Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für ... · 4.7 Komplementation von PA1587 in der...
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Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene
der Medizinischen Hochschule Hannover
____________________________________________________________
Molekulare Charakterisierung von langsam wachsenden Subpopulationen
(small colony variants) von Pseudomonas aeruginosa isoliert aus dem
Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Verena Wild
aus Soltau
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung an der Tierärztlichen Hochschule:
Univ.-Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand
Wissenschaftliche Betreuung an der Medizinischen Hochschule:
Univ.-Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand
2. Gutachterin: Prof. Dr. Beatrice Grummer
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2004
I INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V
1 EINLEITUNG 1
2 SCHRIFTTUM 3
2.1 Pseudomonas aeruginosa: Taxonomie und allgemeine Eigenschaften 3
2.2 Extrazelluläre Virulenzfaktoren von Pseudomonas aeruginosa 4
2.3 Pseudomonas aeruginosa als Erreger nosokomialer Infektionen 6
2.4 Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa beim Tier 7
2.5 Pseudomonas aeruginosa und Cystische Fibrose 8
2.6 Pseudomonas aeruginosa und seine Fähigkeit zur Biofilmbildung 11
2.7 Phänotypische Varianten von Pseudomonas aeruginosa
bei Cystischer Fibrose 14
2.8 Zielsetzung der Arbeit 19
3 MATERIALIEN UND METHODEN 20
3.1 Materialien 20
3.1.1 Bakterienstämme 20
3.1.2 Medien für die Bakterienanzucht 21
3.1.3 Puffer und Lösungen 21
3.1.4 Molekularbiologische Fertigprodukte 22
3.1.5 Enzyme und Molekulargewichtsstandards 22
3.1.6 Oligonukleotide 23
3.1.7 Vektoren 24
3.2 Methoden 24
3.2.1 Anzucht von Bakterien 24
3.2.2 Einfrieren und Entsorgen von Bakterien 24
3.2.3 Isolierung genomischer DNA aus Pseudomonas aeruginosa 24
II INHALTSVERZEICHNIS
3.2.4 Isolierung von Gesamt-RNA 25
3.2.5 Plasmidpräparationen 25
3.2.6 Elektrophoretische Auftrennung von DNA 26
3.2.7 Elektrophoretische Auftrennung von RNA 26
3.2.8 Reinigung von Nukleinsäuren 27
3.2.9 Restriktionsspaltung von Nukleinsäuren 27
3.2.10 Ligation von Nukleinsäuren 27
3.2.11 Herstellung von CaCl2-kompetenten E. coli DH5α-Zellen 27
3.2.12 Transformation von CaCl2-kompetenten E. coli DH5α-Zellen 28
3.2.13 Polymerasekettenreaktion (PCR) 28
3.2.14 Herstellung einer digoxigeninmarkierten DNA-Sonde 29
3.2.15 Sequenzierung von Nukleinsäuren 29
3.2.16 Isolierung des EZ::TN Transposon 29
3.2.17 Transposonmutagenese 30
3.2.18 Untersuchung der Transposonmutanten auf Autoaggregation 31
3.2.19 Untersuchung der Transposonmutanten auf Motilität 31
3.2.20 Southern Blot 31
3.2.21 Northern Blot 33
3.2.22 Identifizierung der Transposon flankierenden DNA-Sequenz mittels
eines Y-Linker 34
3.2.23 Identifizierung der Transposoninsertion 36
3.2.24 Komplementation der Transposonmutante 25/C1 36
3.2.25 Transformation des pvrR-Gens in die Transposonmutante 25/C1 37
3.2.26 Elektronenmikroskopische Darstellung von Fimbrienstrukturen
und Flagellen 37
4 ERGEBNISSE 38
4.1 Transposonmutagenese von Pseudomonas aeruginosa 38
4.2 Transposonmutagenese des WT 20265: Überprüfung auf langsam
wachsende Phänotypen 38
4.3 Transposonmutagenese der SCV 20265: Überprüfung auf schnell
wachsende Phänotypen 39
III INHALTSVERZEICHNIS
4.4 Charakterisierung der Transposonmutanten im Autoaggregations-
Assay 40
4.4.1 Wachstumsverhalten der Transposonmutanten des mutagenisierten
WT 20265 in Flüssigmedium 41
4.4.2 Wachstumsverhalten der Transposonmutanten der mutagenisierten
SCV 20265 in Flüssigmedium 42
4.5 Charakterisierung der Transposonmutanten im Twitching-Motilitäts-Assay 43
4.6 Molekularbiologische Charakterisierung der Transposonmutanten 45
4.7 Komplementation von PA1587 in der Transposonmutante 25/C1 50
4.8 Untersuchung zur cupA1-Genexpression (PA2128) in den Transposon-
mutanten des mutagenisierten WT 20265 51
4.9 Ausbildung von Fimbrienstrukturen und Flagellen in Transposonmutanten
des mutagenisierten WT 20265 53
4.10 Ausbildung von Fimbrienstrukturen und Flagellen in klinischen
autoaggregativen SCVs 56
4.11 Wachstumsverhalten der Transposonmutante 25/C1unter
pvrR-Genexpression in trans 58
4.12 Temperaturabhängiges Wachstum der mutagenisierten SCV 20265 mit
einer Transposoninsertion in PA1120 58
5 DISKUSSION 60
5.1 Molekulare Mechanismen beim phänotypischen Switch von
Pseudomonas aeruginosa 61
5.1.1 Regulation eines autoaggregativen SCV Phänotyps in Verbindung
mit einem phänotypischen Switch bei Pseudomonas aeruginosa 67
5.1.2 Mutationen in den Genen mutS und mutL führen zu einem schnell
wachsenden Phänotyp ähnlich der Revertante 20265 72
5.2 Ausblick 74
6 ZUSAMMENFASSUNG 75
IV INHALTSVERZEICHNIS
7 SUMMARY 77
8 LITERATURVERZEICHNIS 79
9 ANHANG 102
9.1 Chemikalien 102
9.2 Gebrauchsmaterialien 103
9.3 Geräte 104
9.4 Untersuchung der Transposonmutanten des WT 20265
auf langsames Wachstum und Autoaggregation 105
9.5 Untersuchung der Transposonmutanten der SCV 20265
auf schnelles Wachstum und Autoaggregation 113
9.6 Experimentell ermittelte Sequenzen: Transposonmutanten des WT 20265 115
9.7 Experimentell ermittelte Sequenzen: Transposonmutanten der SCV 20265 120
9.8 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 125
V ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
• Abb. Abbildung
• AP Alkalische Phosphatase
• BHI brain-heart infusion Medium
• bidest. zweimal destilliert
• bp Basenpaare
• cDNA komplementäre DNA, die bei der
reversen Transkription von RNA entsteht
• CF Cystische Fibrose
• CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
• cup chaperone/ usher pathway
• DEPC Diethylpyrocarbonat
• DIG Digoxigenin
• d. h. das heißt
• DNA Desoxyribonukleinsäure
• DNase Desoxyribonuklease
• dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
• EDTA Ethylendiamintetraacetat
• GmR Gentamicin-Resistenz
• kb Kilobasen (paare)
• kV Kilovolt
• LB Luria Bertani (Medium)
• LBB Luria Bertani Bouillon
• M Molar
• m milli- (10-3); Masse
• min Minute(n)
• mol 6.022 x 1023 Teilchen
• µ mikro- (10-6)
• MOPS Morpholinopropansulfonsäure
• n nano- (109)
• OD Optische Dichte
• PCR Polymerasekettenreaktion
• REV Revertante, aus SCV in vitro generierter,
schnell wachsender Morphotyp
• RNA Ribonukleinsäure
VI ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
• RNase Ribonuklease
• s. siehe
• SCV(s) small colony variant(s)
• SDS Natriumdodecylsulfat
• spp. Subspezies
• SSC Natriumchlorid/ Trinatrium-Citrat
• Tab. Tabelle
• Taq Thermus aquaticus
• TBE Tris-Borsäure-EDTA
• TE Tris-EDTA
• Tn5 Transposon
• Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethan
• U Unit (Einheit der Enzymaktivität)
• ÜN Über Nacht
• UV Ultraviolett
• vergl. vergleiche
• WT Wildtyp, zur SCV klonales und schnell wachsendes Isolat
• z. B. zum Beispiel
• z. T. zum Teil
• Ω Ohm
1 EINLEITUNG
1. Einleitung
Pseudomonas aeruginosa, ein überall in der Umwelt vorkommender und opportunistisch
pathogener Keim für Pflanze, Tier und Mensch, trägt bei Patienten mit Cystischer Fibrose
(CF) (syn. Mukoviszidose) in Form einer chronischen Lungeninfektion maßgeblich zur
Morbidität und Mortalität bei. Die meisten Mukoviszidosepatienten werden im Schulalter
oder während der frühen Pubertät von P. aeruginosa kolonisiert (TÜMMLER u. KIEWITZ
1999) und obwohl die Mehrzahl der Patienten nur mit einem P. aeruginosa-Klon besiedelt
sind, der dort während des ganzen Lebens verbleibt (RÖMLING et al. 1994), können aus dem
Respirationstrakt eine Vielzahl von phänotypischen Varianten isoliert werden (Dissoziatives
Verhalten) (ZIERDT u. SCHMIDT 1964). Die größte Beachtung ist dabei in zahlreichen
Studien dem mukoiden P. aeruginosa-Phänotyp geschenkt worden, dessen exzessive
Exopolysaccharidbildung (Alginat) eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der chronischen
Lungeninfektion zugeschrieben wird. Neben dem mukoiden Phänotyp werden aus dem
Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten unter anderem auch langsam wachsende
Subpopulationen von P. aeruginosa, so genannte small colony variants (SCVs) isoliert. Dabei
konnte gezeigt werden, dass das Auftreten von SCVs mit schlechten
Lungenfunktionsparametern und einer inhalativen Antibiotikatherapie korreliert und diese
nach mehreren Passagen in reichhaltigem Flüssigmedium zu einem schnell wachsenden
Phänotyp mit großen auslaufenden Kolonien revertieren (HÄUSSLER et al. 1999a). In
nachfolgenden Untersuchungen konnte eine Subgruppe von autoaggregativen und
hyperpilierten SCVs identifiziert werden, die scheinbar in der einzigartigen Umwelt der
CF-Lunge selektioniert werden (HÄUSSLER et al. 2003a). Diese Morphotypen zeigen ein
autoaggregatives Verhalten in Flüssigkultur sowie eine erhöhte Fähigkeit zur Biofilmbildung
und Twitching-Motilität im Gegensatz zum klonalen Wildtyp. Das Auftauchen dieser
hyperpilierten SCVs in der CF-Lunge scheint eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der
chronischen Lungeninfektion mit P. aeruginosa einzunehmen und die Bakterien im Biofilm
zu einer Persistenz in der Lunge zu befähigen. In vorhergehenden Studien über
antibiotikaresistente SCVs von P. aeruginosa mit einer erhöhten Fähigkeit zur
Biofilmbildung wurde die Hypothese aufgestellt, dass phänotypische Differenzierung eine
Adaptation an gegebene Umweltbedingungen durch einen Phasenvariationsmechanismus sein
2 EINLEITUNG
könnte (DEZIEL et al. 2001; DRENKARD u. AUSUBEL 2002). OLIVER et al. (2000)
fanden wiederum in CF-Lungen mit zunehmender Frequenz so genannte Hypermutatoren von
P. aeruginosa und stellten die Hypothese auf, dass nicht nur eine Variation zwischen zwei
Phasen, sondern Mutation und Selektion zur Etablierung von so genannten
Nischenspezialisten verantwortlich sein kann und so eine Adaptation an die Bedingungen der
chronisch infizierten Lunge ermöglicht. Die chronisch infizierte CF-Lunge bietet ein Habitat,
in der P. aeruginosa in hoher Zelldichte einer Vielzahl von Umweltbedingungen gegenüber
steht und so zu morphologischer Differenzierung und Etablierung von Nischenspezialisten
führt. Solche Morphotypen könnten ebenso aufgrund von Mutation und Selektion, wie es für
Pseudomonas fluorescens in einer heterogenen Umwelt beschrieben wurde (RAINEY u.
TRAVISANO 1998), entstehen.
3 SCHRIFTTUM
2. Schrifttum
2.1 Pseudomonas aeruginosa: Taxonomie und allgemeine
Eigenschaften
Die Gattung Pseudomonas wurde erstmals 1894 von MIGULA beschrieben. Zur
Charakterisierung und Klassifizierung dieser Gattung wurden lange Zeit unspezifische
morphologische Merkmale (gramnegativ, stäbchenförmig, gerade, polar begeißelt)
herangezogen, sodass diese ein Auffangbecken für unvollständig charakterisierte Arten wurde
(STANIER et al. 1966). Erst mit der zunehmenden Entwicklung von molekularbiologischen
Techniken wurde die Gattung Pseudomonas mithilfe der DNA-rRNA-Hybridisierung
basierend auf rRNA-Homologien in 5 große Gruppen eingeteilt (PALLERONI et al. 1973;
DE VOS u. DE LEY 1983). Die Art Pseudomonas aeruginosa gehört bis heute mit z. B.
P. fluorescens, P. putida und P. syringae zu der Gruppe I, die im phylogenetischen Baum den
γ-Proteobakterien zugeordnet wird (ANZAI et al. 2000). Bezeichnet werden sie als
Pseudomonaden im engeren Sinne. Bei den Pseudomonaden im weiteren Sinne der Gruppen
II-V kam es nach und nach zu Umklassifizierungen in andere Gattungen. Die Arten der
Gruppe II wurden z. B. in die Gattung Burkholderia überführt (YABUUCHI et al.1992;
URAKAMI et al. 1994), während einige Arten der Gruppe IV zur Gattung Brevundimonas
gehören (SEGERS et al. 1994).
Pseudomonas aeruginosa ist ein 0.5-0.8 µm dickes und 1.5-3.0 µm langes gramnegatives und
polar begeißeltes Stäbchen. Dieser fakultativ pathogene Entzündungserreger besitzt die
Fähigkeit, die verschiedensten ökologischen Nischen zu besiedeln. So findet P. aeruginosa
sein Habitat nicht nur im Erdboden, im Wasser, im Abwasser und in diversen Feuchtzonen,
sondern auch in Pflanzen, Tieren und nicht zuletzt im Menschen, wo er als Erreger eitriger
und septikämischer Infektionen eine große Bedeutung besitzt. P. aeruginosa gehört zu dem
meist isolierten Erreger von nosokomialen Infektionen und trägt bei Patienten mit Cystischer
Fibrose (CF) in Form einer chronischen Lungeninfektion maßgeblich zur Morbidität und
Mortalität bei (TÜMMLER u. KIEWITZ 1999). Die hohe Anspruchslosigkeit und seine
Fähigkeit sich an verschiedene Umweltbedingungen anzupassen, spiegelt sich in der
Genomgröße von P. aeruginosa wider. So besitzt P. aeruginosa PAO1 mit rund 6.3 Millionen
4 SCHRIFTTUM
Basenpaaren (bp) ein deutlich größeres Genom als alle anderen bisher sequenzierten
bakteriellen Genome und erreicht die genetische Komplexität die vom einfachen
eukaryotischen Organismus z. B. Saccharomyces cerevisiae (STOVER et al. 2000).
Aufgrund dieser Vielseitigkeit ist das Bakterium im Labor auf einfach
zusammengesetzten Nährböden, wie z. B. MacConkey-Agar und flüssigen Nährmedien bei
37 °C und 42 °C ohne Probleme anzüchtbar. Bei 4 °C ist allerdings kein Wachstum mehr
möglich. Die meisten P. aeruginosa-Stämme bilden relativ große, meist grünlich metallisch
glänzende und eingesunkene Kolonien mit einem charakteristischen süßlich aromatisch, nach
Lindenblüten erinnernden Geruch, der durch o-Aminoacetophenon hervorgerufen wird. Diese
Koloniemorphologie ist besonders gut auf Blutagar sichtbar. Auf Schafblutagar zeigt der
Keim häufig eine Hämolyse, die durch die zwei Hämolysine Phospholipase C und
hitzestabiles Glykolipid verursacht wird. In flüssigen Nährmedien wächst P. aeruginosa
vorwiegend unter Bildung einer so genannten Kahmhaut an der Oberfläche. Von einigen
Stämmen wird unter bestimmten Wachstumsbedingungen das blaugrüne Pigment Pyocyanin
freigesetzt, welches dem Eiter seine charakteristische Farbe verleiht. Genau diesem Pigment
verdankt der Erreger seinen alten Namen Bacterium pyocyaneum. Als weiterer Farbstoff wird
das gelbgrüne Pyoverdin gebildet. Es ist ein im UV-Licht fluoreszierender Farbstoff, der
unlöslich in Chloroform und für P. aeruginosa nicht spezifisch ist. Weitere, aber selten
vorkommende Farbstoffe sind das rötliche Pyorubin und das bräunliche Pyomelanin. Als
zusätzlich kulturell-biochemische Eigenschaft verfügt P. aeruginosa über das Enzym
Katalase und, von besonderem diagnostischen Wert, die Oxidase.
2.2 Extrazelluläre Virulenzfaktoren von Pseudomonas aeruginosa
P. aeruginosa verfügt über ein großes Repertoire an extrazellulären Virulenzfaktoren, die
nach der Kolonisation an der Entstehung umfassender Gewebszerstörung und Verbreitung des
Erregers beteiligt sind (VAN DELDEN u. IGLEWSKI 1998). Der vermutlich wichtigste
Virulenzfaktor ist das Exotoxin A, welches ähnlich dem Diphterietoxin, eine Hemmung der
Proteinbiosynthese durch ADP-Ribosylierung des Elongationsfaktors 2 bewirkt (WICK et al.
1990; VOGT et al. 1999). Es ist für lokale Gewebszerstörung und bakterielle Invasion
verantwortlich und besitzt eine hohe Toxizität (WOODS u. IGLEWSKI 1983). In vitro
5 SCHRIFTTUM
inhibiert Exotoxin A die Proliferation von B-Zellen sowie die Produktion von Immunglobulin
IgG und IgM (VIDAL et al. 1993).
Die von P. aeruginosa gebildeten zwei Proteasen, die Elastase und die alkalische
Protease, sind möglicherweise von großer Bedeutung während der akuten Phase einer
P. aeruginosa-Infektion. Mit der Elastase besitzt der Erreger die Fähigkeit, das Protein Elastin
zu spalten. Elastin, ein wichtiger Bestandteil des Lungengewebes und der Blutgefäße, ist für
die Kontraktion und Ausdehnung der Lunge sowie für die Elastizität der Blutgefäße
erforderlich (VAN DELDEN u. IGLEWSKI 1998). Die elastolytische Aktivität wird durch
LasA und LasB vermittelt. Elastin wird von LasA so verändert, dass LasB Elastin effektiver
spalten kann (VOGT et al. 1999). LasB spaltet außer Elastin noch Fibrin und Kollagen
(HECK et al. 1986), inaktiviert die Immunglobuline IgG und IgA (HECK et al. 1990),
Lysozym (JACQUOT 1985), Komplementkomponenten (HONG u. GHEBREHIWET 1992)
sowie Substanzen, die am Schutz des Respirationstraktes vor Proteasen beteiligt sind, wie der
humane α-1-Proteinaseninhibitor (MORIHARA et al. 1979). Die alkalische Protease spielt
vermutlich eine zentrale Rolle bei der Infektion der Kornea (HOWE u. IGLEWSKI 1984;
KERNACKI et al. 1995).
Pyocyanin ist nicht nur für die blaugrüne Färbung des Eiters verantwortlich, sondern
wirkt als Virulenzfaktor z. B. toxisch auf den Fadenwurm Caenorhabditis elegans
(MAHAJAN-MIKLOS et al. 1999) und neutrophile Granulozyten (USHER et al. 2002).
Neben den in die Umgebung abgegebenen Virulenzfaktoren besitzt P. aeruginosa ein so
genanntes Typ III Sekretionssystem. Mit diesem System besitzt das Bakterium die Fähigkeit,
Effektorproteine nach Kontakt direkt in die eukaryotische Zielzelle zu injizieren (FRANK
1997; HUECK 1998; GALAN u. COLLMER 1999; CORNELIS u. VAN GIJSEGEM 2000).
Zu den Effektorproteinen gehört das Exoenzym S, welches aus den zwei nicht-kovalent
gebundenen Polypeptiden ExoS und ExoT besteht (FINCK-BARBANCON et al. 1997) und
zusammen mit Exotoxin A zu den ADP-Ribosyltransferasen gehört (IGLEWSKI et al. 1978;
NICAS et al. 1985). Des Weiteren gehört das zytotoxische und Epithelläsionen verursachende
ExoU (FINCK-BARBANCON et al. 1997) zu den Effektorproteinen sowie das ExoY,
welches möglicherweise zu einer cAMP-Anreicherung in der Zielzelle führt (YAHR et al.
1998).
6 SCHRIFTTUM
2.3 Pseudomonas aeruginosa als Erreger nosokomialer
Infektionen
Für eine erfolgreiche Kolonisation seines Wirtes ist P. aeruginosa als opportunistischer
Erreger auf ein geschwächtes oder defektes Abwehrsystem angewiesen. Der Erreger gehört
nach Escherichia coli zu dem am zweit häufigsten vorkommenden gramnegativen
Verursacher nosokomialer Infektionen (DÖRING 1993). So infiziert P. aeruginosa
insbesondere Menschen mit einer Störung der Haut- oder Schleimhautbarriere oder einer
Immunsuppression. Als so genannter „Nass- oder Pfützenkeim" besiedelt P. aeruginosa im
Krankenhaus unter anderem Waschbecken, Luftbefeuchter, Schläuche von Beatmungs- und
Infusionsgeräten, Säuglingsinkubatoren, Desinfektionsmittel (quarternäre Ammonium-
verbindungen) und Blumenvasen. Selbst im destillierten Wasser kann der Erreger
vorkommen, sofern Spuren von organischen Substanzen vorhanden sind (VOGT et al. 1999).
Bei erfolgreicher Kolonisation des Wirtes mit dem Erreger entsteht eine folgenschwere
Infektion. So ist P. aeruginosa für 16% der nosokomialen Pneumonien (WIBLIN 1997), für
8% der Wundinfektionen nach chirurgischen Eingriffen (KLUYTMANS 1997) sowie für
10% der Sepsisfälle (GORDON et al. 1998) verantwortlich.
Künstlich beatmete Patienten, die an eine durch P. aeruginosa verursachte Pneumonie leiden,
zeigen eine höhere Mortalitätsrate als Patienten, deren Pneumonien durch andere Erreger
verursacht wurden (STEVENS et al. 1974; BRYAN u. REYNOLDS 1984; FAGON et al.
1989). Studien von CROUCH BREWER et al. (1996) zeigten mit einer Mortalitätsrate von
68% ähnliche Ergebnisse. Verletzungen des Tracheal- und Bronchialepithels, wie sie während
einer Intubation entstehen können, erhöhen die Empfänglichkeit für eine Infektion mit
P. aeruginosa (DERETIC 2000).
Durch P. aeruginosa verursachte Harnwegsinfektionen entstehen hauptsächlich bei Patienten,
an denen chirurgische Eingriffe am Urogenitaltrakt vorgenommen wurden oder Träger von
Dauerkathetern sind. Des Weiteren können anatomische oder funktionelle Abweichungen des
Urogenitaltraktes die Ursache für eine Infektion sein (VOGT et al. 1999; DERETIC 2000).
Die Urosepsis stellt eine gefürchtete Komplikation bei einer Harnwegsinfektion mit
P. aeruginosa dar.
7 SCHRIFTTUM
P. aeruginosa wird häufig mit Verbrennungswunden assoziiert. So bietet nicht nur die lokale
Zerstörung der Hautbarriere, sondern auch der begleitende immunsuppressive Effekt einer
Verbrennung dem Erreger ideale Bedingungen für eine zunächst lokale und später
systemische Ausbreitung im Körper (DERETIC 2000). Ausbrüche mit P. aeruginosa auf
Stationen mit Verbrennungsopfern sind mit einer hohen Mortalität (60%) verbunden
(RICHARD et al. 1994).
Verletzungen des Auges, die durch Trauma oder einfach nur durch das Tragen von
Kontaktlinsen entstanden sind, können zu einer P. aeruginosa-Infektion führen. Bereits feine
Abrasion des Oberflächenepithels der Kornea, wie sie durch Kontaktlinsen hervorgerufen
werden können, ermöglichen dem Erreger bereits ein erfolgreiches Anheften. Als Folge
entstehen häufig Ulzerationen der Kornea, eine Skleritis und Endophthalmitis. Die Infektion
bei Kontaktlinsenträgern geht meistens auf die Kontamination der Aufbewahrungsflüssigkeit
mit P. aeruginosa zurück sowie ungenügend gereinigte Linsen, die mit Protein und Mukus
bedeckt sind und dem Bakterium einen idealen Nährboden zum Wachstum bieten (VOGT et
al. 1999; DERETIC 2000).
Weitere Beispiele für durch P. aeruginosa verursachte lokale Infektionen sind Otitiden und
Endokarditiden. Bei der Endokarditis spielen prädisponierende Faktoren wie künstliche
Herzklappen und intravenöser Konsum von Drogen eine Rolle (DERETIC 2000). Sehr selten
verursacht P. aeruginosa Meningitiden und Gehirnabszesse, wobei Gehirnabszesse aufgrund
von penetrierenden Schädelverletzungen entstehen können.
Bis zu 24% der Menschen können P. aeruginosa im Stuhl beinhalten (MORRISON u.
WENZEL 1984). Wird der Darm allerdings massiv mit dem Erreger besiedelt, kann eine
nekrotisierende Enterokolitis entstehen, die bei Neugeborenen tödlich verläuft und bei
Erwachsenen mit einer hohen Mortalität einhergeht (STONE et al. 1979).
2.4 Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa beim Tier
P. aeruginosa ist bei Tieren an verschiedenen lokalen, häufig chronischen Infektions-
krankheiten beteiligt, während septikämische Allgemeininfektionen seltener sind. Das Wirts-
8 SCHRIFTTUM
spektrum des Erregers ist sehr breit. So sind neben den Haustierarten ebenso Heim- und
Zootiere betroffen, insbesondere Reptilien, bei denen sich eine Infektion mit P. aeruginosa in
Form von Stomatitiden, Abszessen und Allgemeininfektionen äußert. Eine Herabsetzung des
Abwehrsystems sowie einer Störung der Haut- oder Schleimhautbarriere ist wie beim
Menschen die Voraussetzung für klinisch manifeste Infektionen. Häufig sind Infektionen bei
Jungtieren sowie im Rahmen von Mischinfektionen anzutreffen (SELBITZ 1992, 2002).
Beispiele für lokale Infektionen mit P. aeruginosa sind Wundinfektionen, die chronisch
eitrige Otitis externa des Hundes, ulzerative Keratitiden bei Hunden und Pferden, eine selten
auftretende Infektion des Uterus mit möglichem Abort bei der Stute, Infektionen des
Urogenitaltraktes bei Hund und Katze aufgrund mechanischer Manipulation wie z. B. bei der
Katheterisierung sowie die so genannte Vliesfäule bei Schafen, einer exsudativen Dermatitis
(GYLES 1993; KOWALSKI 1998; PLANT 2000).
Von P. aeruginosa verursachte Mastitiden beim Wiederkäuer sind selten, jedoch können
sie im Rinderbestand enzootisch auftreten. Häufig werden sie in den Beständen beobachtet, in
denen quarternäre Ammoniumsalze als Desinfektionsmittel für Melkgeräte benutzt wurden.
Eine P. aeruginosa-Mastitis kann sowohl systemisch oder als auch lokal, akut, chronisch oder
subklinisch verlaufen. Schwere akute Fälle können zum Tod des Tieres führen (KLASTRUP
1994).
Von P. aeruginosa verursachte septikämische Allgemeininfektionen, die schnell zum Tode
führen können, sind insbesondere beim Geflügel, Nerz und Chinchilla vorzufinden (GYLES
1993). Beim Geflügel sind besonders Küken, die sich über Brutschränke, Tränkesysteme oder
kontaminierte Injektionsspritzen mit dem Erreger infizieren, von einer Septikämie bedroht.
Die Gesamtmortalität in der Herde kann dabei zwischen 1-90% schwanken (SIEGMANN
1993).
2.5 Pseudomonas aeruginosa und Cystische Fibrose
Die Cystische Fibrose (CF) ist die zweithäufigste autosomal rezessive Erbkrankheit der
weißen Bevölkerung und wird durch einen Gendefekt im cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator (CFTR)-Gen verursacht (GALLATI 2001). Bisher sind mehr als 1200
9 SCHRIFTTUM
Mutationen bekannt (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr). Die häufigste Mutation (~ 70%)
ist die (inframe) 3-Basenpaar-Deletion im CFTR-Gen (F508), welche zum Verlust der
Aminosäure Phenylalanin an Position 508 führt (TÜMMLER u. KIEWITZ 1999; PIER
2000). Das CFTR-Gen kodiert für einen cAMP-regulierten Chlorid-Kanal, der ATP bindet
und aktiv am Ionen-Transport durch die Zellmembran beteiligt ist (STUTTS et al. 1995;
GALLATI 2001). Des Weiteren besitzt das CFTR-Protein Regulatorfunktionen für andere
Ionenkanäle (RANDAK u. TÜMMLER 2001).
Klinisch manifestiert sich die CF hauptsächlich in den Organen wie Lunge, Pankreas, Darm,
Leber und Gallenwege sowie Schweißdrüsen und Nebenhoden, wobei die Lunge das am
schwersten betroffene Organ darstellt und die häufigste Ursache für Morbidität und
Mortalität in der CF-Erkrankung ist (GOVAN u. DERETIC 1996; TÜMMLER u. KIEWITZ
1999; RAJAN u. SAIMAN 2002).
Die gestörte Funktionsfähigkeit des CFTR führt zu einer Dysregulation des
Ionentransportes in den epithelialen Zellen. Dadurch kommt es zur Bildung eines hoch
viskösen Bronchialsekretes und in Folge zu einem eingeschränkten Vermögen, den
Bronchialtrakt von Sekreten zu befreien, d. h. zu einer abnormen mukoziliären Clearance.
