bull主講人虹纖生醫科技(股)公司 執行長 施明光 博士

整合高分子醫材與活性劑運用於經皮傳輸劑型之研究與產業前景分享

中 華 民 國 1 0 5 年 4 月 1 5 日

1

內容 一前言

二纖維高分子生醫材料產業及其醫療用途

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

六用以治療陰部感染病症之經皮靶位傳輸新劑型研發案例分享

2

一前言

市售纖維高分子醫材內含活性劑是否有經皮傳輸的效果產品是否具有其所宣稱之效能高分子醫材與活性劑及載體劑型三者相亙之間的依存性高分子醫材與活性劑運用於經皮傳輸劑型能否存有經皮傳輸加乘的效能

關鍵字

高分子醫材生物相容牲水凝膠人造皮膚ips cell(誘導式多功能幹細胞) 經皮靶位傳輸新劑型雙盲實驗高親水性PU泡綿細胞存活率分析藥物毒殺細胞優先性的篩選人乳突病毒藥物加成性生物黏附藥物傳輸系統

3

二纖維高分子生醫產業及其應用

2-1纖維高分子材料分子結構式

2-2纖維高分子醫用材料之用途

2-3醫用高分子材料之生物相容性安全性評估

4

2-1醫用高分子材料分類

5

2-2高分子材料之醫療用途 1

6

2-2醫用高分子材料在手術植入的應用2

7

2-3生醫用高分子材料的安全性評估原則

(1) 考慮一種材料與組織間的相互作用時不能脫離整個生醫用高分子材料的總體設計一個好的生醫用高分子材料必須要具備有效性和安全性這就涉及到材料的各種性能如化學性能電性能力學性能形態性能生物學性能等一個生物相容性好的材料未必具備好得力學性能因此一般是在材料滿足其物理和化學性能後再去評估它的生物性能

(2)醫用高分子材料的安全性評估下表為ISO 10993藥用高分子材料生物學評估指南依接觸部份(表面接觸由體外與體內接觸體內植入)之接觸時間由A短≦24hB中＞ 24h-30dC長＞30d進行細胞毒性致敏性刺激性急(亞)毒性遺傳毒性血液相容性致癌性生物降解等生物學試驗評估

8

基本評估的生物學試驗

補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

表面接觸

皮膚

A

X X

X

B

X X X

C

X X X

黏膜

A

X X X

B

X X X

C

X X X X X

損害表面

A

X X X

B

X X X

9

由體外與體內接觸

血路間接

A

X X X X

X

B

X X X

X X

C

X X X X X X X X

組織骨牙

A

X X X

B

X X X X

C

X X X X X

循環血液

A

X X X X X

B

X X X X

X X

C

X X

X X X X X X X

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

10

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

內容 一前言

二纖維高分子生醫材料產業及其醫療用途

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

六用以治療陰部感染病症之經皮靶位傳輸新劑型研發案例分享

2

一前言

市售纖維高分子醫材內含活性劑是否有經皮傳輸的效果產品是否具有其所宣稱之效能高分子醫材與活性劑及載體劑型三者相亙之間的依存性高分子醫材與活性劑運用於經皮傳輸劑型能否存有經皮傳輸加乘的效能

關鍵字

高分子醫材生物相容牲水凝膠人造皮膚ips cell(誘導式多功能幹細胞) 經皮靶位傳輸新劑型雙盲實驗高親水性PU泡綿細胞存活率分析藥物毒殺細胞優先性的篩選人乳突病毒藥物加成性生物黏附藥物傳輸系統

3

二纖維高分子生醫產業及其應用

2-1纖維高分子材料分子結構式

2-2纖維高分子醫用材料之用途

2-3醫用高分子材料之生物相容性安全性評估

4

2-1醫用高分子材料分類

5

2-2高分子材料之醫療用途 1

6

2-2醫用高分子材料在手術植入的應用2

7

2-3生醫用高分子材料的安全性評估原則

(1) 考慮一種材料與組織間的相互作用時不能脫離整個生醫用高分子材料的總體設計一個好的生醫用高分子材料必須要具備有效性和安全性這就涉及到材料的各種性能如化學性能電性能力學性能形態性能生物學性能等一個生物相容性好的材料未必具備好得力學性能因此一般是在材料滿足其物理和化學性能後再去評估它的生物性能

(2)醫用高分子材料的安全性評估下表為ISO 10993藥用高分子材料生物學評估指南依接觸部份(表面接觸由體外與體內接觸體內植入)之接觸時間由A短≦24hB中＞ 24h-30dC長＞30d進行細胞毒性致敏性刺激性急(亞)毒性遺傳毒性血液相容性致癌性生物降解等生物學試驗評估

8

基本評估的生物學試驗

補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

表面接觸

皮膚

A

X X

X

B

X X X

C

X X X

黏膜

A

X X X

B

X X X

C

X X X X X

損害表面

A

X X X

B

X X X

9

由體外與體內接觸

血路間接

A

X X X X

X

B

X X X

X X

C

X X X X X X X X

組織骨牙

A

X X X

B

X X X X

C

X X X X X

循環血液

A

X X X X X

B

X X X X

X X

C

X X

X X X X X X X

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

10

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

一前言

市售纖維高分子醫材內含活性劑是否有經皮傳輸的效果產品是否具有其所宣稱之效能高分子醫材與活性劑及載體劑型三者相亙之間的依存性高分子醫材與活性劑運用於經皮傳輸劑型能否存有經皮傳輸加乘的效能

關鍵字

高分子醫材生物相容牲水凝膠人造皮膚ips cell(誘導式多功能幹細胞) 經皮靶位傳輸新劑型雙盲實驗高親水性PU泡綿細胞存活率分析藥物毒殺細胞優先性的篩選人乳突病毒藥物加成性生物黏附藥物傳輸系統

3

二纖維高分子生醫產業及其應用

2-1纖維高分子材料分子結構式

2-2纖維高分子醫用材料之用途

2-3醫用高分子材料之生物相容性安全性評估

4

2-1醫用高分子材料分類

5

2-2高分子材料之醫療用途 1

6

2-2醫用高分子材料在手術植入的應用2

7

2-3生醫用高分子材料的安全性評估原則

(1) 考慮一種材料與組織間的相互作用時不能脫離整個生醫用高分子材料的總體設計一個好的生醫用高分子材料必須要具備有效性和安全性這就涉及到材料的各種性能如化學性能電性能力學性能形態性能生物學性能等一個生物相容性好的材料未必具備好得力學性能因此一般是在材料滿足其物理和化學性能後再去評估它的生物性能

(2)醫用高分子材料的安全性評估下表為ISO 10993藥用高分子材料生物學評估指南依接觸部份(表面接觸由體外與體內接觸體內植入)之接觸時間由A短≦24hB中＞ 24h-30dC長＞30d進行細胞毒性致敏性刺激性急(亞)毒性遺傳毒性血液相容性致癌性生物降解等生物學試驗評估

8

基本評估的生物學試驗

補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

表面接觸

皮膚

A

X X

X

B

X X X

C

X X X

黏膜

A

X X X

B

X X X

C

X X X X X

損害表面

A

X X X

B

X X X

9

由體外與體內接觸

血路間接

A

X X X X

X

B

X X X

X X

C

X X X X X X X X

組織骨牙

A

X X X

B

X X X X

C

X X X X X

循環血液

A

X X X X X

B

X X X X

X X

C

X X

X X X X X X X

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

10

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

二纖維高分子生醫產業及其應用

2-1纖維高分子材料分子結構式

2-2纖維高分子醫用材料之用途

2-3醫用高分子材料之生物相容性安全性評估

4

2-1醫用高分子材料分類

5

2-2高分子材料之醫療用途 1

6

2-2醫用高分子材料在手術植入的應用2

7

2-3生醫用高分子材料的安全性評估原則

(1) 考慮一種材料與組織間的相互作用時不能脫離整個生醫用高分子材料的總體設計一個好的生醫用高分子材料必須要具備有效性和安全性這就涉及到材料的各種性能如化學性能電性能力學性能形態性能生物學性能等一個生物相容性好的材料未必具備好得力學性能因此一般是在材料滿足其物理和化學性能後再去評估它的生物性能

(2)醫用高分子材料的安全性評估下表為ISO 10993藥用高分子材料生物學評估指南依接觸部份(表面接觸由體外與體內接觸體內植入)之接觸時間由A短≦24hB中＞ 24h-30dC長＞30d進行細胞毒性致敏性刺激性急(亞)毒性遺傳毒性血液相容性致癌性生物降解等生物學試驗評估

8

基本評估的生物學試驗

補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

表面接觸

皮膚

A

X X

X

B

X X X

C

X X X

黏膜

A

X X X

B

X X X

C

X X X X X

損害表面

A

X X X

B

X X X

9

由體外與體內接觸

血路間接

A

X X X X

X

B

X X X

X X

C

X X X X X X X X

組織骨牙

A

X X X

B

X X X X

C

X X X X X

循環血液

A

X X X X X

B

X X X X

X X

C

X X

X X X X X X X

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

10

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

2-1醫用高分子材料分類

5

2-2高分子材料之醫療用途 1

6

2-2醫用高分子材料在手術植入的應用2

7

2-3生醫用高分子材料的安全性評估原則

(1) 考慮一種材料與組織間的相互作用時不能脫離整個生醫用高分子材料的總體設計一個好的生醫用高分子材料必須要具備有效性和安全性這就涉及到材料的各種性能如化學性能電性能力學性能形態性能生物學性能等一個生物相容性好的材料未必具備好得力學性能因此一般是在材料滿足其物理和化學性能後再去評估它的生物性能

(2)醫用高分子材料的安全性評估下表為ISO 10993藥用高分子材料生物學評估指南依接觸部份(表面接觸由體外與體內接觸體內植入)之接觸時間由A短≦24hB中＞ 24h-30dC長＞30d進行細胞毒性致敏性刺激性急(亞)毒性遺傳毒性血液相容性致癌性生物降解等生物學試驗評估

8

基本評估的生物學試驗

補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

表面接觸

皮膚

A

X X

X

B

X X X

C

X X X

黏膜

A

X X X

B

X X X

C

X X X X X

損害表面

A

X X X

B

X X X

9

由體外與體內接觸

血路間接

A

X X X X

X

B

X X X

X X

C

X X X X X X X X

組織骨牙

A

X X X

B

X X X X

C

X X X X X

循環血液

A

X X X X X

B

X X X X

X X

C

X X

X X X X X X X

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

10

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

2-2高分子材料之醫療用途 1

6

2-2醫用高分子材料在手術植入的應用2

7

2-3生醫用高分子材料的安全性評估原則

(1) 考慮一種材料與組織間的相互作用時不能脫離整個生醫用高分子材料的總體設計一個好的生醫用高分子材料必須要具備有效性和安全性這就涉及到材料的各種性能如化學性能電性能力學性能形態性能生物學性能等一個生物相容性好的材料未必具備好得力學性能因此一般是在材料滿足其物理和化學性能後再去評估它的生物性能

(2)醫用高分子材料的安全性評估下表為ISO 10993藥用高分子材料生物學評估指南依接觸部份(表面接觸由體外與體內接觸體內植入)之接觸時間由A短≦24hB中＞ 24h-30dC長＞30d進行細胞毒性致敏性刺激性急(亞)毒性遺傳毒性血液相容性致癌性生物降解等生物學試驗評估

8

基本評估的生物學試驗

補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

表面接觸

皮膚

A

X X

X

B

X X X

C

X X X

黏膜

A

X X X

B

X X X

C

X X X X X

損害表面

A

X X X

B

X X X

9

由體外與體內接觸

血路間接

A

X X X X

X

B

X X X

X X

C

X X X X X X X X

組織骨牙

A

X X X

B

X X X X

C

X X X X X

循環血液

A

X X X X X

B

X X X X

X X

C

X X

X X X X X X X

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

10

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

2-2醫用高分子材料在手術植入的應用2

7

2-3生醫用高分子材料的安全性評估原則

(1) 考慮一種材料與組織間的相互作用時不能脫離整個生醫用高分子材料的總體設計一個好的生醫用高分子材料必須要具備有效性和安全性這就涉及到材料的各種性能如化學性能電性能力學性能形態性能生物學性能等一個生物相容性好的材料未必具備好得力學性能因此一般是在材料滿足其物理和化學性能後再去評估它的生物性能

(2)醫用高分子材料的安全性評估下表為ISO 10993藥用高分子材料生物學評估指南依接觸部份(表面接觸由體外與體內接觸體內植入)之接觸時間由A短≦24hB中＞ 24h-30dC長＞30d進行細胞毒性致敏性刺激性急(亞)毒性遺傳毒性血液相容性致癌性生物降解等生物學試驗評估

8

基本評估的生物學試驗

補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

表面接觸

皮膚

A

X X

X

B

X X X

C

X X X

黏膜

A

X X X

B

X X X

C

X X X X X

損害表面

A

X X X

B

X X X

9

由體外與體內接觸

血路間接

A

X X X X

X

B

X X X

X X

C

X X X X X X X X

組織骨牙

A

X X X

B

X X X X

C

X X X X X

循環血液

A

X X X X X

B

X X X X

X X

C

X X

X X X X X X X

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

10

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

2-3生醫用高分子材料的安全性評估原則

(1) 考慮一種材料與組織間的相互作用時不能脫離整個生醫用高分子材料的總體設計一個好的生醫用高分子材料必須要具備有效性和安全性這就涉及到材料的各種性能如化學性能電性能力學性能形態性能生物學性能等一個生物相容性好的材料未必具備好得力學性能因此一般是在材料滿足其物理和化學性能後再去評估它的生物性能

(2)醫用高分子材料的安全性評估下表為ISO 10993藥用高分子材料生物學評估指南依接觸部份(表面接觸由體外與體內接觸體內植入)之接觸時間由A短≦24hB中＞ 24h-30dC長＞30d進行細胞毒性致敏性刺激性急(亞)毒性遺傳毒性血液相容性致癌性生物降解等生物學試驗評估

