T.C.

SAĞLIK BAKANLIĞI

İSTANBUL OKMEYDANI EĞİTİM ve ARAŞTIRMA HASTANESİ

KULAK BURUN BOĞAZ KLİNİĞİ

KLİNİK ŞEFİ: DOÇ. DR. İLHAN TOPALOĞLU

ÇEVRESEL SİGARA DUMANININ

VOKAL KORDLAR ÜZERİNE ETKİLERİNİN

SIÇANLARDA HİSTOPATOLOJİK VE İMMUNOHİSTOKİMYASAL

YÖNTEMLE ARAŞTIRILMASI

(DENEYSEL ÇALIŞMA)

Dr. MAHMUT BABALIK

(Uzmanlık Tezi)

İSTANBUL - 2007

1

ÖNSÖZ

Uzmanlık eğitimim süresince, bilgi ve tecrübelerinden her zaman yararlandığım, yakın

ilgi ve samimiyetle bana her konuda yol gösteren klinik şefimiz, sayın hocamız Doç. Dr. İlhan

Topaloğlu’ na en içten teşekkürlerimi sunarım.

Hastanemiz Başhekimi Sayın Dr. M. Hayri Özgüzel’ e eğitime olan katkılarından

dolayı teşekkür ederim.

Asistanlığımın son iki yılında birlikte çalışmaktan mutluluk duyduğum, desteklerini

benden esirgemeyen, önerilerinden faydalandığım, deneyimlerini paylaşmaktan çekinmeyen

şef yardımcımız, Sayın Op. Dr. M. Önder Doğan’a saygılarımı sunarım.

Asistanlığımı birlikte geçirme fırsatı bulduğum, uyum içinde çalıştığım, bana destek

olan değerli uzmanlarım Op. Dr. Levent Eker’e, Op. Dr. Mustafa Kuzdere’ye, Op. Dr. Tamer

Haliloğlu’na, Op. Dr. Güven Yıldırım’a, Op. Dr. Yalçın Varnalı’ya, Op. Dr. Şenel Beysel’e,

Op. Dr. Bennur Çetindağ’a, Op. Dr. Ayşe Hatipoğlu’na ve başasistanımız Op. Dr. Güler

Berkiten’e teşekkür ederim.

Birlikte asistan olarak çalıştığım değerli arkadaşlarım, Op. Dr. Hüseyin Kadehçi’ye,

Op. Dr. Bülent Karapınar’a, Op. Dr. Belgin Keleş Tutar’a, Op. Dr.Halil Akgün’e, Op. Dr. A.

Onur Göksel’e, Dr. Şenol Baş’a, Dr. Hasan Yılmaz’a, Dr. Yavuz Atar’a, Dr. Bünyamin

Turhan’a, Dr. Enise Tekin’e, Dr. Perihan Taşkale’ye, Dr. Serhat Yaslıkaya’ya, Dr. Burcu

Meşe’ye, Dr. Ziya Saltürk’e, Dr. Muhlis Bal’a, Dr. M. Vefa Kılıç’a, Dr. Emrah Çiçek’e

teşekkürlerimi sunarım.

Tez çalışmam esnasında yardımlarını esirgemeyen İstanbul Üniversitesi İstanbul Tıp

Fakültesi Farmakoloji Ana Bilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. Lütfiye Eroğlu ve Uzman

Eczacı Yeşim Karamürsel’e teşekkürlerimi sunarım.

Deneysel çalışmamın histopatolojik incelemesinde yardımlarını esirgemeyen

Okmeydanı Eğitim ve Araştırma Hastanesi Patoloji Klinik şefi Uz. Dr. Deniz Özcan ve

Asistan Doktor Filiz Filiz’e teşekkürlerimi sunarım.

Uyum içinde çalıştığım, kliniğimiz ve ameliyathanemiz hemşirelerine ve tüm personel

ve sekreter arkadaşlara ayrıca teşekkür ederim.

