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Efecto del cobre y zinc en la comunidad microbiana del río Arkansas, Leadville, Colorado, Estados Unidos Shisbeth Danyra Tábora Sarmiento Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano Honduras Noviembre, 2017
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Efecto del cobre y zinc en la comunidad
microbiana del río Arkansas, Leadville,
Colorado, Estados Unidos
Shisbeth Danyra Tábora Sarmiento
Escuela Agrícola Panamericana, Zamorano
Honduras Noviembre, 2017
i
ZAMORANO
CARRERA DE AMBIENTE Y DESARROLLO
Efecto del cobre y zinc en la comunidad
microbiana del río Arkansas, Leadville,
Colorado, Estados Unidos
Proyecto especial de graduación presentado como requisito parcial para optar
al título de Ingeniera en Ambiente y Desarrollo en el
Grado Académico de Licenciatura
Presentado por
Shisbeth Danyra Tábora Sarmiento
Zamorano, Honduras Noviembre, 2017
iii
Efecto del cobre y zinc en la comunidad microbiana del río Arkansas, Leadville,
Colorado, Estados Unidos
Shisbeth Danyra Tábora Sarmiento
Resumen. Una de las actividades más contaminantes de cuerpos de agua es el drenaje ácido
de minas, el cual resulta en elementos tóxicos, como metales a fuentes de agua. El cobre y
zinc son metales pesados que, en altas concentraciones, pueden tener alta toxicidad para los
ecosistemas acuáticos. Las bacterias son de los primeros organismos afectados por la
presencia de metales pesados. El objetivo del estudio fue determinar el efecto del cobre y
zinc en la comunidad microbiana del río Arkansas. Se determinó el efecto de estos metales
en el número de bacterias provenientes de este río y se crearon perfiles de resistencia
bacteriana hacia el cobre, zinc y a ambos metales. Adicionalmente, se realizó un análisis de
Reacción en Cadena Polimerasa (PCR) para identificar bacterias encontradas en las
muestras e identificar genes de resistencia hacia el cobre y zinc. Se realizó un Análisis de
Varianza (ANDEVA) y una prueba post hoc de Duncan para comparar los efectos de los
metales en el comportamiento de las bacterias. Los resultados demuestran que las
concentraciones de metales pesados tienen un efecto inhibitorio en el crecimiento de
bacterias. El cobre fue el metal con mayor toxicidad, la cual aumentó al agregarle zinc al
medio. Se encontró diferencias significativas (P<0.05) en el número de bacterias entre
sitios, siendo la fuente de contaminación el sitio con mayor número de bacterias resistentes.
De acuerdo a los perfiles de resistencia, se encontraron dos bacterias resistentes al cobre y
una bacteria con un gen de resistencia al zinc (CzCc).
Palabras clave: Bacterias, metales pesados, minería, PCR, resistencia.
Abstract. One of the most pollutant activities to water bodies is acid mine drainage, which
results in toxic elements, like metals in water sources. Copper and zinc are heavy metals
that, in higher concentrations, could have high toxicity to aquatic ecosystems. Because they
accumulate in the sediments, bacteria are one of the first organisms to be affected by its
presence. The purpose of this study is to determine the effect of copper and zinc in the
microbial community of the Arkansas River, in Leadville, Colorado. The effect of copper
and zinc in the number of bacteria from this river was determined and resistance profiles to
copper and zinc were created. Also, this study includes Polymerase Chain Reaction (PCR)
analysis to identify the bacteria found in the samples and to identify the metal resistance
genes. An Analysis of Variance (ANOVA) and a post hoc test of Duncan was used to
compare the effect of metals on the behavior of bacteria. The results show that heavy metal
concentrations had an inhibitory effect on bacteria growth. Copper was the metal with
higher toxicity and it increased when adding zinc to the media. Significant differences were
found between sites (P<0.05). The tributary with high concentrations of heavy metals was
the site with higher number of resistant bacteria. Resistance to copper was found in two
strains and a resistance gene for zinc (CzCc) was also found.
Key words: Bacteria, heavy metals, mining, PCR, resistance.
iv
CONTENIDO
Portadilla…………………………………………………………………… i
Página de firmas……………………………………………………………. ii
Resumen……………………………………………………………………. iii
Contenido…………………………………………………………………... iv
Índice de Cuadros, Figuras y Anexos………………………………………. v
1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1
2. METODOLOGÍA ....................................................................................... 5
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 11
4. CONCLUSIONES ....................................................................................... 22
5. RECOMENDACIONES ............................................................................. 23
6. LITERATURA CITADA ............................................................................ 24
7. ANEXOS ...................................................................................................... 29
v
ÍNDICE DE CUADROS, FIGURAS Y ANEXOS
Cuadros Página
1. Cebadores utilizados en el análisis de PCR ..................................................... 9 2. Parámetros fisicoquímicos ............................................................................... 11
3. Unidades formadoras de colonia (UFC/mL) en medio agar R2A diluido (DR2A), diferentes concentraciones de metales y sitio de muestreo del río
Arkansas. ......................................................................................................... 12
4. Unidades formadoras de colonia (UFC/ml) en medio basal microbiológico (BMM), diferentes concentraciones de metales y sitios de muestreo del río
Arkansas. ......................................................................................................... 12
5. Prueba de Kruskal-Wallis para concentración de metales en medio DR2A ... 13 6. Comparación de medias por concentración de metales en medio DR2A ....... 13
7. Análisis de Varianza con dos factores para los UFC/mL del medio BMM .... 14 8. Comparación de medias por sitio en medio BMM .......................................... 14 9. Comparación de medias por concentración de metales en medio BMM ........ 15
10. Bacterias resistentes identificadas ................................................................... 15
Figuras Página
1. Mapa del río Arkansas, Estados Unidos .......................................................... 6
2. Localización de los sitios de muestreo en el río Arkansas, Leadville, Colorado. ......................................................................................................... 7
3. Diseño experimental del estudio ..................................................................... 8 4. Crecimiento de bacteria ST21, proveniente de medio DR2A sitio AR1,
inoculada en medios líquidos DR2B con metales y sin metales ..................... 16 5. Crecimiento de Sphingobacterium, proveniente de medio DR2A + Cu sitio
AR1, inoculada en medios líquidos con metales y sin metales ....................... 17
6. Crecimiento de bacterias en medio líquido DR2B + Cu ................................. 18 7. Crecimiento de bacterias en caldo DR2B + Cu + Zn ...................................... 19 8. Gel de electroforesis para genes resistentes .................................................... 20 9. Gel de electroforesis de Sphingomonas con primer CzCc .............................. 21
vi
Anexos Página
