du2 strojnik lidija - University of Ljubljana · 2015. 12. 17. · Strojnik L. Raznolikost plesni...

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Lidija STROJNIK

RAZNOLIKOST PLESNI NA RDEČEM GROZDJU IN V MOŠTU

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij – 2. stopnja Prehrana

Ljubljana, 2014

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Lidija STROJNIK

RAZNOLIKOST PLESNI NA RDEČEM GROZDJU IN V MOŠTU

MAGISTRSKO DELO Magistrski študij – 2. stopnja Prehrana

DIVERSITY OF MOULDS POPULATION ON RED GRAPES AND IN GRAPE MUSTS

M. SC. THESIS Master Study Programmes: Field Nutrition

Ljubljana, 2014

II Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa druge stopnje Prehrana. Opravljeno je bilo na Katedri za Biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil Oddelka za živilstvo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani. Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala izr. prof. dr. Barbaro Jeršek, za somentorico izr. prof. dr. Tatjano Košmerl in za recenzentko izr. prof. dr. Polono Jamnik. Mentorica: izr. prof. dr. Barbara Jeršek Somentorica: izr. prof. dr. Tatjana Košmerl Recenzentka: izr. prof. dr. Polona Jamnik Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: Član: Član: Član: Datum zagovora: Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Podpisana soglašam z objavo svojega magistrskega dela v polnem tekstu na spletni strani digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v elektronski obliki, identična tiskani verziji.

Lidija Strojnik

III Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Du2 DK UDK 579.67: 663.2: 582.28: 615.9 (043) = 163.6 KG živilska mikrobiologija/grozdje/mošt/vino/grozdne sorte/vinorodni okoliš/plesni/

raznolikost plesni/izolacija plesi/identifikacija plesni/Penicillium/Aspergillus/ mikotoksini/aflatoksin B1/ohratoksin A

AV STROJNIK, Lidija, dipl. inž. živ. in prehr. (UN) SA JERŠEK, Barbara (mentorica)/KOŠMERL, Tatjana (somentorica)/JAMNIK,

Polona (recenzentka) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo LI 2014 IN RAZNOLIKOST PLESNI NA RDEČEM GROZDJU IN V MOŠTU TD Magistrsko delo (Magistrski študij – 2. stopnja Prehrana) OP XI, 60 str., 3 pregl., 39 sl., 45 vir. IJ Sl JI sl/en AI Namen naloge je bil raziskati prisotnost morebitnih ohratoksigenih in aflatoksigenih

plesni v vzorcih devetih različnih grozdnih sort, namenjenih za predelavo v vino v štirih klimatsko različnih vinorodnih okoliših Slovenije (Slovenska Istra, Dolenjska, Bela Krajina in Štajerska Slovenija). Iz vzorcev grozdja smo pripravili vzorce grozdnega soka, ki smo jih nato pustili, da so spontano fermentirali. Plesni smo izolirali iz vzorcev grozdja, med spontano alkoholno fermentacijo in vzorcev vina (skupno 204 vzorci). Populacija plesni je bila največja na grozdju in nato je pričakovano v času fermentacije upadala. Identificirali smo devet različnih rodov plesni (Penicillium, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Alternaria, Mucor, Fusarium, Acremonium in Rhizopus), 4 % izolatov pa so ostali neidentificirani. Na grozdju ter v vinu so bile najpogosteje izolirane plesni rodov Penicillium (v 58,6 % oz. 100 % izolatov), medtem ko so v moštu prevladovale plesni rodu Aspergillus (71 % izolatov). Plesni rodu Penicillium so bile najbolj razširjene v Štajerski Sloveniji na vzorcih grozdja, medtem ko so bile plesni rodu Aspergillus v največji meri prisotne v vzorcih mošta v Beli Krajini. V raziskavi smo identificirali 6 vrst rodu Aspergillus in 24 vrst rodu Penicillium. Najbolj razširjene vrste so bile A. japonicus, A. parasiticus, A. niger in A. carbonarius ter P. chrysogenum, P. janthinellum, P. griseofulvum in P. thomii. Noben izolat vrste A. niger ni tvoril ohratoksina A (OTA) in le 31,3 % izolatov, določenih kot plesni vrste A. carbonarius, je bilo OTA-pozitivnih. Izolati plesni vrste A. parasiticus so bili aflatoksin B1 (AFB1)-pozitivni v 35,3 %. Plesni vrst A. ohraceus in P. verrucosum smo izolirali v majhnem št. vzorcev (A. ohraceus v 2 vzorcih, P. verrucosum v 1 vzorcu), vendar so bili prav vsi izolati OTA-pozitivni. Največje število OTA- in AFB1-pozitivnih sevov je bilo izolirano v Slovenski Istri, medtem ko na Dolenjskem in v Štajerski Sloveniji nismo določili OTA- oz. AFB1-pozitivnih izolatov. Ugotovili smo, da se oba toksina pojavljata le pri sortah cabernet sauvignon in shiraz. Sorte merlot, refošk in modri pinot niso vsebovale OTA ali AFB1 toksigenih plesni. Največ vzorcev je vseboval seve, ki so tvorili OTA oz. AFB1 v prvih treh dneh fermentacije.

IV Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

KEY WORDS DOCUMENTATION DN Du2 DC UDC 579.67: 663.2: 582.28: 615.9 (043) = 163.6 CX food microbiology/grape/must/wine/grapewine varieties/wine-growing districts/

moulds/mould diversity/mould isolation/mould identification/Penicillium/ Aspergillus/mycotoxin/aflatoxin B1/ochratoxin A

AU STROJNIK, Lidija AA JERŠEK, Barbara (supervisor)/KOŠMERL, Tatjana (co-advisor)/JAMNIK,

Polona (reviewer) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and

Technology PY 2014 TI DIVERSITY OF MOULDS POPULATION ON RED GRAPES AND IN

MUSTS DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Nutrition) NO XI, 60 p., 3 tab., 39 fig., 45 ref. LA Sl AL sl/en AB The aim of this thesis was to determine the presence of potential ochratoxin A (OTA)

and aflatoxin B1 (AFB1) producing moulds in samples of nine red grapevine varieties used for wine production in four climatically different wine-growing districts in Slovenia (Slovenska Istra, Dolenjska, Bela Krajina, and Štajerska Slovenia). Grape samples were crushed into grape juice, which was then allowed to spontaneously ferment. Moulds were isolated from grape samples, during spontaneous alcoholic fermentation and from wine samples (204 samples in total). The largest population was found on grapes and then took a downturn during the fermentation. We identified nine different genera of moulds (Penicillium, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Alternaria, Mucor, Fusarium, Acremonium and Rhizopus), with 4 % of the isolates remaining unidentified. The most frequently isolated genera on grapes and in wine were Penicillium with 58.6 % and 100 % of isolates, respectively, while Aspergillus was dominant in the must with 71 % of isolates. Penicilium strains was predominantly found in grape samples from Štajerska Slovenija, while the Aspergillus strains was most frequently found in must samples from Bela Krajina. In total, we identified 6 species of Aspergillus and 24 species of Penicillium. The most prevalent species were A. japonicus, A. parasiticus, A. niger, A. carbonarius and P. chrysogenum, P. janthinellum, P. griseofulvum and P. thomii. None of the A. niger isolates produced OTA and only 31.3 % of isolates of A. carbonarius was OTA-positive. Isolates of A. parasiticus were AFB1-positive in 35.3 %. A. ohraceus and P. verrucosum strains were isolated in a small No. of samples (A. ohraceus in 2 samples and P. verrucosum in 1 sample), but all of them were OTA-positive. The highest number of OTA- and AFB1-positive samples were isolated in Slovenian Istria, while in Dolenjska and in Štajerska Slovenia we did not find any OTA- or AFB1-positive isolates. We found that both toxins occur only in Cabernet sauvignon and Shiraz grapevines. Merlot, Refosco and Pinot Noir did not contain any OTA or AFB1 toxin-producing moulds. Most samples contained strains that produced OTA or AFB1 in the first three days of fermentation.

V Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA .................................................III

KEY WORDS DOCUMENTATION .............................................................................. IV

KAZALO VSEBINE .......................................................................................................... V

KAZALO PREGLEDNIC ............................................................................................. VIII

KAZALO SLIK ................................................................................................................. IX

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ............................................................................................ XI

1 UVOD ........................................................................................................................... 1

1.1 NAMEN DELA ...................................................................................................... 2

1.2 HIPOTEZE ............................................................................................................. 2

2 PREGLED OBJAV ..................................................................................................... 3

2.1 MIKOTOKSIGENE PLESNI ................................................................................. 3

2.1.1 Rod Penicillium .............................................................................................. 3

2.1.2 Rod Aspergillus .............................................................................................. 4

2.2 MIKROFLORA GROZDJA ................................................................................... 4

2.3 MIKOTOKSINI ...................................................................................................... 6

2.3.1 Aflatoksini ...................................................................................................... 7

2.3.2 Ohratoksini .................................................................................................... 8

2.4 UŽIVANJE GROZDJA/VINA ............................................................................... 9

2.5 DEJAVNIKI ZA NASTANEK MIKOTOKSINOV ............................................ 10

2.5.1 Dejavniki, ki vplivajo na prisotnost plesni v vinogradu .......................... 10

2.5.2 Dejavniki, ki vplivajo na pojavnost plesni rodu Aspergillus in produkcijo OTA v grozdju ........................................................................................................... 12

2.5.3 Trgatev in razmere po trgatvi .................................................................... 14

3 MATERIAL IN METODE DELA ........................................................................... 16

3.1 MATERIALI ........................................................................................................ 16

3.1.1 Vzorci grozdja .............................................................................................. 16

3.1.2 Vzorci mošta in vina .................................................................................... 16

3.1.3 Mikrobiološka gojišča ................................................................................. 18

3.1.4 Kemikalije za pripravo suspenzije spor .................................................... 19

VI Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

3.1.5 Kemikalije za pripravo nativnega mikroskopskega preparata in mikroskopiranje ........................................................................................................ 19

3.1.6 Kemikalije za izvedbo tankoplastne kromatografije (TLC) ................... 19

3.1.7 Laboratorijska oprema ............................................................................... 20

3.2 METODE .............................................................................................................. 22

3.2.1 Shema dela ................................................................................................... 22

3.2.2 Priprava grozdja .......................................................................................... 23

3.2.3 Priprava grozdnega soka in potek alkoholne fermentacije ..................... 23

3.2.4 Vzorčenje grozdnega soka, mošta in vina ................................................. 23

3.2.5 Izolacija in kvantifikacija plesni ................................................................ 23

3.2.6 Določitev makro- in mikromorfoloških lastnosti plesni ........................... 24

3.2.7 Izolacija čiste kulture .................................................................................. 24

3.2.8 Identifikacija plesni ..................................................................................... 24

3.2.9 Precepljanje potencialno mikotoksigenih izolatov ................................... 25

3.2.10 Določitev prisotnosti mikotoksinov s TLC ................................................ 25

4 REZULTATI .............................................................................................................. 27

4.1 RAZNOLIKOST PLESNI .................................................................................... 27

4.1.1 Razširjenost plesni v vinorodnih okoliših .................................................. 27

4.1.2 Razširjenost plesni na grozdju, med fermentacijo in v vinu ................... 31

4.1.3 Razširjenost plesni glede na sorto .............................................................. 31

4.2 POPULACIJA PLESNI ........................................................................................ 34

4.2.1 Spremljanje populacije plesni v vinorodnih okoliših ............................... 34

4.2.2 Spremljanje populacije plesni na grozdju, med fermentacijo in v vinu . 34

4.2.3 Spremljanje populacije plesni na sortah ................................................... 35

4.3 PLESNI RODOV Penicillium IN Aspergillus ...................................................... 36

4.3.1 Razširjenost plesni rodov Penicillium in Aspergillus na grozdju, v moštu in vinu glede na vinorodne okoliše ........................................................................... 38

4.3.2 Razširjenost plesni rodov Penicillium in Aspergillus na grozdju, med fermentacijo in v vinu ............................................................................................... 40

4.3.3 Razširjenost plesni rodov Penicillium in Aspergillus glede na sorto ....... 41

4.4 OHRATOKSIGENOST IN AFLATOKSIGENOST IDENTIFICIRANIH VRST PLESNI ............................................................................................................................ 42

VII Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

4.4.1 Ohratoksigenost in aflatoksigenost identificiranih vrst plesni glede na vinorodni okoliš ......................................................................................................... 44

4.4.2 Ohratoksigenost in aflatoksigenost identificiranih vrst plesni iz grozdja, mošta in vina .............................................................................................................. 45

4.4.3 Ohratoksigenost in aflatoksigenost identificiranih vrst plesni glede na sorto............................ ................................................................................................ 45

4.5 POSEBNOSTI PRI IZOLACIJI IN IDENTIFIKACIJI PLESNI ......................... 47

5 RAZPRAVA ............................................................................................................... 52

6 SKLEPI ...................................................................................................................... 58

7 POVZETEK ............................................................................................................... 60

8 VIRI ............................................................................................................................ 61

VIII Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Povzetek razmer, pri katerih različne vrste plesni tvorijo OTA (Amezqueta in sod., 2012) ....................................................................................................................... 13 Preglednica 2: Vinorodni okoliš, datum obiranja in sorta vzorcev grozdja ........................ 16 Preglednica 3: Čas in oznaka vzorcev med alkoholno fermentacijo (mošt) in po njej (vino) ............................................................................................................................................. 17

IX Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

KAZALO SLIK Slika 1: Penicillium spp. a) kolonije na CYA, b) mikroskopski preparat, 1000x povečava . 3 Slika 2: Aspergillus spp. a) kolonije na CYA, b) mikroskopski preparat, 1000x povečava . 4 Slika 3: Stopnje tveganj za kontaminacijo z OTA na grozdju (Battilani in sod., 2008) ..... 11 Slika 4: Shema eksperimentalnega dela .............................................................................. 22 Slika 5: Shema gojišč za identifikacijo plesni. Shema predstavlja kombinacijo petrijevk z izbranimi gojišči in temperaturami inkubacije. Številki 1 in 2 označujeta nacepljene kulture (Pitt in Hocking, 1985) ........................................................................................................ 24 Slika 6: Delež izolatov plesni na grozdju iz različnih vinorodnih okolišev ........................ 28 Slika 7: Razširjenost plesni na grozdju glede na vinorodni okoliš in na skupno koncentracijo plesni v posameznem vinorodnem okolišu ................................................... 28 Slika 8: Delež izolatov plesni v moštu iz različnih vinorodnih okolišev ............................ 29 Slika 9: Razširjenost plesni iz vzorcev mošta glede na vinorodni okoliš in na skupno koncentracijo plesni v posameznem vinorodnem okolišu ................................................... 30 Slika 10: Razširjenost plesni rodu Penicillium v vzorcih vina glede na vinorodni okoliš in na skupno koncentracijo plesni v posameznem vinorodnem okolišu ................................. 30 Slika 11: Delež izolatov plesni na grozdju, v moštu in v vinu ............................................ 31 Slika 12: Delež izolatov plesni na grozdju glede na sorto ................................................... 32 Slika 13: Delež izolatov plesni v moštu glede na sorto ....................................................... 33 Slika 14: Delež izolatov plesni v vinu glede na sorto.......................................................... 33 Slika 15: Povprečna koncentracija plesni na grozdju, v moštu in v vinu po različnih vinorodnih okoliših .............................................................................................................. 34 Slika 16: Povprečna koncentracija plesni na grozdju v različnih časih fermentacije mošta in v vinu ................................................................................................................................... 35 Slika 17: Povprečna koncentracija plesni na grozdju, v moštu in v vinu glede na grozdne sorte ..................................................................................................................................... 35 Slika 18: Deleži vrst identificiranih plesni rodu Aspergillus na grozdju, v moštu in v vinu ............................................................................................................................................. 36 Slika 19: Število sort pri katerih so bile vsaj enkrat določene plesni rodu Aspergillus na grozdju, v moštu in v vinu ................................................................................................... 37 Slika 20: Deleži vrst identificiranih plesni rodu Penicillium na grozdju, v moštu in v vinu ............................................................................................................................................. 37 Slika 21: Število sort v katerih so bile vsaj enkrat določene plesni rodu Penicillium na grozdju, v moštu in v vinu ................................................................................................... 38 Slika 22: Razširjenost plesni rodu Penicillium v grozdju, moštu in vinu glede na vinorodni okoliš ................................................................................................................................... 39 Slika 23: Razširjenost plesni rodu Aspergillus v grozdju, moštu in vinu glede na vinorodni okoliš ................................................................................................................................... 39 Slika 24: Razširjenost plesni rodov Penicillium in Aspergillus na grozdju, v različnih časih fermentacije mošta in v vinu ............................................................................................... 40

X Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

Slika 25: Razširjenost plesni rodu Penicillium v grozdju, moštu in vinu glede na sorto .... 41 Slika 26: Razširjenost plesni rodu Aspergillus v grozdju, moštu in vinu glede na sorto .... 42 Slika 27: Povprečna koncentracija identificiranih ohratoksigenih plesni ........................... 43 Slika 28: Povprečna koncentracija identificiranih aflatoksigenih plesni ............................. 43 Slika 29: Povprečna koncentracija OTA-pozitivnih izolatov glede na vinorodni okoliš .... 44 Slika 30: Povprečna koncentracija AFB1-pozitivnih izolatov glede na vinorodni okoliš .. 44 Slika 31: Povprečna koncentracija OTA- in AFB1-pozitivnih izolatov iz grozdja, mošta v različnih časih fermentacije in iz vina ................................................................................. 45 Slika 32: Povprečna koncentracija OTA-pozitivnih izolatov na grozdju, moštu in v vinu glede na sorto ....................................................................................................................... 46 Slika 33: Povprečna koncentracija AFB1-pozitivnih izolatov na grozdju, v moštu in v vinu glede na sorto ....................................................................................................................... 46 Slika 34: Neštevnost plošče zaradi velikega števila kolonij, ki preraščajo druga drugo ..... 47 Slika 35: Nenavaden apeks plesni rodu Aspergillus, 400x povečava.................................. 48 Slika 36: Izgled sporangija plesni rodu Mucor, 1000x povečava. Na sliki je opaziti tudi konidije, ki pripadajo plesnim rodu Aspergillus .................................................................. 49 Slika 37: Netipičen izgled plesni vrste A. niger oz. A. carbonarius, posledica večkratnega precepljanja z namenom pridobitve čiste kulture ................................................................ 49 Slika 38: Netipičen izgled plesni vrste A. carbonarius na gojišču CYA, 25 °C ................. 50 Slika 39: Poseben izgled plesni vrste A. carbonarius (precepitev s plošč – Slika 38) na gojišču YES, 25 °C .............................................................................................................. 50

XI Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI Okrajšava, simbol Pomen AFB1 Aflatoksin B1 CFU/mL Št. kolonijskih enot v 1 mL; koncentracija mikroorganizmov CYA Gojišče Czapek agar s kvasnim ekstraktom (ang. Czapek Yeast

Extract Agar) DRBC Gojišče dikloran-rozbengal kloramfenikol agar (ang. Dichloran

Rose-Bengal Chloramphenicol Agar) G25N Gojišče 25 % glicerol nitratni agar (ang. 25 % Glycerol Nitrate Agar) MEA Gojišče s sladnim ekstraktom (ang. Malt Extract Agar) OGY Gojišče oksitetraciklin kvasni ekstrakt (ang. Oxytetracyclin Glucose

Yeast Agar) OTA Ohratoksin A TLC Tankoplastna kromatografija (ang. Thin-Layer Chromatography) UV Ultravijolično valovanje YES Gojišče s kvasnim ekstraktom in saharozo (ang. Yeast Extract

Sucrose Agar)

1 Strojnik L. Raznolikost plesni na rdečem grozdju in v moštu. Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2014

1 UVOD Grozdje je bilo včasih sezonsko sadje, sedaj pa ga potrošniki lahko kupujemo skoraj vse leto. Redko koga ne zamikajo vabljive velike grozdne jagode na stojnici ali sveže utrgan grozd iz ljubiteljskih vinogradov ali brajd, ki jih v Sloveniji res ne manjka. Še bolj kot grozdje pa ljudje cenijo in uživajo vino. Ali potrošniki vemo, kakšno grozdje jemo ali kakšno vino pijemo?