8

基本評估的生物學試驗

補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

表面接觸

皮膚

A

X X

X

B

X X X

C

X X X

黏膜

A

X X X

B

X X X

C

X X X X X

損害表面

A

X X X

B

X X X

9

由體外與體內接觸

血路間接

A

X X X X

X

B

X X X

X X

C

X X X X X X X X

組織骨牙

A

X X X

B

X X X X

C

X X X X X

循環血液

A

X X X X X

B

X X X X

X X

C

X X

X X X X X X X

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

10

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

基本評估的生物學試驗

補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

表面接觸

皮膚

A

X X

X

B

X X X

C

X X X

黏膜

A

X X X

B

X X X

C

X X X X X

損害表面

A

X X X

B

X X X

9

由體外與體內接觸

血路間接

A

X X X X

X

B

X X X

X X

C

X X X X X X X X

組織骨牙

A

X X X

B

X X X X

C

X X X X X

循環血液

A

X X X X X

B

X X X X

X X

C

X X

X X X X X X X

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

10

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

由體外與體內接觸

血路間接

A

X X X X

X

B

X X X

X X

C

X X X X X X X X

組織骨牙

A

X X X

B

X X X X

C

X X X X X

循環血液

A

X X X X X

B

X X X X

X X

C

X X

X X X X X X X

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

10

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

基本評估的生物學試驗 補充評估的生物學評估試驗

接觸部位

A 一時接觸(≦24h)

B 短中期接觸

(gt24h-30d)

C 長期接觸(gt30d)

細胞毒性

致敏 刺激或皮內反應

全身急性毒性

亞慢性亞急性毒性

遺傳毒性

植入 血液相容性

慢性毒性

致癌性

生殖與發育毒性

生物降解

體內植入

組織骨

A

X X

X

B

X X

X X

C

X X

X X X X

血液

A

X X X X

X X

B

X X X X

X X X

C

X X X X X X X X X X

11

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

三高分子醫材與活性物於經皮傳輸特性之研究

3-1高分子醫材與活性物於經皮傳輸之特性

3-2現有給藥劑型與經皮給藥劑型之比較

12

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

3-1藥物傳輸系統 (一)藥物傳輸系統（Drug Delivery System）

將治療藥物以不同的給藥技術及型式輸入身體內以達到治療的效果

藥物傳輸系統可大約分為五類給藥途徑分別是 口服劑型(oral controlled-release） 經皮吸收劑型（transdermal）

吸入劑型（Inhalation） 注射植入劑型（Implant and Injectable depot） 速溶劑型（fast dissolving formulations）

口腔黏膜貼劑（oral transmucosal）及微脂粒劑型（liposome）

13

13

13

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

(二) 藥物釋控傳輸技術 口服方式給藥是目前市場最大的投藥方法然而口服藥物容易受到環境影響如胃腸中的Ph值變化及酵素往往會影響藥物的吸收為了維持藥物在血中的有效濃度往往需重覆投藥使得病人需一日服用多劑為了增加藥物的身體可利用率及延長藥物的使用時間增加病人的方便性便成為廠商開發藥物傳輸系統技術之優先選擇口服釋放控制劑型之藥物釋放速率是經由適當的設計與賦形劑之選擇而決定因此能不受環境影響而達到一定的藥物釋放速率維持血液中之藥物有效劑量濃度口服劑型有藥物濃度過高等副作用緩釋劑型是延長通過消化道的時間故血中有效藥物濃度較常用口服劑型維持得長

14

14

14

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

釋放控制劑型對藥物的傳輸具備了下列幾項特點 可延長藥物胃腸道的傳送時間（Transit Time） 達到每日僅需服用一次 藥物作用於局部特定範圍 能與吸收部位進行最佳之接觸 可降低要誤傳送至其他部位的副作用 (三)制放原理 在控制釋放系統中主要是利用藥物 或生物活性物質經過高分子基材或薄膜的擴散原理 或是將藥物包覆於高分子基材中利用基材逐漸水解 而將藥物慢慢釋出 一般常用的制放機制 利用擴散機制（Diffusion controlled） 利用逆滲透壓原理（Osmotically controlled） 利用化學方式（如離子交換樹脂或化學鍵斷裂方式） （Chemically controlled）

15

15

15

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

藥物傳輸釋放控制系統示意圖(圖4)

16

16

16

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

3 -2藥物經皮吸收劑型（TDDS）

經皮吸收是一種發展潛力極為雄厚的新興醫藥品更可說是一種深具中國特色的高科技產品這種新劑型的貼片是利用藥物經皮膚滲透後再以一定的速率被吸收而後經由血液循環運送至全身而達到治療之效果

1981年第一個經皮吸收貼片－克暈貼片上市後便陸續有其它產品如戒煙荷爾蒙抗高血壓等貼片產品問世此種 「不打針」「不吃藥」的醫藥品即在藥物傳輸系統中佔有重要的地位

17

17

17

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

經皮吸收貼片劑型設計(圖6)

18

18

18

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

經皮吸收之藥物(或活性物質) 需具備特性 (1)藥物(或活性物質)為親脂性或低極性的性質

(2)分子量最好小於500

(3)用藥劑量小於每天20mg

(4)藥物及其代謝物不會對皮膚產生毒性為佳

(5)對皮膚的滲透性要佳

19

19

19

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

TDDS有相當多的優點如下 bull避免肝臟之初次代謝胃腸吸收不佳及消化器官受到刺激等問題 對於慢性疾病可避免靜脈注射所引起的危險和不便 bull療效穩定藥物以固定速率輸入可維持有效血中濃度 bull若患者產生不適症狀可立即停止治療過程無藥物在體內滯留的問題 bull使用方便病患配合度高避免忘記服藥而病狀復發的後果並提高病人之醫囑性

20

20

20

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

3-3 新穎性藥物傳輸劑型

新穎的藥物傳輸載體可朝向微脂體奈米化表面修飾特定抗體等技術改良更有效地減少藥物被代謝延長藥物作用時間增進藥物動力學穩定性更適合於標靶傳輸緩釋(或釋控)藥物傳輸之效果此新穎的藥物傳輸劑型可應用於蛋白質及胜肽大分子藥物及特殊疾病(腫瘤)的標靶治療與基因療法

21

21

21

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

以老藥治療帕金森氏症的新劑型

帕金森氏症是腦內的黑質體多巴胺系統退化造成運動障礙出現像小碎步肢體僵硬震顫並次發性引起腦內麩胺酸神經系統過度活化引發神經毒性和細胞凋亡造成失智目前常用治療藥物為左多巴胺多巴胺體促效劑COMT抑制劑抗膽激素金剛胺等

中山醫大何應瑞教授利用治療腦膜炎肺炎等的抗生素「頭孢曲松」其可穿透血腦障壁直接進入腦組織殺細菌的特性進行罹患帕金森氏症的大鼠實驗投藥2週後治癒失智與運動功能 該藥能減少麩胺酸可抑制神經退化並促進神經新生提升海馬迴路神經活性治療失智也保護多巴胺神經系統恢復神經密度改善運動障礙

孢曲松為抗生素要長期使用可能有其限制如何治療和使用期限必須謹慎面對以免造成抗藥性未來在用藥和劑型要研究以防止抗藥性在兩害中取其輕

22

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

基底細胞癌

黑色素細胞癌

皮膚癌

電影《金剛狼》男主角休傑克曼日前鼻子上貼了一塊大紗布在通訊軟體Instagram

上透露出第五度罹患皮膚基底細胞癌

23

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

鱗狀細胞癌

用於治療皮膚癌之外用凝膠

德英生技公司研發的SR-

T100凝膠用以治療皮膚鱗狀細胞原位癌的第三期臨床試驗解盲達到統計學上顯著差異其所含的是台灣原生植物的活性成份在台灣的臨床試驗共收案113位病患使用SR-

T100凝膠治療皮膚鱗狀細胞原位癌16週臨床試驗證實達到原位癌100完全清除的患者有3239

清除超過75的患者有7183統計分析SR-

T100試驗組與空白基劑組在達到25完全清除人數所需時間具有統計學上顯著差異

24

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

四水凝膠高分子於皮膚創傷敷料產業研發應用

4-1水凝膠特性

4-2水凝膠敷料於皮膚傷口醫療產業之運用

4-3人工皮膚之研發近況

25

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

4-1水凝膠之定義與特性1 1水凝膠簡單的定義是含大量水的3D網絡親水性高分子水含量至少20總重量水凝膠的共通性質即它能在水的環境澎潤移去水後收縮

2凝膠由網狀結構的長鏈分子和溶劑兩種成份組成三維的網狀結構包裹住溶液不讓其任意流動具有容器的作用因此凝膠兼具固體與液體的性質凝膠具一定形狀可以藉由外力破壞來改變形狀一般而言凝膠大多軟且具彈性而此特性與生物體大部分的性質相似(生物相容性)

3一般製備水膠之方式大致可區分為化學膠(chemical

hydrogel)及物理膠(physical hydrogel)兩大類

26

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

物理性水凝膠及化學性水凝膠之區別

27

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

(A) 天然高分子(natural polymer)

陰離子高分子 透明質酸(HA)褐藻酸(alginic)果膠(pectin)碳酸軟

骨素(chondroitin aulhate)

陽離子高分子 幾丁聚醣(chitosan)聚離胺酸(polylysine)

雙性高分子 膠原蛋白(collagen)明膠(gelatin)纖維蛋白(fibrin)

中性高分子 葡萄聚醣(dextran)瓊酯膠(agarose)

聚酯類高分子 PEG-PLA-PEPEG-PLGA-PEGPEG-peL-PEG PLA-PEG-PLA

PHB

其他 PAAm PVAcOVA PNPV PEG-bis-(PLA-acrylate)

p(GEMA-sulfate)

(B)複合型(天然合成)高分子材料

PCPEG-co-peptide)alginate-g-(PEO-PPO-PEO) P(PLGA-co-serine) collagen-acrylate P(HPMA-g-peptide) HA-g-NTPAAm

製備親水性高分子凝膠之高分子材料

28

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

親水性高分子凝膠之種類與應用 1

1水凝膠為一高分子鏈段經由化學或物理交聯後所形成之「可吸水性膠體」最常見於家庭芳香劑之製造另外在生醫方面之應用則以隱形眼鏡為最常見在60

年代Wichterle和Lim等科學家利用交聯方法製備出HEMA(甲基丙醯酸羥基乙酯)水膠該水凝膠不但具備「親水(hydrophilic)」特性更具有相當之「生物相容(biocompatible) 」性質因而廣泛引起科學家將水凝膠應用於生醫領域之高度興趣

21980年Lim和Sum成功的利用海藻酸鈣（calcium

alginate）包覆細胞後來Yannas將膠原蛋白（collagen）及鯊魚軟骨素製備成水凝膠應用於燒燙傷之人工敷料等

29

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

親水性高分子凝膠之種類與應用2

1近幾年來伴隨著生醫材料與組織工程之發展水凝膠在此亦扮演一個不可或缺的角色如藥物蛋白質基因遞送之載體與組織工程之多孔隙基材都有其潛在之應用性目前水凝膠技術已應用於傷口照護生醫產品水凝膠敷料具有降低溫度吸收滲液避免細菌侵入引起感染並可防止與傷口的沾黏因此是非常適合的燒燙傷手術傷口創傷敷料

2細胞生長支架 水凝膠體則具有均勻的3D網狀結構高孔隙率親水性的特性可以製作成複雜的外型適合做為各類型的細胞支架

30

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

皮膚傷口敷料構造研究

(1)當皮膚受到嚴重損害時利用傷口敷料來代替皮膚原有的功能使其避免受到感染脫水現象甚至能夠促進傷口癒合減少疼痛感以及能減少癒合後疤痕的形成在皮膚受到損傷時可以給予覆蓋物來代替皮膚並加速傷口癒合和減少疼痛此即為傷口敷材的作用

(2)一般傳統式敷料如紗布主要的功能是當作傷口清潔與保護用途主要是在吸收血液與其他滲出物經時代的演進新式敷料主要是「濕潤傷口癒合」的觀念

(3) 利用水凝膠敷料將開放性傷口轉變為封閉性傷口進而減少水分蒸散蛋白質滲漏以及細菌入侵的機率是治療技術上重要的一環它可以大輻降低病人的罹病率及死亡率

31

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

32

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

3-3-A水凝膠藥物(含活性成份)釋放系統的分類1

(一) 水凝膠材料分類

1按水凝膠骨架形成結構來分可分為線性高分子水凝膠與交聯網絡型水凝膠前者具有溶脹－溶解特徵並具有可逆性後者只有有限度的溶脹而不溶解

2 按水凝膠中水分子鏈的降解性來分可分為溶蝕型與不溶型水凝膠前者交聯鍵或分子鍵是由不穩定鍵形成在特殊介質環境中可降解成rdquo碎片rdquo具有不可逆性由穩定的交聯鍵形成不可降解

3按水凝膠釋放系統之藥物載體材料來源如下

33

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

水凝膠藥物(含活性成份)釋控載體的分類2

3-(1)天然材料如天然膠果膠阿拉伯膠魔芋膠(Kon-Javbel) 藻酸鹽瓊脂瓜耳樹膠西黃蓍膠明膠等

3-(2)改性材料如澱粉及其衍生物纖維素衍生物甲基纖維素(MC)羥乙基纖維素(HEC)羥丙甲纖維素(HPMC)羧甲基纖維素(CMC)羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)非纖維素多糖類売多糖脫乙醯売聚糖半乳糖甘露聚糖

3-(3)合成材料乙烯類聚乙烯醇(PVA)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)丙烯酸及其酯類聚甲基丙烯酸羥乙酯(P-HEMA)Polycarbophil卡波姆(Carbomer)丙烯酸樹酯聚丙烯醯胺類(PAAm)其他類型聚乙二醇(PEG)

34

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

器官或組織之缺損(Missing Organ or Tissue) 人體一個器官或組織因受傷或疾病(先天或後天)而喪

失一部份或全部功能者(An organ may be lost to injury or may fail in disease)

(1) 藥物療法 (2) 器官移植 Transplant (自我-同源-同種-異種- ) (3) 人工植入物 Implant or Artificial Substitute 無機物機物複合材料 (4) 具有活性人工植入物Viable Substitute 生長激素 細胞培植(cell-seeded) (5) 器官培養Organ Culture 體內培養In-vivo amp 體外培養In-vitro (Tissue Engineering)