1. Bacteria ST152, proveniente de medio DR2A, sitio AR5 inoculada en
caldo DR2B con y sin cobre y zinc. .................................................................. 29 2. Bacteria ST244, proveniente de medio DR2A + Zn, sitio AR5 inoculada en
caldo DR2B con y sin cobre y zinc. .................................................................. 30 3. Bacteria ST547, proveniente de medio DR2A + Cu, sitio CG inoculada en
caldo DR2B con y sin cobre y zinc. .................................................................. 30
4. Bacteria ST486, proveniente de medio DR2A + Cu + Zn, sitio CG inoculada en caldo DR2B con y sin cobre y zinc. ............................................................. 31
5. Bacteria ST300, proveniente de medio DR2A, sitio CG inoculada en caldo DR2B con y sin cobre y zinc. ............................................................................ 31
6. Crecimiento de bacterias en caldo DR2B. ......................................................... 32 7. Crecimiento de bacterias en caldo DR2B con presencia zinc. .......................... 32 8. Prueba de normalidad de Shapiro-Wilk para número de bacterias en el
medio DR2A. ..................................................................................................... 33
9. Prueba de homogeneidad de la varianza en número de bacterias en medio DR2A. ................................................................................................................ 33
10. Prueba de Kruskal-Wallis para número de bacterias entre sitios, en medio
DR2A. ................................................................................................................ 33 11. Comparación de medias de número de bacterias en medio DR2A con
concentraciones de metales. .............................................................................. 34 12. Comparación de medias por sitio en medio DR2A. .......................................... 34 13. Prueba de normalidad de Shapiro-Wilk para los sitios en medio BMM. .......... 34
14. Protocolo para elaboración de un litro de medio agar R2A. ............................. 34
15. Protocolo para elaboración de un litro de medio BMM. ................................... 35 16. Componentes para un análisis de PCR. ............................................................. 35 17. Bacterias en medio DR2A y BMM sin metales, provenientes de AR5. ............ 35
18. Bacterias en medio DR2A y BMM con cobre, provenientes de AR5. .............. 36 19. Bacterias en medio DR2A y BMM con zinc, provenientes de AR5. ................ 36
20. Bacterias en medio DR2A y BMM con cobre y zinc, provenientes de AR5. ... 36
1
1. INTRODUCCIÓN
El agua es un recurso indispensable para cualquier organismo vivo, sin embargo, a pesar de
ser un componente fundamental para el funcionamiento de la Tierra, su disponibilidad es
limitada. La distribución del agua disponible en el mundo es de 1,386 millones de km3, de
los cuales aproximadamente el 97% es agua salada y el resto es agua dulce. Del 3% de agua
dulce disponible, aproximadamente 70% se encuentra en los glaciares (Comisión Nacional
del Agua [CONAGUA], s.f.). El agua, además de ser indispensable para sobrevivir, también
es un componente crucial para la economía a nivel mundial, ya que es un requerimiento
para la producción agrícola e industrial.
La contaminación del agua es uno de los grandes problemas que limita el acceso a agua y
el deterioro de ecosistemas. Muchos países están estancados económicamente debido al
incremento de enfermedades por deficiente calidad de agua e inadecuado manejo del
recurso (Academia Nacional de Ciencias, 2007). Asimismo, a este problema se le suma el
crecimiento poblacional exponencial que se está experimentando. Para el año 2014, la
población era de 7,200 millones de habitantes y con la elevada tasa de crecimiento
demográfico se prevé que para el 2025 la población mundial sea de 8,100 millones de
habitantes y 9,600 millones para el 2050 (Naciones Unidas, 2014).
La contaminación de los ríos se origina de diferentes actividades humanas, entre ellas la
minería, industria alimentaria, actividades agrícolas o forestales, entre otras actividades. La
contaminación de los ríos afecta las actividades económicas como el turismo, la pesca y la
recreación. Asimismo, esta contaminación también afecta a la salud de las personas cuando
utilizan el agua contaminada para consumo humano o incluso cuando se ingieren mariscos
provenientes de aguas contaminadas. Debido a la contaminación del agua, no solamente
seres humanos son afectados, también animales, plantas y microorganismos que consumen
el agua contaminada (Escobar, 2002).
La minería, a pesar de brindar muchos beneficios económicos, es una de las principales
industrias contaminantes. El drenaje ácido de minas es agua con pH menor a 5 proveniente
de los residuos de las minas. Este se da cuando el potencial ácido de los componentes es
mayor al potencial de neutralización de los mismos (Xu, Xie, Chen, Wang y Wu, 2008).
Para la generación de ácidos con altas concentraciones de metales se requiere de minerales,
agua o un ambiente húmedo y un agente oxidante, el cual en la mayoría de los casos es el
oxígeno (Akcil y Koldas, 2006). Cuando una mina está activa, este proceso no es de mucha
importancia, sin embargo en minas cerradas y abandonadas, el nivel freático puede
incrementar y causar una descarga de agua contaminada con ácidos y metales pesados
(Johnson y Hallberg, 2005).
2
El río Arkansas tiene 1,469 millas de largo, con su origen cerca de la ciudad de Leadville,
Colorado. Este río atraviesa cuatro Estados de Estados Unidos (Colorado, Kansas,
Oklahoma y Arkansas) hasta confluir con el río Mississippi. En Colorado, un área de 26,150
mi2 drenan este río. El río divide dos provincias fisiográficas, Great Plains al este y las
Montañas Rocosas al oeste. Una de las principales actividades recreativas en Colorado es
la pesca, lo cual aporta al sector económico, por lo que si se reduce la población de peces
debido a contaminación de los ríos, también se reducen los ingresos económicos. Debido a
su extensión y a la variedad de usos, el río Arkansas transporta muchos contaminantes (L.
Harrington y J. Harrington 2003).
El río Arkansas ha sido afectado por operaciones mineras en años anteriores, por lo cual se
han realizado muchos estudios acerca de la contaminación y calidad de su agua (Clements
y Kiffney, 1994). Solamente en Colorado, 230 minas continúan drenando ácidos y metales
pesados, contaminando 1,645 millas de flujo de agua en los ríos y arroyos del Estado,
incluyendo segmentos del río Arkansas (Finley, 2015). Se realizó un programa de 17 años
para la restauración de la calidad del río y se evaluó la efectividad de diferentes actividades
como reforestación y plantas de tratamiento de agua. Estudios posteriores mostraron que
aún se encuentran elevadas concentraciones de algunos metales que afectan los ecosistemas
acuáticos (Clements, Vieira y Church, 2010).
La biomagnificación es la acumulación de nutrientes u otros elementos en diferentes niveles
de la cadena trófica. Este término es de suma importancia cuando se habla de contaminación
de ríos, ya que entre los diferentes niveles están las plantas, microrganismos, animales y
humanos. Cada ser vivo responde de manera diferente a cada contaminante, sin embargo
niveles superiores en la cadena trófica pueden bioacumular más que organismos en niveles
inferiores (Plata, Campos y Ramírez, 1993).