Večina ljudi preveri ali ima grozdje velike jagode, lepo barvo, če ni gnilo in je brez mehanskih poškodb. Pri vinu smo pozorni, iz katere sorte grozdja je pridelano, kakšne suhosti je in kakšna je kakovost. Ekološko ozaveščeni pogledajo tudi, ali je grozdje biološke pridelave, predvsem zaradi ostankov škropiv v jagodah. Koliko pa nas pomisli na plesnivost grozdja?

Ljudje večinoma vedo, da plesni, če jih opazimo s prostim očesom v živilu, pomenijo, da živilo ni več primerno za uživanje. Večinoma pa ne vedo, kaj plesni so in še manj zakaj so tako nevarne.

Če vidimo grozdje, ki je plesnivo, tega ne bomo kupili ali pa bomo plesnive jagode odstranili, ostale pa brez slabe vesti pojedli. Pri vinu smo v slabšem položaju. Če kupimo ustekleničeno vino, ne moremo vedeti, iz kakšne kakovosti grozdja je bilo pridelano. Nekateri vinogradniki se zavedajo slabosti prisotnosti plesni na grozdju, čeprav morda samo zaradi tega, ker plesen vpliva na slabšo aromo vina. Nekateri plesnive jagode grozdja zavržejo, vendar je bolj, predvsem v večjih vinogradih, pomembna količina vina dobljena po stiskanju, zato preventivno veliko uporabljajo razna sredstva za zaščito vinske trte (škropiva) ali pa vinu odstranijo aromo po plesni z raznimi postopki. Toda kljub škropljenju in vseh postopkih čiščenja ne moremo vedeti, koliko plesni oz. njihovih slabih produktov toksinov se je na grozdju, v moštu ali vinu obdržalo, če ne opravimo mikrobiološke analize.

Z opravljenimi mikrobiološkimi analizami smo v nalogi pridobili podatke o mikroflori glivnih vrst na grozdju in o velikosti in trendu gibanja populacije teh vrst od grozdja in mošta do vina. Z enostavno kvalitativno metodo določanja toksinov smo ocenili razširjenost dveh z vidika zdravja najnevarnejših mikotoksinov v posameznih vzorcih in na ta način dobili delen vpogled v plesni in njihove toksine v slovenskih vinogradih.


1.1 NAMEN DELA Namen magistrskega dela je bil raziskati vpliv vinorodnega okoliša, sorte grozdja in različnih časov vzorčenja (grozdje, mošt med fermentacijo, vino) na prisotnost rodov plesni, spreminjanje populacije plesni, razširjenost plesni rodov Aspergillus in Penicillium ter tvorbo ohratoksina A (OTA) in aflatoksina B1 (AFB1).

1.2 HIPOTEZE Zaradi ugodnih vremenskih razmer za razvoj plesni smo predvidevali, da bo razširjenost plesni in njihova raznolikost visoka ter:

- da bodo najpogostejše identificirane plesni rodov Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Penicillium, Epicoccum, Cladosporium, Rhizopus,

- da bomo OTA oz. AFB1 največkrat določili pri prvih vzorčenjih, odvzetih med postopkom maceracije, pred začetkom alkoholne fermentacije,

- da bomo OTA oz. AFB1 določili pri plesnih rodu Aspergillus

- in da bomo največjo koncentracijo plesni, ki tvorijo toksina OTA oz. AFB1, določili v vinorodnem okolišu Slovenska Istra.


2 PREGLED OBJAV Poglavje 2 zajema pregled objav s področja proučevanja razširjenosti in vplivov na prisotnost mikotoksigenih plesni na grozdju in produktih iz njega, v obsegu potrebnem za razumevanje raziskovalnega dela.

2.1 MIKOTOKSIGENE PLESNI Mikotoksigene plesni sodijo med filamentozne glive. So ubikvitarni organizmi, kar pomeni, da uspevajo v vseh podnebnih razmerah po svetu tako na trdnih kot tudi v tekočih substratih (Pitt, 2000). Med drugim kolonizirajo tudi rastlinje, namenjeno prehrani in živalski krmi, kjer lahko, v ugodnih razmerah plesni rodov Aspergillus, Penicillium, Alternaria in Fusarium, sintetizirajo škodljive mikotoksine. Od teh štirih sta prva dva glavna proizvajalca mikotoksinov v sadju (Jakson in Al Taher, 2008). Zaradi zaužitja hrane rastlinskega ali živalskega izvora kontaminirane s toksigenimi plesnimi, ki so v hrano izločile mikotoksine, prihaja do bolezni imenovanih mikotoksikoze. Izpostavljenost toksičnim mikotoksinom se kaže v toksičnih odzivih, ki pa so odvisni od številnih dejavnikov, npr. toksičnosti mikotoksinov, pogostosti in časa trajanja izpostavljenosti, starosti in prehranskega statusa posameznika ter drugih možnih sinergističnih učinkih s kemikalijami, ki jim je posameznik izpostavljen (Peraica in sod., 1999).

2.1.1 Rod Penicillium Za rod Penicillium so značilne hitro rastoče kolonije, ki so največkrat obarvane zeleno, tudi sivo-zeleno, modro-zeleno, rumeno-zeleno ali belo (Slika 1a). Pod mikroskopom rod prepoznamo po značilnih metulah (simetričnih ali asimetričnih razvejitvah na koncu konidiofora), na katerih se v snopih tvorijo keglaste konidiogene celice, ki se imenujejo fialide. V njih se tvorijo verižice konidijev, ki so lahko okrogle, elipsoidne ali cilindrične oblike (Slika 1b) (Pitt in Hocking, 1985).

Slika 1: Penicillium spp. a) kolonije na CYA, b) mikroskopski preparat, 1000x povečava

a b


Plesni rodu Penicillium so, glede na veliko število vrst, ki lahko rastejo v različnih različnih razmerah, najpomembnejši kvarljivci živil. Rastejo lahko pri nizkih temperaturah, nizki vodni aktivnosti (aw) in v širokem območju vrednosti pH (Pitt in Hocking, 1985). Povzročajo kvarjenje hrane in živalske krme rastlinskega izvora, predvsem zelenjave, sadja, žitaric in stročnic. Nekatere vrste povzročajo tudi gnitje sena, redkeje pa se pojavi kolonizacija na mesu, sirih in začimbah (Logrieco in sod., 2003). Med pomembnejše mikotoksine, ki jih tvori ta rod, sodijo ohratoksini, patulin in citridin (Sweeney in Dobson, 1998).

2.1.2 Rod Aspergillus Prav tako kot za rod Penicillium so tudi za rod Aspergillus značilne hitrorastoče kolonije. Te so lahko bele, rumene, rumeno-rjave, črne ali zelenkaste barve (Slika 2a). Pod mikroskopom rod prepoznamo po posebni strukturi, ki je sestavljena iz konidiofora, ki se razširi v vezikel ali mešiček, iz njega pa izhajajo metule, fialide in konidiji, ki se ločijo po velikosti, obliki, teksturi in barvi. Konidiji tvorijo kompaktno stebričasto ali pahljačasto, razvejano obliko nad oziroma okoli vezikla (Slika 2b) (Klich, 2002).

Slika 2: Aspergillus spp. a) kolonije na CYA, b) mikroskopski preparat, 1000x povečava

Je vsesplošno prisoten rod, ki ga najdemo na različnih substratih, poznan predvsem kot kvarljivec rastlinskih pridelkov. Rod vključuje večinoma saprofitske vrste, ki kolonizirajo odpadni rastlinski material, nekaj sevov pa lahko kolonizira tudi žive rastline. Najpomembnejši mikotoksini tega rodu so aflatoksini in ohratoksini (Logrieco in sod., 2012).

2.2 MIKROFLORA GROZDJA Površina zrelega zdravega grozda tipično vsebuje mikrobno populacijo v koncentracijah 103-105 CFU/g, ki je pretežno sestavljena iz kvasovk in številnih vrst mlečnokislinskih in ocetnokislinskih bakterij. Na poškodovanih grozdih je populacija, ki jo v velikem deležu predstavljajo filamentozne glive in ocetnokislinske bakterije, v obsegu 106-108 CFU/g (Fleet, 1999). Dosedanje študije so pokazale, da so na grozdju kot naravna mikroflora

a b


vedno prisotne plesni rodov Alternaria, Aspergillus, Cladosporium in Penicillium (Serra in sod., 2005; Belli in sod., 2006; Aydogdu in Gucer, 2009). Med aspergili so najpogosteje zastopani tako imenovani črni aspergili (El Khoury in sod., 2008), ki jih predstavlja sekcija Nigri. V študiji iz Španije, ki je obsegala triletno vzorčenje grozdja, sta bili iz zgoraj omenjene sekcije najpogosteje izolirani vrsti A. niger (0-77 %) in A. carbonarius (25-100 %). Prvi je zelo redko (2-7 %) proizvajal OTA, medtem ko so skoraj vsi izolati A. carbonarius (78-100 %) tvorili OTA (Belli in sod., 2006). Cabanes in sod. (2013) v najnovejših raziskavah navajajo redkost v naravnem okolju prisotnih netoksigenih izolatov vrste A. carbonarius, kar je izkazano v kar nekaj študijah, kjer je število OTA-pozitivnih izolatov vrste A. carbonarius zelo veliko in dosega tudi 100 % (Cabanes in sod., 2013). Po drugi strani vrsti A. flavus in A. parasiticus proizvajata OTA med 30 in 60 % (Belli in sod., 2006; Cabanes in sod, 2013). Vrsti P. verrucosum in A. ohraceus, ki prav tako lahko proizvajata OTA, v raziskavah nista bili zaznani kot predstavnici normalne mikroflore grozdja (Cabanes in sod., 2002; Belli in sod., 2006).

Skupino A. nigger aggregate, ki jo navaja starejša literatura, predstavljata dve vrsti: A. niger in A. tubigensis. V raziskavi, ki je bila narejena, so bile vse vrste iz skupine A. niger aggregate določene kot A. niger (Cabanes in sod., 2002).

V raziskavi enajstih vinogradov v triletni periodi (2001-2003) štirih portugalskih vinorodnih okolišev so najpogosteje izolirali pet rodov: Cladosporium (24 %), Alternaria (16 %), Botrytis (17 %), Penicillium (24 %) in Aspergillus (15 %) (Serra in sod., 2005). Ugotovili so, da pojavnost tako imenovanih 'plesni na polju' (Alternaria, epicoccum,

Fusarium, Stemphylium in Ulocladium) med zorenjem grozdnih jagod upada, narašča pa pojavnost sporolirajočih plesni, kot so Aspergillus, Penicillium in Rhizopus (Serra in sod., 2005; Chunmei in sod., 2013). Najpogosteje določene vrste rodu Penicillium so bile P. brevicompactum, P. glabrum/spinulosum in P. thomii, med aspergili pa vrste sekcije Nigri: A. niger aggregate in A carbonarius. Kljub temu da je bila večina vrst določena kot netoksigena, je 8 % mikroflore grozdja tvorilo toksine (aflatoksini, OTA, patulin, trihoteceni), med katerimi je bil najpogosteje tvorjen OTA (6 % mikroflore grozdja) (Serra in sod., 2005).

V podobni raziskavi so leta 2010 v provinci Shaanxi na Kitajskem proučevali mikrofloro poškodovanega grozdja ter nagnitega grozdja treh namiznih sort in petih sort namenjenih predelavi v vino. Najpogosteje izoliran rod je bil Apergillus, sledita mu rodova Penicillium in Mucor. Preostali rodovi Rhizopus, Alternaria, Cladosporium in Fusarium so bili določeni v majhnih deležih in le pri nekaterih vinskih sortah. Prisotnost treh najpogostejših rodov je bila večja pri nagnitem kot pri poškodovanem grozdju. Pokazale so se tudi razlike med različnimi sortami grozdja – na splošno se je za najbolj s plesnimi kontaminirano grozdje pokazala pogosto uživana namizna sorta 'Thompson seedless'. Pri tej sorti so

izolirali tudi največje vsebnosti OTA (najpogosteje A. carbonarius) tako iz poškodovanega (4,5 ± 0,2 x104 CFU/g) kot iz nagnitega (1661,1 ± 42,3 x103 CFU/g) grozdja. Grozdje,


namenjeno predelavi v vino, je bilo kontaminirano v bistveno manjših koncentracijah (tako skupna koncentracija plesni kot vrednost OTA). AFB1 pogosto ni bil detektiran, oziroma je bila vrednost manjša od 0,3 x103 CFU/g (Chunmei in sod., 2013).

V raziskavi libanonskega grozdja leta 2005, je 95,5 % izoliranih vrst pripadalo rodu Aspergillus (najpogostejši vrsti A. niger aggregates 52,2 % in A. flavus 43,1 %), preostanek 4,5 % pa rodu Penicillium. Najpogosteje izolirana vrsta rodu Aspergillus je bila A. niger aggregates z 52,2 %. A. carbonarius je bila prisotna v zelo majhnem deležu (1,8 %), kar je v nasprotju z ostalimi mediteranskimi državami, kjer je delež te vrste večji. Je pa A. carbonarius edini od črnih aspergilov, ki je tvoril OTA (vsi izolati – največja vsebnost 8,4 µg/g). Druga najpogosteje izolirana vrsta rodu Aspergillus je bila s 43,1 % A. flavus, od tega je 43,4 % tvorilo AFB1 v vrednostih med 0,1 in 22,6 µg/g (El Khoury in sod., 2008).

Študija, ki je bila narejena v sezoni 2005 v Braziliji, je vsebovala 101 vzorec grozdnega soka in vin iz trgovin v Sao Paulu. 29 rdečih vin in 38 vzorcev grozdnega soka je bilo proizvedenih v Braziliji, preostalih 34 vzorcev rdečega vina pa je bilo iz uvoza (Argentina, Čile, Urugvaj, Francija, Italija, Portugalska, Španija in Severna Afrika). Rezultati so pokazali, da je pojavnost plesni v rdečih vinih iz Južne Amerike majhna, prav tako so majhne vrednosti OTA (od 0,03 do 0,3 ng/L), za razliko od evropskih mediteranskih držav, kjer je pojavnost plesni zelo velika (vsi vzorci so vsebovali OTA). Vrednosti OTA v vinu iz Južne Amerike so bile prav tako nizke (od 0,1 do 1,3 ng/mL), OTA pa ni bil detektiran v nobenem od vzorcev grozdnega soka (Shundo in sod., 2006).

2.3 MIKOTOKSINI Mikotoksini, sekundarni metaboliti gliv, so kemijsko in temperaturno stabilne spojine, ki jih glede na strukturne podrobnosti in toksičnost razvrščamo v več skupin. Posamezna vrsta plesni lahko proizvaja enega ali več različnih mikotoksinov, prav tako je lahko enak mikotoksin proizvod različnih vrst plesni (Hussein in Brasel, 2001). Glede na njihovo delovanje in vsebnost jih uvrščajo v različne skupine. Antibiotiki so toksični za bakterije, fitotoksini so patogeni rastlinam, mikotoksini pa spadajo v skupino nizkomolekularnih spojin, ki so že v nizkih vrednostih toksične za vretenčarje in druge živalske skupine. Med slednje ne sodijo metaboliti gob, velja namreč, da filamentozne glive proizvajajo mikotoksine, gobe in druge makroskopske glive pa strupe. Med mikotoksine se prav tako ne uvrščajo drugi nizkomolekularni sekundarni metaboliti gliv (npr. etanol), ki so toksični le v visokih koncentracijah (Bennett in Klich, 2003).

Obstaja na stotine mikotksinov, vendar je le nekaj takšnih, ki jih pogosto zasledimo v hrani in pomembno vplivajo na zdravje ljudi. Med slednje CAST (ang. Council of Agricultural Science and Technology) šteje aflatoksine, trihotecene, fumonizine, zearalenone, OTA in ergot alkaloide (Serra in sod., 2005).


2.3.1 Aflatoksini Aflatoksini so družina mikotoksinov, ki jih v kmetijskih pridelkih primarno sintetizirajo številni sevi vrst rodu Aspergillus, najpogosteje A. flavus in A. parasiticus (Bennett in Klich, 2003; Jackson in Al Taher, 2008). Obstajajo velike kvalitativne in kvantitativne razlike. Kot primer Bennett in Klich (2003) navajata, da samo približno polovica sevov A. flavus tvori aflatoksine, vendar jih ti proizvajajo v zelo velikih vrednostih, več kot 106 µg/kg. Glede na UV flourescenco in kromatografsko mobilnost ločimo štiri glavne aflatoksine: aflatoksina B1 (C17H12O6) in B2 (C17H14O6) pod UV svetilko florescirata modro, G1 (C17H12O7) in G2 (C17H14O7) pa turkizno (Bennett in Klich, 2003; Barkai-Golan, 2008).

V hrani in živalski krmi se izmed vseh aflatoksinov v najvišjih vsebnostih pojavlja aflatoksin B1, ki pri živalih povzroča največjo akutno toksičnost, sledijo mu aflatoksin G1, B2 in G2 (Barkai-Golan, 2008).

Po klasifikaciji Mednarodne agencije za raziskave raka IARC (angl. International Agency for Research on Cancer) je aflatoksin B1 mikotoksin, ki je pri ljudeh dokazano rakotvoren. Povzroča maligne tumorje, primarni tarčni organ pa so običajno jetra. Poleg rakotvornega učinka lahko na ljudi in živali deluje tudi imunosupresivno (zavira delovanje imunskega sistema), teratogeno (povzroča nepravilnosti v razvoju zarodka) in mutageno (povzroča spremembe genetskega materiala) (Richard, 2007; Barkai-Golan, 2008).

Vsebnost aflatoksinov je zaradi karcinogenih lastnosti le-teh v večini držav kontrolirana in regulatorno urejena.V Ameriki FDA (ang. Food and Drug Administration) določa največjo vsebnost vsote vseh aflatoksinov (B1, B2, G1 in G2) v hrani 20 g/kg (FAO, 2004). V Evropski uniji je zakonodaja še strožja. Uredba ES 1881/2006 določa, uredba EU 165/2010

pa potrjuje skupno vsebnost aflatoksinov v hrani, ki ne sme preseči 10 g/kg (gre za vsoto koncentracij aflatoksinov B1, B2, G1 in G2). V suhem sadju in zemeljskih oreščkih (arašidi) namenjenim neposredni uporabi za prehrano ljudi ali kot sestavina živil ter žitih in žitnih proizvodih, pa je dovoljena vsebnost 2 ng/g za AFB1.

2.3.1.1 Pojavnost aflatoksinov Aflatoksini pretežno proizvedeni s strani A. flavus in A. parasiticus so najpogosteje prisotni v žitaricah, začimbah, oljnih semenih, oreščkih, maslu in mleku (Logrieco in sod., 2003). Veliko tveganje za naravno prisotnost ohratoksinov predstavlja sadje: arašidi, pistacije in oreščki, brazilski oreščki in fige. Majhno tveganje za okužbe pa predstavljajo mandlji, orehi, lešniki in rozine (Battilani in sod., 2008). Do okužbe svežih produktov, kot so žitarice, kava, kakav, suho sadje in začimbe, običajno pride med skladiščenjem. Občasno pa se okužbe pojavijo tudi med pridelavo na polju, posledično so aflatoksini prisotni tudi v raznih sadnih sokovih in vinu (Bhat in sod., 2010). Sadje se večinoma kontaminira na poljih, ugodni skladiščni pogoji pa pogosto vplivajo na povečanje količine mikotoksinov (Bennett in Klich, 2003; Battilani in sod, 2008).


