molecular and cellular Biology Newsletter연/구/실/탐/방

01 ● ● 분 자 세 포 생 물 학 뉴 스 레 터

세포막 단백질 구조 및 기능 연구실(membrane structural and functional biology lab)

진 미 선

광주과학기술원 생명과학과

E-mail: misunjin@gist.ac.kr

연구실 개요

인간 전체 유전자의 30% 이상을 차지하고 있는 세포막

단백질(membrane protein)은 세포막 내외로의 물질 수송

(transporter) 및 전위 차 유지(ion channel)에 중요한 역

할을 수행할 뿐만 아니라 세포와 외부 환경의 상호 작용

을 매개하는 신호 전달 수용체(receptor)로서 기본적인 생

명 현상에 광범위하게 관여하고 있다. 또한 세포막 단백질

의 기능 이상은 곧바로 생명을 위협할 수 있는 심각한 질

병으로 이어지기 때문에 현재 상용 중이거나 개발되고 있

는 화합물 신약의 50-60%는 세포막 단백질을 타겟으로

하고 있다. 세포막 단백질의 30%를 차지하는 수송단백질

(transporter)들은 박테리아에서부터 포유동물에 이르기까

지 거의 모든 생명체에 존재하는 세포막 단백질로서, 세포

막을 통하여 여러 가지 다양한 분자들의 이동을 촉진하는

역할을 수행한다. 예를 들어, 수송단백질을 통해 당이나 비

타민을 에너지원으로 흡수하거나 세포 내 독성 물질을 세

포 밖으로 배출시키는 것은 세포가 정상적인 기능을 수행

하는데 반드시 필요한 과정이라 할 수 있다. 세포막은 소수

성 지질로 이루어져있기 때문에, 대부분의 친수성 분자들은

세포막에 존재하는 각종 수송단백질에 의하여 이동하게 되

며, 최근에는 수송단백질들이 각종 질병과 직접적인 관련

이 있다는 연구 결과가 수차례 발표되면서 신약개발 프로그

램의 가장 주요한 표적이 되고 있다. 예를 들어 P-당단백

질(P-glycoprotein)이 과량 발현되면 항암제들에 대한 내

성이 유도될 수 있으며, CFTR(cystic fibrosis transproter

regulator)의 기능이 저해되면 낭성섬유증이 발생하게 된

다. 수송단백질의 기능 및 활성조절연구는 학문적으로 중

요할 뿐만 아니라 신약 개발과도 밀접한 관련이 있기 때문

에 전 세계적으로 많은 연구가 진행되고 있는 중이다. 본 실

험실에서는 X-선 결정학(X-ray crystallography)을 이용

해 생명 현상에 중요한 세포막 단백질의 3차원 구조를 규명

할 뿐만 아니라, 다양한 생화학/생물리학적 접근 방법을 통

하여 구조-기능의 상관관계를 이해하는 연구를 수행하고

있다. 특히 중추신경계에서 대표적 흥분성 신경전달물질인

글루타메이트의 수송단백질 VGLUT(vesicular glutamate

transporter)의 고해상도 구조를 밝혀 시냅스에서의 흥분성

신호전달의 작용 기작을 규명하는 연구를 진행하고 있으며,

이를 바탕으로 뇌신경질환을 치료할 수 있는 신약후보물질

및 새로운 바이오 의약품 개발의 기반을 마련하고자 한다.

연구 내용

인간의 뇌에서 흥분성 신호전달의 70% 이상을 담당하는

글루타메이트(glutamate)는 학습, 기억, 운동능력 및 감정

을 조절하는 중요 아미노산이다. 시냅스에서 글루타메이트

의 양이 과하게 많아지면 흥분 독성(Excitotoxicity)에 의해

뉴런이 지나치게 활성화되어 결국 괴사하게 되는데, 이는

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알츠하이머, 정신분열증, 간질 및 과잉운동장애 등을 유발한

다. 따라서 시냅스에서 글루타메이트에 의한 흥분성 신호 전

달은 여러 글루타메이트 수송체 및 수용체에 의해 4단계로

엄격하게 조절되고 있다(그림1).