Los metales pesados conforman un grupo de alrededor de 40 elementos en la tabla
periódica. Dentro del grupo de los metales más tóxicos se encuentran el mercurio (Hg),
cobalto (Co), cadmio (Cd), cobre (Cu), cromo (Cr), zinc (Zn), plomo (Pb) y níquel (Ni)
(Hassen, Saidi, Cherif y Boudabous, 1998). Los metales pesados tienen una alta movilidad
en ecosistemas acuáticos, incluyendo macro y microorganismos. Debido a que los metales
no son biológicamente degradables, suelen acumularse en distintos niveles de la cadena
trófica (Villanueva y Botello, 1992). Es por ello que se le debe tomar importancia a las
alteraciones ecosistémicas que resulten en deposición de metales pesados a cuerpos de agua.
Los metales pesados pueden modificar la flora bacteriana y alterar las funciones de algunos
organismos vivos, incluso estos seres vivos pueden generar resistencia a los metales
pesados e incrementar la bioacumulación de ellos (Moraga, Merino y Mondaca, 2003). Las
bacterias son uno de los principales organismos que son objeto de estudio, ya que realizan
funciones vitales en los ecosistemas. Adicionalmente, las bacterias son microorganismos
que contienen grandes cantidades de carbono orgánico particulado, transfiriendo este
carbono a niveles superiores de la cadena alimenticia, como a peces y plantas (Artolozaga,
Ayo, Azúa, Unanue e Iriberry, 2010). Las bacterias producen polisacáridos que brindan
cohesión a las partículas del suelo, incrementando su capacidad de retener nutrientes para
el fitoplancton (Rosas, Cravioto y Escurra, 2004).
3
Todos los metales pesados, en diferentes concentraciones, tienen un efecto inhibitorio en el
crecimiento de las bacterias (Hassen et al., 1998). Existen dos causas de la resistencia de
metales en bacterias, la primera es cuando las bacterias han sido expuestas a estos
contaminantes por períodos prolongados de tiempo y generan un grado de tolerancia hacia
ellos mediante una transformación fisiológica. La segunda es cuando las bacterias
evolucionan genéticamente para obtener esta resistencia por selección natural de genes
resistentes (Klerks y Weis, 1987).
El estudio de microorganismos es muy complejo ya que ellos son muy influenciados por el
ambiente en el que habitan. No es lo mismo comparar el crecimiento microbiológico en
medios de crecimiento con condiciones controladas con el crecimiento microbiológico en
su medio natural. Al hablar del crecimiento microbiológico, existe una gran variedad de
medios de cultivo dependiendo del organismo que se quiere hacer crecer. Para que un
microorganismo crezca, este necesita alimentarse de nutrientes y otros elementos que le
brinden energía para realizar los ciclos celulares (Instructions Fetch Unit [IFU], s.f.).
Para la identificación de genes resistentes a metales pesados en bacterias, el método más
utilizado es el de Reacción en Cadena Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés),
amplificando el gen ARNr 16S de cada miembro de la comunidad microbiana seguido de
su secuenciación. Está técnica se caracteriza por ser eficiente y obtener resultados fáciles
de analizar (Tamay de Dios, Ibarra y Velasquillo, 2013). Mediante esta técnica, se amplifica
un fragmento del ADN de manera exponencial y se hacen réplicas de él (Rodríguez y
Rodríguez 2006). El PCR consiste en tres pasos, primero la desnaturalización, el
alineamiento de los primers o cebadores y finalmente la elongación mediante la enzima Taq
ADN polimerasa (Gonzáles, s.f.). La amplificación y secuenciación del gen ARNr 16S es
utilizado para hacer comparaciones filogenéticas entre organismos procariotas y su
identificación (Rodicio y Mendoza, 2004).
El límite permitido de concentración de Cu es de 0.02 mg/L para ecosistemas de agua dulce.
En cambio, el valor máximo permitido para Zn en ecosistemas de agua dulce es de 1 mg/L
(Schneider, 1971). Según la Agencia de Protección Ambiental (EPA) (2002), la toxicidad
de los metales pesados depende de la dureza expresada como carbonatos de calcio (CaCO3).
Para concentraciones de dureza de 50, 100 y 200 mg/L, la concentración de zinc no debe
exceder los 180, 320 y 570 µg/L respectivamente (EPA, 2002). En cambio, para
concentraciones de dureza de 50, 100 y 200 mg/L, la concentración de cobre no debe
exceder los 12, 22 y 43 µg/L respectivamente (EPA, 1980). Un estudio realizado sobre
metales pesados en el río Arkansas en Colorado, muestra concentraciones de Zn en un rango
de 1 – 1,000 µg/L y de 0.1 – 15 µg/L con respecto al Cu. Ese mismo estudio también midió
metales en el sitio de origen, California Gulch, y se encontraron concentraciones de hasta
1,300 mg/L de Cu y 14,000 de Zn (Kimball, Callender, y Axtmann, 1995).
Con el fin de evaluar los impactos de la minería metálica en ecosistemas acuáticos del Río
Arkansas, esta investigación contó con los siguientes objetivos:
Determinar el efecto de metales pesados en el número de bacterias presentes en el río
Arkansas.
Comparar la toxicidad del cobre, zinc y su interacción de acuerdo al efecto inhibitorio
en el crecimiento de bacterias.
4
Comparar el crecimiento bacteriano entre los sitios aguas arriba, fuente de
contaminación y aguas abajo.
Caracterizar la resistencia de las bacterias hacia los metales pesados.
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2. MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación.
El estudio se realizó en el río Arkansas, Leadville, Colorado, Estados Unidos (Figura 1).
Las muestras de agua y sedimentos fueron tomadas a finales de invierno, el día 20 de marzo
de 2017. Se muestrearon tres sitios diferentes del río Arkansas, aguas arriba; Arkansas River
1 (AR1), aguas abajo; Arkansas River 5 (AR5) y California Gulch (CG) como tributario de
metales pesados provenientes de viejas minas. (Figura 2). El sitio AR1 se encuentra
localizado previo a la contaminación por metales pesados provenientes del sitio CG y se
tomó como el área de control. AR5 está localizado después de CG y se tomó como el área
impactada. Se tomaron tres muestras de agua con sedimentos en cada sitio, para así tener
tres réplicas de los tres diferentes sitios. Las muestras fueron tomadas con intervalos de
cinco minutos entre cada muestra por sitio.
Las muestras fueron colectadas en tubos cónicos de plástico y transportadas en hielo hacia
el Laboratorio de Ecología y Recursos Naturales (NREL) de la Universidad Estatal de
Colorado, Fort Collins, Colorado, donde se almacenaron en un cuarto frío a 4 °C hasta el
momento de inocular las bacterias en los medios de crecimiento. Se midieron las
concentraciones de metales con ayuda de un espectrómetro, la temperatura y el pH se
midieron directamente con un multiparámetro y la dureza se midió en laboratorio. El caudal
se midió mediante un aforo con molinete.
