AGC Chemicals Company - 表1_表4 [更新済み] コピーCYTOP 1.34 95 90 屈折率 アッベ屈折計 アッベ屈折計 光線透過率(%) 可視光領域、200μm アッベ数
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103
B会場(白鳥)
バ
イ
オ
15:35~16:00
表面プラズモン共鳴法を利用した1細胞屈折率可視化技術の開発
広島大学
大学院医歯薬学総合研究科 皮膚科学
助教 柳瀬 雄輝
● プレゼン技術の概要本技術では,従来の表面プラズモン共鳴(SPR)光学系に対物レンズ・CMOS カメラを組み合わせて,センサ表面上の屈折率分布を二次元的に観察することで,1細胞毎の刺激応答(屈折率変化)を可視化することに成功した。
● 従来技術・競合技術との比較本技術により,従来技術では不可能であった,1細胞レベルの屈折率分布を可視化できるため,微量サンプルを使った生細胞刺激応答の解析,正常細胞中の異常細胞応答の検出や,様々な刺激に対する細胞応答を同時に解析することが可能となった。
● プレゼン技術の特徴・1細胞屈性率の可視化・マルチチャンネル細胞応答解析・サンプルの微量化
● 想定される用途・アレルギー診断・細胞機能解析・腫瘍診断
表面プラズモン共鳴法を利用した生細胞応答可視化技術の開発生細胞応答可視化技術の開発
広島大学 医歯薬学総合研究科皮膚科学
助教 柳瀬 雄輝
広島大学 医歯薬学総合研究科皮膚科学広島大学 医歯薬学総合研究科皮膚科学
教授 秀 道広
研究背景研究背景
表面プ ズ 共鳴(SPR S f Pl表面プラズモン共鳴(SPR;Surface Plasmon
Resonance)は 生きた細胞の刺激応答を非標識Resonance)は、生きた細胞の刺激応答を非標識、
リアルタイムかつ高感度に検出できることから、細リアルタイムかつ高感度に検出できることから、細
胞機能を解析するバイオ研究支援装置及び臨床
診断装置への応用が期待される。
研究の目的
・個々の生細胞の刺激応答を非標識・
リアルタイムに検出できる技術の開発リアルタイムに検出できる技術の開発
・超微量の血液から迅速・正確に原因
抗 を特定 き 次世代 ギ抗原を特定できる、次世代アレルギー
診断法の開発診断法の開発
表面プラズモン共鳴(SPR)センサの測定原理エバネッセント波
プラズモン波
波
金薄膜
波数の一致により共鳴(入射角度・屈折率に依存)
入射光 反射光
プラズモン波金薄膜
(a) 結合前 (b) 結合後
屈折率変化の測定例
反射光が最も減衰する入射角度(共鳴角)変化からセンサ上の屈折率変化を検出できる
屈折率変化の測定例
YY YY YYYY金薄膜 検出範囲数百nm 入射光角度
⊿θ共鳴角
プリズム
入射光反射光θ
屈折率変化量(結合量)プリズム
時間
(結合量)フォトダイオード
Living-Cell SPR (CSPR)(細胞応答測定用SPR)(細胞応答測定用SPR)
DNP-HSA抗原 抗DNP-HSA 抗原の結合より抗原
YY抗DNP-HSA
IgE抗体細胞高数μm 検出範囲
抗原の結合よりも大きな変化
RBL細胞
μ 検出範囲数百nm
入射光反射光
θ 時間(Hide M, et al. Anal Biochem 302: 28-37, 2002)
刺激による膜近傍屈折率変化を検出
1.生きた細胞の刺激応答を検出できる(生体に近い)
特徴刺激による膜近傍屈折率変化を検出
2.無標識でよい(細胞を痛めない・本来の状態を損わない)3.迅速(リアルタイム)・高感度4 従来の方法とは全く異なる細胞機能測定原理に基づく4.従来の方法とは全く異なる細胞機能測定原理に基づく
(細胞膜近傍の屈折率変化(ヒスタミン遊離とは無関係))
従来のSPR技術の問題点
・1細胞の変化を検出することはできない(細胞機能解析 試料の微量化に適さない)(細胞機能解析、試料の微量化に適さない)
・マルチチャンネル化が困難マルチチャンネル化が困難(スクリーニング装置に適さない)
・異なる細胞を個別に測定できない(シグナルが平均化され小さな反応が見逃されてしまう)
細胞応答解析 グ( )
(シグナルが平均化され小さな反応が見逃されてしまう)
従来のSPR光学系に対物レンズ CMOSカメラを組み合わ
1細胞応答解析用SPRイメージング(SPRI)の開発
従来のSPR光学系に対物レンズ、CMOSカメラを組み合わせてセンサ上の屈折率分布を二次元的に解析できる。
フ
1細胞応答解析用SPRイメージング装置図・測定原理
金薄膜(50 )
刺激物投与 フローチャンバ
生細胞恒温装置
(37℃)
対物レンズ
金薄膜(50 nm)蒸着ガラス基板
細胞
SPRイメージ56°
CMOS
半導体レーザ(630nm)
偏光板 プリズム