Die gestörte mukoziliäre Clearance gilt als die Hauptursache für die chronische bakterielle
Besiedelung des Bronchialtraktes, bei der insbesondere P. aeruginosa eine bedeutende Rolle
zu kommt. Während in den ersten Stadien der Erkrankung vor allem Hämophilus influenzae
und Staphylococcus aureus aus den Respirationstraktmaterialien isoliert werden, dominiert in
späteren Stadien P. aeruginosa. Heute ist P. aeruginosa der am häufigsten vorkommende
Erreger bei der CF und wird als der CF-Leitkeim bezeichnet (KRAEMER 2001; GOVAN u.
DERETIC 1996; TÜMMLER u. KIEWITZ 1999; LYCZAK et al. 2002). 75-90% der
CF-Patienten sind mit diesem Bakterium infiziert (PIER 2000).
Die Kolonisation der CF-Lunge mit P. aeruginosa findet meistens während der Schulzeit
oder frühen Pubertät statt (TÜMMLER u. KIEWITZ 1999), wobei Studien zeigen konnten,
dass die CF-Patienten mit Umweltisolaten von P. aeruginosa infiziert werden (RÖMLING et
al. 1994). Dabei beginnt P. aeruginosa mit der Besiedlung des Respirationstraktes im Naso-
und Oropharynx (KUBESCH et al. 1988). Die höchste Anzahl der an bukkale Epithelzellen
gehefteten Bakterien wurde bei den Patienten vorgefunden, die eine akute virale Infektion in
den oberen Atemwegen aufwiesen. Das führte zu der Vermutung, dass die Zerstörung der
10 SCHRIFTTUM
intakten Epithelzellschicht und die Produktion von Zelltrümmern während einer viralen
Infektion die Kolonisation des Respirationstraktes von CF-Patienten triggert. Weitere Studien
zeigten, dass intakte Epithelzellen sich an der Beseitigung von P. aeruginosa aus dem
Respirationstrakt sogar aktiv beteiligen, indem sie den CFTR als Rezeptor für die
Internalisierung des Erregers durch Endozytose benutzen. Fehlt der CFTR in der
Plasmamembran der Epithelzelle oder ist die Epithelzellschicht durch virale Infektionen
zerstört, kommt es zu einer Erhöhung der Bakterienanzahl in der Lunge (PIER 1998, 2000).
Auch wird davon ausgegangen, dass insbesondere Erreger wie Staphylococcus aureus und
Hämophilus influenzae mit einer ersten erfolgreichen Infektion der CF-Lunge den Weg für
P. aeruginosa vorbereiten (DERETIC 2000).
Ist es P. aeruginosa gelungen, die CF-Lunge chronisch zu infizieren, so können die
meisten Chemotherapeutika den Erreger nicht mehr eliminieren (DERETIC 2000). Im
Gegenteil, P. aeruginosa scheint besondere Selektionsvorteile in der CF-Lunge zu besitzen
und bildet phänotypische Varianten bzw. genetisch stabile CF-P. aeruginosa-Stämme aus
(s. 2.7). So ist z. B. der Wechsel zum mukoiden Morphotyp von P. aeruginosa und dessen
exzessive Produktion des Exopolysaccharides Alginat mit einer fortschreitenden Abnahme
der Lungenfunktion assoziiert (GOVAN u. DERETIC 1996). Des Weiteren korrelierte der
Nachweis von langsam wachsenden Subpopulationen, so genannten small colony variants
(SCVs) mit schlechten Lungenfunktionsparametern und inhalativer Antibiotikatherpie
(HÄUSSLER et al. 1999a). Der Fähigkeit von P. aeruginosa, einen Biofilm zu bilden,
kommt eine besondere Bedeutung zu, da durch diese Wachstumsform der Erreger z. B. vor
dem Immunsystem des CF-Patienten und Chemotherapeutika geschützt wird (s. 2.6). Somit
ist eine frühe antibiotische Therapie sehr wichtig, da eine Suppression von P. aeruginosa die
Prognose für den CF-Patienten insgesamt deutlich verbessern kann.
Andere Bakterien wie Streptococcus pneumonie, Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus
spp., Serratia spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp. und Streptokokken der Gruppe A
erreichen nicht die Prävalenz wie P. aeruginosa. Es kommt im Allgemeinen zu keiner
Persistenz dieser Erreger in der CF-Lunge. Aspergillus spp., Candida albicans und atypische
Mykobakterien können die CF-Lunge infizieren, allerdings weniger häufig und im späteren
Lebensabschnitt eines CF-Patienten (RENDERS et al. 2001).
11 SCHRIFTTUM
Durch die chronische Infektion in der CF-Lunge wird die mukoziliäre Clearance zusätzlich
gestört. Es entsteht eine Bronchiolitis und obstruktive Bronchitis. In späteren Stadien wird
eine obliterierende Bronchiolitis, eine massive pulmonale Überblähung mit regionalen
Obstruktionsemphysemen, eine interstitielle Pneumonitis, organisierte pneumonische
Infiltrate und eine diffuse Alveolardestruktion gefunden (KRAEMER 2001). Als
Langzeitfolge entwickelt sich bei den meisten CF-Patienten ein Lungenemphysem. Weitere
Spätkomplikationen sind eine pulmonale Hypertonie mit Ausbildung eines Cor pulmonale
sowie der Pneumothorax und die entzündliche Arrosionsblutung von Bronchialarterien
(HELBICH 2001).
2.6 Pseudomonas aeruginosa und seine Fähigkeit zur
Biofilmbildung
Der Biofilm ist eine Gemeinschaft von Mikroorganismen, die umschlossen von einer
Exopolysaccharidmatrix an eine abiotische oder biotische Oberfläche fest angeheftet ist
(COSTERTON et al. 1995; O'TOOLE et al. 2000). Als komplexe, hoch differenzierte
Gemeinschaft wird der Biofilm in beinahe allen nährstoffreichen Ökosystemen vorgefunden
und ermöglicht es den Bakterien, in hoher Rate ihr genetisches Material zu teilen und
verschiedenste Nischen zu besiedeln (WATNICK u. KOLTER 2000). Es können beinahe alle
Oberflächen wie Glas, Metall, Stein und Plastik bis hin zu eukaryotischem Gewebe in Form
eines Biofilms kolonisiert werden. Für P. aeruginosa z. B. wurde gezeigt, dass der Erreger in
der chronisch infizierten CF-Lunge in Form eines Biofilms persistiert (SINGH et al. 2000).
Damit besitzt der Biofilm eine große medizinische Bedeutung. Des Weiteren stellt der
Biofilm für die Bakterien insbesondere eine Wachstumsform des Schutzes dar, d. h. nicht nur
vor ungünstigen Umweltbedingungen, sondern auch vor biologischen und chemischen
antibakteriellen Wirkstoffen. Denn Bakterienzellen gelten im Biofilm als 500-mal höher
resistent gegen antibakterielle Therapeutika als planktonische Zellen (COSTERTON et al.
1995). So trägt der Biofilm zum großen Teil zur Virulenz eines Erregers bei und Infektionen
mit im Biofilm organisierten Mikroorganismen sind von chronischer oder rekurrierender
Natur (WATNICK u. KOLTER 2000; HENTZER et al. 2001).
12 SCHRIFTTUM
Die Biofilmbildung ist ein biologischer Zyklus, der aus den vier Stufen Initiierung, Reifung,
Erhaltung und Auflösung (Abb. 1) besteht (O'TOOLE et al. 2000) und wird im Folgenden für
P. aeruginosa beschrieben.
Abbildung 1: Modell einer Biofilmentwicklung (O’TOOLE et al. 2000).
Mit dem Erhalt von Umweltsignalen beginnen einzelne planktonische Bakterienzellen mit der
Initiierung der Biofilmentwicklung. Die einzelnen Zellen adhärieren an die Oberfläche und bilden mit
anderen Bakterienzellen Mikrokolonien. Durch weitere Signale kommt es zur Bildung eines reifen
Biofilms. Das Kennzeichen des reifen Biofilms sind pilzartig geformte Mikrokolonien, die von einer
Exopolysaccharidmatrix umgeben sind. Die Bakterienzellen können sich zu jeder Zeit wieder vom
Biofilm lösen und als planktonische Zellen weitere Habitate in Form erneuter Biofilmentwicklung
besiedeln. Damit schließt sich der Zyklus der Biofilmentwicklung.
Mit der Initiierung der Biofilmentwicklung beginnen Bakterien, wenn sie aus der Umwelt
Signale erhalten (O'TOOLE et al. 2000). Die Adhäsion an die Oberfläche bildet dabei
vermutlich den entscheidenden Schritt. Vor der Adhäsion führt P. aeruginosa eine
flagellenabhängige Schwimmbewegung entlang der Oberfläche aus und bildet verteilte
Einzelschichten. Eine so genannte Twitching-Motilität befähigt die Bakterien sich entlang der
Oberfläche zu bewegen, und Zellhaufen oder Mikrokolonien zu formen. Diese Form der
Bewegung wird über Typ IV Pili vermittelt, welche am Bakterium polar lokalisiert sind
13 SCHRIFTTUM
(O'TOOLE u. KOLTER 1998; WALL u. KAISER 1999; O'TOOLE et al. 2000). Es konnte
gezeigt werden, dass P. aeruginosa mit einer defekten Typ IV Pili-Biogenese zwar an eine
abiotische Oberfläche binden kann, jedoch weder zur Twitching-Motilität noch zur Bildung
von Mikrokolonien fähig ist (O'TOOLE u. KOLTER 1998). So vermitteln die Typ IV Pili bei
P. aeruginosa den Übergang von der reversiblen zur irreversiblen Adhäsion (STOODLEY et
al. 2002).
Ist ein fester Halt auf der Oberfläche erfolgt, beginnt P. aeruginosa mit der Bildung von
pilzartig geformten Mikrokolonien. Diese sind von einer extrazellulären Matrix umgeben und
in ein Netzwerk von offenen, mit Flüssigkeit gefüllten Kanäle eingefügt, welche die
Gemeinschaft mit Nährstoffen versorgt (O’TOOLE et al. 2000; STOODLEY et al. 2002). Die
extrazelluläre Matrix besteht aus mehreren Komponenten, wie extrazellulären
Polysacchariden, Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Substanzen (DAVEY u. O’TOOLE
2000).
Der häufig aus der chronisch infizierten CF-Lunge isolierte mukoide Morphotyp von
P. aeruginosa besitzt die Eigenschaft, das extrazelluläre Polysaccharid Alginat exessiv zu
produzieren (HENTZER et al. 2001). Alginat ist ein Polymer aus Mannuron- und
Guluronsäure und seine Produktion ist weit verbreitet unter den Pseudomonaden der
rRNA-Homologiegruppe I (GACESA 1998; VOGT et al. 1999). Es wird vermutet, dass
Alginat diesen mukoiden P. aeruginosa-Phänotyp vor dem heterogenen Habitat der
CF-Lunge schützt und somit das Haupt-Exopolysaccharid im Biofilm bei P. aeruginosa bildet
(WOZNIACK et al. 2003). Studien mit diesem Phänotyp haben gezeigt, dass das algC-Gen in
kurzer Zeit hochreguliert wird, sobald die Zellen an eine abiotische Oberfläche angeheftet
sind. Dieses Gen kodiert ein essenzielles Enzym der Alginat-Synthese und bildet einen
Schlüsselpunkt in der Regulation des Alginat-Stoffwechselweges (DAVIES u. GEESEY
1995). Andere Studien gehen von einer Verbindung zwischen der herunterregulierten
Flagellum-Synthese und der hochregulierten Alginat-Synthese aus, da die mukoiden
P. aeruginosa-Isolate aus der CF-Lunge ihre Motilität verloren haben (GARRET et al. 1999).
Es scheint, dass die Bakterien sich an das immobile Leben im Biofilm anpassen, indem sie die
Flagellen verlieren und die extrazelluläre Polysaccharidproduktion erhöhen (DAVEY u.
O'TOOLE 2000). Für nicht-mukoide P. aeruginosa-Stämme, wie sie in der natürlichen
Umwelt vorkommen, scheint Alginat nicht zur Biofilmbildung erforderlich zu sein
(WOZNIAK et al. 2003).
14 SCHRIFTTUM
Die Existenz im Biofilm erfordert von den Bakterien nicht nur die Fähigkeit,
Informationen aus ihrer Umwelt zu empfangen, zu verarbeiten und auf Umweltveränderungen
zu reagieren, sondern auch die Zelldichte ihrer Population wahrzunehmen und über
Signalmoleküle (so genannte Autoinducer) zu kommunizieren. Dieses Phänomen wird
Quorum Sensing genannt und ermöglicht es den Bakterien, als Gemeinschaft zu agieren
(FUQUA et al. 1996; GRAY 1997). DAVIES et al. (1998) konnten zeigen, dass Quorum
Sensing in der Entwicklung des P. aeruginosa-Biofilms notwendig ist. Eine Mutante, die
nicht mehr die Fähigkeit besitzt den Autoinducer N-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserin-Lakton
zu synthetisieren, bildet nur flache, undifferenzierte Biofilme aus. Außerdem reagierten die
von der Mutante gebildeten Biofilme, anders als beim Wildtyp, sensitiv auf das Biozid
Sodium Dodecyl Sulfat (SDS).
Sind die Nährstoffe im Biofilm und seiner Umgebung verbraucht oder werden sie den Zellen
entzogen, lösen sich einzelne Bakterienzellen wieder vom Biofilm (O'TOOLE et al. 2000).
Als planktonische Zellen sind sie in der Lage, neue Habitate in Form eines Biofilms zu
besiedeln und der Zyklus kann von neuem beginnen.
2.7 Phänotypische Varianten von Pseudomonas aeruginosa bei
Cystischer Fibrose
Die Besonderheit einer Infektion der CF-Lunge mit P. aeruginosa ist, dass klonale Isolate
eine unterschiedliche Koloniemorphologie aufweisen. Dieses Auftreten verschiedener
phänotypischer Varianten bei P. aeruginosa wurde als dissoziatives Verhalten beschrieben
(ZIERDT u. SCHMIDT 1964).
Die größte Beachtung wurde in zahlreichen Studien dem mukoiden Phänotyp von
P. aeruginosa geschenkt. Da er selten bei anderen Infektionen als CF vorgefunden wird,
scheint dieser Phänotyp von P. aeruginosa besondere Selektionsvorteile in der CF-Lunge zu
besitzen (DERETIC 2000). Verursacht wird der Wechsel von der nicht-mukoiden zur
mukoiden Form durch Punktmutationen, die zu einer Inaktivierung des mucA-Gens führen
(MARTIN et al. 1993; GOVAN u. DERETIC 1996; BOUCHER et al. 1997). MucA
funktioniert als ein Negativregulator des alternativen Sigmafaktors algU, der die
15 SCHRIFTTUM
Transkription der Alginatbiosynthese steuert. Ist mucA inaktiviert, wird algU nicht mehr
länger inhibiert. Es folgt eine Überproduktion des Exopolysaccharides Alginat und ein
mukoider Phänotyp entsteht (DERETIC 2000). Dieser charakteristischen exzessiven
Alginatproduktion und -sekretion wird eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der
chronischen Lungeninfektion zugeschrieben. Vermutlich wird mit der Konversion vom
nicht-mukoiden zum mukoiden P. aeruginosa-Phänotyp die chronische Infektionsphase für
die CF-Patienten eingeleitet (KOCH u. HØIBY 1993; LYCZAK et al. 2002). Aufgrund des
häufigen Verlustes von Pili und Flagellen weist dieser Phänotyp keine Motilität mehr auf
(PIER 1998; GARRET et al. 1999). Des Weiteren ist für diese Form der Verlust der
O-Seitenketten ihres Lipopolysaccharides in der äußeren Zellwand charakteristisch. Ein
Wechsel, der das Bakterium hoch empfänglich für die opsionierende und bakteriostatische
Wirkung des Komplementsystems werden lässt (PIER 1998).
Neben dem mukoiden wurden weiterere Morphotypen von P. aeruginosa aus dem
Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten isoliert, unter anderem die in sehr kleinen
Kolonien wachsenden (1-3 mm Durchmesser nach 48 Stunden Inkubation auf Columbia
Blutagar und MacConkeyagar bei 37 °C), so genannten small colony variants (SCVs)
(Abb. 2) (HÄUSSLER et al. 1999a).
WT SCV
Abbildung 2: Wachstum der zwei Morphotypen Wildtyp und SCV des P. aeruginosa-Stammes
20265 auf Agar-Platten.
Koloniemorphologie des Wildtyps (WT) und der klonalen SCV 20265 auf Columbia-Blutagar nach 48
Stunden Inkubation bei 37 °C.
16 SCHRIFTTUM
Langsam wachsende bakterielle Subpopulationen sind seit langem bekannt und wurden bei
einer Reihe von grampositiven und gramnegativen Erregern beschrieben, z. B. für
Staphylococcus aureus (LACEY 1969; BULGER 1969), Salmonella typhimurium
(SASARMAN et al. 1970), Enterobacter aerogenes (RUSTHOVEN et al. 1979), Klebsiella
pneumoniae (MURRAY u. MOELLERING 1982), Escherichia coli (ROGGENKAMP et al.
1998), Burkholderia pseudomallei (HÄUSSLER et al. 1999b) und beim Burkholderia
cepacia-Komplex (HÄUSSLER et al. 2003b). Da die SCVs zunehmend mit persistierenden
und rekurrierenden Infektionen in einen ursächlichen Zusammenhang gebracht werden,
gewinnen sie immer mehr an Bedeutung (HÄUSSLER 2003c). Die Infektion der Lunge mit
P. aeruginosa bei Mukoviszidose ist ein klassisches Beispiel für eine chronisch persistierende
bakterielle Infektion.
In einer Studie von HÄUSSLER et al. (1999a) wurden Isolate von CF-Patienten in einem
Zeitraum von zwei Jahren untersucht. Von 346 CF-Patienten waren 86 mit P. aeruginosa
chronisch infiziert und 33 davon mit SCVs kolonisiert. Nach mehreren Passagen der SCVs in
brain-heart infusion (BHI) Medium konnte ein schnell wachsender Phänotyp mit großen
auslaufenden Kolonien isoliert werden, so genannte Revertanten (REV). Mit einer
elektronenmikroskopischen Untersuchung konnte kein signifikanter Unterschied zwischen
SCVs und Revertanten in Bezug auf Zellgröße oder Morphologie festgestellt werden.
Allerdings wiesen die Einzelkolonien der SCVs nach 48 Stunden Inkubation 2.5 bis 16fach
weniger Bakterien auf als die Einzelkolonien der Revertanten, welches ein Zeichen für ein
langsameres Wachstum der SCVs ist. SCVs wurden häufiger aus den CF-Patienten isoliert,
die täglich eine inhalative Therapie mit dem Antibiotikum Tobramycin oder Colistin erhalten
haben. Außerdem waren Träger von SCVs im Durchschnitt stärker in ihrer Lungenfunktion
beeinträchtigt. Untersuchungen mit Aminoglykosiden, Quinolonen, Colistin und ß-Lactam-
Antibiotika in Bezug auf die minimale Hemmkonzentration (MHK) zeigten, dass die SCVs
für ihre Hemmung eine 2- bis 8-fach höhere Antibiotikakonzentration benötigten als die
Revertanten (HÄUSSLER et al. 1999a).
Die SCVs von Staphylococcus aureus sind die am besten untersuchten langsam
wachsenden bakteriellen Subpopulationen. Neben dem langsamen Wachstum zeigen die
SCVs von S. aureus ebenso wie die SCVs von P. aeruginosa eine erhöhte Resistenz
gegenüber Antibiotika und zusätzlich die Fähigkeit zur Persistenz in Endothelzellen
(BALWIT et al. 1994). Die Ursache für diesen SCV-Morphotyp scheint ein Auxotrophismus
17 SCHRIFTTUM
zu sein, da exogenes Hämin oder Menadion den Wildphänotyp wieder herstellen konnte
(BALWIT et al. 1994; PROCTOR et al. 1995). Die SCVs von P. aeruginosa scheinen
allerdings keine auxotrophen Mutanten zu sein. Denn weder eine Supplementation mit
Hämin, Menadion oder Aminosäuren führte zu einem Phänotypwechsel (HÄUSSLER et al.
1999a).
In den nachfolgenden Untersuchungen von HÄUSSLER et al. (2003a) konnte eine
autoaggregative und hyperpilierte Subgruppe von P. aeruginosa SCVs aus dem
Respirationstrakt von CF-Patienten identifiziert werden. Es scheint, als werden sie in der
einzigartigen Umwelt der CF-Lunge selektioniert. Diese Morphotypen zeigten im Gegensatz
zum klonalen Wildtyp ein autoaggregatives Wachstumsverhalten in Flüssigkultur sowie eine
erhöhte Fähigkeit zur Biofilmbildung und Twitching-Motilität. Elektronenmikroskopische
Aufnahmen dieser hoch adhärenten SCVs im Vergleich zum klonalen Wildtyp und der
Revertante zeigten eine vermehrte Expression von Pili. Während bei den Wildtypen keine
oder nur sehr wenige Pili vorgefunden wurden, wiesen die Revertanten eine noch höhere
Pili-Expression auf als die SCVs. Mit dem Northern Blot konnte eine erhöhte Expression des
pilA-Gens bei der SCV und der Revertante des P. aeruginosa Stammes 20265 festgestellt
werden. Das pilA-Gen kodiert die strukturelle Untereinheit der Typ IV Pili. Zusätzlich zeigten
die SCVs ihre höhere Fitness und vermutlich einen selektiven Vorteil in der späten
stationären Phase des Wachstums in Flüssigkultur, während der Wildtyp und die Revertante
in der exponentiellen Phase dominierten. HÄUSSLER et al. (2003a) vermuten, dass das
Wachstum der SCVs durch begrenzte Nährstoffbedingungen in der CF-Lunge begünstigt
wird.
RAINEY u. TRAVISANO (1998) konnten mit in vitro Studien das Auftreten phänotypischer
Varianten in einer heterogenen Umwelt für P. fluorescens belegen. Dabei stellten die Autoren
Mutation und Selektion als Ursache für die Entstehung der verschiedenen Phänotypen in den
Vordergrund. So brachte ein einzelner Genotyp von P. fluorescens in einer heterogenen
Umwelt verschiedene und morphologisch eindeutig voneinander getrennte Phänotypen
hervor. Es entstand eine große Vielfalt, die allein durch Selektion aufrecht erhalten wird und
die bakterielle Population befähigt, Nischen zu besetzen.
18 SCHRIFTTUM
Untersuchungen bei P. aeruginosa von OLIVER et al. (2000) konnten die Studien von
RAINEY u. TRAVISANO (1998) unterstützen. Mutation und Selektion scheinen als
treibende Kräfte für die Etablierung von so genannten Nischenspezialisten in der chronisch
infizierten CF-Lunge verantwortlich zu sein und so eine Adaptation an die Bedingungen in
diesem besonderen Habitat zu ermöglichen. Denn in 36% der untersuchten Lungen von
CF-Patienten wurden so genannte Hypermutatoren von P. aeruginosa gefunden, die für Jahre
in den meisten Patienten persistieren. Diese Hypermutatoren zeigten eine Deletion in der
mutS-Genregion.
Während als Ursache für den mukoiden Phänotyp von P. aeruginosa Punktmutationen
gefunden wurden, wurde für die Entstehung des SCV-Phänotyps ein Phasenvariations-
mechanismus vermutet. Phasenvariationen sind Ereignisse, die über Umwelteinflüsse
reguliert werden (HENDERSON et al. 1999). Ein Beispiel für eine Phasenvariation ist die
jeweilige Expression von zwei möglichen Flagellintypen: H1 oder H2 bei Salmonella
typhimurium. In einer Zelle wird immer nur ein Flagellintyp exprimiert. Es entsteht eine
Phasenvariation, die in diesem Fall durch eine Inversion der DNA verursacht wird (VON
BERG 2001). Weitere Strukturen bei gramnegativen Bakterien, deren Expression durch eine
Phasenvariation reguliert wird, sind z. B. Fimbrien, Außenmembranproteine und
Lipopolysaccharide (HENDERSON et al. 1999). Somit tragen Phasenvariationen bei
pathogenen Bakterien zur Adhärenz und Virulenz bei.
DÉZIEL et al. (2001) konnten aus dem Biofilm des P. aeruginosa Stammes 57RP einen
hyperpilierten und hoch adhärenten SCV-Phänotyp in vitro isolieren. Interessanterweise
zeigten die 57RP SCVs trotz einer Typ IV Hyperpilierung eine verminderte Twitching-
Motilität. Zudem waren die flagellenabhängigen Schwimm- und Schwärmbewegungen sowie
die Chemotaxis beeinträchtigt. Die 57RP SCVs wiesen eine erhöhte Fähigkeit zur
Biofilmbildung auf, die mit einer starken Adhärenz zu abiotischen Oberflächen, erhöhter
Hydrophobizität und Autoaggregation einherging. Die Autoren vermuten, dass das
Vorkommen dieser Varianten in der ökologischen Nische des Biofilms durch einen
Phasenvariationsmechanismus reguliert wird.
Beim Phänotypwechsel von einer antibiotikaresistenten und autoaggregativen rauen SCV
des P. aeruginosa-Stammes PA14 zur Wildtyp-Revertante wurde ebenfalls ein Phasen-
19 SCHRIFTTUM
variationsmechanismus vermutet (DRENKARD u. AUSUBEL 2002). Die SCVs entstanden,
indem der Wildtyp von PA14 auf Kanamycin-haltigen LB-Platten kultiviert wurde. Auch
diese SCVs besaßen im Gegensatz zum Wildtyp eine erhöhte Fähigkeit zur Biofilmbildung.
Zudem wurden Resistenzen gegen Antibiotika, wie Amikacin, Carbenicillin, Gentamicin,
Tobramycin und Tetrazyklin festgestellt. Dies führte zu der Vermutung, dass die erhöhte
Fähigkeit zur Biofilmbildung und die Antibiotikaresistenz der PA14 SCVs koreguliert
werden. Ohne die Zugabe von Antibiotikum waren diese SCVs allerdings nicht stabil und
revertierten zu großen, glatten Kolonien. In dieser Studie wurde das Regulatorgen pvrR
identifiziert, welches für den phänotypischen Variant-Regulator (PvrR) kodiert. Die Autoren
vermuten, dass dieses Protein den phänotypischen Switch über weitere Faktoren reguliert.
Eine Überexpression des pvrR-Gens verlieh der rauen SCV wieder die Eigenschaften des
Wildtyps. Jedoch wurde durch ein Knockout des pvrR-Gens kein phänotypischer Switch vom
Wildtyp zur rauen SCV erreicht. Weitere Untersuchungen konnten das pvrR-Gen in der
Mehrzahl der getesteten CF- und Klinikisolate sowie in Laborstämmen von P. aeruginosa
nachweisen.
2.8 Zielsetzung der Arbeit
Thema der Arbeit ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die zu dem Phänotyp der
so genannten small colony variants (SCVs) bei P. aeruginosa in der chronisch infizierten
CF-Lunge führen. Für P. fluorescens konnten in vitro Studien das Auftreten phänotypischer
Varianten in einer heterogenen Umwelt belegen. Es wurde bewiesen, dass diese
Differenzierung durch Mutation entsteht und durch natürliche Selektion aufrecht erhalten
wird (RAINEY u. TRAVISANO 1998). Vor diesem Hintergrund entstand die Hypothese,
dass Mutation und natürliche Selektion die treibenden Kräfte für die Entstehung der
phänotypischen Varianten in dem heterologen und sich ständig wechselndem Habitat der
CF-Lunge sind.
Um einzelne Gene zu identifizieren, deren Mutationen zu einem phänotypischen Switch
bei P. aeruginosa führen, wurde eine Transposonmutagenese durchgeführt, für die ein schnell
wachsender Phänotyp (Wildtyp) von P. aeruginosa und seine klonale autoaggregative SCV
verwendet wurden. Bei beiden Morphotypen handelt es sich um Isolate aus der CF-Lunge.
20 MATERIALIEN UND METHODEN
3. Materialien und Methoden
3.1 Materialien
3.1.1 Bakterienstämme
In dieser Arbeit wurden drei Phänotypen des klinischen Stammes 20265 von Pseudomonas
aeruginosa verwendet (Abb. 3). Die small colony variant (SCV) und ihr schnell wachsender
klonaler Wildtyp (WT) wurden aus dem Respirationstrakt (Sputum) eines chronisch
infizierten CF-Patienten, der sich regelmäßig in der Pädiatrischen Pneumologie der MHH
vorgestellt hat, isoliert und im Institut für Medizinische Mikrobiologie und
Krankenhaushygiene der MHH identifiziert. Die schnell wachsende Revertante (REV) wurde
in vitro durch Passagieren in BHI-Medium aus der SCV generiert. In der Pulsfeld-
Gelelektrophorese konnte kein Unterschied der SpeI geschnittenen genomischen DNA
festgestellt werden, was auf den klonalen Ursprung der drei Phänotypen hinweist
(HÄUSSLER et al. 1999a). Die SCV 20265 gehört zu einer Subgruppe von autoaggregativen
und hyperpilierten SCVs, die in der Arbeitsgruppe Steinmetz über Proteom- und
Transkriptomanalysen (WEHMHÖNER et al. 2003; VON GÖTZ et al. 2004) sowie mit einer
Untersuchung auf Biofilmbildung (HÄUSSLER et al. 2003a) sehr gut charakterisiert wurde.
Weitere verwendete klinische Isolate von P. aeruginosa sind die Stämme 10, 13, 32, 65,
8226, 74861 und 75962 mit dem Morphotyp der SCV, isoliert aus dem Respirationstrakt von
CF-Patienten (HÄUSSLER et al. 1999a).
21 MATERIALIEN UND METHODEN
WT SCV REV
Abbildung 3: Wachstum der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante des P. aeruginosa-
Stammes 20265 auf Agar-Platten.
Koloniemorphologie des Wildtyps (WT) und der klonalen SCV und Revertante (REV) auf Columbia-
Blutagar nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C.