6
Figura 1. Mapa del río Arkansas, Estados Unidos.
Fuente: Houk et al. (2006).
7
Preparación de medios de crecimiento.
Los medios de crecimiento utilizados fueron: (1) Medio Basal Microbiológico (BMM por
sus siglas en inglés), el cual es utilizado para inocular bacterias de agua dulce, pues provee
un medio de crecimiento con la combinación apropiada de diferentes componentes como
carbono y energía (Tanner, 2007) y (2) medio agar R2A, el cual está diseñado para inocular
bacterias en agua potable. El medio agar R2A se utilizó en forma diluida (DR2A por sus
siglas en inglés) para proveer un ambiente más oligotrófico. Adicionalmente, se agregaron
los metales cobre y zinc en forma de sulfatos, CuSO4 y ZnSO4 respectivamente, a los
medios para que solamente las bacterias con genes resistentes pudieran crecer. Se
inocularon muestras en platos Petri solamente con BMM y DR2A como control, solamente
cobre, zinc y finalmente la combinación de ambos, cobre y zinc. Estas combinaciones se
realizarán con el motivo de obtener las bacterias resistentes solamente al cobre, solamente
al zinc y las bacterias resistentes a ambos metales.
Estudios preliminares con diferentes concentraciones de metales fueron realizados en el
mes de enero y febrero de 2017 en Fort Collins, Colorado. Se probó con 25 ppb para Cu y
650 ppb para Zn con agua de un arroyo cerca de la Universidad Estatal de Colorado llamado
Spring Creek, pero el crecimiento de las bacterias era el mismo en los platos Petri con
metales y sin metales, por lo que se decidió probar con concentraciones más altas. Se
realizaron ensayos preliminares con Cu a 25 ppm y Zn a 650 ppm. En este caso, la
concentración de Cu fue muy baja pero la de Zn muy alta. Se realizaron pruebas con ambos
metales a 200 ppm, pero no se encontró crecimiento alguno. Seguidamente se realizaron
pruebas con ambos metales a 100 ppm, pero los resultados fueron igual que con 200 ppm.
Finalmente se probó Cu a 25 y 50 ppm y Zn a 150, 100, 50 y 25 ppm. De acuerdo al conteo
Figura 2. Localización de los sitios de muestreo en el río Arkansas, Leadville, Colorado.
Adaptado de Clements et al. (2010).
AR1 = Arkansas 1
CG = California Gulch
AR5 = Arkansas 5
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de UFC/mL se decidió utilizar concentraciones de Cu y Zn a 50 ppm ambos metales. Los
metales en estas concentraciones inhiben el crecimiento de bacterias, sin embargo, bacterias
resistentes pueden crecer en los platos Petri.
Después de optimizar las concentraciones de metales y comprobar que las concentraciones
fueran las adecuadas para el estudio, se realizaron ensayos previos con agua y sedimentos
de dos ríos de la ciudad Fort Collins, Colorado, Cache la Poudre y El Dorado. Se realizó un
Análisis de Varianza (ANDEVA) con nivel de significancia del 5% y se demostró que
ambos ríos no son significativamente diferentes en cuanto al crecimiento bacteriano. El
crecimiento de bacterias fue similar en ambos ríos y cuando se agregaron los metales, las
poblaciones de ambos ríos decrecieron, ya que ambos ríos son considerados saludables y
expuestos a las mismas condiciones. De acuerdo a los resultados obtenidos de los ensayos
preliminares, se decidieron las concentraciones a utilizar en el estudio. En cuanto a la
replicabilidad de los ensayos en el río Arkansas, se esperaba que el crecimiento de bacterias
aguas arriba fuera similar a estos dos ríos, Cache la Poudre y El Dorado, ya que es la zona
no impactada por contaminación por metales pesados y se esperaba encontrar diferencias
significativas aguas abajo por ser la zona impactada.
Diseño experimental.
El estudio se desarrolló en diseño factorial de bloques completos al azar con un arreglo de
3 x 3 x 4, donde los bloques fueron los sitios y los factores fueron: sitio (AR1, AR5 y CG),
réplica (1, 2 y 3) y concentración de metales (control, Cu, Zn y Cu + Zn) en dos diferentes
medios de cultivo, BMM y Agar DR2A. Adicionalmente, se contó con ocho diluciones en
serie (100 – 10-7) en cada medio con concentraciones de metales. Para esto se prepararon
576 platos Petri, tomando en cuenta los tres sitios, las tres réplicas por sitio, los ocho
tratamientos y ocho diluciones en serie (Figura 3).
Inoculación y cuantificación de la comunidad microbiana.
Se realizaron ocho diluciones en serie de cada muestra de agua colectada en los diferentes
sitios, con el fin de obtener un número de bacterias posibles de contar (30-300 UFC).
Tomando 100 μL de la cada dilución se inocularon las muestras en platos Petri con los
Figura 3. Diseño experimental del estudio.
BMM = Medio Basal Microbiológico.
DR2A = Agar R2A en forma diluida.
100 – 10-7 100 – 10-7 100 – 10-7 100 – 10-7
100 – 10-7 100 – 10-7 100 – 10-7 100 – 10-7
9
medios de crecimiento previamente descritos. Después de dos semanas se realizó el primer
conteo de bacterias que pudieron crecer en diferentes condiciones. Se realizaron conteos de
bacterias los lunes de cada semana, durante cuatro semanas. Las muestras fueron incubadas
a 20 °C durante toda la investigación (Kalmbach, Manz, Werner y Szewzyk, 1997).
Identificación de bacterias resistentes.
Se realizó análisis de PCR para identificar las bacterias con alguna resistencia al cobre, al
zinc o a ambos metales. Para su preparación, se agregó una pre mezcla de GoTaq Green
que contiene una enzima Taq polimerasa, dNTPs, MgCl2 y buffers. Seguido de realizar la
mezcla de GoTaq Green, se tomó 10 µL de ella para cada bacteria a secuenciar, 1 µL de
cada cebador (27F y 1492R), 8 µL de agua molecular y finalmente una alícuota de la
bacteria, es decir, con ayuda de la punta de una pipeta se tomó una colonia y se colocó
dentro de la mezcla. Se dejaron las muestras en el termociclador, el cual realizó el proceso
con un inicio a 95 °C por 10 minutos, con el objetivo de activar por calor las polimerasas,
luego la desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, alineamiento a 55 °C y la extensión a
72 °C por 10 minutos, este proceso se realizó en 30 ciclos. Luego, se confirmó la presencia
de la banda para secuenciar e identificar las bacterias. Para este proceso, se preparó un gel
con 1% de agarosa y se realizó una electroforesis para medir el fragmento de ADN
amplificado, con ayuda de una escalera llamada “GenRuler” y rayos UV (Bhakta,
Munekage, Ohnishi, Jana y Balcazar, 2014).