Eğitimim süresince beni destekleyen, değerli aileme ve her konuda olduğu gibi ihtisas

süresince de desteğini esirgemeyen sevgili eşim Dr. Mesiha Babalık’a teşekkürlerimi sunarım.

Dr. Mahmut Babalık

2

RESİM DİZİNİ

Resim 1: C. F. Palmer’ ın duman makinesi

Resim 2: Çalışmada kullanılan pleksiglastan yapılmış kabin

Resim 3: Sigara dumanına maruz bırakılan deney grubu sıçanlar

Resim 4: Normal sıçan larenksinin glottis bölgesinin ışık mikroskobik görüntüsü

Resim 5: Vokal kord serbest kenarındaki az tabakalı kolumnar epitel

Resim 6: Aritenoid kıkırdak medialindeki vokal kord orta kısmında çok katlı yassı epitel

Resim 7: Çevresel sigara dumanına 45 gün maruz bırakılan 1. Grup sıçanların vokal kord orta

kısmında gözlenen keratinize metaplazi

Resim 8: Çevresel sigara dumanına 45 gün maruz bırakılan 1. Grup sıçanların vokal kord orta

kısımlarında gözlenen keratinize metaplazi

Resim 9: Çevresel sigara dumanına 90 gün maruz bırakılan 2. Grup sıçanların vokal kord orta

kısımlarında gözlenen keratinize metaplazi ve parakeratoz

Resim 10: Çevresel sigara dumanına 90 gün maruz bırakılan 2. Grup sıçanların vokal kord orta

kısımlarında gözlenen hiperplazi

Resim 11: 1. Grup deney hayvanları vokal kord orta bölümünde bazal tabakadan yukarıya doğru artan

Ki-67 aktivitesi

Resim 12: 2. Grup deney hayvanları vokal kord orta bölümünde bazal tabakadan yukarıya doğru artan

Ki-67 aktivitesi

TABLO DİZİNİ

Tablo 1: Sigara dumanında bulunan bazı gaz ve partiküler faz komponentleri

Tablo 2: Çalışmada kullanılan sıçan grupları

Tablo 3: 1. Grup kontrol hayvanlarındaki kronik mononükleer hücre infiltrasyonu derecesi

Tablo 4: 2. Grup kontrol hayvanlarındaki kronik mononükleer hücre infiltrasyonu derecesi

Tablo 5: 1. Grup deney hayvanlarındaki kronik mononükleer hücre infiltrasyonu derecesi

Tablo 6: 2. Grup deney hayvanlarındaki kronik mononükleer hücre infiltrasyonu derecesi

Tablo 7: 1. ve 2. grup deney grubu hayvanların Ki-67 ekspresyon oranları

ŞEKİL DİZİNİ

Şekil 1: Yalancı çok katlı kolumnar epitel

Şekil 2: Çok katlı yassı epitel

Şekil 3: Larenksin mikroskopik anatomisinin görüntüsü

Şekil 4: Larenks kıkırdakları ve eklemleri

Şekil 5-6: Larenks kaslarının ön-yan ve arka-yandan görünümü

Şekil 7: Larenks boşlukları ve bölümleri

3

İÇİNDEKİLER

GİRİŞ ..............................................................................4

GENEL BİLGİLER ..............................................................................6

MATERYAL VE METOD .............................................................................29

BULGULAR .............................................................................33

TARTIŞMA .............................................................................40

SONUÇ .............................................................................46

ÖZET .............................................................................47

KAYNAKLAR .............................................................................49

4

GİRİŞ

Sigara içimi dünya genelinde en yaygın toplumsal alışkanlıklardan biridir.48 İçerdiği

4000 den fazla zararlı madde ile insan sağlığında ciddi bozulmalara yol açar. Sigara birçok

hastalık için de ciddi risk faktörüdür.