2.3.2 Ohratoksini Ohratoksini A, B, C, D so velika skupina sekundarnih metabolitov številnih sevov rodov Aspergillus in Penicillium. Iz te skupine je ohratoksin A (C20H18O6NCl) najbolj toksična spojina, ki je tudi največkrat tvorjena. Proizvajajo ga primarno plesni vrste A. ohraceus in P. verrucosum (Richard, 2007; Barkai-Golan, 2008). Je imunosupresiven in potencialno teratogen, po klasifikaciji IARC pa tudi potencialno rakotvoren za človeka (skupina 2B) (Bennett in Klich, 2003). OTA, ki je med mikotoksini največkrat najden v krvi ljudi, najden je bil tudi v materinem mleku in v serumu novorojenčkov (Bennett in Klich, 2003; Barkai-Golan, 2008), ima potencialno tudi genotoksično (povzroča genetske spremembe) in nefrotoksično (povzroča poškodbe ledvic) delovanje. Povezan je z obolevnostjo Balkanska endemska nefropatija, kjer je kot agent odgovoren za povzročitev te smrtne bolezni ledvic (Jackson in Al Taher, 2008).

Zaradi morebitnih posledic za človekovo zdravje je Evropska unija tudi za OTA z uredbo ES 1881/2006 nato pa še z dopolnitvijo te uredbe EU 105/2010 določila največje koncentracije v posamezni hrani. Za vino iz grozdja je določena največja vsednost 2,0

g/kg, za grozdni sok 2,0 g/kg in rozine 10,0 g/kg. Viri navajajo, da je vino na drugem mestu za žitaricami kot glavni vir dnevnega vnosa OTA. Grozdni sok in rozine pa so glavni vir OTA pri dietah, posebno pri mladih otrocih (Jackson in Al Taher, 2008).

2.3.2.1 Pojavnost ohratoksina A Ohratoksin A, eden izmed najnevarnejših mikotoksinov, se najpogosteje pojavlja v žitaricah. Pomemben vir predstavlajo še različna živila, kot so kavna zrna, kakavova zrna, oreščki, pivo, vino, grozdni sokovi, začimbe in suho grozdno sadje (rozine, sultanine, kurinte) (EFSA, 2006; Jackson in Al Taher, 2008).

Od prvih raziskav o pojavnosti OTA v vinu (Zimmerli and Dick, 1996) so kasneje tako v Evropi, kot v Avstraliji in Ameriki potekale številne raziskave o pojavnosti toksinov v vinu (Jackson in Al Taher, 2008).

Miraglia in Brera (2002) navajata nivo kontaminacije v velikosti 15,6 g/L južni Evropi. Največje vrednosti OTA so bile določene v rdečem vinu in sladkih vinih, pridelanih iz na soncu posušenih grozdnih jagod (Mateo in sod., 2007; Jackson in Al Taher, 2008).

OTA pa ne kontaminira le vina, temveč tudi druge proizvode iz grozdja. Raziskave na grozdnem soku so pokazale, da skoraj nobeden vzorec grozdnega soka iz belega grozdja ni vseboval OTA (pri tistih, ki so jih vsebovali, pa je bila vsebnost majhna), medtem ko so skoraj vsi vzorci proizvodov iz rdečega grozdja vsebovali OTA v velikih vrednostih (Jackson in Al Taher, 2008). Miraglia and Brera (2002) poročata o vsebnosti OTA 5,3

g/L v nemških vzorcih grozdnega soka.

Kis: raziskave prav tako navajajo vsebnosti toksinov v kisu, in sicer večje vsebnosti OTA v balzamičnem kisu (102 -252 ng/L) kot v navadnem (Jackson in Al Taher, 2008).


Suho sadje: Vsebnosti OTA za rozine, sultanine, korinte so v splošnem večje kot v vinu oz.

grozdnem soku, okoli 50-70 g/kg (Miraglia and Brera, 2002). Po nekaterih raziskavah naj bi kar 88 % vzorcev (rozine, sultanine, korinte) vsebovalo OTA v območju od 0,2-53,6

g/kg. Vsebnost OTA je v drugem suhem sadju značilno manjša kot 3 g/kg. Iz rezultatov je razvidno, da je suho grozdje lahko v velikih količinah onesnaženo z OTA. Ta in ostale podobne raziskave vsebujejo zato pomembne podatke za ljudi, ki veliko uživajo rozine, posebej otroci (Jackson in Al Taher, 2008).

2.4 UŽIVANJE GROZDJA/VINA Proizvodnja vina v Evropi predstavlja kar 75 % svetovne proizvodnje (Battilani in sod., 2006; Belajova in Rauova, 2007), največje pridelovalke grozdja leta 2012 so bile Kitajska, ZDA, Italija, Francija in Španija (FAOSTAT, 2014). Z 62,3 L/prebivalca ima največjo porabo vina Vatikan, Slovenija je na 6. mestu z 45,l L/prebivalca leta 2011 (Wine Institute, 2011). Poraba grozdja (absolutno) je največja na Kitajskem, v 27 državah Evropske unije in v Turčiji (USDA, 2012). Okužba grozdja in grozdnega soka predstavlja še posebej veliko skrb, odkar so glavni potrošniki otroci in odkar je poraba grozdnega soka večja kot poraba vina (Terra in sod., 2012). Sprejemljiv dnevni vnos OTA je 5 ng/kg telesne mase/dan (Terra in sod., 2012).

V okviru Direktive Sveta 93/5/EGS, 25. februarja 1993, o pomoči Komisiji in sodelovanju držav članic pri znanstvenem proučevanju vprašanj v zvezi z živili (SCOOP) je bila izvedena ocena vnosa OTA s hrano pri prebivalstvu Skupnosti. Evropska agencija za varnost hrane (EFSA) je na zahtevo Komisije, ob upoštevanju novih znanstvenih spoznanj, sprejela in posodobila znanstveno mnenje v zvezi z OTA v hrani z dne 4. aprila 2006 in določila sprejemljiv tedenski vnos 120 ng/kg telesne mase. Na podlagi teh mnenj je določila mejne vrednosti za žita, žitne proizvode, suho grozdje, praženo kavo, vino, grozdni sok ter živila za dojenčke in majhne otroke, ki bistveno prispevajo k splošni izpostavljenosti ljudi OTA ali izpostavljenosti občutljivih skupin potrošnik kot so otroci (Uredba komisije ES 1881/2006; Uredba komisije EU 105/2010).

EFSA (2006) podaja oceno izpostavljenosti OTA, ki združuje podatke o analizi živil s podatki o dejanski porabi hrane za tri države članice EU (Francija, Italija, Švedska). Ocenjene vrednosti izpostavljenosti povprečnega potrošnika (2 do 3 ng/kg telesne mase na dan) in velikega potrošnika (od 6 do 8 ng/kg telesne mase na dan) kažejo, da izpostavljenost OTA giblje med 15 do 20 ng/kg telesne mase na teden oziroma med 40 in 60 ng/kg telesne mase na teden pri potrošniku z veliko potrošnjo. Pri dojenčkih, otrocih in drugih segmentih prebivalstva, ki predstavljajo veliko potrošnjo določenih vrst živil, lahko pride tudi do večje stopnje izpostavljenosti.

Na podlagi podatkov o pojavnosti OTA v živilih in živilskih proizvodih ter njihovi porabi, je bilo ugotovljeno, da k vnosu OTA (50 %, 0,06-1,28 ng/kg telesne mase na dan) največ prispevajo živila iz skupine žitaric, sledijo vino (13 %, 0,02-0,86 ng/kg telesne mase na


dan) in kava (10 %, 0,06-0,42 ng/kg telesne mase na dan), preostalih 27 % pa predstavljajo začimbe, pivo, kakav, suho sadje, sadni sokovi in meso. Glede na celotno populacijo je bil vnos OTA v razponu od 0,13 ng/kg telesne mase na dan v Grčiji, do 3,14 ng/kg telesne mase na dan v Nemčiji (WHO, 2001).

2.5 DEJAVNIKI ZA NASTANEK MIKOTOKSINOV Kljub prizadevanjem za omejitev kontaminacije plesni v hrani so mikotoksigene plesni vseprisotni kontaminanti v naravi in najdejo svoje poti v sadje na polju oz. sadovnjaku, kadarkoli med zorenjem, predelavo, skladiščenjem ali prodajo (Serra in sod., 2005; Jackson in Al Taher, 2008). Čeprav je sadje zaradi visoke vodne aktivnosti, vsebnosti sladkorja in prisotnost organskih kislin, ki dajo mesu sadja nižji pH, dovzetnejše za glivične okužbe, vsebuje, tako kot mnogo drugih živil, kemijske in/ali fizikalne lastnosti, ki preprečujejo glivično ali mikrobno razrast. Tako je relativno malo rodov sposobnih kolonizacije sadja. Nekatere vrste plesni so specializirani patogeni in napadajo samo določene vrste sadja, medtem ko imajo nekatere bolj splošne sposobnosti za napad na tkivo sadja. Prav tako prisotnost toksin-producirajoče plesni ne pomeni nujno, da je toksin tudi prisoten. Tvorba toksina je namreč povezana z mnogimi dejavniki, kot so okoljske razmere, vrsta, sorta, vsebnost hranil, mikrobiološka obremenitev in vrsta oz. sev plesni. Prav tako je bilo raziskano tudi, da iste razmere, ki prispevajo k ugodni rasti plesni, ne pomenijo nujno tudi ugodne proizvodnje toksinov (Jackson in Al Taher, 2008).

V naslednjem poglavju so podrobneje predstavljeni dejavniki, ki vplivajo na prisotnost plesni in njihovih toksinov (predvsem črnih aspergilov in OTA) pred trgatvijo, ob trgatvi in po njej.

2.5.1 Dejavniki, ki vplivajo na prisotnost plesni v vinogradu ZEMLJA: Plesni vrst A. carbonarius in A. niger živijo v zemlji, ki je njihov primarni substrat (Hocking in sod., 2007). Spore teh vrst se po vinogradu razširjajo s toplimi (25-30 °C) zračnimi tokovi (Battilani in sod., 2008). Posebno ugoden, s sladkorji bogat substrat, predstavlja zemlja, na katero so popadale poškodovane ali odmrle grozdne jagode (Amezqueta in sod., 2012), pa tudi zemlja, na kateri raste veliko plevela oz. drugih zelenih prekrivnih rastlin (Hocking in sod., 2007). Spore zelo dobro prenašajo nižjo vodno aktivnost, poleg tega so črne barve, kar jim omogoči dobro odpornost na sončno svetlobo, tako preživijo tudi večdnevno sušenje sonca. Vse to, ob dobrih temperaturnih razmerah, omogoča veliko okužbo grozdja v vinogradih (Battilani in sod., 2008).

PODNEBJE: Aflatoksigene plesni so zelo pogoste in lahko rastejo na številnih različnih substratih, v mnogih razmerah, vendar izrazito uspevajo v vročem, vlažnem, subtropskem ali tropskem podnebju (Jackson in Al Taher, 2008). Vrsta P. verrucosum – ohratoksigena plesen se pojavlja v hladnejših, vlažnih območjih S Evrope, medtem ko A. carbonarius, najpogostejši tvorec OTA, prevladuje v območjih s toplejšim podnebjem. Ohratoksigene plesni tako poleg pridelkov, ki zorijo v tropskih in subtropskih regijah, kontaminirajo predvsem pridelke mediteranskega podnebja (Jackson in Al Taher, 2008).


Izkazalo se je, da je prisotnost OTA na grozdju odvisna od zemljepisne širine vinorodnega območja. Stopnje tveganj kontaminacije z OTA so predpostavljene na osnovi kombinacije povprečne temperature in vsote dežja (mm), avgusta na severni in februarja na južni polobli, in so prikazane na sliki 3 (Battilani in sod., 2008). Na splošno velja, da manjša kot je geografska širina, bolj pogosta je prisotnost in večja je vsebnost (Battilani in sod., 2006; Battilani in sod., 2008). Toplejša območja imajo večjo pojavnost OTA kot hladnejša območja (Jackson in Al Taher, 2008).

Slika 3: Stopnje tveganj za kontaminacijo z OTA na grozdju (Battilani in sod., 2008)

Na severni polobli so določena območja z velikim tveganjem (vroče podnebje s povečano vlažnostjo oz. padavinami (Hocking in sod., 2007): v Evropi pretežno okoli mediteranskega morja, z največjim tveganjem na španskem in pirenejskem polotoku, ter v Grčiji in Turčiji ter v južni Franciji – izjema je Portugalska, kjer je tveganje za prisotnost OTA majhno (Battilani in sod., 2006; Battilani in sod., 2008). Območja severne Afrike ne predstavljajo velikega tveganja za prisotnost OTA, predvsem zaradi visokih temperatur in majhne količine dežja, ki so ustreznejši pogoji za tvorbo AFB1. Podobno je v Severni Ameriki (Kalifornija). Na južni polobli obstaja veliko tveganje za prisotnost OTA v Avstraliji in na jugu Afrike, medtem ko je tveganje v Južni Ameriki manjše (Battilani in sod., 2008).


2.5.2 Dejavniki, ki vplivajo na pojavnost plesni rodu Aspergillus in produkcijo OTA v grozdju

ZDRAVSTVENO STANJE GROZDJA: Okužba se najprej pojavi na poškodovanih ali nagnitih (Hocking in sod., 2007) zrelih grozdnih jagodah, od koder se ob ugodnih temperaturnih razmerah razširi na celoten grozd. Mehanske poškodbe (razpoke oz. rane) povzroči hranjenje insektov ali ptic z jagodami, kar povzroči predrtje grozdnega tkiva in omogoči plesnim naselitev v notranjost, ki postane idealen habitat za njihovo razmnoževanje (Battilani in sod., 2008). Povezavo med poškodovanimi grozdnimi jagodami in vsebnostjo OTA v vinu so potrdili v raziskavi, v katero je bilo vkjučenih 156 vinogradov na jugu Francije. Ugotavljali so vsebnost OTA v vinu glede na majhno, srednje

ali veliko število poškodovanih jagod. Največjo vsebnost OTA (>2 g/L) je povzročila kombinacija velikega števila poškodovanih jagod in povprečne temperature nad 21 °C (Clouvel in sod., 2008).

V raziskavi na Kitajskem so Chunmei in sod. (2013) odkrili povezavo med veliko onesnaženostjo zraka s sporami plesni in visoko stopnjo kontaminacije grozdnih jagod. Povezava velja za rodova Aspergillus in Pencillium, ni pa nujno, da visoka koncentracija spor v zraku pomeni tudi visoko celokupno kontaminacijo grozdja. Ugotovili so, da je prisotnost rodov Aspergillus, Penicillium in Mucor večja pri nagnitih grozdnih jagodah kot v poškodovanih grozdnih jagodah.

VREME : Različne vremenske razmere vplivajo na razlike med vinskimi letniki, pa čeprav gre za isto območje (Battilani in sod., 2006). Primerna temperatura in primerna vlaga oz. vodna aktivnost sta pomembna okoljska dejavnika, ki vplivata na pojavnost plesni ter njihovo produkcijo mikotoksinov (Battilani in sod., 2006; Amezqueta in sod., 2012). Amezqueta in sod. (2012) so raziskali različne pogoje (temperatura, vodna aktivnost, število dni starosti micelija) in ugotovili, da različni sevi tvorijo OTA pri različnih temperaturah (Preglednica 1). Tako sta vrsti P.verrucosum in A. ohraceus sposobni tvoriti OTA pri nižjih temperaturah kot vrsti A. carbonarius in A. niger, ki OTA tvorita pri višjih temperaturah. Optimalna temperatura in aw, pri kateri določena plesen uspeva, ter optimalna temperatura in aw, pri kateri ista plesen tvori toksin, se praviloma razlikujejo. Tako večina plesni vrste A. carbonarius raste optimalno med 30 in 35 °C, optimalna aw pa je 0,93 do 0,99. Optimalna temperatura za rast plesni vrste Aspergillus niger je med 30 in 37 °C, optimalna aw pa med 0,9 in 0,995 (Battilani in sod., 2008).


Preglednica 1: Povzetek razmer, pri katerih različne vrste plesni tvorijo OTA (Amezqueta in sod., 2012)

P. verrucosum A. ohraceus A. carbonarius A. niger Min. T (° C) 4 – 10 5 – 10 5 – 15 10 – 15 Max. T (° C) 21 – 31 30 – 40 30 – 45 35 – 41 Optimalna T (° C) 24 – 25 20 – 35 15 – 30 15 – 35 Min. aw 0,80 – 0,83 0,87 – 0,90 0,85 – 0,94 0,90 – 0,95Optimalna aw 0,95 – 0,99 0,95 – 0,99 0,95 – 0.99 0,95 – 0,99Min št. dni 7 3 2 – 5 3 – 7 Optimalno št. dni > 14 9 – 21 10 – 15 5 – 30

Optimalne razmere za rast plesni vrst A. flavus in A. parasiticus so 35 °C in aw 0,95 (Jackson in Al Taher, 2008). Optimalna T za produkcijo aflatoksinov (A. flavus in A. parasiticus): 35 °C, 0,95 aw oz. 33 °C in aw 0,99. Nobena vrsta ne proizvaja toksinov pri temperaturah pod 7,5 °C oz. nad 40 °C (Barkai-Golan, 2008).

VRSTA SADJA, SORTA GROZDJA (HRANILA V SUBSTRATU): V številnih študijah je bilo ugotovljeno, da je grozdje najbolj dovzetno za kontaminacijo s črnimi aspergili v obdobju zrelosti do trgatve. Takrat se grozdna kožica zmehča in postane še bolj dovzetna za poškodbe. Delež sladkorja naraste, sadje z visokim deležem ogljikovih hidratov (OH) pa predstavlja odličen substrat za razrast plesni rodov Aspergillus in Penicillium ter proizvodnjo OTA (Hocking in sod., 2007; Amezqueta in sod., 2012; Chunmei in sod., 2013).

Pomemben podatek predstavlja tudi vrednost pH grozdja oz. grozdnega soka, ki se med zorenjem grozdja zvišuje, načeloma pa ne preseže vrednosti pH 4,5. Rast plesni vrste A. carbonarius je boljša pri pH 4 oz. 7, kot pri pH 2,6. Najboljša produkcija OTA v poskusu je bila pri pH 7 (Battilani in sod., 2008).

VRSTA, SEV PLESNI: Sekcija Aspergillus Nigri vključuje nekaj vrst, ki jih je izredno težko identificirati s klasičnimi metodami, saj razlike med njimi večinoma temeljijo na uniseratni ali biseratni porazdelitvi konidijskih glav ter na velikosti in hrapavosti konidijev. Velja, da uniseratne vrste ne tvorijo OTA, medtem ko biseratne vrste pogosto tvorijo OTA in sicer v velikih vsebnostih (velja za vrsto A. carbonarius) ali pa je produkcija OTA redka in v majhnih vsebnostih (velja za vrsto A. niger aggregate) (Battilani in sod., 2008).

Analiza suhega grozdja iz Argentine je pokazala, da je A. niger bila najpogosteje določena vrsta, vendar so le trije od 293 izolatov tvorili OTA, medtem ko je bila vrsta A. carbonarius manj pogosta (48 izolatov), vendar je kar 96 % izolatov bilo OTA-pozitivnih (Romero in sod., 2005; Battilani in sod., 2008).

Analize zemlje v Italiji so pokazale, da kar 60 % izolatov predstavlja A. niger aggregate in le 19 % A. carbonarius. Slednji je bil OTA-pozitiven v 60 % (Battilani in sod., 2008).


Aspergillus flavus je v raziskavi El Khoury in sod. (2008) predstavljal 43,1 % vseh aspergilov, ki so bili določeni. AFB1 je tvorili pri 43 % izolatov te vrste.