3.1.2 Medien für die Bakterienanzucht
• Luria Bertani Bouillon (LBB): 1% Bacto-Trypton, 0.5% Bacto-Hefeextrakt, 0.5% NaCl,
pH 7.5
• Luria Bertani (LB)-Agar: LBB mit 1.5% Bacto-Agar
• Columbia-Agar mit 5% Schafblut
• Müller-Hinton-Agar: 30% Rinderinfusion, 1.75% Casaminosäuren, 0.15% Stärke, 1.7%
Agar, pH 7.3
• Vogel-Bonner-Medium: 0.3 mM MgSO4 × 7 H2O, 5 mM Zitronensäure × H2O, 14 mM
H5NNaO4P × 4 H2O, 18 mM K2HPO4 × 3 H2O, 213 mM Zitronensäure
• Twitching-Agar: LBB mit 1% Bitek-Agar
3.1.3 Puffer und Lösungen
• 6 × Farbmarker für DNA-Agarosegele: 0.25% Bromphenolblau, 0.25% Xylencyanol, 40%
Saccharose
• 5 × Laufpuffer für RNA-Agarosegele: 50 mM Na-acetat, 0.1 M Morpholinopropan-
sulfonsäure (MOPS), 5 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA), pH 7.0 mit NaOH
eingestellt
22 MATERIALIEN UND METHODEN
• Probenauftragspuffer für RNA-Agarosegele: 2.2 M 37% Formaldehyd, 10 mM EDTA,
20% Glycerol absolut, 50% Formamid, 50 µg/ml Ethidiumbromid, 0.2% Bromphenolblau
• Puffer A: 10 mM Kaliumphosphatpuffer, 140 mM NaCl, pH 7.4
• 10 × Tris-Borsäure-EDTA (TBE)-Puffer: 890 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan
(Tris), 890 mM H3BO3, 20 mM EDTA, pH 8.0
3.1.4 Molekularbiologische Fertigprodukte
• DIG DNA Labeling and Detection Kit, Roche Diagnostics
• DIG Easy Hyb Granules, Roche Molecular Biochemicals
• DNA and Gel Band Purification Kit, Amersham Biosciences
• DNeasy Tissue Kit, Qiagen
• Plasmid Midi Kit, Qiagen
• Qiaprep Spin Miniprep Kit, Qiagen
• RNAprotect Bacteria Reagent, Qiagen
• RNeasy Mini Kit, Qiagen
• Ultrapure dNTP Set, Amersham Biosciences
3.1.5 Enzyme und Molekulargewichtsstandards
• ApaI, T4-DNA-Ligase, HindIII, NlaIII, NsiI, PvuII, SacI, XbaI,
New England Biolabs
• Thermus aquaticus (Taq) Polymerase, Sigma
• EZ::TN Transposase, Epicentre
• Phosphatase, alkaline (AP), Roche Diagnostics
• RNase A, Qiagen
• 1 kb DNA-Leiter, RNA-Leiter, New England Biolabs
• Digoxigenin (DIG)-markierter DNA-Längenstandard III, DIG-markierter RNA-
Längenstandard III, Roche Diagnostics
23 MATERIALIEN UND METHODEN
3.1.6 Oligonukleotide
Alle Oligonukleotide wurden soweit nicht anders erwähnt von der Firma MWG Biotech im
Auftrag hergestellt.
• Linker 1: (Annealing-Temperatur: 58 °C)
5′-TTT CTG CTC GAA TTC AAG CTT CTA ACG ATG TAC GGG GAC ACA TG-3′
• Linker 2: (Annealing-Temperatur: 58 °C)
5′-TGT CCC CGT ACA TCG TTA GAA CTA CTC GTA CCA TCC ACA T-3′
Modifikation: 5′ Phosphat
• Y-Linker Primer: (Annealing-Temperatur: 58 °C)
5′-CTG CTC GAA TTC AAG CTT CT-3′
• SqFP: (Annealing-Temperatur: 58 °C)
5′-GCC AAC GAC TAC GCA CTA GCC AAC-3′
Epicentre, MWG Biotech
• SqRP: (Annealing-Temperatur: 58 °C)
5′-GAG CCA ATA TGC GAG AAC ACC CGA GAA-3′
Epicentre, MWG Biotech
• SqFP-i: (Annealing-Temperatur: 60 °C)
5′-GTT GGC TAG TGC GTA GTC GTT GGC-3′
• SqRP-i: (Annealing-Temperatur: 60 °C)
5′-TTC TCG GGT GTT CTC GCA TAT TGG CTC-3′
• PA1587FP1XbaI: (Annealing-Temperatur: 64 °C)
5′-ATA TTC TAG AAT GAG CCA GAA ATT CGA CGT GGT AGT GAT TGG-3′
• PA1587RP1HindIII: (Annealing-Temperatur: 64 °C)
5′-TAT AAA GCT TTC AGC GCT TCT TGC GGT TGG CGA T-3′
• PA2128FP: (Annealing-Temperatur: 59 °C)
5′-TGG CGG CAA ACA CTA TCA CAT TCA-3′
• PA2128RP: (Annealing-Temperatur: 59 °C)
5′-GGG TTG CCG CCG ACG CTA TC-3′
24 MATERIALIEN UND METHODEN
3.1.7 Vektoren
• EZ::TN pMOD-3<R6Kγori/MCS> Transposon Construction Vector (Gentamicin-
Resistenz (GmR) auf dem Transposon), Epicentre
• pBBR1MCS-5 (GmR) (KOVACH et al. 1994; KOVACH et al. 1995)
• pUCP20 (OLSEN et al. 1982; West et al. 1994)
• pED202 (pUCP19::pvrR, 3.5 kb PstI Fragment aus P. aeruginosa PA14)
von Frederick M. Ausubel der Arbeitsgruppe Häußler (Material, Transfer, Agreement
liegt vor) zur Verfügung gestellt (DRENKARD u. AUSUBEL 2002)
3.2 Methoden
3.2.1 Anzucht von Bakterien
Die Anzucht der verwendeten Bakterienstämme wurde soweit nicht anders angegeben, auf
Columbia-Blutagarplatten und LB-Platten gegebenfalls mit Antibiotikazusätzen bei 37 °C
durchgeführt.
3.2.2 Einfrieren und Entsorgen von Bakterien
Bakterien wurden als Suspension in steriler LBB mit 10% Glyzerin bei –80 °C eingefroren.
Nicht mehr benötigte Platten, Suspensionen sowie verunreinigtes Gebrauchsmaterial wurde
grundsätzlich autoklaviert.
3.2.3 Isolierung genomischer DNA aus Pseudomonas aeruginosa
Die Präparation genomischer DNA wurde nach Anweisung des Herstellers (Qiagen, DNeasy
Tissue Handbook) durchgeführt. Als Ausgangsmaterial wurde eine Bakterien-ÜN-Kultur in
einem Volumen von 5 ml in LBB verwendet. Modifiziert wurden die Anweisungen des
Herstellers insoweit, dass zwischen dem ersten Zentrifugationsschritt und der Zugabe des
25 MATERIALIEN UND METHODEN
Lysispuffer ATL ein zusätzlicher Arbeitsschritt für die Entfernung des von P. aeruginosa
produzierten Exopolysaccharides Alginat vorgenommen wurde, um den ungehinderten
Durchfluss durch die Säule zu gewährleisten. Dazu wurden die Bakterien nach der ersten
Zentrifugation in 500 µl Wasser bidest. überführt und so lange resuspendiert, bis eine
homogene Bakteriensuspension entsteht. Nach einer Zentrifugation von 1 min bei 14926 x g
konnte der Überstand abgenommen und verworfen werden. Dieser Schritt wurde mindestens
dreimal wiederholt, bis kein Alginat auf dem Bakterienpellet mehr sichtbar ist. Anschließend
konnte der Lysispuffer ATL zugegeben werden.
3.2.4 Isolierung von Gesamt-RNA
Sämtliche Lösungen wurden mit autoklavierten Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem
Wasser bidest. in ebenfalls autoklavierten Glasbehältnissen angesetzt und aufbewahrt.
Hitzelabile Geräte, wie die Pufferkammer und Metallgerätschaften wurden in absolutem
Ethanol getaucht oder gespült. Genauso wurde mit der Gelkammer verfahren.
Für die Isolierung der Gesamt-RNA aus den Bakterien wurde als Ausgangsmaterial eine 5 ml
Vorkultur auf eine OD600 von 0.1 in LBB eingestellt und bei 37 °C unter Schütteln über Nacht
(ÜN) inkubiert. Die Bakterienzellen wurden anschließend bei einer OD600 von 0.8 in einem
Volumen von 1.5 bis 2 ml geerntet und nach Anweisung des Herstellers (Qiagen, RNeasy
Mini Handbook und RNAprotect Bacteria Reagent Handbook) präpariert. Die RNA wurde bei
–80 °C aufbewahrt.
3.2.5 Plasmidpräparationen
a) Midi-Plasmidpräparation: Die Midi-Plasmidpräparation wurde nach Anweisung des
Herstellers (Qiagen, Plasmid Purification Handbook) mit Qiagen-tip 100 durchgeführt.
Als Ausgangsmaterial wurde eine LBB ÜN-Kultur von 100 ml verwendet.
b) Mini-Plasmidpräparation: Die Mini-Plamidpräparation wurde nach Anweisung des
Herstellers (Qiagen, Qiaprep Miniprep Handbook) durchgeführt. Dazu wurden 5 ml einer
LBB ÜN-Kultur als Ausgangsmaterial verwendet.
26 MATERIALIEN UND METHODEN
c) Quick & Dirty-Plasmidpräparation: 1.5 ml einer 4 ml ÜN-Kultur wurde für 1 min bei
14926 x g zentrifugiert und das Pellet in 100 µl Puffer P1 (Qiagen) resuspendiert. Nach
Zugabe von jeweils 100 µl Puffer P2 (Qiagen) und Puffer P3 (Qiagen) wurde erneut für 4
min bei 14926 x g zentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde in ein neues Gefäß
überführt und mit 250 µl Isopropanol 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 7 min
Zentrifugation (14926 x g) wurde die DNA mit 500 µl 70%igem Ethanol gewaschen
(Zentrifugation: 4 min bei 14926 x g), getrocknet und in 20 µl Ampuwa unter Schütteln
für 1-2 Stunden gelöst.
3.2.6 Elektrophoretische Auftrennung von DNA
Die elektrophoretische Auftrennung von DNA zu analytischen Zwecken erfolgte in 1%igen
Agarosegelen in 1 × TBE-Puffer bei einer Spannung von 80-120 Volt. Vor dem Auftragen
wurde die DNA mit einem Sechstel des Gesamtvolumens glyzerinhaltigen Laufpuffers
versetzt. Nach elektrophoretischer Auftrennung wurden die Agarosegele für 10-15 min in
einer Ethidiumbromidlösung (2 mg/l) inkubiert, um die DNA unter ultraviolettes (UV)-Licht
sichtbar machen zu können. Die Größe von DNA-Fragmenten wurde mit einem
Größenstandard von 500 bis 104 Basenpaaren ermittelt.
3.2.7 Elektrophoretische Auftrennung von RNA
Die elektrophoretische Auftrennung der Gesamt-RNA erfolgte in 1%igen Agarosegelen in 1 ×
Laufpuffer und 0.5 M 37% Formaldehydlösung, welches beides erst nach dem Aufkochen
und anschließendem Abkühlen auf 60 °C im Wasserbad der Agarose zugegeben wurde, bei
einer Spannung von 120 Volt. Vor dem Auftragen wurde der Gesamt-RNA ein
Probenauftragspuffer in einem Verhältnis von 1:2 zugesetzt und zur Denaturierung für
10-15 min bei 65 °C aufgekocht und auf Eis abgekühlt. Ebenso wurde mit dem
RNA-Längensstandard und dem DIG-markierten RNA-Längenstandard verfahren. Die
Auftrennung erfolgte aufgrund des toxischen Formaldehyds unter einem Abzug. Durch die im
Probenauftragspuffer enthaltene Ethidiumbromidlösung (50 µg/ml) wurde die RNA sofort
nach der Auftrennung unter UV-Licht sichtbar gemacht.
27 MATERIALIEN UND METHODEN
3.2.8 Reinigung von Nukleinsäuren
Die Reinigung von Nukleinsäuren wurde nach Anweisung des Herstellers (Amersham
Biosciences) mit dem PCR DNA and Gel Band Purification Kit durchgeführt.
3.2.9 Restriktionsspaltung von Nukleinsäuren
DNA wurde mit Restriktionsenzymen in einem Volumen von 10-50 µl in dem vom Hersteller
mitgelieferten Puffer für 1 bis 2 Stunden (kurze DNA-Fragmente) oder ÜN (genomische
DNA) bei der empfohlenen Temperatur verdaut. Die Enzymtätigkeit wurde je nach
Anwendung durch hohe Temperatureinwirkung oder Aufreinigung (3.2.8) abgestoppt. Die
Vollständigkeit des Verdaus wurde durch Agarose-Gelelektrophorese (3.2.6) überprüft.
Pro µg DNA wurden etwa 2-10 Unit (U) Enzym eingesetzt.
3.2.10 Ligation von Nukleinsäuren
Die Ligation von DNA-Fragmenten wurde in einem Volumen von 20-50 µl mit der T4-DNA-
Ligase in dem vom Hersteller mitgelieferten Puffer über Nacht bei 16 °C im Wasserbad
durchgeführt. Es wurden 100-200 ng DNA mit 400-800 U Enzym umgesetzt.
3.2.11 Herstellung von CaCl2-kompetenten E. coli DH5α-Zellen
100 ml LBB wurden 1:100 mit einer ÜN-Kultur beimpft und bei 37 °C unter Schütteln bis zu
einer OD650 von 0.3 bebrütet. Die Zellen wurden für 15 min auf Eis abgekühlt und
anschließend für 10 min bei 4 °C und 2600 × g zentrifugiert. Nach dreimaligem Waschen mit
10 ml eiskaltem 0.1 M CaCl2 und folgender Zentrifugation (10 min, 800 × g, 4 °C) wurde das
Pellet in 10 ml eiskaltem 0.1 M CaCl2 resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Die
Bakterien wurden ein letztes Mal zentrifugiert (10 min, 800 × g, 4 °C), in 2 ml eiskaltem
CaCl2 aufgenommen, mit 1 ml 60% Glyzerin in H2O versetzt und in Aliquots von 200 µl
zunächst in flüssigem Stickstoff und schließlich bei –80 °C eingefroren.
28 MATERIALIEN UND METHODEN
3.2.12 Transformation von CaCl2-kompetenten E. coli DH5α-Zellen
Ein Aliquot der kompetenten Zellen wurde auf Eis aufgetaut und die zu transformierende
DNA wurde in einer Menge von maximal 100 ng zu den Zellen gegeben. Nach 20 min
Inkubation auf Eis wurde die Mischung einem Hitzepuls von 42 °C für 90 Sekunden im
Wasserbad ausgesetzt. Es folgten weitere 2 min auf Eis, bevor 1 ml LBB zu den Zellen
gegeben wurde. Nach 1 Stunde Inkubationszeit bei 37 °C unter Schütteln wurden die
Bakterien pelletiert und auf LB-Antibiotikaplatten ausplattiert. Die Inkubation erfolgte für 24
Stunden bei 37 °C.
3.2.13 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Zur Amplifikation von DNA mithilfe der PCR (SAIKI et al. 1988) wurden als Primer Oligo-
nukleotide (3.1.6) mit einer Annealing-Temperatur zwischen 58 °C und 64 °C eingesetzt und
die Template-DNA mithilfe der Taq-Polymerase vervielfältigt. Der 50 µl Standard-Reaktions-
ansatz hatte folgende Zusammensetzung:
36.0 µl Ampuwa
5.0 µl Desoxynukleotidtriphosphat (dNTPs) (c = 2mM)
5.0 µl 10 × PCR-Puffer
1.0 µl Primer a (c = 100 pmol/µl)
1.0 µl Primer b (c = 100 pmol/µl)
1.0 µl Template-DNA
1.0 µl Taq-Polymerase
Erfolgte die Amplifikation im Thermocycler Landgraf, wurden dem Reaktionsansatz 1-2
Tropfen Mineralöl hinzugegeben.
29 MATERIALIEN UND METHODEN
Die PCR lief unter folgenden Bedingungen ab:
1. initiale Denaturierung 180 s, 95 °C
2. Amplifikation a) Denaturierung 60 s, 95 °C
(30 Zyklen) b) Annealing 60 s, Temperaturen s. 3.1.6
c) Elongation 60 s, 72 °C
3. finale Elongation 300 s, 72 °C
3.2.14 Herstellung einer digoxigeninmarkierten DNA-Sonde
Zur Herstellung einer DIG-markierten DNA-Sonde wurde eine 50 µl PCR-Reaktion (3.2.13)
mit dem ca. 1.3 kb langem Produkt des EZ::TN Transposon aufgereinigt (3.2.8) und nach
elektrophoretischer Kontrolle im Agarosegel nach Anweisung des Herstellers (Roche
Diagnostics) präpariert.
3.2.15 Sequenzierung von Nukleinsäuren
1-5 µg der zu sequenzierenden DNA wurden von GATC Biotech AG im Auftrag sequenziert.
3.2.16 Isolierung des EZ::TN Transposon
Für die Klonierung einer Gentamicin-Resistenz in die multiple cloning site des EZ::TN
Transposon Construction Vectors wurde der Vektor mit dem Restriktionsenzym SacI in
einem Volumen von 10 µl verdaut (3.2.9) und aufgereinigt (3.2.8). Anschließend wurde das
mit Enzym behandelte DNA-Fragment mit einer Gentamicin-Resistenz codierenden DNA
(835 bp) aus dem Plasposon pTnMod-Ogm (AF061920) in einem Volumen von 20 µl ligiert
(3.2.10) und transfomiert (3.2.12).
Die Isolierung des EZ::TN Transposon aus dem EZ::TN Transposon Construction Vector
wurde nach Anweisung des Herstellers (Epicentre) mit dem Restriktionsenzym PvuII in
einem Volumen von 20 µl durchgeführt (3.2.9). Anschließend wurde der Ansatz ohne
Hitzeinaktivierung im Agarosegel auf 2 Geltaschen verteilt aufgetragen und nach der
30 MATERIALIEN UND METHODEN
elektrophoretischen Auftrennung (3.2.6) bei einem Molekulargewicht von 1,276 kb das
EZ::TN Transposon aus dem Agarosegel mit dem Skalpell heraus geschnitten, aufgereinigt
(3.2.8), in Ampuwa aufgenommen und im SpeedVac-Concentrator auf etwa 5-10 µl Volumen
ankonzentriert (100 µg/ml).
3.2.17 Transposonmutagenese
Zur Erhaltung einer Mutantenbank mit dem EZ::TN Transposon wurde eine Transposon-
Reaktionslösung nach Anweisung des Herstellers (Epicentre) erstellt. Dazu wurden 0.25 µl
der EZ::TN Transposon-DNA-Lösung (100µg/ml) mit 0.5 µl EZ::TN Transposase (0.5 U)
und 0.25 µl Glyzerin in dieser Reihenfolge gut vermischt und für 30 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Während dieser Inkubationszeit wurde zur Erstellung elektrokompetenter Zellen
das Exopolysaccharid Alginat von P. aeruginosa, welches die Effizienz der Elektroporation
deutlich senkt, entfernt. Dazu wurden die Bakterienzellen auf LB-Agar ÜN jeweils bei 37 °C
und 42 °C kultiviert. Anschließend wurde das gesamte Bakterienmaterial von den LB-Platten,
ohne dabei den Agar zu beschädigen, mit einer Öse abgenommen, in Wasser bidest.
resuspendiert und zentrifugiert (3.2.3). Nach der Entfernung des Alginats wurden die
Bakterienzellen mit einem Endvolumen von 40 µl in Wasser bidest. aufgenommen, mit dem
1 µl der Transposon-Reaktionslösung vermischt und für 2-3 min auf Eis inkubiert. Nach
Überführen in eine trockene und auf Eis gekühlte Elektroporationsküvette wurde die
Spannung mit den Einstellungen 2.5 kV und 200 Ω am Elektroporationsgerät angelegt. Die
Bakterien wurden in 1 ml auf Eis vorgekühlter LBB aufgenommen und 1 Stunde bei 37 °C
unter Schütteln inkubiert. Schließlich wurden die Bakterien auf Antibiotikaplatten (SCV
20265: 40 µg/ml Gentamicin, WT 20265: 200 µg/ml) ausplattiert und bei 37 °C für 48
Stunden inkubiert. Zum Nachweis des EZ::TN Transposons in einer Transposonmutante
wurde eine PCR (3.2.13) mit Oligonukleotiden (3.1.6) durchgeführt, die von den Sequenzier-
Primern des Herstellers (Epicentre) abgeleitet wurden und das EZ::TN Transposon
amplifizieren. Als Template diente die genomische DNA einer Transposonmutante.
31 MATERIALIEN UND METHODEN
3.2.18 Untersuchung der Transposonmutanten auf Autoaggregation
Das Vermögen von Autoaggregation der einzelnen Transposonmutanten wurde in flüssigem
Vogel-Bonner-Medium, modifiziert nach VOGEL u. BONNER (1956) untersucht. Die
Mutanten wurden nach 24 bis 48 Stunden Inkubationszeit bei 37 °C auf Blutagar mit einem
sterilen Wattetupfer entnommen und in 10 ml Vogel-Bonner-Medium überführt. Nach 24 bis
48 Stunden Inkubationszeit bei 37 °C im Inkubationsschüttler erfolgte eine visuelle
Überprüfung auf Autoaggregation.
3.2.19 Untersuchung der Transposonmutanten auf Motilität
Zur Untersuchung der einzelnen Transposonmutanten auf Twitching-Motilität wurden die
Mutanten nach 24 bis 48 Stunden bei 37 °C auf Blutagar mit einem sterilen Zahnstocher
entnommen und durch den Twitching-Agar bis auf dem Petrischalenboden verbracht
(DÉZIEL et al. 2001; HÄUSSLER et al. 2003a). Die Ausdehnung der Bakterien zwischen
Agar und Boden der Petrischale wurde im Vergleich mit WT, SCV und REV 20265 durch
Messung des Durchmessers nach 48 Stunden Inkubationszeit bei 37 °C ermittelt.
3.2.20 Southern Blot
Vor dem Transfer auf eine Nylonmembran wurde die genomische DNA jeweils mit den
Restriktionsenzymen ApaI und NsiI in einem Volumen von 20 µl verdaut (3.2.9) und
elektrophoretisch aufgetrennt (3.2.6). Zur Depurinisierung von DNA-Molekülen über einer
Länge von 5 kb wurde das Gel für 20 min in 0.25 M HCl inkubiert und anschließend
nacheinander je zweimal 30 min mit 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl denaturiert und mit 1 M Tris-
HCl, 3 M NaCl, pH 7.0 neutralisiert. Die Übertragung der DNA auf die Nylonmembran
erfolgte unter Ausnutzung der Kapillarkräfte mit 10 × Natriumchlorid/ Trinatrium-Citrat
(SSC) als Transferpuffer ÜN in einer Transferpyramide mit einer Pufferkammer. Für die
Transferpyramide wurde von unten nach oben in einer Sandwich-Anordnung zwei Lagen
puffergetränktes Filterpapier, Gel, Membran, zwei Lagen Filterpapier sowie ein Stapel
Papierhandtücher fest übereinander gelegt und schließlich mit einem Gewicht beschwert. Die
Geltaschen wurden auf der noch feuchten Nylonmembran markiert und die DNA durch
UV-cross-linking kovalent an die Membran gebunden. Als Vorbereitung für die
32 MATERIALIEN UND METHODEN
Hybridisierung wurde die Membran 30 min mit Hybridisierungspuffer bei 42 °C
prähybridisiert. Zu 5-10 ml frischer Hybridisierungslösung wurde 5 µl Sonde (3.2.14)
gegeben, die zuvor durch Aufkochen für 5 min und anschließendes rasches Abkühlen auf Eis
denaturiert wurde. Die Hybridisierung erfolgte bei 42 °C ÜN im Hybridisierungsofen. Am
nächsten Tag wurde die Membran 2 × 5 min in 2 × SSC, 0.1% Natriumdodecylsulfat (SDS)
bei Raumtemperatur und weitere 2 × 15 min in 0.1 × SSC, 0.1% SDS bei 68 °C im
Hybridisierungsofen gewaschen. Die Hybridisierungsereignisse wurden durch ein Antikörper-
Konjugat und dem Chemilumineszenzsubstrat CSPD nachgewiesen. Das CSPD ist ein
Substrat, welches durch die am Antikörper gebundene alkalische Phosphatase
dephosphoryliert wird und beim anschließenden Zerfall ein Lichtsignal produziert. Dieses
Licht wird auf einem Röntgenfilm nachgewiesen. Folgende Schritte sind für die Detektion bei
Raumtemperatur notwendig:
• 5 min waschen in Waschpuffer (Maleinsäurepuffer mit 0.3 % Tween-20)
• 30 min inkubieren in 1 × Blocking Reagenz (10 × Blocking Reagenz 1:10 verdünnt in
Maleinsäurepuffer)
• 30 min inkubieren in 1 × Blocking Reagenz mit 1:10000 verdünntem anti-DIG-AP-
Konjugat
• 2 × 15 min waschen in Waschpuffer
• 2-5 min äquilibrieren in Detektionspuffer
• 5 min CSPD 1:100 verdünnt in Detektionspuffer
• Einschweißen der Membran in Plastikfolie und Inkubation für 15 min bei 37 °C
• Exposition eines Röntgenfilms für 5 min bis 1 Stunde je nach Alter des CSPD
20 × SSC Maleinsäurepuffer 10 × Blocking Reagenz
3 M NaCl 0.1 M Maleinsäure Maleinsäurepuffer
0.3 M NaCitrat 0.15 M NaCl 10 % Blocking Reagenz
pH 7.0 pH 7.5
33 MATERIALIEN UND METHODEN
Detektionspuffer
0.1 M Tris-HCl
0.1 M NaCl
pH 9.5
3.2.21 Northern Blot
Die zu analysierende Gesamt-RNA wurde in einer Menge von etwa 9-11 µg in einem
denaturierenden Formaldehyd-Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (3.2.7) und unter
Ausnutzung von Kapillarkräften mit 20 × SSC (3.2.20) als Transferpuffer für mindestens 20
Stunden in einer Transferpyramide (3.2.20) auf eine positiv geladene Nylonmembran
übertragen. Das zu blottende Gel wurde vor dem Transfer in 20 × SSC für 2 × 15 min unter
Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert, um das Formaldehyd zu entfernen. Die
Pufferkammer wurde vor dem Aufbau der Transferpyramide mit absolutem Ethanol gespült.
Nach dem Blotvorgang wurde die Membran markiert, die RNA auf ihr kovalent fixiert und
schließlich eine RNA-DNA-Hybridisierung (3.2.20) durchgeführt. Das PCR-Produkt (3.2.13)
für die DIG-markierte DNA-Sonde (3.2.14) wurde mit spezifischen Primern (3.1.6)
amplifiziert. Um unspezifisch gebundene Sonde von der Membran zu entfernen, wurde die
Membran 5 min bei Raumtemperatur mit 6 × SSC, 0.3% SDS, 20 min bei 42 °C mit 2 × SSC,
0.3% SDS und 20 min bei 42 °C mit 0.2 × SSC, 0.3% SDS gewaschen. Die
Hybridisierungsereignisse wurden mit der Verbindung CDP-Star nachgewiesen.
• 5 min waschen in Puffer 1
• 30 min inkubieren in Puffer 1 mit 0.5% Blocking Reagenz
• 30 min inkubieren mit 1:10000 verdünntem anti-DIG-AP-Konjugat in Puffer 1 mit 0.5%
Blocking Reagenz
• 3 × 15 min waschen in Puffer 1
• 2 min äquilibrieren in Puffer 3 (Puffer aufgrund Präzipitat 2 × filtrieren)
• 5 min CDP-Star 1:500 verdünnt in Puffer 3
Die Membran wurde wiederum in eine Plastikfolie eingeschweißt und eine Exposition für 15
min bis 1 Stunde durchgeführt.
34 MATERIALIEN UND METHODEN
Puffer 1 Puffer 3
3 M NaCl 0.1 M NaCl
0.1 M Tris 0.1 M Tris
0.3 % Tween-20 0.05 M MgCl2
pH 8.0 pH 9.5
3.2.22 Identifizierung der Transposon flankierenden DNA-Sequenz mittels
eines Y-Linker
Um die Transposon flankierende DNA-Sequenz effizient zu amplifizieren (KWON u. RICKE
2000) und zu sequenzieren, wurde als erster Schritt die genomische DNA einer Transposon-
mutante mit dem Restriktionsenzym NlaIII in einem Volumen von 50 µl ÜN verdaut (3.2.9)
und anschließend bei 65 °C für 20 min inaktiviert. Es wurden etwa 1-5 µg DNA mit 5 U
Enzym umgesetzt. Durch das Restriktionsenzym NlaIII entsteht an den Schnittstellen ein aus
den 4 bp CATG bestehender Überhang. Zur Herstellung des Y-Linker, der als bekannte
DNA-Sequenz an die unbekannte Transposon flankierende DNA-Sequenz ligiert wird,
wurden 9 µl Linker 2 (350 ng/µl) und 9 µl Linker 1 (350 ng/µl) (3.1.6) in einem Volumen von
29 µl bei 95 °C für 4 min erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Y-Linker
besitzt am 3‘-Ende einen 4 bp großen Überhang, der komplementär zu den durch NlaIII
erzeugten Enden ist. Am 5‘-Ende des Y-Linkers ist die Sequenz über einer Länge von 19 bp
nicht zueinander komplementär und mit dieser Region ist die Sequenz des Y-Linker identisch.
Somit kann er nicht direkt an den Linker binden. Die Ligation der mit NlaIII behandelten
Fragmente genomischer DNA mit dem Y-Linker wurde in einem Volumen von 20 µl bei
Raumtemperatur ÜN durchgeführt (3.2.10). Dabei verbinden sich die Enden der DNA-
Fragmente mit denen am 3‘-Ende des Y-Linkers. Es wurden 5 µl fragmentierte genomische
DNA und 5 µl des Y-Linker mit 40 U Enzym umgesetzt. Der Ligationsansatz wurde
anschließend auf 200 µl mit Ampuwa aufgefüllt, bei 65 °C für 12 min inaktiviert und für
folgende Amplifizierungen bei –20 °C aufbewahrt.