Tütün ürünlerinin yanan uçlarından ve bunları tüketen kişilerin solunum havalarından

çıkardıkları dumana çevresel sigara dumanı denir. Yanan bir sigara iki şekilde duman

oluşturur, birincisi sigara içen kişinin üflediği sigara dumanı ki buna ana akım dumanı (main

stream smoke-ana akım dumanı), ikincisi ise sigaranın yanması sonucu oluşan dumandır buna

ise yan akım dumanı (side-stream smoke-yan akım dumanı) denir. Çevresel sigara dumanı;

ana akım dumanı ve yan akım dumanı karışımı ile oluşmaktadır.60

Sigaranın yanması sonucunda 4000 tane kimyasal bileşik oluşmaktadır ve bunların

içinde en az 40 tanesinin (ör. 4-aminobiphenyl, 2-naphthylamine, benzene, nikel, polisiklik

aromatik hidrokarbonlar) insanlar için karsinojen olduğu bilinmektedir.60 Yan akım dumanı

oluşurken yanma ısısı daha düşük olduğu için yan akım dumanı'nda ana akım dumanı'na göre

çok daha fazla kimyasal madde mevcuttur, örneğin hayvanlar için karsinojen olduğu

gösterilmiş olan N-nitrosodimethylamine yan akım dumanında ana akım dumanına göre 20-

100 kat daha fazla bulunmaktadır.3 Yapılan çalışmalar her bir sigara içiminde etkilenilen

dumanda yan akım dumanı'nın ana akım dumanı'na göre daha tehlikeli olduğunu

göstermektedir.7 Ana akım dumanı ve yan akım dumanı nikotin bileşikleri de farklıdır. Ana

akım dumanı'nda nikotin partikül fazındayken, çevresel sigara dumanı'nda sıvı faza geçmiştir.

Diğer bir önemli fark ise çevresel sigara dumanı'nda partiküllerin boyutunun (0.01-1.0 µm)

ana akım dumanına (0.1-1.0 µm) göre daha küçük olmasıdır.60 Çevresel Sigara Dumanı'ndan

etkilenimi sigara içicilerin sayısı, içilen sigara sayısı, kapalı ortamın büyüklüğü ve

havalandırılması ve etkilenimin süresi belirlemektedir.34

Pasif içicilik, sigara içenlerin nefes verirken çıkardığı “ana akım” ve sigaranın

yanarken çıkardığı “yan akım”dan dolayı etkilenerek, sigara kullanmadıkları halde (ya da

kullanıyorlarsa bile istemedikleri zamanlarda da sigara dumanına maruz kalarak sigara

kullananlarla aynı hava ortamını solumak suretiyle bireysel olarak sigara içiyormuş gibi

etkilenme durumudur.

IUAC (Internationale Union Against Cancer)’ e göre larenks kanseri vakalarının

% 95’i sigara ile ilişkilidir ve bu oran alkol alımı ile artmaktadır. Çevresel sigara dumanı,

sigara içenler kadar olmasa da daha az oranda larenks kanserinin beklenen sebebi olabilir.9

5

Ki-67 ise çoğalan hücrelerde görülen bir çekirdek proteinidir. Bu yapı çoğalan bütün

hücrelerde izlenmiş ve araştırılan hücre populasyonunun büyüyen bölümünü araştırmada

kullanılan önemli bir marker olmuştur.11 Hücre proliferasyonunun morfolojik özelliklerini iyi

bir şekilde gösteren protein olup, mitotik index ve tümör grade’lemesinde sıklıkla kullanılır.47

Çevresel sigara dumanının deney hayvanları üzerindeki etkileri çeşitli hayvan

modellerinde geliştirilmiştir.

Biz bu çalışmamızda çevresel sigara dumanının vokal kordlar üzerine etkilerini

sıçanlarda histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemle araştırmayı amaçladık.

