ECOLE POLYTECHNIQUE PROMOTION X2002 RENAUD Amélie

RAPPORT DE STAGE D’OPTION SCIENTIFIQUE

VARIABILITE INTERSPECIFIQUE DES RELATIONS ENTRE

TRANSMITTANCE ET TENEUR EN CHLOROPHYLLE FOLIAIRE CHEZ LES

ESPECES DE FORET GUYANAISE

NON CONFIDENTIEL

Option : BIOLOGIE Champ de l’option : Ecologie forestière Directeur de l’option : M. Sylvain BLANQUET Directeur de stage : M. Jean-Christophe ROGGY Dates du stage : du 15 avril au 1er juillet 2005 Adresse de l’organisme :

Unité Mixte de Recherche EcoFoG Campus Agronomique BP 316 97379 Kourou Cedex Guyane Française

Ce stage s’est déroulé à l’UMR EcoFoG de Kourou. Je remercie sa directrice Meriem Fournier de m’y avoir accueillie.

Je remercie également Jean-Christophe Roggy et Sabrina Coste, qui m’ont guidée tout au long de ce stage avec compétence et bonne humeur.

Je suis extrêmement reconnaissante à tous ceux qui m’ont aidée dans mon travail : Eliane Louisianna, pour les manipulations en laboratoire, Pascal Imbert pour les prélèvements en forêt, et Eric Marcon pour l’analyse statistique des données.

Enfin, je souhaite adresser une pensée amicale à tout le personnel de l’UMR, pour leur accueil chaleureux.

2

Résumé

Le SPAD-502 est un chlorophyllemètre portatif mesurant la transmittance de la feuille. Contrairement aux méthodes traditionnelles, cet outil est non destructif et les données sont obtenues de façon quasi instantanée. Il est cependant nécessaire d’établir au préalable des courbes de corrélation entre le taux de chlorophylle et la valeur donnée par le SPAD, et ce pour chaque espèce. L’objectif de cette étude était d’établir ces courbes étalon pour 14 espèces de forêt tropicale humide. Il a été montré que la corrélation entre ces deux variables est forte, et que le SPAD-502 constitue un bon outil pour réaliser des mesures de taux de chlorophylle sur une grande échelle. L’étude a mis en évidence l’existence de certains problèmes liés à l’utilisation du SPAD. En particulier, chaque courbe étalon n’est a priori valable que pour une seule espèce. L’étude a toutefois démontré que certains regroupements sont possibles, permettant de n’utiliser qu’une courbe pour plusieurs espèces différentes. Les courbes établies ont d’ores et déjà été utilisées dans le cadre d’une étude concernant l’azote alloué par la plante aux différentes étapes de la photosynthèse. Ces travaux préliminaires ont mis en évidence la variabilité interspécifique des allocations d’azote, suggérant une différence de stratégie entre les espèces.

Abstract

The SPAD-502 is a portable chlorophyll meter that measures the leaf transmittance. Contrary to the traditional methods, the use of this diagnostic tool is non-destructive and the data is obtained almost instantaneously. However, correlation curves between leaf chlorophyll concentration and SPAD readings must first be established, for each species. The objective of this study was to establish these calibration curves for 14 rain forest species. It has been shown that the correlation between the two variables is strong, and thus that the SPAD-502 is a good tool to realize chlorophyll measures on a large scale. The study revealed some problems related to the use of the SPAD chlorophyll meter. In particular, each calibration curve can be used, a priori, for only one species. However, it has been shown that some groups can be made, which would allow the use of one curve for several species. The curves established have already been used for a study concerning the partitioning of nitrogen between the different stages of photosynthesis. This preliminary work has shown the interspecific variability of nitrogen partitioning, which suggests that the species could have different strategies.

Table des matières

TABLE DES MATIERES...................................................................................................................... 2 INTRODUCTION................................................................................................................................... 3 MATERIEL ET METHODE................................................................................................................. 5

I MATERIEL VEGETAL :.................................................................................................................. 5 1 Site d’étude : .......................................................................................................................... 5 2 Matériel végétal :................................................................................................................... 5

II LE SPAD-502 : ........................................................................................................................... 6 III RELATION ENTRE UNITES SPAD ET CONCENTRATION CHLOROPHYLLIENNE : ............................. 7

1 Procédure de calibration du spectrophotomètre : ................................................................. 7 a Détermination des pics d’absorption : .............................................................................................. 8 b Courbes d’étalonnage :DO-Chlorophylle......................................................................................... 8 c Vérification du modèle :................................................................................................................... 9

2 Relation entre valeur SPAD et concentration en chlorophylle :............................................ 9 a Prélèvements : .................................................................................................................................. 9 b Extraction de la chlorophylle : ....................................................................................................... 10

3 Analyse statistique :............................................................................................................. 10 RESULTATS......................................................................................................................................... 11

I CALIBRATION DU SPECTROPHOTOMETRE : ................................................................................ 11 1 Etablissement des coefficients de calcul des concentrations en chlorophylle : ................... 11 2 Linéarité du modèle :........................................................................................................... 12

II COURBES ETALON : ................................................................................................................... 12 1 Variabilité des courbes étalon :........................................................................................... 12

III REGROUPEMENT DES ESPECES :................................................................................................. 14 IV PREMIERES APPLICATIONS : ...................................................................................................... 15

1 Plasticité du taux de chlorophylle vis-à-vis de la lumière :................................................. 15 2 Calcul de Pl : ....................................................................................................................... 16 3 Fraction d’azote allouée à la photosynthèse : ..................................................................... 17 4 Relations entre les traits foliaires, la composition chimique et la capacité

photosynthétique : ....................................................................................................................................... 17 DISCUSSION ........................................................................................................................................ 19

I PROCEDURE D’ETALONNAGE : .................................................................................................. 19 1 Particularités des arbres de forêt tropicale humide :.......................................................... 19 2 Les coefficients de calibration du spectrophotomètre : ....................................................... 19 3 Vérification de la linéarité du modèle : ............................................................................... 19

II LES MESURES SPAD : ............................................................................................................... 19 1 Un modèle polynomial difficilement explicable : ................................................................ 19 2 Incertitudes sur les mesures SPAD:..................................................................................... 20

a Précision des mesures : .................................................................................................................. 20 b Validité des mesures : .................................................................................................................... 20

3 Regroupements d’espèces :.................................................................................................. 21 4 Variabilité interspécifique des traits foliaires : ................................................................... 22 5 Perspectives :....................................................................................................................... 22

CONCLUSION ..................................................................................................................................... 23 BIBLIOGRAPHIE................................................................................................................................ 24 ANNEXE 1 : VARIABILITE INTER ET INTRASPECIFIQUE DES TEMPS D’EXTRACTION

DE LA CHLOROPHYLLE ............................................................................................................................... 26 ANNEXE 2 : COURBES ETALON .................................................................................................... 27 ANNEXE 3: VARIATIONS DU TAUX DE CHLOROPHYLLE EN FONCTION DE

L'ECLAIREMENT............................................................................................................................................. 29

2

Introduction

La forêt tropicale humide est caractérisée par une très grande diversité spécifique. Ainsi, on a déjà dénombré plus de 1300 espèces d’arbres en forêt guyanaise (Ter Steege et al., 2000). L’Unité Mixte de Recherche Ecologie des Forêts de Guyane (UMR EcoFoG) a pour vocation d’étudier les relations qui existent entre cette biodiversité observée, en particulier sa structure et les mécanismes permettant son maintien, et le fonctionnement des écosystèmes de forêt tropicale humide. Pour ce faire, l’UMR a développé quatre grands axes de recherche, dont un consacré à la caractérisation de la diversité fonctionnelle des espèces et à l’étude de son rôle dans le fonctionnement des écosystèmes forestiers. Cette étude concerne, entre autres, les espèces arborescentes. Il s’agit dans un premier temps de caractériser la variabilité des traits fonctionnels des arbres, puis de relier cette variabilité à la diversité des stratégies de survie et de croissance et à l’hétérogénéité des réponses à des modifications de l’environnement. Au sein de la forêt tropical humide, l’intensité du rayonnement lumineux est l’un des facteurs soumis aux plus grandes variations, du sommet de la canopée jouissant d’un fort éclairement au sous-bois où ne parvient qu’une faible partie du rayonnement(Rijkers et al., 2000). L’étude de la variabilité des comportements des espèces face aux différents niveaux d’éclairement est donc un élément important pour la caractérisation de la diversité fonctionnelle. En particulier, l’étude des capacités photosynthétiques constitue un bon point de départ pour déterminer les facteurs permettant la survie des espèces dans un environnement compétitif.

