Efeito dos estímulos adrenérgico e colinérgico na produção ... - POLLYANNA... · Em 1984...
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INSTITUTO DE ENSINO E PESQUISA DA SANTA CASA DE BELO HORIZONTE Núcleo de Pós Graduação e Pesquisa
Efeito dos estímulos adrenérgico e colinérgico na produção de
espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e fagocitose por granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2
Pollyanna Stephanie Gomes
Belo Horizonte Fevereiro/2013
2
POLLYANNA STEPHANIE GOMES
Efeito dos estímulos adrenérgico e colinérgico na produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico e fagocitose por
granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2
Dissertação apresentada ao programa de Pós
Graduação em medicina e biomedicina do
Instituto de Ensino e Pesquisa da Santa Casa
de Belo Horizonte, como requisito parcial para
obtenção do título de mestre em biomedicina.
Orientador: Dr. José Augusto Nogueira
Machado
BELO HORIZONTE
Fevereiro/2013
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AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente ao prof. Dr. José Augusto por tudo que fez por mim,
pela orientação, disponibilidade, paciência e ensinamento. Por ter permitido extrair
seus conhecimentos e por me fazer ser uma profissional melhor!
As amigas queridas de laboratório Kelzinha, Nanda, Carol, Paulinha, Luh,
Elisa e Fabi, por todo apoio, conversas impagáveis e por toda amizade dedicada.
À todos dos laboratórios vizinhos pela disponibilidade, ajuda e empréstimo de
aparelhos.
Ás minhas amigas queridas Kelly e Raquel que mesmo com a distância fazem
parte da minha vida. Amo vocês!
Aos colegas da faculdade Pitágoras!
Aos professores da graduação que foram alicerces importantes na minha
jornada acadêmica. Em especial a profa. Christiane Contigli e ao Xavier Prous, que
foram extremamente importantes e decisivos pra que eu continuasse a minha
jornada.
Aos professores da Pós Graduação, pelos ensinamentos em todos os
momentos.
Às secretárias da Pós Graduação, Shirley, Zélia e Mariana pela colaboração e
paciência.
A todos os doadores de sangue, diabéticos e não diabéticos.
Aos participantes da banca examinadora, por aceitarem o convite e pela
dedicação.
Aos órgãos financiadores, CAPES, FAPEMIG e CNPq.
Aos familiares, pelo apoio e por todos os momentos de alegria.
À Deus por estar sempre ao meu lado, por me permitir enxergar o melhor lado
das coisas, por guiar meus passos, por permitir que eu seja um ser humano melhor
a cada dia e não fazer com que eu perca a fé...
Obrigada!
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“Eu sou é eu mesmo.
Divêrjo de todo o mundo.
Eu quase que nada sei.
Mas desconfio de muita coisa...”
Guimarães Rosa “Grande Sertão: Veredas”
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RESUMO
No presente trabalho avaliamos o efeito da catecolamina (adrenalina),
neurotransmissor (acetilcolina) e de nucleotídeos cíclicos (AMPc e GMPc) em
granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2 (DM2) e seus controles não diabéticos
(ND). Estudou-se as respostas oxidante (ROS e RNS), antioxidante redutora
(redução de MTT) e fagocitose de partículas opsonizadas. A produção de ROS foi
avaliada pelo teste de quimiluminescência, a dosagem de óxido nítrico foi
mensurada pela reação de Griess e o potencial redutor (antioxidante) foi avaliado
pela técnica da redução do sal tetrazólio MTT. Nossos resultados demonstraram que
na presença de adrenalina, houve interferência na função de granulócitos, inibindo a
produção de ROS, tanto nas células em repouso quanto durante processo fagocítico
(modulação negativa da fagocitose). Estes resultados foram similares tanto em DM2,
quanto em ND. Ao contrário, a carbamilcolina (acetilcolina) não teve efeito
significativo na produção de ROS ou fagocitose em ND (p>0,05), mas ativou
significativamente ambos os processos em granulócitos de DM2 (p<0,05). Para
avaliar o efeito da ativação adrenérgica e colinérgica, testamos os segundos
mensageiros (nucleotídeos cíclicos AMP e GMP) como efetores prontos por serem
mediadores intracelulares das respostas adrenérgica e colinérgica, respectivamente,
devido à ativação adrenérgica pela adrenalina ou colinérgica pela acetilcolina. Os
resultados com AMPc e GMPc não mimetizaram os dados previamente obtidos com
adrenalina e acetilcolina. Nestes experimentos observamos que AMPc ativa
granulócitos de DM2, ao contrário da adrenalina e que o GMPc ativou tanto DM2
quanto ND. Desta forma podemos concluir com os nossos resultados, que ativação
adrenérgica ou colinérgica pode interferir com a resposta imune inata e que
granulócitos de DM2 apresentam respostas distintas em relação a indivíduos
saudáveis, possivelmente como resultado de adaptação de sinalização metabólica
induzida pela hiperglicemia.
Palavras Chave: Adrenalina, carbamilcolina, diabetes tipo 2, granulócitos, óxido
nítrico, nucleotídeos cíclicos e fagocitose.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Vias de modulação neural da inflamação.
Figura 2: Espécies reativas de nitrogênio.
Figura 3: Representação esquemática do sistema NADPH oxidase.
Figura 4: Curva dose-resposta adrenalina.
Figura 5: Curva dose-resposta carbamilcolina.
Figura 6: Avaliação da produção de ROS em granulócitos em meio contendo
Adrenalina 1000nM.
Figura 7: Avaliação da produção de ROS em granulócitos em meio contendo
Carbamilcolina 1000nM.
Figura 8: Avaliação da produção de ROS expresso em mediana por granulócitos em
meio contendo Adrenalina 1000nM e AMPc 10-4.
Figura 9: Avaliação da produção de ROS em granulócitos em meio contendo
Carbamilcolina 1000nM e GMPc 10-4.
Figura 10: Produção de óxido nítrico.
Figura 11: Avaliação da capacidade redutora por granulócitos de DM2 e ND sob
estímulo adrenérgico e ZC3b.
Figura 12: Avaliação da capacidade redutora por granulócitos de DM2 e ND sob
estímulo colinérgico e ZC3b.
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio.
Tabela 2: Características clínicas e bioquímicas da população em estudo.
Tabela 3: Efeito do estímulo adrenérgico e colinérgico em granulócitos não ativados
de DM2.
Tabela 4: Produção de ROS e RNS por granulócitos de ND e DM2. Índice de
predisposição inflamatória.
8
LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1: Interação entre os sistemas nervoso, imune e endócrino.
Esquema 2: Obtenção de granulócitos.
