Efectuati un frotiu din cultura.doc

8/13/2019 Efectuati un frotiu din cultura.doc

1/11

. Efectuati un frotiu din cultura

2. Efectuati si colorati un frotiu din produs patologic

1 si 2. - frotiurile se prepara din produs patologic (lichid sau solid) sau din cultura bacteriana(in mediu lichid sau solid),

- se folosesc lame de sticla cu capat rodat, noi, dezinfectate, degresate cu alcool 96%, uscatesi flambate- efectuarea frotiurilor se face cu ansa - se urmareste obtinerea unui frotiu subtire, unistrat,- tehnica efectuarii frotiului in spirala (melc), centrifug,

* Tehnica efectuarii frotiurilor cuprinde mai multe etape:

1. Etalarea frotiului:

- lama de sticla, noua, dezinfectata, degresata,- ansa bacteriologica se arde la rosu (incandescenta),- se incarca bucla ansei cu produs sau cultura bacteriana si se descarca pe suprafata lamei desticla, in centrul ei,

- se etaleaza produsul/ cultura bacteriana sub forma de spirala, in sens centrifug,- nu se ating marginile lamei,- se arde din nou ansa la incandescenta si se lasa la racit, intr-un stati,2. Uscare:

- lama cu fata in sus, langa becul de gaz,- la temperatura camerei,- nu se forteaza uscarea (uscarea brusca la temperatura ridicata altereaza structurile celulare

bacteriene),3. Fixare:

- dupa ce preparatele sunt uscate,- se face in doua scopuri!" mareste aderenta preparatului pe suprafata lamei," pastreaza structura celulara a microorganismului,- prin fi#are, are loc coagularea proteinelor$- se realizeaza fie prin caldura, fie cu fi#atori chimici! alcool metilic, etilic, amestec alcool-eter, alcool- fenol etc.,- prin caldura! se trece frotiul prin flacara,

4. Colorarea frotiurilor:

-prin colorarea frotiurilor au loc interactiuni fizico- chimice intre coloranti si componentelecelulare,

- rezultatul colorarii depinde de structura chimica a colorantului, dar si de compozitia chimicaa componentelor structurale celulare,- depinde de natura solentilor, de temperatura la care se face colorarea, si de aloarea p-ului,Colorantii i!uali:

- cristal iolet,- iolet de gentiana,- fu#ina bazica,- albastru de metilen,- erde malachit,- albastru de toluidina,

"etode de colorare :- metode de colorare simpla,


2/11

- metode de colorare dubla,- metode de coloratii speciale (spori, capsula, cili, flageli etc).

Frotiul din produs patholo#ic- produsul pathologic poate fi solid(folosim ansa bacteriologica

pentru incarcarea cu produs) sau lichid. &a lichid intai se centrifugheaza si apoi se recolteazadin sediment si se realizeaza frotiul. &a lichid etalarea se mai poate realize si cu pipeta.

3. Colorati prin Ziehl-Neelsen un frotiu din sputa

Se foloseste pt evid germenilor acido-alcolo-rezistenti care apartin genuluiMycobacterium tuberculosis, avium, lepreae.

OBS: Bacilii acido-alcoolo-rezistenti apar rosii pe fond albastru; celelalte elementeapar colorate in albastru. Colorabilitatea depinde de varsta culturii si de mediul deizolare. Mycobacteriile patogene sunt mai bogate in ac micolicadica mai rezistente la

decolorare, mentin culoarea rosie pe frotiu! decat cele nepatogene care aparalbastre.

METODA COLOAT!E! D"#LE$ COLOAT!E D!%EENT!ALA

&. 2. COLOAT!A Z!E'L ( NEEL)EN

- eidentierea germenilor acido- alcoolo-rezistenti care apartin genului"$co%acterium:tu%erculosis& aium& %ois& leprae&

'eactii!- fucsina fenicata iehl 1%,- decolorant combinat alcool acid (alcool etilic 96%/ 9* m& + acid clorhidric/ m&),- albastru metilen 1%.Tehnica de lucru*

- frotiul uscat si fi#at la caldura se acopera cu fucsina fenicata iehl 1%, timp de 1 min,- se incalzeste dosul lamei cu flacara becului unsen sau cu un tampon inmuiat in alcool siaprins, pana la emisia de apori (nu se fierbe), de ori in timpul celor 1 min de colorare$daca se eapora fucsina, se poate completa,- se raceste la temperatura camerei,- dupa racire se spala cu apa de robinet,- decolorare cu amestec alcool acid, 2- min,- recolorare prin acoperirea frotiului cu albastru de metilen 1%, timp de 1 min,

- se spala cu apa de robinet,- se usuca,- se e#amineaza la microscopul optic, obiecti cu imersie.