휴지 상태에서 글루타메이트는 신경독성을 피하기 위

해 시냅스 소포에 저장되어 있다. 하지만 전기적 신호에 의

해 뉴런이 흥분상태가 되면 VGLUT은 V형 ATP 분해효

소(V-type ATPase)에 의해 발생되는 전기화학적 기울기

단계 과정 조절 내용

1저장

(storage)글루타메이트는 VGLUT (vesicular glutamate transporter)에 의해 전시냅스 세포(presynaptic cell)에 있는 소포(vesicle)로 흡수되어 저장된다. 신경정보가 전기적 신호로 전파되어 오면 소포가 축색 말단의 세포막과 융합하여 글루타메이트를 시냅스 틈새(synaptic cleft)로 분비한다.

2신호전달

(signaling)

글루타메이트 수용체는 신호전달과정에 따라 이온성 수용체(ionotropic glutamate receptor)와 대사성 수용체 (metabotropic glutamate receptor)로 나뉜다. 글루타메이트가 이온성 수용체(NMDA, AMPA, Kainate)에 결합하면 이온 통로가 열리면서 외부에 있던 양이온(Na+, Ca2+)이 세포 안으로 들어와 세포가 일시적으로 양전하를 갖게 되어 극히 짧은 시간에 흥분성 반응이 일어난다. 반면에 GPCR에 속하는 대사성 수용체는 G-단백질과 결합하여 이차 신호전달물질을 조절함으로써 이온성 수용체를 억제하거나 활성화시켜 뉴런의 흥분성을 조절한다.

3흡수

(clearance)후시냅스 세포(postsynaptic cell)에 있는 EAAT (excitatory amino acid transporter)는 시냅스 틈새로 분비된 글루타메이트를 빠르게 흡수하여 수용체가 지나치게 활성화되는 것을 예방하고 신경세포조직이 파괴되는 것을 방지한다.

4재사용

(recycle)흥분성 신호전달이 끝난 후 뉴런에 흡수된 글루타메이트는 cysteine/glutamate antiporter (System Xc-)에 의해 다시 뉴런 밖으로 배출되어 다음 신호전달 때 재사용된다.

그림 1. 시냅스에서 글루타메이트에 의한 흥분성 신호전달 과정

VGLUT에 의해 시냅스 소포에 저장 되어 있던 글루타메이트는 SNARE 단백질과의 상호 작용을 통해 시냅스 틈새로 분비된다(①). 분비된 글루타메이트는 이온성 또는 대사성 수용체 (mGluR) 와 결합하여 흥분성 반응을 일으킨다(②). EAAT는 과량의 글루타메이트에 의한 신경독성을 피하기 위해 시냅스에 있는 글루타메이트를 빠르게 흡수하며(③), System Xc-는 다른 신경조직에서 글루타메이트를 다시 사용할 수 있도록 시스틴(Cys)과 교환하여 외부로 방출한다(④). Figure is modified from ref 5.

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(proton electrochemical gradients)를 에너지원으로 사용

하여 시냅스 사이로 글루타메이트를 분비한다. 세포막 도메

인이 8-12개의 α-helix로 이루어져 있을 것으로 예상되는

VGLUT은 분자량이 ~60kDa 이며 글루타메이트에 대한 친

화성은 높지 않지만(Km 1-3 mM), 구조가 비슷한 아미노

산인 아스파테이트(aspartate)를 충분히 구분할 만큼 글루

타메이트에 대한 결합 특이성(specificity)은 매우 높은 것

으로 알려져 있다. VGLUT의 또다른 분자생화학적인 특성

은 음전하 이온인 염소(Cl-) 농도에 이상 의존성(biphasic

dependence)를 보인다는 것이다. 즉, 신경세포 내 염소 이

온의 농도가 높으면 VGLUT의 글루타메이트 수송 능력이

증가하지만, 염소 이온이 일정 농도 이상 증가하게 되면 글

루타메이트 수송 능력은 오히려 감소하게 된다. 이는 소포

내에서 글루타메이트의 과량 축적을 방지하기 위한 기작으

로 이해되고 있지만 VGLUT의 구조가 밝혀지지 않았기 때

문에 정확한 작용 메카니즘은 여전히 풀어야 할 숙제로 남아

있다.