6

GENEL BİLGİLER

SİGARA

Sigaranın içerdiği zararlı kimyasal maddeler: Sigara “Nicotina Tabacum” denilen

tütün bitkisinin özel bir şekilde kurutulmuş yapraklarından elde edilir.

Sigara ve dumanında 4000’den fazla kimyasal madde bulunmaktadır. Bunlardan

43’ünün karsinojen olduğu bilinmektedir. Sigara dumanı gaz ve partiküler faz olarak iki fazda

incelenir. Bu fazların içerdiği kimyasal maddelerden bazıları Tablo- 1 de gösterilmiştir.13

Gaz Faz Partiküler Faz

Karbon Monoxide Partiküler matter

Karbon Dioxide Nicotine

Formaldehyde Phenol

Acrolein Catechol

Acetone Aniline

Pyridine 2-toluidine

3-vinylpyridine 2-naphthylamine

Hydrogen cyanide Benz(a)anthracene

Nitrogen oxides Benzo(a)pyrene

Ammonia Qunoline

N-nitrosodimethylamine N-nitrosonornicotine

N-nitrosopyrolidine N-nitrosodiethanolamine

Nickel

Polonium- 210

Tablo-1: Sigara dumanında bulunan bazı gaz ve partiküler faz komponentleri

Serbest radikaller ve nitrik oksid gaz faz içeriğinde yüksek konsantrasyonda bulunur.

Gaz fazdaki radikaller kısa ömürlüdür. Bu fazdaki nitrik oksid oksidasyonla nitrojendiokside

dönüşür. Nitrojendioksid organik yapılara karsı daha reaktiftir. Partiküler faz radikalleri suda

eriyebilir ve oldukça bol miktarda nikotin ve nitrosamin içerir. Partiküler fazdaki bazı

radikaller DNA’yı etkileyebilmektedir. Bu radikaller aracılığı ile dioksijenin redüksiyonu ile

süperoksit (O-) ve hidrojen peroksit (H2O2) oluşur. Bu moleküllerin her ikisi de DNA

harabiyetine sebep olur.14

Nikotin, tütün bitkisinin yapraklarında bulunan sıvı, renksiz, uçucu, suda çözünebilen

ve kuvvetli alkali (pKa=11) özelliği olan bir alkaloiddir. Kurutulmuş tütün yaprağında % 0,5-

8 oranında bulunur. Tütün yaprağındaki alkaloidlerin % 95’ini oluşturur. Zaman içinde

havanın etkisiyle kahverengi renk alır ve tütüne özgü koku kazanır. Yapraktaki nikotinin

yüzdesi tütünün yetiştiği bölgeye ve tütünün türüne göre değişebilir. Nikotin santral sinir

sistemine çok hızlı geçebilecek kadar lipofiliktir.28

7

Akciğer veya ağız yoluyla vücuda giren nikotinin % 5-10’u değişmeden idrarla

atılırken % 85-90’ı karaciğerde metabolize olur. Sonuçta nikotin oxid ve kotinin olarak

bilinen iki ana metabolit ortaya çıkar. Sigara içenlerin kan nikotin düzeyleri sabah

uyandıklarında yaklaşık 5 ng/ml kadardır. Kotininin yarılanma süresi 18-20 saattir. Bu

nedenle günün değişik saatlerinde kan kotinin düzeyi pek değişmez ve 250 ng/ml olarak

ölçülebilir. Kotinin bu özelliği ile sigara ve nikotin kullanımı için güvenilir bir göstergedir.