" acilii acido- alcoolo- rezistenti (00') apar rosii pe fondul albastru." eilalti germeni si elementele tisulere (celule epiteliale, 34, limfocite, fibrina) aparcolorate in albastru." rincipiul coloratiei! se bazeaza pe rezistenta 35cobacteriilor la decolorarea cu aciziminerali diluati si alcool, dupa colorare cu fucsina fenicata iehl$.- olorabilitatea depinde de arsta culturii, mediul de izolare, prezenta in produsul patologic amedicamentelor tuberculostatice.

- i alte bacterii sunt acido- alcoolo rezistente !'ocardia& (ctinomices


3/11

" 3ecanismul colorabilitatii! patrunderea fucsinei fenicate iehl in interiorul bacteriei silegarea colorantului de acidul micolic (din inelisul peptidoglicolic) al peretelui celular, prinlegaturi stabile, legaturi care confera suprafetei celulei caractere hidrofobe.e pare ca 35cobacteriile patogene sunt mai bogate in acid micolic (mai rezistente ladecolorare, mentin culoarea rosie pe frotiu) decat cele nepatogene- saprofite (contin putin acid

micolic in perete, nu rezista la decolorare, apar albastri pe frotiu/"$co%acterium sme#matis).

&a un frotiu din sputa unui pacient cu tuberculoza bacilii sunt dispusi in funie rasucita(cord-factor).

+. !nsa,antarea pe o placa cu geloa

!nsa,antarea produsului patologic$ cu ansa$ pe suprafata ,ediului$ in ederea o&tinerii

coloniilor &acteriene iolate$ necesare identificarii*

e are in edere ca!

- mediul de cultura sa fie proaspat turnat (27- 78 ore),- sa fie erificat din punct de edere al sterilitatii (martori de sterilitate),- sa fie erificat din punct de edere al calitatii mediului (tulpini de referinta),- suprafata mediului de cultura solid sa nu prezinte condens (risc de contaminare),- pe fundul placii se noteaza! data turnarii mediului, simbol referitor la data insamantarii

probei, numarul probei, tipul preleatului (niciodata pe capac),- se tine placa etri in mana stanga, inclinata, iar cu dreapata, se manipuleaza ansa

bacteriologica,- ansa se sterilizeaza prin ardere la rosu- incandescenta la baza flacarii becului unsen,inainte de incarcare a buclei cu produs, dupa terminarea dispersiei pe mediu si intre cadrane!:nsamantarea unui produs patologic recoltat cu tamponul (secretii otice, oculare, nazale,faringiene, uretrale, aginale etc) se face astfel! tamponul se descarca prin rasucire pe mediulde cultura, la apro#. ,; cm de la marginea placii etri$ se continua dispersia cu ansa

bacteriologica, respectand cele 7 cadrane, cu arderea ansei intre cadrane, racire in mediul decultura la 1cm de marginea placii. :n cadranul 7, urmeaza sa se dezolte colonii izolate,

pentru a efectua identificarea bacteriana din cultura pura. arland omparatie fata de etalon sau spectrofotometrie :nsamantare a 2-; colonii,incubare 2-6 ore, * grade elsius


4/11

)tandardiarea

inoculului

O,ogeniare

3ediul utilizat e utilizeaza agarul 3uller-inton teril, turnat in placi etri perfect plate, 7 mm grosime 'acire la temperatura camerei, utilizare sau conserare refrigerat ma#.* zile ontrolul sterilitatii

h- *,2-*,7:nsamantarea placii

e introduce un tampon in suspensie e inlatura e#cesul de lichid prin presare e insamanteaza uniform pe toata suprafata, repetand operatia inca de 2 ori si rotind

placa cu cate 6 de grade

e lasa placa sa se usuce, cu capacul intredeschis ;-1; min3icrocomprimate antibiotic

astrare 2-8 grade elsius sau congelate 'eechilibrare termica 1-2 ore ?tilizare de desicanti in recipiente