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LISTA DE ABREVIATURAS
ADA: American Diabetes Association
AC: adenilato ciclase
ADRE: Adrenalina
AMPc: 3’:5’- adenosina monofosfato cíclico
CARB: Carbamilcolina
CEPCEM : Centro de Estudos e Pesquisas em Endocrinologia e Metabologia
DM2: diabetes tipo 2
EP: erro padrão
GMPc: 3’:5’- guanosina monofosfato cíclico
HbA1c (%): hemoglobina glicada
IMC: índice de massa corpórea
Kg/m2: kilogramas por metro quadrado
KH2PO4 = fosfato de potássio monobásico
mg/dL: miligramas/decilitro
MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difenil-tetrazolium
n = número de amostras
Na2HPO4 = fosfato de sódio bibásico anidro
NaCl = cloreto de sódio
NADPH: nicotamida adenina dinucleotídeo fosfato
ND: Não diabético
NOS: óxido nítrico sintase
NS: não significativo
PBS: tampão fosfato salino
PKC: proteína cinase C
PLC: Fosfolipase C
RNS: espécies reativas de nitrogênio
ROS: espécies reativas de oxigênio
SNA: Sistema Nervoso Autônomo
SC-BH: Santa Casa de Belo Horizonte
SI: Sistema Imune
SN: Sistema Nervoso
SNC: Sistema Nervoso Central
10
ZC3b: Zymosan opsonizado com fragmentos C3b
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 12
1.1 A Cooperação Sistema Nervoso – Sistema Imune: Hipóteses e Evidências12
1.2 Mediadores Neuroimunes ............................................................................ 15
1.2.1 Catecolaminas .............................................................................................. 15
1.2.2 Nucleotídeo cíclico - AMPc: 3’:5’- adenosina monofosfato cíclico ................ 16
1.2.3 Neurotransmissor Colinérgico (Acetilcolina) ................................................. 16
1.2.4 Nucleotídeo cíclico - GMPc: 3’:5’- guanosina monofosfato cíclico ................ 17
1.3 Diabetes e o estresse oxidativo ................................................................... 17
2 JUSTIFICATIVA............................................................................................ 21
3 OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 22
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 22
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 23
4.1 Pacientes ..................................................................................................... 23
4.2 Coleta de sangue ......................................................................................... 23
4.2.1 Obtenção de granulócitos ............................................................................. 24
4.2.2 Teste de viabilidade celular: incorporação de Azul de Trypan ...................... 25
4.3 Ensaio de quimiluminescência dependente de luminol: Quantificação das espécies reativas de oxigênio (ROS) ........................................................................ 25
4.4 Reagentes e soluções .................................................................................. 26
4.5 Produção de Óxido nítrico ............................................................................ 27
4.6 Opsonização de Zymosan ............................................................................ 28
4.7 Redução do sal tretrazólio (MTT) ................................................................. 28
4.8 Análise Estatística ........................................................................................ 30
5 RESULTADOS ............................................................................................. 31
6 DISCUSSÃO ................................................................................................ 42
7 CONCLUSÃO ............................................................................................... 48
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 49
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 A Cooperação Sistema Nervoso – Sistema Imune: Hipóteses e Evidências
Os sistemas imune e nervoso fornecem ferramentas de forma coordenada e
independente no controle dos processos biológicos [1]. Ambos os sistemas atuam
modulando-se entre si apontando uma via de mão dupla através do reconhecimento
de efetores celulares como citocinas, neurotransmissores e hormônios que podem
ser detectados tanto por células do sistema imune quanto do sistema nervoso [2].
Hans Selye, em 1936 foi o primeiro autor a descrever a cooperação entre os
sistemas nervoso e imune ao abordar o estresse em condições clínicas e associado
pela influência do meio. O seu trabalho ficou conhecido como Síndrome Geral de
Adaptação em três fases. Em seus experimentos ele demonstrou o aumento da
incidência de doenças como úlcera péptica, hipertensão arterial, artrites e lesões
miocárdicas em animais estressados após períodos de mudança de vida drástica [3].
Esses resultados sugeriram a existência de interrelação entre o sistema imune e o
sistema nervoso [4-6].
Nas décadas de 1970 a 1990 foram realizados inúmeros experimentos
laboratoriais para comprovar a comunicação entre o sistema imune e o sistema
nervoso central. Dentre os experimentos, naqueles que realizaram o bloqueio de
algum componente do sistema nervoso, foi demonstrado relação direta com o
sistema imune. A ablação do hipotálamo dorsal suprimiu a produção de anticorpos.
Observou-se ainda que a retirada ou o bloqueio farmacológico da hipófise impediu a
resposta imunológica em animais [5, 7-8]. Em 1984 Blalock [9] referiu-se ao sistema
imunológico como o sexto sentido orgânico, responsável por unir as informações do
ambiente com os cinco sentidos do cérebro.
Estudos demonstraram que a resposta imune frente ao estresse emocional
também envolve participação do sistema endócrino, dessa forma a resposta ocorre
pela ação conjunta entre os sistemas imune, nervoso e endócrino [10-11]. A
intensidade ou duração desse estresse pode originar doenças atreladas a algum
desses sistemas [12]. Para que a relação entre os sistemas nervoso, imunológico e
endócrino exista é necessário considerar fatores como [13]:
13
Expressão de receptores nas células imunes, endócrinas e neuronais
capazes de reconhecerem citocinas, hormônios e neurotransmissores
Efetores imunes e neuroendócrinos coexistindo em tecidos linfóides, neurais e
endócrinos
Mediadores endócrinos e neurais capazes de estimular o sistema imune
Mediadores imunes capazes de estimular estruturas endócrinas e neurais [14].
Um exemplo de como estas interações podem acontecer são expressas no
esquema 1.
Esquema 1: Interação entre os sistemas nervoso, imune e endócrino (Alves, G.J & Parlemo-Neto,
J.2007)
Onde neste esquema demonstra-se bem que, em decorrência de um estímulo
qualquer será captado pelo sistema nervoso central e, este por sua vez induz
através de neuropeptídeos e neurotransmissores, ativar sistema endócrino e imune
à liberar hormônios e citocinas que vão atuar tanto em seus próprios sistemas
quanto em outros. Demonstrando uma rede de comunicação de mão dupla.
14
O sistema nervoso se divide anatomicamente em sistema nervoso central (SNC)
e sistema nervoso periférico. Funcionalmente o sistema nervoso periférico é dividido
em somático e autônomo (SNA).
O SNA regula as atividades fisiológicas involuntárias dos mamíferos e é
subdivido em sistema nervoso simpático (SNS) e parassimpático (SNP) [14]. Os
sistemas simpático e parassimpático atuam em oposição para a homeostase
fisiológica através da interação com o cérebro primitivo, incluindo o sistema límbico
(importante na função da memória), o tronco cerebral e o hipotálamo [15]. Estudos
têm demonstrado que o SNA conecta o sistema imune com outros órgãos e
orquestra a resposta imunológica de acordo com as necessidades fisiológicas,
regulando a resposta inflamatória [16].
A interação entre o sistema nervoso e o sistema imune ocorre pela atuação de
efetores, como neurotransmissores, hormônios e outros efetores solúveis, que são
liberados por um desses sistemas e atuam no outro sistema [1]. As catecolaminas e
as citocinas são importantes efetores desses sistemas. A hipófise controla a
produção das catecolaminas, sendo capaz de sintetizar, liberar e induzir sua
produção através da glândula supra-renal. As citocinas são efetores característicos
das células do sistema imune e medeiam os processos inflamatórios [17].
Estudos demonstraram que o SNA foi capaz de regular algumas funções de
células do sistema imune, como os leucócitos, através da liberação de sinais que
ativaram o hipotálamo e as glândulas pituitária e adrenal (eixo HPA) [14, 16, 18]. A
ativação do eixo HPA induz a liberação de efetores, como a adrenalina, pelo SNS
(via adrenérgica), e a acetilcolina, pelo SNS (via colinérgica), que ao interagirem
com seus receptores levam a modulação do SI.
A figura 1 ilustra a cooperação entre o sistema nervoso e imune.
15
Figura 1: Vias de modulação neural da inflamação (MATTHAY, 2004).
1.2 Mediadores Neuroimunes
1.2.1 Catecolaminas
As catecolaminas são moléculas derivadas do aminoácido tirosina, as principais
catecolaminas são: adrenalina, noradrenalina e dopamina [15, 19]. Estas moléculas
são liberadas no organismo após momentos de estresse pelas fibras simpáticas pós-
ganglionares e pela medula da adrenal. As catecolaminas são capazes de mediar
respostas celulares por interação com seus receptores específicos, os
adrenoreceptores, que pertencem à superfamília de receptores acoplados à proteína
G [20]. Os receptores adrenérgicos são divididos em α (1,2) e β (1,2,3) apresentam
diferentes afinidades. Existem três subtipos de α 1 (A,B,D) e três de α 2 (A,B,C) [21].
A estimulação de α receptores ativam a cascata da fosfolipase C, (PLC) levando
a produção de diacilglicerol (DAG) e trifosfato de inositol (IP3) [22].
Os β receptores ativam a via adenilato ciclase promovendo aumento dos níveis
intracelulares de adenosina monofasto cíclico (AMPc), importante regulador de
funções intracelulares [23].
16
As catecolaminas funcionam como agentes moduladores do sistema imune [15],
alterando o número e função de leucócitos. O receptor adrenérgico β2, presente em
quase todos os tipos de células imunes, é o receptor mais importante do sistema
imune.
1.2.2 Nucleotídeo cíclico - AMPc: 3’:5’- adenosina monofosfato cíclico
Adenosina monofosfato cíclico (AMPc) é um tipo de nucleotídeo cíclico. Os
nucleotídeos cíclicos são segundos mensageiros que exercem diversas funções nos
mecanismos fisiológicos [24-25]. O AMPc é sintetizado pela enzima adenilato ciclase
(AC) a partir do ATP, após ativação do receptor β pela adrenalina [26].
