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EFECTO DEL CAMBIO DE SUSTRATO EN LA PRODUCCIÓN DE

AROMAS EN CEPAS AISLADAS DE Trichoderma spp.

Muñoz González Brenda Karina, Yáñez Varela Juan Antonio

Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec, División de Ingeniería Química y

Bioquímica

Introducción.

Los aromas y fragancias utilizadas en la

industria de alimentos, productos de limpieza

y cosméticos tienen gran interés comercial y

muchas de ellas se sintetizan químicamente

mediante largos procesos de producción

generando contaminación ambiental. Es por

esto que se han buscado alternativas

biotecnológicas para la obtención de estos

productos, mediante el uso de

microorganismos. Trichoderma spp es uno de

los géneros que poseen la habilidad de

producir ciertos aromas utilizados en la

industria de alimentos. Trichoderma

harzianum es un hongo con capacidades

biocinéticas muy interesantes. Produce

compuestos de aroma, en función de la fuente

de carbono que se utilice. Cuando se usa

aceite de resino, el metabolito producido es la

6-pentil-α-pirona (6-PP, aroma a coco),

mientras que cuando se usa glucosa, el

metabolito es γ-decalactona (aroma de

durazno). En este último proceso

biotecnológico, un problema fundamental es

el de la homogenización del aceite, el aire y

la biomasa. En este trabajo se realizara las

fermentaciones para ambos aromas con el fin

de observar el comportamiento del

microorganismo con sustrato glucosa y ácido

linoleico y así poder obtener cual sería el

metabolito más rentable para su producción [2,5].

Marco teórico

El entendimiento de la vía de biosíntesis para

ambos aromas no ha sido aún elucidado por

las investigaciones. Sin embargo Serrano y

colaboradores lograron etiquetar con carbono

catorce el ácido linoleico para poder descifrar

la ruta que lleva a la biosíntesis de la lactona

6-pentil-α-pirona mostrada en la Figura 1.

Esta investigación uso a Trichoderma

harzianum y obtuvieron datos suficientes para

comprobar que la β-oxidación del ácido

linoleico es el máximo paso para la vía bio-

sintetica de 6-PP. En estudios más recientes [#]

se ha demostrado que el gen de la

Lipoxigenasa está envuelto en el primer paso

de la biosíntesis pero esta es regulada por la

proteína G (Tga1) en cepas de Trichoderma

atroviride [5,6].

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Fig. 1 Ruta para la biosíntesis de la lactona 6-PP [5]

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Por otro lado Okui en 1963 realizó un estudio

para revelar la biocoversion del ácido

ricinoleico (𝐶18𝐻34𝑂3) a y-decalactona en

levaduras del genero Candida.

Para nuestro estudio en el cual se utilizó

como fuente de carbono glucosa para la

generación de dicho metabolito se deduce que

para llegar a la formación de ac. ricinoleico,

la glucosa entra a la vía de glucolisis, que

posteriormente con la formación de acetil

coA se realiza la síntesis de ácidos grasos

hasta llegar a la formación de ácido

ricinoleico y pasar a la trasformación de este

compuesto para llegar a la producción de y-

decalactona.

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Fig. 2 Ruta para la biosíntesis de la lactona γ-decalactona

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Materiales y métodos

Aislamiento de Trichoderma harzianum

Trichoderma harzianum se obtuvo mangos

enfermos con malformación, esta muestra se

cultivó en un medio solido de papa dextrosa y

se incubo durante 5 días a una temperatura

ambiente y a oscuridad con la finalidad de

generar en el medio la presencia de conidios.

Para asegurar que efectivamente se aisló el

hongo adecuado, este se observó por medio

de microscopia óptica.

Se preparó un pre inoculo de 150 ml con

extracto de Malta 20 g/L y Glucosa 10 g/L, se

tomó una muestra de 1 cm2 del hongo

obtenido en medio PDA, este se incubo en un

Shaker por 72 horas a temperatura ambiente

con una agitación de 100 rpm.