Raziskana je bila kontaminacija grozdja s plesnimi vrste A. carbonarius in posledično pojavnost OTA glede na različne sorte vinske trte. Prisotnost OTA je bila majhna pri groznih sortah kot so 'Bianco d´Alessano', 'Pampanuto' in 'Uva di Troia', v nasprotju s sortami 'Cabernet Sauvignon', 'Trebbiano' in 'Verdeca', ki so kazali veliko vsebnost OTA (Battilani in sod., 2008). V drugi raziskavi Chunmei in sod. (2013) navajajo veliko vsebnost OTA predvsem pri namiznem grozdju sort 'Thompson Seedless' (1,67 x 107

CFU/g) in 'Red Earth' (105,0 x 103 CFU/g). Vsebnosti OTA pri grozdju namenjenemu predelavi so bile največje pri 'Pinot Noir' (15,3 x 103 cfu/g).

INTERAKCIJE: Interakcije plesni vrste A. carbonarius z ostalimi plesnimi, ki so del mikroflore grozdja, kot so plesni vrst Alternaria alternata, Cladosporium herbarum, Penicillium decumbens, Penicillium janthinellumin in Trichoderma harzianum, zavirajo produkcijo OTA, medtem ko interakcije s plesnimi vrst Eurotium amstelodami in Candida spp. stimulirajo produkcijo OTA (Barkai-Golan, 2008).

UPRAVLJANJE VINOGRADA: Zmanjševanje pojavnosti črnih aspergilov v vinogradu je mogoče doseči z dobro prakso, ki vključuje odstranjevanje poškodovanih oz. nagnitih jagod in grozdov s trte oz. iz tal (Jackson in Al Taher, 2008) ter minimizacijo mehanskih in okoljskih poškodb jagod oz. grozdov. Izkazalo se je tudi, da majhni ohlapni šopki grozdja, dobro razporejeni po vinski trti, preprečujejo poškodbe zaradi škodljivcev (Jackson in Al Taher, 2008). Ugoden učinek na zmanjševanje pojavnosti plesni ima zagotavljanje konstantne vlažnosti tal, posebno v kombinaciji z muljeno zastirko, kjer se sprostijo komponente, ki delujejo fungistatično oz. fungicidno (Hocking in sod., 2007). Fungicidno delujejo tudi pripravki, ki vsebujejo baker ali strobilurin (Jackson in Al Taher, 2008).

2.5.3 Trgatev in razmere po trgatvi TRGATEV: Odstranjevanje gnilih grozdnih jagod, jagod, poškodovanih zaradi insektov, plesni, pretiranega namakanja, poškodb dežja ob trgatvi pred nadaljnjo predelavo oz. pred sušenjem, uspešno vpliva na manjšo vsebnost OTA v vinu, soku, kisu in suhem sadju (Serra in sod., 2005; Jackson in Al Taher, 2008).

PROCES VINIFIKACIJE: Ugotovljeno je bilo, da je OTA pogosteje določen v rdečih vinih (54 %) kot v rose (40 %) in belih (25 %) vinih. Največje vsebnosti OTA so prav tako bile določene v rdečih vinih (Battilani in sod., 2008). Vzrok je v poteku maceracije (stik mošta z jagodnimi kožicami in grozdnimi pečkami) rdečih in rose vin, ki ne poteka pri belih vinih. Ta trend so opazili pri evropskih vinih (v Avstraliji in Grčiji razlik med belim in rdečim vinom niso opazili) pa tudi pri grozdnem soku in balzamičnem kisu (Jackson in Al Taher, 2008).


FERMENTACIJA: OTA se med primarno alkoholno fermentacijo ne tvori - predvsem zaradi inhibitornega delovanja alkohola na plesni. Vsebnost OTA, ki je nastala pred pojavom alkohola med fermentacijo (na grozdju, grozdnem soku, grozdnem moštu), pa v vinu ostane. (Hocking in sod., 2007; Battilani in sod., 2008; Jackson in Al Taher, 2008).

OBDELAVA: Obdelava grozdja, grozdnega soka, vina in suhega grozdja z žveplovim dioksidom ugodno vpliva na manjšo pojavnost črnih aspergilov (Hocking in sod., 2007). Prav tako uporaba nekaterih bakterij (Lactobacillus plantarum in Oenococcus oeni) ali kvasovk (Saccharomyces cerevisiae), ki imajo sposobnost razgradnje OTA ali absorbentov, kot so preparati iz aktivnega oglja, tekoče želatine, bentonina, ki vežejo OTA nase, zmanjšajo vsebnost OTA v vinu v povprečju za 40 %, pogosto pa posledično vplivajo na slabšo kakovost vina (Hocking in sod., 2007; Quintela in sod., 2013).

SUŠENJE: Zelo pomembno je, da se proces sušenja izvede takoj po trgatvi, produkt pa se zapakira in shrani le, če sadje doseže primerno stopnjo vlage (Hocking in sod., 2007; Jackson in Al Taher, 2008), temperatura skladiščenja pa ne sme presegati 15 °C (Amezqueta in sod., 2012).

SHRANJEVANJE: Za namizno grozdje je pomembno shranjevanje v hladnem prostoru (0 °C), za suho sadje pa v suhem prostoru. Primeren prostor za shranjevanje ugodno vpliva na manjšo pojavnost vrst črnih aspergilov (Hocking in sod., 2007). Sestava atmosferskih plinov okoli toksigenih plesni prav tako vpliva na produkcijo toksinov. Kontrolirana atmosfera oz. modificirana atmosfera sta se izkazali kot možna zaviralca produkcije aflatokinov plesni vrste A. flavus (Barkai-Golan, 2008).


3 MATERIAL IN METODE DELA

3.1 MATERIALI

3.1.1 Vzorci grozdja V raziskavo smo vključili 12 vzorcev grozdja, ki pripadajo devetim različnim vinskim sortam iz štirih različnih vinorodnih okolišev v Sloveniji. Podatki o sortah, vinorodnih okoliših in datumih obiranja so zapisani v preglednici 2.

Preglednica 2: Vinorodni okoliš, datum obiranja in sorta vzorcev grozdja

Oznaka vzorca grozdja

Sorta Vinorodni okoliš Datum obiranja

G1 Refošk Slovenska Istra 17.9.2012

G2 Merlot Slovenska Istra 17.9.2012

G3 Shiraz Slovenska Istra 17.9.2012

G4 Cabernet sauvignon Slovenska Istra 17.9.2012

G5 Cabernet franc Slovenska Istra 17.9.2012

G6 Šentlovrenka Bela Krajina 18.9.2012

G7 Modra frankinja Bela Krajina 18.9.2012

G8 Žametna črnina Bela Krajina 18.9.2012

G9 Žametna črnina Ptuj 26.9.2012

G10 Modra frankinja Ptuj 26.9.2012

G11 Modri pinot Ptuj 26.9.2012

G12 Žametna črnina Dolenjska 4.10.2012

3.1.2 Vzorci mošta in vina Iz 12 vzorcev grozdja smo po postopku, ki je opisan v poglavju 3.2.2 oz. 3.2.3 pripravili vzorce grozdnega soka, katere smo nato pustili, da so spontano fermentirali. Med alkoholno fermentacijo smo vzorčili mošt oz mlado vino, prav tako smo vzorčili vino po zaključku fermentacije, in sicer po protokolu, ki je zapisan v preglednici 3.

Zaradi lažje obravnave vzorcev pri vseh vzorčenjih od 1. do 35. dne pred filtracijo govorimo o moštu oz. mlademu vinu (v nadaljevanju uporabljamo le izraz mošt). 35. dan po filtraciji govorimo o vinu. V nalogi ni bila opravljena kemijska analiza vzorcev, ki bi natančneje opredelila, pri katerih vzorcih gre za grozdni sok, mošt, mlado vino in vino.


Preglednica 3: Čas in oznaka vzorcev med alkoholno fermentacijo (mošt) in po njej (vino)

* Zaradi lažje obravnave vzorcev, smo konec fermentacije za vse vzorce določili 35. dan od priprave grozdnega soka za fermentacijo. Pri vseh ostalih časih govorimo o moštu oz. mlademu vinu

Oznake vzorcev so oblike An/f-d, kjer na mestu A označimo ali gre za mošt oz. mlado vino (M) ali za vino (V), n je številka vzorca grozdja, f je fermentacijska steklenica mošta/mladega vina oz. vina (paralelka I ali II), d pa pri moštu/mlademu vinu in vinu označuje dan vzorčenja med fermentacijo.

Primer:

M5/I-7; mošt/mlado vino vzorca grozdja G5 (Refošk, Slovenska Istra), prva paralelka, vzorčeno 7. dan fermentacije

Vino

1. dan 3. dan 7. dan 14. dan 21. dan 28. dan 35. dan 35. dan*

M1/I-1 M1/I-3 M1/I-7 M1/I-14 M1/I-21 M1/I-28 M1/I-35 V1/I-35

M1/II-1 M1/II-3 M1/II-7 M1/II-14 M1/II-21 M1/II-28 M1/II-35 V1/II-35






















M12/II-1 M12/II-3 M12/II-7 M12/II-14 M12/II-21 M12/II-28 M12/II-35 V12/I-35G12

Žametna črnina, Dolenjska

G11Modri pinot, Ptuj

G9Žametna črnina, Ptuj

G10Modra frankinja, Ptuj

G6Šentlovrenka, Bela Krajina

G7Modra frankinja, Bela Krajina

G8Žametna črnina, Bela Krajina

G3Shiraz, Slovenska Istra

G4Cabernet sauvignon, Slovenska

G5Cabernet franc, Slovenska

Oznaka vzorca grozdja

Sorta, vinorodni okoliš

Čas in oznaka vzorcev med alkoholno fermentacijo

G1Refošk, Slovenska Istra

G2Merlot, Slovenska Istra


3.1.3 Mikrobiološka gojišča Za izolacijo in identifikacijo plesni ter ugotavljanje sposobnosti tvorbe OTA in AFB1 smo uporabili naslednja gojišča:

- gojišče MEA (ang. Malt Extract Agar, Melt) pripravljeno po navodilih proizvajalca

- gojišče DRBC (ang. Dichloran Rose-Bengal Chloramphenicol Agar, CMO727, Oxoid, Anglija) pripravljeno po navodilih proizvajalca

+ 96 % etanol, denaturirani, tip B (Itrij, Slovenija)

+ kloramfenikol (ang. Chloramphenicol supplement, SR0078E, Oxoid, Anglija)

- gojišče OGY (ang. Oxytetracyclin Glucose Yeast Agar, 4018382, Biolife, Italija) pripravljeno po navodilih proizvajalca

+ oksitetraciklin (ang. Oxytetracycline ant. supplement, 4240000, Biolife, Italija)

- gojišče CYA (ang. Czapek Yeast Extract Agar) po protokolu Pitt in Hocking (1985) pripravljen iz:

- K2HPO4 (Kalij-hidrogenfosfat brezvodni, 1116108, Kemika, Hrvaška)

- kvasni ekstrakt (ang. Yeast extract, 4122202, Biolife, Italija)

- saharoza (ang. Sucrose, 1800408, Kemika, Hrvaška)

- bakteriološki agar (ang. Agar bacteriogical, 4110302, Biolife, Italija)

- Czapek koncentrat (pripravljen po protokolu)

- destilirana voda

- Czapek koncentrat po protokolu pripravljen iz:

- NaNO3 (Natrijev nitrat)

- KCl (Kalijev klorid, 4936, Merck, Nemčija)

- MgSO4 · 7H2O (Magnezijev sulfat heptahidrat, 1058860500, Merck, Nemčija)

- FeSO4 · 7H2O (Železov sulfat heptahidrat)

- ZnSO4 · 7H2O (Cinkov sulfat heptahidrat)

- CuSO4 · 5H2O (Bakrov sulfat pentahidrat)

- destilirana voda


- gojišče G25N (ang. 25 % Glycerol Nitrate Agar) po protokolu Pitt in Hocking (1985) pripravljen iz:

- K2HPO4 (kalij-hidrogenfosfat brezvodni, 1116108, Kemika, Hrvaška)

- Czapek koncentrat (pripravljen po protokolu)


- glicerol redestiliran (0711901, Kemika, Hrvaška)


- destilirana voda

- gojišče YES (ang. Yeast Extract Sucrose Agar) po protokolu pripravljen iz:


- saharoza (ang. Sucrose, 1800408, Kemika, Hrvaška)


- destilirana voda

3.1.4 Kemikalije za pripravo suspenzije spor - 0,5 % agar s Tweenom po protokolu pripravljen iz:


- emulgator Tween 80 (8221870500, Merck, Nemčija)

3.1.5 Kemikalije za pripravo nativnega mikroskopskega preparata in mikroskopiranje

- laktofenolno modro (ang. Lactophenol blue solution, 10108400, Sigma Aldrich, Nemčija)

- imerzijsko olje (0900104, Kemika, Hrvaška)

- destilirana voda

3.1.6 Kemikalije za izvedbo tankoplastne kromatografije (TLC) Standardi:

- ciklopiazonska kislina (ang. Cyclopiazonic acid, from Penicillium cyclopium, C1530-5MG, Sigma Aldrich, Nemčija)


- ohratoksin A (ang. Ochratoxin A solution, 34037-2ML-R, Sigma Aldrich, Nemčija)

- aflatoksin B1 (ang. Aflatoxin B1 from Aspergillus flavus, A6636-1MG, Sigma Aldrich, Nemčija)

Kemikalije za pripravo mobilnih faz:

- kloroform (1024451000, Merck, Nemčija)

- aceton (1000201000, Merck, Nemčija)

- toluen (1083251000, Merck, Nemčija)

- etil acetat (1096231000, Merck, Nemčija)

- mravljična kislina 98-100% (1002641000, Merck, Nemčija)

Stacionarna faza:

- TLC plošča (TLC Silica gel 60F254, Merck, Nemčija)

- absolutni etanol (1009831000, Merck, Nemčija) za sterilizacijo opreme

Kemikalije za potrditev prisotnosti toksinov

- Erlichov reagent (101195815, Sigma Aldrich, Nemčija)

3.1.7 Laboratorijska oprema Pri eksperimentalnem delu smo uporabljali sledečo laboratorijsko opremo:

- gnetilnik (Stomacher 400, tip BA 7021, Seward, Anglija)

- vrečke za gnetilnik (Golias Labortehnika, Slovenija)

- fermentacijske stekleničke z vrelnimi vehami

- pipete in nastavki (Eppendorf, Francija)

- plastične petrijevke 90 mm in 75 mm (Golias Labortehnika, Slovenija)

- krovna in objektna stekelca

- namizno mešalo (TTS 2, tip T, Yelowline, Nemčija)

- hladilnik LTH, 101 Gorenje in LAE


- hladilna omara LTH in WHIRPOLLE

- inkubator (tip I-105 CK, Kambič, Slovenija)

- inkubator z magnetnimi mešali (tip I-45-4M, Kambič, Slovenija)

- tehtnica (tip PB 1502-S/A, Mettler toledo, Švica)

- avtoklav (serija 1-61-137, Sutjeska, Srbija)

- avtoklav (tip 500X700, Sutjeska, Srbija)

- digestorij (tip 382)

- mikroskop (BA 210, Motic, Kitajska)

- stereo mikroskop – lupa (MS 5, Leica, Nemčija)

- UV svetilka (z valovno dolžino 366 nm, tip MANWOOD/36)

- računalniški program Motic Images Plus 2.0 (Motic, Kitajska)

- ostali osnovni in laboratorijski pribor: računalnik, komora za TLC, gorilnik, cepilna igla, cepilna zanka, trikotna palčka za razmazovanje, sterilne epruvete, pinceta, skalpel, steklenice za pripravo gojišč, čaše, merilni valji, ravnilo, svinčnik, škarje, kartonaste škatle, plastične vrečke, sterilni zobotrebci, parafilm, parni indikatorski trak za avtoklaviranje, rokavice iz lateksa, papirnate brisače, etanol (70 % za razkuževanje), raztopina natrijev hipoklorid (18 % NaOCl) (za mikroskopske preparate, TLC plošče in nastavke za pipetiranje toksinov), destilirana voda.


3.2 METODE

3.2.1 Shema dela Na sliki 4 je predstavljena je poenostavljena shema dela, po kateri smo izvedli naš poskus.

Slika 4: Shema eksperimentalnega dela


3.2.2 Priprava grozdja Iz dveh srednje velikih grozdov smo naključno izbrali grozdne jagode v skupni količini enega grozda in jih vložili v plastično vrečko. To smo nato postavili v gnetilnik in grozdne jagode 120 sekund homogenizirali pri srednji hitrosti. S tem smo pridobili homogen vzorec.

3.2.3 Priprava grozdnega soka in potek alkoholne fermentacije Približno pet kilogramov grozdja smo ročno zmečkali, pri čemer smo predhodno odstranili pecljevino. Iz zmečkane drozge smo tako pridobili grozdni sok, ki smo ga označili kot vzorec s časom ena med fermentacijo. Preostalo drozgo smo natočili v 2 fermentacijski steklenici z vrelnimi vehami (paralelki), ki smo ju postavili v klet s konstantnimi razmerami (T = 18±1 °C).

3.2.4 Vzorčenje grozdnega soka, mošta in vina Vsak vzorec smo vzorčili v dveh paralelkah. Med fermentacijo smo vzorčili 3., 7., 14., 21., 28. in 35. dan. 35. dan smo vzorčili pred filtracijo mladega vina ter po njej (vino). Filtracijo smo opravili preko dvakrat prepognjene gaze.

3.2.5 Izolacija in kvantifikacija plesni Nato smo pripravili razredčitve vsakega vzorca (od 10-1 do 10-5) (ISO 7218, 1996; ISO 4833, 1991). Vsako razredčitev smo pripravili v dveh paralelkah. Razredčitev 10-1 smo dobili direktno s prenosom 100 µL homogeniziranega vzorca na gojišče. Razredčitev 10-2 smo pridobili iz matične suspenzije (pripravljena iz 10 mL homogeniziranega vzorca in 90 mL fosfatnega pufra), tako da smo raztopino homogenizirali na namiznem mešalu in 100 µL prenesli na gojišče DRBC. Razredčitev 10-3 smo pridobili kot razredčitev 10-2, le da smo namesto homogeniziranega vzorca vzeli razredčitev 10-2. Ostale razredčitve smo pridobili po istem postopku. Gojišča DRBC z vzorci smo sedem dni inkubirali pri 25 ºC. Pri nekaterih vzorcih (kjer ni bilo kolonij) smo inkubacijo podaljšali na 10 oziroma na 14 dni. Po inkubaciji smo določili koncentracijo plesni v vzorcih s štetjem kolonij na gojiščih DRBC. Upoštevali smo, da so števne plošče tiste z najmanj 15 kolonijami in največ 150 kolonijami. Ker je bilo pri vzorcih oziroma pri posameznih paralelkah število kolonij plesni mnogokrat manjše od 15, smo koncentracije celic kljub temu izračunali in jih označili z opombo, da gre za oceno. Izračun koncentracije celic (CFU/mL) v vzorcu smo izračunali po formuli:

∑

,………...……………………………………………………(1)

∑ …vsota kolonij na števnih gojiščih DRBC n1…število gojišč prve upoštevane razredčitve n2…število gojišč druge upoštevane razredčitve d…faktor prve upoštevane razredčitve


3.2.6 Določitev makro- in mikromorfoloških lastnosti plesni Da smo lahko določili mikromorfološke lastnosti posamezne kolonije plesni, smo najprej pripravili nativni mikroskopski preparat, tako da smo s sterilnima zobotrebcema odvzeli del zračnega micelija skupaj s substratnim micelijem in ga prenesli na objektno steklo v kapljico laktofenola ter pokrili s krovnim stekelcem. Nato smo preparat mikroskopirali pri 400x povečavi. Na podlagi značilnih makro- in mikromorfoloških lastnosti smo določili morebitne rodove plesni: Alternaria, Cladosporium, Fusarium, Acremonium, Penicillium, Aspergillus, Botrytis, Rhisopus in Mucor. V kolikor smo določili enega izmed naštetih rodov, smo iz kolonije izolirali čiste kulture in jih identificirali.