Nikotin hedef hücrelerdeki nikotinik reseptörleri aktive ederek etki gösterir. Bu

reseptörlerin iletim mediyatörü asetilkolindir. Nikotinik reseptörlerin çeşitliliği, fonksiyonel

farklılığı nedeniyle nikotinin fizyolojik ve farmakolojik etkileri çok çeşitlidir.28

SİGARANIN EPİDEMİYOLOJİSİ

Sigara, tüm ülkeler için en önemli sağlık problemidir. Ülkemizin de içinde bulunduğu

coğrafya, dünya tütün tüketiminde birinci sırayı almaktadır. Dunyada her yıl 4 milyon insanın

ölümüne neden olan sigara kullanımı, yaşı 15’in üzerinde olan 1,2 milyar kişi (her üç

erişkinden birisi) tarafından kullanılıyor olup, bunların % 80’i orta ve az gelişmiş ile

gelişmekte olan ülkelerdendir.26 Sigara tüketimi sadece gelişmiş ülkelerde azalırken,

gelişmekte olan ülkelerde artmaya devam etmektedir.

Sigara, dünyada her 8 saniyede bir kişinin ölümüne neden olmaktadır. Dünya Sağlık

Örgütü verilerine göre her yıl 4 milyon kişi sigaraya bağlı bir hastalıktan dolayı vaktinden

erken ölmektedir ve 2030 yılına ulaşıldığında bu sayının yılda 10 milyona çıkması

beklenmektedir. 2020’li yıllarda dünyada sigaraya bağlı olan ölümlerin % 70’nin gelişmekte

olan ülkelerde olacağı hesaplanmaktadır.63 Sigara içme oranlarının bugünkü seviyelerde

devam etmesi durumunda önümüzdeki 30 yıl içinde sigara nedenli ölümlerin; kazanılmış

immun yetmezlik sendromu (AIDS), tuberküloz, trafik kazaları, anne ölümleri, intihar ve

cinayetlerin toplamından daha fazla olacağı tahmin edilmektedir.1

Gelişmekte olan ülkelerde sigaraya başlama yaşı 12-16’dır. Her gün dünyada 80.000-

100.000 gencin sigara bağımlısı olduğu bildirilmektedir.26 1999’da yapılan bir çalışmada,

gelişmiş ülkelerde 13-15 yaşları arasındaki gençlerde sigara içme oranının % 10-33 arasında

olduğu tespit edilmiş.58 Günümüzde erişkin sigara içicilerinin % 80’inden fazlası 18 yaşından

önce başlamaktadır.55

Ülkemizde ise farklı çalışmalarda gençlerde ortalama sigara başlama yaşları 11-18 yaş

arasında bulunmuştur.6 1988’de yapılan bir araştırmaya göre 15 yaş üzeri sigara içme

prevelansı % 43’tür (erkeklerin % 63’ü, kadınların % 24’ü).40 Yakın zamandaki bir başka

çalışmada ise, ülkemizde 20 yaş üzeri populasyon da erkeklerde 50.9, kadınlarda % 10.9

8

içicilik saptanmıştır.46 Türk Kardiyoloji Derneği tarafından 1990'dan beri yürütülen

TEKHARF çalışmasına göre ise erişkin erkeklerin % 59.4'ü, kadınların % 18.9'u sigara

içicisidir. 2000 yılındaki taramalarında erkeklerde sigara içme prevalansı % 11 azalmışken

özellikle genç kadınlarda artış olduğu bildirilmektedir.51,53 Ülkemizin de içinde bulunduğu

Doğu Avrupa bölgesi halen dünyada tütüne bağlı yıllık ölümlerin % 25'inden sorumludur ve

2020 yılında bu bölgedeki erişkin erkekler dünyada erken ölüm riski en yuksek grup olarak

öngörülmektedir.61

ÇEVRESEL SİGARA DUMANI

Tütün ürünlerinin yanan uçlarından ve bunları tüketen kişilerin solunum havalarından