Determinación de perfiles de resistencia y genes resistentes a metales.
Utilizando una placa de microtitulación de 96 pocillos y un lector de plato fluorescente, se
crearon gráficas y perfiles de resistencia de nueve bacterias, de diferente proveniencia, en
diferentes tipos de medio con concentraciones de metales en cortos períodos de tiempo.
Con esto se determinó qué bacterias o grupo de bacterias son resistentes y su desarrollo con
y sin metales. Con estas poblaciones, utilizando PCR y añadiendo cebadores para los genes
resistentes ya identificados (CopA y CzCc para cobre y zinc respectivamente), se determinó
qué gen resistente es responsable de la resistencia de las bacterias (Silver y Walderhaug,
1992) (Cuadro 1).
Cuadro 1. Cebadores utilizados en el análisis de PCR.
Nombre Secuencia (5'- 3')
Tamaño
(pb) Referencia
27F
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1500
(Morillo y Miño,
2011)
1492R
ACGGCTACCTTGTTACGACTT
1500
(Morillo y Miño,
2011)
CopA GGGCAGCGCTTACTGGTAGGCTCAC 1200 (Altamira, 2010)
CzCc GGTCAGCATCGGCAGCAAGTACG 1200 (Perron et al., 2004)
10
Análisis estadístico.
A las variables de sitio y medios de cultivo se les aplicó el test de Shapiro-Wilk para conocer
la normalidad de los datos y el test de Levene para conocer la homocedasticidad de varianza.
Para aquellos datos cuya distribución no fue normal, se realizó una prueba no paramétrica
de Kruskal-Wallis con un nivel de significancia de 0.05. Para datos con distribución normal
se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) con un modelo lineal generalizado (GLM,
por sus siglas en inglés) de dos factores y una prueba post hoc de Duncan con un nivel de
significancia de 0.05. Se utilizó el programa “IBM SPSS Versión 19.0” para el análisis
estadístico de los datos obtenidos.
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3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Parámetros fisicoquímicos.
Los parámetros físicos y químicos medidos en los tres sitios de muestro en el río Arkansas
(AR1, AR5 y CG) fueron pH, temperatura, dureza, conductividad eléctrica y caudal. Una
muestra por sitio fue tomada para determinar la concentración de zinc en laboratorio y los
valores reportados para cobre son valores históricos. El cuadro 2 presenta los resultados de
los parámetros físicos y químicos del agua del río Arkansas.
Cuadro 2. Parámetros fisicoquímicos de los sitios de muestreo seleccionados, Arkansas 1,
Arkansas 5 y California Gulch.
&Sin datos.
Fuente: Kimball et al. (1995).
El pH se encontró en un rango de 8.26 – 8.10. La temperatura se encontró en un rango de 3
– 4.3 °C debido a encontrarse en época de invierno. En cuanto a dureza, en los sitios AR1
y AR5 fue de 112 y 114 mg/L respectivamente, en cambio en CG, la dureza encontrada fue
de 699 mg/L. Los valores de dureza han incrementado desde el 2010, los cuales eran valores
de 77.9 mg/L en AR1 y 84.9 mg/L en AR5 (Clements et al., 2010). La dureza es un
parámetro de importancia al hablar de metales pesados, ya que al incrementar la dureza,
disminuye la toxicidad de los metales (EPA, 2002). De acuerdo a la dureza y su relación
con los metales pesados, todos los valores encontrados se encuentran bajo la normativa. Los
valores de zinc fueron medidos en el laboratorio de la Universidad Estatal de Colorado, sin
embargo, no se logró determinar las concentraciones actuales de cobre en el río Arkansas,
por lo que se decidió utilizar los valores encontrados en estudios previos.
La contaminación por metales pesados provenientes de drenaje de minas suele persistir y
ser transferidos a ecosistemas acuáticos, incluso hasta 100 años después del cierre de la
mina (Merrington y Alloway, 1994). Johnson y Thornton (1987), en su estudio sobre los
factores hidrológicos y químicos que controlan las concentraciones de metales pesados en
Sitio Zn
(µg/L)
Cu
(µg/L)
Dureza
(mg/L) pH
Conductividad
Eléctrica
(µS/cm)
Temperatura
(°C)
Caudal
(m3)
AR1 21.5 0.1-15 112 8.26 231.7 3.1 0.174
AR5 139.8 & 114 8.86 267.5 3.1 0.678
CG 604.5 1,300 699 8.10 1315 4.3 0.578
12
un río contaminado por drenaje acido de minas encontraron que las concentraciones de Cu
y Zn son directamente proporcionales al caudal (Johnson y Thornton, 1987).
Cuantificación de la comunidad microbiana.
El cuadro 3 presenta el conteo de bacterias en UFC/mL en el medio DR2A con los
tratamientos, DR2A, DR2A + Cu, DR2A + Zn y DR2A + Cu + Zn; expresados en forma
logarítmica después de los cuatro conteos. Se promedió el número de bacterias encontradas
en las ocho diluciones, para los ocho tratamientos en todas las réplicas y los sitios.
Cuadro 3. Unidades formadoras de colonia (Log10 UFC/mL) en medio agar R2A diluido
(DR2A), diferentes concentraciones de metales y sitio de muestreo del río Arkansas.
Medio
AR1 AR5 CG
1 2 3 1 2 3 1 2 2
DR2A 5.56 5.73 5.04 5.26 5.98 5.23 5.67 6.70 5.29
DR2A + Cu 1.36 1.06 0.81 0.93 1.26 0.74 1.63 2.52 1.30
DR2A + Zn 4.13 4.06 3.47 3.60 4.52 3.41 4.68 5.63 4.40
DR2A + Cu
+Zn 1.79 0.78 1.04 1.33 1.52 0.85 1.26 1.97 1.60
En el cuadro 4 se presenta el conteo de bacterias en UFC/mL en el medio BMM con los
tratamientos, BMM, BMM + Cu, BMM + Zn y BMM + Cu + Zn; expresados en forma
logarítmica.
Cuadro 4. Unidades formadoras de colonia (Log10 UFC/ml) en medio basal microbiológico
(BMM), diferentes concentraciones de metales y sitios de muestreo del río Arkansas.