3.2.7 Izolacija čiste kulture Želeli smo proučevati značilne lastnosti posamezne vrste plesni, zato smo jo morali najprej izolirati (osamiti) v čisti kulturi. To smo naredili tako, da smo se s sterilno cepilno iglo dotaknili kolonije, ki smo jo želeli izolirati. S cepilno iglo (na katero so se prijele spore) smo nato naredili dva vboda v novo gojišče OGY. Tako pripravljena gojišča OGY smo nato sedem dni inkubirali pri 25 ºC.

3.2.8 Identifikacija plesni Po izolaciji čistih kultur smo izbrali posamezne kolonije plesni za identifikacijo. S sterilno cepilno zanko smo spore posamezne čiste kulture plesni prenesli v 0,5 % agar s Tweenom, tako, da je bila suspenzija rahlo motna. Suspenzijo smo nato homogenizirali na namiznem mešalu in za vsako plesen precepili spore plesni, aseptično s cepilno iglo, na naslednja gojišča: CYA, MEA, G25N. Precepljanje spor in inkubacijo gojišč, ki je trajala sedem dni pri 25 ºC, 37 ºC oziroma 5 ºC, pa smo izvedli po shemi za identifikacijo plesni na sliki 5 (Pitt in Hocking, 1985).

Slika 5: Shema gojišč za identifikacijo plesni. Shema predstavlja kombinacijo petrijevk z izbranimi gojišči in temperaturami inkubacije. Številki 1 in 2 označujeta nacepljene kulture (Pitt in Hocking, 1985)


3.2.8.1 Določitev makromorfoloških lastnosti Po 7-dnevni inkubaciji gojišč za identifikacijo (3.2.8) smo naredili za vsak izolat na gojiščih zapis makromorfoloških lastnosti (velikost kolonije (premer 2r), barva substratnega in zračnega micelija, struktura substratnega in zračnega micelija, tvorba eksudata, tvorba kleistotecijev). Makromorfološke lastnosti smo določali tudi s pregledom kolonije z lupo pri 40x povečavi.

3.2.8.2 Določitev mikromorfoloških lastnosti Mikromorfološke lastnosti smo določali na nativnem preparatu (izjema pri Aspergillus spp., kjer zaradi boljše vidljivosti nismo uporabili laktofenola) pri 400x in 1000x povečavi. Opazovali smo septiranost micelija, tvorbo in izgled askospor, tvorbo konidijev, vrsto in izgled konidijev (apeks, metula, fialida, kleistoteciji z askosporami). Po zaključenem mikroskopiranju smo preparate preventivno dekontaminirali v raztopini NaOCl.

3.2.8.3 Identifikacija plesni Glede na določene makromorfološke značilnosti ter mikromorfološka opažanja smo s podrobnimi navodili in ključi za identifikacijo določili posamezne vrste iz rodov Penicillium (Pitt, 1991) in Aspergillus (Klich, 2002). Vrst plesni drugih rodov nam ni uspelo določiti zaradi presplošnih in ne dovolj podrobnih ključev za identifikacijo. Plesni, kjer glede na dane značilnosti nismo uspeli določiti niti rodu, so ostale neidentificirane.

3.2.9 Precepljanje potencialno mikotoksigenih izolatov Glede na vrsto identificiranih plesni smo iz literature in člankov (Bennett in Klich, 2003; Belajova in Rauova, 2007; Richard, 2007; Jackson in Al Taher, 2008; Barkai-Golan, 2008; Aydogdu in Gucer, 2009;) predvideli, kateri od izolatov so potencialni tvorci mikotoksinov: ohratoksina A, aflatoksina B1 in ciklopiazonske kisline (ta nas je zanimala izključno zaradi tega, ker z drugimi metodami nismo mogli določiti ali imamo izolate vrst Aspergillus flavus ali Aspergillus parasiticus - ciklopiazonska kislina se pojavlja samo pri vrsti Aspergillus flavus). Izolate, ki bi lahko tvorili te mikotoksine smo, aseptično s sterilno cepilno iglo z enim vbodom, precepili na gojišča YES. Tako nacepljene izolate smo inkubirali 14, 21 ter 28 dni pri 25 ºC.

3.2.10 Določitev prisotnosti mikotoksinov s TLC Pri delu z mikotoksini smo obvezno uporabljali zaščitne rokavice. Delo smo opravljali v digestoriju in z vsemi topili ravnali kot z nevarnimi snovmi. Ves material, ki je prišel v stik z mikotoksini (nastavki za pipete, TLC plošče, čepi plesni…), pa smo dekontaminirali v raztopini NaOCl.

3.2.10.1 Priprava vzorcev čepov plesni Čepe plesni smo pripravili s pomočjo orodja za izdelovanje čepov ali pa kar s pinceto za čepe, če je bilo gojišče prevlažno. Delo smo opravili aspetično s sterilnim orodjem. Za sterilizacijo orodja smo uporabljali 96 % etanol in gorilnik.


3.2.10.2 Priprava TLC-plošče Kot stacionarno fazo smo uporabili ploščo TLC, ki je sestavljena iz nosilca (aluminijeva pločevina) z naneseno tanko plastjo stacionarne faze (silikagel in aluminijev oksid). Glede na to, ali smo uporabili malo ali veliko komoro, smo ploščo predhodno ustrezno razrezali s škarjami (velika komora 10 cm x 20 cm, mala komora 10 cm x 10 cm). Na ploščo smo s svinčnikom rahlo označili spodnjo črto (2,5 cm od spodnjega roba) in na njej označili vzorce v razmiku po 1,5 cm.

3.2.10.3 Priprava mobilne faze Glede na vrsto mikotoksina smo pripravili mešanico topil – mobilno fazo (200 ml za veliko komoro in 20 mL za malo komoro). Za določitev tvorbe ciklopiazonske kisline in ohratoksina A smo pripravili mobilno fazo TEF v razmerju 5:4:1 (toluen, etil acetat, mravljinčna kislina). Za določitev aflatoksina B1 pa smo pripravili mobilno fazo KAC v razmerju 9:1 (kloroform:aceton).

3.2.10.4 Izvedba TLC Na prvo in zadnje označeno mesto na plošči TLC smo nanesli standardno raztopino mikotoksina; raztopine je bilo potrebno nanesti zelo pazljivo, tako da je premer lise manjši od 3 mm. Nato smo nanesli na preostala mesta vzorce čepov plesni. Vsak vzorec smo nanesli 3x na eno mesto. Paziti smo morali, da smo dobili lepo liso brez sledi vzorca gojišča. Ko smo nanesli vse vzorce, smo v digestoriju odparili topilo. Ploščo z vzorci smo nato previdno postavili v komoro z mobilno fazo. Komoro smo pokrili in počakali, da je mobilna faza zaradi kapilarnega tlaka pripotovala skoraj do vrha plošče. Takrat smo ploščo vzeli iz komore in ponovno počakali, da je topilo odparelo v digestoriju.

3.2.10.5 Potrditev prisotnosti toksinov Za potrditev prisotnosti ciklopiazonske kisline smo potem, ko smo odparili topilo v digestoriju, ploščo ovlažili z Erlichovim reagentom. Ta nam naravne rjave repe toksina, ki so sicer slabše vidni, obarva vijolično in potrditev je tako enostavnejša. Po literaturi (Samson in sod., 2000) naj bi po postopku z Erlichovim reagentom ploščo ovlažili še s 50 % žveplovo (VI) kislino v vodi (dobimo modro obarvanje repov), vendar se ta postopek ni obnesel, saj je žveplova kislina največkrat uničila TLC-ploščo.

Za potrditev prisotnosti ohratoksina A in aflatoksina B1 smo uporabili UV svetilko. Z UV-svetlobo valovne dolžine 366 nm smo osvetlili ploščo tako, da so postale lise vidne, nato smo jih označili in plošče tudi fotografirali. Glede na izmerjeno razdaljo, ki jo prepotujejo standardna raztopina mikotoksina in posamezne spojine vzorcev, smo določili ali vzorec tvori določen mikotoksin (+) ali ne (-).


4 REZULTATI Iz štirih slovenskih vinorodnih okolišev in devetih različnih vinskih sort smo na rdečem grozdju, v moštu po različnih časih fermentacije ter v vinu določali prisotnost rodov plesni. Spremljali smo spreminjanje populacije plesni ter prisotnost plesni rodov Penicillium in Aspergillus. Identificirali smo vrste znotraj teh dveh rodov. S TLC smo preverjali toksigenost izolatov tistih vrst, ki potencialno tvorijo toksina OTA in AFB1.

Razširjenost plesni smo določali preko povprečne koncentracije plesni, kot je podana v poglavju 3.2.5 (enačba 1). Izračunana je kot vsota koncentracij plesni (CFU/mL) v vseh vzorcih, deljena s skupnim številom vzorcev.

Primer 1: Število izolatov rodu Aspergillus v vzorcih grozdnega mošta iz Bele Krajine.

Število vzorcev najdemo v preglednici 2:

3 (vzorci grozdnih sort G6, G7 in G8 ) * 2 (steklenica I, II)* 7 (število vzorčenj) = 42

Vsota koncentracij plesni rodu Aspergillus v navedenih vzorcih = 646356,4 CFU/mL

Povprečna koncentracija = vsota koncentracij plesni / št. vzorcev = 646356,4 CFU/mL / 42 = 1539 CFU/mL

4.1 RAZNOLIKOST PLESNI Identificirali smo 4137 izolatov devetih različnih rodov plesni. 4 % izolatov je zaradi neizrazitih tipičnih mikro- in makromorfoloških znakov ostalo neidentificiranih.

4.1.1 Razširjenost plesni v vinorodnih okoliših Opazovali smo koncentracijo plesni v posameznih vinorodnih okoliših posamično za grozdje, mošt in vino. Prav tako smo posamično za grozdje, mošt in vino določali, v katerih okoliših so posamezni rodovi plesni najbolj razširjeni.

4.1.1.1 Plesni na grozdju iz različnih vinorodnih okolišev Razširjenost rodov plesni na grozdju med vinorodnimi okoliši zelo varira. Tako ne moremo trditi, da sta dve vinorodni območji med sabo podobni, saj v vsakem območju prevladujejo drugi rodovi (slika 6). Glede na povprečno koncentracijo plesni v vinorodnem okolišu Slovenska Istra prevladuje rod Cladosporium z 49 %, sledita rodova Alternaria z 21 % in Fusarium z 15 %. V Beli Krajini sta najpogostejša rodova Botrytis z 47 % ter Cladosporium z 18 %. V Štajerski Sloveniji pa je najbolj razširjen rod Penicillium (61 %), sledi rod Botrytis (16 %), 14 % pa je bilo neidentificiranih izolatov (izračun glede na povprečno koncentracijo plesni). Slednjih je bilo največ na Dolenjskem, kjer predstavljajo kar 84 %.


Slika 6: Delež izolatov plesni na grozdju iz različnih vinorodnih okolišev Legenda: * Skupna koncentracija plesni (CFU/mL) v posameznem vinorodnem okolišu Iz slike 7 je razvidno, v katerih vinorodnih okoliših so bili posamezni rodovi najbolj razširjeni. Največ izolatov rodov Aspergillus, Acremonium in Rhizopus je bilo pridobljenih iz vzorcev v vinorodnem okolišu Bela Krajina. Rodovi Penicillium, Botrytis, Fusarium, Cladosporium in neidentificirani izolati so bili izolirani pretežno iz vzorcev, pridobljenih v Štajerski Sloveniji. Rod Alternaria je podobno razširjen tako v Beli Krajini kot v Štajerski Sloveniji.

Slika 7: Razširjenost plesni na grozdju glede na vinorodni okoliš in na skupno koncentracijo plesni v posameznem vinorodnem okolišu

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Bela Krajina Dolenjska SlovenskaIstra

ŠtajerskaSlovenija

Delež izolatov

Vinorodni okoliš

Acremonium

Alternaria

Aspergillus

Botrytis

Cladosporium

Fusarium

Penicillium

Rhizopus

Neidentificirano

4248* 5600* 372* 168333*

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%

Delež izolatov

Rodovi plesni

Bela Krajina

Dolenjska

Slovenska Istra

Štajerska Slovenija


4.1.1.2 Plesni v moštu iz različnih vinorodnih okolišev Tudi razširjenost plesni v moštu v vinorodnih okoliših je zelo raznolika, kar je prikazano na sliki 8. V Slovenski Istri prevladuje Alternaria (64 %), sledi Botrytis (11 %) in neidentificirane plesni (11 %). V vinorodnem okolišu Dolenjska prevladuje z 62 % Botrytis in z 25 % sledi Cladosporium. Visoko, kar z 92 % v Beli Krajini prevladujejo plesni rodu Aspergillus. Plesni rodu Alternaria z 49 % prevladujejo na Štajerskem. Sledita rodova Acremonium (25 %) in Penicillium (16 %).

Slika 8: Delež izolatov plesni v moštu iz različnih vinorodnih okolišev Legenda: * Skupna koncentracija plesni (CFU/mL) v posameznem vinorodnem okolišu

Rodovi Acremonium, Alternaria in neidentificirani rodovi se v moštu večinoma pojavljajo v Štajerski Sloveniji. Rodova Cladosporium in Botrytis najdemo predvsem na Dolenjskem. Penicillium, Aspergillus, Mucor in Fusarium so v največji meri prisotni v Beli Krajini (slika 9).

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%


ŠtajerskaSlovenija

Delež izolatov

Rodovi plesni

Acremonium

Alternaria

Aspergillus

Botrytis

Cladosporium

Fusarium

Penicillium

Neidentificirano

700379* 6673* 91* 1890*


Slika 9: Razširjenost plesni iz vzorcev mošta glede na vinorodni okoliš in na skupno koncentracijo plesni v posameznem vinorodnem okolišu

4.1.1.3 Plesni v vinu iz različnih vinorodnih okolišev V vzorcih vina smo identificirali samo plesni rodu Penicillium. Največja razširjenost rodu je bila v Beli Krajini (92 % izolatov), zaznali pa smo ga tudi v vzorcih iz Slovenske Istre (5 %) ter Dolenjske (3 %) (slika 10).

Slika 10: Razširjenost plesni rodu Penicillium v vzorcih vina glede na vinorodni okoliš in na skupno koncentracijo plesni v posameznem vinorodnem okolišu

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%

Delež izolatov

Rodovi plesni

Bela Krajina

Dolenjska

Slovenska Istra

ŠtajerskaSlovenija

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Penicillium

Delež izolatov

Rodovi plesni

Bela Krajina

Dolenjska

Slovenska Istra

ŠtajerskaSlovenija


4.1.2 Razširjenost plesni na grozdju, med fermentacijo in v vinu Iz primerjave razširjenosti plesni na grozdju, v moštu in v vinu ne glede na vinorodni okoliš ali sorto vidimo, da pretežno prevladujeta dva rodova in sicer Penicillium in Aspergillus, ki sta nadalje v nalogi obsežneje prikazana. Tako na grozdju prevladuje Penicillium (58,6 %), v moštu pa Aspergillus (71 %), medtem ko smo v vinu našli zgolj predstavnike Penicillium (Slika 11).

Slika 11: Delež izolatov plesni na grozdju, v moštu in v vinu Legenda: * Skupna koncentracija plesni (CFU/mL) na vzorcih grozdja, mošta oz. vina

4.1.3 Razširjenost plesni glede na sorto Na devetih različnih sortah smo proučevali prisotnost rodov plesni na grozdju, v moštu in vinu.

4.1.3.1 Razširjenost plesni na grozdju glede na sorto Na grozdju je opaziti veliko raznolikost rodov. Na sortah 'Cabernet franc', 'Modra frankinja' in 'Refošk' so bile prisotne pretežno plesni rodu Cladosporium. Plesni rodu Cladosporium so enakovredno zastopane kot plesni rodu Fusarium na sorti 'Merlot'. Na sorti 'Cabernet sauvignon' prevladujejo plesni rodu Alternaria, ki so bile v večjem deležu poleg neidentificiranih vrst določene tudi na sorti 'Shiraz'. V večjem deležu smo na sortah 'Modri pinot' in 'Šentlovrenka' določili plesni rodu Botrytis. Na grozdju sorte 'Žametna črnina' pa skoraj celoto populacije plesni predstavlja rod Penicillium, kar je prikazano na sliki 12.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Grozdje Mošt Vino

Delež izolatov

Acremonium

Alternaria

Aspergillus

Botrytis

Cladosporium

Fusarium

Mucor

Penicillium

Rhizopus

Neidentificirano

43682* 37741* 9*


Slika 12: Delež izolatov plesni na grozdju glede na sorto Legenda: * Skupna koncentracija plesni (CFU/mL) na grozdju po posameznih sortah

4.1.3.2 Razširjenost plesni v moštu glede na sorto

V moštu je prav tako opaziti veliko raznolikost plesni, kar prikazuje slika 13. Tudi struktura rodov se glede na grozdje bistveno ne spreminja. Če so na grozdju prevladovale plesni rodov Cladosporium, Alternaria, Botrytis in Penicillium, v moštu poleg teh prevladujejo še plesni rodu Aspergillus. Slednji je najpogosteje določen v moštih sort cabernet sauvignon, šentlovrenka in modra frankinja. Plesni rodu Penicillium prevladujejo v moštu shiraz, v večjem deležu pa tudi v moštu refošk. Rod Cladosporium prevladuje v moštu merlot, v večjem deležu pa je prisoten tudi v moštu refošk. Plesni rodu Alternaria prevladujejo v moštih cabernet franc in modri pinot. Plesni rodu Botrytis pa prevladujejo v moštu žametna črnina.

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%

Delež izolatov

Sorta

Acremonium

Alternaria

Aspergillus

Botrytis

Cladosporium

Fusarium

Mucor

Penicillium

Rhizopus

Neidentificirano

445* 8* 640* 18366* 151768* 600* 165* 9399* 105412*


Slika 13: Delež izolatov plesni v moštu glede na sorto Legenda: * Skupna koncentracija plesni (CFU/mL) v moštu po posameznih sortah

4.1.3.3 Razširjenost plesni v vinu glede na grozdno sorto Plesni, ki smo jih določili v vinih treh sort: cabernet savignon, šentlovrenka in žametna črnina, pripadajo rodu Penicillium (slika 14).

Slika 14: Delež izolatov plesni v vinu glede na sorto Legenda: * Skupna koncentracija plesni (CFU/mL) v vinu po posameznih sortah

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Delež izolatov

Sorta

Acremonium

Alternaria

Aspergillus

Botrytis

Cladosporium

Fusarium

Mucor

Penicillium

Neidentificirano

342* 265* 358* 7054* 2450* 185* 488* 31260* 5754*

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

Delež izolatov

Sorta

Penicillium

5* 50* 17*


4.2 POPULACIJA PLESNI Prikazali smo, kako se populacija plesni na grozdju razlikuje od mošta in vina ter ali vinorodni okoliš oz. sorta vplivata na populacijo plesni na grozdju, moštu in vinu.

4.2.1 Spremljanje populacije plesni v vinorodnih okoliših S spremljanjem populacije plesni v vinorodnih okoliših smo ugotovili, da je bila največja populacija (koncentracija plesni) na grozdju določena v Štajerski Sloveniji. Največjo populacijo v moštu smo določili v Beli Krajini in na Dolenjskem, največjo populacijo v vinu pa smo določili v Beli Krajini. Najmanjše povprečne vrednosti, tako na grozdju, kot v moštu in vinu, so bile določene v Slovenski Istri (slika 15). Ob rezultatih je treba omeniti še, da so odkloni med posameznimi vzorci grozdja in vina zelo veliki – večji kot razlike med povprečnimi vrednostmi, kar je razvidno iz slike 15.

Slika 15: Povprečna koncentracija plesni na grozdju, v moštu in v vinu po različnih vinorodnih okoliših

4.2.2 Spremljanje populacije plesni na grozdju, med fermentacijo in v vinu Populacija plesni je časovno odvisna, kar je prikazano na sliki 16. Na grozdju in prvi dan vzorčenja mošta (dan 1) je povprečna koncentracija plesni najvišja, nato z vsakim vzorčenjem pada, najmanjša je bila pričakovano v vinu.