細胞
カメラ(RI=1.72)
(a) (c)(b)
RBL-2H3細胞のSPRイメージ生細胞屈折率可視化原理(a) (c)(b)
共鳴曲線(a) 緩衝液(b) 生細胞(無刺激)(b) 生細胞(無刺激)(c) 生細胞(刺激)
⊿Intensity(反射光強度変化)
56°入射光角度
細胞と緩衝液の屈折率の違いによる反射光強度差
0 i 10 i 20 i
RBL-2H3マスト細胞を刺激した時の1細胞屈折率変化
0 min 10 min 20 min
30
40
50
sity
1 2 3 45激
0
10
20
⊿In
tens 5
average
無刺
激
50
1 23
0 600 1200 1800-10
Time (second)
20
30
40
nte
nsi
ty
3 4 5 average
0 600 1200 1800-10
0
10
DNP-HSA
⊿In
0 600 1200 1800
Time (second)反射光強度(Yanase Y, et al. Biosens Bioelectron 26: 674-681, 2010)
刺激後の1細胞レベルでの活性化(細胞膜近傍屈折率変化)をリアルタイムに検出できる。
刺激後の細胞内局所での屈折率変化M i刺激前 刺激(DNP HSA)20分後 Movie 刺激前 刺激(DNP-HSA)20分後
80
100
細胞中心付近 細胞辺縁 ・細胞の中心付近に特に高屈折率の
領域が観察された
(Yanase Y, et al. Biosens Bioelectron 26: 674-681, 2010)
60
80
Inte
nsi
ty
・刺激後の屈折率変化パターンは細胞中心付近と、細胞辺縁では異なる
20
40
DNP-HSA
⊿I
これまで見えていなかったものを
0 600 1200 1800
0DNP HSA
Time (second)
れまで見えていなかったものを可視化することで、新しい細胞機能の解明につながるかもしれない
まとめ①
・細胞の活性化時の細胞膜近傍の屈折率変化を1細胞レベ
グ きルでモニタリングできた
・細胞局所における屈折率分布変化を観察できるため、屈
折率変化のメカニズムの解析が容易になった折率変 解析 容易
・1細胞毎の解析が可能なため 1細胞 もしくは数個の細1細胞毎の解析が可能なため、1細胞、もしくは数個の細
胞を1スポットとした多チャンネル化が可能であり、多種類
の刺激物質に対する細胞(群)の反応性を効率的に検出の刺激物質に対する細胞(群)の反応性を効率的に検出
するハイスループットスクリーニングが可能
型 ギ 診 法 応 例I型アレルギー診断法としての応用例
抗原に対する好塩基球の応答を利用したアレルギー診断
Ⅰ型アレルギー発症機構
抗原:食物、ダニ、花粉、汗等
YY好塩基球:血中に存在
IgE抗体(各抗原に特異的)原因細胞好塩基球 中 存在肥満細胞:組織中に存在 細胞活性化
Anti-IgE
ヒスタミン、脂質メディエータ炎症性サイトカイン等放出
I型アレルギー症状の誘発アナフィラキシーショック、食物アレルギー、気管支喘息、花粉症、
蕁麻疹等、アトピー性皮膚炎
原因細胞を活性化する抗原の種類を正確に特定できれば、抗原から隔離することでアレルギー症状の発症を予防でき、減感作治療も選択し得る。
SPRIを使ったアレルギー診断の利点
・患者から採取した細胞自体の反応は生体内での反・患者から採取した細胞自体の反応は生体内での反
応を良く反映するため、信頼性の高い結果が得られるる。
・1細胞レベルの屈折率変化を感度良く検出できるため 採取血液量の超微量化が期待できるため、採取血液量の超微量化が期待できる。
1視野内で複数の細胞の反応を同時に検出できる・1視野内で複数の細胞の反応を同時に検出できるため1チップでのアレイ化が可能である。
方法4104
分離前 分離後①採血:EDTA入り真空採血管
②好塩基球分離(磁気ビーズ法)
102
103
104
CD
203c
0.067 92.3
102
103
104
CD
203c
0.1 2.53
YY
磁気ビーズ付抗体(好塩基球以外の細胞を認識)
Y
100
101
10
FL4-
H: C
3.534.1100
101
10
FL4-
H: C
1186.4強力
金属ビーズ充填カラム(抗体が結合 た
(好塩基球以外の細胞を認識)
Y
Y
③細胞固定
純度90%以上の好塩基球を分離(FACS解析)
好塩基球
100 101 102 103 104FL2-H: CD123
10100 101 102 103 104
FL2-H: CD123
10強力マグネット
(抗体が結合した細胞をトラップ)
Y
③細胞固定 (FACS解析)
抗好塩基球抗体BA312(塩野義製薬)による固定
抗好塩基球抗体
センサチ プ上に固定