Or, le processus photosynthétique comporte trois étapes-clés, et chacune d’entre elles requiert l’intervention d’azote : la carboxylation, lors du cycle de Calvin, où l’enzyme Rubisco incorpore le carbone du CO2, la bioénergétique, avec le transport des électrons par les cytochromes, et l’interception de la lumière par l’intermédiaire des chlorophylles a et b. L’azote, présent dans la Rubisco, les cytochromes et les chlorophylles, est donc un facteur important pour la photosynthèse. Des travaux antérieurs (Niinemets et al., 2003 ; Hikosaka, 2004) montrent que la quantité totale d’azote foliaire a moins d’influence que la manière dont la plante alloue l’azote dont elle dispose aux différentes fonctions (photosynthèse, défense, structure). Le processus photosynthétique requiert de l’azote pour ses 3 étapes-clés : Le modèle proposé par Niinemets (1997) permet de calculer la fraction d’azote allouée à chacune de ces trois fonctions, respectivement Pc, Pb, et Pl.

La chlorophylle joue un rôle majeur non seulement dans la photosynthèse, en tant que pigment intervenant dans la collecte de l’énergie lumineuse, mais également dans l’étude de la relation entre azote et photosynthèse : chaque molécule de chlorophylle contient quatre atomes d’azote, et la teneur en chlorophylle a donc une grande influence sur la valeur de Pl. Ainsi, il est important de pouvoir mesurer la teneur en chlorophylle des feuilles. Cependant, les méthodes traditionnelles de mesure des concentrations en chlorophylle sont à la fois longues et destructrices : elles nécessitent d’extraire la chlorophylle des feuilles par chauffage au bain-marie pendant plusieurs heures puis de mesurer au spectrophotomètre la densité optique de la solution obtenue. Cette méthode est inapplicable pour des mesures sur une grande échelle, avec de nombreux échantillons. Il était donc nécessaire de trouver une méthode rapide et efficace pour mesurer le taux de chlorophylle, de manière à pouvoir calculer la fraction d’azote Pl.

3

Cependant, une nouvelle méthode, rapide, relativement peu coûteuse et permettant des mesures immédiates sur le terrain a été développée : un appareil, le SPAD-502, permet d’obtenir rapidement la teneur en chlorophylle des feuilles, par l’intermédiaire de la mesure de la transmittance des feuilles. Le SPAD fournit une valeur sans unité comprise entre 0 et 100, fortement corrélée au taux de chlorophylle, qui est l’un des principaux composés absorbants de la feuille. Cependant, cette valeur n’est pas directement utilisable, car il n’existe pour l’instant pas de relation directe entre la mesure de l’absorption, qui dépend de nombreux facteurs, et le taux de chlorophylle. Il est donc nécessaire d’établir des courbes étalon fournissant la relation entre valeur SPAD et concentration en chlorophylles a et b. De telles courbes ont déjà été réalisées (Castelli et al., 1996 ; Markwell et Blevins, 1999). Mais pratiquement aucune étude n’a été réalisée pour des espèces de forêt tropicale humide. De plus, les travaux menés sur les espèces de milieu tempéré ont révélé de grandes variations interspécifiques des courbes, d’où la nécessité a priori de réaliser une courbe étalon par espèce étudiée. Au vu du nombre d’espèces présentes en forêt guyanaise, cette méthode, bien que beaucoup plus rapide que les techniques plus anciennes de mesures du taux de chlorophylle, correspond toutefois à de nombreuses heures de travail.

C’est pourquoi l’objectif de ce stage fut double : tout d’abord, réaliser les courbes étalon donnant la correspondance entre valeur SPAD et teneur en chlorophylle, pour les espèces étudiées dans le cadre de la thèse de Sabrina Coste. Dans un deuxième temps, chercher des regroupements, c’est-à-dire chercher une équation globale permettant de décrire le comportement de toutes les espèces, ou une équation pour un groupe d’espèces.

4

Matériel et méthode

I Matériel végétal :

1 Site d’étude :

Cette étude a été réalisée à Kourou en Guyane française (5°10’N, 52°40’W, Amérique du sud) entre les mois de mai et juillet 2005. Le climat de cette région se caractérise par l’existence d’une saison humide de décembre à août, interrompue en février par une courte saison sèche, et d’une saison sèche plus longue de septembre à novembre. La moyenne des précipitations annuelles est de 2500 mm par an et la température moyenne de 25°C avec peu de variations saisonnières.

Les prélèvements ont été effectués principalement sur des jeunes plants de deux ans cultivés dans une serre située à Kourou, au sein de l’UMR. Tous les plants ont été élevés dans des pots de 30 L contenant un mélange de 2/3 de terre prélevée en forêt et 1/3 de sable. Les sols ont été maintenus à capacité au champ (environ 0.25 m3 m-3) pour et ont régulièrement été fertilisés (Multicote ;18-6-9). Comme seul le toit de la serre est vitré, les conditions climatiques, à l'exception des précipitations, étaient celles du milieu extérieur. Sous cette serre, les espèces ont été réparties sous trois niveaux d’éclairement différents : 5%, 10% et 20% du rayonnement incident.

Des prélèvements supplémentaires ont également été effectués en forêt, au sein du dispositif sylvicole expérimental de Paracou (CIRAD Forêt), au Nord-est de Kourou.

2 Matériel végétal :

Tableau 1: espèces prélevées, familles botaniques et abréviations utilisées

Héliophile

Héliophile

Hémi tolérant

Tolérant

Tolérant

Tolérant

Hémi tolérant

Héliophile

Hémi tolérant

Hémi tolérant

Héliophile

Héliophile

Héliophile

Hémi tolérant

Tempéramentsvis-à-vis de la lumière

Serre + forêt

Serre + forêt

Serre + forêt

Serre + forêt

Serre + forêt

Serre

Serre

Serre + forêt

Serre

Serre

Serre + forêt

Serre + forêt

Serre

Serre + forêt

Lieux de prélèvements

Va

Tm

Sg

Sr

Po

Pc

Pm

It

Hc

Ef

Co

Cp

Bg

Ag

code

32CaesalpiniaceaeVouacapoua americana J.B. Aublet

34CaesalpiniaceaeTachigali melinonii (Harms) Barneby

32ClusiaceaeSymphonia globulifera Linnaeus f.

35LauraceaeSextonia rubra Mez

38BurseraceaeProtium opacum Swart

30SapotaceaePradosia cocchlearia (Lecomte) Pennington

30SapotaceaePouteria macrophylla (Lam.) Eyma

37MimosaceaeInga thibaudiana D.C.

32CaesalpiniaceaeEperua falcata J.B. Aublet

34CaesalpiniaceaeHymenea courbaril Linnaeus

34CecropiaceaeCecropia obtusa Trécul.

36MeliaceaeCarapa procera A.P. De Candolle

30MoraceaeBagassa guyanensis J.B. Aublet

36EuphorbiaceaeAmanoa guyanensis J.B. Aublet

Nombre de prélèvementsFamilleEspèce

Héliophile

Héliophile

Hémi tolérant

Tolérant

Tolérant

Tolérant

Hémi tolérant

Héliophile

Hémi tolérant

Hémi tolérant

Héliophile

Héliophile

Héliophile

Hémi tolérant

Tempéramentsvis-à-vis de la lumière

Serre + forêt

Serre + forêt

Serre + forêt

Serre + forêt

Serre + forêt

Serre

Serre

Serre + forêt

Serre

Serre

Serre + forêt

Serre + forêt

Serre

Serre + forêt

Lieux de prélèvements

Va

Tm

Sg

Sr

Po

Pc

Pm

It

Hc

Ef

Co

Cp

Bg

Ag

code

32CaesalpiniaceaeVouacapoua americana J.B. Aublet

34CaesalpiniaceaeTachigali melinonii (Harms) Barneby

32ClusiaceaeSymphonia globulifera Linnaeus f.

35LauraceaeSextonia rubra Mez

38BurseraceaeProtium opacum Swart

30SapotaceaePradosia cocchlearia (Lecomte) Pennington

30SapotaceaePouteria macrophylla (Lam.) Eyma

37MimosaceaeInga thibaudiana D.C.

32CaesalpiniaceaeEperua falcata J.B. Aublet

34CaesalpiniaceaeHymenea courbaril Linnaeus

34CecropiaceaeCecropia obtusa Trécul.