5/11

'ezistent - tulpinile nu sunt inhibate de nielurile de antibiotic realizate dupaadministrarea dozelor terapeutice$ nu au aplicabilitate clinica

0 fost standardizata pentru bacteriile cu crestere rapida entru germenii cu crestere dificila testarea a fost modificata si adaptata

'ezultatele nesatisfacatoare pot apare dupa o terapie prelungita$ initial germenii sunt sensibili,dar pot deeni rezistenti dupa -7 zile de la inceperea terapiei

rincipiu!-un inocul standardizat al tulpinii testate este insamantat intr-un gradient discontinude concentratii ale medicamentului antimicrobian realizat fie in placi cu mediu agarizat,fie inmediu cu bulion nutriti.


6/11

)ELECTAEA )"#)TANTELO ANT!M!CO#!ENE

CL)! 1Clinical La&orator< )tandards !nstitute

E"CA)T 1European Co,,ittee on Anti&iotic )uscepti&ilit


7/11

0 $nanginei lapurttorii sntoise recolteaz# e/udatul nazal i faringian.

Medii de conservare si transport*tuart si 0mies$ transportul se realizeaza in ma#im 1 ora.

(/amenul direct. Examenul macroscopiceviden%iaz# un puroi galben cremos iar examenul

microscopicpe frotiuri colorate 'ram, efectuate din puroi, relev# $n primul r8nd prezen%a leucocitelor,din care maoritatea sunt distruse i coci sferici cu diametrul de 6,


8/11

-lactozo-negativi Salmonella, Sigella, !roteus, "ersinia! care formeaz# colonii

transparente.

=estele biochimice permit stabilirea genului, precum Fi diferenDierea speciilor Fi subspeciilor!

almonella fermenteazE glucoza cu producere de gaz, nu fermenteazE lactoza, produc 2(cu unele e#cepDii), folosesc citratul ca unicE sursE de carbon etc. nu formeazE indol ureazE

higella 4u fermenteazE lactoza (). sonneifermenteazE lactoza tardi), nu produc gaz prinfermentarea carbohidraDilor, nu produc 2. Gn douE mari subgrupe biochimice! - Hrupul manito-poziti (grupele ,,ermenteazE lactoza Blebsiella >ermenteazE lactoza. roduce gaz, indol,foloseste citratul roteus unt germeni lactozo-negatii, produc hidrogen sulfurat (2), ureazE Fi secretE

fenilalanindezaminazE (>0.


9/11

n prima etap se pun n reacie COMPLEMENT , serul de cercetat i Ag cunoscut+ eist* posibiliti: a. n serul de cercetat exist !c s"eci#ici, rezult-nd un comple AgAc pe care se va

fia COMPLEMENTb.n serul de cercetat nu exist !c s"eci#ici, nu se formeaz comple Ag

Ac, COMPLEMENT rm-ne liber

n a doua etap se introduce n reacie sistemul emolitic indicator (ematii / Ac anti

ematie)+ eist * posibiliti: a. COMPLEMENTnu este liber, nu are loc emoliza,b. COMPLEMENTse fieaz pe sistemul emolitic, lizeaz ematiile i observm apariia emolizei

$nter"retare:

0niial se verific rezultatele aprute pentru martori (fie c este vorba de o metod cantitativ

sau calitativ)+ spre e. n cazul metodei calitative, n tubul martor pentru serul de cercetat trebuies fie emoliz, la fel ca i n tuburile martor pentru Ag, COMPLEMENTi ser sigur negativ. 1n

tuburile martor sigur pozitiv i martor pentru sistemul emolitic, nu trebuie s fie emoliz.

1n tuburile cu serul de cercetat, dac apare emoliza, nseamn c nu exist !ciar testul

este ne%ati&(licidul din tub va avea un aspect rou, limpede).