Producción de γ-decalactona a nivel

reactor

Se preparó 4.5 L de medio de cultivo para la

generación de γ-decalactona con glucosa

como fuente de carbono con 20 g/L de

glucosa, suplementado con 1.0 g/L de

extracto de levadura, 2.0 g/L de caseína

hidrolizada, 1.5 g/L de 𝐾𝐻2𝑃𝑂4 y 1.0 g/L de

𝑀𝑔𝑆𝑂4 .7𝐻2𝑂. Dicho medio se inoculo con

una suspensión de conidios de la cepa

Trichoderma harzianum.

El reactor se colocó a una temperatura de 27

°C, con 1 VVM de aireación, y una agitación

de 200 rpm durante 5 días.

Producción de 6-pentil-α-pirona a nivel

reactor

Se preparó 4.5 L de medio de cultivo para la

generación de 6-pentil-α-pirona con 10 g/L

de ácido linoleico como fuente de carbono,

suplementado con 0.94 g/L (𝑁𝐻4)2 , 7 g/L

𝐾𝐻2𝑃𝑂4 , 2 g/L 𝑁𝑎2𝐻𝑃𝑂4 , 1.5 g/L

𝑀𝑔𝑆𝑂4 .7𝐻2𝑂 , 0.008 g/L 𝐶𝑎𝐶𝑙2 0.0001

𝑍𝑛𝑆𝑂4 .7𝐻2𝑂.

El reactor se colocó a una temperatura de 27

°C, con 1 VVM de aireación, y una agitación

de 200 rpm durante 5 días. Se realizó la

cuantificación de peso seco durante las

fermentaciones para conocer el

comportamiento de crecimiento del hongo

con cada sustrato expuesto.

Condiciones de operación

Dicho reactor está construido de acero

inoxidable, con una camisa que contiene una

entrada de agua fría y una salida del mismo

fluido. Además contiene un eje que es girado

por medio de un motor, este eje cuenta con

aspas de paleta, esto junto con los bafles que

mantienen una buena difusión del medio

durante la fermentación, además consta de

una entrada para aire que pasa a través de

una trampa de agua regulada con un medidor

de flujo. Este reactor contiene una entrada

para la incorporación del inoculo y del medio

de cultivo y otra entrada para un termopar

que permitirá mantener la temperatura

adecuada para el proceso.

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Figura 3: Diseño de reactor

Metodología de extracción del metabolito

Para extraer el metabolito γ-decalactona y 6-

pentil-α-pirona, una vez pasado el tiempo de

fermentación, el contenido de cada reactor se

sometió a una centrifugación durante 20 min

a 3500 rpm para eliminar biomasa y trabajar

con el sobrenadante.

En dos embudos de separación se colocó una

alícuota de 26 ml de cada sobrenadante

respectivamente, con 13 ml de ciclohexano y

65 ml de solución salina al 10%. Ambos

embudos se mezclaron perfectamente y se

dejó en reposo durante 12 horas para la

separación de fases.

La capa de ciclohexano con cada lactona se

separaro de la solución salina, y se pasó a

través de 9.75 g de sulfato de sodio anhidro

para eliminar el agua y secarlos.

Figura 4. Comparación macroscópica de la cepa aislada (A) con una foto de una cepa de Trichoderma spp obtenida de

bibliografía (B)

Motor

Medidor de aire

Trampa de aire

Termostato

Regulador de rpm Camisa

Entrada y salida de agua

fría

Agitador

A B

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Resultados y Discusión

Aislamiento y comprobación.

El aislamiento se corroboro analizando la

morfología macroscópica y microscópica de

la cepa aislada en Papa Dextrosa Agar. Se

comparó con morfologías antes reportadas [1].