Die PCR zur Amplifizierung der unbekannten DNA-Sequenz zwischen dem Y-Linker und
Transposon wurde mit den zur Sequenzierung bestimmten Primer SqFP oder SqRP (3.1.6) in
einem Volumen von 50 µl durchgeführt (Abb. 4).
35 MATERIALIEN UND METHODEN
Reaktionsansatz: 34.8 µl Ampuwa
3.0 µl dNTPs (c = 2 mM)
5.0 µl 10 × PCR-Puffer
1.0 µl Primer Y-Linker (c = 100 pmol/µl)
1.0 µl Primer SqFP/ SqRP (c = 100 pmol/µl)
5.0 µl Ligationsansatz
0.2 µl Taq Polymerase (1 U)
Die PCR lief unter den Bedingungen wie unter (3.2.13) beschrieben ab.
1.5 kb__
1.0 kb__
0.5 kb__
Abbildung 4: Agarosegel mit aufgereinigten PCR-Produkten.
In dieser Abbildung ist die elektrophoretische Trennung aufgereinigter PCR-Produkte von einigen
Transposonmutanten für die Squenzierung und Identifzierung der Transposon flankierenden
DNA-Sequenz mittels eines Y-Linkers im Agarosegel dargestellt. Als Marker wurde ein
Größenstandard mit DNA-Fragmenten von 0.5 bis 10 kb aufgetragen.
DNA-Lei
ter
Negat
iv-K
ontro
lle
SCV-Tn5
-M R
6
SCV-Tn5
-M R
7
SCV-Tn5
-M 1
C
SCV-Tn5
-M 1
D
SCV-Tn5
-M 1
L
SCV-Tn5
-M 2
E
SCV-Tn5
-M 2
L
SCV-Tn5
-M 3
D
SCV-Tn5
-M 3
E
SCV-Tn5
-M 3
F
36 MATERIALIEN UND METHODEN
3.2.23 Identifizierung der Transposoninsertion
Zur Identifizierung des zerstörten Gens wurde zuerst die NlaIII-Schnittstelle, die sich
zwischen dem Transposon und dem Y-Linker genau einmal befinden sollte, mithilfe des
Computerprogramms Clone Manager 6 (Version 6.00, Scientific & Educational Software) auf
ihre Position innerhalb der sequenzierten DNA überprüft. Anschließend wurde die Sequenz
mit dem Pseudomonas Genom-Projekt (http://www.pseudomonas.com) auf der Aminosäure-
und Nukleotidebene mit den Sequenzen des Pseudomonas aeruginosa-Stammes PAO1
verglichen. Blieb die Datenbanksuche auf diese Weise erfolglos, wurde eine weitere Analyse
des Gens mit GenomeNet, Blast (http://www.genome.jp) durchgeführt.
3.2.24 Komplementation der Transposonmutante 25/C1
Für die Komplementation wurde das lpdG-Gen (PA1587) des WT 20265 mittels PCR mit
spezifischen Primern (3.1.6), auf den sich Restriktionsschnittstellen für HindIII und XbaI
befinden, amplifiziert (3.2.13) und aufgereinigt (3.2.8). Als Template diente die genomische
DNA des WT 20265. Das PCR-Produkt und der Klonierungsvektor pUCP20 mit einer
Ampicillin-Resistenz wurden jeweils mit den genannten Restriktionsenzymen in einem
Volumen von 50 µl verdaut (3.2.9). Nach der Reinigung (3.2.8) wurde der geschnittene
Vektor mit 4 U alkaliner Phosphatase in einem Volumen von 50 µl für 1 Stunde bei 37 °C im
Wasserbad umgesetzt, um die Phosphatreste am Vektor zu entfernen und eine Ligation mit
sich selbst zu verhindern. Auch hier erfolgte anschließend eine Aufreinigung. Die folgende
Ligation wurde in einem Volumen von 50 µl durchgeführt (3.2.10). 10 µl des aufgereinigten
Ligationsansatzes wurde darauf folgend in E. coli DH5α-Zellen transformiert (3.2.12). Das
Plasmid der auf Antibiotikaplatten gewachsenen Transformanten wurde präpariert (3.2.5b)
und zur Kontrolle erneut mit XbaI und HindIII geschnitten (3.2.9). Das erfolgreich in den
Vektor pUCP20 klonierte Gen wurde in die Transposonmutante 25/C1 elektroporiert (3.2.17)
und auf LB-Agar mit 300 µg/ml Carbenicillin ausplattiert. Nach 48 Stunden Inkubationszeit
bei 37 °C wurde die komplementierte Mutante zur Überprüfung des Phänotyps und
Koloniewachstums auf Blutagar mit entsprechendem Antibiotikum ausgestrichen und zur
eindeutigen Identifizierung 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Als Kontrolle wurde der Vektor
pUCP20 ohne lpdG-Gen in die 25/C1 transformiert.
37 MATERIALIEN UND METHODEN
3.2.25 Transformation des pvrR-Gens in die Transposonmutante 25/C1
Zur in trans Expression des von DRENKARD u. AUSUBEL (2002) beschriebenen Phänotyp-
Variant-Regulator (pvrR) in der Transposonmutante 25/C1 wurde das pvrR-Gen auf dem
Vektor pED202 mit einer Ampicllin-Resistenz jeweils in die Bakterienzellen elektroporiert
(3.2.17) und auf LB-Agar mit 300 µg/ml Carbenicillin ausplattiert. Nach 72 Stunden
Inkubationszeit bei 37 °C wurde die 25/C1 zur Überprüfung des Phänotyps und
Koloniewachstums auf Blutagar mit entsprechendem Antibiotikum ausgestrichen und für 48
Stunden bei 37 °C inkubiert. Als Kontrolle wurde der Vektor pUCP20 ohne dem pvrR-Gen
mit demselben Verfahren in die 25/C1 transformiert.
3.2.26 Elektronenmikroskopische Darstellung von Fimbrienstrukturen und
Flagellen
Zur elektronenmikroskopischen Untersuchung auf Fimbrienstrukturen und Flagellen durch M.
Rhode in der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (GBF) in Braunschweig
durchgeführt, wurden klinische CF-Isolate (3.1.1) mit dem Morphotyp der autoaggregativen
SCV (3.2.18) sowie sequenzierte Transposonmutanten aus der Transposon-Bank des WT
20265 verwendet. Für die Untersuchung wurden die Bakterien auf Twitching-Agarplatten für
3 Tage bei 28 °C inkubiert (3.2.19). Die sich in der Schnittstelle zwischen Agar und
Petrischalenboden befindlichen Bakterien wurden für 1 min in TE-Puffer (10mM Tris-HCl,
2mM EDTA, pH 6.9) resuspendiert und auf ein mit Kohlenstoff beschichtetes Formvar
Kupfergrid (Maschenweite: 300) in Form eines Tropfens verbracht. Anschließend wurde das
Grid mit TE-Puffer gespült und mit einer 2%igen Uranylacetat-Lösung (pH 4.5) versehen.
Die Proben wurden mit einem Zeiss Transmissions-Elektronenmikroskop EM910 bei einer
Beschleinigungsspannung von 80 kV untersucht.
38 ERGEBNISSE
4. Ergebnisse
4.1 Transposonmutagenese von Pseudomonas aeruginosa
Die Transposonmutagenese der Morphotypen WT und SCV des P. aeruginosa-Stammes
20265 wurde mit dem käuflichen EZ::TN Transposon (3.1.7) durchgeführt, welches auf
einem Tn5-Transposon basiert (GORYSHIN u. REZNIKOFF 1998; GORYSHIN et al. 2000).
Mit dieser Technologie werden Mutationen mit zufälliger Verteilung im Genom des
Bakteriums erzeugt. Gene, deren Mutation zu einem phänotypischen Switch bei dem WT
bzw. bei der SCV 20265 führen, sollten durch die Transposonmutagenese identifiziert
werden. Aufgrund der Eigenschaft von P. aeruginosa, auf Aminoglykoside empfindlich zu
reagieren, wurde zunächst zur späteren Selektion der Mutanten eine Gentamicin-
Resistenzkassette in die multiple cloning site des Transposons kloniert. Auf diese Weise
wurde ein effiziente Überprüfung der Mutanten ermöglicht.
Zur Optimierung der Transformationseffizienz wurden Transformationen des WT und der
SCV 20265 mit dem Vektor pBBR1MCS-5 (KOVACH et al. 1994; KOVACH et al. 1995)
mit einer Gentamicin-Resistenz durchgeführt. Dabei wurden zur Herstellung der
elektrokompetenten Bakterienzellen die gängigen Methoden ausprobiert. Eine besonders hohe
Menge an Bakterienmaterial von der Agarplatte zur Transposonmutagenese zu verwenden,
zeigte sich als die beste Methode (ENDERLE u. FARWELL 1998). Durch die Umsetzung des
gesamten Materials mindestens einer Agarplatte konnte die Mutantenausbeute auf etwa 200
Klone/ng DNA erhöht und somit die Effizienz der Transposonmutagenese optimiert werden.
Zum Nachweis, dass das Transposon nur einmalig in das bakterielle Genom inseriert, wurde
eine Analyse mit dem Southern Blot durchgeführt. Bei den getesteten Mutanten ergab die
Analyse, dass jede Mutante nur eine Transposoninsertion besitzt.
4.2 Transposonmutagenese des WT 20265: Überprüfung auf
langsam wachsende Phänotypen
Transposonmutanten des WT 20265 (3.2.17) wurden nach langsam wachsenden Phänotypen
überprüft. Kleine Kolonieformen konnten von großen deutlich nach 48 Stunden Inkubation
bei 37 °C direkt nach der Transposonmutagenese auf LB-Agar (200 µg/ml Gentamicin)
39 ERGEBNISSE
voneinander unterschieden werden. Langsam wachsende Kolonien wurden mit einer Impföse
von der LB-Platte abgenommen, im 3-Ösen-Ausstrich auf Blutagar sowie Müller-Hinton-
Agar überführt und für mindestens 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. So konnten mit der
Überprüfung im Verlauf dieser Arbeit rund 12000 Mutanten auf langsam wachsende
Phänotypen untersucht werden. Im direkten Vergleich zum WT und der SCV 20265 wurden
von 105 auf LB-Agar klein erscheinende Kolonien 32 eindeutig langsam wachsende
Phänotypen auf Blut- sowie Müller-Hinton-Agar identifiziert. Des Weiteren konnten 73
Mutanten, die im Gegensatz zum Müller-Hinton-Agar auf Blutagar einen schnell wachsenden
Phänotyp zeigten, von den 32 langsam wachsenden Mutanten abgegrenzt werden (s. Anhang:
Tab. 9).
Der Vektor pBBR1MCS-5 mit einer Gentamicin-Resistenz wurde neben den
Optimierungsversuchen für die Transformationseffizienz gleichzeitig als Kontrolle für
spontan auftretende phänotypische Wechsel verwendet und in den WT 20265 elektroporiert
(3.2.17; 8-13 ng/50 µl Bakteriensuspension). Nach erfolgter Elektroporation wurden die
Transformanten auf LB-Platten mit 200 µg/ml Gentamicin ausplattiert. Die Inkubation wurde
für 48 Stunden bei 37 °C durchgeführt. Anschließend wurden klein erscheinende Kolonien im
3-Ösen-Ausstrich auf Blutagar überführt und der Phänotyp im Vergleich mit WT und SCV
20265 auf ein langsames Wachstum überprüft. Bei über 6700 untersuchten Transformanten
des WT 20265 trat mit diesem Vektor nur ein einziger langsam wachsender Phänotyp auf.
4.3 Transposonmutagenese der SCV 20265: Überprüfung auf
schnell wachsende Phänotypen
Transposonmutanten der SCV 20265 (3.2.17) wurden nach schnell wachsenden Phänotypen
überprüft. Da schnell wachsende Phänotypen selbst nach prolongierter Inkubation auf den
LB-Platten direkt nach der Transposonmutagenese nicht identifiziert werden konnten, wurden
die Mutanten auf Blutagar überführt. Dazu wurden die Mutanten von 3 bis 4 LB-Platten mit
einem sterilen Tupfer in 2 bis 3 ml Puffer A aufgenommen. Die Bakterienanzahl/ml wurde
aus der fotometrisch gemessenen optischen Dichte der Suspension bei 650nm mit Hilfe einer
durch lineare Regression erstellten Eichgrade geschätzt und anschließend auf Blutagar
40 ERGEBNISSE
ausplattiert. Die Blutplatten wurden für 24 Stunden und zur eindeutigen Identifizierung bis zu
48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Groß erscheinende Kolonien wurden mit einer Impföse
abgenommen und erneut auf Blutagar ausgestrichen. Die Inkubation wurde wiederum für 24
bis 48 Stunden bei 37 °C vorgenommen. Es wurden rund 10000 Mutanten auf schnell
wachsende Phänotypen untersucht. Ein größeres Koloniewachstum als bei der SCV 20265
konnte bei 101 Mutanten festgestellt werden. Davon zeigten 67 Mutanten einen schnell
wachsenden Phänotyp ähnlich dem WT 20265, 6 Mutanten einen Phänotyp ähnlich der REV
20265 und 28 Mutanten einen intermediären Phänotyp (s. Anhang: Tab. 13).
Auch hier erfolgte die Kontrolle, ob allein die Transformation mit dem Vektor pBBR1MCS-5
mit einer Gentamicin-Resistenz zu einem phänotypischen Switch führt. Die Transformanten
wurden auf Blutagar wie oben beschrieben überführt und groß erscheinende Kolonien nach
erneutem Ausstrich auf Blutagar auf schnell wachsende Phänotypen überprüft. Bei etwa 5800
untersuchten Transformanten konnte kein einziger schnell wachsender Phänotyp verzeichnet
werden.
4.4 Charakterisierung der Transposonmutanten im Auto-
aggregations-Assay
Da eine große Subgruppe der klinischen SCVs ein autoaggregatives Verhalten zeigt
(HÄUSSLER et al. 2003a), wurden zur weiteren Charakterisierung die identifizierten
Transposonmutanten des WT und der SCV 20265 (4.2 u. 4.3) auf die Fähigkeit eines
autoaggregativen Wachstums im Vogel-Bonner-Medium untersucht. Der WT, die SCV und
die REV 20265 wurden als Vergleich herangezogen. Die SCV 20265 zeigt mit ihrer Fähigkeit
zur Autoaggregation im Vogel-Bonner-Medium nach 24 bis 48 Stunden im Gegensatz zum
klonalen WT und der REV eine erhöhte Produktion sichtbarer Bakterienaggregate mit
Bildung eines Randes am Glaskolben, während die Kultur des WT und der REV mit nur
vereinzelt sichtbar großen Aggregaten ohne die Entstehung eines Randes weitestgehend
homogen bleibt (Abb. 5).
41 ERGEBNISSE
WT SCV REV
WT SCV REV
Abbildung 5: Wachstum der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante des P. aeruginosa-
Stammes 20265 in Flüssigmedium.
Autoaggegation der SCV im Vergleich zum homogenen Wachstum des klonalen Wildtyps (WT) und
der Revertante (REV) im modifizierten Vogel-Bonner-Medium nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C.
Die drei unteren Abbildungen sind vergrößerte Ausschnitte aus den entsprechenden oberen
Abbildungen.
Allerdings ist die Untersuchung auf Autoaggregation mit Schwierigkeiten verbunden. Es
zeigte sich im Verlauf der Arbeit, dass autoaggregatives Wachstumsverhalten sehr variabel
und vermutlich von der Inkubationstemperatur abhängig ist, d. h. kleinste Veränderungen
während der Inkubation (Brutschrank, Umgebungstemperatur ect.) können zu
unterschiedlichen Ergebnissen führen.
4.4.1 Wachstumsverhalten der Transposonmutanten des mutagenisierten WT
20265 in Flüssigmedium
Von den 32 langsam wachsenden Transposonmutanten des WT 20265, die wie die klinischen
SCVs nicht nur auf LB-Agar sondern auch auf Blutagar kleine Kolonien ausbilden, zeigten 13
Mutanten ein autoaggregatives Wachstumsverhalten. Dabei war der Ausprägungsgrad unter
den Mutanten sehr variabel (Tab. 1). Während bei 5 Mutanten (WT-Tn5-M 25/B3, WT-Tn5-
42 ERGEBNISSE
M 2C, WT-Tn5-M 24C, WT-Tn5-M 24E, WT-Tn5-M 41D) überhaupt kein Wachstum im
Vogel-Bonner-Medium zu verzeichnen war, zeigten 14 Mutanten eine homogene Kultur, wie
sie beim WT 20265 vorkommt (s. Anhang: Tab. 8).
Tabelle 1: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten auf autoaggregatives Wachstum nach 48 Stunden
Inkubation bei 37 °C.
WT-Tn5-Mutante Aggregate Randbildung
WT-Tn5-M 24/H4 +++ +++WT-Tn5-M 34C ++ +++WT-Tn5-M 24/F5 ++ ++WT-Tn5-M 37D ++ ++WT-Tn5-M 33C +++ ++WT-Tn5-M 25/C1 ++ +WT-Tn5-M 37B +++ -WT-Tn5-M 18F +++ -WT-Tn5-M 24/B1 +++ -WT-Tn5-M 43A +++ -WT-Tn5-M 14F ++ -WT-Tn5-M 24/E8 + +++WT-Tn5-M 24/E1 - +
Deutliche Aggregat- oder Randbildung: +++; kleine bis sehr feine Aggregate, geringe Randbildung:
++; 1-2 große Aggregate, sehr geringe Randbildung: +; keine Aggregat- oder Randbildung: -
Von den 73 Transposonmutanten, die nur auf Müller-Hinton-Agar einen SCV-Phänotyp
aufwiesen und auf Blutagar den Phänotyp des WT beibehielten, kamen 28 mit einem
autoaggregativen Phänotyp vor. Kein Wachstum in Vogel-Bonner-Medium war bei 15
Mutanten zu verzeichnen (s. Anhang: Tab. 10).
4.4.2 Wachstumsverhalten der Transposonmutanten der mutagenisierten
SCV 20265 in Flüssigmedium
Von den 67 Transposonmutanten mit einem schnell wachsenden Phänotyp ähnlich dem WT
20265 und 6 Mutanten mit einem Phänotyp ähnlich der REV 20265 aus der mutagenisierten
SCV 20265 zeigten 25 eine homogene Kultur ohne die Bildung eines Randes am Glaskolben.
43 ERGEBNISSE
Damit haben diese Mutanten nicht nur den langsam wachsenden, sondern ebenso den
autoaggregativen Phänotyp der SCV 20265 verloren. Bei 2 Mutanten konnte kein
vollständiger Verlust der Autoaggregation festgestellt werden. 46 Mutanten zeigten weiterhin
den autoaggregativen Phänotyp der SCV 20265 (s. Anhang: Tab. 13).
Von den 28 Mutanten, deren Koloniewachstum sich zwischen dem WT und der SCV 20265
befand, hatten 16 den autoaggregativen Phänotyp der SCV verloren (s. Anhang: Tab. 13).
4.5 Charakterisierung der Transposonmutanten im Twitching-
Motilitäts-Assay
Weiterhin sollte untersucht werden, ob das autoaggregative Wachstumsverhalten der
Transposonmutanten des WT 20265 mit der Ausbildung von Typ IV Pili in Verbindung steht,
wie es für die von HÄUSSLER et al. (2003a) identifizierte autoaggregative SCV-Subgruppe
gezeigt werden konnte, zu denen auch die SCV 20265 gehört. Außerdem wurde bei den
Transposonmutanten der SCV 20265 getestet, ob sie die Fähigkeit der Twitching-Motilität der
SCV 20265 verloren haben und die beeinträchtigte Motilität des WT 20265 zeigen.
Für die Untersuchung der Transposonmutanten dienten der WT 20265, die zum WT
klonale SCV 20265 und die in vitro generierte Revertante als Vergleich. Nach der Beimpfung
des Petrischalenbodens durch den Twitching-Agar formt die SCV 20265 bei 37 °C nach 48
Stunden eine größere Twitching-Zone (durchschnittl. 0.9 cm) als ihr klonaler WT
(durchschnittl. 0.14 cm), während die Revertante die größte Twitching-Zone bildet
(durchschnittl. 3.2 cm) (Abb. 6).
44 ERGEBNISSE
Abbildung 6: Motilitätsverhalten der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante des P.
aeruginosa-Stammes 20265.
Twitching-Motilität der SCV und der Revertante (REV) im Vergleich zum Wildtyp (WT) nach 48
Stunden Inkubation bei 37 °C. Die Darstellung der drei Morphotypen wurde durch die Färbung des
Petrischalenbodens mit Kristallviolett erreicht.
Von den Transposonmutanten des WT 20265 wies nur die 25/C1 eine Twitching-Motilität
auf. Allerdings war die gebildete Zone deutlich kleiner als bei der SCV 20265, jedoch größer
als beim klonalen WT (Abb. 7).
WT
SCV
REV
45 ERGEBNISSE
Abbildung 7: Motilitätsverhalten der zwei Morphotypen Wildtyp und SCV des P. aeruginosa-
Stammes 20265 und der Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten Wildtyps 20265.
Twitching-Motilität der SCV und der Mutante 25/C1 im Vergleich zum Wildtyp (WT) nach 48 Stunden
Inkubation bei 37 °C. Die Darstellung der drei Morphotypen wurde durch die Färbung des
Petrischalenbodens mit Kristallviolett erreicht.
Die Transposonmutanten der SCV 20265 mit einem großen Koloniewachstum und fehlender
Autoaggregation zeigten interessanterweise eine sehr deutliche Twitching-Motilität. Die
gebildete Twitching-Zone war bei jeder Mutante deutlich größer als bei der SCV 20265 und
bei 8 Mutanten wurde sogar der Durchmesser der Revertante 20265 erreicht (ohne Abb.).
4.6 Molekularbiologische Charakterisierung der Transposon-
mutanten
Die Bestimmung der Transposoninsertion im bakteriellen Genom wurde mittels Ligation der
Transposon flankierenden Sequenz an einen Y-Linker nach Literaturangaben von KWON u.
RICKE (2000) durchgeführt. Aufgrund des langsam wachsenden Phänotyps, ähnlich der SCV
20265 wurden die identifizierten 32 Transposonmutanten des mutagenisierten WT 20265
(4.2) zur molekularbiologischen Charakterisierung ausgewählt. Erfolgreich sequenzieren
ließen sich 28 Mutanten (Tab. 2).
WTSCV
25/C1
46 ERGEBNISSE
Zur Auswahl der Transposonmutanten aus der Transposon-Bank der SCV 20265 wurden die
Kriterien wie großes Koloniewachstum und ein homogenes Wachstum in Flüssigmedium
herangezogen. Erfüllt wurden diese Kriterien von 25 der 73 schnell wachsenden Mutanten
ähnlich dem WT bzw. der REV 20265. Obwohl die Mutanten SCV-Tn5-M R5, SCV-Tn5-M
R7 und SCV-Tn5-M 1D der 73 schnell wachsenden Mutanten weiterhin ein autoaggregatives
Wachstumsverhalten zeigten, wurden sie aufgrund eines intermediären bzw. der REV 20265
ähnlichen Phänotyps auf Blutagar ebenfalls für die weitere molekularbiologische Analyse
ausgewählt. Während das Koloniewachstum von der SCV-Tn5-M R5 deutlich zwischen dem
WT 20265 und der Revertante 20265 liegt, zeigen die SCV-Tn5-M R7 und die SCV-Tn5-M
1D den Phänotyp der Revertante. Erfolgreich sequenzieren ließen sich 26 Mutanten (Tab. 3).
Die erhaltenen Sequenzen wurden zur computergestützten Identifizierung mit dem P.
aeruginosa-Stamm PAO1 über das Pseudomonas Genom-Projekt verglichen. Blieb die
direkte Datenbanksuche mit dem Pseudomonas PAO1 Genom-Projekt erfolglos, wurde die
Identifizierung des Gens mit GenomeNet, Blast durchgeführt.
Die Transposonmutanten mit dem jeweils identifizierten Gen, welches das Transposon
enthält, sind in den Tabellen 2 und 3 dargestellt. Sämtliche in den Tabellen aufgeführten
Informationen wie PA-Nummer, Genname, Protein, Funktion und Stoffwechselweg wurden
dem Pseudomonas PAO1 Genom-Projekt entnommen.
47 ERGEBNISSE
Tabelle 2: Mutanten aus der Transposonbank des WT 20265 mit einem phänotypischen Switch zum
SCV-Phänotyp.
Tn5-Mutante PA-Nummer Gen Protein Funktion Stoffwechsel-
wegWT-Tn5-M24/E7
PA1583 sdhA Succinat-Dehydro-genase (Unter-einheit A)
Energie-Metabolismus
WT-Tn5-M24/G11
PA5174 möglicheß-Ketoacyl-Synthase
Fettsäuren- u.Phospholipid-Metabolismus
WT-Tn5-M25/C1
PA1587 lpdG Lipoamid-Dehydro-genase-Glc
Energie-Metabolismus,Aminosäure-Biosynthese u.-Metabolismus
Citrat-Zyklus,Threonin- u.Pyruvat-Metabolis-musGlykolyse,Glukoneogenese
WT-Tn5-M 2C PA3164 still frameshift3-Phospho-Shikimat1-Carboxyvinyl-TransferasePrephenat-Dehydrogenase
Aminosäure-Biosynthese u.-Metabolismus
WT-Tn5-M 24C PA5277 lysA Diaminopimelat-Decarboxylase
Aminosäure-Biosynthese u.-Metabolismus
Lysin-Biosynthese
WT-Tn5-M34B*
AE004796zwischenPA3769 u.
PA3770
guaA
guaB
GMP-Synthase
Inosin-5‘-Mono-phosphat-Dehydrogenase
Aminosäure- u.Nukleotid-Biosynthese u.-Metabolismus
Nukleotid-Biosynthese u.-Metabolismus
Glutamat-Metabolismus,Purin-Metabolismus
Purin-Metabolismus
WT-Tn5-M 41D PA3527 pyrC Dihydroorotase Nukleotid-Biosynthese u.-Metabolismus
Pyrimidin-Metabolismus
WT-Tn5-M25/B3
PA4756 carB Carbamoyl-Phosphat-Synthetase (großeUntereinheit)
Nukleotid-Biosynthese u.-Metabolismus,Biosynthese u.Metabolismus
Arginin- u. Prolin-Metabolismus,Glutamat-Metabolismus,Pyrimidin-Metabolismus
WT-Tn5-M24/F5
PA2615 ftsK Zellteilung-ProteinFtsK
Zellteilung
WT-Tn5-M24/E4
PA4480 mreC Stäbchen-FormbestimmendesProtein MreC
Zellteilung
48 ERGEBNISSE
Tn5-Mutante PA-Nummer Gen Protein Funktion Stoffwechsel-
wegWT-Tn5-M 14F PA5565 gidA Glukose
hemmendesTeilungsprotein A
Zellteilung
WT-Tn5-M 13AWT-Tn5-M 18AWT-Tn5-M 18CWT-Tn5-M 18F
PA3242 möglicheLauroyl-Acyltrans-ferase
ZellwandLPSKapsel
Lipopolysaccharid-Biosynthese
WT-Tn5-M24/A3
WT-Tn5-M24/E8
WT-Tn5-M24/H8
PA5161 rmlB DTDP-D-Glukose4,6-Dehydratase
Kohlenstoff-Verbindung,Katabolismus,Kapsel
Lipopolysaccharid-BiosyntheseMetabolismus
WT-Tn5-M 37BWT-Tn5-M 37DWT-Tn5-M 37E
PA3818 suhB extragenesSuppressor-Protein SuhB
Adaptation,ProtektionTranslation, post-translationaleModifizierung,Abbau
WT-Tn5-M24/H4
PA4265PA4277
tufAtufB
ElongationsfaktorTu
Translation, post-translationaleModifizierung,Abbau
WT-Tn5-M 3E PA 4275 nusG Transkriptions-Antiterminations-Protein NusG
Transkription,RNA-Prozessierung u.-Abbau
WT-Tn5-M24/E1
PA4497 möglicheProtein-bindendeKomponente einesABC Transporters
Transport kleinerMoleküle
WT-Tn5-M24/A11
WT-Tn5-M 34C
PA4729 panB 3-Methyl-2-OxobutanoatHydroxymethyl-Transferase
Biosynthese vonCo-Faktoren,prosthetischenGruppen u.Trägern
ein Kohlenstoff-Pool über FolatPantothenat u.CoA-Biosynthese
WT-Tn5-M 42B PA2963 konservierteshypothetischesProtein
WT-Tn5-M25/E1
PA2982 konservierteshypothetischesProtein
* Die Identifizierung des Transposon enthaltenen Gens mußte über GenomeNet, Blast durchgeführt
werden, da eine direkte Datenbanksuche mit dem Pseudomonas PAO1 Genom-Projekt erfolglos
blieb. Ein Vergleich der Sequenz auf Nukleotidebene ergab auf dieses Weise eine Identität von 100%
mit dem Gen AE004796. Weitere Analysen mit dem Pseudomonas PAO1 Genom-Projekt zeigten,
dass dieser Abschnitt sich zwischen den Genen PA3769 und PA3770 befindet.
49 ERGEBNISSE
Tabelle 3: Mutanten aus der Transposonbank der SCV 20265 mit einem phänotypischen Switch zum
WT-Phänotyp.