1

10

100

1000

10000

100000

1000000


ŠtajerskaSlovenija

Povp

rečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Vinorodni okoliš

Grozdje

Mošt

Vino


Slika 16: Povprečna koncentracija plesni na grozdju v različnih časih fermentacije mošta in v vinu

4.2.3 Spremljanje populacije plesni na sortah Spremljali smo spreminjanje populacije plesni po posameznih sortah. Opaziti je, da na sortah cabernet franc, cabernet sauvignon, merlot, modra frankinja, refošk, shiraz in šentlovrenka populacija plesni v moštu prevlada nad populacijo na grozdju, za razliko od sort modri pinot in žametna črnina, kjer je populacija plesni na grozdju večja kot v moštu. Plesni v vinu smo določili le pri treh sortah (šentlovrenka, žametna črnina in cabernet sauvignon) (slika 17).

Slika 17: Povprečna koncentracija plesni na grozdju, v moštu in v vinu glede na grozdne sorte

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

Grozdje 1. 3. 7. 14. 21. 28. 35. Vino

Povp

rečna ko

ntaminacija (CFU

/mL)

t (dan)

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

Povp

rečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Sorta

Grozdje

Mošt

Vino


4.3 PLESNI RODOV Penicillium IN Aspergillus Identificirali smo šest vrst plesni rodu Aspergillus in 24 vrst rodu Penicillium. Med plesnimi rodu Aspergillus največji delež predstavljata vrsti A. carbonarius (56,7 % vseh izolatov rodu Aspergillus) in A. niger (39,6 %). Ostale identificirane vrste so bile A. japonicas (3,2 %), A. parasiticus (0,4 %), A. versicolor (0,03 %) in A. ochraceus (0,001 %) (slika 18). Med plesnimi rodu Penicillium prevladujejo plesni vrste P. glabrum (77,4 %) (Slika 20) Ta vrsta je bila sicer zastopana zgolj v enem vzorcu, kjer pa je bila določena zelo visoka koncentracija plesni. Da bi lahko dobili bolj detajlno sliko o razširjenosti posameznih vrst plesni, smo pri nadaljni analizi namesto povprečne koncentracije plesni (CFU/mL) po vseh vzorcih raje spremljali število pozitivnih vzorcev (prisotnost plesni) ter povprečno koncentracijo plesni izračunali zgolj iz pozitivnih vzorcev (Slika 19, 21 in od slike 22 dalje). Če torej rezultate predstavimo z vidika števila vzorcev, na katerih smo uspeli določiti različne plesni (prisotnost), dobimo nekoliko drugačno sliko.

Slika 18: Deleži vrst identificiranih plesni rodu Aspergillus na grozdju, v moštu in v vinu

S predstavitvijo rezultatov glede na prisotnost izolatov (da/ne), smo želeli predstaviti koliko sort predstavlja nevarnost za kontaminacijo z rodovoma Aspergillus in Penicillium. Izmed plesni rodu Aspergillus smo na največ sortah izolirali plesni vrste A. japonicus, sledijo plesni vrst A. parasiticus, A. niger in A. carbonarius. Najmanjše število vzorcev pripada plesnim vrst A. ohraceus in A. versicolor (slika 19). Pri plesnih rodu Penicillium po prisotnosti prevladujejo vrste P. chrysogenum, P. janthinellum, P.griseofulvum in P. thomii (slika 21).

A. niger39,6 %

A. carbonarius56,7 %

A. ohraceus0,001 %

A. parasiticus0,4 %

A. japonicus3,2 % A. versicolor

0,03 %


Slika 19: Število sort pri katerih so bile vsaj enkrat določene plesni rodu Aspergillus na grozdju, v moštu in v vinu

Slika 20: Deleži vrst identificiranih plesni rodu Penicillium na grozdju, v moštu in v vinu

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Številosort

P. thomii5,1 %

P. chrysogenum1,4 %P. janthinellum

11,1 %

P. solitum1,0 %

P. glabrum77,4 %

Ostali4,0 %


Slika 21: Število sort v katerih so bile vsaj enkrat določene plesni rodu Penicillium na grozdju, v moštu in v vinu

4.3.1 Razširjenost plesni rodov Penicillium in Aspergillus na grozdju, v moštu in vinu glede na vinorodne okoliše

Zanimalo nas je, ali obstajajo razlike v prisotnosti plesni rodov Penicillium in Aspergillus med vinorodnimi okoliši. Razlike v povprečnih koncentracijah obstajajo na grozdju tako pri plesnih rodu Penicillium (najvišja povprečna koncentracija plesni v Štajerski Sloveniji, najmanjša v Slovenski Istri in na Dolenjskem, kjer plesni rodu Penicillium nismo izolirali) (slika 22), kot pri plesnih rodu Aspergillus, kjer smo najvišjo povprečno koncentracijo plesni določili v Beli Krajini (slika 23). V moštu se povprečna koncentracija plesni rodu Penicillium med vinorodnimi okoliši bistveno ne razlikuje, za razliko od povprečne koncentracije plesni rodu Aspergillus, kjer prevladuje Bela Krajina z najvišjo povprečno koncentracijo plesni rodu Aspergillus in Dolenjska brez določenih izolatov plesni rodu Aspergillus. V vinu plesni rodu Aspergillus nismo določili, povprečna koncentracija plesni rodu Penicillium pa je najvišja v Beli Krajini.

0123456789

P. aurantiogriseum

P. bilaii

P. brevicompactum

P. chrysogenum

P. citrinum

P. citroenigrum

P. crustocum

P. decumbens

P. glabrum

P. glandicola

P. griseofulvum

P. hirstum

P. janthinellum

P. lividum

P. m

elini

P. rugulosum

P. sclerotiorum

P. sim

plicissimum

P. solitum

P. thomii

P. variabile

P. verrucosum

P. viridicatum

P. m

iczynskii

Število sort


Slika 22: Razširjenost plesni rodu Penicillium v grozdju, moštu in vinu glede na vinorodni okoliš Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Penicillium

Slika 23: Razširjenost plesni rodu Aspergillus v grozdju, moštu in vinu glede na vinorodni okoliš Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Aspergillus

2*

1*

3*

13*

2*17*

6*

2*

1*1*

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

Bela Krajina Dolenjska Istra ŠtajerskaSlovenija

Povprečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Vinorodni okoliš

Grozdje

Mošt

Vino

3*

2*

12*

11*

6*

1

10

100

1000

10000

100000

Bela Krajina Dolenjska Istra ŠtajerskaSlovenija

Povp

rečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Vinorodni okoliš

Grozdje

Mošt

Vino


4.3.2 Razširjenost plesni rodov Penicillium in Aspergillus na grozdju, med fermentacijo in v vinu

Razširjenost plesni rodu Aspergillus je časovno odvisna. Število izolatov pada z vsakim vzorčenjem mošta. Manjša odstopanja so le 21. in 35. dan. Podobno obnašanje lahko ugotovimo tudi pri plesnih rodu Penicillium, kjer je vidna monotona časovna odvisnost povprečne koncentracije plesni. Večja odstopanja v primerjavi povprečnih koncentracij plesni rodov Penicilium in Aspergillus se prikažejo pri vzorčenju grozdja. Pri plesnih rodu Aspergillus tako povprečna koncentracija ni najvišja, temveč je med najnižjimi. Trend je razviden tudi v smeri vedno manjše prisotnosti plesni na vzorcih, sploh pri plesnih rodu Aspergillus, medtem ko prisotnost plesni rodu Penicilium nekoliko bolj variira (slika 24). Glede na rezultate lahko predvidevamo, da so plesni rodu Penicillium bolj odporne na proces fermentacije kot plesni rodu Aspergillus, saj število vzorcev, v katerih smo jih določili, ne upade bistveno.

Slika 24: Razširjenost plesni rodov Penicillium in Aspergillus na grozdju, v različnih časih fermentacije mošta in v vinu Legenda: * Število vzorcev (prisotnost), iz katerih smo izolirali plesni rodu Aspergillus oz. Penicillium

6*

9*

6* 7*

3* 2*6*

5* 4*

5*

8* 7*

6*

4*

1*

2*1*

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

Grozdje 1. 3. 7. 14. 21. 28. 35. Vino

Koncentracija plesni (CFU

/mL)

t (dan)

Penicillium

Aspergillus


4.3.3 Razširjenost plesni rodov Penicillium in Aspergillus glede na sorto Na grozdju smo plesni rodu Penicillium v najvišjih povprečnih koncentracijah določili pri sortah 'Žametna črnina' in 'Modri pinot' (slika 25), plesni rodu Aspergillus pa pri sortah 'Modra frankinja' in 'Šentlovrenka' (slika 26). Na moštu plesni rodu Aspergillus prevladujejo na istih dveh sortah, sta se pa prisotnost in populacija plesni generalno povečala v primerjavi z vzorci grozdja. Plesni rodu Penicillium so v moštu približno enakovredno zastopane na vseh sortah.

V vinu plesni rodu Aspergillus nismo določili, plesni rodu Penicillium pa smo približno enakovredno določili na sortah merlot, šentlovrenka in žametna črnina. Iz slik 25 in 26 je poleg zgoraj naštetih stvari opaziti, da je povprečna koncentracija plesni na grozdju in v moštu bistveno višja pri plesnih rodu Penicillium kot pri plesnih rodu Aspergillus. Največjo populacijo plesni rodu ali Penicillium ali Aspergillus je opaziti na naslednjih štirih sortah grozdja: 'Modra frankinja', 'Modri pinot', 'Šentlovrenka' in 'Žametna črnina'.

Slika 25: Razširjenost plesni rodu Penicillium v grozdju, moštu in vinu glede na sorto Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Penicillium

1*

2*

1*

2*

2*

6*4*

4*3*

2*4*

4*13*

1*

1* 2*

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

Povprečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Sorta

Grozdje

Mošt

Vino


Slika 26: Razširjenost plesni rodu Aspergillus v grozdju, moštu in vinu glede na sorto Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Aspergillus

4.4 OHRATOKSIGENOST IN AFLATOKSIGENOST IDENTIFICIRANIH VRST PLESNI

Določili smo štiri vrste, ki so po pregledu literature (Bennett in Klich, 2003; Belajova in Rauova, 2007; Richard, 2007; Jackson in Al Taher, 2008; Barkai-Golan, 2008; Aydogdu in Gucer, 2009) možni proizvajalci OTA in 1 vrsto, ki bi lahko proizvajala ABF1. Po izvedeni TLC-analizi smo določili delež pozitivnih izolatov. Tako je bila najpogosteje določena vrsta A. carbonarius OTA-pozitivna v 31,3 %, medtem ko so bili vsi vzorci vrste A. niger OTA- negativni. Sta pa bili vrsti, ki sta bili najredkeje določeni, A. ochraceus in P. verrucosum 100 % OTA-pozitivni (slika 27). Vrsta A. parasiticus je bila AFB1-pozitivna v 35,3 % (slika 28).

1*

1*

1*

1*2*

4*

1*

7*

1*

1*

3*

5*

5*

1

10

100

1000

10000Povp

rečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Sorta

Grozdje

Mošt

Vino


Slika 27: Povprečna koncentracija identificiranih ohratoksigenih plesni Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Aspergillus oz. Penicillium

Slika 28: Povprečna koncentracija identificiranih aflatoksigenih plesni Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Aspergillus

1

10

100

1000

10000

100000

A.carbonarius

A. niger A. ohraceus P.verrucosum

Povprečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Identificirana vrsta

OTA +

16*

5*

19*

2* 2*

1* 1*

0

50

100

150

200

250

300

350

A. parasiticus

Povprečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Identificirana vrsta

AFB1 +

17*

6*


4.4.1 Ohratoksigenost in aflatoksigenost identificiranih vrst plesni glede na vinorodni okoliš

Zanimiva je porazdelitev OTA- in AFB1-pozitivnih izolatov glede na vinorodni okoliš. Tako na Dolenjskem kot v Štajerski Sloveniji namreč ni bilo OTA- oz. AFB1-pozitivnega izolata ne na grozdju, kakor tudi ne v moštu in vinu. Največje število OTA- in AFB1-pozitivnih vzorcev je bilo izolirano v Slovenski Istri. Največjo vrednost OTA-pozitivnih izolatov smo določili v moštu v Beli Krajini (slika 29), največ AFB1-pozitivnih izolatov pa v Slovenski Istri, prav tako v moštu (slika 30).

Slika 29: Povprečna koncentracija OTA-pozitivnih izolatov glede na vinorodni okoliš Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Aspergillus oz. Penicillium

Slika 30: Povprečna koncentracija AFB1-pozitivnih izolatov glede na vinorodni okoliš Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Aspergillus

1

10

100

1000

10000

Bela Krajina Dolenjska Slovenska Istra ŠtajerskaSlovenija

Povp

rečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Vinorodni okoliš

Grozdje

Mošt

Vino

2*

2*

1*

1*

1

10

100

1000

Bela Krajina Dolenjska Slovenska Istra ŠtajerskaSlovenija

Povprečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Vinorodni okoliš

Grozdje

Mošt

Vino1*

4*


4.4.2 Ohratoksigenost in aflatoksigenost identificiranih vrst plesni iz grozdja, mošta in vina

Glede povprečno koncentracijo OTA-pozitivnih izolatov zelo izstopa drugo vzorčenje mošta (dan 3). Večino AFB1- pozitivnih izolatov smo določili v prvem in drugem vzorčenju (dan 1 in 3) (slika 31). Opazili smo, da po drugem vzorčenju mošta povprečna koncentracija toksigenih izolatov zelo oz. popolnoma upade, nesorazmerno z upadom populacije.

Slika 31: Povprečna koncentracija OTA- in AFB1-pozitivnih izolatov iz grozdja, mošta v različnih časih fermentacije in iz vina Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Aspergillus oz. Penicillium

4.4.3 Ohratoksigenost in aflatoksigenost identificiranih vrst plesni glede na sorto Najvišjo povprečno koncentracijo OTA-pozitivnih izolatov smo določili na sorti modra frankinja v moštu, v manjšem številu sledita sorti cabernet sauvignon (mošt in vino) in žametna črnina (mošt) (slika 32). Na sortah shiraz, cabernet sauvignon, cabernet franc in šentlovrenka smo določili AFB1-pozitivne izolate, vse v moštu, z najvišjo povprečno koncentracijo pri grozdni sorti shiraz (Slika 33). V vinu smo določili le prisotnost OTA, in sicer le pri sorti cabernet sauvignon. Ugotovili smo, da se oba toksina pojavljata le pri sortah cabernet sauvignon in shiraz. Sorte merlot, refošk in modri pinot pa niso vsebovale OTA ali AFB1 toksigenih plesni.

1

10

100

1000

Povp

rečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

t (dan)

OTA‐pozitivni

AFB1‐pozitivni2*

3*

1*

3*

1*

1*


Slika 32: Povprečna koncentracija OTA-pozitivnih izolatov na grozdju, moštu in v vinu glede na sorto Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Aspergillus oz. Penicillium

Slika 33: Povprečna koncentracija AFB1-pozitivnih izolatov na grozdju, v moštu in v vinu glede na sorto Legenda: * Število vzorcev, iz katerih smo izolirali plesni rodu Aspergillus

0,1

1

10

100

1000

Povprečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Sorta

Grozdje

Mošt

Vino

1*

1*

1*

1*

1* 1*

1

10

100

1000

Povprečna ko

ncentracija (CFU

/mL)

Sorta

Grozdje

Mošt

Vino

1*1*

2*

1*


4.5 POSEBNOSTI PRI IZOLACIJI IN IDENTIFIKACIJI PLESNI Izolacija in kvantifikacija plesni: Pri kvantifikaciji plesni se je pogosto zgodilo, da je bila plošča pri neki razredčitvi (npr. 10-3) neštevna zaradi prevelikega št. kolonij (nad 300), pri večji razredčitvi (npr. 10-4) pa prav tako zaradi premajhnega št. kolonij (pod 15). Pogosto se kolonij ni dalo prešteti tudi v območju števnosti (npr. 200), saj so kolonije preraščale ena drugo in se jih ni dalo ločiti med sabo (slika 34).

Slika 34: Neštevnost plošče zaradi velikega števila kolonij, ki preraščajo druga drugo

Izolacija čiste kulture: Pri eksperimentalnem delu smo pri izolaciji plesni rodu Aspergillus v zadnjih vzorčenjih posebno iz vzorcev Bele Krajine preko mikroskopskih preparatov opazili deformiranost posameznih struktur. Pogosto smo tako le na polovici vezikla opazili metule (slika 35). Poleg struktur, ki so imele značilen izgled za plesni rodu Aspergillus, smo v istem preparatu našli tudi strukture, ki so imele tipičen izgled plesni rodu Mucor (slika 36). Izgled kolonije je bil značilen za plesni rodu Aspergillus. Pri pregledu pod lupo smo našli celice, ki so bile po obliki podobne apeksu, vendar brez metul, vendar nismo mogli zanesljivo določiti ali gre za razrast plesni rodu Mucor preko plesni rodu Aspergillus ali gre mogoče za nezrele apekse plesni rodu Aspergillus. Predvidevali smo, da gre za okužbo s plesnimi rodu Mucor. Pri precepljanju kolonije Aspergillus iz takšne mešane kolonije smo uporabili različne tehnike: od standardnega postopka za pridobitev čiste kulture, nadalje smo poskusili s kombinacijo standardnega postopka in uporabo lupe, s katero smo določili nekontaminirani del. Ker se je izkazalo, da je konica cepilne igle bila predebela, smo cepilno iglo zamenjali s pasteurjevimi cevkami, s katerimi smo pridobili


kot las tanko iglo. S slednjim postopkom smo iz kar nekaj mešanih plošč uspešno izolirali čisto kulturo. Uspešnost izolacije čiste kulture je bila največja pri prvi precepitvi. Pri vsaki nadaljini precepitvi narejeni iz prejšne precepitve je izgled kolonije postajal vrstno netipičen (slika 37), kljub temu, da lastnosti kolonije pod lupo in mikroskopom niso izgledale kot kontaminirana kolonija. Zaradi nenavadega poteka dogodkov smo takšne kolonije določili kot rod Mucor. Kolonije, ki so bile določene kot čiste kulture in so imele tipičen izgled vrste A. carbonarius, z izjemo barve kolonije (bela na gojišu CYA), smo identificirali kot A. carbonarius (slika 38). Ko smo te kolonije precepili na gojišče primerno za določitev toksinov (YES), smo ponovno pridobili netipični izgled (slika 39 a in b) (običajno je bil izgled na gojišču YES primerljiv z izgledom na gojišču CYA). Predvidevamo, da gre za kakšen poseben sev plesni vrste A. carbonarius.

Slika 35: Nenavaden apeks plesni rodu Aspergillus, 400x povečava


Slika 36: Izgled sporangija plesni rodu Mucor, 1000x povečava. Na sliki je opaziti tudi konidije, ki pripadajo plesnim rodu Aspergillus

Slika 37: Netipičen izgled plesni vrste A. niger oz. A. carbonarius, posledica večkratnega precepljanja z namenom pridobitve čiste kulture


Slika 38: Netipičen izgled plesni vrste A. carbonarius na gojišču CYA, 25 °C

Slika 39: Poseben izgled plesni vrste A. carbonarius (precepitev s plošč – Slika 38) na gojišču YES, 25 °C

a b


Identifikacija plesni: Identifikacijo plesni do nivoja vrste smo izvedli za izolate rodov Penicillium in Aspergillus. Pri ostalih rodovih ključi za identifikacijo vsebujejo premalo vrst, da bi vrsto lahko zanesljivo določili. Ključi za identifikacijo plesni rodov Penicillium in Aspergillus pa vsebujejo raznolik nabor vrst. Identifikacija določene vrste po ključu se pogosto razlikuje le v drobnih podrobnostih, ki so praviloma pod mikroskopom zelo težko določljive in odvisne od dobre priprave mikroskopskega preparata. Po standardni metodi priprave nativnega mikroskopskega preparata naj bi za boljšo prepoznavnost struktur uporabili modro barvilo. Izkazalo se je, da (posebno pri plesnih rodu Aspergillus) to barvilo pogosto zakrije strukture, ki ločijo eno vrsto od druge. Za pomemben pripomoček pri razlikovanju vrst med sabo se je izkazala lupa. Zelo uporabne bi bile tudi barvne fotografije kolonij (zračni in substratni micelij) ter slike pod lupo za opažanje posebnih značilnosti določenih vrst (izgled metul, eksudata, sklerocijev). Opis kolonije posamezne vrste vsebuje tudi barvo substratnega in zračnega micelija. Ker so barve v določenih primerih težko predstavljive, bi ob ključu bila zelo zaželena barvna lestvica.