O aumento intracelular de AMPc está associado com diversas funções
fisiológicas como a redução da liberação de histaminas e leucotrienos de mastócitos,
liberação de espécies reativas de oxigênio (ROS), regulação de diversas citocinas,
[27] óxido nítrico por macrófagos, [28] regulação de diferentes processos biológicos
como, mecanismos metabólicos, proliferação, apoptose, diferenciação, migração,
desenvolvimento, transporte iônico, regulação de pH e expressão gênica [52].
1.2.3 Neurotransmissor Colinérgico (Acetilcolina)
Na via parassimpática a comunicação é mediada principalmente pela acetilcolina.
A acetilcolina é sintetizada no interior das terminações nervosas a partir do precursor
colina [29].
A Acetilcolina é capaz de mediar respostas celulares por interação com os
receptores nicotínicos e muscarínicos acoplados à proteína G. Os receptores
nicotínicos são ionotrópicos [30], ou seja, são influenciados pelos canais iônicos, e os
receptores muscarínicos são da classe dos metabotrópicos e não dependem de íons
[31].
A estimulação desses receptores ativa a via guanilato ciclase promovendo
aumento dos níveis intracelulares de guanosina monofasto cíclico (GMPc),
importante regulador de funções intracelulares [32].
17
1.2.4 Nucleotídeo cíclico - GMPc: 3’:5’- guanosina monofosfato cíclico
Guanosina monosfosfato cíclico(GMPc), assim como o AMPc, é um nucleotídeo
cíclico. A produção de GMPc acontece a partir do sistema enzimático das guanilato
ciclases e fosfodiesterases (PDEs) que convertem o GTP citosólico em GMP em
resposta a diferentes sinais, tais como o óxido nítrico (NO), alguns peptídeos e
também devido ao fluxo intracelular de cálcio [33]. O sistema guanilato ciclase está
presente em células do sistema imune, tais macrófagos, neutrófilos e linfócitos [32].
A literatura tem demonstrado a existência de um balanço entre os nucleotídeos
cíclicos, sendo que o aumento de um pode resultar na redução do outro. Esse
balanço permite a hipótese de que AMPc e GMPc podem exercer atividades
regulatórias opostas sobre determinadas funções celulares [34-35].
Esses mediadores metabólicos têm função definida em células do sistema
nervoso, entretanto, pouco se conhece sobre a ação colinérgica ou adrenérgica
sobre células da imunidade inata.
A interação entre os sistemas imune e nervoso tem sido amplamente estudada
em diferentes patologias, principalmente aquelas de caráter inflamatório. Autores
demonstraram essa interação na depressão melancólica e na hipercortisolemia.
Nessas patologias, o aumento de hormônios do estresse levam o indivíduo à
imunossupressão, predispondo-o à infecções [13, 36]. Além disso, outros estudos
demonstraram essa interação no Lupus Eritromatoso, na asma e em úlceras [36].
Com bases nesses relatos e nas informações sobre os mediadores da
interação entre os sistemas, resolvemos estudar a ação colinérgica e adrenérgica
em células do sistema imune de pacientes diabéticos.
1.3 Diabetes e o estresse oxidativo
O Diabetes mellitus é uma doença metabólica caracterizada pela hiperglicemia
associada à ativação do sistema imune, anormalidades funcionais das células,
alterações metabólicas e inflamação [37-38]. Por consequência tem sido considerado
18
como uma patologia inflamatória [39]. Por ter caráter inflamatório, é possível supor
que esta patologia sofra regulação endócrina, imunológica e do sistema nervoso.
O diabetes tipo 2 é uma doença grave a nível mundial com características
multifatoriais resultando de fatores ambientais e genéticos; que tem principal
característica a hiperglicemia induzida pela deficiência na secreção e/ou ação da
insulina [40-41].
Estudos demonstram que a hiperglicemia é a base de muitas complicações
do diabetes, como nefropatia, neuropatia e retinopatia. A hiperglicemia altera
diferentes vias de sinalização celulares, como a alteração da produção de espécies
reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS) que parecem ter papel crucial no
desenvolvimento e progressão das complicações [42-43].
Tabela 1: Espécies reativas de oxigênio e nitrogênio.
Espécies Reativas de Oxigênio (ROS)
Radicais Não radicais
Superóxido O-2 Peróxido de hidrogênio H2O2
Hidroxila OH. Ácido hipocloroso HClO
Peroxila LO.2 Ozônio O3
Alkoxila LO. Oxigênio “singlet”
Hidroxiperoxila HO.2 Peróxidos lipídicos
Espécies Reativas de Nitrogênio (RNS)
Óxido nítrico NO. Ácido nitroso HNO2
Dióxido nítrico NO2. Trióxido de nitrogênio N2O3
Tetróxido de nitrogênio N2O4
Peroxinitrito ONOO-
Alkil peroxinitritos LOONO
As fontes celulares de geração de ROS são a mitocôndria e o complexo
enzimático NADPH oxidase. O complexo enzimático NADPH oxidase é a principal
fonte de ROS em células fagocíticas e é formado por subunidades que estão
19
localizadas tanto na membrana celular, como a gp91phox e p22phox, quanto no
citosol, p47phox e p67phox (figura 3).
Sob estimulação, a sub-unidade citosólica p47phox é fosforilada e todo o
complexo citosólico é translocado para a membrana formando a oxidase ativa para a
produção de ROS [44].
No diabetes, a hiperglicemia aumenta os níveis de diacilglicerol (DAG) que
ativam a PKC e, consequentemente, ativam o complexo NADPH oxidase [45-46].
O excesso de ROS e a hiperglicemia alteram moléculas biológicas
importantes tais como lipídeos, proteínas e DNA, modificando suas funções [47].
Além do aumento da produção de ROS pela NADPH oxidase, estudos
demonstram que o processo de fagocitose, principal evento celular da imunidade
inata, também está alterado em pacientes diabéticos devido ao estado
hiperglicêmico [42-43].
A fagocitose é caracterizada pelo englobamento de partículas e
microrganismos que são digeridos pela liberação de enzimas hidrolíticas, produção
de espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS) conforme exemplificado
na tabela 1 [48].
A alteração da fagocitose, assim como a ativação da NADPH oxidase,
aumenta a produção de espécies oxidantes, como demonstrado nas figuras 2 e 3. O
aumento destas espécies caracteriza o estresse oxidativo, condição causada pelo
aumento das espécies oxidantes, sem o aumento equivalente na resposta
antioxidante neutralizadora. O estresse oxidativo é um dos principais fatores
relacionados à patogênese do diabetes, gerando danos endoteliais e teciduais que
levam às complicações macro e microvasculares, além de danos há algumas
moléculas como, DNA e lipídios conforme mostrado na figura 2. O estudo do
balanço entre as respostas oxidante e redutora é importante para o entendimento
sobre a patofisiologia do diabetes.
Desta forma, pretendemos avaliar se a sensibilidade ou reatividade de células
do sistema imune de pacientes diabéticos frente a estímulos adrenérgicos ou
colinérgicos poderia estar alterada devido à hiperglicemia crônica.
A hiperglicemia do diabetes pode ser considerada como indutor de ativação
metabólica, dessa forma, é possível levantar a hipótese que as células de pacientes
diabéticos respondam aos estímulos adrenérgico/colinérgico de forma diferente das
células oriundas de doadores não diabéticos.
20
Com estas informações sobre o eixo neuroimune-endócrino e sobre a
produção de espécies oxidantes, resolvemos avaliar se a sensibilidade ou
reatividade de células do sistema imune de pacientes diabéticos frente a estímulos
adrenérgicos ou colinérgicos poderia estar alterada devido à hiperglicemia crônica.
Figura 2. Representação dos efeitos de espécies reativas de nitrogênio em macromoléculas.
Figura 3: Representação esquemática do sistema NADPH oxidase. Adaptado [37]
.
