gürke

Geburtstag: 11.10.1974

Geburtsort: Fulda

Schulbildung

08.1981-07.1985 Grundschule Maberzell

09.1985-06.1994 Domgymnasium Fulda

15.06.1994 Erlangung der Allgemeinen Hochschulreife

Studium

10.1994-09.1996 Vorklinisches Studium der Humanmedizin

Philippsuniversität Marburg

11.09.1996 Ärztliche Vorprüfung

10.1996-09.1997 Klinisches Studium der Humanmedizin

Philippsuniversität Marburg

28.08.1997 1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

10.1997-09.2000 Klinisches Studium

Medizinische Universität zu Lübeck

26.09.2000 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

04.1999-09.1999 Urlaubssemester nach Frühgeburt der Tochter

03.1998-03.2000 experimentelle Untersuchungen der Dissertation

12.02.2001 Beginn des Praktischen Jahres

Klinikum Fulda

15.01.2002 3.Abschnitt der ärztlichen Prüfung

ab 05/2002 Ärztin im Praktikum

Frauenklinik/Klinikum Fulda

Publikation Weiss JM, Oltmanns K, Gürke EM, Eick F,

Felberbaum R,Diedrich K, Ortmann O: Actions of

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