5 RAZPRAVA Raziskavo smo izvedli, ker pri pregledu dosedanje literature nismo zasledili študij o raznovrstnosti populacije plesni, o velikosti njihove populacije, stopnji kontaminacije s plesnimi rodov Aspergillus oz. Penicillium ter o prisotnosti mikotoksinov OTA in AFB1, narejenih na slovenskem grozdju, moštu oziroma vinu. Poraba vina v Sloveniji znaša 45 L/prebivalca in je med največjimi glede na evropska (povprečje držav Italije, Francije in Španije je 35 L) oz. svetovna merila (povprečje držav Avstralija, Argentina, ZDA, Kitajska je 14,5 L/prebivalca) (Wine Institute, 2011). Skrb glede kontaminacije s plesnimi in posledično prisotnosti mikotoksinov ni pomembna zgolj pri vinu, temveč tudi na grozdju in grozdnem soku, še posebej odkar so glavni potrošniki otroci in odkar je poraba grozdnega soka večja kot poraba vina (Terra in sod., 2012). Skrb je izrazila tudi Evropska agencija za varnost hrane (EFSA), ki je podala oceno izpostavljenosti OTA, ki se giblje med 15 do 60 ng/kg telesne mase na teden in določila sprejemljiv tedenski vnos 120 ng/kg telesne mase (Uredba komisije ES 1881/2006; Uredba komisije EU 105/2010). Na podlagi podatkov o pojavnosti OTA v živilih in živilskih proizvodih ter njihovi porabi je bilo ugotovljeno, da je vino na drugem mestu, za žitaricami, glavni vir dnevnega vnosa OTA (13 % vnosa) (WHO, 2001; Jackson in AL Taher, 2008). Za razliko od vina pa grozdje, suho grozdje in mošt zaradi manjšega odstotka uživanja ne predstavljajo tako velikega vnosa OTA kot vino, kljub temu da so vsebosti OTA v suhem grozdju (50-70 µg/kg) večje od tistih, določenih v vinu (15,6 µg/L) (Miraglia in Brera, 2002). Največje vsebnosti OTA so bile določene v rdečih vinih (Jackson in Al Taher, 2008; Mateo in sod., 2007; Battilani in sod., 2008), kar je posledica postopka maceracije (stika mošta z jagodnimi kožicami) rdečih vin, ki pri belih vinih ne poteka (Jaskoson in Al Taher, 2008). Jagodna kožica, ki je za kontaminacijo s črnimi aspergili najbolj dovzetna v obdobju od zrelosti do trgatve, se v tem obdobju zmehča in postane bolj dovzetna za poškodbe. Delež sladkorja naraste, sadje z visokim deležem ogljikovih hidratov pa predstavlja odličen substrat za razrast plesni rodov Aspergillus in Penicillium ter proizvodnjo OTA (Hocking in sod., 2007; Jackson in Al Taher 2008; Amezqueta in sod., 2012; Chunmei in sod., 2013).

Dosedanje študije so pokazale, da so na grozdju, kot naravna mikroflora, vedno prisotne plesni rodov Alternaria, Aspergillus, Cladosporium in Penicillium (Serra in sod, 2005; Belli in sod., 2006; Aydogdu in Gucer, 2009). Pred raziskavo smo predvidevali, da bomo identificirali plesni rodov Alternaria, Asprgillus, Botrytis, Penicillium, Epicoccum, Cladosporium, Rhizopus. Hipotezo smo deloma potrdili, saj smo identificirali vse rodove, razen rodu Epicoccum. Na grozdju je bil najpogosteje identificiran rod Penicillium (58,6 %), s čimer smo potrdili dosedanje raziskave, ki navajajo, da pojavnost tako imenovanih plesni na polju, kamor spadajo rodovi Alternaria, Epicoccum, Fusarium, Stemphylium in Ulocladium, z zorenjem grozdnih jagod upada, naraščajo pa sporolirajoče plesni, kot so rodovi Aspergillus, Penicillium in Rhizopus (Serra in sod., 2005; Chunmei in sod., 2013). 4 % izolatov so zaradi neizrazitih tipičnih mikro- in makro-morfoloških znakov ostali neidentificirani. Slednjih je bilo največ na Dolenjskem, kjer predstavljajo kar 84 %.


Zanimivo je, da so bili skoraj vsi neidentificirani izolati določeni na grozdju, kasneje pa se v moštu oz. vinu ne pojavljajo več. Med fermentacijo (v moštu) smo najpogosteje izolirali plesni rodu Aspergillus z 71 %, po končani fermentaciji (v vinu) pa zopet plesni rodu Penicillium (100 %). Zanimiva je ugotovitev, da najpogosteje izolirana rodova, Penicillium oz. Aspergillus, prevladujeta le v enem okolišu, vendar pa je v tem okolišu povprečna koncentracija plesni višja kot v drugih okoliših (slike 6, 8 in 10). Najvišja povprečna koncentracija plesni rodu Penicillium je bila določena na grozdju v Štajerski Sloveniji (v drugih vinorodnih okoliših sta bila najpogosteje izolirana rodova Cladosporium in Botrytis) in v vinu (Bela Krajina). Izolate rodu Aspergillus smo najpogosteje določili v moštu v Beli Krajini (v drugih območjih smo najpogosteje izolirali rodova Botrytis in Alternaria). Iz tega lahko zaključimo, da obstajajo razlike v povprečni koncentraciji plesni med vinorodnimi okoliši tako na grozdju, v moštu kot v vinu ter da se sestava mikroflore v okoliših z določeno najvišjo povprečno koncentracijo plesni bistveno razlikuje od sestave mikroflore v ostalih okoliših (z izjemo pri vinu, kjer v vseh pokrajinah prevladuje le en rod plesni). Štajerska Slovenija in Bela Krajina torej izstopata po najvišji povprečni koncentraciji plesni, pri prvem vinorodnem okolišu določeni na grozdju, kjer v večjem deležu pripada rodu Penicillium, pri drugem pa v moštu, kjer skoraj vsi izolati pripadajo rodu Aspergillus.

Povprečna koncentracija plesni na grozdju je primerljivo s povprečno koncentracijo plesni v moštu. Povprečna koncentracija plesni v vinu predstavlja zanemarljiv delež, saj je 10000x nižja kot na grozdju oz. v moštu (slika 11). Populacija plesni je največja na grozdju in nato po dnevih fermentacije pričakovano upada. Po 14 dneh fermentacije je populacija plesni v moštu primerljiva s populacijo plesni v vinu (slika 16). S tem lahko potrdimo dosedanje študije, ki navajajo vinograd kot primarni vir okužbe (Bennett in Klich, 2003; Battilani in sod., 2008; Bhat in sod., 2010). Ob neprimernem skladiščenju oz. predelavi se populacija plesni lahko še poveča in je tako večja kot na primarni surovini - grozdju (Bennett in Klich, 2003; Battilani in sod., 2008). Veča se lahko vse do zadostne tvorbe alkohola, ki ima dokazano inhibitorno (zaviralno) delovanje na rast in razmnoževanje plesni (Hocking in sod., 2007; Battilani in sod., 2008; Jackson in Al Taher, 2008).

V vseh vinorodnih deželeh, razen v Štajerski Sloveniji, je bilo ugotovljeno, da je povprečna koncentracija plesni rodu Penicillium v moštu višja kot na grozdju. Najnižja je v vinu (slika 22). Tudi za plesni rodu Aspergillus velja, da je povprečna koncentracija plesni v moštu višja kot na grozdju v vseh vinorodnih okoliših (slika 23). Za visoke koncentracije plesni v moštu je več razlogov; eden izmed njih je gotovo ugoden medij za rast in razvoj plesni (jagodne kožice, prisotnost sladkorja) (Hocking in sod., 2007; Jackson in Al Taher, 2008, Chunmei in sod., 2013), verjetno pa vpliva tudi čistoča procesnega postopka. Nižje koncentracije plesni proti koncu fermentacije in v vinu so verjetno posledica naraščanja vsebnosti alkohola in prekinitve postopka maceracije (Hocking in sod., 2007; Battilani in sod., 2008; Jackson in Al Taher, 2008).


Poleg poškodovanih oz. nagnitih grozdnih jagod je za stopnjo kontaminacije in prisotnost toksinov bistvenega pomena tudi podnebje vinogradniškega področja in vremenske razmere vinorodnega letnika (Battilani in sod., 2006; Jackson in Al Taher, 2008). Najvišje vsebnosti OTA (>2 µg/L) so bile določene ob kombinaciji velikega števila poškodovanih jagod in višje povprečne temperature (nad 21 °C). Ugotovljeno je bilo tudi, da se optimalna temperatura in aw, pri kateri uspevajo plesnih vrst P. verrucosum, A. ohraceus, A. carbonarius in A. niger, praviloma razlikuje od optimalne temperature in aw kjer te iste plesni tvorijo toksin (Battilani in sod., 2008).

Določena so bila območja z najvišjim tveganjem OTA v Evropi na Pirenejskem polotoku, v južni Franciji, Grčiji in Turčiji (Battilani in sod., 2008). Dosedanje študije navajajo prisotnost plesni rodu Penicillium v hladnejših območjih in rodu Aspergillus (vrsti A. niger in A. carboarius) v območjih z mediteranskim oz. subtropskim (A. parasiticus) podnebjem (Battilani in sod, 2006; Jakson in Al Taher, 2008; Battilani in sod, 2008). Slovenija ima kljub svoji majhnosti klimatsko zelo različna območja. Zato smo predvidevali, da se bodo pokazale razlike med različnimi vinorodnimi okoliši – predvsem med Slovensko Istro s submediteranskim podnebjem in ostalimi območji s celinskim podnebjem. Izkazalo se je, da plesni rodu Penicillium na grozdju prevladujejo v Štajerski Sloveniji, medtem ko jih na Dolenjskem nismo izolirali. Najvišje povprečne koncentracije plesni v vinu smo določili v Beli krajini (slika 22). V slednji smo določili najvišje povprečne koncentracije plesni rodu Aspergillus na grozdju in v moštu. Plesni rodu Aspergillus v vinu nismo določili, prav tako jih nismo določili v vinorodnem okolišu Dolenjska (slika 23). Glede na jakost kontaminacije tako prevladujeta dve območji: Štajerska Slovenija (rod Penicillium na grozdju) in Bela Krajina (rod Aspergillus v moštu).

Prikazane so bile tudi določene razlike med različnimi sortami grozdja. Tako naj bi namizne sorte grozdja vsebovale bistveno večje vrednosti OTA kot vinske sorte, namenjene predelavi (Chunmei in sod., 2013). V raziskavi smo dokazali, da med grozdjem in moštom pri večini sort ne obstajajo bistvene razlike v populaciji plesni. Tako na grozdju kot v moštu z visokimi povprečnimi koncentracijami plesni izstopajo sorte modra frankinja, modri pinot, šentlovrenka in žametna črnina. Zanimiva je ugotovitev, da so to sorte celinskega dela. Pri vseh sortah iz Slovenske Istre je bila namreč določena 100x manjša povprečna koncentracija plesni (glede na »celinske sorte«) (slika 25). Nižja koncentracija plesni je najverjetneje posledica dobrega upravljanja vinogradov. Populacijo plesni v vinu, ki je bistveno manjša od populacije tako na grozdju kot v moštu, predstavljajo tri sorte (šentlovrenka, žametna črnina in cabernet sauvignon) (slika 25).

Opaziti je tudi razlike v prisotnosti plesni rodov Penicillium oz. Aspergillus med sortami. Na grozdju plesni rodu Penicillium prevladujejo pri sortah 'Modri pinot' in 'Žametna črnina' (sorti Štajerske Slovenije), niso pa prisotne pri sortah iz Slovenske Istre oz. so prisotne v zanemarljivih deležih. Tako na grozdju kot v moštu pri sortah modra frankinja in šentlovrenka, ki sta sorti iz Bele Krajine, prevladujejo plesni rodu Aspergillus (slika 25).


Če povzamemo rezultate, lahko zaključimo, da ima na prisotnost in stopnjo kontaminacije s plesnimi rodov Penicillium oz. Aspergillus vlogo geografska lokacija vinograda in klimatski vplivi na tem območju, kar v raziskavah navajajo tudi Battilani in sod. (2008). Predvidevamo, da na razlike med vzorci pomembno vpliva tudi upravljanje vinograda. Zmanjševanje prisotnosti aspergilov v vinogradu je mogoče doseči z minimizacijo mehanskih in okoljskih poškodb jagod, z odstranjevanjem poškodovanih oz. nagnitih jagod s trte oz. iz tal ter z uporabo fungicidnih pripravkov (Jackson in Al Taher, 2008). Po trgatvi na vsebnost OTA, predvsem pri suhem grozdju, pomembno vplivajo okoljski dejavniki (temperatura, relativna vlaga). Zelo pomembno je, da se proces sušenja izvede čim prej, produkt pa se lahko zapakira le ob primerni stopnji vlage in skladišči pod 15° C (Hocking in sod., 2007; Jackson in Al Taher, 2008; Amezqueta in sod., 2012). Znižanje pojavnosti črnih aspergilov na namiznem grozdju, grozdnem soku, vinu in suhem grozdnem sadju je mogoče doseči z žveplovim dioksidom (Hocking in sod., 2007). Uporaba določenih bakterij, kvasovk ali absorbentov, kot so aktivno oglje, tekoča želatina ali bentonit, sicer zmanjša vsebnost OTA v vinu (v povprečju za 40 %), vendar pogosto negativno vpliva na kakovost vina (Hocking in sod., 2007; Quintela in sod., 2013).

V raziskavi smo identificirali šest vrst plesni rodu Aspergillus in 24 vrst plesni rodu Penicillium. Med plesnimi rodu Aspergillus so prevladovali tako imenovani črni aspergili. Glede na izračunane povprečne koncentracije določene plesni v vzorcu smo med aspergili najpogosteje identificirali vrsti A. carbonarius in A. niger z 56,7 % oz. 39,6 % (slika 18). Tudi drugi avtorji (Serra in sod., 2005; Belli in sod., 2006; El Khoury in sod., 2006; Chunmei in sod., 2013) so najpogosteje identificirali ravno ti dve vrsti. Serra in sod., 2005 navajajo kot najpogosteje določene vrste rodu Penicillium vrste P. brevicompactum, P. glabrum in P. thomii. V naši raziskavi pa je z 77,4 % prevladovala vrsta P. glabrum (slika 20). Kar je posledica izredno visoke koncentracije plesni enega vzorca. Bolj smiseln prikaz razširjenosti plesni rodov Aspergillus in Penicillium dobimo, če rezultate prikažemo v obliki števila kontaminacij, pri izračunu koncentracij pa upoštevamo zgolj kontaminirane vzorce. Tako lahko ocenimo pogostnost pojavljanja (razširjenost) plesni in jakost kontaminacije. Na takšen način dobimo informacijo o pogostosti pojavljanja vrst rodu Aspergillus, med katerimi se na največjem številu sort grozdja pojavljata vrsti A. japonicus in A. parasiticus, šele nato sledita vrsti A. niger in A. carbonarius (slika 19). Pri plesnih rodu Penicillium sledi, da so najbolj razširjene vrste P. chrysogenum, P. janthinellum, P. griseofulvum in P. thomii (slika 21).

Ker so mikotoksini, sekundarni metaboliti gliv, kemijsko in temperaturno stabilne spojine, jih tako le s težavo odstranimo iz živil. Uživanje z mikotoksini onesnažene hrane pa privede do toksičnih odzivov, ki so odvisni od številnih dejavnikov, kot so toksičnost mikotoksinov, pogostost in čas trajanja izpostavljenosti, starost in prehranski status posameznika ter drugih (Peraica in sod., 1999). Med toksine, ki pomembno vplivajo na zdravje ljudi, CAST prišteva tudi OTA in AFB1 (Serra in sod., 2005). Ohratoksin A velja za imunosupresivnega (zavira delovanje imunskega sistema), potencialno teratogenega


(povzroča nepravilnosti v razvoju zarodka), potencialno kancerogenega (povzroča rakasta obolenja) (Bennett in Klich, 2003), ima pa tudi potencialno genotoksično (povzroča genetske poškodbe) in nefrotoksično delovanje (povzroča poškodbe ledvic) (Jackson in Al Taher, 2008). Aflatoksin B1 je dokazano kancerogen, poleg tega deluje tudi imunosupresivno, teratogeno in mutageno (povzroča spremembe genetskega materiala) (Richard, 2007; Barkai-Golan, 2008).

Izolirali smo štiri vrste plesni, ki glede na literaturo (Bennett in Klich, 2003; Bennett in Klich, 2003; Belajova in Rauova, 2007; Richard, 2007; Jackson in Al Taher, 2008; Barkai-Golan, 2008; Aydogdu in Gucer, 2009) v ugodnih razmerah lahko tvorijo OTA (A. carbonariusm, A. niger, A. ohraceus in P. verrucosum) in eno vrsto, ki prav tako v ugodnih razmerah lahko tvori AFB1 (A. parasiticus). Plesni vrste A. flavus, ki je prav tako aflatoksigena, nismo določili. Med identificiranimi izolati plesni vrste A. niger nismo našli ohratoksigenih. V nasprotju z dosedanjimi študijami, kjer so vsi oz. skoraj vsi vzorci A. carbonarius OTA-pozitivni (Romero in sod., 2005; Battilani in sod., 2008; Chunmei in sod., 2013), je bilo v naši raziskavi takšnih le 31,3 % (slika 27). Vzrok za tako majhen delež OTA-pozitivnih vzorcev vrste A. carbonarius v naši raziskavi bi morebiti lahko izhajal iz pomanjkljive identifikacije, saj je bila ta izvedena s klasičnimi preiskavami, pri katerih določamo prdvsem morfološke značilnosti izolatov. Razlika med plesnimi vrst A. niger in A. carbonarius je bila določena na podlagi velikosti eksudata, na podlagi drugih lastnosti je bila identifikacija neizvedljiva. Vzrok je lahko tudi v premajhni občutljivosti metode TLC in posledično slabšem vizualnem odčitavanju rezultatov. Plesni vrste A. parasiticus so bila aflatoksin B1-pozitivne v 35,3 % izolatov (slika 28), kar je primerljivo rezultatom iz objavljene literature (El Khoury in sod., 2008).

Nepričakovana je izolacija in identifikacija plesni vrst A. ohraceus in P. verrucosum, čeprav v zanemarljivih deležih. Vrsti sta prvotni tvorki ohratoksina A, a se kot del naravne mikroflore grozdja ne pojavljata (Cabanes in sod., 2002; Belli in sod., 2006). Izolirali smo tako plesni vrste A. ohraceus kot vrste P. verrucosum v treh vzorcih in vsi vzorci so bili OTA-pozitivni (slika 27). Glede na močno intenziteto florescirajoče črte predvidevamo, da bi bila vsebnost OTA, če bi jo preverjali s kvantitativnimi metodami, velika. S tem smo ovrgli hipotezo, da bomo OTA oz AFB1 določili le pri rodu Aspergillus.