21
2 JUSTIFICATIVA
O diabetes mellitus é uma doença inflamatória sujeita à ação de diferentes
efetores solúveis (citocinas, neurotransmissores, neuro-hormônios). Isso sugere que
o eixo neuro-imune tenha participação na patogênese desta patologia. Por isso o
estudo do efeito de catecolaminas e acetilcolina pode fornecer subsídios importantes
sobre os mecanismos moleculares envolvidos no diabetes tipo 2. Neste estudo
avaliamos a ação dos efetores adrenalina e acetilcolina na produção e modulação
de mediadores inflamatórios, tais como: ROS e NO em granulócitos além de avaliar
o balanço oxidante/redutor; bem como a capacidade fagocítica que será avaliada
com Zymosan contendo partículas opsonizadas pelo sistema completo, pelo
fragmento C3b. Onde pretendemos através dos ensaios realizados dar suporte as
afirmações que apontam que sistema nervoso e sistema imune atuem em via de
mão dupla bem como sofrendo influencias mutuas, como em patologias como no
caso do diabetes do tipo2.
22
3 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito da estimulação adrenérgica e colinérgica em granulócitos de
pacientes diabéticos do tipo 2 e não diabéticos.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Quantificar a resposta oxidante (produção de ROS) em granulócitos de DM2 e
ND na ausência/presença de efetores adrenérgico, colinérgico e partículas
opsonizadas de Zymosan (ZC3b);
Avaliar o efeito dos nucleotídeos cíclicos AMPc e GMPc na geração de ROS
em granulócitos de DM2 e ND;
Mensurar a produção de óxido nítrico (NO) em granulócitos de DM2 e ND na
ausência/presença de efetores adrenérgico, colinérgico.
Quantificar a resposta antioxidante em granulócitos de DM2 e ND na
presença/ausência de efetores adrenérgico/colinérgico e ZC3b;
23
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Pacientes
O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa (CEP) da Santa
Casa de Belo Horizonte (SC-BH). Os pacientes foram selecionados pelas Dra.Maria
Regina Calsolari, no Centro de Estudos e Pesquisas em Endocrinologia e
Metabologia (CEPCEM) da SC-BH, Dra. Janice Sepúlveda Reis, no consultório do
plano de saúde da SCM-BH, Dra. Adriana Aparecida Bosco, no ambulatório de
diabetes da SC-BH.
Critérios de inclusão: foram incluídos os doadores que concordaram em
assinar o Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). Foram selecionados
pacientes de ambos os sexos, com diagnóstico de diabetes tipo 2, conforme os
critérios estabelecidos pela American Diabetes Association (ADA) e doadores do
grupo controle, sabidamente normoglicêmicos. A idade dos doadores variou entre 30
e 70 anos.
Critérios de exclusão: foram excluídos do trabalho, os pacientes com doenças
inflamatórias ou auto-imune, câncer, demência, gestantes, fumantes e aqueles que
não concordaram em assinar o Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE).
4.2 Coleta de sangue
Foram coletadas aproximadamente 10mL de sangue venoso periférico dos
pacientes através da punção venosa, em tubos vacuntainer, um tubo contendo
heparina como anticoagulante. Neste estudo foram selecionados 40 indivíduos.
24
4.2.1 Obtenção de granulócitos
Esquema 2: Obtenção dos granulócitos.
Os granulócitos foram obtidos a partir do sangue periférico, de acordo com a
técnica adaptada de Bicalho, H. M. S. et al.[49]. Quatro mililitros de sangue periférico
heparinizado foram adicionados a três mililitros de gradiente monopaque e três
mililitros de leucopaque (BION LTDA). O tubo foi centrifugado à temperatura
ambiente (100 x g) por 30 minutos, originando dois anéis formados por células
mononucleares e mais abaixo o anel de granulócitos conforme demonstrado no
esquema 2.
Este anel de granulócito foi transferido para um tubo siliconizado e lavado três
vezes em PBS. Após as lavagens, os granulócitos foram ressuspensos em 1 mL de
PBS. A contagem destas células foi feita no microscópio usando-se uma câmara de
Neubauer e o número expresso em nº de células/mL, foi calculado pela fórmula:
células/mL = nº/4 x 10 x diluição (100) x 103. A viabilidade celular de cada amostra
foi superior a 90%, como determinado pelo teste de exclusão por incorporação de
azul de Trypan.
30 minutos após a centrifugação
25
4.2.2 Teste de viabilidade celular: incorporação de Azul de Trypan
O teste de viabilidade celular foi feito com o Azul de Trypan a 1%. As células,
contadas na câmara de Neubauer, que incorporam o Azul de Trypan foram
consideradas mortas. Foram utilizadas no experimento apenas as amostras que
continham, pelo menos, 90% de células vivas.
4.3 Ensaio de quimiluminescência dependente de luminol: Quantificação das
espécies reativas de oxigênio (ROS)
O ensaio de quimiluminescência permite avaliar, indiretamente, a atividade da
NADPH oxidase, a enzima responsável pela geração de ROS durante a fagocitose
das células. As células produzem uma luminosidade definida como
quimiluminescência nativa ou natural. Contudo, esta luminosidade pode ser
amplificada, usando-se reagentes químicos que, ao reagirem com o ROS produzido,
passam a emitir a luminescência amplificada, conforme a reação abaixo:
A reação ocorre no interior de um sistema cátodo-ânodo, o que permite a
captação e registro dos fótons emitidos pelo aminofitalato.
Para a leitura basal, foram colocados em um tubo específico para o
luminômetro, 200 µL de luminol 10-4 M, 300 µL de PBS e 100 µL de granulócitos (1 x
105/mL). A leitura foi a cada minuto, durante 30 minutos. Os resultados foram
expressos em unidades relativas de luz (RLU) por minuto. Após este tempo foi
acrescido os estimuladores (adrenalina 1000 nM, carbamilcolina 1000 nM, AMPc 10-
4 M, GMPc 10-4 M e/ou ZC3b). E para cada item acrescido ao tubo foi realizada
leituras complementares de 30 minutos.
26
4.4 Reagentes e soluções
- PBS (Tampão fosfato salino): a solução salina tamponada foi preparada como
abaixo, pH= 7,3
Na2HPO4 anidro ------------- 8,12 g
KH2PO4 ------------------------ 1,35 g
NaCl ------------------------------ 8,0 g
H2O destilada, q.s. -------------1 litro
- Luminol (5 – amino – 2, 3 – dihydro- 1,4 phthalozinedione) – SIGMA Co.
1,77 g de luminol foram diluídos em 1,0 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) originando
uma concentração de 10-2 M. A partir daí, a solução foi diluída em PBS e usada a 10-
4 M.
- Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Sigma Co.) pH 7,3: o meio de
cultura foi preparado, em capela de fluxo laminar e filtrado adicionando:
10 mL de antibiótico-antimicótico: 10000 unidades/mL de penicilina 6 sódio
(Invitrogen) diluído 10 vezes em H2Od (água deionizada); 10000 µg/mL de sulfato
de streptomicina; 25 µg/mL anfotericina B (0,85% salina)
2 mL de sulfato de gentamicina 80 mg (Schering-Plough)
2 g de bicabornato de sódio (Farmax)
q.s.p. 1L de água destilada.
O meio de cultura foi suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sorali
Biotecnologia).
- Solução de leucopaque
A solução de leucopaque foi adquirida pela BION LTDA.
-Azul de Trypan (SIGMA Co.)
O azul de Trypan foi usado a 1% em PBS.
- AMPc (3’:5’- adenosina monofosfato cíclico)
O AMPc foi comprado da Sigma Chemical Co.
27
A solução estoque foi preparada a 10-2 M, sendo estocada ao abrigo da luz.
Para uso, foi realizada diluição para 10-4M em PBS.
- GMPc (3’:5’- guanosina monofosfato cíclico)
O GMPc foi comprado da Sigma Chemical Co. Essa solução (10-2 M) foi estocada ao
abrigo da luz. Para uso, dilui-se 100x (1:100) a solução estoque em solução salina
balanceada de PBS.
- Adrenalina
A adrenalina foi comprada da Sigma Chemical Co. e reconstituído com NaCl a 0,9%.
- Carbamilcolina
O Carbachol foi comprado da Sigma Chemical Co.e reconstituído com NaCl a 0,9%.
- Luminômetro: 20/20n – Turner Byosystems24
- Microscópios: Edu VU 1300 – WESCO; Ken – A vision TT – 1500 N acoplado a
câmera digital color SDC- 312 (Samsung) e ao monitor de computador Pro view.