36MeliaceaeCarapa procera A.P. De Candolle

30MoraceaeBagassa guyanensis J.B. Aublet

36EuphorbiaceaeAmanoa guyanensis J.B. Aublet

Nombre de prélèvementsFamilleEspèce

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Quatorze espèces de forêt tropicale humide ont été sélectionnées de façon à couvrir la gamme de tempérament vis-à-vis de la lumière la plus large possible (voir Tableau 1 ci-dessus). Pour chaque espèce, une quarantaine d’échantillons ont été prélevés.

II Le SPAD-502 :

Le SPAD-502 (Minolta, Japan, figure 1), est un instrument permettant de mesurer rapidement le taux de chlorophylle des feuilles.

Figure 1 : SPAD-502

Le principe de base du SPAD est la mesure de la transmittance de la feuille. La partie du SPAD servant à la mesure est en forme de pince, dans laquelle on glisse la feuille. Puis, comme on peut le voir sur la Figure 1 ci-dessus, l’opérateur referme la pince sur la feuille. La branche supérieure émet alors de la lumière qui traverse la feuille puis est captée par des récepteurs. Ces derniers, situés dans la branche inférieure de l’appareil, transforment la lumière transmise en signal électrique et l’amplifient. Le signal est ensuite converti en unités analogiques, appelé unités SPAD. La surface utilisée lors de la mesure est de 6 mm², et la mesure a une précision de +

- 1 unité SPAD (MinoltaCompany, 1989). L’appareil a une capacité de stockage de 30 données, et est capable d’effectuer la moyenne de toutes les mesures prises.

La feuille contient plusieurs types de pigments : chlorophylles, caroténoïdes, anthocyanes, xanthophylle. Pour que la mesure donnée par le SPAD puisse être mise en relation avec le taux de chlorophylle, la transmittance est mesurée à deux longueurs d’ondes différentes : deux diodes électroluminescentes (DEL) émettent un rayonnement respectivement à 650 nm (rouge) et 940 nm (infrarouge). A 650 nm, l’absorbance des chlorophylles est élevée (Figure 2 ci-dessous) et il a été montré qu’à cette longueur d’onde, l’absorbance est fortement corrélée avec le taux de chlorophylle (Gitelson et al., 2003). A 940 nm au contraire, cette absorbance est très faible, et on peut considérer que l’absorption de la lumière émise par la DEL est due uniquement aux pigments non chlorophylliens, et aux caractéristiques de la structure foliaire.

6

Figure 2 : spectres d’absorption des principaux pigments foliaires : caroténoïdes, chlorophylle a et chlorophylle b.

L’appareil émet des intensités lumineuses I650 et I940 connues, puis mesure les intensités I’650 et I’940 transmises. Selon (Markwell et al., 1995), la valeur M fournie par le SPAD correspond à :

M=log(I650/ I’650)- log(I940/ I’940) (1)

III Relation entre unités SPAD et concentration chlorophyllienne :

1 Procédure de calibration du spectrophotomètre :

Cette étape s’appuie sur la loi de Beer-Lambert, donnant une relation linéaire entre la Densité Optique (DO) mesurée au spectrophotomètre et la concentration C de la solution en molécules absorbant à la longueur d’onde considérée:

DO=α C (où α est une constante) (2)

Comme la feuille contient des pigments autres que la chlorophylle, on effectue les mesures aux pics d’absorption des chlorophylles a et b (figure 2). Les équations permettant de calculer les concentrations en chlorophylle a et b (notées respectivement CA et CB) à partir de la DO mesurée aux pics d’absorption ont déjà été établies par d’autres études (Arnon, 1949 ; Barnes et al., 1992 ; Wellburn, 1994), et sont largement utilisées par les études ultérieures. Cependant, ces équations dépendent fortement du spectrophotomètre utilisé lors des mesures de DO. En particulier, les longueurs d’onde des pics d’absorption peuvent varier de quelques nm, induisant des écarts dans les mesures et donc dans les coefficients. C’est pourquoi nous avons jugé nécessaire de procéder à la calibration de notre spectrophotomètre (Jenway)

7

a Détermination des pics d’absorption :

Des standards de chlorophylle a et b extraits de l’épinard (BioChemika 10865 et 25740) ont été dissous dans de l’éthanol à 95%. On obtient deux solutions mères, qui vont nous permettre de déterminer les longueurs d’onde d’absorbance maximale des chlorophylles, qui seront utilisées par la suite pour les mesures sur les extraits végétaux. Les deux chlorophylles possèdent chacune deux pics d’absorption, vers 450 nm et 650 nm (voir Figure 2), le pic principal étant à 450nm. Cependant, à cette longueur d’onde, d’autres pigments foliaires, comme le carotène, sont susceptibles d’absorber la lumière et donc de perturber la mesure de densité optique. C’est pourquoi nous n’avons utilisé que le pic secondaire, à 650 nm environ. Les spectres d’absorption entre 600 nm et 680 nm environ ont donc été établis (Figure 3 ci-dessous) pour déterminer les longueurs d’onde λmax (A) et λmax (B) d’absorption maximale des chlorophylles a et b.

spectre d'absorption de la chlorophylle a

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

645 650 655 660 665 670 675 680 685

Longueur d'onde (nm)

D.O

.

spectre d'absorption de la chlorophylle b

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

580 600 620 640 660 680 700

Longueur d'onde (nm)

D.O

.

Figure 3: spectres d'absorption des chlorophylles a et b

On a ainsi obtenu les valeurs λmax (A)= 664 nm et λmax (B)= 647 nm. Toutes les mesures de DO des extraits de feuille ont effectuées à ces longueurs d’onde, où on peut considérer que la chlorophylle est la seule espèce absorbante : l’équation (2) devient :

DO = a CA+ b CB (3)

où a et b sont des coefficients caractéristiques respectivement de la chlorophylle a et b. Ils dépendent de plus de la température et surtout de la longueur d’onde à laquelle on se place pour effectuer la mesure.

b Courbes d’étalonnage : DO-Chlorophylle

Le but de cette étape est de déterminer les coefficients a et b de l’équation (3) aux pics d’absorption des deux chlorophylles.

Pour déterminer les coefficients de la chlorophylle a, on utilise des solutions ne contenant que ce type de chlorophylle : la concentration en chlorophylle a est donc directement proportionnelle à la DO mesurée : DO = a CA

Pour calculer le coefficient a aux maxima d’absorption, on prépare plusieurs solutions, chacune ayant une concentration en chlorophylle a différente. On mesure la DO pour chacune de ces solutions aux maxima d’absorption, puis par régression linéaire on en déduit le

8

coefficient a. Pour déterminer les coefficients de la chlorophylle b, on suit le même protocole que pour la chlorophylle a.

c Vérification du modèle :

Pour vérifier la linéarité du modèle DO = a CA+ b CB, on utilise des solutions chlorophylle a et b en mélange, puis on compare les résultats obtenus expérimentalement avec les valeurs calculées à partir des coefficients a et b. Si on trace les courbes correspondant à [Chl A] (respectivement [Chl B]) constante, le modèle prévoit l’obtention de droites.

La relation entre DO et concentration en chlorophylle obtenue, permet de déduire directement la concentration en chlorophylle a et b de la mesure de la DO d’un extrait de feuille

664 664 664

647 647 647

647 664664 647

664 647 647 664 664 647 647 664

664 647647 664

664 647 647 664 664 647 647 664

A B

A B

A

B

DO a C b CDO a C b C

b bC DOa b a b a b a b

a aC DOa b a b a b a b

= +⎧⎨ = +⎩⎧ = −⎪ − −⎪⇔ ⎨⎪ = −⎪ − −⎩

DO

DO

O

(4)

Avec les coefficients calculés, on obtient donc :

664 647

647 664

16,40 6,43 55,08 16,20

A

B

C DO DOC DO D

= −⎧⎨ = −⎩ (5)

2 Relation entre valeur SPAD et concentration en chlorophylle :

a Prélèvements :

Les extraits végétaux ont été prélevés sous forme de disques à l’aide d’un emporte-pièce. Initialement, la surface des disques était de 2,27 cm², mais au vu des difficultés rencontrées lors de l’extraction de la chlorophylle, cette surface a été réduite à 0,78 cm², ce qui a permis de réduire considérablement les temps d’extraction.

