静岡大学 理学部 生物科学科 特任助教 伏見圭司

2019 年 11 月 07 日

哺乳類個体における in vivo イメージングが可能な近赤外蛍光プローブの開発

光変換

青色光 / 緑色光変換型 赤色光 / 緑色光変換型

遠赤色光 / 橙色光変換型 赤色光 / 青色光変換型

特定の光質（波長）や光量（強度）を吸収することで光受容体（色素タンパク質）の構造を可逆的に変化

シアノバクテリアのみがもつ光受容体 シアノバクテリオクロム

シアノバクテリオクロムに結合する色素

色素の種類（共役系の長さ）による吸収する光の多様性

色素の Z / E 異性化反応 タンパク質全体の立体構造が変化

HNO

E Z

NH

O

NH

OO

+HN

-O

O

HN

O1

3 15

16 19

31

32 A

B

C

D

10

ビリン色素

シアノバクテリオクロムの多様性 様々な波長領域の光を感知するシアノバクテリオクロムを発見・改変

Kuwasaki, Y. et al., Int. J. Mol. Sci., 20(12), 2935, 2019. . Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019. Fushimi, K. and Narikawa, R., Curr. Opin. Struct. Biol., 57, 39–46, 2019. Hasegawa, M. et al., J. Biol. Chem., 293(5), 1713–1727, 2018. Fushimi, K. et al., Photochem. Photobiol., 93(3), 903–906, 2017.

Fushimi, K. et al., Photochem. Photobiol., 93(3), 681–691, 2017. Fushimi, K. et al., Biochemistry, 55(50), 6981–6995, 2016. Fushimi, K. et al., Front. Microbiol., 7, 588, 2016. Narikawa, R. et al., Sci. Rep., 5, 7950, 2015. Narikawa, R. et al., Biochemistry, 53(31), 5051–5059, 2014.

光の波長と色

赤外光 紫外光 可視光

紫 藍 青 緑 黃 橙 赤 短波長側 長波長側

短波長 長波長

光の波長と色

660 nm 670 nm 680 nm 690 nm 700 nm

610 nm 620 nm 630 nm 640 nm 650 nm

560 nm 570 nm 580 nm 590 nm 600 nm

510 nm 520 nm 530 nm 540 nm 550 nm

460 nm 470 nm 480 nm 490 nm 500 nm

410 nm 420 nm 430 nm 440 nm 450 nm 400 nm

長波長光

短波長光

光受容体を利用した生体分子の検出・制御

光受容体 ＋ 生体分子

光照射によって生体分子の動態・活性をの任意の場所、時間で検出・制御

遺伝子工学的手法でキメラタンパク質を創出し、特定の細胞内で発現

OFF ON

利用される光の波長 長波長光

哺乳類に対して非侵襲、高浸透

In vivo における検出・制御

多波長光 複数個の生体分子を同時に照射

In vitro における検出・制御

フィコシアノビリン （哺乳類非内在性色素）

ビリベルジン （哺乳類内在性色素）

天然に存在するビリン色素の中で、最も長波長の光を吸収

哺乳類内在性色素・ビリベルジン

哺乳類内在性色素非結合型 / 結合型の比較

Fushimi, K. et al., Front. Microbiol., 7, 588, 2016. Narikawa, R. et al., Sci. Rep., 5, 7950, 2015.

800

吸光

度

赤色光吸収型 緑色光吸収型

波長（nm）

700 600 500 400 300

フィコシアノビリンを結合

AnPixJg2

波長（nm）

吸光

度

遠赤色光吸収型

橙色光吸収型

NH

O

NH

OO

+HN

-O

O

HN

O

800 700 600 500 400 300

ビリベルジンを結合

AM1_C0023g2

哺乳類内在性色素結合型への改変

哺乳類内在性色素結合型に保存されている重要な４つのアミノ酸残基を特定

AnPixJg2 DTHLQETQGG RYRHQESFVV NDIYEAGHFS CHLEILEQFE IKAYIIVPVF AM1_1557g2 DTYLQENQGG KYRDNATTVV ADIYQESYRD CHLEILEWYK IRAYMVVPVF AM1_C0023g2 DTYLQENQGG KFKDNAPTVV ADIYQQSYTD CHLEILEWFD IRAYMVVPVF AM1_6305g2 DTYLQETQGG HYRHQATTVV ADIYEQGYTD CHLAMLERFH IRAFMVVPVF

293 308 318 336

Phe308

Ile336

His293

His318

フィコシアノビリン

AnPixJg2 の結晶構造

Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019.