(6) 基因療法 Gene Therapy (7) 複製生命體

4-3再生醫學

35

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

Bioreactor

36

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

由與透明質酸與膠原蛋白所組成之多孔性海綿基質

結合纖維細胞所形成的人工培養皮膚之特性1

1 一種同種異體人工培養皮膚（CDS）這是經由纖維母細胞在透明質酸HA和膠原蛋白（col）雙層式海綿組織所培養出來的膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維母細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周一定含水量之功能 膠原蛋白海綿層須有連結性及促進纖維細胞分裂增生的能力HA海綿層須有維持傷口表面四周之一定含水量2關於HAcol最適當化的重量比率要由以下因素來決定的如手功剝除之機械性質經冷凍處理后之細胞存活性及有促進血管內因子（VEGF）能力傷口癒合能力及製作成本等報告主要是討論人工剝除之機械（物理）性質及在海綿體中的纖維細胞的成長行為及在初生及經冷凍處理后之成長因子（VEGF）由纖維細胞中所釋放數量的多寡

37

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

38

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

1圖1由電子顯微鏡可以看出雙層海綿基層是由不同重量比例的HAcol所組成的圖示HA層是一種均一結構且多孔性的海綿基質而較於col的多孔性較小些了不織布是接在HA層的底部

2未參與混合的不織布將會使得人們容易用鑷子夾起CDS

因為CDS是由HA單獨組成或HAcol雙層組成其中HAcol重量比例在101或51發現無法用鑷子夾起可能是水合反應太高

39

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

由圖2中可以明顯看出CDS是由不同雙層組織結構圖當col海綿層可以用來維護基質的多孔性當然比例愈高基質多孔性就多由此可以看出col海綿是控制CDS基質的水合反應

40

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

開始培育纖維母細胞是控制在10cellcm2大多數的細胞無法加裝在高親水性的HA海綿層內及大量的繁殖這些情形與單獨col時（100wit）的情形是一樣的在培養1天后細胞經算數后約072~091 x 10cellcm2

在圖3中可以看出雙層HAcol及單獨的col海綿基質皆可以大量成長

41

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

CDS低溫冷藏下之纖維母細胞的生存能力

細胞的數目可以間接由MTT試劑的吸收能力來估算圖4可以看出初生的CDS經1星期之培養繁殖中col重量比例與細胞數目之關係圖由圖中也可以看出CDS經冷凍及再冷凍培植1星期后纖維母細胞的數目隨col在CDS中重量比例之增加有增加之情形發生纖維母細胞在雙層海綿組織經冷凍處理后再培養仍然可以大量分裂增殖單獨col海綿層亦有相同情形發生

42

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

由CDS釋放游離VEGF之定量分析

由圖5中可以看出VEGF由CDS

所游離之數量在冷凍之前及冷凍處理隨著再生培養1星期之關係圖在初生製備的純HA或高比例HAcol（101）時之海綿基質中可以游離大量的VEGF但是以上經過冷凍處理組成再行重生處理所游離的VEGF數量就小了許多而膠原單獨（100）或海綿基質膠原比例為52~54時CDS基質經冷凍再行重生處理所能重生的VEGF數目就有明顯的增加 43

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

工研院生醫所研究團隊研發全透明人工皮

燒燙傷患者處理傷口換藥時最怕遇到拆解繃帶因為會將逐漸癒合的外皮組織撕裂造成二度傷害

工研院研發出的「全透明材料」使用動物膠原蛋白製成具有高透明高含水特性完全具有完全貼合皮膚輕巧可被生物吸收裂解不會沾黏傷口組織且不須再取出適合做成人體內外傷口的敷傷材料未來更可結合幹細胞成為含細胞的「人工皮膚」

44

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

ips cell人造皮膚新研究

近來已有許多以血管內皮細胞及各種基質來建立各種血管新生模型的研究Black AF等人在1998年發表了以膠原蛋白聚合物表皮細胞纖維母細胞及臍靜脈內皮細胞合成的皮膚由組織工程所製造出來的皮膚自然形成類似微血管的構造再者Frerich B等人於2001 年發展出以人類脂肪細胞臍靜脈內皮細胞及由纖維蛋白支架所製成的軟組織也能長出類微血管的構造後來學者有關血管新生的模型有更深入的研究

為近來人造皮膚的研究開啓了重大向進展

45

45

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

誘導式多功能幹細胞 (Induced pluripotent

stem cells ) 簡稱為Ips cell

2003年英國劍橋大學的 John Gurdon研究小組發現將已分化完全的小鼠胸腺細胞注射至非洲爪蟾的卵母細胞時卵母細胞的某種配方會重新設定胸腺細胞並讓其開始表現胚胎幹細胞的特殊轉錄因子Oct4 (Curr Biol2003 )

2006年時日本京都大學Shinya Yamanaka

的研究發現只需要將四個基因 Oct34 Sox2 c-

Myc Klf4 轉入已分化完全的小鼠纖維母細胞即可以把纖維母細胞重新設定回類似胚胎幹細胞他們將這種重新設定細胞稱之為誘導式多功能幹細胞 (iPS cells)(Cell 2006)

46

46

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

iPS細胞的特質很類似胚胎幹細胞經由特殊訊號分子之引導即可將它們轉換成為各種體細胞 (如神經細胞或肝臟細胞等)但是第一代iPS細胞的基因程度與胚胎幹細胞還是有顯著的差異也沒法合成鼠形成嵌合體 (chimera)

為了更精確地將纖維母細胞完全的轉變成為真正的胚胎幹細胞2007年Shinya Yamanaka研究團隊除使用四種轉錄因子並利用Nanog分子作為鑑定iPS細胞的標記他們在Nanog 載體後接上了一段抗藥性的基因如此被轉型成功的iPS 細胞在加了抗生素的培養皿內方可生存這個改良方式所得到的第二代iPS細胞不但具有和胚胎幹細胞幾乎一樣的基因印痕 (imprinting) 模式順利的合成鼠形成嵌合體並產生後代 (Nature2007)後來美國Rudol

Jaenisch 研究團隊也利用這四個轉錄因子成功地將體細胞轉變成iPS 細胞 (Biotechnol 2007)證實 Shinya由老鼠體細胞轉變來的第二代iPS細胞跟胚胎幹細胞近乎具有一樣的特質

47

47

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

以誘導式多功能幹細胞 培植具毛囊及汗腺功能人工皮

神戶科學家先從一隻「無毛鼠」的牙齦提取人工誘導多能幹細胞（iPS）經過一週培養出細胞群後隨後將細胞群植入膠原蛋白並植入實驗鼠體內30天後出現腫瘤樣的肉片分析肉片發現包含毛囊等的皮膚以及其他組織科學家之後設法製作多層的皮膚組織毛囊及汗腺達成該研究團隊在這次實驗中的最大成就這隻實驗用鼠的免疫系統已受抑制人工皮與牠的皮膚緊密貼合並開始長毛與正常老鼠一樣的生長週期內換了3

次毛在3個月觀察期中iPS細胞都沒有發生癌病變

48

48

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

五含活性物高分子醫材於經皮傳輸劑型療效評估

5-1含活性物高分子醫材之經皮傳輸評估

5-2具活性有效成份之功效機轉評估

49

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

5-1-1經皮傳輸性能評估方法

將事先浸泡於生理食鹽水中過夜之豬皮裁成適當大小（直徑約44公分）置於O形台深凹玻片內角質層面豬皮朝上與山藥配方貼片平行緊靠接受池注滿36mL之生理食鹽水溫度控制37在磁石均勻攪拌下於05103060120240小時分別取樣取樣體積每次8mL並立即充滿新的生理食鹽水取出接受液用微孔滤膜過滤並以uv光譜分析儀以254nm波長來測定含薯預皂含量藉由檢量曲線來定量其有效成份的濃度

50

50

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

51

5-1-1a促進細胞增生的動物評估機制 經皮傳輸儀器設備

1 － 檢體室 2 － 皮膚膜片 3 － O形台 4 － 標本採集 5 － 保溫槽 6 － 攪拌子 經皮傳輸性能評估儀

51

51

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

抗老化（清除DPPH自由基）能力評估方法 清除DPPH(αα-diphenyl-β-picrylhydrazyl)自由基之評估以Scavenging 表示定義如下

52

52

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

5-1-1bReun山藥能量霜抗自由基評估結果 抗老化抗自由基（DPPH）效能評估圖

53

53

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

五-2含活性成份之高分子醫材其功效機轉評估

54 54

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

A活性萃取物之細胞毒性評估

細胞毒性試驗 以測定法觀察萃取物之細胞毒性首先分別將50微升不同濃度(0至200微克毫升)之萃取物加入至含有纖維母細胞Hs68之96孔培養盤中(每孔接種10 4 個細胞)於37含有5體積之二氧化碳的培養箱中培養24小時後添加15微升之MTT溶液(5毫克毫升溶於磷酸鹽緩衝溶液中)再將纖維母細胞Hs68於37下培養3小時接著添加75微升之十二基硫酸鈉(SDS)溶液(10之SDS溶於001當量濃度之鹽酸中)至該培養盤中並於24小時後以一酵素免疫分析儀於570奈米之波長下測定各孔之吸光值計算細胞存活率以定量萃取物之細胞毒性

55 55

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

B活性萃取物對皮膚刺激性評估

皮膚刺激試驗將New Zealand White rabbits背部皮膚部位剃去毛皮使用無菌的20號皮下注射針之尖端在各受試皮膚部位做成tic-tac-toe圖樣之刮傷將試料施用至經處理的試驗皮膚上由有經驗的科學家檢視24小時72小時後的皮膚受刺激徵象包括產生紅斑結疤及形成水腫皮膚受刺激程度的評分標準為最低的0分(無刺激反應)至最高的8分(嚴重刺激)

56 56

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

C活性萃取物對抑制黑色素細胞生成評估

1細胞培養方法 使用來自老鼠之B16黑色素瘤(melanoma)培養細胞利用含有10FBS與茶葉鹼(009mgml)之英格爾(Eagle)EM培養基於CO 2 恆溫槽（95空氣5二氧化碳）內37的條件下進行培養於培養24小時後添加試料溶液使得最終濃度（萃取乾燥物換算濃度）成為10 -2 ~10 -5 再持續3天的培養然後藉以下的方法來測定黑色素生成量之視覺判定以及酪氨酸酶活性

2黑色素生成量之視覺判定 於96井板之蓋上放置擴散板以倒立顯微鏡觀察細胞內之黑色素量來與未添加萃取物之試料（基準）的情形進行比較

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

3黑色素生成抑制試驗

(1)細胞播種小鼠B16黑色素瘤細胞以100000細胞孔播種於6孔板第2天添加試驗物質溶液(溶媒DMSO)

(2)細胞增殖試驗在添加試驗物質溶液後的第3天將培養基吸除後添加含有阿爾瑪藍(Alamar Blue TM)的EMEM培養基1ml在37下反應30分鐘後將100μl 移到96孔板以激發波長544nm測定波長590nm測定螢光將測定值作為細胞數的相對值算出試驗物質添加組的細胞數對試驗物質無添加組(對照組僅添加溶媒)的比率(細胞數)

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

細胞數越高表示細胞毒性越低以細胞數在80以上時判斷為無毒性未達80時判斷為有毒性

(3)黑色素定量細胞增殖試驗後的細胞以PBS洗淨3次後添加1MNaOH 200μl 溶解細胞測定475nm的吸光度以此值作為黑色素量的相對值算出試驗物質添加組對試驗物質無添加組(只加溶媒)的黑色素含量比率()黑色素量比率越低表示黑色素生成抑制效果越高

59

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

D活性物藥物對細胞存活率分析(MTT assay)

MTT assay(3-(45-Dimethylthiazol-2-yl)-25-diphenyltetrazolium bromide)是一種用於測量細胞的之存活性試驗 MTT為一種接受氫離子黃染料可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈在琥珀酸胞脫氫醇(SDH)細胞色素C的作用下四氫唑環會開裂生成紫色結晶物利用DMSO將formazan溶解出來之後再利用吸光度的測定去評估細胞存活率(死細胞中的琥珀酸胞脫氫醇會消失但不能將MTT還原）也可在培養基投入藥物評估藥物對細胞的增生或死亡有無具體影響[

60

六用以治療陰部感染病症經皮靶位傳輸新劑型開發及新劑型效益

虹纖生醫科技股份有限公司 執行長 施明光 分子生技博士

61

4

現行陰道感染治療主要藥物劑型及其不良反應分析表

陰道感染源 治療藥物 廠商名稱 劑型 不良反應

1黴菌白色念珠菌

Nystatin

CAS 400-619

分子式

C47H75N017

Bristol 口服 Nystan 腸胃不適噁心胸悶便秘過敏反應

PampG 陰道塞劑

Nysert

皮膚燒灼疼痛乾澀刺激脫皮

Bayer 乳膏

Nystaform

皮膚紅腫燒灼疼痛乾澀

2寄生蟲陰道滴蟲

Metronidazole

甲硝唑

CAS 443-48-1

分子式

C6H9N303

美國輝瑞

口服 Flagyl

異味(金屬味)噁心排尿困難過敏肝腎不適痙孿

澳洲藥廠

陰道塞劑

AdeLaide

皮膚燒灼乾澀疼痛脫皮

62

陰道感染源

治療藥物 廠商名稱

劑型 不良反應

3細菌

披衣菌

支原體菌

加德納菌

Miconazole

噻康唑

CAS 22916-47-8

分子式

C18H14Cl4N2O

英國

口服

Daktarin

24mgml

腸胃不適嘔吐噁心腹痛過敏反應

美國嬌生

乳膏2Daktacort

cream

皮膚紅腫燒灼疼痛

4病毒

皰疹病毒

HSV

Acyclovir

無環鳥苷

CAS 59277-89-3

分子式

C8H11N5O3

GSK

澳洲藥廠

口服200mg

Zovirx

肝腎不適症頭痛噁心血液病變過敏反應皮疹

乳膏5

Zovirxcream

皮膚紅腫疼痛搔癢脫皮乾澀刺激

現行陰道感染治療主要藥物劑型及其不良反應分析表

63

本研發產品新穎性說明

新劑型係含有高親水性PU泡綿及水凝膠體載體 PU泡綿的產品設計 圓形直徑尺5cm內圓周圍事先切有半圓形的細縫結構便於使用者自行用手托入陰道底部 PU泡綿的產品設計可塞滿陰道平均3cm之空間新劑型可藉由PU泡綿內可自由移動的水分子作用下將分散於水凝膠載體的活性藥物進行經皮藥物傳輸 與陰道濕膜的病灶細胞直接產生了生物的粘附作用以發揮藥效與口服劑型比較具有以下之優點