뉴런 세포에서 글루타메이트의 저장과 농도 조절에 핵심

적인 역할을 하는 VGLUT은 가장 중요한 신약개발 표적 중

하나이다. 평상시 시냅스 간극에서의 Glutamate 농도는

1-3 μM이지만 소포 내에 저장되어 있던 글루타메이트가 방

출되면 농도는 수백~수천 μM 이상으로 올라간다. 따라서

VGLUT에 이상이 발생하면 소포에 저장되어 있던 글루타메

이트가 비정상적으로 과량 분비되어 주변 뉴런들이 비정상

적으로 흥분 상태가 되는데, 이는 각종 뇌신경질환을 일으키

는 직접적인 원인이 되고 있다. 미국의 한 연구팀에 의하면

글루타메이트는 뉴런의 생화학/구조적 변화에도 관여하는

데, VGLUT의 기능 이상으로 시냅스에서 글루타메이트 농

도가 지나치게 높아지면 수상돌기의 가시(spine) 수가 감소

하거나 형태에 변화가 생겨 ‘기억’ 형성에 장애가 발생해 알

츠하이머 질병을 유발한다고 알려져 있다. 또한 글루타메이

트가 과량 분비되면 뉴런의 발화 역치가 비정상적으로 낮아

지게 되는데 이는 직접적으로 간질(epilepsy)을 유발하는 원

인이 되기도 한다. 글루타메이트는 흥분성 신경전달물질로

서의 역할 뿐만 아니라 신경세포의 발달 및 성장 과정에서도

중요한 역할을 하기 때문에 VGLUT의 구조 및 기능 연구는

학문적으로 중요할 뿐만 아니라 신약 개발과도 밀접한 관련

이 있어 전 세계적으로 많은 연구팀들의 관심이 집중되어 있

는 첨단 연구분야이다. 본 연구실에서는 고등생명체에서 유

래하는 글루타메이트 수송체(VGLUT)의 고해상도 구조를

X-선 결정학 방법으로 규명하여 생화학적인 기능 연구와

함께 인간의 뇌에서 흥분성 신호 전달의 작용 메카니즘을 분

자 수준에서 밝히는 연구를 수행하고 있는 중이다.

연구 방법

세포막 단백질의 구조 및 기능 사이의 상관관계를 규명하

기 위해서는 일반적으로 3단계의 연구 추진 과정을 거치게

된다.

(1) GFP융합 방법을 이용한 유전자 스크리닝 및 단백질 정제 조건 확립

세포막 단백질 구조연구에서 가장 중요한 핵심기술은 다

양한 유전자 라이브러리를 확보하고, 단백질을 과량 발현

할 수 있는 유전자를 빠른 시간 안에 스크리닝 하는 것이다.

이를 위해 인간뿐만 아니라 인간의 단백질과 아미노산 서

열이 유사한 고등생명체, 혹은 박테리아 유전자를 확보하

여 GFP(Green Fluorescence Protein)가 삽입되어 있는 벡

터에 클로닝하면 형광의 관찰 유무에 따라 별도의 정제 과

정 없이도 단백질의 발현 여부를 쉽게 확인할 수 있다. 이

러한 GFP-융합방법을 이용하면 타겟 단백질을 세포막으

로부터 추출하는데 효과적인 detergent 스크리닝 역시 용

이하다. 형광을 감지할 수 있는 HPLC 장비를 이용하면 소

량의 단백질로도 detergent에 따른 단백질의 구조적 변화

및 안정성을 쉽게 모니터링 할 수 있다(그림2). 단백질 정제

에 적합한 detergent 선택이 끝나면 친화 크로마토그래피

(affinity chromatography), 겔 여과 크로마토그라피(gel-

extrusion chromatography)를 통해 세포막 단백질을 순수

분리하게 된다.

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(2) 결정화를 통한 구조 분석

고해상도 구조를 얻기 위해서는 정제된 단백질을 고농도

로 농축한 후 X-선의 강한 에너지를 견딜 수 있는 질 좋은

단백질 결정을 만들어야 한다(그림3). X-선은 입자이면서

파동이기 때문에 결정 안에서 규칙적으로 배열된 수많은 단

백질들이 만드는 각각의 회절 파동이 정확하게 중첩되면 비

로소 구조 분석을 할 수 있는 강한 회절 신호를 수집할 수

있다. 이를 위해 전통적인 vapor diffusion 방식을 통한 결

정화 방법 외에도 생체막과 유사한 환경을 제공하여 세포막

단백질의 안정성을 증가시킬 수 있는 새로운 결정화 방법인

Bicelle과 Lipidic Cubic Phase 방법도 많이 이용되고 있다

(그림4).