- Centrífugas: Centrifugador Excelsa Fanem Ltda; Bio Eng – 6000
- Banho Maria: Hemoquímica
- Leitor de ELISA - STAT FAX – 2100
- Espectrofotômetro – BIO PLUS 2000
4.5 Produção de Óxido nítrico
O óxido nítrico é um mediador gasoso responsável por uma variedade de
fenômenos fisiológicos. A l-arginina é a precursora da síntese do óxido nítrico, na
presença de óxido nítrico-sintase. Dessa forma então, mensuramos a produção
deste mediador na presença, ausência de adrenalina e carbamilcolina.
28
A produção de Oxido Nítrico foi avaliada em sobrenadante de cultura celular
(18 horas em estufa de 5% CO2/37ºC) de granulócitos, pelo método de Griess. Na
presença/ausência carbachol, adrenalina e Zymosan C3b.
Método de Griess: Os sobrenadantes da cultura de granulócitos (18 horas em estufa
de 5% CO2/37ºC) foram analisados quanto à produção de nitrito pela reação de
Griess, como medida da produção de óxido nítrico (Green et al, 1982) [50]. Para
medir a produção de nitrito, alíquotas de 100uL das amostras foram incubadas com
100uL dos reagentes (50uL da solução de sulfanilamida 1% e 50uL de solução de N-
naphthylethylenediamine dihydrocloride 0,1% em 2,5% de H3PO4) à temperatura
ambiente por 10 minutos. A leitura foi realizada no espectrofotômetro com
absorbância de 570nm.
4.6 Opsonização de Zymosan
Para a produção de Zymosan opsonizado (Zc3b) foi coletado sangue venoso
periférico humano em tubos vacuntainer sem anticoagulante, e armazenados em
geladeira por 2 horas. Após o repouso, o sangue foi então, centrifugado a 3000 rpm
por 15 minutos, formando no tubo 2 camadas, sendo a primeira de cor amarelada
translúcida correspondente ao soro. Para cada mL de soro é acrescentado 50ul de
Zymosan (13mg), formando uma nova solução que foi incubada a 37ºC por 2 horas.
4.7 Redução do sal tretrazólio (MTT)
Este ensaio baseia-se na medida do dano induzido pelo composto/extrato em
estudo no metabolismo celular de glicídeos usualmente através da avaliação da
atividade de desidrogenases mitocondriais. A viabilidade mitocondrial, e
consequentemente, a viabilidade celular, é quantificada pela redução do MTT (um
sal de coloração amarela) a formazan (sal de coloração arroxeada e insolúvel em
água) pela atividade daquelas enzimas. Dessa forma, a redução do MTT a
formazan, será diretamente proporcional à atividade mitocondrial e a viabilidade
celular.
29
Para avaliar a redução do 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT) foi utilizando granulócitos [1x105/10uL], partículas de Zymosan
opsonizado (Z-C3b)[100uL de suspensão a 13mg/mL] com fragmento C3b, Dibutiril
AMP cyclic (10-4 M) e 8-Bromo-cyclic GMP (10-3 M). O MTT é um sal de tetrazólio,
que pode ser reduzido pelas desidrogenases, formando cristais de formazan
solúveis em isopropanol. Desta forma, o MTT passa de uma cor amarela (forma
oxidada) para uma cor púrpura (forma reduzida).
Em tubos de ensaio os granulócitos foram incubados à 37 ºC durante 4 horas,
na presença e ausência (leitura basal) e presença adrenalina, carbamilcolina e Zc3b,
acrescidos de 25ul de MTT em cada tubo. Após incubação, foi adicionado 1,5 mL de
uma solução de isopropanol (HCl 0,04N) aos tubos, e estes foram fortemente
homogeneizados no Vortex, durante 1 minuto, para dissolução dos cristais de
formazan, produto da redução do MTT. Os tubos foram centrifugados durante 10
minutos e os sobrenadantes foram analisados no Stat Fax, no comprimento de onda
de 570 nm e os resultados expressos em densidade óptica (D.O) 570nm.
30
4.8 Análise Estatística
Na análise estatística foi realizada pelo teste “t” de Student, Mann Whitney e
Qui-quadrado (X2) dependendo dos dados em estudo. Onde p<0,05 foi considerado
como estatisticamente significativo.
31
5 RESULTADOS
A tabela 2 demonstra as características clínicas e bioquímicas dos pacientes
diabéticos e seus controles não diabéticos. Observamos diferença significativa
(p<0,05) entre DM2 e ND nos seguintes parâmetros: Idade dos indivíduos, IMC,
glicose jejum, HbA1c e ureia.
Tabela 2: Características clínicas e bioquímicas da população em estudo.
Parâmetros
Média ± EP
Não diabéticos p Diabéticos tipo 2
Amostra (n) 40 - 40
Idade (anos) 45,6±1,31 p<0,05 52,8±1,52
Sexo (F/M) 22/18 - 27/13
Tempo da doença (anos) NA - 8,91±0,97
Índice de massa corporal (kg/m2) 24,1±0,54 p<0,05 33,7±1,44
Glicose jejum (mg/dL) 81,7±1,56 p<0,05 162,9±10,05
HbA1c (%) 6,4±0,08 p<0,05 8,1±0,41
Triglicérides (mg/dL) 145,0±8,75 NS 165,6±18,11
Colesterol total (mg/dL) 156±16,82 NS 192,4±4,92
Colesterol LDL (mg/dL) 112,4±2,39 NS 126,8±3,87
Colesterol HDL (mg/dL) 51,4±0,9 NS 58,0±2,54
Creatinina (mg/dL) 1,02±0,02 NS 1,57±0,37
Ureia (mg/dL) 29,4±2,58 p<0,05 46,7±3,85
32
n = número de amostra; IMC = índice de massa corpora; mg/dL = miligramas/decilitro; kg/m2 =
kilograma/metro2; mmHg = milímetros de mercúrio; HbA1c = hemoglobina glicada; NS = não
significativo
Os resultados serão apresentados em forma de figuras, tabelas e quadro.
Para determinação da dose ideal a ser usada nos experimentos, realizamos curva
dose-resposta para definição de concentrações ideais para uso nos teste
subsequentes.
Primeira pergunta: Qual a melhor dose de adrenalina ou carbamilcolina
capaz de interferir na produção de ROS por granulócitos?
Figura 4: Curva dose-resposta do efeito da adrenalina na produção de ROS por granulócitos de ND
(n=4) e DM2 (n=4). ND =Não diabético; DM2= pacientes com diabetes mellitus do tipo 2. Cada dose
foi comparada com a leitura basal (ausência de adrenalina). Valores expressos em média. NS=Não
significativo; p<0,05= significativo estatisticamente. RLU/min: unidades relativas de luz por minuto.
33
Figura 5: Curva dose-resposta do efeito da carbamilcolina na produção de ROS por granulócitos de
ND (n=4) e DM2 (n=4). ND=Não diabético; DM2= pacientes com diabetes mellitus do tipo 2; NS= não
significativo. Cada dose foi comparada com a leitura basal (ausência de carbamilcolina). Valores
expressos em média. NS=Não significativo; p<0,05= significativo estatisticamente. RLU/min: unidades
relativas de luz por minuto.
Os resultados das figuras 4 e 5 demonstraram o efeito de diferentes
concentrações de adrenalina e carbamilcolina na produção de ROS por granulócitos
de pacientes diabéticos e não diabéticos. Após comparações, verificamos que a
melhor concentração tanto para adrenalina quanto para carbamilcolina foi de
1000nM, concentração utilizada em todos os testes.
Segunda pergunta: Granulócitos de diabéticos e não diabéticos se
comportam de forma semelhante sob ativação adrenérgica ou colinérgica?
Os resultados são demonstrados na tabela 3.
Tabela 3: Efeito do estímulo adrenérgico e colinérgico sobre a produção de ROS em
granulócitos não ativados de DM2.
EXPERIMENTOS
Produção de ROS (RLU/min) expresso em Mediana
NÃO DIABÉTICOS DIABÉTICOS P
1) G + PBS 216 417 p<0.05
2) G + ADRENALINA 114* 241* p<0.05
3) G + CARBAMILCOLINA 272 633* p<0.05
Avaliação da produção de ROS em granulócitos na presença ou ausência de adrenalina 1000nM e Carbamilcolina 1000nM. Número de amostra (n) = 15 para não diabéticos e 15 para diabéticos tipo 2. p<0,05 significativo. NS = não significativo (p>0,05). G=Granulócitos. Valores expressos em mediana. Análise estatística realizada pelo teste de Mann-Whitney. *=p<0,05 em relação à produção de ROS basal (G+PBS). Ensaio de quimiluminescência.