1新劑型與陰道濕膜病灶細胞直接作用藥物用量少毒副小

2新劑型具有藥物緩釋的効果

3水凝膠載體在陰道組織形成保護膜可減輕發炎時的疼痛

4新劑型之水凝膠載體及泡綿醫材對抑制HPV16假病毒的活性

具有加成的效果

64

六之一高親水性PU泡綿醫材的研究

PU材料是由多元醇與異氰酸塩之縮合聚合物 (2324)

目前已應用在生醫材料上一般的PU纖維若在擠壓延伸下呈現彈性纖維時之吸水率在03以下若改為發泡擠壓射出氣泡會呈密密蔴蔴的海綿狀PU泡綿單位面積內孔洞數目提高時PU泡綿吸水性就會增加 (一般工業級的PU海綿吸水率約為250左右)本實驗將增加高親水性的多元醇(polyol)的配方比例來取代現行工業用PU泡綿之聚醚三元醇以開發出高吸水性(吸水率要大於500以上)低密度(03gcm以下)高透氣性小於5秒之內的新醫材

65

6-1-A-(1)高親水性泡PU泡綿配方改質的實驗方法

1本實驗PU發泡是採二液型(two-component)就是將異氰酸塩單獨置於一槽 其 餘的多元醇及發泡劑觸媒發泡穩定劑及其它的潻加劑等置於另一槽於無溶劑下採單一步驟合成程序流程如圖2此程序是同時混合共同反應物與潻加劑

2將聚醚三元醇發泡劑鏈延長劑催化劑發泡穩定劑發泡穩定劑等按表1所列的組合(如實驗例1實驗例2比較例A比較例B比較例C)按其配方之重量比率分別加入A槽維持在40下充份溶解並攪拌約20分準備下個步驟

3單獨將異氰酸塩按下表1所列的組合按其配方之重量比率分別加入B槽維持在40下充份溶解並攪拌約10分準備下個步驟

4將充份攪拌均勻後之A槽及B槽的潻加物 同時注入聚合槽內以高速(3000rpm)混合約2秒後經擠壓射出機射出後再經發泡程序

(100發泡2分鐘)形成發泡體再置於熟成室(室溫下熟成7天)即成高親水性泡PU泡綿(如圖2所示)稍候進行以下的物性評估

5 PU泡綿的密度透氣性保水度回彈性孔隙度等物性物性評估方法 参考下一頁

66

高親水性PU泡綿醫材性質評估

1比重=質量體積單位(gcm3)比重小質輕 使用時較舒適測試評估IS-103-NSP-002(ASTM D1056)

2透氣單位(秒)透氣性秒數越小泡綿親膚性舒適性越佳測試評估 IS-103-NSP-003(CNS12915 B法)

3吸水率 = times 100 吸水率越高親膚性

舒適性越佳測試評估IS-103 NSP-001(CNS7819)

4回彈試驗單位(sec)回彈的時間越小 PU泡綿入陰道之回彈性質越佳測試評估IS-103-NSP-005(ASTM D395 B法)

5孔隙度係先利用影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera

Pro150ES)在相同浮標尺寸下將泡綿樣品以40倍的放大倍率拍攝成分析影像分別計算樣品各單位面積內孔洞個數值越高

表示泡綿的吸水性透氣性柔軟度膠體的包覆及膠體的釋放率愈佳

67

吸水重量－回潮重量 回潮重量

高親水性泡PU泡綿配方調配原則

本實驗配方組合的多元醇藉由選用GCP-203GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較隨著醚基及羥基用量比例增加來增加PU泡綿的親水之能力實驗配方組合的異氰酸塩藉由選用MDI與習用TDI的區劑在於TDI對人體的毒性較高且選用MDI相較於TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構選用水分子作為發泡劑與傳統PU泡綿的發泡劑二氯甲烷除能降低對人體的毒性外且因水分子較小發泡蒸發時PU泡棉所產出的孔洞數目也隨著增多藉由實驗配方組合的變化對PU泡綿醫材之物性包括密度透氣性保水度回彈性孔隙度等進行評估

68

密度(gcm3) 保水率

rate ()

通氣性(sec) 回彈時間(sec)

孔隙度

(porescm2)

實驗例 1 0058plusmn0001 1104plusmn26 89plusmn01 lt1 3400plusmn88

實驗例 2 0033plusmn0001 1674plusmn35 17plusmn002 lt1 5700plusmn181

比較例 A 006plusmn0001 2544plusmn5 346plusmn05 gt1 788plusmn23

比較例 B 002plusmn00003 390plusmn8 299plusmn04 gt1 --

比較例 C 001plusmn00001 600plusmn13 303plusmn04 gt1 --

表2 改變PU配方添加重量比例變化對泡綿物性變化之結果

實驗例1及實驗例2 經改質高親水性PU泡綿實驗得出的物性結果 與傳統的比較例ABC 相互比較 均擁有較佳的保水率透氣性及回彈性 且改質高親水性PU泡綿 所得出泡綿的密度較低表示該泡綿的孔洞較多

69

6-1-A-(2) 泡綿結構及孔隙度的分析結果 泡綿結構之影像分析

影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera Pro150ES)

1 mm 1 mm

1 mm1 mm1 mm

比較例A

實施例1 實施例2

70

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

4

現行陰道感染治療主要藥物劑型及其不良反應分析表

陰道感染源 治療藥物 廠商名稱 劑型 不良反應

1黴菌白色念珠菌

Nystatin

CAS 400-619

分子式

C47H75N017

Bristol 口服 Nystan 腸胃不適噁心胸悶便秘過敏反應

PampG 陰道塞劑

Nysert

皮膚燒灼疼痛乾澀刺激脫皮

Bayer 乳膏

Nystaform

皮膚紅腫燒灼疼痛乾澀

2寄生蟲陰道滴蟲

Metronidazole

甲硝唑

CAS 443-48-1

分子式

C6H9N303

美國輝瑞

口服 Flagyl

異味(金屬味)噁心排尿困難過敏肝腎不適痙孿

澳洲藥廠

陰道塞劑

AdeLaide

皮膚燒灼乾澀疼痛脫皮

62

陰道感染源

治療藥物 廠商名稱

劑型 不良反應

3細菌

披衣菌

支原體菌

加德納菌

Miconazole

噻康唑

CAS 22916-47-8

分子式

C18H14Cl4N2O

英國

口服

Daktarin

24mgml

腸胃不適嘔吐噁心腹痛過敏反應

美國嬌生

乳膏2Daktacort

cream

皮膚紅腫燒灼疼痛

4病毒

皰疹病毒

HSV

Acyclovir

無環鳥苷

CAS 59277-89-3

分子式

C8H11N5O3

GSK

澳洲藥廠

口服200mg

Zovirx

肝腎不適症頭痛噁心血液病變過敏反應皮疹

乳膏5

Zovirxcream

皮膚紅腫疼痛搔癢脫皮乾澀刺激

現行陰道感染治療主要藥物劑型及其不良反應分析表

63

本研發產品新穎性說明

新劑型係含有高親水性PU泡綿及水凝膠體載體 PU泡綿的產品設計 圓形直徑尺5cm內圓周圍事先切有半圓形的細縫結構便於使用者自行用手托入陰道底部 PU泡綿的產品設計可塞滿陰道平均3cm之空間新劑型可藉由PU泡綿內可自由移動的水分子作用下將分散於水凝膠載體的活性藥物進行經皮藥物傳輸 與陰道濕膜的病灶細胞直接產生了生物的粘附作用以發揮藥效與口服劑型比較具有以下之優點

1新劑型與陰道濕膜病灶細胞直接作用藥物用量少毒副小

2新劑型具有藥物緩釋的効果

3水凝膠載體在陰道組織形成保護膜可減輕發炎時的疼痛

4新劑型之水凝膠載體及泡綿醫材對抑制HPV16假病毒的活性

具有加成的效果

64

六之一高親水性PU泡綿醫材的研究

PU材料是由多元醇與異氰酸塩之縮合聚合物 (2324)

目前已應用在生醫材料上一般的PU纖維若在擠壓延伸下呈現彈性纖維時之吸水率在03以下若改為發泡擠壓射出氣泡會呈密密蔴蔴的海綿狀PU泡綿單位面積內孔洞數目提高時PU泡綿吸水性就會增加 (一般工業級的PU海綿吸水率約為250左右)本實驗將增加高親水性的多元醇(polyol)的配方比例來取代現行工業用PU泡綿之聚醚三元醇以開發出高吸水性(吸水率要大於500以上)低密度(03gcm以下)高透氣性小於5秒之內的新醫材

65

6-1-A-(1)高親水性泡PU泡綿配方改質的實驗方法

1本實驗PU發泡是採二液型(two-component)就是將異氰酸塩單獨置於一槽 其 餘的多元醇及發泡劑觸媒發泡穩定劑及其它的潻加劑等置於另一槽於無溶劑下採單一步驟合成程序流程如圖2此程序是同時混合共同反應物與潻加劑

2將聚醚三元醇發泡劑鏈延長劑催化劑發泡穩定劑發泡穩定劑等按表1所列的組合(如實驗例1實驗例2比較例A比較例B比較例C)按其配方之重量比率分別加入A槽維持在40下充份溶解並攪拌約20分準備下個步驟

3單獨將異氰酸塩按下表1所列的組合按其配方之重量比率分別加入B槽維持在40下充份溶解並攪拌約10分準備下個步驟

4將充份攪拌均勻後之A槽及B槽的潻加物 同時注入聚合槽內以高速(3000rpm)混合約2秒後經擠壓射出機射出後再經發泡程序

(100發泡2分鐘)形成發泡體再置於熟成室(室溫下熟成7天)即成高親水性泡PU泡綿(如圖2所示)稍候進行以下的物性評估

5 PU泡綿的密度透氣性保水度回彈性孔隙度等物性物性評估方法 参考下一頁

66

高親水性PU泡綿醫材性質評估

1比重=質量體積單位(gcm3)比重小質輕 使用時較舒適測試評估IS-103-NSP-002(ASTM D1056)

2透氣單位(秒)透氣性秒數越小泡綿親膚性舒適性越佳測試評估 IS-103-NSP-003(CNS12915 B法)

3吸水率 = times 100 吸水率越高親膚性

舒適性越佳測試評估IS-103 NSP-001(CNS7819)

4回彈試驗單位(sec)回彈的時間越小 PU泡綿入陰道之回彈性質越佳測試評估IS-103-NSP-005(ASTM D395 B法)

5孔隙度係先利用影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera

Pro150ES)在相同浮標尺寸下將泡綿樣品以40倍的放大倍率拍攝成分析影像分別計算樣品各單位面積內孔洞個數值越高

表示泡綿的吸水性透氣性柔軟度膠體的包覆及膠體的釋放率愈佳

67

吸水重量－回潮重量 回潮重量

高親水性泡PU泡綿配方調配原則

本實驗配方組合的多元醇藉由選用GCP-203GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較隨著醚基及羥基用量比例增加來增加PU泡綿的親水之能力實驗配方組合的異氰酸塩藉由選用MDI與習用TDI的區劑在於TDI對人體的毒性較高且選用MDI相較於TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構選用水分子作為發泡劑與傳統PU泡綿的發泡劑二氯甲烷除能降低對人體的毒性外且因水分子較小發泡蒸發時PU泡棉所產出的孔洞數目也隨著增多藉由實驗配方組合的變化對PU泡綿醫材之物性包括密度透氣性保水度回彈性孔隙度等進行評估

68

密度(gcm3) 保水率

rate ()

通氣性(sec) 回彈時間(sec)

孔隙度

(porescm2)

實驗例 1 0058plusmn0001 1104plusmn26 89plusmn01 lt1 3400plusmn88

實驗例 2 0033plusmn0001 1674plusmn35 17plusmn002 lt1 5700plusmn181

比較例 A 006plusmn0001 2544plusmn5 346plusmn05 gt1 788plusmn23

比較例 B 002plusmn00003 390plusmn8 299plusmn04 gt1 --

比較例 C 001plusmn00001 600plusmn13 303plusmn04 gt1 --

表2 改變PU配方添加重量比例變化對泡綿物性變化之結果

實驗例1及實驗例2 經改質高親水性PU泡綿實驗得出的物性結果 與傳統的比較例ABC 相互比較 均擁有較佳的保水率透氣性及回彈性 且改質高親水性PU泡綿 所得出泡綿的密度較低表示該泡綿的孔洞較多

69

6-1-A-(2) 泡綿結構及孔隙度的分析結果 泡綿結構之影像分析

影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera Pro150ES)

1 mm 1 mm

1 mm1 mm1 mm

比較例A

實施例1 實施例2

70

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

陰道感染源

治療藥物 廠商名稱

劑型 不良反應

3細菌

披衣菌

支原體菌

加德納菌

Miconazole

噻康唑

CAS 22916-47-8

分子式

C18H14Cl4N2O

英國

口服

Daktarin

24mgml

腸胃不適嘔吐噁心腹痛過敏反應

美國嬌生

乳膏2Daktacort

cream

皮膚紅腫燒灼疼痛

4病毒

皰疹病毒

HSV

Acyclovir

無環鳥苷

CAS 59277-89-3

分子式

C8H11N5O3

GSK

澳洲藥廠

口服200mg

Zovirx

肝腎不適症頭痛噁心血液病變過敏反應皮疹

乳膏5

Zovirxcream

皮膚紅腫疼痛搔癢脫皮乾澀刺激

現行陰道感染治療主要藥物劑型及其不良反應分析表

63

本研發產品新穎性說明

新劑型係含有高親水性PU泡綿及水凝膠體載體 PU泡綿的產品設計 圓形直徑尺5cm內圓周圍事先切有半圓形的細縫結構便於使用者自行用手托入陰道底部 PU泡綿的產品設計可塞滿陰道平均3cm之空間新劑型可藉由PU泡綿內可自由移動的水分子作用下將分散於水凝膠載體的活性藥物進行經皮藥物傳輸 與陰道濕膜的病灶細胞直接產生了生物的粘附作用以發揮藥效與口服劑型比較具有以下之優點

1新劑型與陰道濕膜病灶細胞直接作用藥物用量少毒副小

2新劑型具有藥物緩釋的効果

3水凝膠載體在陰道組織形成保護膜可減輕發炎時的疼痛

4新劑型之水凝膠載體及泡綿醫材對抑制HPV16假病毒的活性

具有加成的效果

64

六之一高親水性PU泡綿醫材的研究

PU材料是由多元醇與異氰酸塩之縮合聚合物 (2324)