(3) 분자생화학적인 접근을 통한 기능 연구

타겟 세포막 단백질의 작용 메커니즘을 정확하게 이해하

기 위해서는 구조-기능의 상관 관계에 대한 연구가 병행되

어야 한다. 이러한 기능 연구는 타겟 단백질의 생화학적인

그림 3. 다양한 단백질 결정

그림 2. GFP 형광을 이용한 유전자 스크리닝

타겟 유전자의 아미노산 혹은 카복시 말단에 GFP 유전자와 His tag을 삽입하여 단백질의 발현과 정제 과정을 수행한다. 유전자와 tag 사이에는 thrombin이나 TEV와 같은 protease를 인식할 수 있는 펩타이드를 삽입하여 tag 제거가 용이하게 이루어 질 수 있도록 한다. 세포막 단백질을 소량 발현시킨 후 원심 분리하여 세포만 분리 수집한

다. Glass bead와 vortex를 이용하여 세포들을 파괴한 후 detergent를 이용하여 세포막 단백질을 추출해 낸다. 고속원심분리 후 GFP 형광을 감지할 수 있는 HPLC이용

하여 타겟 단백질의 발현여부를 스크리닝한다. Figure is modified from ref 6.

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특성을 분자수준에서 규명하는데 필수적이다. 세포막 단백

질들이 세포막으로부터 분리되면 고유의 기능을 잃어버리

는 경우가 많은데 이러한 in vivo 혹은 in vitro 상에서의 기

능 확인 실험은 구조 연구에 쓰이는 타겟 단백질이 활성을

유지하는지 검증하는 중요한 과정이기도 하다. 수송단백질

의 경우 생체막과 유사한 성분과 구조를 갖고 있는 리포좀

(liposome)에 타겟 단백질을 삽입하여 기능 연구에 광범위

하게 이용되고 있다(그림 5). 지질 이중막으로 구성된 리포

좀의 내부 공간에는 이온이나 리간드들이 축적될 수 있기 때

문에, 이를 이용하면 타겟 단백질을 통해 세포막 내외로 물

질 이동이 어떻게 일어나는지에 대한 정보를 얻을 수 있다.

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P-glycoprotein from Caenorhabditis elegans (2012)

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2. Kang JY, Nan X, Jin MS, Youn SJ, Ryu YH, Mah

S, Han SH, Lee H, Paik SG, Lee JO. Recognition of

그림 4. Bicelle, LCP를 이용한 세포막 단백질 결정화 방법

세포막과 유사한 환경을 제공하여 막단백질의 결정화 가능성을 향상시키는 새로운 결정화 방법. ① DMPC lipid와 CHAPSO detergent를 섞어 bicelle disc를 만든 후 정제된 단백질을 혼합하여 이를 결정화에 이용한다. ② monoolein과 정제된 단백질을 주사기를 이용하여 섞으면 3차원으로 만들어지는 lipid channel에 단백질이 삽입되

어 세포막 단백질의 안정성이 증가된다. Figure is modified from ref 7 and 8.

그림 5. 리포좀 생성 방법

sonication으로 unilamella 구조를 갖는 리포좀을 만든 후 detergent를 이용

하여 정제된 단백질이 리포좀 사이로 삽입이 잘 되도록 한다. 리포좀 막을 느슨하도록 만드는데 사용한 과량의 detergent는 bio-bead로 제거해 단단한 구조를 갖는 proteoliposome를 만든다. 이를 이용하면 VGLUT의 글루타메이트 수송 능력과 활성에 필요한 염소 이온의 의존성 및 이온의 이동 등을 테스트할 수 있다.

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진 미 선

저 | 자 | 약 | 력

2000 서강대학교 화학/화학공학과 학사

2004 카이스트 화학과 석사

2008 카이스트 화학과 박사

2008-2009 카이스트 화학과 포스닥 과정

2009-2013 퍼듀대학교 포스닥 과정

2013-2014 퍼듀대학교 Research Specialist 과정

2014-현재 광주과학기술원 생명과학과 조교수

연 | 구 | 진 | 구 | 성

• 담당교수 진미선 (가운데)

• 석·박 통합 과정 김송원 (오른쪽)

• 석사과정 김수빈 (왼쪽)