Pour chaque échantillon, on a noté la mesure fournie par le SPAD. Trois mesures par disque environ ont été effectuées, la valeur SPAD retenue étant la moyenne de ces trois valeurs. Des données concernant la structure foliaire ont également été mesurées: l’épaisseur (µm), la masse surfacique (LMA : Leaf Mass Area, g cm-2) et la densité (LMA/épaisseur, g cm-3) de la feuille. Les échantillons prélevés ont été immédiatement conservés dans le diméthylsulfoxide (DMSO), dans des tubes protégés de la lumière par de l’aluminium. D’autres solvants peuvent être utilisés pour l’extraction de la chlorophylle comme l’acétone, l’éthanol, ou le diméthylformamide (DMF) (Webb et al., 1992 ; Sanchez, 1998). Certaines études (Shinano et al., 1996 ; Sanchez, 1998) ont montré que le DMSO et le DMF ont une efficacité comparable, et sont mieux adaptés que l’acétone ou l’éthanol, car ils ne nécessitent pas une macération préalable des feuilles. De plus, il a été avéré que le DMSO permettait une bonne conservation des échantillons dans des conditions de terrain (Tait et Hik, 2003).

9

b Extraction de la chlorophylle :

L’extraction a été effectuée par incubation au bain-marie à 65°C. Les tubes étaient retirés du bain-marie dès que toute la chlorophylle était extraite des feuilles, pour éviter la dégradation du pigment. Le temps d’incubation nécessaire pour une extraction totale varie de façon significative entre les espèces (p<0,001, voir Figure 4.) Les temps donnés dans la littérature pour les espèces tempérées sont compris entre 2 et 5h d’incubation à des températures variant de 40 à 65°C, pour des surfaces de disques supérieures à celles que nous avons choisies (Barnes et al., 1992 ; Wellburn, 1994 ; Sanchez, 1998). La Figure 4 ci-dessus montre que pour les espèces de forêt tropicale humide, les temps d’incubation sont considérablement plus longs.

Co Tm Hc It Pc Va Ag2

4

6

8

10

12

14

16

18

Figure 4 : temps moyen d’incubation (en heures) par espèce nécessachlorophylle. La moyenne, l’écart-type et l’intervalle de confiance à 95% sUne valeur de p<0,001 indique une différence significative entre les espèce

Les concentrations en chlorophylle a et b ont été obtenuesdes mesures de DO à 647 et 664nm. Nous avons ainsi pu traconcentration totale en chlorophylle en fonction des unités SPAD

3 Analyse statistique :

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées sous le lStatsoft Inc., USA).Le seuil de significativité (p) a été fixé à 0,Plusieurs types d’analyse ont été réalisés dans cette étude :

• Des ANOVA complétées par les tests Post Hoc de Tuck

• Des régressions linéaires, suivies du test de la normalité

10

p<0,001

Moyenne Erreur-type Intervalle de confiance

ire à l’extraction totale de la ont donnés pour chaque espèce.

s.

à l’aide de l’équation (5) et cer les courbes donnant la .

ogiciel STATISTICA (v6.0, 05 pour toutes les analyses.

ey

des résidus.

Résultats

I Calibration du spectrophotomètre :

1 Etablissement des coefficients de calcul des concentrations en chlorophylle :

A partir des deux solutions mères de chlorophylles a et b dissoutes dans de l’éthanol à 95%, nous avons par des dilutions successives obtenu pour chaque type de chlorophylle plusieurs solutions de concentrations différentes. La mesure de la DO de ces solutions a permis l’établissement de 4 courbes d’étalonnage donnant la DO en fonction des concentrations en chlorophylle, aux deux pics d’absorption 647nm et 664nm (voir Figure 5 ci-dessous)

Chlorophylle a (647 nm)y = 0,0179xR2 = 0,9861

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0 2 4 6 8 10 12

CA (µg/ml)

DO

Chlorophylle a (664 nm)y = 0,0608xR2 = 0,9993

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 2 4 6 8 10 12

CA (µg/ml)

DO

Chlorophylle b (647 nm)y = 0,0181xR2 = 0,9984

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 2 4 6 8 10 12 14

CB (µg/ml)

DO

Chlorophylle b (664 nm)y = 0,0071xR2 = 0,9901

00,010,020,030,040,050,060,070,080,09

0,1

0 2 4 6 8 10 12 14

CB (µg/ml)

DO

Figure 5 : courbes d’étalonnage donnant la DO correspondant aux concentrations de chlorophylle a à 647 nm (A) et à 664 nm(B) et de chlorophylle b à 647 nm (C) et 664 nm (D). Les pentes des droites A, B, C et D donnent respectivement les coefficients a647, a664, b647 et b664

Les coefficients obtenus sont ainsi :

a647= 0,0179 et a664= 0,0608 et

b647= 0,0181 et b664= 0,0071

C

A B

D

11

2 Linéarité du modèle :

A partir des solutions de chlorophylle a et b utilisées lors de l’étape de calibration du spectrophotomètre, des mélanges de chlorophylle a et b, CA et CB étant connues, ont été réalisés. Ces mélanges ont été utilisés pour tracer des courbes donnant la DO des mélanges en fonction de CB, CA restant constante, et inversement. Les courbes obtenues sont des droites, et le coefficient de régression est toujours supérieur à 0,98 (voir Figure 6).

CA = 1,66 µg/ml

0,35

CB= 1,66 µg/ml

0,8

A B

Figufoncd’abvarierepr

polyPoules mexpode cprécaux Tabvalidnormaux de d

y = 0,0343x + 0,0873R2 = 0,9948

y = 0,0143x + 0,1902R2 = 0,9871

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 2 4 6

CB

D.O

.

8

647 nm664 nm

re 6: linéarité du modèle. Le graphique (A) donntion de la concentration en chlorophylle b (ensorption (647nm et 664 nm). Dans chacun des méla, la concentration en chlorophylle a (CA) restant

ésente la manipulation inverse : CA varie tandis que

II Courbes étalon :

1 Variabilité des courbes étalo

Différents modèles ont été appliqués nomial, et exponentiel. Pour toutes les esteria Macrophylla et de Pradosia cocchlear

eilleurs résultats. Pour Eperua Falcata et Pnentiel convenait mieux. Pradosia cocchleaette espèce diffère nettement de celles desédemment n’a convenu. Les équations des mcourbes, ainsi que les coefficients de régressleau 2. Les courbes étalon sont présentées enité du modèle polynomial a été testée, nalité a été vérifiée. Une vérification a poster

données a également été effectuée : en particegré 2 est statistiquement acceptable : tous le

y = 0,0446x + 0,0672R2 = 0,9994

y = 0,0996x + 0,0391R2 = 0,9989

00,10,20,30,40,50,60,7

0 2 4 6 8

CA

D.O

. 647 nm664 nm

e la DO de 4 mélanges de chlorophylles a et b en µg/ml). La DO a été mesurée aux deux pics nges, seule la concentration en chlorophylle b (CB) constante et égale à 1,66 µg/ml. Le graphique (B) CB reste égale à 1,66 µg/ml.

n :

aux courbes obtenues : modèles linéaire, pèces à l’exception d’Eperua Falcata, de ia, c’est le modèle polynomial qui a donné outeria Macrophylla en revanche, le modèle ria constitue un cas à part : la courbe étalon autres espèces, et aucun des modèles cités

odèles polynomial et exponentiel appliqués ion R² correspondants, sont présentés dans le Annexe 2. A l’aide du logiciel Statistica, la otamment par l’étude des résidus, dont la iori du degré du modèle polynomial appliqué ulier, l’hypothèse selon laquelle le polynôme s coefficients au-delà du degré 2 sont nuls.

12

Tableau 2 : équations des modèles polynomial et exponentiel appliqués à chaque espèce. Les coefficients R² correspondant sont également indiqués. Ces équations donnent la relation entre la valeur SPAD et la concentration totale en chlorophylle exprimée en µmol/m².