目前已應用在生醫材料上一般的PU纖維若在擠壓延伸下呈現彈性纖維時之吸水率在03以下若改為發泡擠壓射出氣泡會呈密密蔴蔴的海綿狀PU泡綿單位面積內孔洞數目提高時PU泡綿吸水性就會增加 (一般工業級的PU海綿吸水率約為250左右)本實驗將增加高親水性的多元醇(polyol)的配方比例來取代現行工業用PU泡綿之聚醚三元醇以開發出高吸水性(吸水率要大於500以上)低密度(03gcm以下)高透氣性小於5秒之內的新醫材

65

6-1-A-(1)高親水性泡PU泡綿配方改質的實驗方法

1本實驗PU發泡是採二液型(two-component)就是將異氰酸塩單獨置於一槽 其 餘的多元醇及發泡劑觸媒發泡穩定劑及其它的潻加劑等置於另一槽於無溶劑下採單一步驟合成程序流程如圖2此程序是同時混合共同反應物與潻加劑

2將聚醚三元醇發泡劑鏈延長劑催化劑發泡穩定劑發泡穩定劑等按表1所列的組合(如實驗例1實驗例2比較例A比較例B比較例C)按其配方之重量比率分別加入A槽維持在40下充份溶解並攪拌約20分準備下個步驟

3單獨將異氰酸塩按下表1所列的組合按其配方之重量比率分別加入B槽維持在40下充份溶解並攪拌約10分準備下個步驟

4將充份攪拌均勻後之A槽及B槽的潻加物 同時注入聚合槽內以高速(3000rpm)混合約2秒後經擠壓射出機射出後再經發泡程序

(100發泡2分鐘)形成發泡體再置於熟成室(室溫下熟成7天)即成高親水性泡PU泡綿(如圖2所示)稍候進行以下的物性評估

5 PU泡綿的密度透氣性保水度回彈性孔隙度等物性物性評估方法 参考下一頁

66

高親水性PU泡綿醫材性質評估

1比重=質量體積單位(gcm3)比重小質輕 使用時較舒適測試評估IS-103-NSP-002(ASTM D1056)

2透氣單位(秒)透氣性秒數越小泡綿親膚性舒適性越佳測試評估 IS-103-NSP-003(CNS12915 B法)

3吸水率 = times 100 吸水率越高親膚性

舒適性越佳測試評估IS-103 NSP-001(CNS7819)

4回彈試驗單位(sec)回彈的時間越小 PU泡綿入陰道之回彈性質越佳測試評估IS-103-NSP-005(ASTM D395 B法)

5孔隙度係先利用影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera

Pro150ES)在相同浮標尺寸下將泡綿樣品以40倍的放大倍率拍攝成分析影像分別計算樣品各單位面積內孔洞個數值越高

表示泡綿的吸水性透氣性柔軟度膠體的包覆及膠體的釋放率愈佳

67

吸水重量－回潮重量 回潮重量

高親水性泡PU泡綿配方調配原則

本實驗配方組合的多元醇藉由選用GCP-203GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較隨著醚基及羥基用量比例增加來增加PU泡綿的親水之能力實驗配方組合的異氰酸塩藉由選用MDI與習用TDI的區劑在於TDI對人體的毒性較高且選用MDI相較於TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構選用水分子作為發泡劑與傳統PU泡綿的發泡劑二氯甲烷除能降低對人體的毒性外且因水分子較小發泡蒸發時PU泡棉所產出的孔洞數目也隨著增多藉由實驗配方組合的變化對PU泡綿醫材之物性包括密度透氣性保水度回彈性孔隙度等進行評估

68

密度(gcm3) 保水率

rate ()

通氣性(sec) 回彈時間(sec)

孔隙度

(porescm2)

實驗例 1 0058plusmn0001 1104plusmn26 89plusmn01 lt1 3400plusmn88

實驗例 2 0033plusmn0001 1674plusmn35 17plusmn002 lt1 5700plusmn181

比較例 A 006plusmn0001 2544plusmn5 346plusmn05 gt1 788plusmn23

比較例 B 002plusmn00003 390plusmn8 299plusmn04 gt1 --

比較例 C 001plusmn00001 600plusmn13 303plusmn04 gt1 --

表2 改變PU配方添加重量比例變化對泡綿物性變化之結果

實驗例1及實驗例2 經改質高親水性PU泡綿實驗得出的物性結果 與傳統的比較例ABC 相互比較 均擁有較佳的保水率透氣性及回彈性 且改質高親水性PU泡綿 所得出泡綿的密度較低表示該泡綿的孔洞較多

69

6-1-A-(2) 泡綿結構及孔隙度的分析結果 泡綿結構之影像分析

影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera Pro150ES)

1 mm 1 mm

1 mm1 mm1 mm

比較例A

實施例1 實施例2

70

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

本研發產品新穎性說明

新劑型係含有高親水性PU泡綿及水凝膠體載體 PU泡綿的產品設計 圓形直徑尺5cm內圓周圍事先切有半圓形的細縫結構便於使用者自行用手托入陰道底部 PU泡綿的產品設計可塞滿陰道平均3cm之空間新劑型可藉由PU泡綿內可自由移動的水分子作用下將分散於水凝膠載體的活性藥物進行經皮藥物傳輸 與陰道濕膜的病灶細胞直接產生了生物的粘附作用以發揮藥效與口服劑型比較具有以下之優點

1新劑型與陰道濕膜病灶細胞直接作用藥物用量少毒副小

2新劑型具有藥物緩釋的効果

3水凝膠載體在陰道組織形成保護膜可減輕發炎時的疼痛

4新劑型之水凝膠載體及泡綿醫材對抑制HPV16假病毒的活性

具有加成的效果

64

六之一高親水性PU泡綿醫材的研究

PU材料是由多元醇與異氰酸塩之縮合聚合物 (2324)

目前已應用在生醫材料上一般的PU纖維若在擠壓延伸下呈現彈性纖維時之吸水率在03以下若改為發泡擠壓射出氣泡會呈密密蔴蔴的海綿狀PU泡綿單位面積內孔洞數目提高時PU泡綿吸水性就會增加 (一般工業級的PU海綿吸水率約為250左右)本實驗將增加高親水性的多元醇(polyol)的配方比例來取代現行工業用PU泡綿之聚醚三元醇以開發出高吸水性(吸水率要大於500以上)低密度(03gcm以下)高透氣性小於5秒之內的新醫材

65

6-1-A-(1)高親水性泡PU泡綿配方改質的實驗方法

1本實驗PU發泡是採二液型(two-component)就是將異氰酸塩單獨置於一槽 其 餘的多元醇及發泡劑觸媒發泡穩定劑及其它的潻加劑等置於另一槽於無溶劑下採單一步驟合成程序流程如圖2此程序是同時混合共同反應物與潻加劑

2將聚醚三元醇發泡劑鏈延長劑催化劑發泡穩定劑發泡穩定劑等按表1所列的組合(如實驗例1實驗例2比較例A比較例B比較例C)按其配方之重量比率分別加入A槽維持在40下充份溶解並攪拌約20分準備下個步驟

3單獨將異氰酸塩按下表1所列的組合按其配方之重量比率分別加入B槽維持在40下充份溶解並攪拌約10分準備下個步驟

4將充份攪拌均勻後之A槽及B槽的潻加物 同時注入聚合槽內以高速(3000rpm)混合約2秒後經擠壓射出機射出後再經發泡程序

(100發泡2分鐘)形成發泡體再置於熟成室(室溫下熟成7天)即成高親水性泡PU泡綿(如圖2所示)稍候進行以下的物性評估

5 PU泡綿的密度透氣性保水度回彈性孔隙度等物性物性評估方法 参考下一頁

66

高親水性PU泡綿醫材性質評估

1比重=質量體積單位(gcm3)比重小質輕 使用時較舒適測試評估IS-103-NSP-002(ASTM D1056)

2透氣單位(秒)透氣性秒數越小泡綿親膚性舒適性越佳測試評估 IS-103-NSP-003(CNS12915 B法)

3吸水率 = times 100 吸水率越高親膚性

舒適性越佳測試評估IS-103 NSP-001(CNS7819)

4回彈試驗單位(sec)回彈的時間越小 PU泡綿入陰道之回彈性質越佳測試評估IS-103-NSP-005(ASTM D395 B法)

5孔隙度係先利用影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera

Pro150ES)在相同浮標尺寸下將泡綿樣品以40倍的放大倍率拍攝成分析影像分別計算樣品各單位面積內孔洞個數值越高

表示泡綿的吸水性透氣性柔軟度膠體的包覆及膠體的釋放率愈佳

67

吸水重量－回潮重量 回潮重量

高親水性泡PU泡綿配方調配原則

本實驗配方組合的多元醇藉由選用GCP-203GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較隨著醚基及羥基用量比例增加來增加PU泡綿的親水之能力實驗配方組合的異氰酸塩藉由選用MDI與習用TDI的區劑在於TDI對人體的毒性較高且選用MDI相較於TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構選用水分子作為發泡劑與傳統PU泡綿的發泡劑二氯甲烷除能降低對人體的毒性外且因水分子較小發泡蒸發時PU泡棉所產出的孔洞數目也隨著增多藉由實驗配方組合的變化對PU泡綿醫材之物性包括密度透氣性保水度回彈性孔隙度等進行評估

68

密度(gcm3) 保水率

rate ()

通氣性(sec) 回彈時間(sec)

孔隙度

(porescm2)

實驗例 1 0058plusmn0001 1104plusmn26 89plusmn01 lt1 3400plusmn88

實驗例 2 0033plusmn0001 1674plusmn35 17plusmn002 lt1 5700plusmn181

比較例 A 006plusmn0001 2544plusmn5 346plusmn05 gt1 788plusmn23

比較例 B 002plusmn00003 390plusmn8 299plusmn04 gt1 --

比較例 C 001plusmn00001 600plusmn13 303plusmn04 gt1 --

表2 改變PU配方添加重量比例變化對泡綿物性變化之結果

實驗例1及實驗例2 經改質高親水性PU泡綿實驗得出的物性結果 與傳統的比較例ABC 相互比較 均擁有較佳的保水率透氣性及回彈性 且改質高親水性PU泡綿 所得出泡綿的密度較低表示該泡綿的孔洞較多

69

6-1-A-(2) 泡綿結構及孔隙度的分析結果 泡綿結構之影像分析

影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera Pro150ES)

1 mm 1 mm

1 mm1 mm1 mm

比較例A

實施例1 實施例2

70

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

六之一高親水性PU泡綿醫材的研究

PU材料是由多元醇與異氰酸塩之縮合聚合物 (2324)

目前已應用在生醫材料上一般的PU纖維若在擠壓延伸下呈現彈性纖維時之吸水率在03以下若改為發泡擠壓射出氣泡會呈密密蔴蔴的海綿狀PU泡綿單位面積內孔洞數目提高時PU泡綿吸水性就會增加 (一般工業級的PU海綿吸水率約為250左右)本實驗將增加高親水性的多元醇(polyol)的配方比例來取代現行工業用PU泡綿之聚醚三元醇以開發出高吸水性(吸水率要大於500以上)低密度(03gcm以下)高透氣性小於5秒之內的新醫材

65

6-1-A-(1)高親水性泡PU泡綿配方改質的實驗方法

1本實驗PU發泡是採二液型(two-component)就是將異氰酸塩單獨置於一槽 其 餘的多元醇及發泡劑觸媒發泡穩定劑及其它的潻加劑等置於另一槽於無溶劑下採單一步驟合成程序流程如圖2此程序是同時混合共同反應物與潻加劑

2將聚醚三元醇發泡劑鏈延長劑催化劑發泡穩定劑發泡穩定劑等按表1所列的組合(如實驗例1實驗例2比較例A比較例B比較例C)按其配方之重量比率分別加入A槽維持在40下充份溶解並攪拌約20分準備下個步驟

3單獨將異氰酸塩按下表1所列的組合按其配方之重量比率分別加入B槽維持在40下充份溶解並攪拌約10分準備下個步驟

4將充份攪拌均勻後之A槽及B槽的潻加物 同時注入聚合槽內以高速(3000rpm)混合約2秒後經擠壓射出機射出後再經發泡程序

(100發泡2分鐘)形成發泡體再置於熟成室(室溫下熟成7天)即成高親水性泡PU泡綿(如圖2所示)稍候進行以下的物性評估

5 PU泡綿的密度透氣性保水度回彈性孔隙度等物性物性評估方法 参考下一頁

66

高親水性PU泡綿醫材性質評估

1比重=質量體積單位(gcm3)比重小質輕 使用時較舒適測試評估IS-103-NSP-002(ASTM D1056)

2透氣單位(秒)透氣性秒數越小泡綿親膚性舒適性越佳測試評估 IS-103-NSP-003(CNS12915 B法)

3吸水率 = times 100 吸水率越高親膚性

舒適性越佳測試評估IS-103 NSP-001(CNS7819)

4回彈試驗單位(sec)回彈的時間越小 PU泡綿入陰道之回彈性質越佳測試評估IS-103-NSP-005(ASTM D395 B法)

5孔隙度係先利用影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera

Pro150ES)在相同浮標尺寸下將泡綿樣品以40倍的放大倍率拍攝成分析影像分別計算樣品各單位面積內孔洞個數值越高

表示泡綿的吸水性透氣性柔軟度膠體的包覆及膠體的釋放率愈佳

67

吸水重量－回潮重量 回潮重量

高親水性泡PU泡綿配方調配原則

本實驗配方組合的多元醇藉由選用GCP-203GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較隨著醚基及羥基用量比例增加來增加PU泡綿的親水之能力實驗配方組合的異氰酸塩藉由選用MDI與習用TDI的區劑在於TDI對人體的毒性較高且選用MDI相較於TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構選用水分子作為發泡劑與傳統PU泡綿的發泡劑二氯甲烷除能降低對人體的毒性外且因水分子較小發泡蒸發時PU泡棉所產出的孔洞數目也隨著增多藉由實驗配方組合的變化對PU泡綿醫材之物性包括密度透氣性保水度回彈性孔隙度等進行評估

68

密度(gcm3) 保水率

rate ()

通氣性(sec) 回彈時間(sec)

孔隙度

(porescm2)

