1

DR. OKTAY ARDA

HistolojiÇalışma Metotları

PROF. DR. OKTAY ARDAİ.Ü. CERRAHPAŞA TIP FAKÜLTESİ

HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

2

DR. OKTAY ARDA

Histoloji

● Yunanca●Histo

• Ağ veya Doku

● Logos●Çalışma

● Dokuların Çalışılması●Hücreler●Hücreler dışı Ortam

● MATRİKS

3

DR. OKTAY ARDA

Neleri İçerir?

● Eğer Gözün Görme Sınırı İçinde İse

● Anatomi●Sınır = 0.1 mm

(100 μm)

4

DR. OKTAY ARDA

● Eğer Bir BüyüteçAracılığı ile İse● Mikroskopik Anatomi

Neleri İçerir?

5

DR. OKTAY ARDA

Yapı ve Fonksiyon

● Yapının İncelenmesi● Fonksiyonun

Anlaşılmasında● Fonksiyonun

Bilinmesi● Yapının Tahmin

Edilebilmesinde

6

DR. OKTAY ARDA

Anormali Anlamak

● Normalin Bilinmesi Gerekir● Yapı● Fonksiyon

● Böylece Patoloji Anlaşılabilir● Anormal:

●Yapı●Fonksiyon

7

DR. OKTAY ARDA

İki Mühim Metodik Düşünce

● Limitler● Uygun Seçim

●Hangi Mikroskop?●Hangi Mikro-teknik?

8

DR. OKTAY ARDA

Histolojinin Gelişebilmesi

● Şu Gelişimlere Bağlıdır:● Mikroskoplar● Kimya● Fizyoloji● İmmünoloji● Patoloji

9

DR. OKTAY ARDA

Bilim Sahalarının Etkileşimi

● Histo-kimya● Histo-fizlyoloji● İmmüno-sito-kimya● Histo-patoloji

10

DR. OKTAY ARDA

Araçlar ve Metodlar

● Ölçü Üniteleri● Doku Hazırlıkları● Mikroskopi● Histokimya● Doku Kesitlerinin Yorumu

11

DR. OKTAY ARDA

Araçlar ve Metodlar

● Radioautografi● Canlı Doku ve Hücrelerin İncelenmesi● In Vitro● Saf Hücre Kültürleri● Hücre Fonksiyonu

12

DR. OKTAY ARDA

Ölçü Üniteleri

● Micrometre●μm● 0.001 mm● 0.000 001 m ( 10-6 m )

● Nanometre● nm● 0.001 μm● 0.000 000 001 m ( 10-9 m )

13

DR. OKTAY ARDA

Dokunun Hazırlanması

● İnce Doku Örnekleri● Işık Geçirgenliği

● İnce ● Saydam● Kesit

14

DR. OKTAY ARDA

Dokunun Hazırlanması

● Çok İnce Örnek● Kesit Alma Yok

●Doku Tabakaları●Saydam Membranlar

● Işığı Geçiren● Mezanterler● Kurbağa Larva Kuyruğu● Hamster in Yanak Poşu Duvarı

15

DR. OKTAY ARDA

Dokunun Hazırlanması

● Çok İnce Örnek● İncelenebilinir

●Uzun Sürede●Değişen Ortamlarda●Fizyolojik●Deneysel

16

DR. OKTAY ARDA

Dokunun Hazırlanması

● Kalıcı Örnekler● Doku Örnekleri

17

DR. OKTAY ARDA

Dokunun Tespiti

● Otolizi Önlemek● Doku Sindirimi

●Enzimler●Bakteri

18

DR. OKTAY ARDA

Tespit

● Dokuyu Koruyabilmek İçin Kullanılan Kimyasal Maddeler

● Kimyasal Yöntem● ? (Henüz Çok İyi Anlaşılamamıştır)● Komplike

19

DR. OKTAY ARDA

Rutin IM İçin En İyi Tespit Eriyiği

● İzotonik Solüsyon da Tamponlanmış 4% Formol aldehit

20

DR. OKTAY ARDA

De-kalsifiye EdilmemişKemik ve Diş

İçin En İyi Tespit Eriyiği

● 70% ALKOL

21

DR. OKTAY ARDA

Popüler Fiksatifler

● Formol aldehit● Glutar aldehit

● Proteinlerle Reaksiyona Girer (Amine Grupları ile (Nh2))

● Proteinler Arasıda Çapraz Bağlar Kurabilir

22

DR. OKTAY ARDA

Fiksatifler ve Yüksek Rözülüsyon

● Çift Fiksasyon Yöntemi (EM) UltrasütrüktürüKoruyabilmek İçin● Tamponlanmış Glutaraldehit● Tamponlanmış Osmium Tetroxit

● Lipid ve Proteinleri Korur● Lipid ve Proteinleri Boyar

23

DR. OKTAY ARDA

Dehidratasyon (Suyun Giderilmesi)

● Gömmek İçin Gerekli● Suyun Giderilmesi

● Yükselen Serilerde Etanol ve Su● 70% 100%

24

DR. OKTAY ARDA

Impregnasyon (Şeffaflaştırma)

● Etanol ün Yerini Alma● Gömme Ortamı İle Karışabilme

● Xylene, Parafine Gömme●Doku, Işığı Geçirir Hale Gelir

(Şeffaflaşır)

25

DR. OKTAY ARDA

Gömme

● Kesit Alma İçin Gerekli● İnce Kesitlerin Alınabilmesi● Yumuşak Dokunun Sert Hale

Getirilmesi● Gömme Ortamları

● Parafin (IM Rutin)● Plastik Rezinler (IM & EM)