Medio
AR1 AR5 CG
1 2 3 1 2 3 1 2 3
BMM 6.12 5.36 5.40 5.38 5.32 5.33 3.94 6.37 5.69
BMM + Cu 2.48 2.32 1.58 2.05 2.47 1.91 3.14 3.65 2.44
BMM + Zn 3.25 3.04 3.19 2.81 3.31 3.06 3.60 5.53 4.11
BMM + Cu
+Zn 1.36 1.64 1.18 2.34 2.03 0.90 1.85 3.23 1.90
13
Todos los datos obtenidos fueron transformados a escala logarítmica y se aplicó un test de
normalidad de Shapiro-Wilk y un test de homocedasticidad de Levene. Para el medio DR2A
no se encontró una distribución normal, por lo tanto se realizó una prueba no paramétrica
de Kruskal-Wallis. La prueba mostró diferencias significativas en los medios de cultivo con
diferentes concentraciones de metales (Cuadro 5). Sin embargo, en la prueba de Kruskal-
Wallis para los sitios, no se encontró diferencias significativas. Este resultado pudo haber
sido obtenido debido al tipo de medio utilizado, DR2A, ya que provee un ambiente
oligotrófico para el crecimiento de bacterias. En cambio, para el medio BMM si se encontró
diferencias significativas entre los sitios de muestreo (Cuadro 7).
Cuadro 5. Prueba de Kruskal-Wallis para crecimiento de bacterias en medio DR2A con
concentraciones de Cu y Zn.
Parámetros UFC/mL
Chi-cuadrado 28.869
Significancia 0.000
Al encontrar diferencias significativas entre los medios de cultivo con metales pesados, se
procedió a realizar una prueba de medias. El medio de control, DR2A sin metales pesados,
obtuvo la media más alta. Esto debido a que los metales pesados tienen un efecto inhibitorio
en las bacterias. Asimismo, el medio con zinc obtuvo la segunda media más alta (Cuadro
6). Esto concuerda con el estudio de Hassen et al. (1998), en el cual muestran que zinc tiene
menor toxicidad y efecto inhibitorio en bacterias en comparación con el cobre.
Cuadro 6. Comparación de medias para crecimiento de bacterias en medio DR2A con
concentraciones de Cu y Zn.
Medio Media Desviación típica
DR2A 5.6067 A .50540
DR2A + Cu 1.2910 C .54301
DR2A + Zn 4.2104 B .70332
DR2A + Cu + Zn 1.3324 C .40350 ABCLetras diferentes indican diferencias significativas de acuerdo a la prueba post hoc de
Duncan.
Debido a que los datos obtenidos del medio BMM siguieron una distribución normal
mediante el test de Shapiro-Wilk (P>0.05), se realizó un análisis de varianza (ANDEVA)
de dos factores con un nivel de significancia del 5% (P<0.05). Se encontró diferencias
significativas entre sitios y entre medios (P<0.05), sin embargo no se encontró diferencias
en su interacción (P<0.05). El coeficiente de determinación (R2) fue alto (88.6%),
expresando que los datos se ajustaron bien al modelo lineal, es decir, los factores explican
un 88.6% la variación con respecto al número de bacterias. El R2 también indica que se
14
controló muy bien el error experimental al momento de tomar los datos (Cuadro 7). Después
de encontrar diferencias significativas, se realizó una prueba post hoc de Duncan.
Cuadro 7. Análisis de varianza con dos factores para los UFC/mL del medio BMM.
Origen F Significancia
Modelo corregido 17.023 .000
Intersección 996.107 .000
Medio 56.810 .000
Sitio 5.096 .014
Interacción 1.105 .388
R cuadrado = .886 (R cuadrado corregida = .834).
El sitio con la media más alta, de acuerdo a la prueba post hoc de Duncan, fue California
Gulch (CG) (Cuadro 8), esto puede relacionarse con bacterias resistentes a los metales
presentes en dicho sitio, tributario del río Arkansas. Las bacterias, al estar en presencia de
metales por períodos prolongados, se exponen a una selección de genes capaces de resistir
a estos contaminantes (Silver y Walderhaug, 1992).
Cuadro 8. Comparación de medias del crecimiento de bacterias por sitio de muestreo en
medio BMM con concentraciones de Cu y Zn.
Sitio Media Desviación típica
AR1 3.07 B 1.69
AR5 3.07 B 1.49
CG 3.78 A 1.45 AB Letras diferentes indican diferencias significativas de acuerdo a la prueba post hoc de
Duncan.
De acuerdo a la prueba post hoc de Duncan, el medio de cultivo con mayor número de
bacterias fue el medio BMM sin metales pesados. Con base en estos resultados se puede
decir que los metales si tuvieron un efecto inhibitorio en el crecimiento de las bacterias
(Cuadro 9). Como mencionan Hassen et al. (1998), en su estudio sobre la resistencia de las
bacterias hacia metales pesados, todos los metales pesados, generalmente tienen un efecto
inhibitorio en las bacterias (Hassen et al., 1998). En los tratamientos, el cobre presentó
mayor toxicidad en comparación con el zinc. Esto debido a que, según Akinbowale et al.
(2007), el cobre tiene menor concentración mínima inhibitoria (MIC, por sus siglas en
inglés) que el zinc. Según Gaete y Chávez (2008), el cobre y zinc pueden presentar sinergia,
adición o antagonismo en diferentes concentraciones. Para concentraciones de 1:1 en ambos
metales, mostraron que se presentan como aditivos. Es decir, que el cobre y zinc en las
mismas concentraciones se comportan de manera individual, aún en la mezcla de ambos.
15
Sin embargo, en el presente estudio se buscó determinar las bacterias resistentes a cobre,
zinc y aquellas resistentes a ambos metales.
Cuadro 9. Comparación de medias del crecimiento de bacterias en medio BMM con
concentración de metales.
Medio Media Desviación típica
BBM 5.4351 A .67678
BBM + Zn 3.5455 B .83480
BBM + Cu 2.4498 C .62829
BBM + Cu + Zn 1.8253 D .68962
ABCD Letras diferentes indican diferencias significativas de acuerdo a la prueba post hoc de
Duncan.
Bacterias resistentes identificadas.
Con el análisis de PCR se identificaron tres géneros de bacterias resistentes a cobre y zinc,
Sphingomonas, Luteibacter y Sphingobacterium. En el cuadro 10 se describen las bacterias
resistentes encontradas y sus características.
Cuadro 10. Bacterias resistentes identificadas.
Género Gram Características Referencia
Sphingomonas
(ST244)
[-] Estrictamente aerobia,
monoflagelados con pigmentación
amarilla, relacionada con plantas y
no se ve afectada por ZnCl2.
(White, Sutton y
Ringelberg,
1996)
Luteibacter
(ST486)
[-] Aerobia, monoflagelado con
pigmentación amarilla, pertenece a
la familia Xanthomondaceae y está
relacionada con suelo o rizósfera.
(Johansen,
Binnerup, Kroer
y Molbak, 2005)
Sphingobacterium
(ST536)
[-] Aerobia, pigmentación amarilla,
usualmente encontrada en suelo,
agua estancada o vegetación.