Espèce Equation polynomiale R² Equation exponentielle R²

Amanoa Guyanensis (Ag) y = 0,1573x² + 5,5383x + 69,493 0,9737 y = 115,23exp(0,0336x) 0,9437

Bagassa Guyanensis (Bg) y = 0,0813x² + 7,6724x + 6,4391 0,9742 y = 38,165exp(0,0638x) 0,87

Carapa Procera (Cp) y = 0,0845x² + 7,4511x + 16,395 0,9744 y = 102,72exp(0,0321x) 0,9448

Cecropia Obtusa (Co) y = 0,4152x² - 8,0587x + 125,9 0,9375 y = 52,329exp(0,0519x) 0,8875

Eperua Falcata (Ef) y = 0,1064x² + 0,0323x + 171,84 0,7659 y = 135,19exp(0,0231x) 0,7843

Hymenea Courbaril (Hc) y = 0,0674x² + 11,531x - 25,049 0,9135 y = 72,463exp(0,0442x) 0,7895

Inga Thibaudiana (It) y = 0,1099x² + 9,5003x + 170,46 0,926 y = 206,86exp(0,028x) 0,8485

Pradosia Cocchlearia (Pc) y = 0,3805x² - 12,501x + 1149,9 0,0048 y = 977,02exp(0,0017x) 0,0016

Protium Opacum (Po) y = 0,1666x² + 7,3279x + 47,765 0,9408 y = 87,414 exp(0,0476x) 0,9297

Pouteria Macrophylla (Pm) y = 0,4752x² - 26,022x + 894,13 0,9231 y = 346,64exp(0,0205x) 0,958

Symphonia Globulifera (Sg) y = 0,0857x² + 6,8659x + 51,063 0,9762 y = 87,772exp(0,0356x) 0,8603

Sextonia Rubra (Sr) y = 0,0738x² + 10,554x - 17,556 0,9916 y = 119,67exp(0,0323x) 0,9594

Tachigali Melinonii ( Tm) y = 0,2652x² - 3,3247x + 289,44 0,9356 y = 205,68exp(0,0262x) 0,8395

Voucapoua Americana (Va) y = 0,4075x² - 12,471x + 267,1 0,8986 y = 112,24exp(0,0341x) 0,832

On observe une grande variabilité des équations obtenues. En particulier, les valeurs maximales de SPAD pour chaque espèce s’échelonnent de 50,7 (Bagassa Guyanensis) à 87 (Pouteria Macrophylla) (Figure 7)

Bgy = 0,0813x2 + 7,6724x + 6,4391

R2 = 0,9742

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 100SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

Pmy = 0,4752x2 - 26,022x + 894,13

R2 = 0,9231

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 10SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

0

Figure 7 : courbes étalon de Bagassa Guyanensis (à gauche) et Pouteria Macrophylla (à droite). En abscisse sont données les valeurs SPAD, et en ordonnée la concentration totale en chlorophylle (en µmol/m²)

13

Une analyse en covariance (ANCOVA) a été effectuée. La variable dépendante est la racine carrée du taux de chlorophylle (ce qui permet d’obtenir un modèle linéaire) et les deux covariants choisis sont valeur SPAD mesurée et l’espèce de l’échantillon. Sur la Figure 8, on observe un « effet espèce » : une même valeur SPAD correspond à différentes concentrations en chlorophylle selon l’espèce considérée.

Bg Co Tm Po Hc Ef It Pm Sg Va Sr Ag CpEspèce

16

18

20

22

24

26

28

30

Sqrt

chlo

ro

valeur du covariant:SPAD: 38,81663

Figure 8 : influence de l’espèce de l’échantillon sur la correspondance entre valeur SPAD et taux de chlorophylle. Pour une même valeur SPAD (38,8), la racine carrée du taux de chlorophylle (en (µmol/m²)^1/2, en ordonnées) varie selon l’espèce (en abscisses).

III Regroupement des espèces :

Des regroupements ont été effectués selon la classification établie par Favrichon (1995). Les espèces ont été séparées en 3 groupes, selon leur comportement vis-à-vis de la lumière : espèces héliophiles, hémi-tolérantes et tolérantes. La courbe obtenue en regroupant toutes les espèces est également présentée. Au vu des résultats obtenus pour la courbe étalon de Pradosia cocchlearia, cette espèce a été exclue de tous ces regroupements (voir Figure 9 ci-dessous). On constate qu’on obtient à chaque fois des coefficients R² supérieurs à 0,86.

14

A y = 0,0674x2 + 11,695x - 19,366R2 = 0,8621

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 20 40 60 80 100SPAD

[Chl

](µm

ol.m

-2)

Bg

Co

It

Tm

Cp

B y = 0,2872x2 - 5,896x + 210,75R2 = 0,8683

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 20 40 60 80 100SPAD

[Chl

](µm

ol.m

-2)

Hc

Ef

Sg

Ag

Pm

C y = 0,105x2 + 7,4835x + 58,581R2 = 0,9331

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 20 40 60 80 100

SPAD

[Chl

](µm

ol.m

-2)

PoSrVa

D y = 0,1884x2 + 2,0565x + 118,55

R2 = 0,8617

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 20 40 60 80 100

SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

BgCoTmPoHcEfItPmSgVaSrAgCp

Figure 9 : courbes étalon des espèces regroupées selon la classification de Favrichon : espèces héliophiles (A), hémi-tolérantes (B) et tolérantes (C). Le graphique (D) montre la courbe obtenue en regroupant toutes les espèces (sauf Pradosia cocchlearia). Pour l’espèce Tachigali Melinonii, sur le graphique (A), seules les valeurs de SPAD supérieures à 15 ont été prises en compte pour la régression polynomiale: les valeurs inférieures à 15 unités SPAD, concernant des feuilles très jeunes, rouges, ont été considérées comme non fiables. La concentration en chlorophylle est exprimée en µmol/m².

IV Premières applications :

1 Plasticité du taux de chlorophylle vis-à-vis de la lumière :

La Figure 10 ci-dessous montre l’existence de différences significatives entre les espèces, pour chaque niveau d’éclairement (P<0,001, voir Annexe 3). Par contre, le caractère significatif de la plasticité intraspécifique est variable selon les espèces. Pour les données traitées, les différences intraspécifiques peuvent être considérées comme significatives pour toutes les espèces sauf Eperua Falcata et Symphonia Globulifera (voir Annexe 3)

15

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Ef Po Va Bg Tm Co Hc Sr It Sg Pm

[Chl

](µm

ol.m

-2)

5%15%30%

Figure 10 : variabilité du taux de chlorophylle foliaire par espèces, en fonction du niveau d’éclairement.

2 Calcul de Pl :

La réalisation des courbes étalon a permis le calcul de la part d’azote allouée à la capture de la lumière : Pl, selon le modèle proposé par Niinemets (1997). La fraction d’azote allouée à la chlorophylle varie du simple (10%) à plus du triple (33%) (voir Figure 11 ci-dessous). Amanoa Guyanensis et Eperua Falcata se détachent nettement de la moyenne des autres espèces, le premier allouant plus de 30% de l’azote à la chlorophylle tandis que le second n’y consacre qu’environ 10%.

Median 25%-75%

Ag Bg Co Cp

e

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

Pl

0,50

1

Figure 11 : boites à moustache de la fraction d’azote a14 espèces étudiées (voir Tableau 1 pour abréviations)25%-75% et 10%-90% sont indiqués.

P<0,00

10%-90%Ef Hc Sg Va

sp

llouée à l’interception de la lumière (Pl)pour 8 des . Pour chaque espèce, la médiane et les quantiles à

16

3 Fraction d’azote allouée à la photosynthèse :

Le calcul de la fraction d’azote Pl consacrée par la plante à l’interception de la lumière a permis de calculer la part d’azote allouée au processus photosynthétique dans son ensemble, grâce aux taux Pc (pour la carboxylation) et Pb (pour le transfert des électrons) déjà calculés dans le cadre de la thèse de Sabrina Coste. La somme de ces trois contributions est représentée sur la figure 13 (A). La variation interspécifique est significative statistiquement du terme. La part d’azote consacrée à la photosynthèse varie de 70% environ pour Amanoa Guyanensis à seulement 30% pour Vouacapoua Americana. La figure 13 (B) illustre la façon dont cette part d’azote allouée à la photosynthèse est répartie entre les 3 étapes du processus. On constate que chez toutes les espèces, la part consacrée Pb à la bioénergétique (transfert des électrons) est minoritaire, et varie de 0,03 (pour Vouacapoua Americana) à 0,08 (pour Cecropia Obtusa). A l’inverse, c’est l’étape de carboxylation qui reçoit la plus grande part d’azote. Les rapports entre les trois fractions varient selon les espèces. Pl et Pc subissent d’importantes variations entre les espèces, variant du simple au triple. Ainsi, Pl varie de 0,1 (Eperua Falcata) à 0,33 (Amanoa Guyanensis) et Pc varie de 0,16 (Vouacapoua Americana) à 0,44 (Cecropia Obtusa)

1,0

1,1

0,45

0,5A B

Méd 25% 10%Ag Bg Co Cp Ef Hc Sg Va

Espèces

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Pc+

Pb+

Pl

Figure 12 : (A) : fraction d’azote allouchaque espèce sont représentés la médiane et lindique une différence significative entre les esétapes de la photosynthèse (fractions Pc en bleu

4 Relations entre les tracapacité photosynthét

Une très forte corrélation a été obvariables sont également toutes intercorétablie entre Pl et Pc, ni entre Pl et Pb. Untrouvée. Le Tableau 3 donne les indices d

iane -75% -90%

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

Ag Bg Co Cp Ef Hc Sg VaEspèces

Pc

Pb

Pl

ée à la photosynthèse dans son ensemble (Pc+Pb+Pl). Pour es quantiles 25%-75% et 10%-90%. Une valeur de p<0,001 pèces. En (B), la répartition de l’azote entre les différentes , Pb en violet et Pl en jaune) est représentée.

its foliaires, la composition chimique et la ique :

servée entre Vcmax, Jmax et Rd, et entre Pc et Pb. Ces 5 rélées entre elles. Aucune corrélation n’a pu être e corrélation entre Cm et la densité a également été

e corrélation entre les variables citées ci-dessus.