實驗例 1 0058plusmn0001 1104plusmn26 89plusmn01 lt1 3400plusmn88

實驗例 2 0033plusmn0001 1674plusmn35 17plusmn002 lt1 5700plusmn181

比較例 A 006plusmn0001 2544plusmn5 346plusmn05 gt1 788plusmn23

比較例 B 002plusmn00003 390plusmn8 299plusmn04 gt1 --

比較例 C 001plusmn00001 600plusmn13 303plusmn04 gt1 --

表2 改變PU配方添加重量比例變化對泡綿物性變化之結果

實驗例1及實驗例2 經改質高親水性PU泡綿實驗得出的物性結果 與傳統的比較例ABC 相互比較 均擁有較佳的保水率透氣性及回彈性 且改質高親水性PU泡綿 所得出泡綿的密度較低表示該泡綿的孔洞較多

69

6-1-A-(2) 泡綿結構及孔隙度的分析結果 泡綿結構之影像分析

影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera Pro150ES)

1 mm 1 mm

1 mm1 mm1 mm

比較例A

實施例1 實施例2

70

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-A-(1)高親水性泡PU泡綿配方改質的實驗方法

1本實驗PU發泡是採二液型(two-component)就是將異氰酸塩單獨置於一槽 其 餘的多元醇及發泡劑觸媒發泡穩定劑及其它的潻加劑等置於另一槽於無溶劑下採單一步驟合成程序流程如圖2此程序是同時混合共同反應物與潻加劑

2將聚醚三元醇發泡劑鏈延長劑催化劑發泡穩定劑發泡穩定劑等按表1所列的組合(如實驗例1實驗例2比較例A比較例B比較例C)按其配方之重量比率分別加入A槽維持在40下充份溶解並攪拌約20分準備下個步驟

3單獨將異氰酸塩按下表1所列的組合按其配方之重量比率分別加入B槽維持在40下充份溶解並攪拌約10分準備下個步驟

4將充份攪拌均勻後之A槽及B槽的潻加物 同時注入聚合槽內以高速(3000rpm)混合約2秒後經擠壓射出機射出後再經發泡程序

(100發泡2分鐘)形成發泡體再置於熟成室(室溫下熟成7天)即成高親水性泡PU泡綿(如圖2所示)稍候進行以下的物性評估

5 PU泡綿的密度透氣性保水度回彈性孔隙度等物性物性評估方法 参考下一頁

66

高親水性PU泡綿醫材性質評估

1比重=質量體積單位(gcm3)比重小質輕 使用時較舒適測試評估IS-103-NSP-002(ASTM D1056)

2透氣單位(秒)透氣性秒數越小泡綿親膚性舒適性越佳測試評估 IS-103-NSP-003(CNS12915 B法)

3吸水率 = times 100 吸水率越高親膚性

舒適性越佳測試評估IS-103 NSP-001(CNS7819)

4回彈試驗單位(sec)回彈的時間越小 PU泡綿入陰道之回彈性質越佳測試評估IS-103-NSP-005(ASTM D395 B法)

5孔隙度係先利用影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera

Pro150ES)在相同浮標尺寸下將泡綿樣品以40倍的放大倍率拍攝成分析影像分別計算樣品各單位面積內孔洞個數值越高

表示泡綿的吸水性透氣性柔軟度膠體的包覆及膠體的釋放率愈佳

67

吸水重量－回潮重量 回潮重量

高親水性泡PU泡綿配方調配原則

本實驗配方組合的多元醇藉由選用GCP-203GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較隨著醚基及羥基用量比例增加來增加PU泡綿的親水之能力實驗配方組合的異氰酸塩藉由選用MDI與習用TDI的區劑在於TDI對人體的毒性較高且選用MDI相較於TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構選用水分子作為發泡劑與傳統PU泡綿的發泡劑二氯甲烷除能降低對人體的毒性外且因水分子較小發泡蒸發時PU泡棉所產出的孔洞數目也隨著增多藉由實驗配方組合的變化對PU泡綿醫材之物性包括密度透氣性保水度回彈性孔隙度等進行評估

68

密度(gcm3) 保水率

rate ()

通氣性(sec) 回彈時間(sec)

孔隙度

(porescm2)

實驗例 1 0058plusmn0001 1104plusmn26 89plusmn01 lt1 3400plusmn88

實驗例 2 0033plusmn0001 1674plusmn35 17plusmn002 lt1 5700plusmn181

比較例 A 006plusmn0001 2544plusmn5 346plusmn05 gt1 788plusmn23

比較例 B 002plusmn00003 390plusmn8 299plusmn04 gt1 --

比較例 C 001plusmn00001 600plusmn13 303plusmn04 gt1 --

表2 改變PU配方添加重量比例變化對泡綿物性變化之結果

實驗例1及實驗例2 經改質高親水性PU泡綿實驗得出的物性結果 與傳統的比較例ABC 相互比較 均擁有較佳的保水率透氣性及回彈性 且改質高親水性PU泡綿 所得出泡綿的密度較低表示該泡綿的孔洞較多

69

6-1-A-(2) 泡綿結構及孔隙度的分析結果 泡綿結構之影像分析

影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera Pro150ES)

1 mm 1 mm

1 mm1 mm1 mm

比較例A

實施例1 實施例2

70

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

高親水性PU泡綿醫材性質評估

1比重=質量體積單位(gcm3)比重小質輕 使用時較舒適測試評估IS-103-NSP-002(ASTM D1056)

2透氣單位(秒)透氣性秒數越小泡綿親膚性舒適性越佳測試評估 IS-103-NSP-003(CNS12915 B法)

3吸水率 = times 100 吸水率越高親膚性

舒適性越佳測試評估IS-103 NSP-001(CNS7819)

4回彈試驗單位(sec)回彈的時間越小 PU泡綿入陰道之回彈性質越佳測試評估IS-103-NSP-005(ASTM D395 B法)

5孔隙度係先利用影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera

Pro150ES)在相同浮標尺寸下將泡綿樣品以40倍的放大倍率拍攝成分析影像分別計算樣品各單位面積內孔洞個數值越高

表示泡綿的吸水性透氣性柔軟度膠體的包覆及膠體的釋放率愈佳

67

吸水重量－回潮重量 回潮重量

高親水性泡PU泡綿配方調配原則

本實驗配方組合的多元醇藉由選用GCP-203GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較隨著醚基及羥基用量比例增加來增加PU泡綿的親水之能力實驗配方組合的異氰酸塩藉由選用MDI與習用TDI的區劑在於TDI對人體的毒性較高且選用MDI相較於TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構選用水分子作為發泡劑與傳統PU泡綿的發泡劑二氯甲烷除能降低對人體的毒性外且因水分子較小發泡蒸發時PU泡棉所產出的孔洞數目也隨著增多藉由實驗配方組合的變化對PU泡綿醫材之物性包括密度透氣性保水度回彈性孔隙度等進行評估

68

密度(gcm3) 保水率

rate ()

通氣性(sec) 回彈時間(sec)

孔隙度

(porescm2)

實驗例 1 0058plusmn0001 1104plusmn26 89plusmn01 lt1 3400plusmn88

實驗例 2 0033plusmn0001 1674plusmn35 17plusmn002 lt1 5700plusmn181

比較例 A 006plusmn0001 2544plusmn5 346plusmn05 gt1 788plusmn23

比較例 B 002plusmn00003 390plusmn8 299plusmn04 gt1 --

比較例 C 001plusmn00001 600plusmn13 303plusmn04 gt1 --

表2 改變PU配方添加重量比例變化對泡綿物性變化之結果

實驗例1及實驗例2 經改質高親水性PU泡綿實驗得出的物性結果 與傳統的比較例ABC 相互比較 均擁有較佳的保水率透氣性及回彈性 且改質高親水性PU泡綿 所得出泡綿的密度較低表示該泡綿的孔洞較多

69

6-1-A-(2) 泡綿結構及孔隙度的分析結果 泡綿結構之影像分析

影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera Pro150ES)

1 mm 1 mm

1 mm1 mm1 mm

比較例A

實施例1 實施例2

70

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

高親水性泡PU泡綿配方調配原則

本實驗配方組合的多元醇藉由選用GCP-203GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較隨著醚基及羥基用量比例增加來增加PU泡綿的親水之能力實驗配方組合的異氰酸塩藉由選用MDI與習用TDI的區劑在於TDI對人體的毒性較高且選用MDI相較於TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構選用水分子作為發泡劑與傳統PU泡綿的發泡劑二氯甲烷除能降低對人體的毒性外且因水分子較小發泡蒸發時PU泡棉所產出的孔洞數目也隨著增多藉由實驗配方組合的變化對PU泡綿醫材之物性包括密度透氣性保水度回彈性孔隙度等進行評估

68

密度(gcm3) 保水率

rate ()

通氣性(sec) 回彈時間(sec)

孔隙度

(porescm2)

實驗例 1 0058plusmn0001 1104plusmn26 89plusmn01 lt1 3400plusmn88

實驗例 2 0033plusmn0001 1674plusmn35 17plusmn002 lt1 5700plusmn181

比較例 A 006plusmn0001 2544plusmn5 346plusmn05 gt1 788plusmn23

比較例 B 002plusmn00003 390plusmn8 299plusmn04 gt1 --

比較例 C 001plusmn00001 600plusmn13 303plusmn04 gt1 --

表2 改變PU配方添加重量比例變化對泡綿物性變化之結果

實驗例1及實驗例2 經改質高親水性PU泡綿實驗得出的物性結果 與傳統的比較例ABC 相互比較 均擁有較佳的保水率透氣性及回彈性 且改質高親水性PU泡綿 所得出泡綿的密度較低表示該泡綿的孔洞較多

69

6-1-A-(2) 泡綿結構及孔隙度的分析結果 泡綿結構之影像分析

影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera Pro150ES)

1 mm 1 mm

1 mm1 mm1 mm

比較例A

實施例1 實施例2

70

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

密度(gcm3) 保水率

rate ()

通氣性(sec) 回彈時間(sec)

孔隙度

(porescm2)

實驗例 1 0058plusmn0001 1104plusmn26 89plusmn01 lt1 3400plusmn88

實驗例 2 0033plusmn0001 1674plusmn35 17plusmn002 lt1 5700plusmn181

比較例 A 006plusmn0001 2544plusmn5 346plusmn05 gt1 788plusmn23

比較例 B 002plusmn00003 390plusmn8 299plusmn04 gt1 --

比較例 C 001plusmn00001 600plusmn13 303plusmn04 gt1 --

表2 改變PU配方添加重量比例變化對泡綿物性變化之結果

實驗例1及實驗例2 經改質高親水性PU泡綿實驗得出的物性結果 與傳統的比較例ABC 相互比較 均擁有較佳的保水率透氣性及回彈性 且改質高親水性PU泡綿 所得出泡綿的密度較低表示該泡綿的孔洞較多

69

6-1-A-(2) 泡綿結構及孔隙度的分析結果 泡綿結構之影像分析

影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera Pro150ES)

1 mm 1 mm

1 mm1 mm1 mm

比較例A

實施例1 實施例2

70

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-A-(2) 泡綿結構及孔隙度的分析結果 泡綿結構之影像分析

影像分析儀(OLYMPUS CH30鏡頭Pixera Pro150ES)

1 mm 1 mm

1 mm1 mm1 mm

比較例A

實施例1 實施例2

70

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-A高親水性PU泡綿醫材的實驗結果 1本實驗之實驗例與習用比較例配方的改良藉由選用GCP-203

GC-7030與習用的聚醚三元醇作比較實驗例隨著醚基及羥基用量比例增加會增加PU泡綿的親水之能力

2實驗例的異氰酸塩配方選用MDI相較於比較例選用TDI可增加PU泡綿的軟鏈結構且習知的TDI對人體毒副性較高

3實驗例的發泡劑選用水分子與比較例的發泡劑選用二氯甲烷除能降低對人體的毒副性外且因水分子較小泡綿於發泡蒸發時實驗例所產出PU泡綿的孔洞數目也隨著增多

4實驗例的催化劑乙基嗎啡啉可以提供異氰酸塩具有足夠的親核加成性藉由共振穩定的異氰酸塩官能基轉化成高能量的過渡狀態使得PU縮合聚合的決定步驟-逐步釋放反應速率加快也加快PU泡綿的孔洞及其孔徑區域的形成

5高親水性PU泡綿(控制組實驗例) 與習知 (對照組比較例)泡綿之製作配方(詳如上表) 再將改質後之高親水性PU泡綿 塞入兔子之陰道組織內部 進行組織病理刺激性的評估求證是否為可應用之生醫材料

71

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

改質PU泡綿醫材對紐西蘭白兔進行陰道刺激性的實驗方法

依據ISO 10993-12(2002)規範中所建議之萃取方法將本實驗例2之PU泡綿(以下簡稱為試驗物質)於70plusmn2degC下以注射用生理食鹽水萃取24plusmn2小時並以所得萃取液進行試驗試驗期間連續5天將1mL試驗物質萃取液或對照物質(注射用生理食鹽水) 注入兔子陰道中並在最後一次投予試驗物質24小時後犧牲所有動物並進行肉眼病理檢查及取下陰道組織製作組織切片陰道組織病理變化描述及病理評估標準主要是依據Eckstein等人方法進行評估(252627282930)

72

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

陰道組織病理判讀的標準

1依據Eckstein 等人方法(1969)進行評估主要評估陰道前段(uro-vagina UV)中段(mid-vagina MV)以及子宮頸段(cervico-vagina CV)三段另外於外陰道(vagina vestibule VV)之組織切片組織病理切片判讀評估項目為陰道上皮細胞完整(0-4)鬱血(0-4)及水腫(0-

4)等陰道組織變化病變程度等級為無(0)極微(1)輕度(2)中度(3)極嚴重(4)等四種等級分數總積分為16

2當總積分lt8為不具刺激性屬於可接受(acceptable)

總積分9-10為接近刺激性(borderline irritation

potential)但仍可接受(marginal)總積分gt11為具刺激性(significant irritation potential)且不可接受(unacceptable)

73

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子進行陰道刺激組織病理實驗結果

Fig 4顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)

與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段

左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為生理食鹽水

Fig5顯微鏡兔子陰道病理檢查圖對照組(左側)與試驗組(右側) 左上圖陰道前段左中圖陰道中段左下圖子宮頸段右側上圖中圖 下圖與左側的部位完全相同兩組處理劑同為棉籽油