Tn5-Mutante PA-Nummer Gen Protein FunktionSCV-Tn5-M 1L PA0005 mögliche
AcyltransferaseFettsäuren- u.PhospholipidMetabolismus
SCV-Tn5-M 2E PA1119 mögliches Lipoprotein derAußenmembran
Membranprotein
SCV-Tn5-M 3F PA2129 cupA2 möglichesPili-AssemblierungsChaperon
Motilität u. Anheftung,Chaperone u.Hitzeschock Proteine
SCV-Tn5-M 3DSCV-Tn5-M 3ESCV-Tn5-M 3K
PA2130 cupA3 mögliches FimbrienBiogenese usher Protein
Motilität u. Anheftung
SCV-Tn5-M 1C PA3861 rhl ATP-abhängige RNAHelicase RhlB
Transkription,RNA-Prozessierung u.-Abbau
SCV-Tn5-M R2 PA3620 mutS DNA Reparatur-ProteinMutS
DNA-Replikation,-Rekombination,-Modifizierung u.-Reparatur
SCV-Tn5-M R1*SCV-Tn5-M R7*SCV-Tn5-M 11A*
PA4946 mutL DNA Reparatur-ProteinMutL
DNA-Replikation,-Rekombination,-Modifizierung u.-Reparatur
SCV-Tn5-M R4*SCV-Tn5-M R5*SCV-Tn5-M R6
PA4235 bfrA Bacterioferritin Adaptation, Protektion,Transport von Molekülen
SCV-Tn5-M 6E*SCV-Tn5-M 6F*SCV-Tn5-M 6G*SCV-Tn5-M 6MSCV-Tn5-M 6NSCV-Tn5-M 8A*SCV-Tn5-M 8BSCV-Tn5-M 8CSCV-Tn5-M 8DSCV-Tn5-M 8F
PA1120 konservierteshypothetisches Protein
hypothetisch, nichtklassifiziert, unbekannt,Membranprotein
SCV-Tn5-M 2L PA4601 konservierteshypothetisches Protein
hypothetisch, nichtklassifiziert, unbekannt,Membranprotein
SCV-Tn5-M 1D PA5227 konservierteshypothetisches Protein
hypothetisch, nichtklassifiziert, unbekannt
* Bei der Überführung der Mutanten vom LB-Agar auf Blutagar kam es bei der Überprüfung nach
schnell wachsenden Phänotypen zur Isolierung von klonalen Mutanten. Das Zeichen * kennzeichnet
von einander unabhängige Mutanten.
50 ERGEBNISSE
4.7 Komplementation von PA1587 in der Transposonmutante
25/C1
Die Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten WT 20265 ist mit ihren Eigenschaften wie
kleines Koloniewachstum, autoaggregatives Wachstum im Vogel-Bonner-Medium (Abb. 8)
sowie einer Twitching-Motilität, der klinischen SCV 20265 besonders ähnlich und wurde
deshalb für weiter führende Untersuchungen ausgewählt.
WT 25/C1
(A)
(B)
WT 25/C1
Abbildung 8: Wachstum vom Wildtyp des P. aeruginosa-Stammes 20265 und der
Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten Wildtyps 20265 auf Agarplatten und in
Flüssigmedium.
(A) Koloniemorphologie des Wildtyps (WT) 20265 und der Transposonmutation auf Columbia-Blutagar
nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C. (B) Autoaggregation der 25/C1 im Vergleich zum homogenen
Wachstum des WT im modifizierten Vogel-Bonner-Medium nach 48 Stunden bei 37 °C.
51 ERGEBNISSE
Das Gen mit einer Transposoninsertion in der 25/C1 wurde über das Pseudomonas Genom-
Projekt als PA1587 (Lipoamid-Dehydrogenase-Glc (lpdG))-Gen identifiziert. Die Lipoamid-
Dehydrogenase-Glc ist eine Untereinheit des aus drei Enzymen bestehenden
Multienzymkomplexes der im Citrat-Zyklus aktiven α-Ketoglutarat-Dehydrogenase. Mit der
in trans Komplementation von PA1587 in der 25/C1 sollte untersucht werden, ob die
Mutation im lpdG-Gen oder ein polarer Effekt für den langsam wachsenden und
autoaggregativen Phänotyp der Mutante verantwortlich ist. Mit spezifischen Primern wurde
PA1587 amplifiziert und in den Klonierungsvektor pUCP20 ligiert mit anschließender
Transformation in den E. coli DH5α. Nach Plasmidpräparation mehrerer Transformanten mit
folgender Restriktionsspaltung durch XbaI und HindIII wurde die Klonierung auf einen
Erfolg überprüft. Die nachfolgende Elektroporation des Vektors pUCP20::PA1587 in die
25/C1 führte zu Transformanten, die auf Antibiotikaplatten selektioniert wurden. Zur
Überprüfung des Phänotyps und Koloniewachstums wurde die komplementierte 25/C1 auf
Blutagar mit Antibiotikazusatz ausgestrichen. Nach 48 Stunden Inkubation war die
komplementierte 25/C1 im Koloniewachstum und Phänotyp wieder identisch mit dem WT
20265. Allerdings behielt die komplementierte 25/C1 weiterhin ihr autoaggregatives
Wachstum nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C im Vogel-Bonner-Medium mit
entsprechendem Antibiotikumzusatz bei. Als Kontrolle wurde der Vektor pUCP20 ohne
PA1587 in die 25/C1 transformiert. Im Gegensatz zur Komplementation wurde der Phänotyp
der Mutante alleine mit dem Vektor pUCP20 nicht komplementiert.
4.8 Untersuchung zur cupA1-Genexpression (PA2128) in den
Transposonmutanten des mutagenisierten WT 20265
Eine genomweite Expressionsanalyse der Transposonmutante 25/C1 mit P. aeruginosa
GeneChips (Affimetrix) (durchgeführt von F. v. GÖTZ 2003, Dissertation in Arbeitsgruppe
Häußler/ Steinmetz) zeigte eine gesteigerte Expression des chaperone/ usher pathway
(cupA1-A5)-Gene (PA2128-PA2133), der in der Ausbildung von Fimbrienstrukturen in vielen
gramnegativen Bakterien involviert ist (VON GÖTZ 2003, Tab. 6). Zur Bestätigung der
cup-Genexpression in der 25/C1, wurde in dieser Arbeit eine Analyse mit dem Northern Blot
durchgeführt. Dabei erfolgte die Herstellung der DIG-markierten Sonde mit der Gensequenz
52 ERGEBNISSE
des PA2128 (cupA1)-Gens. Dieses Gen zeigte in der Transkriptionsanalyse die höchste
Expression. Tatsächlich ergab die geblottete RNA der 25/C1 ein deutliches Signal, während
beim WT und bei der SCV 20265, die als Kontrollen eingesetzt wurden, kein Signal sichtbar
wurde (Abb. 9). So wurde das Ergebnis des DNA-Microarray von PA2128 mit dem Northern
Blot bei der 25/C1 eindeutig bestätigt.
1.517 kb
1.049 kb
0.575 kb
0.483 kb
0.310 kb
Abbildung 9: Northern Blot zur Darstellung der cupA1-Genexpression in der Transposon-
mutante 25/C1 im Vergleich zum Wildtyp und der SCV des P. aeruginosa-Stammes 20265.
RNA von der Transposonmutante 25/C1, Wildtyp (WT) und SCV 20265 wurde mit einer PA2128
(cupA1)-Sonde hybridisiert. Die RNA-Leiter ist ein DIG-markierter Größenstandard aus RNA-
Fragmenten von 0.310 bis 1.517 kb (3.1.5). Die 25/C1 des mutagenisierten WT 20265 zeigt ein
deutliches Signal im Gegensatz zu dem negativen WT und der SCV 20265.
RNA-Lei
ter
25/C
1
SCV 202
65
WT
2026
5
53 ERGEBNISSE
Zur Klärung, ob eine erhöhte cup-Genexpression auch in anderen z. T. autoaggregativen
Transposonmutanten mit einem SCV-Phänotyp auftritt und ein möglicher Zusammenhang
zwischen kleinem Koloniewachstum und Autoaggregation besteht, wurden weitere Northern
Blot-Analysen mit den restlichen sequenzierten Transposonmutanten des WT 20265
durchgeführt. Allerdings zeigte keine dieser Mutanten eine cupA1-Genexpression.
4.9 Ausbildung von Fimbrienstrukturen und Flagellen in
Transposonmutanten des mutagenisierten WT 20265
Der chaperone/ usher pathway (cupA1-A5), welcher für putative Fimbrienstrukturen kodiert,
wurde von VALLET et al. (2001) in P. aeruginosa identifiziert. Die Autoren konnten
nachweisen, dass die Fimbrienstrukturen vollkommen unabhängig von den Typ IV Pili für die
frühe Phase der Biofilmentwicklung in P. aeruginosa erforderlich sind. Das autoaggregative
Wachstumsverhalten der Transposonmutante 25/C1 in Flüssigmedium und die Induktion des
chaperone/ usher pathway (cupA1-A5) weisen auf eine mögliche Expression der vom
chaperone/ usher pathway kodierenden putativen Fimbrienstrukturen auf der Zelloberfläche
der Mutante hin. Zur Überprüfung dieser Vermutung wurde die 25/C1 mit der Transmissions-
Elektronenmikroskopie durch M. Rhode in der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung
(GBF) in Braunschweig untersucht (3.2.26). Es zeigte sich, dass die Darstellung der
Fimbrienstrukturen von der Temperatur abhängig ist. Mit einer Inkubation der Mutante auf
Twitching-Agarplatten bei 28 °C und einer Inkubationszeit von 3 Tagen ließen sich zahlreiche
Fimbrienstrukturen auf der gesamten Zelloberfläche und einzelne Fimbrienfragmente in der
Umgebung der Bakterien darstellen (Abb. 10 u. 11). Bei 37 °C dagegen sank die Expression
der Fimbrienstrukturen deutlich, während bei 42 °C keine Fimbrien mehr dargestellt werden
konnten.
54 ERGEBNISSE
Abbildung 10: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Zelloberflächen und Umgebung der
Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten P. aeruginosa-Wildtyps 20265.
Für die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden Zellen aus den äußeren Twitching-Zonen von
1%igen LB-Agarplatten, die zuvor mit einem sterilen Zahnstocher beimpft und bei 28 °C für 3 Tage
inkubiert worden waren, präpariert, auf ein Formvar Kupfergrid überführt und mit einer 2%igen
Uranylacetat-Lösung gefärbt. Pili: , Flagellen:
Da die RNA-Präparation für den Northern Blot zur Überprüfung ob noch weitere
Transposonmutanten des WT 20265 die cup-Gene hochreguliert haben, von Kulturen erfolgte,
die bei 37 °C inkubiert wurden, wurde ein Großteil der Transposonmutanten des WT 20265
elektronenmikroskopisch auf Fimbrienstrukturen durch M. Rhode (GBF, Braunschweig)
untersucht (3.2.26). Nach einer Inkubation bei 28 °C ließen sich bei weiteren 8
Transposonmutanten Fimbrienstrukturen darstellen (Tab. 5).
55 ERGEBNISSE
Tabelle 4: Elektronenmikroskopische Untersuchung von Transposonmutanten des WT 20265 mit
einer Inkubation der Mutanten auf Twitching-Agarplatten bei 28 °C.
WT-Tn5-Mutante Fimbrien Flagellen
24/A3 + -
24/A11 n. d. n.d.
24/E1 - -
24/E4 n. d. n. d.
24/E7 (+) +
24/F5 (-) +
24/G11 + +
24/H4 + +
25/B3 n.d. n. d.
25/C1 + +
25/C1 mit pED202 - -
25/E1 - +
WT-Tn5-M 2C + -
WT-Tn5-M 3E n. d. n. d.
WT-Tn5-M 14F - +
WT-Tn5-M 18A - -
WT-Tn5-M 18F (-) +
WT-Tn5-M 24C (-) kleine Stücke -
WT-Tn5-M 37B n. d. n. d.
WT-Tn5-M 41D n. d. n. d.
WT-Tn5-M 42B n. d. n. d.
Positiv: +, negativ: -, vereinzelt: (+), sehr vereinzelt: (-), n. d.: nicht durchgeführt
56 ERGEBNISSE
4.10 Ausbildung von Fimbrienstrukturen und Flagellen in
klinischen autoaggregativen SCVs
Die Expression von Cup-Fimbrien auf der Bakterienzelloberfläche könnte P. aeruginosa in
der chronisch infizierten CF-Lunge möglicherweise einen Selektionsvorteil bieten. Zur
Überprüfung dieser Hypothese wurden 7 klinische autoaggregative SCVs, isoliert aus dem
Respirationstrakt von CF-Patienten, elektronenmikroskopisch auf die Ausbildung von
Fimbrienstrukturen durch M. Rhode (GBF, Braunschweig) untersucht (3.2.26). Wie in
Tabelle 6 dargestellt, zeigten 6 der klinischen SCVs mit einem autoaggregativen Wachstum
deutlich sichtbare Fimbrienstrukturen wie die Transposonmutante 25/C1 (Abb.10 u. 11),
während bei einer SCV nur ganz vereinzelt Fimbrienstrukturen sichtbar waren. Die
Fimbrienstrukturen waren auf der gesamten Zelloberfläche lokalisiert. Es handelt sich daher
wahrscheinlich nicht um Typ IV Pili, die sich an den Polen der Bakterienzelle befinden.
Flagellen konnten bei 6 von 7 der SCVs elektronenmikroskopisch dargestellt werden.
Tabelle 5: Elektronenmikroskopische Untersuchung klinischer SCVs mit einem autoaggregativen
Phänotyp auf Fimbrienstrukturen und Flagellen mit einer Inkubation der Bakterien auf Twitching-Agar-
platten bei 28 °C.
Klinische SCVs Fimbrien Flagellen
10 + +
13 + +
32 + +
65 + -
8226 + +
74861 (-) +
75962 + +
Positiv: +, negativ: -, sehr vereinzelt: (-)
57 ERGEBNISSE
Abbildung 11: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von der Umgebung der Transposon-
mutante 25/C1 des mutagenisierten P. aeruginosa-Wildtyps 20265.
Für die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden Zellen aus den äußeren Twitching-Zonen von
1%igen LB-Agarplatten, die zuvor mit einem sterilen Zahnstocher beimpft und bei 28 °C für 3 Tage
inkubiert worden waren, präpariert, auf ein Formvar Kupfergrid überführt und mit einer 2%igen
Uranylacetat-Lösung gefärbt. Pili: , Flagelle:
58 ERGEBNISSE
4.11 Wachstumsverhalten der Transposonmutante 25/C1 unter
pvrR-Genexpression in trans
DRENKARD u. AUSUBEL (2002) identifizierten das Regulatorgen pvrR (phänotypischer
Variant-Regulator), welches den phänotypischen Switch einer antibiotikaresistenten und
autoaggregativen rauen SCV des P. aeruginosa-Stammes PA14 zur Wildtyp-Revertante
kontrolliert. Nach Tranformation des pED202 Vektors mit dem pvrR-Gen beobachteten sie
eine höhere Rate des phänotypischen Switches von der rauen SCV zur Wildtyp-Revertante.
Mit der Transformation des Vektors pED202 mit dem pvrR-Gen in die Transposonmutante
25/C1 sollte untersucht werden, ob eine pvrR-Genexpression auch in der 25/C1 zu einem
phänotypischen Switch führt, d. h. zu einem schnell wachsenden Phänotyp und zum Verlust
der Autoaggregation. Die auf Antibiotikaplatten selektionierten Transformanten der 25/C1
wurden zur genauen Untersuchung des Phänotyps und Koloniewachstums auf Blutagar mit
entsprechendem Antibiotikum überführt. Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Kolonien
rau, flach und fingen an, geringfügig an den Rändern auszulaufen, während die Kolonien der
25/C1 ohne pvrR kugelig und glänzend sind. Untersuchungen auf Veränderungen des
autoaggregativen Wachstums der 25/C1 mit dem pvrR-Gen im Vogel-Bonner-Medium
führten zu keinen eindeutigen Aussagen. Zur Kontrolle, ob die phänotypischen
Veränderungen auf Blutagar auch wirklich vom pvrR-Gen verursacht werden und nicht
alleine durch das Vorhandensein des Vektors zustande kommen, wurde der Vektor pUCP20
ohne dem pvrR-Gen in die 25/C1 transformiert. Auf Blutagar zeigte die 25/C1 mit dem
Vektor pUCP20 jedoch dieselben Kolonieveränderungen wie mit dem pvrR-Gen. Die
Kolonien wurden rau, flach und am Rand leicht auslaufend.
4.12 Temperaturabhängiges Wachstum der mutagenisierten SCV
20265 mit einer Transposoninsertion in PA1120
Die Transposonmutante SCV-Tn5-M 6E der mutagenisierten SCV 20265 besitzt neben 9
anderen Mutanten eine Transposoninsertion im Gen PA1120, welches für ein mögliches
Membranprotein kodiert. Diese Mutante zeigt bei einer Inkubation von 48 Stunden bei 37 °C
auf Blutagar einen dem WT 20265 ähnlichen schnell wachsenden Phänotyp und in
Flüssigmedium ein homogenes Wachstum. Wird die Mutante allerdings bei 28 °C inkubiert,
59 ERGEBNISSE
zeigt sie auf Blutagar den langsam wachsenden Phänotyp der SCV 20265. Die Ausbildung
eines langsam wachsenden Phänotyps bei 28 °C weist auf die Expression von
Fimbrienstrukturen auf der Zelloberfläche der Mutante hin. Durch die elektronen-
mikroskopische Untersuchung der Mutante durch M. Rhode (GBF, Braunschweig) konnten
bei 28 °C Fimbrienstrukturen auf der gesamten Zelloberfläche dargestellt werden.
60 DISKUSSION
5. Diskussion
In der chronisch infizierten CF-Lunge ist P. aeruginosa einem sehr heterogenen und sich
ständig wechselnden Habitat ausgesetzt. In dieser Umgebung steht P. aeruginosa in hoher
Zelldichte einer Vielzahl von Umweltfaktoren gegenüber, wie z. B. dem Immunsystem des
Patienten, Entzündungsprozessen, Gewebszerstörung und Chemotherapeutika. Die
mikrobiologische Antwort des Erregers ist die Bildung morphologischer Varianten in der
CF-Lunge, obwohl die Mehrzahl der Patienten nur mit einem oder wenigen P. aeruginosa-
Klonen kolonisiert ist (RÖMLING et al. 1994). Dieses Verhalten wurde bei P. aeruginosa als
dissoziatives Verhalten beschrieben (ZIERDT u. SCHMIDT 1964). Beispiele für
morphologische Varianten aus der CF-Lunge sind: der am häufigsten beschriebene mukoide
Phänotyp (GOVAN u. DERETIC 1996) und die SCVs (HÄUSSLER et al. 1999a).
In vitro Studien konnten das Auftreten phänotypischer Varianten in einer heterogenen
Umwelt für P. fluorescens belegen. Es wurde gezeigt, dass die unterschiedlichen Phänotypen
von P. fluorescens durch Mutation entstehen und die Differenzierung durch natürliche
Selektion aufrecht erhalten wird (RAINEY u. TRAVISANO 1998). Tatsächlich wurden als
Ursache für die Entstehung des mukoiden Phänotyps von P. aeruginosa Punktmutationen
entdeckt, die zu einer Inaktivierung des mucA-Gens führen (MARTIN et al. 1993; GOVAN u.
DERETIC 1996; BOUCHER et al. 1997). Vor diesem Hintergrund entstand die Hypothese,
dass der Phänotyp der SCV durch Mutation aus dem schnell wachsenden Phänotyp (Wildtyp)
entsteht und aufgrund eines natürlichen Selektionsvorteils in dem sich ständig wechselnden
heterogenen Habitat der CF-Lunge erhalten bleibt. Ebenso wurden Mutation und Selektion für
die in vitro generierten Revertanten als Entstehungsmechanismus in den Vordergrund gestellt.
Denn unter bestimmten Bedingungen, wie z. B. dem Wegfall des Antibiotikadrucks und
reichhaltigen Kulturbedingungen können viele SCVs wieder zum schnell wachsenden
Phänotyp revertieren.
61 DISKUSSION
5.1 Molekulare Mechanismen beim phänotypischen Switch von
Pseudomonas aeruginosa
SCVs, die in einer Reihe von grampositiven und gramnegativen Erregern beschrieben
wurden, werden zunehmend mit persistierenden und rekurrierenden Infektionen in einen
ursächlichen Zusammenhang gebracht. So isolierten PROCTOR et al. (1995) bei 5 Patienten
mit chronischen Infektionen erstmals SCVs von Staphylococcus aureus. In einer Gruppe von
14 Patienten mit Osteomylitis erlitten diejenigen mit SCVs von S. aureus rekurrierende
Infektionen, während die anderen Patienten unauffällige klinische Verläufe zeigten (VON
EIFF et al. 1997). ROGGENKAMP et al. (1998) wiederum konnten eine chronische Infektion
des Hüftgelenks mit einer SCV von Escherichia coli dokumentieren.
Die SCVs von S. aureus sind die am besten untersuchten langsam wachsenden
bakteriellen Subpopulationen. Neben dem langsamen Wachstum zeigen die SCVs von
S. aureus ebenso wie die SCVs von P. aeruginosa eine erhöhte Resistenz gegenüber
Antibiotika und zusätzlich die Fähigkeit zur Persistenz in Endothelzellen auf (BALWIT et al.
1994). Die Ursache für diesen S. aureus SCV-Morphotyp scheint ein Auxotrophismus zu
sein, da exogenes Hämin oder Menadion den Wildphänotyp wieder herstellen konnte
(BALWIT et al. 1994; PROCTOR et al. 1995). Eine Supplementation mit Hämin, Menadion
oder Aminosäuren führte bei den SCVs von P. aeruginosa allerdings zu keinem
Phänotypwechsel (HÄUSSLER et al. 1999a). Des Weiteren sind die SCVs von P. aeruginosa
bei der Mukoviszidose im Gegensatz zu den nicht pigmentierten und keine β-Hämolyse
aufweisenden SCVs von S. aureus in ihrer Koloniemorphologie und Eigenschaften wie
Oberflächenhydrophobizität, Biofilmbildung, Schwimmbewegung und Assoziation mit
eukaryoten Zellen sehr heterogen (HÄUSSLER et al. 2003a). Eine Subgruppe von SCVs zeigt
z. B. neben dem langsamen Wachstum und der erhöhten Antibiotikaresistenz eine verstärkte
Expression von Typ IV Pili, die für erhöhte Motilität (Twitching-Motilität) und verstärkte
Adhärenz verantwortlich gemacht werden. Diese hyperpilierten SCVs weisen mit ihrem
gesteigerten autoaggregativen Wachstumsverhalten in Flüssigmedium eine besonders hohe
Fähigkeit zur Biofilmbildung auf. Die Biofilmbildung ist ein bedeutsamer Virulenzfaktor von
P. aeruginosa. Im Gegensatz zu den planktonischen Bakterienzellen ist der Erreger in der
Nische Biofilm vermutlich besonders gut vor den Umweltfaktoren der CF-Lunge geschützt
und kann somit zur Persistenz von P. aeruginosa beitragen.
62 DISKUSSION
Als Entstehungsursache für die in vitro isolierten SCVs der P. aeruginosa-Stämme 57RP
und PA14, die eine erhöhte Fähigkeit zur Biofilmbildung aufwiesen und deren
phänotypisches Erscheinungsbild unter geeigneten Bedingungen zu schnell wachsenden
Phänotypen wechselte, wurde ein Phasenvariationsmechanismus in den Vordergrund gestellt
(DÈZIEL et al. 2001; DRENKARD u. AUSUBEL 2002) (vergl. 2.7). Eine Phasenvariation
allein ist allerdings nach den Studien von HÄUSSLER et al. (2003a) als Ursache für die
Entstehung der SCVs in der CF-Lunge eher unwahrscheinlich. Denn außer einer erheblichen
Variabilität unter den verschiedenen klinischen SCV-Stämmen lagen die aus den SCVs in
vitro generierten Revertanten bei der Untersuchung der Oberflächenhydrophobizität, der
Biofilmbildung, der Assoziation mit eukaryoten Zellen und der Fähigkeit zur
Schwimmbewegung häufig zwischen den SCVs und den Wildtypen (HÄUSSLER et al.
2003a). Außerdem zeigen die Revertanten z. B. einen schnell wachsenden Phänotyp auf
Blutagar, der sich allerdings erheblich in der Koloniemorphologie von dem Wildtyp
unterscheidet (Abb. 3) sowie eine erhöhte Anzahl von Typ IV Pili. Außer einer
Phasenvariation ist es daher denkbar, dass Mutation und Selektion die treibenden Kräfte bei
der Entstehung der klinischen SCVs sind.
Die Ergebnisse aus der Transposonmutagenese des WT 20265 bzw. der SCV 20265, die
im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurde, unterstützen die Hypothese der Mutation und
Selektion.Von rund 12000 Transposonmutanten des WT 20265 zeigen nur 32 Mutanten einen
langsam wachsenden Phänotyp. Mutationen in Genen des WT 20265, die den Stoffwechsel,
die Zellteilung, die Zellwandbiosynthese, die Proteinbiosynthese, den RNA-Stoffwechsel,
den Molekültransport und die Co-Faktoren-Biosynthese betreffen sowie eine Gruppe von
Genen mit noch unbekannter Funktion rufen langsam wachsende Subpopulationen hervor.
Genau wie die klinischen SCVs aus der CF-Lunge sind sie sehr heterogen, allerdings zeigt
auch hier eine große Subgruppe ein autoaggregatives Verhalten. Andersherum führen
Mutationen in Genen der SCV 20265, die den Fettstoffwechsel, die
Zellmembranbiosynthese, die Motilität und Adhäsion, den RNA-Stoffwechsel, die DNA-
Reparatur und den Molekültransport betreffen sowie eine Gruppe von Genen mit noch
unbekannter Funktion zu schnell wachsenden Phänotypen ähnlich dem WT 20265.
Die Transposonmutante 25/C1, mit einer Transposoninsertion im Gen PA1587 (Lipoamid-
Dehydrogenase-Glc (lpdG)), kristallisierte sich aus den 32 langsam wachsenden
63 DISKUSSION
Transposonmutanten des WT 20265 für weiterführende Untersuchungen als besonders
interessant heraus. Denn mit ihren Eigenschaften wie langsames Wachstum, Autoaggregation
in Flüssigmedium und Twitching-Motilität, ist sie der von HÄUSSLER et al. (2003a)
beschriebene SCV-Subgruppe, zu der die SCV 20265 gehört, besonders ähnlich. Außerdem
verdeutlichte die Komplementation der Mutante, dass die Mutation im lpdG-Gen für den
langsam wachsenden Phänotyp verantwortlich ist und nicht eine unzureichende Transkription
nachfolgender Gene. Allerdings behielt die komplementierte 25/C1 weiterhin ihr
autoaggregatives Wachstum (Inkubation bei 37 °C) in Flüssigmedium bei. Dieses Ergebnis
wurde möglicherweise durch kleinste Veränderungen während der Inkubation (häufiges
Öffnen des Brutschranks, Umgebungstemperatur ect.) verursacht. Denn im Verlauf dieser
Arbeit zeigte sich, dass autoaggregtives Wachstumsverhalten sehr variabel und vermutlich
von der Inkubationstemperatur abhängig ist.
Mit einer genomweiten Expressionsanalyse der 25/C1 mit P. aeruginosa GeneChips
(Affimetrix) (durchgeführt von F. v. GÖTZ 2003, Dissertation in Arbeitsgruppe Häußler/
Steinmetz) wurde deutlich, dass die 25/C1 keine Ähnlichkeit im Genexpressionsprofil zu der
klinischen SCV 20265 zeigt (VON GÖTZ 2003), obwohl die Mutante der SCV in ihren
Eigenschaften sehr ähnlich ist und aus der Transposonmutagenese des zur SCV klonalen WT
20265 stammt. Im Vergleich zum WT 20265 wurden mehr als 40 Gene in der 25/C1 induziert
und kein Gen zeigte sich transkriptionell herunterreguliert. Unter den regulierten Genen
befinden sich die Gene sdhC (PA1581), sdhD (PA1582) und sucA (PA1585), die unmittelbar
in der Nähe zum lpdG-Gen liegen sowie das lpd3 (PA4829)-Gen. Die Gene sdhC und sdhD
kodieren jeweils für eine Untereinheit der Succinat-Dehydrogenase und sucA für eine α-
Ketoglutarat-Dehydrogenase, während lpd3 für eine Dihydrolipoamid-Dehydrogenase 3
kodiert. Dieses Ergebnis spiegelt möglicherweise den Versuch der Mutante wider, den
Gendefekt im lpdG-Gen zu kompensieren. Interessanterweise zeigte die Transkriptions-
analyse der 25/C1 eine gesteigerte Expression des flagellaren Basalkörpers (flgB-flgE
(PA1077-PA1080), flgG (PA1082), flgK (AF332547), orfC (AF332547)) sowie des
chaperone/ usher pathway (cup) (PA2128-2133), der in der Ausbildung von Fimbrien-
strukturen in vielen gramnegativen Bakterien involviert ist (VON GÖTZ 2003, Tab. 6). Mit
einer in dieser Arbeit durchgeführten Northern Blot-Analyse konnte das Ergebnis der
erhöhten cupA1 (PA2128)-Genexpression, welches für ein Fimbrienprotein kodiert, eindeutig
bestätigt werden (Abb. 9).
64 DISKUSSION
Tabelle 6: Differenzielle Genexpression der Transposonmutante 25/C1 während der exponentiellen
Wachstumsphase (VON GÖTZ 2003).
Signalintensitäts- Gen Protein Verhältnissea
Citrat-Zyklus
PA1581 (sdhC) Succinat-Dehydrogenase (C Untereinheit) 3.2 (0.9)
PA1582 (sdhD) Succinat-Dehydrogenase (D Untereinheit) 2.6 (0.6)
PA1585 (sucA) α-Ketoglutarat-Dehydrogenase (E1 Untereinheit) 2.5 (0.2)
PA4829 (lpd3) Dihydrolipoamid-Dehydrogenase 30.2 (23.8)
PA1077 (flgB) flagellares Basal-Körper Protein 11.8 (3.7)
PA1078 (flgC) flagellares Basal-Körper Protein 17.9 (14.0)
PA1079 (flgD) flagellares Basal-Körper Modifizierungs-Protein 5.0 (2.8)
PA1080 (flgE) flagellares Haken Protein 3.3 (0.8)
PA1082 (flgG) flagellares Basal-Körper Protein 2.7 (0.2)
AF332547 (flgK) mit flagellarem Haken assoziertes Protein, PAK 2.1 (0.1)
AF332547 (orfC) mögliche 3-Oxoacyl-(Acyl-Transport-Protein) Synthase von 2.7 (0.3)
Glykosylierungsinsel, PAK
Cup-Fimbrien
PA2128 Fimbrien Protein 39.4 (8.7)
PA2129 mögliches Pili-Assemblierungs Chaperon 20.2 (13.8)
PA2130 mögliches Fimbrien Biogenese usher Protein 7.3 (4.7)
PA2131 hypothetisches Protein 11.4 (11.1)b
PA2132 mögliches Pili-Assemblierungs Chaperon 14.7 (1.0)
PA2133 mögliches Signal-Transduktions Protein, EAL Domäne 8.0 (1.8)c
Sonstige Gene mit Funktionszusammenhang
PA4843 möglicher Zwei-Komponenten-System Response Regulator, 2.4 (0.2)
GGDEF Domäne
PA-Nummer, Gen- und Proteinname wurden von dem P. aeruginosa PAO1 Genom-Projekt
übernommen. Für nicht-PAO1-Gene werden statt einer PA-Nummer der Genbank-Eintrag sowie eine
nähere Bezeichnung des einzelnen Gens angegeben.a Angegeben ist das arithmetische Mittel der Signalintensitäts-Verhältnisse aus vier Kreuzvergleichen.