17

Tableau 3 : tableau des corrélation pour Vcmax, Jmax, épaisseur, densité, Rd, Nm, Cm, Pc, Pb , Pl, Pc+Pb, Pc+Pb+Pl, et concentration en chlorophylle. Les valeurs en rouge indiquent une corrélation significative.

Variablevcamx jmax rd ép. LMA densité Nm Cm Pc Pb Pb+Pc Pl [Chl] Ptot

vcamx (µmol/g/s)

jmax (µmol/g/s)

rd (µmol/g)

épaisseur(µm)

LMA(g/m²)

densité(g/cm^3)

Nm (mg/g)

Cm (mg/g)

Pc

Pb

Pb+Pc

Pl

Chloro(mmol/g)

Ptot (Pc+Pb+Pl)

1,0000 ,9854 ,9645 ,7860 ,8228 ,7954

p=,000

-,0133 -,6408 -,6054 ,5293 -,2134 -,0914 ,3976 ,4919

p= --- p=,000 p=,021p=,975 p=,087 p=,112 p=,177 p=,612 p=,012 p=,018

,9854 ,9249 ,7464 ,8240 ,7622

p=,000

p=,830 p=,329 p=,216

1,0000 ,0368 -,6457 -,6631 ,5652 -,3118 -,1026 ,3830 ,4644

p= --- p=,001 p=,033 0 p=,028

,9645 ,9249 ,7374 ,7307 ,7396

0 p=,001 p=,037

p=,931 p=,084 p=,073 p=,144 p=,452 p=,809 p=,349 p=,246

1,0000 -,1347 -,6591 -,4872 ,5198 -,0824 -,2014 ,3446 ,4012

p= --- p=,751 p=,075 p=,221 p=,187 p=,846 p=,040 p=,036 p=,632 p=,403 p=,325

-,0133 ,0368 -,1347 1,0000 ,5356 -,5916 -,6060 -,6853 ,3649 ,4357 ,3779 ,5767 -,3210 ,5323

p=,975 p=,931 p=,751 p= --- p=,171 p=,122 p=,111 p=,061 p=,374 p=,281 p=,356 p=,135 p=,438 p=,174

-,6408 -,6457 -,6591 ,5356 1,0000 ,3396 ,0258 -,1507 -,2012 -,1595 ,4953 -,4827 ,1311

p=,087 p=,084

-,8055

p=,075 p=,171 p= --- p=,410 p=,952 p=,722p=,016 p=,633 p=,706 p=,212 p=,226 p=,757

-,6054 -,6631 -,4872 -,5916 ,3396 1,0000 -,0240 -,6344 -,6556 -,2973 -,2534 -,5850

p=,112 p=,073

,8507 -,7488

p=,221 p=,122 p=,410 p= --- p=,955 p=,091p=,007 p=,033

-,8055 -,7570

p=,078 p=,474 p=,545 p=,128

,5293 ,5652 ,5198 -,6060 -,0240 1,0000 ,2719 -,0880 ,0183 -,0712 ,1489 -,4118

p=,177 p=,144 p=,187 p=,111 p=,955 p= --- p=,515 p=,836p=,016 p=,966 p=,867 p=,725 p=,311

-,2134 -,3118 -,0824 -,6853 ,0258 ,2719 1,0000 -,4251 -,5550 -,4479 -,5322 -,2675 -,5582

p=,612 p=,452

p=,030

,8507

p=,846 p=,061 p=,952 p=,515 p= --- p=,294p=,007 p=,153 p=,266 p=,175 p=,522 p=,150

,3649 -,1507 -,6344 -,0880 -,4251 1,0000 ,4925 ,4551,7860 ,7464 ,7374 ,9674 ,9992 ,9099

p=,021 p=,033 p=,037 p=,374 p=,722 p=,091 p=,836 p=,294 p= --- p=,000 p=,000 p=,002

,8228 ,8240 ,7307 -,7488 ,9674 ,9769 ,8703

p=,012 p=,012

p=,215 p=,257

,4357 -,2012 ,0183 -,5550 1,0000 ,4408 ,4254

p=,040 p=,033 p=,000 0 p=,005

,7954 ,7622 ,7396 ,9992 ,9769 ,9075

p=,018 p=,028

p=,281 p=,633 p=,966 p=,153 p= --- p=,274 p=,293

,3779 -,1595 -,6556 -,0712 -,4479 1,0000 ,4863 ,4523

p=,036 0 0 p= --- 0

-,7570 ,8083

p=,356 p=,706 p=,078 p=,867 p=,266 p=,222 p=,261

-,0914 -,1026 -,2014 ,5767 ,4953 -,2973 -,5322 ,4925 ,4408 ,4863 1,0000 ,4027

p=,830 p=,809 p=,632 p=,135 p=,212 p=,474 p=,175 p=,215p=,030 p=,274 p=,222 p= --- p=,323

,3976 ,3830 ,3446 -,3210 -,4827 -,2534 ,1489 -,2675 ,4551 ,4254 ,4523 ,4027 1,0000 ,4980

p=,329 p=,349

p=,015

p=,403 p=,438 p=,226 p=,545 p=,725 p=,522 p=,257 p=,293 p=,261 p=,323 p= --- p=,209

,4919 ,4644 ,4012 ,5323 ,1311 -,5850 -,4118 -,5582 ,4980 1,0000

p=,216 p=,246

,9099 ,8703 ,9075 ,8083

p=,325 p=,174 p=,757 p=,128 p=,311 p=,150 p=,002 p=,005 p=,002 p=,015 p=,209 p= ---

18

Discussion

I Procédure d’étalonnage :

1 Particularités des arbres de forêt tropicale humide :

Nous avons constaté une différence importante entre le comportement des 14 espèces de forêt tropicale humide étudiées, et celui des espèces vivant en milieu tempéré, tel qu’il est décrit dans la littérature, ce qui nous a amené à modifier à plusieurs reprises le protocole de prélèvement et d’extraction. En particulier, les temps d’extraction sont considérablement plus longs, ce qui semble indiquer une différence de structure significative entre les espèces de forêt tropicale et celles des forêts tempérées. L’augmentation de la température du bain-marie, de 65°C à 70°C, n’a pas amélioré l’extraction, et a même entraîné la dégradation de la chlorophylle. Nous avons donc choisi comme solution de diminuer fortement la surface de l’échantillon prélevé.

2 Les coefficients de calibration du spectrophotomètre :

Lorsque le SPAD est utilisé, pour des mesures de taux de chlorophylle ou d’azote, les coefficients les plus utilisés sont ceux calculés par Barnes (Barnes et al., 1992) ou par Wellburn (Wellburn, 1994). Les concentrations de chlorophylle obtenues en appliquant ces coefficients aux mesures SPAD effectuées au cours de cette étude sont présentées en Annexe 2. Les longueurs d’onde auxquelles ont été effectuées les mesures diffèrent de quelques nanomètres, puisque Barnes et Wellburn ont effectués leurs mesures respectivement à 664nm et 648 nm pour Barnes et 665nm et 649 nm pour Wellburn. Cette variation, due au type de spectrophotomètre, explique pourquoi les résultats diffèrent.

3 Vérification de la linéarité du modèle :

Lors de cette étape de validation du modèle, nous avons mesuré la DO de plusieurs mélanges de chlorophylle a et b, que nous avons regroupés de façon a faire varier la concentration d’un type de chlorophylle tout en gardant la concentration de l’autre chlorophylle constante (voir Résultats, I-2). On a ainsi obtenu plusieurs séries de droites de pente a (respectivement b). Ce résultat confirme la linéarité du modèle proposé (DO = a CA+ b CB).

