視覚障害治療のための 可視光に感受波長を持つ 光活性化陽イオンチャネルタンパク質

岩手大学 工学部 応用化学・生命工学科 教授 冨田 浩 史 特任准教授 菅野 江里子

1

視覚・・・・外界からの情報の80％

米国基準 良い方の視力0.1以上0.5未満 ：ロービジョン 良い方の視力0.1以下 ：失明 視覚障害者

本邦の視覚障害者の数： 約164万人

2030年には200万人に！！

(2009年：日本眼科医会資料)

一旦、失明に至ると、視機能を回復させる治療法は無い

視覚障害がもたらす社会損失額

8.8兆円 失明者数は18.8万人

失明を来す疾患とその要因

2

網膜の構造と疾患

光受容細胞 （視細胞：桿体、錐体）

内顆粒層 （アマクリン、双極、 水平、ミューラー細胞）

神経節細胞 （ON, OFF, ON-OFF)

脳へ

失明を来たす疾患 (日本) 1. 緑内障 2. 糖尿病網膜症 3. 網膜色素変性症 4. 加齢黄斑変性症

神経節細胞、視神経 進行により異なる 視細胞（桿体） 視細胞（錐体）

第一位

3

網膜色素変性症

光を受け取る唯一の細胞

視細胞の情報を受け取り、神経節細胞にその情報を伝達

脳に情報を送る

映像、光

神経節細胞

外側膝状体

脳（視覚野）

視細胞

変性

厚生省特定疾患 頻度： 1/4000～8000人 原因： 視細胞、網膜色素上皮細胞などの光受容に関係する遺伝子の変異

原因遺伝子: 135

有効な治療法はない

視神経

Point !! 視細胞が完全に消失しても他の神経細胞は残存

残存する神経細胞を利用して視覚情報を伝達

光受容細胞を作り出し移植

・人工網膜 ・遺伝子治療

・幹細胞移植 （iPS細胞）

入 力

4

Osakada F, Takahashi M, et al, Nature Biotec.2008

Nakano T, Sasai Y,et al., Cell Stem Cell, 2012

・移植後、生来の シナプスが再構成 されるか不明 ・拒絶反応

Embryonic Stem Cells 幹細胞

iPS細胞・・・自身の細胞から作るため、拒絶反応は回避できる。しかし、同一の遺伝子変異を持つため、利用できない。視細胞に分化させる前に変異を修復し、視細胞を作る研究が進められている。

5

チャネルロドプシン－２(ChR2) Nagel G. et al. PNAS. 2003

池や沼に住む走光性の緑藻類 葉緑体を持ち、光合成によりエネルギーを作る

眼点で光を受容し、鞭毛運動により移動する 眼点に存在する光受容タンパク質

チャネルロドプシン-2 光受容体 + 陽イオン選択的チャネル

眼点 葉緑

体

鞭毛

5-10 m

クラミドモナス

EC

membrane

IC

透過性 ↑ Na+

脱分極

活動電位発生

light １つの遺伝子を導入することで光受容能を与えることができる

神経細胞へ遺伝子導入

変性

二次ニューロン

神経節細胞 脳へ 視覚情報伝達

＋ 光受容能

6

従来技術とその問題点 (1/2)

緑藻類クラミドモナスの光活性化陽イオン

チャネルチャネルロドプシン-2(ChR2)

EC

membrane

IC

透過性 ↑ Na+

脱分極

活動電位発生

light

ChR2遺伝子を神経細胞に導入し発現させることで、神経細胞に光受容能を与えることができる。

神経細胞へ遺伝子導入

7

従来技術とその問題点 (２/2)

Arrenberg AB, et al, Science. 2010

Osawa S, et al, PLOS ONE, 2013

変性

二次ニューロン

Tomita H, et al, IOVS, 2007

失明

ChR2遺伝子導入

残存する網膜神経細胞に

ChR2遺伝子を

導入し光受容能を賦与

問題点：ChR2の感受波長が 青色に限定される

可視光に感受波長を持つ光活性化陽イオンチャネルタンパク質を開発 8

硝子体内投与 5 μl （1012～1013 particles / ml）

AAV-ChR2V

CAG ChR2 (1-315AA) Venus アデノ随伴ウイルスベクター 遺伝子治療用ベクターとして実績豊富 2型は、神経節細胞に高親和性

遺伝子導入用ベクターの選択

遺伝盲ラット 視機能評価

電気生理学的評価(VEP) Visually Evoked Potential

行動解析

回転する縞模様に対するラットの追従行動

光 刺 激

光刺激に伴う視覚野の電位変化

導入効率評価

9

全神経節細胞数の27.7±9.4 ％

Ganglion cells Double labeled cells

0

500

1000

1500

2000

Th

e n

um

ber

of

cells (

cells /

mm

2)