● Büzüşmeyi Engeller

● Boşlukları Doldurur

26

DR. OKTAY ARDA

Parafine Gömme

● Etüvde● Erimiş Parafin

● 58-60oC● Isı

● Şeffaflaştıran Maddeyi Buharlaştırır

● İnfiltrasyon● Kalıplara gömme

27

DR. OKTAY ARDA

Mikrotomlar

● Kesit Alma● Bıçaklar

●Çelik●Elmas●Cam

● Kesit Kalınlığı(1-10 μm)

28

DR. OKTAY ARDA

Dondurma Mikrotomları

● Lipidlerin Kaybolması● Xylene

● Lipid KaybınıEngelleme● Doku Düşük Isılarda

Sertlaştirilir● Gerekli Sertlik Elde

Edilir● Kesit Alınır

29

DR. OKTAY ARDA

Dondurma Mikrotomları

● Kısa Sürede Kesit Alınabilir● Gömme İşlemi Yoktur● Parçaların Süratle İncelenebilmesi Sağlanır● Cerrrahi Müdahaleler

Sırasında Teşhise Gitme

30

DR. OKTAY ARDA

Dondurma Mikrotomları

● Histokimyasal Çalışmalarda● Çok Hassas Enzimler● Küçük Moleküller● Pek Çok Enzim Dondurma İle

Etkisiz Hale Gelmez

31

DR. OKTAY ARDA

Dokunun Hazırlanması

Kalıcı Hazırlık● Mikroskop Altında İnceleme

32

DR. OKTAY ARDA

Boyalar

● Seçici Olarak Doku KısımlarınıBoyarlar● Asid Bileşenler● Bazik Bileşenler

● Doku Bileşenleri Boyanır● Bazik Boyalar İle (Bazofilik)● Asid Boyolar İle (Asidofilik)

33

DR. OKTAY ARDA

Basik Boyalara Örnekler:

● Toluidine Blue● Methylene Blue● Hematoxylin

● Dokunun Basokilik KısımlarınıBoyar

● Nucleoproteinleri● Glycosaminoglykanları● Asid Glikoproteinleri

34

DR. OKTAY ARDA

Asid Boyalara Örnekler:

● Orange G● Eosin● Asid Fuksin

● Dokunun Asidofilik KısımlarınıBoyar●Mitokondrileri●Sekretuar Granülleri●Kollajen

35

DR. OKTAY ARDA

Hematoxylin ve Eosin (H&E)● En sık Kullanılan

Boyalar● Hematoxylin Maviye

Boyar● Nüveyi ● Sitoplazmanın RNA -

zengin Kısımlarını● Eosin Pembe - Kırmızı

● Sitoplazma Kırmızı● Kollajen Pembe

36

DR. OKTAY ARDA

Metaller ile Impregnasyon

● Gümüş● Altın

37

DR. OKTAY ARDA

İdeal Doku Hazırlığı

● Uygun Kimyasal Maddeler● Lam Üzerindeki ince Kesitler

● Orjinal Hallerini Korumalı:● Morfolojisini● Moleküler İçeriğini

38

DR. OKTAY ARDA

Artefakt lar

● Orijinali Koruma:● Morfoloji● Moleküler Muhteviyat

39

DR. OKTAY ARDA

Dokunun Çok Şüratli Tespiti

● Morfolojinin Korunması● Perfüzyon

40

DR. OKTAY ARDA

Surfaktant’ın Morfolojik Demonstrasyonu

● Fiksasyon● Vaskülar Perfüzyon

● Skop● Elektron Mikroskop

41

DR. OKTAY ARDA

IM● Doku Yapıtaşları İle

Fotonların Etkileşeme● Im● Faz Kontrast Mikroskobi● Polorize Mikroskobi● Konfokal Mikroskobi● Floresans Mikroskobi

42

DR. OKTAY ARDA

Işik Mikroskobu Kısımları

● Mekanik● Optik

43

DR. OKTAY ARDA

IM Optik Kısımları

● Kondansatör● Işığı Toplar Ve Odaklar●Koni Şeklinde Bir Işık

Kaynağını Meydana Getirir● İncelenecek Parçayı Aydınlatır

44

DR. OKTAY ARDA

IM Optik Kısımları

● Objektif●Büyütür● Işığın İzini

Odaklar

45

DR. OKTAY ARDA

IM Optik Kısımları

● Oküler● İmajı Dahada Büyütür● İmajı Odaklar

● İzleyicinin Retinasına● Fotoğraf Plakasına

46

DR. OKTAY ARDA

Rezülüsyon

● Birbirinden ayrı olarak algılanabilen İki Partikül Arasıdaki En Küçük Mesafe

47

DR. OKTAY ARDA

Mikroskobun Çözüm Gücü

● Elde Edilebilen Kritik Faktörler● Temiz● Detaylı

●Mikroskop Tan Elde Edilebilen

48

DR. OKTAY ARDA

IM Maksimum Çözüm Gücü

● ~0.1 μm● Büyütmelerde İyi Görünüm Verir

● X 1000-1500● Rözülüsyon

● =< 0.1 μm

49

DR. OKTAY ARDA

Büyütme ve Rözülüsyon

● Cözüm Gücü Sınırlıdır● Işığın Dalgaboyu ile

50

DR. OKTAY ARDA

Lütfen Hangi !

● Biliniz● Mikroskobu Kullanacağınızı● Hangi Mikrotekniği

51

DR. OKTAY ARDA

Observasyon ve Enterperatasyon

● Gross Anatomi● 3 Boyutlu Yapılar

● Histoloji● Parçadan Alınan Kesitler

● 2 Boyutlu● Seri Kesitlerden Nihayi

Sonuca Gidilebilme