A produção basal de ROS em DM2 foi maior quando comparado com ND
(p<0,05), indicando que o metabolismo do DM2 está possivelmente ativado pela
34
hiperglicemia. Na presença de carbamilcolina observamos que os granulócitos de
ND não mostraram alteração significativa (p>0,05) na produção de ROS, no entanto
em DM2 houve aumento significativo (p<0,05) na produção de ROS. Na presença de
adrenalina houve inibição significativa (p<0,05) da produção de ROS tanto em
diabéticos quanto em não diabéticos.
Esse resultado foi realizado em células em repouso. Para verificarmos o efeito
colinérgico e adrenérgico em células ativadas, estimulamos o processo fagocítico
nos granulócitos de diabéticos e não diabéticos com partículas opsonisadas de
Zymozan (ZC3b). É sabido que a fagocitose é um processo importante da imunidade
inata. Neste contexto, a fagocitose pode sugerir que granulócitos apresentam
ativação de diversas vias metabólicas. Dessa forma, fizemos nossa próxima
pergunta.
Terceira pergunta: O sistema adrenérgico pode exercer algum efeito sobre
granulócitos durante o processo fagocítico?
Baseado nesta questão realizamos o experimento com objetivo de observar o
efeito da adrenalina ou carbamilcolina na produção de ROS em granulócitos durante
a fagocitose de partículas de Zymosan opsonizado com partícula C3b. Os resultados
estão dispostos na figura 6, expresso pela relação experimento [E] dividido pelo
controle [C] (leitura basal).
Figura 6: Avaliação do processo fagocítico em granulócitos na presença de Adrenalina 1000 nM. Número de amostra (n) = 15 para não diabéticos e 15 para diabéticos tipo 2. DM2= diabéticos do tipo 2; ND= não diabéticos; ZC3b= partículas de Zymosan opsonizado com fragmentos C3b. Análise estatística realizada pelo teste Qui-quadrado. E/C= valor do experimento /valor do controle (média 194 ND, 394 DM2). ±Erro padrão. Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. Ensaio de quimiluminescência.
35
A figura 6 mostra redução significativa (p<0,05) na produção de ROS por
granulócitos de ND e DM2 na presença de adrenalina comparada com a leitura
basal (média: ND =194 e DM2=394). Entretanto, não foi observada diferença dessa
inibição entre os grupos (E/C= 0,6 e 0,6 respectivamente). A estimulação da
fagocitose por ZC3b aumentou significativamente (p<0,05) a produção de ROS em
ND e DM2. Esse aumento foi significativamente maior (p<0,05) em células de ND
(4,9±1,0) comparado com células de DM2 (3,7±0,75). Na presença de adrenalina
houve redução significativa (p<0,05) da fagocitose, avaliada pela produção de ROS,
nos grupos em estudo (0,5 ND e 0,3 DM2). O percentual de inibição foi de 95% e
97% para ND e DM2, respectivamente. Portanto estes resultados demonstram que a
ativação adrenérgica modula negativamente o processo fagocítico.
Assim, resolvemos avaliar o mesmo fenômeno usando ativação colinérgica.
Quarta pergunta: O sistema colinérgico pode exercer algum efeito sobre
granulócitos durante o processo fagocítico?
Figura 7: Avaliação do processo fagocítico em granulócitos em meio contendo Carbamilcolina 1000 nM. Número de amostra (n) = 15 para não diabéticos e 15 para diabéticos tipo 2. DM2= diabéticos do tipo 2; ND= não diabéticos, p<0,05 estatisticamente significativo. CARB1mM = Carbamilcolina Sigma; ZC3b= partículas de Zymosan opsonizado com fragmentos C3b; Análise estatística realizada pelo teste Qui-quadrado. E/C= valor do experimento/valor do controle (média 194 ND, 394 DM2). ±Erro padrão. Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. Ensaio de quimiluminescência.
A figura 7 mostra os resultados, expressos pela relação E/C ± EP, da
produção de ROS por granulócitos de ND e DM2 na ausência e presença de
36
carbamilcolina e/ou ZC3b. Verificamos que na presença de carbamilcolina houve
aumento significativo (p<0,05) da produção de ROS em células de pacientes
diabéticos quando comparado à produção basal (média: ND =194 e DM2=394), essa
ativação não foi observada em células de controles não diabéticos. Os valores foram
de 1,2±0,08 para ND e 1,7±0,1 para DM2. A estimulação da fagocitose por ZC3b
aumentou significativamente (p<0,05) a produção de ROS em ND e DM2. Esse
aumento foi significativamente maior (p<0,05) em células de ND (4,9±1,0)
comparado com células de DM2 (3,7±0,75). Na presença de carbamilcolina houve
redução da fagocitose nos grupos em estudo, a inibição foi de 23% para ND e de
36% para DM2 (p<0,05) em relação ao controle G+ZC3b.
Sabe-se que a adrenalina ativa o receptor β adrenérgico em granulócito induz
a adenil ciclase a hidrolisar o ATP em AMPc (segundo mensageiro)[23]. Nesse
contexto, fizemos nossa próxima pergunta.
Quinta pergunta: O AMPc tem efeito comparável à adrenalina sobre a
produção de ROS em granulócitos de ND e DM2?
Figura 8: Avaliação da produção de ROS expresso em mediana por granulócitos na presença de Adrenalina 1000nM e AMPc 10
-4. Número de amostra (n) = 15 para não diabéticos e 15 para
diabéticos tipo 2. Valores expressos em mediana. Análise estatística realizada pelo teste Mann-Whitney. Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. RLU/min=Unidades relativas de luz por minuto. Ensaio de quimiluminescência.
A figura 8 mostra os resultados da produção de ROS, expressa em Mediana,
na ausência e presença de AMPc ou Adrenalina. Verificamos que na presença de
37
AMPc não houve alteração na produção de ROS em granulócitos de ND quando
comparada com a produção basal (média: ND =184 e DM2=385). Contudo, em DM2
a presença do AMPc aumentou significativamente (p<0,05) a produção de ROS em
aproximadamente 200% quando comparada à produção basal. Como demonstrado
anteriormente (tabela 3 e figura 8), houve diminuição significativa (p<0,05) da
produção de ROS na presença de adrenalina tanto em células de ND quanto de
DM2.
Dentro do mesmo raciocínio, a acetilcolina (carbamilcolina) ativa receptor
muscarínico (guanil ciclase) que é associado ao GTP que origina a formação de
GMPc. Com estas informações fizemos a mesma indagação anterior, mas agora em
relação à carbamilcolina.
Sexta pergunta: O ativador colinérgico (carbamilcolina) e GMPc apresentam
semelhanças no efeito na produção de ROS em granulócitos de diabéticos?
Figura 9: Avaliação da produção de ROS expresso em mediana por granulócitos na presença de Carbamilcolina 1000 nM ou GMPc 10
-4. Número de amostra (n) = 15 para não diabéticos e 15 para
DM2. Valores expressos em mediana. Análise estatística realizada pelo teste Mann-Whitney. Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. RLU/min=Unidades relativas de luz por minuto. Ensaio de quimiluminescência.
A figura 9 mostra os resultados da produção de ROS, expresso em Mediana,
na ausência e presença de GMPc ou Carbamilcolina. A produção basal de ROS está
significativamente maior (p<0,05) em DM2 comparado com ND. Quando analisamos
a produção de ROS em presença de GMPc verificamos que houve aumento
38
significativo (p<0,05) para ambos os grupos comparado com a leitura basal (média:
ND=184 e DM2=385). Em presença de carbamilcolina a produção de ROS por
granulócitos de ND e DM2 foi significativamente maior (p<0,05) em comparação com
a leitura basal.
Como vimos, a estimulação adrenérgica ou colinérgica tem efeito sobre a
produção de espécies reativas de oxigênio liberado por granulócitos. Será que este
efeito se repete em espécies reativas de nitrogênio (RNS)? Neste contexto
formulamos a pergunta seguinte.
Sétima pergunta: Ativação colinérgica e adrenérgica interferem com a
produção de óxido nítrico por granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2 ?
Figura10: Produção de óxido nítrico por granulócitos de DM2 e ND na ausência ou presença de adrenalina ou carbamilcolina. ND=não diabéticos (n=10), DM2=diabetéticos tipo 2 (n=10). Resultados expressos em umol/L ±Erro padrão (EP). Letras iguais p>0,05; letras diferentes p<0,05.