74

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-A-(4) PU泡綿對兔子陰道組織刺激反應評估結果(續)

(1)試驗組以生理食鹽水處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為30plusmn1730plusmn10及27plusmn06試驗組

以棉仔油處理陰道前段中段及子宮頸段等之組織病理總積分分別為33plusmn1530plusmn20及13plusmn12(詳参上表)於兔子陰道刺激總積分與人體刺激性之相關性上 若陰道各段總積分平均皆lt8為不具刺激性屬於 acceptable(可接受等級)綜合以上結果本實驗所用之高親水性PU改質泡綿在本實驗條件下對兔子陰道組織並無刺激性

(2)高親水性PU泡綿(實施例2)對兔子陰道組織並無刺激性推測原因 可能與所選用的發泡劑 改成100的水分子傳統的比較例 二氯甲烷的毒性較強應有相連性且水分子較小

因此改質泡綿的孔隙數較多 透氣性較佳 而選用多元醇使得改質泡綿的吸水率倍增 使得改質泡綿的 親水性 ( 親膚性)等均獲得較佳的物性多有相連性

75

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-B PU泡綿基材及凝膠載體新劑型藥物擴散性研究方法

研究方法

1本論文所開發的凝膠載體分為對照組水凝膠載體(適合分散於親水型之治療陰部感染藥物)及控制組OW之凝膠載體 (適合分散於拒水型之藥物)藉由改變上述兩種凝膠載體配方組成及其黏度值 並藉由凝膠載體對泡綿基材及豬子宮內膜（以下簡稱生物膜）接觸後所產生的對泡綿基材的吸附量及對生物膜吸附量多寡的變化以求出較適合凝膠之配方組成

2 治療陰部感染AcyclovirMetronidazoleNystatinMiconazolnitrate等OTC學名藥物(参考表11)以公開的用藥濃度均勻分散於水凝膠及水包油凝膠(OW GEL) 對生物膜以體外方式進行接觸滲透模式實驗不同含藥凝膠劑型對陰部組織內膜實驗所得出之藥物滲透率 由於本劑型的給藥方式為直接作用於陰部粘膜病灶處因此上述所得出之藥物滲透率

將可視為生物可利用的藥物濃度

3當上述含藥凝膠劑型直接對陰部病灶黏膜作用之藥物生物可利用率愈高時相對於口服的給藥方式即表示該含藥凝膠劑型對正常細胞的毒副性就愈低 76

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

PU泡綿(實驗例2)之凝膠配方及其對生物膜的沾黏實驗示意圖

凝膠配方(表6)

對生物膜的沾黏實驗示意圖6

6-1-B-(1)各組凝膠配方的變化對泡綿與生物膜之間 的沾黏實驗

Gel H2O 3-Mix oil Aqua oil PEG MD12 Cellulose Viscosity

A W(g) 487495 - - 03036 07007 02495

193 9749 - - 061 140 050

B W(g) 487572 - - 03013 07772 01744

320 9749 - - 060 155 035

C W(g) 487593 - - 02501 08286 01745

376 9749 - - 050 166 035

D W(g) 432570 30257 30123 01516 06019 -

208 8643 605 602 030 120 -

E W(g) 432530 30131 30339 01009 06522 -

312 8641 602 606 020 130 -

F W(g) 430023 30022 30219 03500 06507 -

386 8596 600 604 070 130 -

生物膜 Gel

實驗例2 (1x1x2 cm)

皿 保鮮膜

接觸 15 秒後將泡綿移開生物膜

分別秤重

水溶膠

(

對照組)

水包油凝膠

(

控制組)

77

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-B-(2)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率變化結果

不同黏度凝膠對泡綿與生物膜沾黏結果

bull 膜附著量 Gel

bull 泡綿減少量Gel

0

4

8

12

16

A B C

GelG

el

膜附著量 泡棉減少量

圖7水溶膠(對照組)

- 193 cps - 320 cps - 376 cps

0

4

8

12

16

D E F

Gel

Ge

l

膜附著量 泡棉減少量

圖8水包油凝膠(控制組)

- 208 cps - 312 cps - 386 cps

Gel = 泡綿減少之Gel重

泡綿吸收之Gel總重 X 100

Gel = Gel附著於膜上重量

泡綿吸收之Gel總重 X 100

78

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-B-(3)改變凝膠劑型粘度對泡綿及生物膜沾黏率

的結果分析

1由於泡綿吸附凝膠之損失量大於凝膠在生物膜上之沾黏量約1~2 係因泡綿吸附凝膠之重量在實驗期間會隨時間

逐漸減少可推斷生物膜所粘附之凝膠係由吸附在泡綿之凝膠被傳遞的結果且在相同的黏度值範圍內不論是對照組之水溶膠劑型或是控制組之水包油 (OW)凝膠劑型對陰道之上皮層濕膜的病灶細胞都有生物的粘附作用

2 由以上結果顯示不論是對照組水溶膠或控制組之水包油

(OW)凝膠劑型在193 cps到376 cps黏度的範圍係為低黏度且可自由流動的膠體將沿著泡綿之氣泡支架產生膠體的流動現象可將上述兩種凝膠載體進行質量轉移至生物膜上經由黏液膠體的濕潤-鋪展(wetting-spreading)作用將分散於水凝膠載體的藥物 與生物膜(陰部濕膜)直接產生了生物黏附的作用

79

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-B-(4)凝膠配方體外溶血實驗方法及實驗結果

根據「 ASTM F 756-93 Standard Practice for Assessment of

Hemolytic Properties of Materials 」

計算

Hemolytic index (H I)Hb released (mgmL) Hb present (mgmL) X 100

結果

Hemolytic Index Hemolytic Grade

0-2 non-hemolytic(不溶血)

2-10 slightly hemolytic(輕微溶血)

10-20 moderately hemolytic(中等溶血)

20-40 markedly hemolytic(顯著溶血)

Above40 severely hemolytic(嚴重溶血)

Sample Hemolytic Index Hemolytic Grade

水溶膠(對照組) 0 non-hemolytic

水包油(ow)凝膠(控制組) 5 slightly hemolytic

水溶性膠無溶血現象而水包油型凝膠則有輕微溶血現象 80

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

81

3-1-B ndash(5)含藥凝膠經生物膜滲透實驗方法

含藥之水凝膠和水包油型(OW)凝膠經生物膜滲透實驗

含藥凝膠調配 OTC學名藥(参考表11)

表9含藥水溶凝膠(對照組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

表10含藥水包油 (ow)凝膠(控制組) - ACYMTZNYSMIC添加量約2 mgmL Gel

ACY MTZ NYS MIC H2O PEG MD12 Cellulose

Weight 646 mg 599 mg 640 mg 642 mg 306850 g 001864 g 004217 g 001503 g

- - - - 975 06 14 05

ACY MTZ NYS MIC H2O 3-Mix oil Aqua oil MD12

Weight 634 mg 635 mg 619 mg 622 mg 261317 g 018048 g 018278 g 001515 g

- - - - 87 6 6 05

Gel

Membrane

Analyze

Normal Saline

(or IPA) Stir bar

約取025mL含藥凝膠進行實驗 取點進行HPLC分析

ACY NYS MIC的檢測波長為230nm

MTZ的檢測波長為305nm

81

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

六之二本實驗所篩選OTC治療陰部感染症等學名藥

(1) Acyclovir 分子式 C8H11N5O3治療疱疹病毒學名藥(456)

(2) Metronidazole 分子式 C6H9N3O3治療陰道滴蟲菌學名藥(456)

(3)Nystatin 分子式C47H75NO17治療白色念珠菌學名藥(456)

(4)Miconazole nitrate 分子式C18H14Cl4N2OHNO3治療披衣菌學名藥(456)

82

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

83

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果

000

002

004

006

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Concentr

atio

n (

mgm

L)

ACY MTZ

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ

含藥水溶膠(對照組)經生物膜滲透實驗結果如圖11

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜以外層面接觸含藥凝膠而內層面接觸生理食鹽水

實驗第20小時起水溶性之ACY和MTZ經生物膜滲透至生理食鹽水中逐漸趨於緩和

-第21小時ACY和MTZ經生物膜的藥物滲透率約為63及664

-(以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率) T-TEST P值lt005

NYS和MIC經生物膜的滲透率極低係因其為親脂性的分子結構無法有效溶於水凝膠中

83

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

84

6-1-B-(1) 含藥凝膠經生物膜滲透實驗結果(續)

000

003

005

008

010

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Co

nce

ntr

atio

n (

mg

mL

)

ACY MTZ NYS MIC

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30

Time (hr)

Ra

tio

(

)

ACY MTZ NYS MIC

含藥之水包油(ow)凝膠(控制組)經生物膜滲透實驗結果如圖12

結果討論

模擬生理狀況

-生物膜外層面接觸含藥凝膠而內層面改接觸IPA(原生理食鹽水NYS及MIC無檢出)

-實驗第21小時起下方IPA中陸續檢出有水溶性之ACY和MTZ及脂溶性之NYS及MIC

第26小時ACY和MTZ經生物膜滲透率 可達606~565 NYS及MIC經生物膜滲透率

可達466~591 (以上等同於藥物對陰部粘膜之生物利用率)T-TEST P值lt00083

與對照組水溶膠比較水包油的凝膠具有藥物延釋之現象產生

NYS經生物膜藥物滲透率最低推測與NYS藥物分子太大有關

84

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-C-(1)含MTZ藥物水凝膠泡綿醫材藥物向外擴散速率的實驗方法

1將所有ABCD配方MTZ濃度固定為2mgg (依 gel重量為準)A凝膠配方為100 Tmode gel B配方凝膠濃度為Ａ之50C配方凝膠濃度為Ａ之25 D配方凝膠濃度為Ａ之10分別浸泡於2x2x1公分之泡綿中 使吸滿各組含藥凝膠配方後取出置於裝滿200ml水的燒杯中 並依下列的時間點051234689 hr等依取樣時間點取出5mL水溶液進行UVVis檢測MTZ的含量以分別求得A凝膠配方 B凝膠配方 C凝膠配方 及D凝膠配方各組含藥凝膠配方的藥物擴散率

2Mo表示含MTZ藥物水凝膠之泡綿醫材在水浴中對外擴散初始的藥物濃度M為任意時間 在水浴中對外擴散實驗所測的藥物濃度則藥物對外擴散百分率(DiffusionRatio)D=MMo因而藥物對外擴散速率

(Diffusion Rate) D =dDdt

85

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-C-(2)含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率與時間變化

之實驗結果 1上圖含MTZ水凝膠之泡綿醫材藥物擴散率與時間之變化

自第六小時至第九小時其藥物擴散百分率趨於平衡約80左右利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 比較其相關係數R2值都大於097 代表實驗具有統計學上的意義

2下圖含MTZ凝膠泡綿藥物擴散速率(Dlsquo)與時間變化之關係

由初始至第九小時期間內其藥物擴散速率(Diffusion Rate) D 取其ln

值與時間作圖 ABCDGel含藥凝膠在水浴中藥物擴散速率D值

都呈幾近等速率下降的趨勢都為一階的藥物釋放模式

86

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

含MTZ藥物水凝膠之泡綿在標準狀態下經時烘乾速率之實驗方法

將上述MTZ濃度固定為2mgg A凝膠配方為100

Tmode gel B凝膠配方濃度為Ａ之50C凝膠配方濃度為Ａ之25 D凝膠配方濃度為Ａ之10分別置於開放式的玻璃皿上在標準空調室內進行自然烘乾(失水)實驗每隔約2hr磅取失水烘乾後的含藥凝膠泡綿醫材重量 直至隨時間的增加 含藥凝膠泡綿醫材的重量 不再減少為止

於任意時間點泡綿內所含含水率稱為R 當泡綿醫材失水率的變化趨於平衡(最高達84hr) 也就是說泡綿醫材含水率不再減少時 當時泡綿醫材所含水率稱之為臨界水份率Rc 依此可推算泡綿醫材內含有可自由移動水份率Ra值即等於RRc之比值

87

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

圖16含MTZ水凝膠泡綿失水率與時間變化的實驗結果

1在標準狀態下 PU泡綿醫材含A-D配方mtz藥物水凝膠經時的失水率隨著時間的增長 PU泡綿內所含可自由移動水份率Ra隨著時間 自第60小時至第84小時不同凝膠配方就陸續趨於平衡

2PU泡綿藥物水凝膠經時的失水率隨著時間減少的趨勢

幾近於指數函數遞減的趨勢

其冪數曲線廻歸係數R2值約為096

88

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-1-C-(2)高親水性PU泡綿可自由移動水份率

與藥物擴散速率關連性之研究

1由影像分析儀觀察泡綿的孔隙度結果圖改質後高親水性

PU泡綿(實驗例2) 較傳統比較例A之孔隙數增加了723可

提高藥物凝膠劑型的包覆率且該泡綿的氣泡支架(struts)

呈連續相排列狀具有Cell Reactivity之特性可使呈物理

性吸附於泡綿氣泡內的含藥膠體得以向外擴散傳輸

2假設泡綿所含藥物對外擴散性與泡綿內所含有可自由移動

的水份量多寡有關一直到泡綿內所含水份達到臨界水份時為

止那此時藥物對外擴散率也將趨於平衡則泡綿凝膠劑型藥

物對外的擴散速率與泡綿內可自由移動水有關連而進行

以下的理論推導

89

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

泡綿凝膠所含可移動水份率與藥物擴散率之理論推導

D=MMo Ra=RRc

-dM= -d(R-Rc)xD-dRcxD = -dRxD

there4D=dMRThen D=MMo D =dDdt

there4 D =dMdt=dRdt

圖17 凝膠泡綿在水浴中藥物對外擴散性與可移動水份之關連圖

90

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

圖18含MTZ水凝膠泡綿之藥物擴散率與可自由移動水份率理論值與實驗值關係圖

1 所求出的線性斜率作比較得知A-DGel其藥物釋放速率其縱軸ln D 斜率值大小依序DGelgtCGelgtBGelgtAGel

顯示上述MTZ藥物擴散速率(Diffusion Rate) Drsquo值

與PU泡綿內可自由移動水份率Ra是呈正相關的而DGel可自由移動水份率Radt值為最大因此DGel之藥物擴散速率(Diffusion

Rate) D就最大

2利用冪數曲線廻歸法 將實驗值與計算值 作一相關性曲線圖 加以比較相關係數R2值達099以上 代表實驗的數值 具有統計學上的意義

91

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-3-A具抑制子宮頸癌細胞毒性天然複方組合物之研究

一研究方法

1雷公滕於低劑量即能毒殺癌細胞但同時對正常細胞的殺傷力很大

對已喪失正常免疫功能的罹癌患者治療上將產生疑慮参考同屬性愛滋病之治療方法中醫認為愛滋病是外來的邪毒所侵治病時藥方除對抗病毒的主劑外尚需兼顧提升免疫調節的佐劑因此中醫藥一向主張以中草藥傳統的複方來加強治病本文篩選之主劑(如下)及佐劑(如下)

