Efeitos da quitosana no controle de doenças pós colheita
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EFEITOS DE QUITOSANA NO CONTROLE DE
DOENÇAS PÓS COLHEITA E
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS EM FRUTOS DE
TOMATE
Ernane Nogueira Nunes
Mestrando em Agronomia – CCA-UFPB
Areia – PB
2012
EFFECTS OF CHITOSAN ON CONTROL OF
POSTHARVEST DISEASES AND
PHYSIOLOGICAL RESPONSES OF TOMATO FRUIT
AUTORES: Jia Liu, Shiping Tian, Xianghong Meng, Yong Xu;
PERIÓDICO: Postharvest Biology and Technology 44 (2007)300–306
Laboratory of Photosynthesis and Environmental MolecularPhysiology, Institute of Botany, Chinese Academy ofSciences, Nanxingcun 20, Xiangshan, Haidian, Beijing100093, China.
Areia – PB2012
INTRODUÇÃO
• Pós colheita: responsável por grandes perdas de frutase hortaliças (chegando até 40%);
• Fungicidas sintéticos:
▫ Ainda são as melhores alternativas;
▫ Preocupação internacional;
▫ Patógenos resistentes;
▫ Novas alternativas.
INTRODUÇÃO
• QUITOSANA (N-acetil-d-glucosamina):Polissacarídeo derivado da carapaça (quitina) decrustáceos;
• É natural, possui efeitos antifúngicos e estimulante derespostas de defesa nos vegetais (Terry e Joyce, 2004);
• Puccinia arachidis Speg. (Sathiyabama eBalasubramanian, 1998), Alternaria alternata (Fr.)Keissler (Reddy et al., 1998) e Aspergillus niger V.Tiegh. (Plascencia-Jatomea et al., 2003).
INTRODUÇÃO• Através de pesquisas anteriores sabe-se que a quitosana
aumentou a atividade da fenilalanina amônia liase (PAL) embagas de uva (Romanazzi et al, 2002); (BIOSSÍNTESE DEFLAVONOIDES E LIGNINA)
• Quitinase e 1,3-glucanase em laranjas, morangos eframboesas (Fajardo et al, 1998;. Zhang e Quantick, 1998);(ESTÍMULOS A DEFESA VEGETAL)
• Quitosana apresentou efeitos em B. cinerea e P. expansumem frutos de cereja doce e morango (Romanazzi et al., 2003) em cítros (Reddy et al., 2000);
• Estudos recentes indicam resistência dos fungos.
OBJETIVOInvestigar os efeitos da quitosana no controle do mofocinzento e mofo azul, causada por B. cinerea e P.expansum, em frutos de tomate armazenados adiferentes temperaturas e o desencadeamento demarcadores de defesa, incluindo polifenoloxidase(PPO), peroxidase (POD) e compostos fenólicos.
B. cinerea P. expansum
MATERIAL E MÉTODOS
• Os frutos de tomate (Lycopersicon esculentum Mill)foram colhidas no estádio vermelho maduro;
• Classificados com base no tamanho e na ausência delesões físicas ou doença de infecção;
• Antes dos tratamentos, os frutos foram desinfetadoscom hipoclorito de sódio a 2% durante 3min, e emseguida enxaguados com água corrente e secos aoambiente.
MATERIAL E MÉTODOS
• B. cinerea e P. expansum foram isolados a partir de frutos infectados de tomate e cultivados em BDA a 25◦C;
• Os esporos de ambos os agentes patogênicos foram removidos a partir de 2 semanas de idade e suspensas em 5ml de água destilada estéril contendo 0,05%(v/v) de Tween 80, como solubilizante;
• As suspensões foram filtradas através de quatro camadas de gaze estéril, de modo a aderir os micélios.
MATERIAL E MÉTODOS
• Quitosana com desacetilação de 90% e uma viscosidade de 15cP foi obtido a partir do OceanUniversity of China;
• Dissolvido em 2%(w/v) em HCl a 1% sob constante agitação;
• Depois diluiu-se a: 0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5% e 1%, com o valor do pH de cada solução ajustado para 5,4 com NaOH.
MATERIAL E MÉTODOS• Foram preparadas 50 placas de Petri para cada fungo (60
mm de diâmetro) com 10ml BDA e com os conídios a1×106spores/mL-1, que continham diferentesconcentrações (0%, 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,5% e 1%) dequitosana, com posterior incubação a 25◦C por 12h;
• Discos de micélio (5mm de diâmetro) a partir de 2semanas de idade, foram colocados no centro de placas dePetri (90 mm de diâmetro) com 20mL de BDA, contendodiferentes concentrações de quitosana emseguida, incubadas a 25 ◦C.
• O crescimento micelial foi determinado medindo odiâmetro das colónias 3 dias após a inoculação.
• Cada tratamento foi repetido três vezes e a experiência foirepetida duas vezes.