Merged

青色蛍光（神経節細胞） 緑色蛍光（ChR2V） 両方で標識された細胞数を計測

眼内へウイルスベクターを1回注入すると約28万個の細胞が光受容細胞になる

ヒト：1００万個の神経節細胞

人工網膜 ChR2遺伝子治療 ・16画素 ・28万画素 （Max:1000画素） ・4-5cells/１電極 ・個々が光受容細胞 ・擬似光覚 ・細胞の興奮 ・手術時間3-4時間 ・１０分程度

神経節細胞への 遺伝子導入効率

10

視覚誘発電位

P1 30 ms

50 μV

正常ラット

遺伝盲ラット

遺伝子導入後

光反応が回復！！

潜時短縮 視細胞層

（光受容細胞）

内顆粒層

神経節細胞層 (GCL)

視神経

外側膝状体

視覚野 入力

ChR2

by-pass (20-25ms)

神経節細胞が直接、光に応答

Tomita H., et al., IOVS, 2007

11

青-黒の縞模様を弁別できる

行動解析

0.5 2.0 4.0 8.00

5

10

15

20

25

30

35

40

rdy/rdy - ChR2V

+/+

rdy/rdy

rpm

Th

e n

um

ber

of

mo

vem

en

t

0 2 4 6 8 100

5

10

15

RCS (+/+)RCS (rdy/rdy)-ChR2V

R2= 0.7415

R2= 0.3166

rpman

gle

dis

pla

cem

en

t (d

eg

ree)

0 2 4 6 8 100

10

20

30

40

RCS (+/+)

RCS (rdy/rdy)-ChR2V

R2= 0.6339

R2= 0.2322

rpm

an

gle

sp

eed

角度変位量 角速度 首振り回数

AAV-ChR2V control

Tomita H., et al., Exp. Eye Res.2010

12

遺伝子改変動物の作製

ln 1 ln 4 ln 5 ln 7

ln 4

Thy-Iプロモーターの下流にChR2Vを導入

神経節細胞にChR2が発現

Tomita H., et al, 2009, PLoS ONE 13

オプトモーターを用いた視機能検査

blue

black sine wave

・各空間周波数 ・コントラスト 感度測定

Display

Display

Dis

pla

y Disp

lay

platform

mirror

Top View

14

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.61

10

100ChR2V+/-

LD - ChR2V+/-

Spatial Frequency (c/d)

Co

ntr

ast

Sen

sit

ivit

y

** **

TGラット （視細胞有）

TGラット （視細胞無）

縞模様多い

コントラスト 悪い

良い

縞模様少ない

遺伝子改変動物の視覚特性

15

light

light

light

ChR2によって得られる視覚

16

Sugano E, et al Gene Therapy, 2010

titration of AAV2 antibody

titration of ChR2 antibody

T-cell ratio

臨床応用に向けた取り組み

免疫反応

no severe immune response

17

P1 30 ms

50 μV

Normal

RCS rat (Genetically blind rat)

before

遺伝子導入後の視覚誘発電位の変化

Sugano E, Gene Therapy, 2010 視覚誘発電位の回復

after ChR2 transfer

18

ChR2の波長感受性

3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0

1 .2R C S -C h R 2 V

n o n -d y s tr o p h ic R C S

w a v e le n g th ( n m )

re

lati

ve

se

ns

itiv

ity

(%

)

Tomita H, Exp Eye Res, 2010 19

Volvox carteri

ボルボックスChR1の発見 Zhang F., et al. Nat. Neurosci., 2008

培養し、volChR1 cDNAをクローニング

ClChR2

VChR1

0.001 0.01 0.1 1 10 0

20

40

60

80

100

120 ClChR2

VChR2

blue LED ( mw / cm 2 ) am

plitu

de (

m

V )

クラミドモナスChR2 ボルボックスChR1

新規チャネルロドプシンの開発

20

原因：細胞膜への発現効率

クラミドモナス由来チャネルロドプシン-1 (ChR1) N末２３個のアミノ酸 → 細胞外への輸送シグナル

a b c

改変型VChR1 VChR1

whole cell lysates

anti-GFP

anti-β-actin

con

trol

mV

Ch

R1

VC

hR

1

membrane fraction

anti-GFP anti-cadherin

con

trol

mV

Ch

R1

VC

hR

1

mVChR1：多波長感受性 国内：登録済み 米国：登録済み PCT/JP2010/063786 ＪＳＴ支援

21

視覚誘発電位測定 行動解析

400 450 500 550 600 650 7000.0

0.5

1.0

1.5ChR2V

mVChR1

nm

rela

tive s

en

sit

ivit

ies

( to

468 n

m)