2將主劑佐劑 於不同劑量濃度在24hr48hr72hr條件對毒殺子宮頸癌細胞(HeLa cell)存活率之變化以及主劑佐劑 劑量濃度變化對正常細胞(Huvec cell)存活率之關係再以MTT assay方式評估各主劑佐之藥物濃度對正常細胞存活率毒殺子宮頸癌細胞存活率以求出各單方適藥濃度

3再將上述主劑佐劑以適當劑量濃度比例混合成複方組合物重複進行MTT assay經72hr後實驗求得複方組合毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度與混合前單方單獨使用時毒殺 HeLa cell之IC50劑量濃度作比較當該複方組合物中各單方IC50劑量之總和較混合前各單方IC50劑量之總和

若有減少的趨勢 則判定該複方組合物初步具有藥物的加成效果

92

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-2-A-(1)天然活性化合物及對照組試劑的分子式

1化合物A活性成份Isopsoralen分子式C11H6O3

2化合物B活性成份Triptolide分子式C20H24O6

3化合物C活性成份Baicalein分子式C15H10O5

4化合物D活性成份Gallic acid分子式（HO）3C6H2CO2H

5化合物E活性成份Quercertin 分子式C15H10O7

6化合物F活性成份Gossypol-acetic acid分子式C30H30O8C2H4O2

7化合物G活性成份Baicalin分子式C21H18O11

8化合物H活性成份Berberine Hydrochloride分子式

C20H18NO4Cl

9對照組為Doxorubicin HCl ( Sigma-Aldrich USA)分子式C27H29NO11 HCl一種可商業取得的化療藥物用以治療癌症

93

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-3-A-(2)藥物毒殺細胞優先性篩選的原理

1利用MTT(細胞毒性)分析來評估所篩選之天然化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性將所篩選之天然化合物以不同濃度與HeLa細胞與HUVEC細胞感染244872hr

以MTT分析的標準流程每一樣本重複3次

2利用ELISA分析儀讀取每一孔受測樣品以560nm波長偵測光學密度（Optical DensityOD）求出該化合物對細胞存活率（） = OD實驗組OD對照組 x 100

並利用GraFit資料分析軟體（Erithacus Software Ltd）來計算每一化合物的IC50值

3並以化療藥物doxorubicin HCl作為對照組以探討所篩選之天然化合物的有效性

4 MTT assay詳細的實施方法請参考如下頁

94

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

具有降低人乳突病毒感染之天然物的實驗方法

1細胞株質體及培養方法

(1) HeLa細胞株( HeLa cell )來自工研院生醫所沈欣欣博士HeLa細胞為貼附型細胞並以DMEM來增殖並維持培養基中添加了10胎牛血清（FBS）15

gL碳酸氫鈉（NaHCO3）1mM丙酮酸鈉（CH3CO

COOH）以及01mM非必須胺基酸(購於Gibcoreg )

(2) 人類臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購自新竹食品工業研究所Medium 199培養基來培殖培養基中添加了10的FBS肝抗凝血素與EGFP(購於Sigma公司)

293FT細胞購於Invetrogen公司

(3)質體 p16sheLLpCIneoEGFP來自美國National Cancer InstituteJohn T Schiller

PhD

95

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

2細胞毒性分析方法（MTT assay）

(1)抑制HeLa cell細胞存活性實驗方法

將不同濃度試劑及對照組以子宮頸癌細胞(HeLa

cell)進行VLP (類HPV) 病毒感染細胞存活性評估同時將不同濃度試劑反覆對正常細胞 HUVEC cell 作細胞存活性評估作交叉分析試劑單方降低子宮頸癌細胞毒性之評估

(2)利用MTT assay來評估本發明實施例提出之化合物對HeLa細胞與HUVEC細胞之細胞毒性並以HUVEC細胞來研究上述化合物對正常人類細胞的細胞毒性此外利用化療藥物Doxorubicin HCl作為陽性對照組以探討根據本發明具體實施之有效性

96

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-3-A-(3)複方組合物之藥物加成性的分析原則

1過往於西藥之藥學理論對單一病症 並不主張使用複方藥物 乃是因藥物之間會有進一步的交互作用因此對單一病症複方藥物加成性的評估模式仍是紛亂難以統一的情勢而中藥方劑複方之藥物加成性的評估方法 係参考陳奇等編「著中藥藥效研究思路與方法」中國北京人民衛生出版社出版P22提及中藥複方的配伍性之藥物加成性的評估方法及参考中西藥的順勢療法的文章 Smitu

Introduction toBioregulatory Medicine (ISBN 9783131476111)

copy 2009 Georg Thieme Verlag KG(2005)皆是依Buumlrgi`s

Principle來計算複方之藥物協同性(加成性)

2本文依此Buumlrgi原則來計算複方之藥物加成性係以混合後各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和除以混合前各單方對抑制HeLa細胞之IC50總和所求出之比值以符號S代表假若複方之S gt 1即表示組合物之單方組合不具有藥物的協同性(加成性)反之複方之S lt

1即表示組合物之單方組合具有藥物協同性(加成性)且當複方組合S值愈小1 時就表示該複方組合物之藥物協同性(加成性)愈佳

97

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果

表20 主劑及控制組化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

主劑化合物A

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 27 5 2

HUVEC ＞125 57 38

HUVECHeLa ratio ＞46 114 19

主劑化合物B

24小時之IC50

（ngml）

48小時之IC50

（ngml）

72小時之IC50

（ngml）

HeLa 7208 724 287

HUVEC ＞1000 151 84

HUVECHeLa ratio ＞139 209 293

主劑化合物F

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 29 12 8

HUVEC 30 33 23

HUVECHeLa ratio 10 28 29

ControlDoxorubin HCl

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 048 020 012

HUVEC ＞058 0299 022

HUVECHeLa ratio ＞12 15 18

98

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

3-2-A-(4)天然活性物毒殺細胞優先性的實驗結果(續)

表21佐劑化合物化合物對正常細胞子宮頸癌細胞存活性之結果

佐劑化合物C

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 37

HUVEC ＞125 ＞125 ＞125

HUVECHeLa ratio -- -- ＞34

佐劑化合物G

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa ＞125 ＞125 92

HUVEC ＞125 ＞125 218

HUVECHeLa ratio -- -- 24

佐劑化合物H

24小時之IC50

（μgml）

48小時之IC50

（μgml）

72小時之IC50

（μgml）

HeLa 39 21 15

HUVEC 30 15 9

HUVECHeLa ratio 08 07 06

99

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

3-2-A-(5)具毒殺細胞優先性天然活性的複方組合物

表22複方組合物主劑及佐劑之配方組成

配方 各單方於配方中所佔的量 (ugmL)

M1 H 40μgmLA 20μgmL

M2 C 40μgmLA 20μgmL

M3 G 40μgmLA 20μgmL

M7 H 30ngmLB 10ngmL

M8 C 30ngmLB 10ngmL

M9 G 30ngmLB 10ngmL

M10 H 40μgmLF 20μgmL

M11 C 40μgmLF 20μgmL

M12 G 40μgmLF 20μgmL

100

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

3-2-A-(6)天然複方組合物毒殺癌細胞藥物加成性的實驗結果

表23 複方組合物經72小時處理對抑制子宮頸癌細胞IC50值

配方 配方中各單方的 IC50 藥物加成性 S值

M1 H A

56μgmL 28μgmL

M2 C A

1212μgmL 606μgmL

M3 G A

013 8μgmL 4μgmL

H B

186 ngmL 62 ngmL

C B

384 ngmL 128 ngmL

G B

231 ngmL 77 ngmL

H F

32μgmL 16μgmL

C F

4μgmL 2μgmL

G F

52μgmL 26μgmL

049

4144

1

047

M7 139 x 10

-3

M8 128 x 10

-3

M9 325 x 10

-4

M10 021

M11 013

M12 008

101

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-2-B具抑制人乳突假病毒感染天然活性化合組合物之研究

一研究方法

本研究係利用美國National Cancer InstituteDr Schiller實驗室所提供的質體在293FT細胞內生產帶有綠螢光蛋白基因質體

及人類乳突病毒第16型L1L2外殼蛋白之假病毒(HPV 16

pseudovirus)並利用此假病毒建立藥物篩選平台來篩選具有抑制HPV 16感染的藥物(如圖19所示)在本研究中測試了8個天然活性化合物以及對本文所研發的PU泡綿與凝膠載體及其組合物進行抑制HPV 16 pseudovirus感染HeLa細胞的活性感染可行性的評估以進一步了解PU泡綿及其凝膠載體之組合物是否具有抑制HPV 16 pseudovirus 感染HeLa 細胞的活性感染的效果

二 HPV 16假病毒的實驗材料及利用293 FT細胞生產帶有綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒之實驗方法詳細請参考下文而利用HPV 16假病毒的力價(titer)建立天然活性藥物篩選的實驗方法

参考下文

102

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

天然物利用239FT產生綠螢光蛋白基因的HPV 16假病毒感染的實驗方法

(1)利用二個分別帶有HPV16 L1 L2蛋白(p16sheLL)與綠螢光蛋白(pCIneoEGFP)的質體感染239FT細胞在經過48小時之後利用非離子性Brij-58介面活性劑成份為聚醯醚(polyoxyethylene acyl ethe detergent) 作為細胞破碎時清洗細胞壁之用途接著離心取得上清液此上清液即是帶有綠螢光蛋白基因(GFP)的HPV 16假病毒( pseudovirus)儲存液將此儲存液分裝並供後續實驗的進行

(2) 測定HPV 16 pseudovirus的titer將293FT細胞培養在24-

well plate上依序加入10倍系列稀釋的HPV 16假病毒儲存液感染293FT細胞經過48小時利用螢光顯微鏡觀察293FT細胞被HPV 16假病毒感染後綠螢光蛋白的表現情形依此估計假病毒的titer病毒的titer計算公式如下1000ulmL times stock

dilution times 2x105 cells at time of infection timesFraction of

cells with green fluorescence 依據上述公式本批次病毒的titer約為1000times10times2times105times20 = 4times108 infectious unit mL

103

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

建立藥物篩選平台

在96-well plate中植入6 x 103 per well的HeLa細胞隔天加入2倍系列稀釋的HPV 16

pseudovirus經過48小時之後利用ELISA

reader 讀取綠螢光的讀值並用螢光顯微鏡觀察綠螢光蛋白在細胞內表現的情況結果顯示螢光強度與假病毒使用劑量有正相關性

104

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

圖16在96-well plate中pseudovirus感染HeLa細

胞48小時後的情況 16-A 16-B

16-C 16-D

圖16-A及16-B每個well加入025μl的pseudovirus圖16-C及16-D不加pseudovirus的對照組圖A圖C是一般光學視野圖B圖D是綠螢光視野

105

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-2-B-(1)帶有綠螢光基因的HPV16假病毒感染細胞的實驗

1實驗採用每個well加入025 μl的HPV 16 pseudovirus當作抗感染的藥物篩選實驗平台將HeLa細胞植入96-well plate中隔天將要測試的樣品與細胞在37培養30

分鐘接著加入HPV 16假病毒感染HeLa cell 48小時之後用ELISA

reader測定綠螢光讀值

2 ELISA reader測定綠螢光強度

激發光(Excitation)偵測波長為485

nm發散光(Emission)偵測波長為535 nm並利用MTT assay測定細胞的存活率

3利用HPV 16假病毒感染HeLa細胞的藥物篩選的實施方法参考本文p72

圖19產生帶有綠螢光基因的HPV16假病毒與後續感染HeLa細胞示意圖

106

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

6-2-B-(2)具有抑制HPV16假病毒的天然化合物之實驗結果

圖24 樣品C對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖形為二次相似實驗

樣品C IC50為82μgml

圖25 樣品D對HPV 16假病毒感染HeLa細胞的影響圖為二次相似實驗的代表

樣品D IC50為89μgml

EGFP

EGFP

107

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

108

Positive control Carrageenan

凝膠 in 泡棉

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Control Vehicle Tmode

00003

Tmode

00008

Tmode

00025

Tmode

0025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Con

trol

Vehicle

Tmod

e 0

000

09

Tmod

e 0

000

28

Tmod

e 0

000

8

Tmod

e 0

002

5

Tmod

e 0

025

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTTIC50

凝膠only

0

20

40

60

80

100

120

140

Con

trol

Vehicle

Car

rage

enan

00

4 ug

ml

Car

rage

enan

01

2 ug

ml

Car

rage

enan

03

7 ug

ml

Car

rage

enan

11

ug

ml

Corr

ect

o

f C

ontr

ol

EGFP MTT

1 Tmode IC50為2ppm （以凝膠固含量25計算）

2 Carrageenan IC50=015ppm

3 泡綿吸附凝膠IC50lt09ppm顯示其具加成性及可再釋放性

6-2-B-(3) 凝膠及泡綿對抑制HPV假病毒感染活性實驗結果

108

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

虹纖生醫科技股份有限公司業界合作項目

1仿真桔皮紋之環保紗傢飾用布針織布厚度達09mm3D布面呈現凸點織紋高低不規則的排列具有止滑透氣及鬆軟耐磨之特效布成份為100PET 內含約60回收PET全幅54英吋適用於座椅用布等用途

2植激素理療乳霜適用廣大亞健康族群群植激素可透過八大腺體吸收誘發自體產生賀而蒙消除體內過多自由基活血化淤瘦小臉不必摸臉

3私密處保養調理專用噴劑幕斯凝膠劑型消除異味止癢抑菌預防抑制皰疹及乳突病毒增生功效

4可協助業界申請政府申請相關科專補助計畫

5歡迎有興趣業界洽談合作共創市場利基

109

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110

感謝大家的合作與聆聽

並請指教

110