II Les mesures SPAD :

1 Un modèle polynomial difficilement explicable :

Une étude préliminaire de la littérature a montré que les types d’équation que l’on peut obtenir sont très variés. En particulier, on trouve des équations linéaires (Martinez et Guiamet, 2004), polynomiales (Manetas et al., 1998), et exponentielles (Markwell et Blevins, 1999). Le fait qu’en ce qui concerne notre étude le modèle polynomial soit celui qui convienne le mieux pour la majorité des espèces n’est donc pas en contradiction avec les travaux qui l’ont

19

précédée. Une recherche plus poussée a mis en évidence le manque de discussions approfondies au sujet de la relation entre la valeur mesurée au SPAD et le taux de chlorophylle correspondant. Dans la plupart des cas, les auteurs se contentent d’établir leurs courbes étalon en appliquant le modèle qui convient le mieux, sans donner de précisions sur les raisons de leur choix. Cependant, Markwell et al (1995) propose un modèle théorique, que nous avons présenté dans la partie Matériel et Méthode. Si nous admettons que la relation donnée dans l’équation (1) est juste, et en faisant l’hypothèse supplémentaire que la relation entre l’absorbance de la feuille et le taux de chlorophylle suit une loi de type Beer-Lambert, alors c’est le modèle exponentiel qui doit être utilisé pour décrire la relation entre la valeur SPAD et la concentration en chlorophylle. Cependant, nous pouvons émettre plusieurs réserves vis-à-vis de cette justification théorique du modèle exponentiel : tout d’abord, il est regrettable que Markwell et al ne fournissent pas la source de leur équation, celle-ci ne figurant pas sur le mode d’emploi du SPAD-502. De plus, l’étude menée par Vogelmann et al (1996) a montré l’extrême complexité du comportement des photons lumineux au sein de la feuille. Ces considérations nous ont incité à conserver le modèle polynomial, même si nous ne pouvons pas à l’heure actuelle l’expliquer du point de vue biologique.

La réalisation de l’ANCOVA (Résultats-III) a mis en évidence l’existence d’une relation quasi-linéaire entre la racine carrée du taux de chlorophylle et la mesure SPAD. Ceci confirme non seulement la validité du modèle polynomial, mais semble également indiquer que les coefficients de degré 1 et 0 de l’équation, bien que non nuls, sont négligeables devant le coefficient du second degré.

2 Incertitudes sur les mesures SPAD:

a Précision des mesures :

Selon l’utilisation qui veut être faite des taux de chlorophylle mesurés, le SPAD-502 constitue un outil plus ou moins performant. S’il s’agit d’effectuer des mesures qualitatives visant par exemple à comparer le taux de chlorophylle présent dans deux feuilles différentes, le SPAD est sans contexte l’instrument le mieux adapté, par son utilisation simple et rapide. Cependant, dans le cas où on souhaiterait effectuer des mesures quantitatives, le problème de la précision des mesures se pose. En effet, le protocole suivi pour l’établissement des courbes étalon comporte deux étapes, toutes deux sujettes à des approximations. En ce qui concerne les regroupements d’espèces, pour n’utiliser qu’une seule courbe étalon pour plusieurs arbres, il s’agit ici encore de déterminer le niveau « acceptable » d’erreur.

b Validité des mesures :

L’existence d’une corrélation forte entre les mesures effectuées au SPAD et le taux de chlorophylle est indéniable, et a été prouvé par plusieurs études (Richardson et al., 2002 ; Van den Berg et Perkins, 2004). Cependant, dans certains cas la précision des mesures peut être diminuée.

Tout d’abord, l’entreprise Minolta affirme que l’exactitude des mesures ne peut être garantie pour des valeurs supérieures à 50 unités SPAD (MinoltaCompany, 1989). Il a effectivement été montré (Richardson et al., 2002) que la corrélation entre la valeur SPAD et le taux de chlorophylle diminue lorsque la concentration en chlorophylle augmente. Ceci pourrait être dû au fait qu’au sein des feuilles contenant beaucoup de chlorophylle, les molécules du pigment sont réparties de façon moins homogène que dans les feuilles plus pauvres en chlorophylle. Cette distribution irrégulière des molécules de chlorophylle pourrait

20

expliquer la baisse de performance des mesures effectuées au SPAD (Monje et Bugbee, 1992). Or, on peut constater sur les courbes étalon (voir Annexe 2) que beaucoup de valeurs SPAD relevées sont supérieures à 50, et atteignent même des valeurs dépassant les 80 unités SPAD chez Carapa Procera et Pouteria Macrophylla. Nous nous sommes donc posés la question de la validité de telles mesures. En comparant les courbes étalon d’origine avec les mêmes courbes amputées de toutes les valeurs SPAD dépassant 50, nous n’avons pas constaté de différences significatives (courbes non montrées) : les équations obtenues étaient comparables. De plus, la plupart des études utilisant le SPAD ne considèrent pas comme non valides les valeurs dépassant 50 unités SPAD (Markwell et al., 1995 ; Murillo-Amador et al., 2004 ; Wang et al., 2004) Il semble donc inutile de rejeter ces valeurs .

Ensuite, chez certaines espèces, les très jeunes feuilles ne sont pas vert pale mais rouges, indiquant une forte concentration d’anthocyanes. Ces anthocyanes seront rendus minoritaires dans la feuille par l’augmentation du taux de chlorophylle au fur et à mesure du vieillissement de la feuille. Cependant, pour les feuilles juvéniles, la question se pose de savoir si on peut encore considérer que la valeur relevée au SPAD est représentative du taux de chlorophylle. On constate chez des espèces comme Tachigali Melinonii, dont les jeunes feuilles sont rouges, que la courbe étalon subit une inflexion à proximité de l’origine. Bien que l’étude menée par (Manetas et al., 1998) conclut la crédibilité des mesures effectuées sur des feuilles à forte concentration d’anthocyanes, il semble qu’il existe un biais, dont il est nécessaire de tenir compte lors des mesures.

3 Regroupements d’espèces :

En dehors du taux de chlorophylle, plusieurs facteurs sont susceptibles d’avoir une influence sur l’absorption de la lumière par la feuille. En premier lieu, il a été montré (Broge et Mortensen, 2002 ; Gitelson et al., 2003) que les caractéristiques foliaires ont une grande influence sur les propriétés optiques de la feuille, en particulier l’épaisseur, où les poils recouvrant la surface de la feuille. Cependant, la méthode de mesure du SPAD est censée tenir compte ce ces facteurs : c’est (entre autres), à cela que sert la mesure de la transmittance à 940 nm. C’est pourquoi nous n’avons pas tenté des regroupements selon des critères de structure. Un autre facteur est le taux de pigments foliaires non chlorophylliens : xanthophylle, carotène, anthocyanes. En effectuant la mesure de la transmittance à 650 nm, on considère qu’à cette longueur d’onde seules les chlorophylles a et b vont absorber la lumière émise par l’appareil, mais on peut penser que les autres pigments vont tout de même contribuer à l’absorption et donc perturber la mesure. Cependant, les données concernant les taux de pigments non chlorophylliens n’étant pas disponibles pour les espèces considérées, nous n’avons pas pu tenter des regroupements selon ce critère.

Nous avons donc choisi comme critère l’appartenance aux groupes définis par Favrichon. Les courbes obtenues possèdent toutes de très bons coefficients R², tous supérieurs à 0,85, en particulier le groupe des tolérants (R²=0,93). Cependant, on constate l’existence de « déviants » dans le groupe des hémi-tolérants et des héliophiles. Dans le premier groupe, Pouteria Macrophylla se situe clairement au-dessus de la courbe étalon, et Eperua Falcata au-dessous. Les hémi-tolérants constituent donc un groupe hétérogène, du point de vue des courbes étalon. Ceci n’est pas surprenant puisque sont désignées « hémi-tolérantes », les espèces ne présentant pas les caractéristiques des deux autres groupes. En ce qui concerne la courbe des espèces héliophiles, celle-ci est plus homogène, sauf pour Inga Thibaudiana, qui se détache du reste des espèces. La raison de cette irrégularité n’a a l’heure actuelle pas pu être déterminée.

21

En étudiant la courbe étalon où toutes les espèces sont rassemblées, on constate là aussi un très bon R² (0,86). Cependant, même si les résidus suivent une loi normale, leur écart-type est beaucoup plus important que pour les courbes étalon séparées par espèce. La question est donc de savoir quelle marge d’erreur est acceptable dans les études menées à l’aide de ces courbes étalon : plus les regroupements sont importants et moins la précision est grande. Cependant, il faut aussi prendre en compte le temps gagné par le fait que la courbe étalon est déjà disponible et non à refaire pour chaque nouvelle espèce rencontrée, comme cela était le cas jusqu’à présent. Ces courbes conviennent parfaitement à une étude qualitative du taux de chlorophylle. Dans le cas d’une étude qualitative, cette méthode reste valide, malgré une perte de précision.