Največ vzorcev je tvorilo OTA oz. AFB1 v prvih treh dneh fermentacije (slika 31). S tem smo potrdili hipotezo, da bomo največ OTA oz. AFB1 (glede na koncentracijo plesni) določili pri prvih vzorčenjih pred alkoholno fermentacijo. Prisotnost OTA in AFB1 na grozdju je primerljiva s pojavnostjo v vinu in je zanemarljivo majhna, vsi vzorci pa prihajajo iz Slovenske Istre. Prisotnost AFB1 v moštu smo določili le pri vzorcih iz Slovenske Istre in Bele Krajine (slika 30). OTA v moštu smo prav tako določili le iz teh dveh okolišev (slika 29). Če podrobneje pogledamo, kateri toksin prevladuje pri posamezni sorti, ugotovimo, da smo OTA najpogosteje določili pri sorti modra frankinja iz Bele Krajine, sledita sorti shiraz in cabernet sauvignon iz Slovenske Istre (slika 32). AFB1 smo


najpogosteje določili pri sorti shiraz iz Slovenske Istre (slika 33). Če povzamemo rezultate, lahko sklepamo, da so ugodne razmere za rast ohratoksigenih plesni hkrati tudi ugodni razmere za tvorbo OTA, saj je bila pojavnost plesni rodu Aspergillus in OTA največja v Beli Krajini. To pa ni nujno tudi res, saj velja, da razmere, ki prispevajo k ugodni rasti plesni, pogosto niso enake razmeram za tvorbo toksinov (Jackson in Al Taher, 2008). Glede na tvorbo AFB1, ki je bila zabeležena izključno v Slovenski Istri, lahko potrdimo navedbe, ki prikazujejo A. parasiticus kot vrsto, ki dobro uspeva in tvori toksine v subtropskih območjih (Jackson in Al Taher, 2008). Deloma smo potrdili tudi hipotezo, da bomo največje število izolatov, ki tvorijo OTA oz. AFB1 res določili v vinorodnem okolišu Slovenska Istra (skupno osem vzorcev). Hipoteza ni potrjena v celoti, saj glede na nijvišjo povprečno koncentracijo plesni, ki so tvorile toksin OTA oz. AFB1, prevladuje vinorodni okoliš Bela Krajina (sliki 29 in 30).


6 SKLEPI - Populacija plesni je bila največja na grozdju in je nato po dnevih fermentacije pričakovano upadala. Po 14 dneh fermentacije je bila povprečna koncentracija plesni v moštu primerljiva s povprečno koncentracijo plesni v vinu.

- V vzorcih grozdja, mošta in vina smo identificirali plesni rodov Penicillium, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Alternaria, Mucor, Fusarium, Acremonium in Rhizopus.

- Najpogosteje izolirane so bile plesni rodov Penicillium na grozdju (58,6 %) in v vinu (100 %) ter Aspergillus v moštu (71 %).

- Najvišja povprečna koncentracija plesni rodu Penicillium je bila določena na grozdju v Štajerski Sloveniji, v moštu in v vinu pa v Beli Krajini.

- Na grozdju ter v vinu so bile najpogosteje izolirane plesni rodov Penicillium (v 58,6 % oz. 100 % izolatov), medtem ko so v moštu prevladovale plesni rodu Aspergillus (71 % izolatov).

- Bistvenih razlik v populaciji plesni med grozdjem in moštom pri večini sort nismo zasledili. Tako na grozdju kot v moštu z visokimi povprečnimi koncentracijami izstopajo sorte modra frankinja, modri pinot, šentlovrenka in žametna črnina. Pri vseh sortah iz Slovenske Istre je bila določena veliko nižja povprečna koncentracija.

- V raziskavi smo identificirali šest vrst plesni rodu Aspergillus in 24 vrst plesni rodu Penicillium. Najbolj razširjene vrste so bile A. japonicus, A. parasiticus, A. niger in A. carbonarius ter P. chrysogenum, P. janthinellum, P. griseofulvum in P. thomii.

- Med sortami smo zasledili razlike v prisotnosti plesni rodu Penicillium oz. Aspergillus. Na grozdju plesni rodu Penicillium prevladujejo pri sortah 'Modri pinot' in 'Žametna črnina' (Štajerska Slovenija), na grozdju in v moštu pa pri sortah modra frankinja in šentlovrenka (Bela Krajina) prevladujejo plesni rodu Aspergillus.

- Izolirali smo štiri vrste plesni, ki v ugodnih razmerah lahko tvorijo OTA (A. carbonarius, A. niger, A. ohraceus in P. verrucosum) in eno vrsto, ki lahko tvori AFB1 (A. parasiticus).

- Noben izolat vrste A. niger ni tvotil OTA in 31,3 % izolatov, določenih kot plesni vrste A. carbonarius, je bilo OTA-pozitivnih. Izolati plesni vrste A. parasiticus so bili AFB1-pozitivni v 35,3 %. Plesni vrst A. ohraceus in P. verrucosum smo izolirali v majhnem št. vzorcev (A. ohraceus v 2 vzorcih, P. verrucosum v 1 vzorecu), vendar so bili prav vsi vzorci OTA-pozitivni.

- Najvišje povprečne koncentracije OTA- in AFB1-pozitivnih izolatov smo izolirali in identificirali iz vzorcev v prvih treh dneh fermentacije.


- AFB1- in OTA-pozitivne izolate smo določili med izolati iz Slovenske Istre in Bele Krajine. Prisotnost OTA-pozitivnih izolatov na grozdju je primerljiva s pojavnostjo izolatov v vinu (vsi vzorci prihajajo iz Slovenske Istre) in je glede na izolate iz mošta zanemarljivo majhna. AFB1-pozitivne izolate smo določili le v moštu.

- OTA-pozitivne izolate smo najpogosteje (glede na koncentracijo plesni) določili pri sorti modra frankinja iz Bele Krajine, sledita sorti shiraz in cabernet sauvignon iz Slovenske Istre, kjer smo najpogosteje določili tudi AFB1-pozitivne izolate in sicer pri sorti shiraz. Največ vzorcev, ki je vsebovalo OTA- oz. AFB1-pozitivne izolate, je prihajalo iz Slovenske Istre. Glede na najvišjo povprečno koncentracijo plesni, ki je tvorila toksin OTA oz. AFB1, pa prevladuje vinorodni okoliš Bela Krajina.


7 POVZETEK Prisotnost mikotoksinov, sekundarnih metabolitov plesni, ki v več pogledih škodljivo vplivajo na zdravje ljudi, predstavlja ne samo velik ekonomski, temveč tudi zdravstveni problem. To velja še posebej v območjih oz. pri določenih skupinah ljudi, ki v večjem deležu uživajo s toksini najbolj kontaminirana živila. Med slednje spada tudi vino. Poraba vina je v Sloveniji med najvišjimi glede na evropska oz. svetovna merila. Poleg vina, skrb glede kontaminacije s plesnimi in posledično prisotnosti mikotoksinov predstavljata tudi grozdje in grozdni sok, še posebej, ker so glavni potrošniki otroci in druge rizične skupine (dietna prehrana). Pri pregledu dosedanje literature nismo zasledili študij o prisotnosti mikotoksinov OTA in AFB1, opravljenih na slovenskem grozdju, moštu oziroma vinu.

V raziskavo smo vključili 12 vzorcev grozdja, ki pripadajo devetim različnim vinskim sortam iz štirih različnih vinorodnih okolišev v Sloveniji. Iz 12 vzorcev grozdja smo pripravili vzorce grozdnega soka oz. mošta in jih nato pustili, da so spontano fermentirali. Med alkoholno fermentacijo smo vzorčili mošt oz. mlado vino, prav tako smo vzorčili vino po zaključku fermentacije. Skupno smo tako obravnavali 204 vzorce.

Z opravljenimi mikrobiološkimi analizami smo v magistrski nalogi pridobili podatke o mikroflori glivnih vrst na grozdju in o velikosti in trendu gibanja populacije od grozdja,do mošta in vina. Pri potencialno toksinogenih vrstah smo z enostavno kvalitativno metodo določanja toksinov (TLC) ocenili razširjenost dveh (OTA in AFB1) z vidika zdravja najnevarnejših mikotoksinov v posameznih vzorcih. Tako smo dobili delni vpogled v pojavnost plesni in njihovih toksinov v slovenskih vinogradih.

Prikazali smo gibanje populacije plesni v postopku nastanka vina. Ta je bila največja na grozdju in v prvih dneh fermentacije, nato pa je s časom fermentacije upadala. Najmanjša je bila določena v vinu. Dobljeni rezultati so pokazali, da obstajajo tako razlike med vinorodnimi okoliši kot razlike med sortami, saj so bili določeni rodovi oz. vrste plesni razširjeni le v nekaterih vinorodnih okoliših in le pri nekaterih sortah. Podobno velja tudi za toksina OTA in AFB1. Predvidevali smo, da bomo OTA in AFB1 največkrat določili pri prvih vzorčenjih. Hipotezo smo potrdili, saj je največ vzorcev tvorilo OTA oz. AFB1 v prvih treh dneh fermentacije. Glede na dosedanje objave smo predvideli večji delež OTA-pozitivnih izolatov. Vzrok za majhen delež pripisujemo predvsem metodi identifikacije in določitve toksinov.

Zaključimo lahko, da bi bila uporaba sodobnejših metod in večjega števila vzorcev, kjer bi statistična obdelava prinesla smiselne rezultate, dobro izhodišče za nadaljnje raziskave o razširjenosti toksinov na slovenskem grozdju, moštu oz. vinu.


8 VIRI Amezqueta S., Galindo S.S., Arbizu M.M., Penas G.E., Cerain L.A., Guiraud J.P. 2012.

OTA-producing fungi in foodstuffs: A review. Food Control, 26: 259-268

Aydogdu H., Gucer Y. 2009. Microfungi and mycotoxins of grapes and grape products. Trakia Journal of Sciences, 7, 2: 211-214

Barkai-Golan R. 2008. Aspergillus mycotoxin. V: mycotoxins in fruits and vegetables. Barkai-Golan R., Paster N. (eds.). 1st ed. Amsterdam, Elsevier: 115-152

Battilani P., Magan N., Logrieco A. 2006. European research on ochratoxin A in grapes and wine. International Journal of Food Microbiology, 111, Suppl. 1: S2-S4

Battilani P., Barbano C., Logrieco A. 2008. Risk assessment and safety evaluation of mycotoxins in fruits. V: Mycotoxins in fruits and vegetables. Barkai-Golan R., Paster N. (eds.). 1st ed. Amsterdam, Elsevier: 1-26

Belajova E., Rauova D. 2007. Determination of ochratoxin A and its occurrence in wines of Slovakian retail. Journal of Food and Nutrition Research, 46, 2: 68-74

Belli N., Bau M., Marin S., Abarca M.L., Ramos A.J., Bragulat M.R. 2006. Mycobiota and ochratoxin A producing fungi from Spanich wine grapes. International Journal of Food Microbiology, 111, Suppl. 1: S40-S45

Bennett J.W., Klich M. 2003. Mycotoxins. Clinical Microbiology Reviews, 16, 3: 497-516

Bhat R., Rai R.V., Karim A.A. 2010. Mycotoxins in food and feed: Present status and future concerns. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 9, 1:57-81

Cabanes F.J., Accensi F., Bragulat M.R., Abarca M.L., Castella G., Minguez S., Pons A. 2002. What is the source of ochratoxin A in wine? International Journal of Food Microbiology, 79: 213-215

Cabanes F.J., Bragulat M.R., Castella G. 2013. Characterization of nonochratoxigenic strains of Aspergillus carbonarius from grapes. Food Microbiology, 36: 135-141

Chunmei J., Junling S., Qi'an H., Yanlin L. 2013. Occurrence of toxin-producing fungi in intact and rotten table and wine grapes and related influencing factors. Food Control, 31: 5-13

Clouvel P., Bonvarlet L., Martinez A., Lagouarde P., Dieng I., Martin P. 2008. Wine contamination by ochratoxin A in relation to vine environment. International Journal of Food Microbiology, 123: 74-80


EFSA. 2006. Opinion of the Scientific Panel on contaminants in the food chain on a request from the commission related to ochratoxin A in food. EFSA Journal, 4, 6: 365, doi:10.2903/j.efsa.2006.365: 56 str.

El Khoury A., Rizk T., Lteif R., Azouri H., Delia M.L., Lebrihi A. 2008. Fungal contamination and aflatoxin B1 and ochratoxin A in Lebanese wine-grapes and musts. Food and Chemical Toxicology, 46: 2244-2250

FAO. 2004. Worldwide regulations for mycotoxins in food and feed in 2003. Rome, Food and Agriculture Organization: 165 str.

FAOSTAT. 2014. World production (tonnes) of grapes in year 2012. Rome, Food and Agriculture Organization Statistics Division: 1 str.

http://faostat.fao.org/site/567/DesktopDefault.aspx?PageID=567#ancor (avgust 2014)

Fleet G.H. 1999. Microorganisms in food ecosystems. International Journal od Food Microbiology, 50: 101-117

Hocking A.D., Leong S.L., Kazi B.A., Emmett R.W., Scott E.S. 2007. Fungi and mycotoxins in vineyards and grape products. International Journal of Food Microbiology, 119: 84-88

Hussein H.S., Brasel J.M. 2001. Toxicity, metabolism and impact of mycotoxins on humans and animals. Toxicology, 167, 2: 101-134

ISO 4833. Microbiology – general guidance for the enumeration of micro-organisms – Colony count technique at 30 degrees C. 1991: 4 str.

ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules for microbiological examinations. 1996: 43 str.

Jackson L.S., Al Taher F. 2008. Factors affecting mycotoxin production in fruits. V: Mycotoxins in fruits and vegetables. Barkai-Golan R., Paster N. (eds.). 1st ed. Amsterdam, Elsevier: 75-104

Klich M.A. 2002. Identification of common Aspergillus species. Washington, ASM Press: 116 str.

Logrieco A., Bottalico A., Mule G., Moretti A., Perrone G. 2003. Epidemiology of toxigenic fungi and their associated mycotocins for some Mediterranean crops. European Journal of Plant Patology, 109, 7: 645-667

Mateo R., Medina A., Mateo E.M., Mateo F., Jimenez M. 2007. An overview of ochratoxin A in beer and wine. International Journal of Food Microbiology, 119: 79-83


Miraglia M., Brera C. 2002. Assessment of dietary intake of ochratoxin A by the population of EU Member States. Rome, Instituto Superiore di Sanita: 153 str.

Peraica M., Radić B., Lucić A., Pavlović M. 1999. Toxic effects of mycotoxins in humans. Bulletin of the World Health Oragnization, 77, 9: 754-766

Pitt J.I., Hocking A.D. 1985. Fungi and food spoilage. Sydney, Academic Press Australia: 413 str.

Pitt J.I. 1991. A laboratory guide to common Penicillium species. 2nd ed. North Ryde, CSIRO Food Research Laboratory: 187 str.

Pitt J.I. 2000. Toxigenic fungi and mycotoxins. British Medical Bulletin, 56, 1: 184-192

Quintela S., Villaran C., Armentia L.I., Elejalde E. 2013. Ochratoxin A removal in wine: A review. Food Control, 30: 439-445

Richard J.L. 2007. Some major mycotoxins and their mycotoxicoses – an overview. International Journal of Food Microbiology, 119: 3-10

Romero S.M., Comerio R.M., Larumbe G., Ritieni A., Vaamonde G., Pinto V.F. 2005. Toxigenic fungi isolated from dried vine fruits in Argentina. International Journal of Food Microbiology, 104: 43-49

Samson R.A, Hoekstra E.S., Frisvad J.C., Filtenborg O. 2000. Introduction to food- and airborne fungi. 6th ed. Utrecht, Centraalbureau voor Schimmelcultures: 389 str.

Serra R., Braga A., Venancio A. 2005. Mycotoxin-producing and other fungi isolated from grapes for wine production, with particular emphasis on ochratoxin A. Research in Microbiology, 156: 515-521

Shundo L., Almeida A.P., Alaburda J., Ruvieri V., Navas S.A., Lamardo L.C.A., Sabino M. 2006. Ochratoxin A in wines and grape juices commercialized in the city of Sao Paulo, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, 37: 533-537

Terra M.F., Prado G., Pereira G.E., Emante H.J., Batista L.R. 2012. Detection of ochratoxin A in tropical wine and grape juice from Brazil. Journal of the Science of Food and Agriculture, 94, 4: 890-894

Uredba komisije (ES) št. 1881/2006 z dne 19. decembra 2006 o določitvi mejnih vrednosti nekaterih onesnaževal v živilih. 2006. Uradni list Evropske unije, 49, L364: 5-24

Uredba komisije (EU) št. 105/2010 z dne 5. februarja 2010 o spremembah Uredbe Komisije (ES) št. 1881/2006 o določitvi mejnih vrednosti nekaterih onesnaževal v živilih glede ohratoksina A. 2010. Uradni list Evropske unije, 53, L35: 7-8


Uredba komisije (EU) št. 165/2010 z dne 26. februarja 2010 o spremembah Uredbe Komisije (ES) št. 1881/2006 o določitvi mejnih vrednosti nekaterih onesnaževal v živilih glede aflatoksinov. 2010. Uradni list Evropske unije, 53, L50: 8-12

USDA. 2014. Fresh table grapes domestic consumption by country in MT in year 2012. Washington, USDA: 1 str.

http://www.indexmundi.com/agriculture/?commodity=grapes&graph=fresh-domestic-consumption (marec 2014)

Wine Institute. 2011. Per capita wine consumption by country. San Francisco, Trade Data

and Analysis, Wine Institute: 53-57 http://www.wineinstitute.org/files/World_Per_Capita_Consumption_by_Country_2011.pdf

(marec 2014)

WHO. 2001. Safety evaluation of certain mycotoxins in food. Fifty-sixth meeting of the joint FAO/WHO Expert Committee on food additives (JECFA). Geneva, World Health Organization: 701 str.

http://services.leatherheadfood.com/eman/FactSheet.aspx?ID=49 (julij 2014) Zimmerli B., Dick R. 1996. Ochratoxin A in table wine and grape-juice: occurrence and

risk assessment. Food Additives and Contaminants, 13, 6: 665-668

ZAHVALA

Hvala mentorici prof. dr. Barbari Jeršek za izvrstno izbrano tematiko, za pomoč, nasvete in strokoven pregled magistrskega dela. Hvala tudi za potrpežljivost in razumevanje tekom nastajanja naloge.

Hvala somentorici prof. dr. Tatjani Košmerl za stokovno pomoč in temeljit pregled naloge, ter za vse nasvete, da je naloga dobila pravo podobo.

Zahvalila bi se tudi recenzentki prof. dr. Poloni Jamnik za strokoven in natančen pregled magistrskega dela.

Za pregled virov in navajanja literature se zahvaljujem univ. dipl. inž. Lini Burkan Makivić.

Hvala Saši in Petri za vso nesebično pomoč in marsikateri strokovni in prijateljski nasvet.

Zahvala gre tudi Jasni, Špeli in Mitotu za lektoriranje naloge.

***

Posebna zahvala gre mami in očetu, ki sta mi študij omogočila in me vseskozi podpirala. Jasna in Mojca hvala tudi vama!

Najpomembnejša zahvala gre mojima najdražjima, možu Martinu in hčerki Sari. Martin hvala za vso podporo, nasvete in temeljit pregled naloge. Hvala ti za potrpežljivost, za razumevanje ter pomoč. Martin in Sara hvala, da sta moja sončka.

Zahvaljujem se tudi vsem prijateljem in sošolcem, ki so mi popestrili dneve v času študija ter vsem ostalim neimenovanim, ki ste mi v tem času stali ob strani.

du2 strojnik lidija - University of Ljubljana · 2015. 12. 17. · Strojnik L. Raznolikost plesni...

Documents

Transcript of du2 strojnik lidija - University of Ljubljana · 2015. 12. 17. · Strojnik L. Raznolikost plesni...