Na figura 10 estão dispostos os resultados, expressos em umol/L ± EP, da
produção de óxido nítrico em granulócitos de DM2 e ND sob estímulos adrenérgico
(adrenalina) e colinérgico (carbamilcolina). Observamos que a produção basal (sem
estímulo) de NO em ND foi significativamente maior (p<0.05) do que em DM2. Na
presença de adrenalina houve redução significativa (p<0,05) da produção de NO em
ND comparado com a leitura basal. Em granulócitos de DM2 a presença de
adrenalina aumentou significativamente (p<0.05) a produção de NO comparado com
39
a leitura basal, este aumento foi de aproximadamente 110%. Na presença de
carbamilcolina houve inibição significativa (p<0,05) da produção de NO em ND, e em
pacientes diabéticos houve ativação significativa (p<0.05) quando comparado a
produção de NO na ausência de estímulo.
A tabela 4 demonstra o índice de predisposição inflamatória, que representa a
relação entre a produção de ROS e a produção de NO, nos pacientes diabéticos e
controles não dibéticos. Realizamos um balanço comparativo entre a produção de
espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS e RNS).
Os resultados apresentados na tabela 4 demonstram o perfil inflamatório dos
pacientes diabéticos e controles não diabéticos de acordo com a relação entre a
produção de NO e ROS. Essa relação foi sugerida por Darley-Usmar [47].
Tabela 4: Produção de ROS e RNS por granulócitos de ND e DM2. Índice de predisposição inflamatória (IPI).
EXPERIMENTOS E/C Razão
NO ROS NO/ROS
G+ADRENALINA - ND 0,9 0.7 1.3
G+ADRENALINA - DM2 3,9 0,5 7,8
G+CARBAMILCOLINA - ND 1,0 1,2 0,8
G+CARBAMILCOLINA - DM2 2,0 1,0 2,0
IPI: índice de predisposição inflamatória, determinado pela razão NO/ROS o perfil anti-inflamatório
será sempre > 1,0 e pró-inflamatório < 1. Onde E=Experimento (adrenalina ou carbamilcolina) e
C=Controle (leitura sem estímulo).
Os resultados apresentados na tabela 4 mostram que os granulócitos de ND
em presença de adrenalina produziram menos ROS quando comparados com o NO,
porém esta diferença não foi significativa (p>0,05), que segundo descrito por Darley-
Usmar (1995) [47] é um perfil anti-inflamatório.
Em granulócitos de ND em presença de adrenalina a relação de E/C, o NO foi
maior que o ROS (p>0,05), porém em carbamilcolina o oposto foi percebido,
40
demonstrando uma tendência de granulócitos de ND em presença de carbamilcolina
ser pró-inflamatório. Em granulócitos de DM2 tanto em presença de adrenalina
quanto carbamilcolina houve tendência a um aumento na produção de NO quando
comparado ao E/C da produção de ROS, no entanto esta diferença não foi
significativa (p>0,05).
Até aqui analisamos a resposta oxidante pela produção de ROS e RNS (NO)
extracelular. Como se comportaria na resposta redutora frente à estimulação
adrenérgica e colinérgica?
Oitava pergunta: A ativação adrenérgica interfere com a resposta anti-
oxidante ou redutora dada por granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2?
Figura 11: Avaliação da capacidade redutora por granulócitos de DM2 e ND sob estímulo adrenérgico e ZC3b= partículas de Zymosan opsonizado com fragmentos C3b Número de amostra (n)= 10 DM2 e 10 para ND. Valores expressos em E/C (E=experimento/C=controle). Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. G=granulócitos e ADRE=adrenalina.
Os resultados expressos em E/C aparecem na figura 11 nos mostra a
capacidade redutora de granulócitos de doadores ND e DM2. Granulócitos de DM2
e ND apresentaram resultados semelhantes (p>0,05). No experimento contendo
granulócitos mais ZC3b houve ativação significativa (p<0,05) em ND e quando com
DM2, esta relação não foi significativa (p>0,05).
Nos experimentos contendo adrenalina e ZC3b houve um aumento
significativo do poder redutor em ambos os grupos (p<0,05) mas quando
comparados entre eles este aumento não foi significativo (p>0,05). Estes dados
41
mostram que a fagocitose de DM2 é menor e que a adrenalina potencializa a
resposta redutora ou antioxidante tanto em ND quanto DM2.
Nona pergunta: A ativação colinérgica interfere com a resposta antioxidante ou
redutora dada por granulócitos de pacientes diabéticos do tipo 2?
Figura 12. Avaliação da capacidade redutora por granulócitos de DM2 e ND sob estímulo colinérgico e ZC3b. ZC3b= partículas de Zymosan opsonizado com fragmentos C3b; Número de amostra (n)= 10 para diabéticos tipo 2 e 10 para não diabéticos. Valores expressos em E/C. Letras diferentes p<0,05; letras iguais p>0,05. G=granulócitos e CARB=carbamilcolina.
A figura 12 nos mostra a capacidade redutora na presença de carbamilcolina
em granulócitos de ND e DM2. A resposta redutora ou antioxidante em DM2 teve
uma tendência a ativação quando comparado com ND, mas esta diferença não foi
significativa entre eles (p>0,05). No experimento contendo granulócitos mais ZC3b
houve ativação significativa (p<0,05) em ambos os grupos e quando comparados
entre eles a ativação foi significativa (p<0,05).
No experimento com ZC3b na presença de carbamilcolina houve um
aumento significativo em ambos os grupos (p<0,05) quando comparado com seu
basal e, quando comparados entre eles, este aumento também foi significativo
(p<0,05). Além disto, a comparação entre G+ZC3b com G+ZC3b+Carb mostrou
inibição da capacidade redutora, no entanto esta capacidade foi significativa apenas
em ND (p<0,05). Isto sugere que a ativação colinérgica interfere na reposta anti-
oxidante produzida por granulócitos e que DM2 e ND.
42
6 DISCUSSÃO
O presente trabalho mostra que o sistema imune é sensível à estimulação
adrenérgica e colinérgica.
Em nossos experimentos avaliamos o efeito de neurotransmissor
(acetilcolina) e da catecolamina (adrenalina) sobre a função de granulócitos de DM2
e controle não diabético. Existem poucos resultados na literatura que associam o
efeito de modulação adrenérgica ou colinérgica sobre efetores celulares ou solúveis
da imunidade inata.
As figuras 4 e 5 representam curvas dose–resposta que definiram a melhor
dose in vitro tanto para adrenalina quanto para carbamilcolina (acetilcolina). As
concentrações extrapoladas das curvas da figura 4 e 5 estão de acordo com dados
descritos na literatura [51-52].
Na tabela 3, granulócitos de DM2 produziram maiores quantidades de ROS
quando comparado com ND (p<0,05). Na presença de adrenalina a houve
diminuição da produção de ROS nos dois grupos em estudo, a inibição foi de 50%
para ND e 58% para DM2. A carbamilcolina (acetilcolina) não exerceu nenhum efeito
sobre a produção de ROS em granulócitos de ND, mas uma significativa ativação foi
observada em células de pacientes diabéticos DM2 (p<0,05).
Isto pode sugerir que a maior produção de espécies reativas de oxigênio por
células de diabéticos seja consequência do efeito da hiperglicemia e que os testes,
mesmo in vitro, envolvem granulócitos pré ativados, in vivo pelos altos teores de
glicose sanguínea.
Wenisch et al. [53] já relataram que catecolaminas estão associadas com a
diminuição da geração da produção de ROS bem como a capacidade fagocítica.
Nos experimentos com fagocitose, observamos que a adrenalina foi capaz de
inibir a fagocitose de partícula opsonizada por C3b tanto em diabéticos quanto não
diabéticos. A inibição foi maior em granulócitos de DM2 (fig. 6). Este aumento de
adrenalina, se associado ao estresse emocional, físico ou crônico pode abrir portas
para infecções oportunistas por patógenos. Sobretudo porque o estresse emocional
e físico pode aumentar os níveis de adrenalina, podendo interferir negativamente na
imunidade inata.