In der Klammer befindet sich die Standardabweichung. Hochregulierte Gene haben positive und
herunterregulierte Gene negative Werte.b Die Signalintensitäts-Verhältnisse waren nur in 3 von 4 GeneChips höher als 2-fach.c Die Expression war nur in 2 von 4 GeneChip Einzelvergleichen signifikant unterschiedlich.
65 DISKUSSION
Fimbrien oder Pili sind Haftungsorganellen der Bakterienzelle, die an der
zytoplasmatischen Membran der Bakterienzelle inserieren und durch die Zellhülle hindurch
ins Milieu hineinragen (HAHN et al. 1999). Mit ihnen besitzt das Bakterium die Fähigkeit, an
die eukaryotische Zellmembran zu adhärieren. Dabei wird die Adhäsion durch bestimmte
Komponenten der Fimbrien/ Pili vermittelt, die als Adhäsine bezeichnet werden und an
spezifische Rezeptoren der eukaryotischen Zellmembran binden (SOTO u. HULTGREN
1999). Fimbrien/ Pili sind somit bedeutende Virulenzfaktoren (THANASSI et al. 1998). Denn
nur eine erfolgreiche Adhäsion kann zu einer Kolonisation und/ oder Invasion der Wirtszelle
führen (SOTO u. HULTGREN 1999). Damit stellt die Adhäsion ein Schlüsselereignis in der
frühen Infektionsphase dar (HULTGREN et al. 1996).
Der chaperone/ usher pathway ist ein bedeutender Stoffwechselweg für den Aufbau von
Fimbrienstrukturen bei Enterobacteriaceae und umfasst zwei spezifische Klassen von
Proteinen: ein periplasmatisches Chaperon Protein und ein Außenmembran Usher Protein.
Das periplasmatische Chaperon Protein ist für die korrekte Faltung der strukturellen
Fimbrienuntereinheiten und den Transport dieser Untereinheiten zu dem Außenmembran
Usher Protein verantwortlich. Anschließend vermittelt das Außenmembran Usher Protein die
Translokation der Fimbrienstrukturen auf die Zelloberfläche, in dem es einen Kanal durch die
Außenmembran formt. Am besten wurde der chaperone/ usher pathway bei den P Pili und
Typ I Pili von Escherichia coli studiert (SOTO u. HULTGREN 1999). Des Weiteren wurde er
für die F17 Pili von E. coli beschrieben (BUTS et al. 2003). Während die uropathogenen
E. coli mit P Pili und Typ I Pili Harnwegsinfektionen verursachen, indem das PapG-Adhäsin
der P Pili und das FimH-Adhäsin der Typ I Pili an Zellen der Harnblase und Niere binden
(ROBERTS et al. 1994; LANGERMANN et al. 1997), vermittelt das F17G-Adhäsin der F17
Pili die Adhäsion an Mikrovilli des Intestinums. Dies führt z. B. beim Wiederkäuer zur
Diarrhoe und Septikämie (BUTS et al. 2003).
Fimbrien/ Pili befähigen die Bakterienzelle jedoch nicht nur zur Adhäsion an die Wirtszelle,
d. h. an eukaryotische Strukturen, sondern auch zur Adhäsion an eine abiotische Oberfläche
und somit in beiden Fällen auch zur Biofilmbildung. Studien von PRATT u. KOLTER (1998)
konnten für E. coli belegen, dass die Typ I Pili dem Bakterium eine stabile Adhäsion an eine
abiotische Oberfläche vermitteln und für eine erfolgreiche Biofilmentwicklung erforderlich
sind.
66 DISKUSSION
Während in bisherigen Studien über die Biofilmbildung bei P. aeruginosa die Typ IV Pili im
Vordergrund standen, konnten VALLET et al. (2001) zum ersten Mal zeigen, dass die cup-
Gene (cupA1-A5) für die frühe Phase der Biofilmentwicklung im Wildtyp von P. aeruginosa
notwendig sind und zwar unabhängig von den Typ IV Pili. Allerdings fehlten bisher
elektronenmikroskopische Aufnahmen über die Expression so genannter Cup-Fimbrien auf
der Zelloberfläche von P. aeruginosa. Die Fimbrienstrukturen auf der Zelloberfläche der
25/C1 (Abb. 10), die aufgrund ihrer besonderen Lokalisation von den Typ IV Pili abgrenzbar
waren, und die gleichzeitig erhöhte Expression der cup-Gene legen den Schluss nahe, dass es
sich bei den Fimbrienstrukturen um so genannte Cup-Fimbrien handelt. Interessanterweise
ließen sich außer bei der 25/C1 noch bei weiteren langsam wachsenden Transposonmutanten
und insbesondere auch bei klinischen autoaggregativen SCVs solche Fimbrienstrukturen
elektronenmikroskopisch darstellen. Es ist denkbar, dass langsames Wachstum und
Autoaggregation miteinander verknüpft sind. Da die klinischen autoaggregativen SCVs mit
den Fimbrienstrukturen in der CF-Lunge offensichtlich selektioniert wurden, scheinen die
Fimbrien bei P. aeruginosa für die Biofilmentwicklung und eventuell auch für die Virulenz in
vivo eine wichtige Rolle zu spielen.
Interessanterweise befinden sich unter den Transposonmutanten der SCV 20265 mit
einem phänotypischen Switch zum Wildtyp, Mutanten mit einer Transposoninsertion in den
cup-Genen PA2129 (cupA2) und PA2130 (cupA3). In der SCV 20265 sind die cup-Gene
gegenüber dem Wildtyp zwar nicht hochreguliert (VON GÖTZ 2003), trotzdem führt eine
Mutation in diesen Genen zu einem schnell wachsenden Phänotyp und zu einem Verlust der
Autoaggregation. Das Gen PA2129 kodiert für ein mögliches Pili-Assemblierungs Chaperon
und PA2130 für ein mögliches Fimbrien Biogenese Usher Protein. Mit einer Mutation im
PA2129-Gen werden die strukturellen Fimbrienuntereinheiten der Cup-Fimbrien
möglicherweise nicht mehr korrekt gefaltet und/ oder zur Außenmembran transportiert,
während bei einer Mutation im PA2130-Gen die Lokalisation der Fimbrienstrukturen auf der
Zelloberfläche nicht mehr möglich ist. Beide Mutationen heben die Bedeutung der cup-Gene
für ein autoaggregatives Wachstum hervor und die mögliche Rolle, die sie für den Biofilm-
Phänotyp spielen. Allerdings ist über die Regulation der cup-Gene bei P. aeruginosa bisher
nichts näheres bekannt.
67 DISKUSSION
5.1.1 Regulation eines autoaggregativen SCV-Phänotyps in Verbindung mit
einem phänotypischen Switch bei Pseudomonas aeruginosa
In einer Studie über Salmonella typhimurium wurde gezeigt, dass die Expression eines
multizellulären autoaggregativen Morphotyps bei 28 °C positiv reguliert wird (RÖMLING et
al. 2000). Gleiches konnten D’ARGENIO et al. (2002) für P. aeruginosa zeigen. In ihren
Untersuchungen wurde eine Autoaggregation durch hohe Inkubationstemperaturen
unterdrückt. Da sich in dieser Arbeit zahlreiche Fimbrienstrukturen nur nach einer Inkubation
der Bakterien bei 28 °C darstellen ließen, scheint die Expression der Cup-Fimbrien in
P. aeruginosa ebenfalls temperaturabhängig zu sein.
Allerdings wird der multizelluläre autoaggregative Morphotyp von S. typhimurium nicht
nur über die Temperatur, sondern auch über ein Transmembranprotein (AdrA) reguliert.
Interessanterweise besitzt dieses Protein eine GGDEF-Domäne und ist an der Regulation der
Zellulosebiosynthese beteiligt. Die Zellulose ist bei S. typhimurium für das
Aggregationsverhalten und die Biofilmbildung erforderlich (RÖMLING et al. 2000; ZOGAJ
et al. 2001).
Die GGDEF-Domäne ist eine konservierte Domäne (GALPERIN et al. 2001) und wurde
zuerst im Response Regulator PleD identifiziert, der die Zelldifferenzierung in Caulobacter
crescentus kontrolliert (HECHT u. NEWTON 1995). Aufgrund der konservierten
GG[DE][DE]F-Sequenz entstand der Name dieser Domäne. Die GGDEF-Domäne kommt
häufig in bakteriellen Proteinen vor und zeigt keine Ähnlichkeit zu bekannten DNA-
bindenden Domänen. Sie tritt einzeln oder zusammen in unterschiedlichen Kombinationen
mit anderen Domänen auf, z. B. mit der EAL-Domäne (Name aufgrund der konservierten
Sequenz) (GALPERIN et al. 2001; PEI u. GRISHIN 2001). Das Genom von P. aeruginosa
PAO1 kodiert 33 Proteine mit einer GGDEF-Domäne (http://www.sanger.ac.uk/
Software/Pfam/index.shtml).
Außer bei S. typhimurium wurde die Regulation der Autoaggregation über Proteine mit einer
GGDEF-Domäne bei weiteren Proteobakterien beschrieben. So konnte z. B. für Burkholderia
cepacia gezeigt werden, dass ohne das funktionsfähige Protein YciR mit einer GGDEF-
Domäne nur dünne Biofilme ohne die Entwicklung von Mikrokolonien ausgebildet werden
(HUBER et al. 2002). Bei Vibrio cholerae wurde ein Regulatorprotein (MbaA) mit einer
GGDEF-Domäne und zusätzlich einer EAL-Domäne gefunden, welches die Synthese von
Komponenten der Biofilmmatrix reguliert und damit für die Erhaltung des Biofilms
68 DISKUSSION
notwendig ist (BOMCHIL et al. 2003). Eine Mutation im mbaA-Gen führte zu einer
Überproduktion des Exopolysaccharidmaterials im Biofilm. SPIERS et al. (2002) wiederum
untersuchten einen autoaggregativen Morphotyp von P. fluorescens, der zur Biofilmbildung
ein Polymer (CLP) überproduziert, welches der Zellulose ähnlich ist. Dabei wurde ein Gen
(wspR) entdeckt, welches für das Protein WspR mit einer GGDEF-Domäne kodiert und an der
Regulation der CLP-Biosynthese beteiligt ist. Interessanterweise beschrieben D’ARGENIO et
al. (2002), dass die Autoaggregation von P. aeruginosa bei 23 °C von einem regulatorischen
Protein mit einer GGDEF-Domäne positiv kontrolliert wird und mit der Regulation der cup-
Gene in Verbindung steht. Dabei zeigte sich eine Homologie des regulatorischen Proteins von
P. aeruginosa zu dem WspR-Protein von P. fluorescens. In der 25/C1 konnte allerdings keine
erhöhte Expression des WspR-Proteins gefunden werden. Jedoch wurde in der Mutante das
PA4843-Gen differenziell exprimiert (Tab. 4). Dieses Gen kodiert für einen Response
Regulator mit einer GGDEF-Domäne (Abb. 12). Möglicherweise wird die Expression der
cup-Gene in der 25/C1 und damit ihr autoaggregativer Phänotyp über die GGDEF-Domäne
des Response Regulators PA4843 positiv reguliert.
Die Vermutung einer regulatorischen Funktion der GGDEF-Domäne auf einen langsam
wachsenden und autoaggregativen Phänotyp wird durch den Phänotyp der SCV 20265 mit
einer Transposoninsertion in den Genen PA1120 und PA4601 unterstützt. Zwar kodieren
beide Gene für Proteine mit noch unbekannter Funktion, jedoch besitzen diese Proteine
jeweils eine GGDEF-Domäne und PA4601 zusätzlich eine EAL-Domäne (Abb. 12). Mit einer
Mutation in diesen Genen verliert die SCV 20265 ihr autoaggregatives Wachstumsverhalten
in Flüssigmedium und zeigt bei 37 °C einen schnell wachsenden Phänotyp auf Blutagar
ähnlich dem WT 20265. Es ist erstaunlich, dass bei 28 °C der Phänotyp der SCV 20265 auf
Blutagar gezeigt wird und im Elektronenmikroskop Fimbrien dargestellt werden können. Es
scheint, dass bei 28 °C die Mutation eventuell über die Hochregulation anderer Gene, die
ebenfalls für Proteine mit einer GGDEF-Domäne kodieren, ausgeglichen wird.
Eine negative Regulation der Autoaggregation bei P. aeruginosa wurde dagegen von
DRENKARD u. AUSUBEL (2002) beschrieben. Die Autoren stellten einen
Phasenvariationsmechanismus in den Vordergrund, der einen phänotypischen Switch einer
antibiotikaresistenten und autoaggregativen SCV von P. aeruginosa PA14 zur Wildtyp-
Revertante verursacht. Es wurde vermutet, dass dieser Switch durch den phänotypischen
69 DISKUSSION
Variant-Regulator PvrR kontrolliert wird. Durch eine Überexpression des Regulatorproteins
konnte die Rate des phänotypischen Switch von der rauen SCV zum Wildtyp erhöht werden.
Allerdings wurde durch ein Knockout des pvrR-Gens kein phänotypischer Switch vom
Wildtyp zur rauen SCV erreicht. Es wurde von den Autoren vermutet, dass das Protein nicht
direkt am Switch beteiligt ist, sondern nur die für den Switch erforderlichen Faktoren
reguliert.
Eine in trans Expression des pvrR-Gens in der 25/C1 konnte zwar den Phänotyp des WT
20265 nicht wieder herstellen, jedoch ließen sich elektronenmikroskopisch keine
Fimbrienstrukturen mehr auf der Zelloberfläche der Mutante darstellen. Durch
Sequenzanalysen des pvrR-Gens wurde deutlich, dass das Protein PvrR eine EAL-Domäne
besitzt (Abb. 12). Die EAL-Domäne ist wie die GGDEF-Domäne eine konservierte Domäne
und wurde als Erstes in einer Studie des BvgR-Proteins in Bordetella pertussis beschrieben
(MERKEL et al. 1998). Die EAL-Domäne kommt wie die GGDEF-Domäne häufig in
bakteriellen Proteinen vor (GALPERIN et al. 2001). P. aeruginosa PAO1 besitzt 23 Proteine
mit einer EAL-Domäne (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml).
70 DISKUSSION
PvrR
PA4843
PA1120
PA4601
Abbildung 12: Darstellung der GGDEF-Domäne bzw. EAL-Domäne in den Proteinen PvrR,
PA4843, PA1120 und PA4601.
Der Response Regulator PA4843 eines Zweikomponentensystems ist in der Transposonmutante
25/C1 differenziell exprimiert. Seine GGDEF-Domäne beeinflusst möglicherweise die
cup-Genexpression in der 25/C1 positiv, während die EAL-Domäne im phänotypischen Variant-
Regulator PvrR den Biofilm-Phänotyp negativ kontrolliert. Mutationen in den Genen PA1120 und
PA4601 der SCV 20265 führen zu einem schnell wachsenden Phänotyp und zu einem Verlust der
Autoaggregation. Beide kodieren sie Proteine mit einer GGDEF-Domäne und PA4601 zusätzlich eine
EAL-Domäne. Die Abbildungen dieser vier Proteine wurden der Datenbank Pfam für Protein families
database of alignments and HMMs (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml) entnommen.
Untersuchungen über regulatorische Proteine mit einer GGDEF-Domäne und einer EAL-
Domäne zeigten, dass diese Proteine möglicherweise eine Diguanylat-Zyklase- bzw. eine
Phosphodiesterase A-Aktivität besitzen. Die Diguanylat-Zyklase und die Phosphodiesterase A
sind Enzyme im Zellulosebiosyntheseweg. In einer ausführlichen Studie über die
Zellulosebiosynthese (ROSS et al. 1991) am gramnegativen Bakterium Gluconacetobacter
xylinum wurde beschrieben, dass die Diguanylat-Zyklase und die Phosphodiesterase A für die
Umsetzung eines neu entdeckten Signalmoleküls verantwortlich sind: das zyklische di-GMP
71 DISKUSSION
(c-di-GMP). Das c-di-GMP besteht aus zwei Molekülen GMP mit zwei 5' zu 3'
Phosphorylbindungen (ROSS et al. 1987) und ist im Zellulosebiosyntheseweg ein spezifisch
positiver Nukleotidregulator, oder anders ausgedrückt, ein reversibler allosterischer Effektor
der β-1,4-Glucan (Zellulose)-Synthase (ROSS et al. 1991; TAL et al. 1998). Durch die
Bindung des c-di-GMP erhält die Zellulosesynthase die Fähigkeit, Glukose zu polymerisieren.
Während die Synthese des c-di-GMP durch die Diguanylat-Zyklase katalysiert wird, erfolgt
der Abbau des c-di-GMP durch die Phosphodiesterase A. Neuere Studien zeigen, dass die
GGDEF-Domäne als Bestandteil der Diguanylat-Zyklase vermutlich für die Biosynthese des
c-di-GMP verantwortlich ist (TAL et al. 1998; PEI u. GRISHIN 2001), während die EAL-
Domäne die Aktivität der Phosphodiesterase A und damit den Abbau des c-di-GMP zu
beeinflussen scheint (GALPERIN et al. 2001). So gibt es zunehmend Hinweise, dass
regulatorische Proteine mit einer GGDEF-Domäne und einer EAL-Domäne für die
Umsetzung des c-di-GMP verantwortlich sind. Die weite Verbreitung dieser beiden Domänen
in regulatorischen Proteinen von Proteobakterien weist auf ein bedeutendes regulatorisches
System hin. So sind die GGDEF- und die EAL-Domäne nicht nur an dem
Zellulosebiosyntheseweg beteiligt, sondern scheinen, wie bereits erwähnt, eine bedeutende
Regulatorfunktion für die Exopolysaccharidproduktion, die Autoaggregation und
Biofilmbildung zu besitzen. Dem c-di-GMP kommt möglicherweise als intrazelluläres
Signalmolekül eine Schlüsselrolle zu. Vor diesem Hintergrund kann man spekulieren, dass
die cup-Genexpression und damit möglicherweise der autoaggregative Phänotyp von
P. aeruginosa durch die Domänen GGDEF und EAL über die Umsetzung des c-di-GMP
reguliert werden (Abb. 13).
72 DISKUSSION
Abbildung 13: Darstellung der intrazellulären Signalkaskade, die möglicherweise zu einem
Biofilm-Phänotyp bei P. aeruginosa führt.
Die GGDEF-Domäne in regulatorischen Proteinen, wie z. B. WspR oder PA4843 beeinflusst über die
Biosynthese des neuen Signalmoleküls zyklisches di-GMP (c-di-GMP) möglicherweise die
cup-Genexpression in P. aeruginosa positiv. Es werden Cup-Fimbrien auf der Zelloberfläche
exprimiert und ein autoaggregativer Phänotyp entsteht. Eine negative Regulation des Biofilm-
Phänotyps entsteht dagegen über den Abbau des c-di-GMP durch die EAL-Domäne z. B. im
phänotypischen Variant-Regulator PvrR. Das c-di-GMP spielt möglicherweise als intrazelluläres
Signalmolekül eine Schlüsselrolle beim phänotypischen Switch.
5.1.2 Mutationen in den Genen mutS und mutL führen zu einem schnell
wachsenden Phänotyp ähnlich der Revertante 20265
Unter den Transposonmutanten der SCV 20265 befinden sich Mutanten mit einer
Transposoninsertion in den Genen mutS (PA3620) und mutL (PA4946). Auffällig ist, dass
diese Mutanten den Phänotyp der in vitro generierten Revertante 20265 auf Blutagar zeigen
(Abb. 14).
Signale aus der Umwelt Temperatur?
GGDEF-Domäne(WspR, PA4843, andere Proteine?)
EAL-Domäne(PvrR, andere Proteine?)
putativeFimbrienstrukturen
autoaggregativer SCV-Phänotyp
c-di-GMP
c-di-GMP
73 DISKUSSION
SCV SCV-Tn5-M R 7 REV
Abbildung 14: Wachstum der zwei Morphotypen SCV und Revertante des P. aeruginosa-
Stammes 20265 und der Transposonmutante SCV-Tn5-M R7 der mutagenisierten SCV 20265
auf Agar-Platten.
Koloniemorphologie der SCV und der klonalen Revertante (REV) 20265 im Vergleich zur Mutante
SCV-Tn5-M R7 auf Columbia-Blutagar nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C.
Die Proteine dieser Gene gehören zum DNA-Reparatur-System, welches nach dem Einbau
falscher Basen bei der DNA-Synthese aktiviert wird. Besonders genau wurde dieser
Mechanismus bei Escherichia coli studiert. Mutationen in den Genen mutS und mutL führen
zu den so genannten Hypermutatoren, die eine erhöhte Mutationsrate genomweit aufweisen.
Untersuchungen mit klinischen P. aeruginosa-Isolaten von CF-Patienten zeigten, dass 36%
der Patienten mit Hypermutatoren kolonisiert sind, die für Jahre in den meisten Patienten
persistieren. Dagegen wurden keine Hypermutatoren in Patienten mit einer akuten
P. aeruginosa-Infektion gefunden (OLIVER et al. 2000). Die Hypermutatoren scheinen in
dem heterogenen Habitat der CF-Lunge gegenüber dem Wildtyp besondere Selektionsvorteile
zu besitzen. Mit einem defekten DNA-Reparatur-System ist die Wahrscheinlichkeit auch
vorteilhafte Mutationen zu erhalten, größer als mit einem funktionsfähigen System.
Es ist zwar denkbar, dass die alleinige Mutation in den Genen mutS und mutL in der SCV
20265 zu einem schnell wachsenden Phänotyp ähnlich der Revertante 20265 führt.
Wahrscheinlicher ist jedoch, dass die in vitro erzeugten Hypermutatoren durch ihr defektes
DNA-Reparatursystem offensichtlich sekundäre Mutationen aufweisen, die auf Blutagar ein
schnelles Wachstum zulassen. Da allein die Mutanten mit einem defekten DNA-
Reparatursystem den Phänotyp der Revertante 20265 zeigen, ist es denkbar, dass sekundäre
Punktmutationen, die durch Transposoninsertionen nicht erzeugt werden können, für den
Revertanten-Phänotyp verantwortlich sind.
74 DISKUSSION
5.2 Ausblick
Die mikrobiologische Besonderheit von P. aeruginosa, in der CF-Lunge morphologische
Varianten zu bilden, die sich als so genannte Nischenspezialisten besonders gut an ihr Habitat
anpassen, trägt maßgeblich zur Persistenz des Erregers in der CF-Lunge bei. Selbst eine
intensive Chemotherapie vermag den Erreger aus der chronisch infizierten CF-Lunge nicht
mehr zu eliminieren. In dieser Arbeit konnte in vitro gezeigt werden, dass Mutationen zu
einem phänotypischen Switch bei P. aeruginosa führen. Allerdings sollten zukünftige
Untersuchungen klären, welche Rolle die in dieser Arbeit beschriebenen Cup-Fimbrien in
vivo spielen, d. h. welche Bedeutung den Cup-Fimbrien bei der P. aeruginosa-
Biofilmentwicklung in der CF-Lunge zu kommt und ob die SCVs durch die Expression der
Cup-Fimbrien tatsächlich Selektionsvorteile erhalten. Des Weiteren sollte ihre mögliche Rolle
als Virulenzfaktoren bei P. aeruginosa nicht unbeachtet bleiben. Gegenwärtig werden in
unserer Arbeitsgruppe klinische SCVs von P. aeruginosa, die aus dem Respirationstrakt von
CF-Patienten isoliert wurden, mit einem polyklonalen Antikörper auf die Expression von
Cup-Fimbrien untersucht. Besonders interessant ist es, die Lokalisation der SCVs mit Cup-
Fimbrien direkt im Lungengewebe (Explantat) von transplantierten CF-Patienten zu
identifizieren und dadurch ihre Nische zu lokalisieren.
75 ZUSAMMENFASSUNG
6. Zusammenfassung
Verena Wild
Molekulare Charakterisierung von langsam wachsenden Subpopulationen (small
colony variants) von Pseudomonas aeruginosa isoliert aus dem Respirationstrakt von
Mukoviszidosepatienten
Pseudomonas aeruginosa trägt bei Patienten mit Cystischer Fibrose (CF) in Form einer
chronischen Lungeninfektion maßgeblich zur Morbidität und Mortalität bei. Obwohl die
Mehrzahl der Patienten nur mit einem P. aeruginosa-Klon kolonisiert sind, entsteht in dem
sehr heterogenen und sich ständig wechselnden Habitat der CF-Lunge eine große
morphologische Differenzierung des Erregers. So werden neben dem mukoiden
P. aeruginosa-Phänotyp, dessen exzessive Exopolysaccharidbildung (Alginat) eine wichtige
Rolle bei der Pathogenese der chronischen Lungeninfektion zugeschrieben wird, so genannte
small colony variants (SCVs) aus dem Respirationstrakt von CF-Patienten isoliert. Es konnte
gezeigt werden, dass das Auftreten von SCVs mit schlechten Lungenfunktionsparametern und
einer inhalativen Antibiotikatherapie korreliert und diese nach mehreren Passagen in
reichhaltigem Flüssigmedium zu einem schnell wachsenden Phänotyp revertieren.
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der molekularbiologischen Zusammenhänge, die zu
diesem phänotypischen Switch bei P. aeruginosa in der CF-Lunge führen und insbesondere
den SCV-Phänotyp entstehen lassen. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei einer
klinischen Subgruppe von autoaggregativen und hyperpilierten SCVs geschenkt, die
scheinbar mit ihrer erhöhten Fähigkeit zur Biofilmbildung in der einzigartigen Umwelt der
CF-Lunge selektioniert werden. Mit der Hypothese, dass Mutation und Selektion die
treibenden Kräfte der morphologischen Differenzierung sind, wurde eine
Transposonmutagenese mit einer SCV und einem Wildtyp eines klinischen P. aeruginosa-
Stammes durchgeführt. Einzelne Gene, deren Mutationen zu einem langsam oder schnell
wachsenden Phänotyp bei P. aeruginosa führen, sollten auf diesem Wege identifiziert
werden.
Im Wildtyp eines klinischen P. aeruginosa-Stammes führten 20 unterschiedliche Mutationen
zu einem langsam wachsenden Phänotyp und in der zum Wildtyp klonalen SCV führten 11
76 ZUSAMMENFASSUNG
unterschiedliche Mutationen zu einem schnell wachsenden Phänotyp. Beim Vergleich der
Transposonmutanten in ihrer Koloniemorphologie ließ sich insbesondere unter den langsam
wachsenden Mutanten eine erhebliche Variabilität feststellen. Allerdings scheint langsames
Wachstum und Autoaggregation bei P. aeruginosa miteinander verknüpft zu sein.
Die nähere Untersuchung einer langsam wachsenden und autoaggregativen
Transposonmutante (25/C1) zeigte eine Hochregulation der P. aeruginosa chaperone/ usher
pathway (cup)-Gene. Offensichtlich kodieren die (cup)-Gene für Fimbrienstrukturen auf der
Bakterienzelloberfläche und ihre Expression ist möglicherweise für einen autoaggregativen
Phänotyp von P. aeruginosa verantwortlich.
Die Ergebnisse in dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die cup-Genexpression und damit der
autoaggregative Phänotyp von P. aeruginosa möglicherweise durch Proteine mit einer
GGDEF-Domäne positiv reguliert wird, während eine negative Regulation der
cup-Genexpression in P. aeruginosa durch eine weitere Domäne und zwar durch die
EAL-Domäne im phänotypischen Variant-Regulator PvrR erfolgt. Die Expression der
Fimbrienstrukturen auf der Bakterienzelloberfläche bei P. aeruginosa könnte also in
antagonistischer Weise durch Regulatorproteine mit einer GGDEF-Domäne und einer EAL-
Domäne über die Umsetzung des neuen Signalmoleküls zyklisches di-GMP beeinflusst
werden. Das zyklische di-GMP spielt als intrazelluläres Signalmolekül dabei möglicherweise
eine Schlüsselrolle beim phänotypischen Switch von P. aeruginosa.
77 SUMMARY
7. Summary
Verena Wild
Molecular characterization of slow growing subpopulations (small colony variants) of
Pseudomonas aeruginosa isolated from the respiratory tract of cystic fibrosis
patients
Chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection is the major cause of morbidity and
mortality in patients with cystic fibrosis (CF). Although most CF patients are colonised with
only one P. aeruginosa clone, the pathogen exhibits a substantial morphotypic diversity in the
heterogeneous and ever-changing habitat of the CF lung. Apart from the mucoid P.
aeruginosa phenotype whose excessive exopolysaccharide (alginate) production obviously
plays a major role in the pathogenesis of CF, it has been recognised that so called small
colony variants (SCVs) can be isolated from the respiratory tract of CF patients. The recovery
of SCVs correlates with poor lung function parameters and inhaled antibiotic therapy.
Another distinct feature of the SCVs was their reversion after several passages in rich medium
to a fast growing phenotype.
The aim of this study was to identify the molecular mechanism that lead to a phenotypic
switch of P. aeruginosa in the CF lung and particularly the emergence of SCVs. Attention
was focused on a clinical subgroup of autoaggregative and hyperpiliated SCVs with an
increased capability of biofilm formation, which apparently select in the unique environment
of the CF lung. With the aim to verify the hypothesis that mutation and selection are the
driving forces for morphologic diversity, a transposon mutagenesis of a SCV and wildtype P.
aeruginosa strain was carried out.