哺乳類内在性色素結合型への改変

Phe308

Ile336

His293

His318

フィコシアノビリン

Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019.

800

吸光

度

赤色光吸収型 緑色光吸収型

波長（nm）

700 600 500 400 300

フィコシアノビリンを結合

AnPixJg2 Tyr

Thr

Val

Tyr ビリベルジン

４箇所のアミノ酸残基を置換することで、哺乳類非内在性色素結合型から哺乳類内在性色素結合型に改変 波長（nm）

吸光

度

遠赤色光吸収型

橙色光吸収型

NH

O

NH

OO

+HN

-O

O

HN

O

800 700 600 500 400 300

ビリベルジンを結合

AnPixJg2_BV4

AnPixJg2_BV4 を結晶化し、構造解析に成功

水素結合（2.6 – 3.3 Å） 分解能：1.6 Å

Cys321

哺乳類内在性色素結合型の分子構造

Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019.

フィコシアノビリン ビリベルジン

AnPixJg2 AnPixJg2_BV4

哺乳類内在性色素結合型の作用機構

Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019.

31

Cys321

AnPixJg2

32

Cys321

AnPixJg2_BV4

フィコシアノビリン

Cys321

ビリベルジン

Cys321

哺乳類内在性色素結合型の作用機構

Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019.

32

Cys321

31

Cys321

AnPixJg2 AnPixJg2_BV4

Cys321

シフト

色素結合部位

哺乳類内在性色素結合型の作用機構

Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019.

Phe308

31

Ile336 Ile336

Phe308

32

32

Cys321

31

Cys321

AnPixJg2 AnPixJg2_BV4

Cys321

シフト

色素結合部位 変異導入

Phe308

31

Ile336

Thr308

32

Val336

哺乳類内在性色素結合型の作用機構

Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019.

AnPixJg2 AnPixJg2_BV4

フィコシアノビリン ビリベルジン

Phe308

31

Ile336

Thr308

32

Val336

哺乳類内在性色素結合型の作用機構

Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019.

機能改変の汎用性と応用

Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019.

波長（nm）

吸光

度

800 700 600 500 400 300

AnPixJg2 _BV4

AnPixJg4 _BV4

AnPixJg2 のホモログ分子に対して同様の変異導入を施すことで、哺乳類内在性色素結合能を付加

波長（nm）

吸光

度

800 700 600 500 400 300

AM1_1870g3 _BV4

NpF2164g5 _BV4

遠赤色光吸収型

橙色光吸収型

Fushimi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 116(17), 8301–8309, 2019.

生きた哺乳類の細胞、組織、個体のどの系からも、近赤外光の蛍光を観測することに成功

機能改変の汎用性と応用 個体

組織 細胞

従来の技術との比較 – 問題点、改善点、課題 – フィトクロム シアノバクテリオクロム

分子の大きさ

吸収波長領域

応用例

大きい

赤色光 〜 近赤外光

多い

小さい

紫外光 〜 近赤外光

少ない

PHY

GAF

PAS

従来の技術との比較 – 問題点、改善点、課題 – シアノバクテリオクロム

分子の大きさ

吸収波長領域

応用例

小さい

紫外光 〜 近赤外光

少ない

細胞内の生体分子や細胞内小器官に対して、相互に干渉を受けにくい

歴史が浅く、光反応機構や分子間相互作用に関して不明な点が多い

実験の用途（in vivo、in vitro）に合わせて、波長を自由に選択できる 哺乳類内在性色素結合型シアノバクテリオクロムの作用機構を解明したことで、他の分子にも本技術を汎用できる可能性がある

今後の研究課題 近赤外蛍光の強度の改善

光依存的な分子の構造変化、相互作用の解明

企業の方々へのメッセージ

赤外蛍光分子の蛍光強度について ランダム変異導入法による改良を施行中 光依存的な分子の構造変化、相互作用について 各種スペクトル解析による分子の動態を観察中 様々な波長領域の光を利用できる分子について 部位特異的変異導入法による分子機構を解析中

本研究グループの取り組みについて

基礎

応用

光 を操ることで 生命現象 を解き明かす 研究 に興味をもって下さる企業の方々は、ご連絡下さい。

本技術に関する知的財産権 発明の名称 ビリベルジン結合性シアノバクテリオクロム 出願番号 特願2019–035694 出願人 国立大学法人 静岡大学 発明者 成川 礼、伏見 圭司、佐藤 守俊

お問い合わせ先 静岡大学イノベーション社会連携推進機構 コーディネーター 安池 雅之 TEL ：054–238–4630 FAX ：054–238–3018 E-mail ：sangakucd@cjr.shizuoka.ac.jp