(Gupta, Logan,
Elhag y Almond,
2016)
Perfiles de resistencia.
En cuanto al comportamiento, en la mayoría de los casos las bacterias tienen un crecimiento
similar con medios sin presencia de metales. Debido a que las bacterias fueron tomadas de
los platos Petri con concentraciones de cobre y zinc, algunas bacterias provenientes de
platos Petri con medio con cobre o zinc presentan un crecimiento normal al inocularse en
16
caldos con cobre o zinc. Esto se puede relacionar con la realidad del río Arkansas, bacterias
y otros organismos pueden generar resistencia a metales pesados.
Al inocularse en caldos DR2B, DR2B + Zn, DR2B + Cu y DR2B + Cu + Zn, la bacteria ST
121 mostró un comportamiento normal en el medio sin presencia de metales. Sin embargo,
al agregar los metales, la bacteria no tuvo crecimiento alguno (Figura 4).
Figura 4. Crecimiento de bacteria ST21, proveniente de medio DR2A sitio AR1, inoculada
en medios líquidos DR2B con metales y sin metales.
El género Sphingobacterium proviene de AR5 e inoculada previamente en plato Petri con
medio DR2A + Cu. Al inocularse en medio líquido, DR2B con cobre, zinc y cobre y zinc,
la bacteria presenta crecimiento normal sin presencia de metales y con presencia de cobre.
La bacteria pudo haber generado cierta resistencia hacia el cobre debido a su crecimiento
normal en presencia de dicho metal. En cambio, no hubo crecimiento en presencia de zinc,
sin embargo en presencia de cobre y zinc su crecimiento fue poco, pero mayor en
comparación con solamente zinc (Figura 5).
0.090
0.095
0.100
0.105
0.110
0.115
0.120
5 7 9 11 13 15 17 19
Ab
sorb
an
cia
Tiempo (h)
DR2B
Zn
Cu
Cu + Zn
17
Figura 5. Crecimiento de Sphingobacterium, proveniente de medio DR2A + Cu sitio AR1,
inoculada en medios líquidos con metales y sin metales.
0.08
0.09
0.10
0.11
0.12
0.13
0.14
0.15
0.16
0.17
0.18
0 10 20 30 40 50 60
Ab
sorb
an
cia
Tiempo (h)
DR2B
Zn
Cu
Cu + Zn
18
El género Luteibacter, proveniente de CG e inoculada previamente en DR2A con cobre y
zinc, también desarrolló un comportamiento normal con presencia de cobre. Los géneros
Sphingobacterium y Luteibacter fueron los únicos de los seleccionados que lograron un
crecimiento en medios con presencia de cobre (Figura 6).
Figura 6. Crecimiento de bacterias en medio líquido DR2B + Cu.
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
0 10 20 30 40 50 60 70
Ab
sorb
an
cia
Tiempo (h)
ST21
ST124
ST536
ST152
ST244
ST300
ST395
ST486
ST547
19
En la figura 7 se muestra que a pesar del buen crecimiento del género Luteibacter en medio
con cobre, al agregar zinc se presenta un efecto inhibitorio en su crecimiento. Sin embargo,
el género Sphingobacterium sí tuvo un crecimiento en presencia de ambos metales.
Figura 7. Crecimiento de bacterias en caldo DR2B + Cu + Zn.
La toxicidad de los metales concuerda con el estudio realizado por Cabrera et al. (2006), en
el cual se utilizó CuSO4 y ZnSO4 para determinar la toxicidad de metales pesados en dos
diferentes bacterias. Este estudio muestra una relación inversa entre la población de
bacterias y el incremento de la concentración de metales (Cabrera, Pérez, Gómez, Abalos y
Cantero, 2006). Otro estudio donde se evaluó la toxicidad de metales pesados en insectos
acuáticos mostró que los insectos tienen una alta sensibilidad hacia los metales pesados y
el metal más tóxico es el cobre. Asimismo, los peces son incluso más sensible a estos
contaminantes (Warnick y Bell, 1969). Un estudio sobre la resistencia a metales pesados en
bacterias de la bahía de Iquique mostró 11 cepas con cierta resistencia hacia el cobre,
mayormente Pseudomonas (Moraga et al., 2003).
Genes de resistencia.
Una vez conocida la identidad de las nueve bacterias, se procedió a realizar un análisis de
PCR, pero esta vez con cebadores para genes resistentes ya conocidos. Los cebadores
utilizados fueron CopA para resistencia en cobre y CzCc para resistencia en zinc. Solamente
una de las cepas obtuvo la banda de amplificación con el cebador de Zinc, Sphingomonas
(ST244) proveniente de AR5, DR2A + Zn. Esto muestra que las Sphingomonas presentan
0.085
0.090
0.095
0.100
0.105
0.110
0.115
0 5 10 15 20
Ab
sorb
an
cia
Tiempo (h)
ST21ST124ST536ST152ST244ST300ST395ST486ST547
20
un gen de resistencia hacia el zinc (Figura 8). El cebador CzCc fue utilizado anteriormente
por Silver y Walderhaug (1992), en un estudio para evaluar la regulación genética de
plásmidos y cromosomas en el transporte de iones inorgánicos en bacterias, en el cual
encontraron bacterias sensibles a cadmio y cobalto, sin embargo todas las bacterias con el
gen CzCc fueron resistentes a zinc (Silver y Walderhaug, 1992). Las Sphingomonas son un
género de bacterias Gram negativo que no se ven afectadas por algunas sales, entre ellas el
ZnCl2 (White et al., 1996). Esta podría ser una razón por la cual se obtuvo un gen de
resistencia hacia el zinc en los ensayos realizados.
27F + CzCc
27F + CopA
ST21
ST124
ST536
ST152
ST244
ST300
ST395
ST486
ST547
ST21
ST124
ST536
ST152
ST244
ST300
ST395
ST486
ST547
Control (-)
1,500 bp
Figura 8. Gel de electroforesis para genes resistentes.
21
Para confirmar la presencia del gen resistente a zinc en Sphingomonas se realizó una
repetición del PCR solamente para Sphingomonas (ST244) y nuevamente se obtuvo la
banda de amplificación para dicho gen con el cebador CzCc (Figura 9).
ST244
Control
1,500 bp
Figura 9. Gel de electroforesis de Sphingomonas con primer CzCc.
22
4. CONCLUSIONES
Los metales pesados, cobre y zinc, tuvieron un efecto inhibitorio en el crecimiento de
bacterias. Sin embargo, las concentraciones de metales pesados en el río sí cumplen con
la normativa de la EPA en cuanto a la toxicidad de metales pesados en ecosistemas de
agua dulce.