In the wildtype of a clinical P. aeruginosa strain 20 different mutations led to a slow growing
phenotype and 11 different mutations in the clonal SCV led to a fast growing phenotype.
Among the transposon mutants a substantial diversity in their colony morphology particularly
among the slow growing mutants occurred. Nevertheless, it seemed that slow growth and
autoaggregation in P. aeruginosa were linked.
The characterisation of an autoaggregative and slow growing transposon mutant (25/C1)
exhibited an upregulation of the P. aeruginosa chaperone/ usher pathway (cup) genes.
78 SUMMARY
Apparently the (cup) genes encode for fimbrial structures on the bacteria surface and their
expression may be responsible for the autoaggregative phenotype of P. aeruginosa.
The results of this study implicate the expression of the cup genes (and therefore the
autoaggregative phenotype of P. aeruginosa) might be positively regulated by proteins with a
GGDEF domain, whereas a negative regulation of the cup gene expression in P. aeruginosa
be caused by the EAL domain containing phenotype variant regulator (PvrR). The expression
of the fimbrial structures on the bacteria surface at P. aruginosa could be influenced by
regulator proteins containing a GGDEF domain and EAL domain in an antagonising way. The
novel intracellular signal molecule cyclic di-GMP might play a key role in the phenotypic
switch of P. aeruginosa.
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Toxins of Pseudomonas aeruginosa: new perspectives.
Rev. Infect. Dis. 5 Suppl. 4, 715-722
WOZNIAK, D. J., T. J. WYCKOFF, M. STARKEY, R. KEYSER, P. AZADI, G. A.
O’TOOLE u. M. R. PARSEK (2003):
Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14
and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms.
Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100, 7907-7912
YABUUCHI, E., K. YOSHIMASA, H. OYAIZU, I. YANO, H. HOTTA, Y. HASHIMOTO,
T. EZAKI u. M. ARAKAWA (1992):
Proposal of Burkholderia gen. nov. and transfer of seven species of the genus Pseudomonas
homology group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia (Palleroni
and Holmes 1981) comb. nov.
Microbiol. Immunol. 36, 1251-1275
YAHR, T. L., A. J. VALLIS, M. K. HANCOCK, J. T. BARBIERI u. D. W. FRANK (1998):
ExoY, an adenylate cyclase secreted by the Pseudomonas aeruginosa type III system.
Proc. Natl. Acad. Sci USA. 95, 13899-13904
ZIERDT, C. H., u. P. J. SCHMIDT (1964):
Dissociation in Pseudomonas aeruginosa.
J. Bacteriol. 87, 1003-1010
ZOGAJ, X., M. NIMTZ, M. ROHDE, W. BOKRANZ u. U. RÖMLING (2001):
The multicellular morphotypes of Salmonella typhimurium and Escherichia coli produce
cellulose as the second component of the extracellular matrix.
Mol. Microbiol. 39, 1452-1463
102 ANHANG
9. Anhang
9.1 Chemikalien
• Agarose Seakem LE, Biozym
• Ampuwa (Wasser für Injektionszwecke), Bayer AG
• Borsäure, Merck
• Bromphenolblau, Sigma
• Calciumchlorid Dihydrat, Sigma
• Carbenicillin Na2-salz, Serva
• CDP-Star, Roche Diagnostics
• Citric acid (Zitronensäure), Sigma
• CSPD, Tropix/ PE Applied Biosystems
• DEPC, Applichem
• Ethanol absolut, J. T. Baker
• Ethidiumbromidlösung, Roth
• Formaldehyde (Formalin) für Molekularbiologie, Sigma
• Formamide für Molekularbiologie, Sigma
• Gentamicin Solution (Gentamicin-Lösung), Sigma
• Gluconic acid (Glukonsäure), Sigma
• Glycerol 99% für Molekularbiologie, Sigma
• Glyzerin absolut, Merck
• Isopropanol (2-Propanol), Merck
• Kaliumdihydrogenphosphat, Merck
• di-Kaliumhydrogenphosphat, Merck
• di-Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat, Merck
• Magnesiumchlorid-Hexahydrat, Merck
• Magnesiumsulfat, Sigma
• Maleic acid (Maleinsäure), Sigma
• 2-Mercaptoethanol, Sigma
• MOPS, Serva
103 ANHANG
• Natriumacetat für Molekularbiologie, Sigma
• Natriumammoniumhydrogenphosphat-Tetrahydrat, Fluka Chemie GmbH
• Natriumchlorid, Merck
• Natriumcitrat-Dihydrat, J. T. Baker
• Natriumhydroxid, Merck
• Nujol Mineral Oil, PE Applied Biosystems
• Salzsäure mind. 37%, Riedel-de Haën AG
• SDS, Sodium dodecyl sulfate für Molekularbiologie, Sigma
• Sucrose (Saccharose), Sigma
• Titriplex® III (EDTA), Merck
• TRIS, Serva
• Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate) für Molekularbiologie, Sigma
• Xylencyanol FF, Applichem
9.2 Gebrauchsmaterialien
• 0.5 und 1.5 ml Mikroreaktionsgefäße, Sarstedt
• 25 und 50 ml Polypropylen Falcons, Greiner bio-one, Cellstar
• Faltenfilter, Schleicher & Schull
• Filterpapier, Whatman
• 96-well-Platten für Suspensionskultur, Greiner bio-one
• Polystyrolröhrchen, Greiner
• Petrischalen, Sarstedt
• Küvetten für OD-Messung, Sarstedt
• Gene Pulser/ E. coli Pulser Cuvettes, Bio-Rad
• Nylonmembranen: Hybond-N für Southern Blot, Hybond-N+ für Northern Blot,
Amersham Biosciences
• Röntgenhyperfilm: MP Envelope, Amersham Biosciences
104 ANHANG
9.3 Geräte
• Brutschrank, Heraeus
• Easy Enhanced Analysis System (Easy RH-3, Videokamera 429K)
• Elektrophoresekammern: Bio-Rad; Mini M, Peqlab
• Gefriertruhen, Heraeus
• Gene Pulser, Bio-Rad
• Hybridisierungsofen, Biometra
• Inkubationsschüttler TH30, Edmund Bühler
• Labortiefkühlschrank, Liebherr
• Netzgeräte: Phero-stab. 500, Biotec Fischer; 200/ 2.0 Power Supply, Bio-Rad
• pH-Meter 761 Calimatic, Knicke
• Photometer Ultraspec III, Pharmacia LKB
• Schüttler Unimax 2010, Heidolph Instruments
• Sicherheitswerkbank HS 18/2, Heraeus
• SpeedVac-Concentrator, Savant
• Thermomixer 5436, Eppendorf
• Thermocycler Genius, Techne
• Thermocycler Landgraf
• UV Stratalinker 1800, Stratagene
• Waagen: PL 1200, Mettler; BP 211 D, Sartorius; 3719 MP, Sartorius
• Wasserbäder: 1002, GFL; 1003, GFL
• Zentrifugen: Biofuge 13 und fresco, Heraeus
Kühlzentrifuge Modell, J2-21, Beckmann
Minifuge GL, Heraeus
Tischzentrifuge Typ 1000, Hettich
105 ANHANG
9.4 Untersuchung der Transposonmutanten des WT 20265 auf
langsames Wachstum und Autoaggregation
Tabelle 7: WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Columbia-Blutagar und Müller-
Hinton-Agar.
Tn5-Mutante Columbia-Blutagar Müller-Hinton-Agarsehrklein
klein(SCVs)
mittel groß sehrklein
klein(SCVs)
mittel groß
WT-Tn5-M24/A3
X X
WT-Tn5-M24/A11
X X
WT-Tn5-M24/B1
X X
WT-Tn5-M24/E1
X X
WT-Tn5-M24/E4
X X
WT-Tn5-M24/E7
X X
WT-Tn5-M24/E8
X X
WT-Tn5-M24/F5
X X
WT-Tn5-M24/G11
X X
WT-Tn5-M24/H4
X X
WT-Tn5-M24/H8
X X
WT-Tn5-M25/B3
X X
WT-Tn5-M25/C1
X X
WT-Tn5-M25/E1
X X
WT-Tn5-M2C
X X
WT-Tn5-M3E
X X
WT-Tn5-M13A
X X
WT-Tn5-M14F
X X
WT-Tn5-M18A
X X
WT-Tn5-M18C
X X
106 ANHANG
Tn5-Mutante Columbia-Blutagar Müller-Hinton-Agarsehrklein
klein(SCVs)
mittel groß Sehrklein
klein(SCVs)
mittel groß
WT-Tn5-M18F
X X
WT-Tn5-M24C
X X
WT-Tn5-M24E
X X
WT-Tn5-M 33C
X X
WT-Tn5-M34B
X X
WT-Tn5-M34C
X X
WT-Tn5-M37B
X X
WT-Tn5-M37D
X X
WT-Tn5-M37E
X X
WT-Tn5-M41D
X X
WT-Tn5-M42B
X X
WT-Tn5-M43A
X X
Tabelle 8: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Columbia-
Blutagar und Müller-Hinton-Agar auf autoaggregatives Wachstum.
Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 24/A3 Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/A11 Homogen gelb-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/B1 Aggregate, kein Rand, klarWT-Tn5-M 24/E1 Keine Aggregate, leichter Rand, homogen molkigWT-Tn5-M 24/E4 Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/E7 Homogen milchig-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/E8 1-2 größere Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 24/F5 Kleine Aggregate, kleiner Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 24/G11 Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/H4 Aggregate, deutlicher Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 24/H8 3-4 Aggregate, kein Rand, molkig > eher wie WT 20265WT-Tn5-M 25/B3 Wächst nicht anWT-Tn5-M 25/C1 Wenige Aggregate, sehr leichter Rand, molkigWT-Tn5-M 25/E1 Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 2C Wächst nicht anWT-Tn5-M 3E Homogen wäßrig-molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 13A Homogen milchig-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 14F Viele sehr feine Aggregate, kein Rand, molkig
107 ANHANG
Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 18A Homogen milchig-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 18C Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 18F Aggregate, kein Rand, molkigWT-Tn5-M 24C Wächst nicht anWT-Tn5-M 24E Wächst nicht anWT-Tn5-M 33C Aggregate, leichter Rand, molkigWT-Tn5-M 34B Homogen grün-molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 34C Sehr feine Aggregate, deutlicher Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 37B Aggregate, kein Rand, milchig-grünWT-Tn5-M 37D Kleine Aggregate, leichter Rand, milchigWT-Tn5-M 37E Homogen molkig-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 41D Wächst nicht anWT-Tn5-M 42B Homogen molkig-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 43A Aggregate, kein Rand, milchig
Tabelle 9: WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Müller-Hinton-Agar und einem
schnellen Wachstum auf Columbia-Blutagar.
Tn5-Mutante Columbia-Blutagar Müller-Hinton-Agarsehrklein
klein(SCVs)
mittel groß sehrklein
klein(SCVs)
mittel groß
WT-Tn5-M24/A1
X X
WT-Tn5-M24/A12
X X
WT-Tn5-M24/B3
X X
WT-Tn5-M24/B5
X X
WT-Tn5-M24/B6
X X
WT-Tn5-M24/C3
X X
WT-Tn5-M24/C4
X X
WT-Tn5-M24/D7
X X
WT-Tn5-M24/D8
X X
WT-Tn5-M24/D9
X X
WT-Tn5-M24/E5
X X
WT-Tn5-M24/E11
X X
WT-Tn5-M24/F6
X X
108 ANHANG
Tn5-Mutante Columbia-Blutagar Müller-Hinton-Agarsehrklein
klein(SCVs)
mittel groß sehrklein
klein(SCVs)
mittel groß
WT-Tn5-M24/F7WT-Tn5-M24/F10
X X
WT-Tn5-M24/G6
X X
WT-Tn5-M24/G9
X X
WT-Tn5-M24/H2
X X
WT-Tn5-M24/H5
X X
WT-Tn5-M24/H6
X X
WT-Tn5-M24/H7
X X
WT-Tn5-M25/A2
X X
WT-Tn5-M25/A5
X X
WT-Tn5-M25/A9
X X
WT-Tn5-M25/A11
X X
WT-Tn5-M25/B2
X X
WT-Tn5-M25/B4
X X
WT-Tn5-M25/B5x
X X
WT-Tn5-M25/B5
X X
WT-Tn5-M25/B6x
X X
WT-Tn5-M25/B6
X X
WT-Tn5-M25/C6
X X
WT-Tn5-M25/C8
X X
WT-Tn5-M25/D1
X X
WT-Tn5-M25/D2
X X
WT-Tn5-M25/D12
X X
WT-Tn5-M1A
X X
WT-Tn5-M1B
X X
WT-Tn5-M1C
X X
109 ANHANG
Tn5-Mutante Columbia-Blutagar Müller-Hinton-Agarsehrklein
klein(SCVs)
mittel groß sehrklein
klein(SCVs)
mittel groß
WT-Tn5-M1D
X X
WT-Tn5-M1F
X X
WT-Tn5-M2D
X X
WT-Tn5-M2E
X X
WT-Tn5-M3D
X X
WT-Tn5-M4A
X X
WT-Tn5-M4C
X X
WT-Tn5-M4D
X X
WT-Tn5-M5C
X X
WT-Tn5-M5F
X X
WT-Tn5-M7C
X X
WT-Tn5-M7D
X X
WT-Tn5-M7F
X X
WT-Tn5-M8F
X X
WT-Tn5-M9C
X X
WT-Tn5-M9D
X X
WT-Tn5-M9E
X X
WT-Tn5-M10B
X X
WT-Tn5-M10C
X X
WT-Tn5-M12B
X X
WT-Tn5-M15A
X X
WT-Tn5-M15E
X X
WT-Tn5-M16B
X X
WT-Tn5-M16C
X X
WT-Tn5-M17E
X X
WT-Tn5-M28D
X X
110 ANHANG
Tn5-Mutante Columbia-Blutagar Müller-Hinton-Agarsehrklein
klein(SCVs)
mittel groß sehrklein
klein(SCVs)
mittel groß
WT-Tn5-M30F
X X
WT-Tn5-M31A
X X
WT-Tn5-M31C
X X
WT-Tn5-M32C
X X
WT-Tn5-M35B
X X
WT-Tn5-M39B
X X
WT-Tn5-M41E
X X
Tabelle 10: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Müller-Hinton-
Agar und einem schnellen Wachstum auf Columbia-Blutagar auf autoaggregatives Wachstum.
Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 24/A1 Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/A12 Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 24/B3 Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 24/B5 Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/B6 Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/C3 3-4 Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 24/C4 Homogen gelb-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/D7 Homogen molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/D8 Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/D9 Aggregate, kein Rand, grünWT-Tn5-M 24/E5 Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/E11 Leichte Aggregatbildung, kein Rand, türkisWT-Tn5-M 24/F6 Homogen gelb-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/F7 Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/F10 Wächst nicht anWT-Tn5-M 24/G6 Wächst nicht anWT-Tn5-M 24/G8 Aggregate, leichter Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 24/G9 Wächst nicht anWT-Tn5-M 24/H2 Homogen > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/H5 Homogen gelb-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/H6 Wenige Aggregate, leichter Rand, gelb-grünWT-Tn5-M 24/H7 Wenige Aggregate, leichter Rand, gelb-grünWT-Tn5-M 25/A2 Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 25/A5 Homogen molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 25/A9 Aggregate, Rand, molkigWT-Tn5-M 25/A11 Wächst nicht anWT-Tn5-M 25/B2 Wächst nicht anWT-Tn5-M 25/B4 Wächst nicht an
111 ANHANG
Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 25/B5x Wächst nicht anWT-Tn5-M 25/B5 Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 25/B6x Wächst nicht anWT-Tn5-M 25/B6 Wächst nicht anWT-Tn5-M 25C6 Einzelne kleine u. große Aggregate, leichter Rand, gelb-grünWT-Tn5-M 25/C8 Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 25/D1 Aggregate, deutlicher Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 25/D2 Aggregate, leichter Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 25/D12 Homogen molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 1A Homogen gelb-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 1B Sehr geringe Anzahl an kleinen Flocken, leichter Rand, gelb-grünWT-Tn5-M 1C Aggregate, deutlicher Rand, gelb-grünWT-Tn5-M 1D Homogen gelblich > wie WT 20265WT-Tn5-M 1F Sehr kleine Aggregate, kein Rand, molkigWT-Tn5-M 2D Wenige kleine Aggregate, leichter Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 2E Kleine Aggregate, kein Rand, grün-wässrigWT-Tn5-M 3D Wenige Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 4A Homogen grün-molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 4C Homogen grün-molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 4D Homogen grün-molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 5C Wächst nicht anWT-Tn5-M 5F Aggregate, deutlicher Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 7C Kleine Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 7D Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 7F Viele kleine Aggregate, kein Rand, grün-wässrigWT-Tn5-M 8F Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 9C Viele Aggregate, deutlicher Rand, grün-wässrigWT-Tn5-M 9D Wächst nicht anWT-Tn5-M 9E Wächst nicht anWT-Tn5-M 10B Wenige kleine Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 10C Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 12B Wenige kleine Aggregate, kein Rand, molkigWT-Tn5-M 15A Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 15E Sehr kleine zahlreiche Aggregate, Rand, grün-klarWT-Tn5-M 16B Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 16C Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 17E Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 28D Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 30F Aggregate, leichter Rand, milchigWT-Tn5-M 31A Aggregate, leichter Rand, milchigWT-Tn5-M 31C Wächst nicht anWT-Tn5-M 32C Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 35B Wächst nicht anWT-Tn5-M 39B Aggregate, kein Rand, molkigWT-Tn5-M 41E Wächst nicht an
112 ANHANG
Tabelle 11: Autoaggregative WT-Tn5-Mutanten mit einem intermediären bis schnellen Wachstum auf
Columbia-Blutagar und Müller-Hinton-Agar.
Tn5-Mutante Columbia-Blutagar Müller-Hinton-Agarsehrklein
klein(SCVs)
mittel groß sehrklein
klein(SCVs)
mittel groß
WT-Tn5-M24/A2
X X
WT-Tn5-M24/A4
X X
WT-Tn5-M24/A6
X X
WT-Tn5-M24/D10
X X
WT-Tn5-M25/B11
X X
WT-Tn5-M25/C9
X X
WT-Tn5-M25/D5
X X
WT-Tn5-M25/D8
X X
WT-Tn5-M5B
X X
WT-Tn5-M14C
X X
WT-Tn5-M17A
X X
WT-Tn5-M30D
X X
WT-Tn5-M31D
X X
WT-Tn5-M31E
X X
WT-Tn5-M33E
X X
WT-Tn5-M43D
X X
Tabelle 12: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem intermediären bis schnellen Wachstum
auf Columbia-Blutagar und Müller-Hinton-Agar auf autoaggregatives Wachstum.
Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 24/A2 Kleine Aggregate, deutlicher Rand, milchigWT-Tn5-M 24/A4 Kleine Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 24/A6 Wenige kleine Aggregate, sehr leichter Rand, molkigWT-Tn5-M 24/D10 Aggregate, deutlicher Rand, milchig-grünWT-Tn5-M 25/B11 Keine Aggregate, leichter Rand, gelb-grün milchikWT-Tn5-M 25/C9 Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 25/D5 Aggregate, deutlicher Rand, molkig
113 ANHANG
Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 25/D8 Aggregate, leichter Rand, molkigWT-Tn5-M 5B Kleine Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 14C Sehr kleine Aggregate, Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 17A Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 30D Kleine Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 31D Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 31E Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 33E Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 43D Kleine Aggregate, deutlicher Rand, grün-molkig
9.5 Untersuchung der Transposonmutanen der SCV 20265 auf
schnelles Wachstum und Autoaggregation
Tabelle 13: Untersuchung der SCV-Tn5-Mutanten auf ein schnelles Wachstum auf Columbia-Blutagar
und autoaggregatives Wachstum.
Tn5-Mutante Columbia-Blutagar BiofilmbildungSCV-Tn5-M 1A groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1C groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 1E groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1F groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1G groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1L groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 1O groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1P groß > ähnlich WT 20265 kein vollständiger Verlust der Biofilmb.SCV-Tn5-M 1Q groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1R groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1T groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2A groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2E groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 2F groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2H groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2J groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2L groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 2M groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 3A groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 3B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 3D groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3E groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3F groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3K groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 4B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265
114 ANHANG
Tn5-Mutante Columbia-Blutagar BiofilmbildungSCV-Tn5-M 4C groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4H groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4I groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4J groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4K groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4L groß > ähnlich WT 20265 kein vollstäniger Verlust der Biofilmb.SCV-Tn5-M 4M groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5D groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5F groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5G groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5H groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5J groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5K groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6A groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6D groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6E groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6F groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6G groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6H groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6K groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6L groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6M groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6N groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6O groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6Q groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6R groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6S groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6T groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6V groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 7A groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8A groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8B groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8C groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8D groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8F groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R3 groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R4 groß > zwischen WT u. REV 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R5 groß > zwischen WT u. REV 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1D groß > ähnlich REV 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 11A groß > ähnlich REV 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R1 groß > ähnlich REV 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R2 groß > ähnlich REV 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R6 groß > ähnlich REV 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R7 groß > ähnlich REV 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1H intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1I intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1J intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1M intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 1N intermediär kein vollständiger Verlust der Biofilmb.SCV-Tn5-M 2C intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 2P intermediär homogen > wie WT 20265
115 ANHANG
Tn5-Mutante Columbia-Blutagar BiofilmbildungSCV-Tn5-M 3C intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3G intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3H intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3J intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3L intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3M intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3N intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 4A intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4F intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 4G intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 5A intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5C intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 5E intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5I intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5L intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5M intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5N intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6I intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6U intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8E intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 9A Intermediär wie SCV 20265
9.6 Experimentell ermittelte Sequenzen: Transposonmutanten
des WT 20265
Mutante 24/A3:
CGAGCTTCGGGTTGAGAGTGTATAAGAGACAGGCCGCGCGCCGACGGCCGCAGCTATCGCGAGCAGATCACCTTC
GTCAAGGATCGTCCGGGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGACATCTGCATCGAGAC
CGGCGAGACCGTCTACATCCGTTCCAAGGCCGTGGTCCTGGCCACTGGCGGTGCCGGCCGTATCTACGCCTCCAC
CACCAACGCGCTGATCAACACCGGTGACGGCGTGGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGC
AGANA
Mutante 24/A11:
AGAGCTTCGGGTTGAGAGTGTATAAGAGACAGGGTCTGGGCCACGGAATGGCTGGATTCGAAGGCCAGGTCGGTG
ACGATCAGGGAACCTTTGTTACCGCGTTTCACGCAGGCCGTGTGATAGGCCATTTCCTCGTTGCTGACCGGCAGG
GTGCTGTCGTGACCCTGCAATACCATTCCGAGCGAATCTCCGACCAGAAGCACGTCCACGCCGGCCTGGCTGGCG
GTGTGGGCGAAGGTGGCGTCGTAGCAGGTCAGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAAATTCGAGCA
116 ANHANG
Mutante 24/E1:
GCATTCGACGCCTACTACGTGTTGTTCAGCTTCCAGCGCATGTGTCCCCGTACATTGTTTACAAGCTTGAATTCG
AGCAGGGTCCTTTTCTTTGGCGACAAGTTAGACTGTCAGGCAAAAAGAAGGGGCGGCGTCTTCCCGATGCCGGTT
TCGTGTAGCTGCGGATACTGGTCGCTGACCCGGTACCTGAAGCGGTCCCTGGTGGGCAGCTCGCGAGCCATGTGT
CCCCGTACATCGTGAGTACCTTGAATTCTTGCCGTTGCTCCCGTAACCTGCCATAAAACCCAGCGAAGCTTCTTC
GGCAGCCATTTTAGAAAAATATATTCCTTTAATTTCAATAAGTTACTTAAATTCACCGAGCGTTTTTTGTTATCC
TCCCGGGCATTTATCTACTTAGGCTCACACGCCGTGTAAGTTAATGCTTACAAGAGCAGACACAAAAAACCCGGC
GAACGCCGGGTCTTCAGTGGGTCTAAGGTTTTCCGTCACTGGAACAGCGCGTCACTCGACAGGCCATTCTTCTCC
AGGATCTCCCGCAGGCGCTTCAGCGCCTCGACCTGGATCTGACGAACCCGCTCGCGGGTCAGGCCGATTTCCTGG
CCGACCTCTTCCAGCGTGCTGCTTTCGTGCCCGCGCAAGCCGAAGCGGCGAATCACCACCTCACGCTGCTTGTCG
GTGAGTTCCGTCAGCCACTGGTCGATGCTTTCGCTGAGATCGTCATCCTGCAGCAGCTCGCACGGGTC
Mutante 24/E4:
ATTCTCGATGATGGTTGAGATGTGTATAAGACACAGGCACCGGGATACTGTGGGTGGTGTCGGTGAGCAGCAGGA
CCCGCGCGGTATAGGGCATCACCTCGACCACCTGGCCCATCAGGCCGCTGGCATCGAGCACCGGCTGGCCGACGA
AGACGCCGTCGTTCTCGCCCTTGTCGATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAAATTCGAGCAGAA
Mutante 24/E7:
ATGAACTTCAGGTTGAGATGGTATTAAAAACAGGTCTTGGACAGTTCGCAGATGCCGGGCAGGCGGCTGTGCAGG
ACTTCCTCGCCGAGGTGGTCGAGCTTCAGCAGCACGTGGTCCTTGTTCGGGCCCACGCCGTTGCCGGCCAGGACT
TCCTTGACCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACTGANAATTTCGAGCAGA
Mutante 24/E8:
AAGAAGTTAGGGTTGAGAGTGTATAAGAGACAGGCCGCGCGCCGACGGCCGCAGCTATCGCGAGCAGATCACCTT
CGTCAAGGATCGTCCGGGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTGGAAATTCGAGCAGA
Mutante 24/F5:
AAGAGCTTAGGATTGAGATGGTTAAGAGAAGTCTCCGAAGTGCTGTCGTCGCCGGAGTACGACGAGCACAAGTCC
ACCGTGCCGCTGGCCCTGGGCCACGACATCGGCGGTCGGCCGATCATCACCGACCTGGCGAAGATGCCGCACCTG
CTGGTGGCCGGTACCACCGGCTCCGGTAAGTCGGTGGGGGTCAACGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACTG
ANATTTCGAGCAGA
117 ANHANG
Mutante 24/G11:
AGGCGCTGACCTTAAGGTTCTCGCCCAAGCAACTGCCCGAGCCGCTGCCGGCCAACTGGTCGATCGCTCCCGCGG
AGGACGGCGAGGTGCTGGTGAGCATCCACGAGCGCTGCGAGTTCAAGGTGGACAGCTACCGTGCGCTGACGGTGA
AGTCCGCCGGCCAGTTGCCCACCGGTTTCGAACCGGGCGAGCTGTACAACTCGCGCTTCCACCCGCGCGGCCTGC
AGATGTCGGTGGTCGCCGCGACCGACGCGATCCGCTCCACCGGCATCGACTGGAAGACCATCGTCGACAACGTCC
AGCCCGACGAGATCGCGGTATTCTCCGGCAGCATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAGTGAAATTTTTNNNAGA
Mutante 24/H4:
ACCCAGCGTGAAGCGTAGAGCGTGGCCAGGTACTGGCCAAGCCGGGCACCATCAAGCCGCACACCAAGTTCGAGT
GCGAAGTGTACGTGCTGTCCAAGGAAGAAGGTGGTCGTCACACCCCGTTCTTCAAGGGCTACCGTCCGCAGTTCT
ACTTCCGTACCACTGACGTGACCGGTAACTGCGAGCTGCCGGAAGGCGTAGAGATGGTAATGCCGGGCGACAACA
TCAAGATGGTTGTCACCCTGATCGCTCCGATCGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAAACTGAATTTTT
Mutante 24/H8:
ATAGAAACTTAGGGTTGAGATGTGTATTAAGAGAACAGACGCCGAGTAGGGACTTGTTCGGCTCGTAGCGGTTGT
TCTCGGTGAAGGCCGGATCGCTCGGTGCCAGCGAGCCATAGACTTCGTCGGTGGAGACATGTGTCCCCGTACATC
GTTAGAACTGGAAATTTCGAGCAGAAGNNNNTGC
Mutante 25/B3:
TACGGTGGACAGACCCCGCTGAAGCTCTGCCGCGCCCTCGAAGAGGCCGGCGTGCCGATCATCGGCACCAGTCCG
GACGCCATCGACCGTGCCGAAGACCGCGAGCGCTTCCAGCAGATGGTCCAGCGCCTGAACCTGCGCCAGCCGGCC
AACGCCACCGCGCGCAGCGAAGACGAGGCCCTGGCCGCGTCCAAGGCCATCGGATATCCGCTGGTGGTACGCCCG
TCCTACGTGCTGGGCGGGCGGGCGATGGAAATCGTCTACCAGGAAGAAGAACTCAAGCGCTACATGTGTCCCCGT
ACATCGTTAAANNAAAATTNNNAAGC
Mutante 25/C1:
TGAATGCCTTGAGTGTTCAGGACCTTCAGGGCTTCCTTGGCGATTTGCTCGTCGGCAGCCGGGAGGAACTTGTCC
AGGGCTTCCAGCACGGTCACCTCGGCACCCAGGCGGGCCCATACCGAACCCAGCTCCAGGCCGATGACGCCGGCG
CCGATCACACCCAGCTTCTTCGGCACGGCCTGGAATTCCAGGGCGCCGGTGGAGTCGACGATGATGTCGTCGGTC
AGCGGGGCCGGCGGGATCTCCACCGGGCGGGAGCCGGAAGCGATGATCACGTTCTCGGCTTCCAGGACCTGGGTC
TTGCCGTCCAGACCGGTCACTTCCACCTGCTTGTTGGCCAGCAGCTTGCCGTGGCCTTCGAAGGAGGTCACGCCG
TTGGCCTTGAACAGGGTAGCGATGCCGCCGGTCAGGTTCTTGACGATGTTGGCCTTGCGCGCAACCATCGCCGGA
ACGTCGATGGTGACGCCCTTGGCTTCGATACCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAATGAAATTTTTC
118 ANHANG
Mutante 25/E1:
ATTCTCGATGATGGTTGAGATGTGTATAAGAGAAGGGGTGAAGGTGGTACTGACCACGAAGAACAGCAGCAGGAC
GAAGATCACGTCGATCAGCGACGCCAGGTTGATGAAGACGTCTTCACGGGCGGCACCCGCCCGTCTGCGGCGGAA
TTTCACGCTTTGCCTTCCTCGACGTAGTCGACTTCACGATCGCCCTGCACCACTTCCACCAGCTTGATGGCCTCC
TGCTCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGGAATTTCGAGCAG
Mutante WT-Tn5-M 2C:
ATGAGTTAGGCTTGAGAATGGTATAAGAAACAGGGCCCAGCCGGGCGGCAGCCTGTCCGGAACCATCCGGGTACC
GGGCGACAAGTCGATTTCCCATCGCTCGATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGGAAATTCGAGCAGA
Mutante WT-Tn5-M 3E:
AAGAGCTTCAGGGTTGAGATGTGTATAAGAGACAGCACCATTGAAGTCGGCGAAAGGACCATCGATGACACGAAC
GGTCTCGCCCGGCTCGAACAGGGTCTTCGGCTTGGGCTTGTCGCCGCTATCGGCCACGCGACGCAGGATTGCATC
AGCCTCACGATCGGTGATCGGAGCCGGCTTGTCGGCAGTCCCGCCGATGAAGCCCATGTGTCCCCGTACATCGTT
AGAAGTGAAATATCCGAGCA
Mutante WT-Tn5-M 13A:
CTGACTCGCTCTCGCCGGGGAAGTCCTCCAGTGGCGGGTGGATGGTCAGGCGATAACCGCTGCCATCGGCCAGGC
GGCTCTGGGTGAACGGCAACACCCGCGCCCGGTCCAGGCGGACGAACTTGGTGGTGGCGGTGACGGTGGCCGCCG
GGATGCCGAACAGCGGCANNNAACAGGCTCTGCTTGGCGCCGTAGTCCTGGTCCGGTGCGTACCAGATGGCGCGG
CCGCCACGCAGCACCTTGAGCATCGAGCGCACGTCCTCGCGCTCGATGGCGGTGGCATCGAGGTTGTGCCGCTCG
CGGCCACGGCGCTGGACGTAGTCGAACACCGGGTTGTCGTGCTCACGGTANNNTGTGTCCCCGTACATCGTTAGA
ANNNAAATTCCNAAA
Mutante WT-Tn5-M 14F:
ATGAAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATTAAGAAGACAGCCCTGGGGCAGATGAGCTGCAACCCCGCCATCGGTGG
CATCGGCAAGAAGCCATCTGGTCAAGGAAATCGACGCCCTTGGCGGCGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAT
TGGAAATTTCGAGCAGANNTGNC
Mutante WT-Tn5-M 18A:
AAAACTTAGGCTTGAGATGGTATAAGAGACAGACCTTGAGCATCGAGCGCACGTCCTCGCGCTCGATGGCGGTGG
CATCGAGGTTGTGCCGCTCGCGGCCACGGCGCTGGACGTAGTCGAACACCGGGTTGTCGTGCTCACGGTACATGT
GTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGGAAATTTCGAGCAGA
119 ANHANG
Mutante WT-Tn5-M 18C:
AAGAACTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACATACCTTGAGCATCGAGCGCACGTCCTCGCGCTCGATGGCGG
TGGCATCGAGGTTGTGCCGCTCGCGGCCACGGCGCTGGACGTAGTCGAACACCGGGTTGTCGTGCTCACGGTACA
TGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGGAAATTTCGAGCAGANA
Mutante WT-Tn5-M 18F:
ACGTGCTTTCANGCTTGAGATGTGTATAAGAAACAGTACCTTGAGCATTCGAGCGCACGTCCTCGCGCTCGATGG
CGGTGGCATCGAGGTTGTGCCGCTCGCGGCCACGGCGCTGGACGTAGTCGAACACCGGGTTGTCGTGCTCACGGT
ACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTGGAATTTCGAGCAGANNCTCGCACCCGCAAATGCCAATGCA
Mutante WT-Tn5-M 24C:
ATTCTCGATGATGGTTGAGATGGTATAAGAGAAGGGGTCTGGGCGTCCACGTCCGGGTTGACCCGCAGCGATACC
GGCGCTTTCACGCCGAGTTCCGCAGCTACCCGTTGCAGGCGCTCCAGCTCTTCGCCGGACTCGACGTTGAAGCAG
TGCACGCCGACTTCCAGGGCGCGGCGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACTGGAAATTCGAGCAGAA
Mutante WT-Tn5-M 34B:
ATGAAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATTAAGAAGACAGATTCAGCCCCCGTGTCGTTTTCGAATTCCGTAGCGAG
AGATGGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTGGAATTCGAGCAGANNC
Mutante WT-Tn5-M 34C:
ATGAACTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGTTTCACGCAGGCCGTGTGATAGGCCATTTCCTCGTTGCT
GACCGGCAGGGTGCTGTCGTGACCCTGCAATACCATTCCGAGCGAATCTCCGACCAGAAGCACGTCCACGCCGGC
CTGGCTGGCGGTGTGGGCGAAGGTGGCGTCGTAGCAGGTCAGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACT
Mutante WT-Tn5-M 37B:
AAGAGCTTCAGGTTGAGATGGTTAGAGACAGATATCGGCCTGCGCGCCGCTCGCAGCGCCGGTGAACTGATTTTC
CGCTCCATCGAACGCCTGGATGTCATCTCGGTCAACGAGAAGGATGCCAAGGACTACGTCACCGAAGTCGATCGC
GCCGCCGAGCAGACCATCGTCGCCGCGCTGCGCAAGGCCTATCCGACTCACGCGATCATGTGTCCCCGTACATCG
TTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGA
Mutante WT-Tn5-M 37D:
TGTATAACAGACAGATATCGCCCTGCGCGCCGCTCGCAGCGCCGGTGAACTGATTTTCCGCTCCATCGAACGCCT
GGATGTCATCTCGGTCAACGAGAAGGATGCCAAGGACTACGTCACCGAAGTCGATCGCGCCGCCGAGCAGACCAT
CGTCGCCGCGCTGCGCAAGGCCTATCCGACTCACGCGATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATTCC
GAG
120 ANHANG
Mutante WT-Tn5-M 37E:
GGCCTGAGATGTGTATAAGAGACAGATATCGCCCTGCGCGCCGCTCGCAGCGCCGGTGAACTGATTTTCCGCTCC
ATCGAACGCCTGGATGTCATCTCGGTCAACGAGAAGGATGCCAAGGACTACGTCACCGAAGTCGATCGCGCCGCC
GAGCAGACCATCGTCGCCGCGCTGCGCAAGGCCTATCCGACTCACGCGATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAA
CTNNNATTTCCGAGCA
Mutante WT-Tn5-M 41D:
AAGAACTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGTGGCAGGCGCCCGCCAGCCTCCCCTTCGGCGACTTCGACG
TGGTGCCGCTGCGCGCCGGCGAGACACTCCGCTGGAAACTGCTGGAGGCCGGGGCATGTGTCCCCGTACATCGTT
AGAACTGGAAATTCGAGCAGAGCTGGTGCT
Mutante WT-Tn5-M 42B:
AAAGAACTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGACCCTGTATTTCGTGGCGCGCGGCGATGGCAGCCATGTG
TCCCCGTACATCGTTAGAAGTTTGAATTCGAGCAG
9.7 Experimentell ermittelte Sequenzen: Transposonmutanten der
SCV 20265
Mutante SCV-Tn5-M R1:
CAGAGGAACTCCTGGAAAACAGCCTTGACGCCGGATCCCGGCGCATTGATGTGGAGGTCGAGCAGGGCGGCATCA
AGTTGCTGCGAGTGCGCGACGACGGTCGCGGCATCCCCGCCGACGACCTGCCGCTGGCCCTGGCTCGCCACGCCA
CCAGCAAGATCCGCGAGCTGGAAGACCTGGAGCGGGTGATGAGCCTCGGCTTCCGTGGCGAGGCGCTGGCCTCGA
TCAGCTCGGTAGCGCGCCTGACCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTTCGAGCA
Mutante SCV-Tn5-M R2:
AAGAGCTTAGGGTTGAGATGGTATAAGAGACAGCAGAGGCTCTTGTGCGCCGAGTCGCGATCGAAGTCCCATGTG
TCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAAGTTGGCTAGTGCGTANTCGTTGACAA
Mutante SCV-Tn5-M R4:
CGGTTCACATCTGCGACTGCAGGCAGTTCTCCAGGCCCATCCTGGCGATCAGGCCAAGCTGTTGCTCCAACCAGT
AGGCGTGGTCTTCCTCGGTGTCGGCCAACTGGGCCTTGAGGATGTCGCGGCTGACGAAGTCCTTATGCTGCTCGC
AGAGGGCGATGCCCTTGGCCAGCGCGGCGCGGACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATTTC
121 ANHANG
Mutante SCV-Tn5-M R5:
AAGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAACAAACAGGTTCACATCTGCGACTGCAGGCAGTTCTCCAGGCCCATCC
TGGCGATCAGGCCAAGCTGTTGCTCCAACCAGTAGGCGTGGTCTTCCTCGGTGTCGGCCAACTGGGCCTTGAGGA
TGTCGCGGCTGACGAAGTCCTTATGCTGCTCGCAGAGGGCGATGCCCTTGGCCAGCGCGGCGCGGACATGTGTCC
CCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATT
Mutante SCV-Tn5-M R6:
AAGAGCTTCAGGNTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGTCAGATCTGCGACTGCAGGTAGTTCTCCAGGCCCATCC
TGGCGATCAGGCCAAGCTGTTGCTCCAACCAGTAGGCGTGGTCTTCCTCGGTGTCGGCCAACTGGGCCTTGAGGA
TGTCGCGGCTGACGAAGTCCTTATGCTGCTCGCAGAGGGCGATGCCCTTGGCCAGCGCGGCGCGGACATGTGTCC
CCGTACATCGTTAGAACTGNNAANTCCGAGCAGA
Mutante SCV-Tn5-M R7:
AAGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGCCGCACACCGCGCCGACCCGGCGCGCGCGGGCCAGCTCG
TCTCGCGCCTCGTGCAGGGCGAAGATGGTCTTGCCGTTGTGGCGCAGGTGGAAAGCCACGTCGAAGCGGGCCAGC
GCCAGGCGCTTGATGACCTCCTGCAGATGGTCGAACTCGGTCTTCTCGGCACGCAGGAACTTGCGCCGCGCCGGG
GTGTTGAAGAACAGGTCGCGAACCTCGACGCTGGTCCCCACCGGGTGCGCCGCCGGCTGTACCCGCGGCTGCATG
TGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATTTCGAGCA
Mutante SCV-Tn5-M 1C:
AAGAGCTTANGGTTGAGAGTGTATAAGAGAAGCATCGGCCGCGCCCAGACCGGCACCGGCAAGACCGCCGCGTTC
CTCATCTCGATCATCACCCAATTGCTGCAGACCCCGCCGCCGAAAGAGCGCTACATGTGTCCCCGTACATCGTTA
GAAGTGGAAATTCGAGCAGA
Mutante SCV-Tn5-M 1D:
AGCTTCGCGCCTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGAAAGCGCCGCCCGTTACCTGGACGGCAAGATGCGCGAGATC
CGCTCCAGCGGCAAAGTCATCGGCGCCGACCGGGTTGCCGTGATGGCCGCCCTCAACATCACCCACGACCTGCTG
CACCGCAAGGAGCGCCTGGACCAGGAAAGCAGCTCGACCCGCGAGCGCGTGCGCGAACTGCTCGATCGCGTCGAC
CGCGCCCTGGCGAATCCGGCCGATGCCGGCGAAGCCTGACCCGGGCGCGGCCAATTCGGGTATACTGGCCTCCGC
TCCCTGGTGTGTTGGCCAGTCGGTGATGTCCCTGAGCCGATAACTGCAACAACGGAGGTTGCCAGTTGGACCGGT
GTGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAATTTCCAAGCA
122 ANHANG
Mutante SCV-Tn5-M 1L:
TTGAGATGGTATAAGAGAAGGGCCAGGGCCCAGCCGAAGAACGGCACGTAGAGCAGCTCGCGCTTGAGTACCTGG
CTGAGTGGCTCGAAGAAGCCGGAGAGGAAGAAGGTTTCCCAGGTGCTCTGGTGCTTGGAGAGGATCACGCAGGGC
TTTTCCGGGATGTTCTCCAGTCCGCGCACCTCGTAGCGGATGCCGGCGACCACGCGGGTCAGCCAGATCGCGAAG
CGGCACCAGTTCTGTACCACGAAGCGGTAGCGGGCGCGGAACGGCAGGATCGGCGCGATGAAGAAGCTGAGGGTG
CCCCAGACGAACGCGCTGGCGGACAGCAGCAGGTAAAAGAGGACGGTTCTGATGGCCTGCACTGTCGACATGTGT
CCCCGTACATCGTTAGAAGTGAANNNTTCCAAG
Mutante SCV-Tn5-M 2E:
AAGAGCTTCAGGNTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGAGCAGGGCTTCGAACTCCGCGACGAAGGCTGGGAGTTCG
GCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTTGAATTCGAGCAGA
Mutante SCV-Tn5-M 2L:
AAGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGCATCAGGACGATCCGCAGTTCGATGGGAATCTTGCGTCCG
TCGGCGCGCAGGCAGTCGAGGGCGAACAGATGCTGGCCAGGGTTTTCCCGCAGCTCGGCGAGCTTCTGGCGGTCG
CCGATGGCGTGCCGCACGCGGCGCAGCAGGCCGTTCAGGCGGCCGAGCTGGCGCGGGTTGGTGGCGGTCTGGTGG
AGGCCGTTGAGCAGCGCCCATTCCGGGCTGTAGCCGAACACGTGCTGTACCGAGGGGCTGACGTAGCTGGCGTTG
AGCTCGGCGTCGGTGGAGAAGATCACGTCGCTGATGTTTTCCGCCAGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTN
AGATTCCCCA
Mutante SCV-Tn5-M 3D:
AAGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGATCCCAGGTGTCCCCGTGGCGCAGTGCGTCGCGCGAGCCG
AGCACGTCGCCGAGTTCGCGGTAGCCTTCGGTGGAATAGCGGTAGCCGGCCAGGGTCAGGGTAGTGCCGGTGGGC
TGGAAGGTCCGGCTGTAGTCGAGCCCGATGCGCCAGCCCTGCTTGCGCGCGCCATCCTCGACGCGTGCGCTGGAA
TAGGTGCTGTTCAGGCCGAAGGCGCCGAAGCGGGTGGCGAGGACGCCGCCGCCCAGCATGTGTCCCCGTACATCG
TTAGAAGTGAANNNTCCGAGCA
Mutante SCV-Tn5-M 3E:
AAGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGATCCCAGGTGTCCCCGTGGCGCAGTGCGTCGCGCGAGCCG
AGCACGTCGCCGAGTTCGCGGTAGCCTTCGGTGGAATAGCGGTAGCCGGCCAGGGTCAGGGTAGTGCCGGTGGGC
TGGAAGGTCCGGCTGTAGTCGAGCCCGATGCGCCAGCCCTGCTTGCGCGCGCCATCCTCGACGCGTGCGCTGGAA
TAGGTGCTGTTCAGGCCGAAGGCGCCGAAGCGGGTGGCGAGGACGCCGCCGCCCAGCATGTGTCCCCGTACATCG
TTAGAAGCTGAATTTCCCAGCA
123 ANHANG
Mutante SCV-Tn5-M 3F:
AAGAGCTTNNNGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGCGAACGAGGCGTAGTAGCCGCTCGGGTTGTCCACCCGC
ACCGCCCAGCCGGCGCTGCGCCGGACCAGTGCGAAACGCAGTTGCCCGGGCAGGTCCTCGGGACGGCCCTGGATG
CCCGCCGGGCGGTAGAACAGCTTCAGGCGATTGCGCAGCATCAGCAGCATCTGGTTCCGATCCGCATGTGTCCCC
GTACATCGTTAGAAGCTGAAATATTCGAGCA
Mutante SCV-Tn5-M 3K:
GCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGATCCCAGGTGTCCCCGTGGCGCAGTGCGTCGCGCGAGCCGAGCA
CGTCGCCGAGTTCGCGGTAGCCTTCGGTGGAATAGCGGTAGCCGGCCAGGGTCAGGGTAGTGCCGGTGGGCTGGA
AGGTCCGGCTGTAGTCGAGCCCGATGCGCCAGCCCTGCTTGCGCGCGCCATCCTCGACGCGTGCGCTGGAATAGG
TGCTGTTCAGGCCGAAGGCGCCGAAGCGGGTGGCGAGGACGCCGCCGCCCAGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAG
AAGTGAAAATTTCGAGCA
Mutante SCV-Tn5-M 6E:
ACGAGCTTCGCGCTTGAGATGTGTATAAGAGAAGGTGTCACCGATCAGCCCGGCGGCGTAATACCGAGACCAGCG
CCACGCCCAGGTGTGCGCGATAGAGCACCCGGCGCAGCGATGGATTGGAACCCGTATAGCGACGACGACGGTTCA
TCACGGAGTGGCCTGCCGCCTTGCCAGTTTCAATACGCTCGGGTGCACGCGTACGCCGCTGCGGGCGATGGAGTC
GAGATTGGCCTCGAAGGTGATGCGCGGGCCGCCGACGTTGAGGCAGAACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGC
TGANATATCCGAGCAGA
Mutante SCV-Tn5-M 6F:
GACCAGCGCCACGCCCAGGTGTGCGCGATAGAGCACCCGGCGCAGCGATGGATTGGAACCCGTATAGCGACGACG
ACGGTTCATCACGGAGTGGCCTGCCGCCTTGCCAGTTTCAATACGCTCGGGTGCACGCGTACGCCGCTGCGGGCG
ATGGAGTCGAGATTGGCCTCGAAGGTGATGCGCGGGCCGCCGACGTTGAGGCAGAACATGTGTCCCCGTACATCG
TTAGAAGTGAAATATTCC
Mutante SCV-Tn5-M 6G:
ACGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTCACCGCCAGCCCGGCGGTGAATACCGCGACCAGCGC
CACGCCCAGGTGTGCGCGATAGAGCACCCGGCGCAGCGATGGATTGGAACCCGTATAGCGACGACGACGGTTCAT
CACGGAGTGGCCTGCCGCCTTGCCAGTTTCAATACGCTCGGGTGCACGCGTACGCCGCTGCGGGCGATGGAGTCG
AGATTGGCCTCGAAGGTGATGCGCGGGCCGCCGACGTTGAGGCAGAACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAGNNN
AAATTTTCAA
124 ANHANG
Mutante SCV-Tn5-M 6M:
ACGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTCACCGCCAGCCCGGCGGTGAATACCGCGACCAGCGC
CACGCCCAGGTGTGCGCGATAGAGCACCCGGCGCAGCGATGGATTGGAACCCGTATAGCGACGACGACGGTTCAT
CACGGAGTGGCCTGCCGCCTTGCCAGTTTCAATACGCTCGGGTGCACGCGTACGCCGCTGCGGGCGATGGAGTCG
AGATTGGCCTCGAAGGTGATGCGCGGGCCGCCGACGTTGAGGCAGAACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACNN
NATATTCCAAGCAG
Mutante SCV-Tn5-M 6N:
AGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTCACCGCCAGCCCGGCGGTGAATACCGCGACCAGCGCCAC
GCCCAGGTGTGCGCGATAGAGCACCCGGCGCAGCGATGGATTGGAACCCGTATAGCGACGACGACGGTTCATCAC
GGAGTGGCCTGCCGCCTTGCCAGTTTCAATACGCTCGGGTGCACGCGTACGCCGCTGCGGGCGATGGAGTCGAGA
TTGGCCTCGAAGGTGATGCGCGGGCCGCCGACGTTGAGGCAGAACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAANNAAAN
NNTCCCAAGC
Mutante SCV-Tn5-M 8A:
AAGAGCTTCGGCTTGAGAGTGTATAAGAGAAGCCGCTGCACCTGCTGGAACAGCAACTGGCGCACTGTGCTGCTC
AGCGCGCCGACCGAACAACCGATCCTGCACGACGGCCAGAAGATCGGTTCGGTGGAGGTGAAGGGCTCCGGCGGC
AGCCTGCTGCGCTTCCTGCTCACAGGTTTCGCCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGANATNTNCCGAG
CAGGA
Mutante SCV-Tn5-M 8B:
CGAGCTTCAGGTTGAGATGGTTAAGAGAAGCCGCTGCACCTGCTGGAACAGCAACTGGGCGCACTGTGCTGCTCA
GCGCGCCGACCGAACAACCGATCCTGCACGACGGCCAGAAGATCGGTTCGGTGGAGGTGAAGGGCTCCGGCGGCA
GCCTGCTGCGCTTCCTGCTCACAGGTTTCGCCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGAAATATTCNAGCA
GA
Mutante SCV-Tn5-M 8C:
AAGAGCTTCGGCTTGAGAGTGTATAAGAGACAGCCGCTGCACCTGCTGGAACAGCAACTGGCGCACTGGCTGCTC
AGCGCGCCGACCGAACAACCGATCCTGCACGACGGCCAGAAGATCGGTTCGGTGGAGGTGAAGGGCTCCGGCGGC
AGCCTGCTGCGCTTCCTGCTCACAGGTTTCGCCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGAAATATTCGAGC
AGA
125 ANHANG
Mutante SCV-Tn5-M 8D:
AAGAGCTTCAGGTTGAGATGGTTAAGAGAAGCCGCTGCACCTGTCTGGAACAGCAACTGGGCGCACTGTGCTGCT
CAGCGCGCCGACCGAACAACCGATCCTGCACGACGGCCAGAAGATCGGTTCGGTGGAGGTGAAGGGCTCCGGCGG
CAGCCTGCTGCGCTTCCTGCTCACAGGTTTCGCCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGANAAATCCGAG
CAGGA
Mutante SCV-Tn5-M 8F:
CAGGTTGAGAGTGTATAAGAGAAGCCGCTGCACCTGCTGGAACAGCAACTGGGCGCACTGTGCTGCTCAGCGCGC
CGACCGAACAACCGATCCTGCACGACGGCCAGAAGATCGGTTCGGTGGAGGTGAAGGGCTCCGGCGGCAGCCTGC
TGCGCTTCCTGCTCACAGGTTTCGCCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGAAATATTCGAGC
Mutante SCV-Tn5-M 11A:
AAGAGCTTCAGGTTGAGATGGTTAAGAGACAGGGTGTAGGCGGAATAGCCGGAGGAGCCGCCGGAGGCCGATGAG
CCGCCACTCCAGCCCACCCGTGCCGCCGGACTCTCCAGCACGCTCTCGGCCAGGCGCATCTCGCCCTGCGGGCCG
AACTCGCCGGCAGCAGCGCCGGTCGGACGCGGCTCGGTCAGGCTGGTCGCCCCGGGCGGCGCGAGCTGGTCGTCG
GGACGGACCTCGCCCAGCGCACGATGCAGGGTGCCATAGAGGAAGTCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACNNN
ATTTTCGAAAC
9.8 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
Tab. 1: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten auf autoaggregatives Wachstum nach 48 Stunden
Inkubation bei 37 °C 42
Tab. 2: Mutanten aus der Transposonbank des WT 20265 mit einem phänotypischen
Switch zum SCV-Phänotyp 47
Tab. 3: Mutanten aus der Transposonbank der SCV 20265 mit einem phänotypischen
Switch zum WT-Phänotyp 49
Tab. 4: Elektronenmikroskopische Untersuchung von Transposonmutanten
des WT 20265 mit einer Inkubation der Mutanten auf Twitching-Agarplatten
bei 28 °C 55
Tab. 5: Elektronenmikroskopische Untersuchung klinischer SCVs mit einem
autoaggregativen Phänotyp auf Fimbrienstrukturen und Flagellen mit
einer Inkubation der Bakterien auf Twitching-Agarplatten bei 28 °C 56
Tab. 6: Differenzielle Genexpression der Transposonmutante 25/C1 während der
exponentiellen Wachstumsphase (VON Götz 2003) 64
126 ANHANG
Tab. 7: WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Columbia-Blutagar
und Müller-Hinton-Agar 105
Tab. 8: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf
Columbia-Blutagar und Müller-Hinton-Agar auf autoaggregatives Wachstum 106
Tab. 9: WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Müller-Hinton-Agar
und einem schnellen Wachstum auf Columbia-Blutagar 107
Tab. 10: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf
Müller-Hinton-Agar und einem schnellen Wachstum auf Columbia-Blutagar auf
autoaggregatives Wachstum 110
Tab. 11: Autoaggregative WT-Tn5-Mutanten mit einem intermediären bis schnellen Wachstum
auf Columbia-Blutagar und Müller-Hinton-Agar 112
Tab. 12: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem intermediären bis schnellen
Wachstum auf Columbia-Blutagar und Müller-Hinton-Agar auf autoaggregatives
Wachstum 112
Tab. 13: Untersuchung der SCV-Tn5-Mutanten auf ein schnelles Wachstum auf
Columbia-Blutagar und autoaggregatives Wachstum 113
Abb. 1: Modell einer Biofilmentwicklung (O’TOOLE et al. 2000) 12
Abb. 2: Wachstum der zwei Morphotypen Wildtyp und SCV des P. aeruginosa-
Stammes 20265 auf Agar-Platten 15
Abb. 3: Wachstum der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante des
P. aeruginosa-Stammes 20265 auf Agar-Platten 21
Abb. 4: Agarosegel mit aufgereinigten PCR-Produkten 35
Abb. 5: Wachstum der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante des
P. aeruginosa-Stammes 20265 in Flüssigmedium 41
Abb. 6: Motilitätsverhalten der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante
des P. aeruginosa-Stammes 20265 44
Abb. 7: Motilitätsverhalten der zwei Morphotypen Wildtyp und SCV des
P. aeruginosa-Stammes 20265 und der Transposonmutante 25/C1 des
mutagenisierten Wildtyps 20265 45
Abb. 8: Wachstum vom Wildtyp des P. aeruginosa-Stammes 20265 und der
Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten Wildtyps 20265 auf Agarplatten
und in Flüssigmedium 50
Abb. 9: Northern Blot zur Darstellung der cupA1-Genexpression in der Transposon-
mutante 25/C1 im Vergleich zum Wildtyp und der SCV des P. aeruginosa-
Stammes 20265 52
127 ANHANG
Abb. 10: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Zelloberflächen und Umgebung
der Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten
P. aeruginosa-Wildtyps 20265 54
Abb. 11: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von der Umgebung der
Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten P. aeruginosa-Wildtyps 20265 57
Abb. 12: Darstellung der GGDEF-Domäne bzw. EAL-Domäne in den Proteinen PvrR,
PA4843, PA1120 und PA4601 70
Abb. 13: Darstellung der intrazellulären Signalkaskade, die möglicherweise zu
einem Biofilm-Phänotyp bei P. aeruginosa führt 72
Abb. 14: Wachstum der zwei Morphotypen SCV und Revertante des P. aeruginosa-
Stammes 20265 und der Transposonmutante SCV-Tn5-M R7 der
mutagenisierten SCV 20265 auf Agar-Platten 73
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Molekulare Charakterisierung von langsam wachsenden
Subpopulationen (small colony variants) von Pseudomonas aeruginosa isoliert aus dem
Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten“ selbständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden keine Hilfen Dritter in Anspruch genommen.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder
anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar
entgeltliche Leistungen für die Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der
Medizinischen Hochschule Hannover durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für
Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover angefertigt.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck
zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit
entsprechend gemacht habe.
Hannover, den 23.08.2004
.........................................................
Verena Wild
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bedanken bei Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann für die
Überlassung des Themas und für die stets freundliche Arbeitsatmosphäre, die unter seiner Leitung im
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule
Hannover herrschte.
Ein großer Dank gilt Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand für die Übernahme der Betreuung an der
Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Ein ganz besonderes Dankeschön geht an Dr. Susanne Häußler für ihre immense Geduld, die sie
aufbrachte, um mich in die Welt von Pseudomonas aeruginosa und seinen SCVs einzuweihen sowie
für ihre ständige Ansprechbarkeit und Diskussionsbereitschaft. Erst ihre engagierte Betreuung und die
große Begeisterung ermöglichte das Gelingen dieser Arbeit.
Birgit Brenneke und Jessika Garlisch danke ich herzlich für ihre tatkräftigen Unterstützungen in allen
organisatorischen Angelegenheiten sowie bei kleinen und größeren Katastrophen im Laboralltag.
Bei Dr. Ralf-Peter Vonberg möchte ich mich nicht nur für seine regelmäßigen Dienste als Chauffeur
bedanken, sondern insbesondere auch für seinen Einsatz als Fotograf. Ohne diese Hilfe hätten die
Fotos nie diese Qualität erreicht.
Dr. Beate Fehlhaber danke ich für ihr biochemisches und vor allen Dingen mathematisches Wissen,
welches sie mir stets mit großer Begeisterung und Engelsgeduld zur Verfügung stellte.
Bei meiner Arbeitsgruppe möchte ich mich für die stete Hilfsbereitschaft, Unterstützung und für das
angenehme Arbeitsklima bedanken. Besonderer Dank gilt dabei Dagmar Löns; getrennt von der
restlichen Arbeitsgruppe haben wir gemeinsam die Höhen und Tiefen der Forschung erlebt, ohne die
Hoffnung und vor allen Dingen den Humor zu verlieren.
Neben allen anderen Doktoranden und Mitarbeitern der Medizinischen Hochschule möchte ich ein
besonderes Dankeschön an die Arbeitsgruppe von Dr. I. Steinmetz richten, mit denen ich nicht nur
während der Laborarbeit, sondern auch außerhalb des Labors sehr viel Spaß hatte.
Mein allerherzlichster Dank gilt meiner Familie für die jahrelange Unterstützung während meines
Studiums und der Promotion.