4 Variabilité interspécifique des traits foliaires :

On constate une grande différence de comportement entre les différentes espèces étudiées, en ce qui concerne les allocations d’azote consacrées au processus photosynthétique. Ainsi, la part Ptot consacrée à la photosynthèse dans son ensemble varie de façon significative selon les espèces. Mais cette variabilité s’exprime également dans la manière dont les plantes répartissent cet azote entre les trois étapes principales du processus. On constate que les fractions Pc, Pb et Pl ne restent pas constantes parmi les 8 espèces pour lesquelles on a pu effectuer le calcul de ces fractions. Même si l’ordre d’importance d’allocation reste toujours le même (Pc > Pl > Pb), l’importance relative des fractions varie de façon significative. Or, cette étude a également confirmé les résultats de travaux antérieurs (Coste et al., 2005) concernant les relations entre les traits foliaires, la composition chimique et la capacité photosynthétique. La forte corrélation entre Pc et Pb d’une part, Vcmax et Jmax d’autre part, ainsi que la corrélation négative entre Pc et la densité (par exemple), permet de suggérer l’existence de différentes stratégies au sein des différentes espèces, non seulement dans la compromis entre la photosynthèse et les autres fonctions nécessitant l’apport d’azote, mais également en ce qui concerne les trois étapes de la photosynthèse.

5 Perspectives :

Au moment où prend fin cette étude, il manque encore de nombreuses données pour pouvoir exploiter pleinement les possibilités offertes par les courbes étalon et le calcul de Pl. En particulier, les données concernant le taux d’azote présent dans les feuilles n’est pour l’instant connu que pour 8 des 14 espèces étudiées. Une fois ces valeurs obtenues, on pourra calculer la fraction d’azote allouée à la photosynthèse pour un plus grand nombre d’espèces, et rendra les comparaisons entre les espèces plus pertinentes. De plus, une évaluation de la durée de vie des feuilles est actuellement effectuée. Cette information, une fois obtenue et combinée avec les données concernant entre autres Pc, Pb et Pl, permettra une meilleure analyse du compromis effectué par la plante entre capacité photosynthétique et survie

22

Conclusion

L’établissement de courbes étalon pour 14 espèces de forêt tropicale humide permet désormais de déterminer rapidement la concentration en chlorophylle d’une feuille d’une de ces espèces, et ce sans détruire l’échantillon. De plus, cette étude a confirmé la variabilité interspécifique de la corrélation entre la valeur mesurée au SPAD et la concentration en chlorophylle de la feuille, puisqu’une valeur SPAD donnée correspond à différents taux de chlorophylle selon les espèces. Cependant, il a été montré que des regroupements sont possibles, malgré une perte de précision dans les mesures. Malgré les incertitudes pesant sur mesures effectuées au SPAD, et le fait que la forte corrélation entre valeur SPAD et taux de chlorophylle, bien que prouvée empiriquement, reste à ce jour difficilement explicable, cette méthode rapide et non destructive est un outil très efficace pour les études qualitatives, et quantitatives à un degré moindre. Pour l’instant, les applications de ces courbes étalons sont limitées par le fait que les données concernant les caractéristiques foliaires et chimiques des spécimens étudiés sont incomplètes. Cependant, il est déjà possible d’observer les variabilités interspécifiques des allocations d’azote, à la photosynthèse dans son ensemble et au sein même du processus, avec la répartition de l’azote entre les trois étapes clé. Cette variabilité suggère une différence de stratégies suivant les espèces, hypothèse qui pourra être confirmée ou modifiée une fois que toutes les données nécessaires auront été obtenues.

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25

Annexe 1 : variabilité inter et intraspécifique des temps d’extraction de la chlorophylle

Espèce Temps d'incubation minimum (heures)

Temps d'incubation maximum (heures)

Temps d'incubation moyen (heures)

Co 4h30 4h30 4h30

Bg 3h30 3h30 3h30

Tm 4h30 4h30 4h30

Po 7h 15h30 11h15

Hc 9h 9h 9h

Ef 5h30 20h 15h10

It 3h30 4h10 3h56

Pm 5h 7h30 6h20

Pc 3h45 6h 5h15

Sg 2h 12h30 6h30

Va 2h 19h 14h15

Sr 5h30 13h 8h48

Ag 3h30 9h 5h45

Cp 5h 7h30 6h10

26

Annexe 2 : courbes étalon

Bg

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0

[Chl

](µm

ol/m

²)

0500

10001500200025003000

[Chl

](µm

ol/m

²)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0

[Chl

](µm

ol/m

²)

Courbes étalon donnant la correspondance entre la mesure SPAD et la concentration totale en chlorophylle (en µmol/m²). les coefficients utilisés pour calculer la concentration en chlorophylle à partir de la DO sont les coefficients calculés au sein de l’UMR (en rouge), et ceux calculés par Barnes (1992, en bleu) et Wellburn (1994, en rose)

Ag

y = 0,0813x2 + 7,6724x + 6,4391R2 = 0,9742

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 1SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

00

BarnesWellburncoeffs calculés

y = 0,1573x2 + 5,5383x + 69,493R2 = 0,9737

20 40 60 80 10SPAD

0

BarnesWellburncoeffs calculés

Cp

y = 0,0845x2 + 7,4511x + 16,395R2 = 0,9744

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 1

SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

00

BarnesWellburncoeffs calculés

Co

y = 0,4152x2 - 8,0587x + 125,9R2 = 0,9375

0 20 40 60 80 100SPAD

BarnesWellburncoeffs calculés

27

Hc

y = 0,0393x2 + 12,141x - 24,242R2 = 0,8254

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 100SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²) BarnesWellburncoeffs calculés

Ef

y = 0,1064x2 + 0,0323x + 171,84R2 = 0,7659

20 40 60 80 100

SPAD

BarnesWellburncoeffs calculés

It

y = 0,1099x2 + 9,5003x + 170,46R2 = 0,926

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 100

Pc

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 100SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

coeffs calculésBarnesWellburn

SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²) BarnesWellburncoeffs calculés

28

Tm

y = 0,2652x2 - 3,3247x + 289,44R2 = 0,9356

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 100

SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

BarnesWellburncoeffs calculés

Po

y = 0,1666x2 + 7,3279x + 47,765R2 = 0,9408

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80

SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

100

BarnesWellburncoeffs calculés

Pm

y = 0,4806x2 - 26,522x + 900,05R2 = 0,925

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 10

SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

0

BarnesWellburncoeffs calculés

Sg

y = 0,0857x2 + 6,8659x + 51,063R2 = 0,9762

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80

SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

100

BarnesWellburncoeffs calculés

Va

y = 0,4075x2 - 12,471x + 267,1R2 = 0,8986

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 100

SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

BarnesWellburncoeffs calculés

Sr

y = 0,0738x2 + 10,554x - 17,556R2 = 0,9916

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 20 40 60 80 1

SPAD

[Chl

](µm

ol/m

²)

00

BarnesWellburncoeffs calculés

Annexe 3: variations du taux de chlorophylle en fonction de l'éclairement

A B

Niveau d'éclairement: 5% (P<0,001)

Bg Co Cp Ef Hc It Pm Po Sg Sr Tm VaEspèces

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Chl

(µm

ol.m

-2)

Niveau d'éclairement: 15% (P<0,001)

Bg Co Cp Ef Hc It Pm Po Sg Sr Tm VaEspèces

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

Chl

(µm

ol.m

-2)

C D

Niveau d'éclairement: 30% (P<0,001)

Bg Co Cp Ef Hc It Pm Po Sg Sr Tm VaEspèces

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Chl

(µm

ol.m

-2)

Espèce PAg 0,002Bg 0,0044Co 0,0038Cp 0,00009Ef 0,4769Sg 0,4019Va 0,0099

Annexe 3 : boites à moustache du taux de chlorophylle foliaire à 5%(A), 15%(B) et 30%(C) du rayonnement incident. Une valeur de P<0,005 indique une différence significative entre les espèces. Sur chacun de ces graphiques sont représentés la médiane et les quantiles 25-75% et 10-90%. Le tableau (D) donne les valeurs de P obtenues en comparant au sein de chaque espèce les taux de chlorophylle pour les différents niveaux d’éclairement.

29