YYYYYYY金薄膜(50 nm)蒸着ガラス板
抗好塩基球抗体(BA312:塩野義製薬)
センサチップ上に固定された好塩基球
偏光板対物
レンズ AOI(測定領域)
④SPRI測定レーザ
CMOSカメラ
1細胞毎の光強度変化を観察・経時的にプロット
無刺激 刺激
ヒト好塩基球をanti-IgE刺激したときの1細胞屈折率変化
無刺激 anti-IgE刺激
25 25 12
屈折率 屈折率
15
20
25
折率
)変化
1 2 3 4 5 Average
15
20
25
折率
)変化
2 3 4 5 Average
0
5
10Buffer
強度
(屈折
0
5
10強
度(屈
折
0 600 1200 1800-5
0
光強
時間(秒)
0 600 1200 1800-5
0anti-hIgE光
時間(秒)
ヒト好塩基球を抗原刺激したときの1細胞屈折率変化(アトピー患者例)(アトピー患者例)
ヒスタミン遊離 SPRI解析
1003540
anti-IgEダ 抗
ヒスタミン遊離 SPRI解析
60
80
遊離
(%)
20253035
度変
化
ダニ抗原 スギ抗原 汗抗原
40
60
スタ
ミン
遊
5101520
光強
度aIgE ダニ スギ 汗
0
20ヒ
0 600 1200 1800-505
aIgE ダニ スギ 汗
時間(秒)
抗原 ダニ スギ 汗 抗原 ダニ スギ 汗抗原 ダニ スギ 汗
反応 陽性 陰性 陽性
抗原 ダニ スギ 汗
反応 強 無 強
健常人、アトピー性皮膚炎患者の好塩基球を汗抗原刺激したときの細胞屈折率変化汗抗原刺激したときの細胞屈折率変化
****
抗原に対する反応(過敏性の有無)を感度良く診断することができる
ダニ感作、非感作患者から採取した好塩基球のダニ抗原に対する反応性を同チップ上で解析ダ 抗原 対する反 性を同チッ 解析
ヒスタミン遊離 SPRI解析
ドナー1 ドナー225
30
(%
)
ダニ抗原刺激
15
20
ミン
遊離
ダニ抗原刺激
5
10
ヒス
タ
無刺激 ダニ 無刺激 ダニ0
各0.7μl細胞液ドナー1 ドナー2
ダニ感作(+) ダニ感作(-)屈折率
同チップ上で抗原に対する好塩基球の反応性の違いを検出可能
まとめ②
・ヒト血液から分離した好塩基球の種々な抗原に対する刺激応答を1細胞レベルで検出できたる刺激応答を1細胞レベルで検出できた。→数個の好塩基球で診断可能(採血の超微量化)
・疾患、ヒスタミン遊離との高い相関性が認められた。→再現性・信頼性の高い診断→再現性・信頼性の高い診断
・複数の患者から採取した好塩基球の抗原刺激応・複数の患者から採取した好塩基球の抗原刺激応答を1センサチップ上で同時に解析することにも成功したた。→多種類の抗原に対する反応をチップ上で網羅的にスクリ ニングが可能スクリーニングが可能
想定される用途想定される用途
• 1生細胞機能解析1生細胞機能解析
非標識細胞の細胞内屈折率分布を観察
• アレルギー診断アレルギ 診断
好塩基球、T細胞、B細胞の刺激応答解析
• 腫瘍診断腫瘍診断
正常細胞と腫瘍細胞の刺激応答の違いを利用
実用化に向けた課題
• リアルタイム1細胞応答解析法の確立
個々の細胞における光強度変化をリアルタイムに解析する技術(画像解析法)解析する技術(画像解析法)
• 1細胞応答解析用SPRイメージング装置の作製
装置の作製(現在の光学系は手作り)装置の作製(現在の光学系は手作り)
• 多チャンネル同時解析のための測定チップの開発
網羅的解析のためのマルチチャンネルチップ網羅的解析のためのマルチチャンネルチップ
企業への期待業 期待
• ヒト末梢血からの迅速血球細胞(好塩基球等)• ヒト末梢血からの迅速血球細胞(好塩基球等)分離技術を探索中
• ガラス基板への金薄膜の蒸着パターニング技ガラス基板 の金薄膜の蒸着パタ ング技術を持つ企業との共同研究を希望
• 1細胞機能解析・臨床検査分野(アレルギー・細胞機能解析 臨床検査分野(ア ギ腫瘍検出)への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる技術の導入が有効と思われる
本技術に関する知的財産権本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 :細胞活性分析装置及び細胞活性分析方法
出願番号 特願 2010 061710• 出願番号 :特願 2010-061710
• 出願人 :国立大学法人広島大学出願人 :国立大学法人広島大学
• 発明者 :秀 道広、柳瀬 雄輝
お問い合わせ先お問い合わせ先
広島大学
産学・地域連携センター
TEL 082-421-3631
FAX 082 421 3639FAX 082-421-3639
e-mail techrd@hiroshima-u.ac.jp@ jp