El cobre a 50 mg/L fue el metal con mayor toxicidad y efecto inhibitorio en el número
de bacterias del río Arkansas en comparación con el zinc. La inhibición fue aún mayor
en los medios con presencia de ambos metales, cobre y zinc a 50 mg/L.
Sí se encontraron diferencias significativas en el número de bacterias entre los sitios,
aguas arriba (AR1), aguas abajo (AR5) y la fuente de contaminación (CG). El sitio CG
fue el sitio con mayor crecimiento de bacterias en medios con metales pesados, por lo
que la resistencia de bacterias hacia los metales pesados evaluados fue mayor en el sitio
donde se encuentran mayormente expuestas a estos contaminantes.
Los géneros Sphingobacterium y Luteibacter presentan una resistencia al cobre a 50
mg/L. Al agregar zinc a 50 mg/L solamente Sphingobacterium continúa con crecimiento
normal. Con respecto a los genes de resistencia determinados con análisis de PCR, el
género de las Sphingomonas muestra una banda del gen resistente a zinc, en cambio
Sphingobacterium y Luteibacter no presentaron ninguna banda en ninguno de los
cebadores para los metales evaluados en este estudio.
23
5. RECOMENDACIONES
Replicar el estudio en las épocas de verano, primavera y otoño para conocer la
variabilidad de bacterias y otros parámetros a lo largo del año. Debido a que muchos
microorganismos son fuertemente influenciados por el ambiente en el que viven, la
temperatura es un parámetro de importancia en su crecimiento. El tipo de bacterias
puede variar de acuerdo a la temperatura del agua y el nivel de estrés en el que se
encuentren.
Al replicar el estudio, evaluar también la adición, sinergia y antagonismo entre los
metales pesados. Puede ser que el cobre en presencia de zinc presente menor toxicidad
que solamente en medio con cobre y viceversa.
Tomar en cuenta un mayor número de bacterias para identificar genes de resistencia a
los metales. Por razones de tiempo, solamente se tomaron nueve especies en este
estudio.
Aumentar el número de repeticiones en la medición de parámetros fisicoquímicos para
poder realizar análisis estadísticos y comparaciones entre los sitios de estudio. Para
realizar análisis estadísticos se necesitan tres o más repeticiones, sin embargo en esta
investigación solo se tomó una medición de los parámetros fisicoquímicos por cada
sitio. Es importante analizar estadísticamente los datos encontrados para evitar
resultados subjetivos y poder respaldar la información brindada.
24
6. LITERATURA CITADA
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29
7. ANEXOS
Anexo 1. Bacteria ST152, proveniente de medio DR2A, sitio AR5 inoculada en caldo
DR2B con y sin cobre y zinc.
30
Anexo 2. Bacteria ST244, proveniente de medio DR2A + Zn, sitio AR5 inoculada en caldo
DR2B con y sin cobre y zinc.
Anexo 3. Bacteria ST547, proveniente de medio DR2A + Cu, sitio CG inoculada en caldo
DR2B con y sin cobre y zinc.
31
Anexo 4. Bacteria ST486, proveniente de medio DR2A + Cu + Zn, sitio CG inoculada en
caldo DR2B con y sin cobre y zinc.
Anexo 5. Bacteria ST300, proveniente de medio DR2A, sitio CG inoculada en caldo DR2B
con y sin cobre y zinc.
32
Anexo 6. Crecimiento de bacterias en caldo DR2B.
Anexo 7. Crecimiento de bacterias en caldo DR2B con presencia zinc.
33
Anexo 8. Prueba de normalidad de Shapiro-Wilk para número de bacterias en el medio
DR2A.
Anexo 9. Prueba de homogeneidad de la varianza en número de bacterias en medio DR2A.
Valores Estadístico de
Levene gl1 gl2 Sig.
Basándose en la media 4.966 3 32 .006
Basándose en la mediana. 1.896 3 32 .150
Basándose en la mediana y con gl
corregido
1.896 3 8.128 .208
Basándose en la media recortada 3.381 3 32.0 .030
Anexo 10. Prueba de Kruskal-Wallis para número de bacterias entre sitios, en medio DR2A.
Parámetro UFC/mL
Chi-cuadrado 1.850
gl 2.0
Sig. asintót. 0.397
Medio
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.
DR2A .371 9 .001 .533 9 .000
DR2A + Cu .423 9 .000 .483 9 .000
DR2A + Zn .433 9 .000 .489 9 .000
DR2A + Cu + Zn .253 9 .102 .829 9 .043
34
Anexo 11. Comparación de medias de número de bacterias en medio DR2A con
concentraciones de metales.
Anexo 12. Comparación de medias por sitio en medio DR2A.
Anexo 13. Prueba de normalidad de Shapiro-Wilk para los sitios en medio BMM.
Sitio
Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk
Estadístico gl Sig. Estadístico gl Sig.
AR1 .210 12 .151 .883 12 .094
AR5 .187 12 .200* .871 12 .067
CG .162 12 .200* .938 12 .470
Anexo 14. Protocolo para elaboración de un litro de medio agar R2A.
R2A Cantidad (g)
Levadura 0.50
Peptona 0.50
Casaminoácidos 0.50
Dextrosa 0.50
Almidón 0.50
Piruvato de sodio 0.30
Fosfato de dipotasio 0.30
Sulfato de magnesio 0.05
Agar 15.00
Medio Media N Desv. típ.
DR2A 5.6067 9 .50540
DR2A + Cu 1.2910 9 .54301
DR2A + Zn 4.2104 9 .70332
DR2A + Cu + Zn 1.3324 9 .40350
Total 3.1101 36 1.96311
Sitio Media N Desv. típ.
AR1 2.9021 12 1.95742
AR5 2.8850 12 1.99313
CG 3.5433 12 2.03734
Total 3.1101 36 1.96311
35
Anexo 15. Protocolo para elaboración de un litro de medio BMM.
Anexo 16. Componentes para un análisis de PCR.
Reactivos Unidad Volumen
Agua molecular µL 8
Gotaq Green mix µL 10
Primer 27F µL 1
Primer 1492R µL 1
Muestra de bacteria colonias 1
BMM Unidad Cantidad
Solución mineral mL 10.000
Solución de vitaminas mL 10.000
Metales en trazos mL 2.500
Glucosa g 0.717
MOPS g 2.400
Fosfato de potasio monobásico
(KH2PO4) mL 1.000
Agar g 15.000
Anexo 17. Bacterias en medio DR2A y BMM sin metales, provenientes de AR5.
36
Anexo 18. Bacterias en medio DR2A y BMM con cobre, provenientes de AR5.
Anexo 19. Bacterias en medio DR2A y BMM con zinc, provenientes de AR5.
37
Anexo 20. Bacterias en medio DR2A y BMM con cobre y zinc, provenientes de AR5.