MATERIAL E MÉTODOS: Ensaio de
integridade da membrana plasmática dos
esporos▫ As amostras foram inoculadas em meio de cultura PDA
diluídas a 5×105spores/mL-1 e depois centrifugadas a 200rpm durante 10 min a 25◦C e lavadas duas vezes com tampão 5omM de fosfato de sódio (pH 7,0) para remover meio residual.
▫ As suspensões de conídios foram coradas com 10 µgml-1
de iodeto de propídio(PI), durante 5 min a 30 ◦ C.
MATERIAL E MÉTODOS: Efeitos da quitosana
nos frutos• De acordo com dados não mostrados foram escolhidas as concentrações de
0,5% e 1%;
• Os frutos foram feridos com o auxílio de um prego estéril (3mm de profundidade e 3mm de largura);
• TRATAMENTOS: 0,5% de quitosana (15µL), 1% de quitosana (15µL) e água destilalada (15µL) nos ferimentos;
• Depois 4 horas, 5µL de uma suspensão de esporos de B. cinerea e P. expansum a 5×103 spores/mL-1 foram adicionados a cada ferida;
• Os frutos tratados foram colocados em caixas estéreis para manter uma umidade relativa (cerca de 95%) e armazenados a 25◦C e 2◦C;
• Verificação da incidência de podridões: 3 e 21 dias após a inoculação;
• Tratamento: 3 repetições e o Experimento: 2 vezes.
MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do
PPO, POD e compostos fenólicos
• Frutos de tomate foram feridos e 15µL de 1% de quitosanaforam adicionados a cada ferida, com agua destilada adicionada servindo como controle;
• Após o tratamento, os frutos foram divididos aleatoriamente em dois lotes: 25◦C e 2◦C;
• Foram retiradas amostras de polpa em torno das feridas de 10 frutos a 0, 1, 2 e 3 dias a 25◦C e aos 0, 7, 14 e 21 a 2◦ C;
• Cada tratamento continha três repetições e a experiência foi repetida duas vezes.
• As amostras de tecido (2g) de cada tratamento foram homogeneizados com 10ml de 100 mM de solução tampão de fosfato de sódio (pH 6,4) contendo 0,2g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) e terra a 4◦C;
• O homogeneizado foi centrifugado a 15000 × g durante 30 min a 4◦C e o sobrenadante foi utilizado para o ensaio;
• Atividade PPO foi determinada através da adição de 0,1ml de enzima preparada em 3,0mL de substrato catecol(500mM, 100mM em tampão fosfato de sódio, (pH6.4) e o aumento da absorvância em 398nm foi verificada.
MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do
PPO, POD e compostos fenólicos
• A atividade de POD foi determinada utilizando guaiacol como substrato (Ippolito et al., 2000);
• A mistura de reação consistiu em 0,1ml de extrato bruto, 2mL de guaiacol (8mM, de sódio 100mM tampão de fosfato, pH 6,4), incubou-se durante 30 min a 30◦C;
• O aumento da absorvância a 460nm foi medida após a adição de 1mL H2O2 (24mM).
MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do
PPO, POD e compostos fenólicos
• 1g de polpa de cada 10 frutos foram homogeneizadascom 20mL de gelo á 1% de HCl metanol-solução e emseguida centrifugou-se a 15000 × g durante 15 min a4ºC.
• O sobrenadante foi recolhido e a absorbância foimedida a 280nm.
MATERIAL E MÉTODOS: Determinações do
PPO, POD e compostos fenólicos
MATERIAL E MÉTODOS: Análises estatísticas
• Todas as análises estatísticas foram realizadas com o SPSS11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).
• Os dados do ensaio de membrana de plasma integridadeforam comparados independente-amostras teste t.
• Demais análises foram analisadas através da ANOVA.
• Teste de médias realizadas através do teste de Duncan (P<0,05).
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
CONCLUSÕES• Os resultados evidenciaram que quitosana foi eficaz no
controle do mofo cinzento (B. cinerea) e mofo azul (P.expansum) em frutos de tomate armazenados a 25◦C e2◦C, indicando que a temperatura de armazenamento tevepouca influência sobre os efeitos de controle de quitosanaem doenças pós-colheita de frutos de tomate.
• Sendo o efeito da quitosana sobre mofo cinzento melhordo que no azul.
• Verificou-se que as atividades de PPO, POD e nível decompostos fenólicos em frutos tratados com quitosanaaumentaram significativamente a 25◦C e 2◦C, o queconfere propriedades de defesa.
• Quitosana tem potencial para substituir os fungicidassintéticos, mas muitos estudos ainda são necessários.
EFEITOS DE QUITOSANA NO CONTROLE DE
DOENÇAS PÓS COLHEITA E
RESPOSTAS FISIOLÓGICAS EM FRUTOS DE
TOMATE
Ernane Nogueira Nunes
Mestrando em Agronomia – CCA-UFPB
Areia – PB
2012