blu

e-b

lac

k

gre

en

-bla

ck

ye

llo

w-b

lac

k

red

-bla

ck

0 .0

0 .1

0 .2

0 .3

0 .4

0 .5

cy

cle

s p

er d

eg

re

e

Tomita H et al, Mol Therapy, 2014

22

安全性評価（遺伝盲ラット：non-GLP）

ChR2（青型） → 免疫学的、組織学的に重篤な副作用所見無し mVChR1では？ 網膜変性症ラット （遺伝子導入後10ヶ月） ・血液一般、生化学検査（WBC, RBC, GOT, ALT, etc) → 無 ・抗体価測定 ・組織学的評価

WBC

PBS Venus YR0

10

20

30

40

50

60

70

80

normal:4500-6030

Injection

Nu

mb

er

X10E

2/

ul

RBC

PBS Venus YR400

500

600

700

800

900

Nu

mb

er

x 1

0E

4 /

ul

PBS Venus YR0

100

200

300

400

AS

T (

IU/L

)

PBS Venus YR40

50

60

70

80

90

100

AL

T (

IU/L

)

GOT ALT

0 0.5 2 4 6 10 antibody0

500

1000

1500

2000

Months after injection

anti

YR

pep

tid

e (p

g/m

l)

200000

PBS Venus

20m

mVChR1

23

試験物（ＡＡＶ-mVChR1）の規格

品質検査項目（225cm2 flask 120本から製造） ・力価（qPCR・ゲノムコピー数） ・純度確認試験（SDS-PAGE・銀染色） ・無菌試験（培養法） ・マイコプラズマ否定試験 ・エンドトキシン試験 ・mVChR1の塩基配列確認 安定性試験 ・mVChR1抗体作製 M

ark

er

試作品

本製造

大学内製造品

B lu e G r e e n

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

s tim u lu s c o lo r

am

pli

tud

e (

V)

tr ia l s a m p le

L a b o ra try m a d e

約5倍 約5倍

試作品： 1 × 1011 vg/ml

試作品： 5 × 1011 vg/ml 必要

高濃度AAVの生産法検討へ

24

安全性試験（マーモセット：non-GLP）

右：無処置 左：投与 （n=3） １．無処置群 ２．PBS投与群 ３．低用量群 (1×1011 vg/ml) ４．高用量群 (5×1011 vg/ml)

検査項目 ・一般状態観察 ・血液検査（一般、生化学） ・眼底検査 ・電気生理学的検査 （網膜電図、視覚誘発電位） ・排泄物中のウイルス濃度

co

ntr

ol

PB

S

Lo

w

Hig

h

0

2

4

6

8

1 0

b /a

am

pli

tud

e (

b/a

)

c o n tro l

P B S

Low

H igh

25

GLP試験予定

・ラットを用いた単回投与毒性試験（GLP） 期間： 3か月 動物：雌雄SDラット ・ウサギを用いた単回投与毒性試験（GLP） 期間： 3か月 動物：雌雄ウサギ ・マウスを用いた造腫瘍試験 期間：3か月 動物：雌雄SCIDマウス（1群12匹×3群； 2用量+対照群） ・安全性薬理試験 中枢、心血管系および呼吸器に対する作用 期間：24時間 動物：雄イヌ（マーモセット）（1群1匹×3群； 2用量+対照群）

実用化に向けた課題

失明者の視覚を再建するための治療薬として共同開発

26

謝 辞

日本網膜色素変性症協会

成田アニマルサイエンス研究所 萩森一郎先生

東北大学病院臨床研究推進センター

宮城県眼科医会

文部科学省科学研究費補助金

（基盤B, C, 若手研究B, 萌芽研究）

（独）医薬基盤研究所 (H22～26)

文部科学省橋渡し研究加速ネットワーク（H26～28）

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本技術に関する知的財産権

•発明の名称 ：手続き中

•出願番号 ：手続き中

•出願人 ：国立大学法人岩手大学

•発明者 ：冨田浩史、菅野江里子

※特許出願から1.5年未満の未公開特許情報を含んだ説明会ですので、情報の取り扱いに十分ご注意下さい。公開する情報の範囲につきましては、特許出願人（知財本部、TLO等）とご相談ください。

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お問い合わせ先

岩手大学 研究推進機構

プロジェクト推進部門 知財Gr.

副機構長・教授 対馬正秋

ＴＥＬ ０１９－６２１－６４９４

ＦＡＸ ０１９－６０４－５０３６

e-mail iptt@iwate-u.ac.jp

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