En la Figura 4 se muestra la comparación

macroscópica de la cepa. Se puede observar

que tienen una gran similitud en los colores

verde y blanco, y en la forma amorfa del

crecimiento. Para la obtención de una mayor

certeza en la Figura 5 se muestra la

comparación microscópica donde se observan

el mismo tipo de conidióforos, estos son

erectos, hialinos, en su mayoría ramificados.

Las conidios son unicelulares y subglobosas

algunos ramificados y otros solitarios,

característicos de la cepa [1] y se observa una

gran similitud entre la cepa aislada (A) y la

foto obtenida de bibliografía (B).

Comportamiento del crecimiento

microbiano en la producción de aromas

En la figura 6 se muestran las curvas de

crecimiento microbiano para ambas

fermentaciones. Se puede observar

claramente cómo es que la fermentación para

la γ-decalactona hay un crecimiento mayor

que para la del 6-PP. Esto se puede explicar

debido a la naturaleza de las fuentes de

carbono ya que la dilución del sustrato en la

producción de γ-decalactona es mucho mejor

desde un principio ya que es un compuesto

soluble en agua, y la difusión en el reactor es

mucho mejor. En contraste, la fuente de

carbono para la producción de 6-PP es el

aceite linoleico, el cual es difícil que se

difunda por todo el reactor ya que esta

fermentación es conocida como una

fermentación trifásica (agua, aceite, aire) y

por lo tanto la poca difusión de los nutrientes

ocasionó un menor desarrollo de la biomasa [2].

Figura 5. Comparación microscópica de un frotis con azul de lactofenol de la cepa aislada (A) contra una tinción de

Trichoderma spp (B)[1]

40X

A B

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0.35

0.4

0.45

0.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

Pes

o S

eco

(g/

L)

Tiempo (días)

Curva de Crecimiento

γ-decalactona 6-pentil-α-pirona

Separación de los metabolitos

Figura 7. Embudos de separación

Figura 6. Comportamiento del crecimiento durante las fermentaciones

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Figura 8. Embudos de separación de y-decalactona Figura 9. Embudos de separación de 6PP

Extracción de los aromas

Tabla 1: Rendimiento de aromas producido a partir de Trichoderman harzianum

Aroma Fuente de carbono Alícuota (ml) Volumen de

metabolito (ml)

y-decalactona

(durazno) Glucosa 26 10

6PP (coco) Ácido linoleico 26 7

Figura 10. Fase de extracción del metabolito

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Referencias.

1. Chávez García Mónica Paola. 2006.

Producción de Trichoderma sp. Y

evaluación de su efecto en cultivo de

crisantemo (Dendranthema

grandiflora). Tesis de Licenciatura.

Pontificia Universidad Javeriana.

Facultad de ciencias, Microbiología

Industrial.

2. Galindo Fentanes Enrique. 2014.

Aspectos de ingeniería en

fermentaciones: cómo mezclar

gases, líquidos y sólidos. Instituto de

Biotecnología, Universidad

Autónoma de México.

3. Sanchez Perez, Maria Isabel, 2009,

Aislamiento y caracterización

molecular y agronómica

Trichoderma spp nativos del norte

de Tamaulipas. México. Instituto

Politécnico Nacional, Centro de

Biotecnología Genómica.

4. Michel-Aceves Casimiro Alejandro,

Otero-Sánchez Marco Antonio, 2004,

Producción y Actividad Antibiótica

del 6 pentil-αpirona de Trichoderma

spp., Sobre Especies de Fusarium.

México. Fitotecnia, Colegio Superior

Agropecuario del Estado de

Guerrero, Centro de Estudios

Profesionales

5. L. Serrano-Carreon, Y. Hathout, M.

Bensoussan and J.-M. Belin, 1993.

Metabolism of Linoleic Acid or

Mevalonate and 6-Pentyl- a-Pyrone

Biosynthesis by Trichoderma

Species. Journals.

6. Rosa Da Silva Arleida. 2002.

Biotransformacion de ácido

linoleico en presencia de levaduras

de genero Candida oleophila y

Candida guillermondi.