43
Os nossos resultados são corroborados por outros achados disponíveis na
literatura reforçando esta sugestão [2, 53-54]. Os resultados da figura 7 mostram que o
estímulo colinérgico com a carbamilcolina (acetilcolina) não impediu a capacidade
fagocítica, se levarmos em consideração a comparação entre G+CARB e
G+CARB+ZC3b; porém se compararmos o G+ZC3b e G+CARB+ZC3b foi possível
identificar uma diminuição da capacidade fagocítica de 23% e 36% para ND e DM2.
Podemos sugerir que a falta de ação da acetilcolina possa ser devido à ação da
hiperglicemia.
Esta sugestão encontra suporte nos trabalhos de Mowat et al [55] que
demonstrou baixa taxa de atividade quimiotática de neutrófilos devido a altas taxas
de glicose no soro. Outros trabalhos também destacam que polimorfonucleares de
pacientes diabéticos apresentam uma redução da atividade fagocítica [56-57] que
parece estar diminuída quando associada à hiperglicemia [58-59]. Rocha et al.[60]
demonstraram que nos pacientes diabéticos ocorre diminuição da atividade
fagocítica das células polimorfonucleares, diretamente relacionada aos níveis de
hiperglicemia, alteração na aderência, quimiotaxia e opsonização leucocitária.
Como teoricamente o efetor bioquímico da ação da adrenalina é o AMPc,
resolvemos testar diretamente este nucleotídeo cíclico. Na presença de AMPc os
granulócitos do grupo ND diminuíram a produção de ROS, comparável ao observado
a adrenalina (Fig.6 e 8). Estes dados são semelhantes a trabalhos na literatura [60].
Coffey, R. G. [61] abordou as várias funções de granulócitos além de modular a
expressão de receptores celulares e eventos dependentes de cálcio, mas não
aqueles sinalizados pela ativação da PKC.
Observamos que houve aumento da produção de ROS em DM2 na presença
de AMPc possivelmente esse resultado tenha ocorrido devido a alteração na
reatividade celular devido à hiperglicemia [60, 62-63]. Brandt et al. [64] relataram em seus
estudos que as citocinas potencializam a degranulação de neutrófilos em resposta a
citocinas produzidas por neutrófilos ativados por peptídeos 2 (NAP-2) e IL-8
modulando níveis de AMPc intracelular.
Analisamos comparativamente os granulócitos de ambos os grupos
estimulados com adrenalina e a inibição se manteve, não denotando nenhuma ação
mimética do AMPc e adrenalina, nestas condições. Podendo sugerir que neste
intervalo compreendido entre a ativação da adenil ciclase/proteína G e a formação
44
de AMPc, outros fatores possam sofrer ação desta estimulação interferindo na
formação de ROS.
Os resultados sugerem que esta inibição seja modulada negativamente pelas
mudanças de vias metabólica com predominância de um dado receptor de AMPc
(PKA) em relação aos outros (Epac) além da possibilidade de interferência direta na
via PKC/NADPHoxidase. Usando raciocínio análogo, testamos o efeito de GMPc e
comparamos com a ação da acetilcolina.
Observamos que a produção de ROS em granulócitos na presença de GMPc,
foi aumentada tanto em ND quanto DM2 porém houve tendência a ativação em ND
do que em DM2 mas este, não foi significativo (p>0,05). O GMPc parece apresentar
função antagonista em relação ao AMPc [65].
Em presença de adrenalina a produção de NO em DM2 foi maior do que
aquela produzida por granulócitos de ND, o percentual de ativação foi de 100%
quando comparado a ND (p<0,05). Podemos sugerir uma ativação da iNOS,
isoforma induzível da enzima óxido nítrico sintase, possa ser ativada pela
hiperglicemia do diabetes, justificando os nossos achados. Uma vez que a iNOS não
está expressa sob condições normais, mas pode ser induzida por citocinas e/ou
endotoxinas em vários tipos celulares como macrófagos, linfócitos T, células
endoteliais, miócitos, hepatócitos, condriócitos, neutrófilos e plaquetas [66] isto reforça
os nossos achados.
A hiperglicemia tratando-se de um fator que naturalmente desequilibra vias
metabólicas, vai levar a injúrias e complicações micro e macrovasculares a longo
prazo. A produção de NO em excesso também pode levar a injúrias endoteliais e
teciduais [67].
Neste mesmo contexto, observamos que a produção de NO em meio
contendo carbamilcolina por granulócitos de DM2 teve uma tendência a aumentar
em relação à ND, no entanto esta diferença não foi significativa (p>0.05).
Tomando por base estudos de Darley-Usmar [47], estabelecemos uma relação
matemática entre a produção de NO e ROS (NO/ROS), para determinar a
predominância de NO e ROS na presença de estímulo colinérgico ou adrenérgico.
Observamos que granulócitos de ND e DM2 apresentaram um perfil anti-
inflamatório quando estimulados por adrenalina. Já na presença de carbamilcolina
controles não diabéticos apresentaram perfil pró-inflamatório e doadores DM2
45
apresentaram um perfil anti-inflamatório. O quadro abaixo resume as conclusões
encontradas pelos resultados apresentados.
Quadro 1: Resumo resultado NO.
NO/ROS
ADR CAR
ND anti-inflamatório pró-inflamatório
DM2 anti-inflamatório anti-inflamatório Perfil apresentado pelos indivíduos amostrados nos experimentos de óxido nítrico e produção de
ROS. Neste cálculo estabelecemos a relação entre a produção de NO e ROS, dos experimentos [E]
em relação aos seus respectivos controles [C]. A relação E/C foi usado para calcular NO/ROS e
definir o perfil.
Podemos sugerir que a ausência da hiperglicemia em ND leva a um perfil
anti-inflamatório quando em condições homeostáticas e, no seu balanço oposto a
carbamilcolina aponte para um perfil pró-inflamatório.
Em DM2 houve determinação de perfil anti-inflamatório na presença de
adrenalina e também com a carbamilcolina.
Darley-Usmar [47], já descreveu que na relação NO/ROS a maior produção de
ROS e menor produção de NO pode originar o peroxinitrito, substância tóxica que
indica perfil pró-inflamatório [68]. Quando acontece o inverso, aumento de NO e
diminuição de ROS denota-se um perfil anti-inflamatório. Este conjunto de resultado
deixou claro o efeito da ativação colinérgica ou adrenérgica sobe a resposta
oxidante.
A adrenalina mostrou um aumento similar na resposta redutora em células de
ND e DM2. Durante o processo fagocítico o poder redutor foi maior em ND (9.4
vezes) do que em DM2 (4.4 vezes) (p<0.05) fig.11. Na presença de adrenalina
houve uma super estimulação no poder redutor de células de ND e DM2, o aumento
foi de 17.2 vezes em ND e 16.9 vezes em DM2, demonstrando que durante a
fagocitose a resposta antioxidante foi semelhante na presença de adrenalina.
46
Na fig.12 avaliamos o potencial redutor, durante a estimulação fagocítica e na
presença de carbamilcolina. Os resultados encontrados demonstram que houve
ativação da capacidade redutora na presença de carbamilcolina (E/C= 1.3 e 1.5
respectivamente ND e DM2), entretanto esta ativação não foi significativa (p>0.05).
Na presença de carbamilcolina houve aumento da atividade fagocítica tanto para ND
quanto para DM2, no entanto em ND a capacidade fagocítica foi de 7,7 vezes e em
DM2 4.6 vezes.
A capacidade redutora na presença de efetores colinérgicos durante o
processo fagocítico foi menor nos pacientes diabéticos isso sugere que, nessas
condições a hiperglicemia influencia o potencial redutor dos granulócitos durante a
fagocitose, diferentemente do que foi apresentado na produção de ROS.
47
No seu conjunto, os nossos resultados demonstram que a hiperglicemia do
diabetes tem efeito sobre a reatividade celular e sobre efetores solúveis da
imunidade inata.
48
7 CONCLUSÃO
Os nossos resultados sugerem que os efetores adrenérgico e colinérgico têm
uma ação direta sobre efetores da imunidade inata tanto na produção de ROS
quanto na produção de NO. A capacidade fagocítica também está alterada em
presença destes efetores. Demonstrando também que a capacidade
redutora/antioxidante pode estar diminuída em função de fatores exógenos tal como
a hiperglicemia, no caso do diabetes do tipo2. Sugerindo um efeito metabólico
adaptativo devido à hiperglicemia.
49
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