2estul este "o'iti&atunci c-nd n tuburile cu ser de cercetat nu apare emoliz, ematiile sedepun form-nd un 3buton4 n partea inferioar a tubului (n serul de cercetat exist !c). 5entru a

stabili diagnosticul final, este necesar ca '&67 s fie confirmat prin reacii specifice (vezi

capitolul 8#).

45. E=udatul faringian

4. "Nor,e de recoltare*- recoltare cat ,ai aproape de de&utul &olii$- inaintea ad,inistarii de anti&iotice$- e= faringian se recolteaa di,ineata$ inainte de ca pacientul sa ,anance$ inainte de a se

spala pe dinti sau de a face gargaris,e cu su&stante antiseptice$- respectarea conditiilor de asepsiesi antisepsiein recoltarea produsului patologic,- folosirea echipa,entului de protectie pentru preenirea contaminarii personalului de

laborator,2. Transport rapid (ma# 1 2 ore) si utiliarea ,ediilor de conserare si transport*)tuart$ A,ies$ 0i>e 3. E=a,en ,acroscopic al prodului patologic* aspectul purulent,culoare, miros$ consistenta etc.,+. E=a,en ,icroscopic*

- e#aminarea unui frotiu colorat Hram din scretie faringiana (de e#.) pune in eidentaprezenta cocilor Hram pozitii alungiti, in diolo, lanturi scurte, dar nu ofera nicio relatiedespre caracterele de patognitate$ pot fi streptococi iridans, saprofiti. ingurul diagnostic

bacteriologic care se pune pe frotiu colorat Hram este prezenta asocierii fuo- spirilare1&acili fuifor,i ? &acili spiralati 9ra, negatii$ anaero&i care deter,ina anginaulcero-necrotica 0laut- 8incent.

Mod de recoltare se deprima baza limbii cu un apasator steril,dupa care seMod de recoltare se deprima baza limbii cu un apasator steril,dupa care se

sterg cu tamponul amigdalele si peretele posterior al faringeluizonesterg cu tamponul amigdalele si peretele posterior al faringeluizone

inflamate,ulcerate,depozite purulenteinflamate,ulcerate,depozite purulente

'ecoltarea se face inainte de ingestia alimentelor sau toaleta cavitatii'ecoltarea se face inainte de ingestia alimentelor sau toaleta cavitatii

bucalebucale


10/11

2ransportul in *2ransportul in *

Identificare bacteriana:

L pe baza caracterelor culturale:- Caractere culturale: pe mediu geloza- sange berbec, streptococul se dezvolta sub

forma de colonii mici

L pe baza caracterelor biocimice:

- Testul sensi&ilitaii la &acitracina! metoda simpla, care diferentiaza streptococii piogeni/

grup 0 (bacitracina- sensibili) de celelalte grupe de streptococi beta hemolitici, grup non-0

(bacitracina- rezistenti). rocent subunitar de tulpini de treptococi beta hemolitici grup 0

sunt rezistenti la bacitracina si e#ista tulpini de streptococi beta hemolitici grup non- 0

sensibili la bacitracina (e#ceptii).=ehnica! pe o placa cu mediu geloza- sange se efectueaza cu ansa bacteriologica sectoare de

cultura pura, prin insamantare striu langa striu, dens (dintr-o singura colonie caracteristica de

streptococ beta hemolitic se obtine un sector). :n miAlocul sectorului se aplica un disc de

bacitracina si se incubeaza placa la *M, pana a doua zi.


11/11

ontrolul se a efectua la -; zile de la intreruperea tratamentului

C#amen macroscopic! se pot obsera modif de culoare, prez unor tulburari, prez de

sediment, prez de hematii.C#amen microscopic! se centrifugheaza si frotiul se realizeaza din sediment. e frotiuse pot obsera hematii, leucocite, cristale, leuri, bacterii. e foloseste mediul agar 3aconcOe5 si geloza sange. e incubeaza placile aerob la *de grade si a 2a si se numara coloniile de la suprafata placilor.

Efectuati un frotiu din cultura.doc

Documents

Transcript of Efectuati un frotiu din cultura.doc