çıkardıkları dumana çevresel sigara dumanı denir. Yanan bir sigara iki şekilde duman

oluşturur, birincisi sigara içen kişinin üflediği sigara dumanı ki buna ana akım dumanı (main

stream smoke-ana akım dumanı), ikincisi ise sigaranın yanması sonucu oluşan dumandır buna

ise yan akım dumanı (side-stream smoke-yan akım dumanı) denir. Çevresel sigara dumanı;

ana akım dumanı ve yan akım dumanı karışımı ile oluşmaktadır.60

Sigaranın yanması sonucunda 4000 tane kimyasal bileşik oluşmaktadır ve bunların

içinde en az 40 tanesinin (ör. 4-aminobiphenyl, 2-naphthylamine, benzene, nikel, polisiklik

aromatik hidrokarbonlar) insanlar için karsinojen olduğu bilinmektedir. Ayrıca amonyak,

nitrojen oksitleri, kükürt dioksit ve çeşitli aldehitler gibi irritan maddeler ve karbonmonoksit,

nikotin ve polisiklik aromatik hidrokarbon gibi kardiyovasküler toksik ajanlar da mevcuttur.60

Yan akım dumanı oluşurken yanma ısısı daha düşük olduğu için yan akım dumanı'nda ana

akım dumanı'na göre çok daha fazla kimyasal madde mevcuttur, örneğin hayvanlar için

karsinojen olduğu gösterilmiş olan N-nitrosodimethylamine yan akım dumanında ana akım

dumanına göre 20-100 kat daha fazla bulunmaktadır.3 Yapılan çalışmalar her bir sigara

içiminde etkilenilen dumanda yan akım dumanı'nın ana akım dumanı'na göre daha tehlikeli

olduğunu göstermektedir.7

Ana akım dumanı ve yan akım dumanı nikotin bileşikleri de farklıdır. Ana akım

dumanı'nda nikotin partikül fazındayken, çevresel sigara dumanı'nda sıvı faza geçmiştir.

Diğer bir önemli fark ise çevresel sigara dumanı'nda partiküllerin boyutunun (0.01-1.0 µm)

ana akım dumanına (0.1-1.0 µm) göre daha küçük olmasıdır.60

Çevresel sigara dumanının esas kaynağı tütün yanmasıdır. Çevresel sigara dumanı

çoğu toplumda vardır. Maruziyet sigara içilen her kapalı ortamda oluşur. Maruziyet derecesi

sigara içen kişi sayısı, tüketilen sigara sayısı, odanın büyüklüğü ve havalandırması ile

sigaraya maruz kalınan süreyle ilişkilidir.60

9

Çevresel sigara dumanı partikül ve gaz fazındaki binlerce bileşenden oluştuğu için bir

bütün olarak ölçülemez. Onun yerine çeşitli biyolojik markırlara bakılarak maruziyet miktarı

ölçülür. Birçok çevresel sigara dumanı komponenti kapalı ortamda ölçülebilir (Örneğin CO ve

Polisiklik aromatik hidrokarbonlar gibi). Fakat bunlar ölçüm için yeterli değildir. Çünkü

bunlar birçok farklı kaynaktan elde edilebilir. Kapalı ortamdaki çevresel sigara dumanı

seviyesini ölçmek için sıvı fazdaki nikotin düzeyi ve havada asılı olan ve solunabilen partikül

yoğunluğu (respirable suspended particle mass-(RSP) sıklıkla kullanılan iki belirleyicidirler.

Nikotin iç yüzeylerce emilebildiği ve tekrar salınabildiği için çevresel sigara dumanı

maruziyetini ölçmede dezavantaj oluşturur.60 Kotinin ise sigaraya özgüdür ve tükürük, kan ya

da idrarda ölçülebilir. Yarılanma ömrü yaklaşık bir gündür ancak bu süre çocuklarda daha

uzundur.54 Amerika Birleşik Devletleri (ABD)'nde eğer sigara içilmekteyse nikotin

konsantrasyonları evde 1 µg/m3-10 µg/ m3 arasında ve işyerlerinde sıfıra yakın bir değer ila

30 µg/ m3 arasında ölçülmektedir.54 Uluslararası Kanser Araştırma Ajansı'nın 10 ülkeyi ve 13

merkezi kapsayan sigara içmeyen kadınlarla yaptığı ve idrarda kotinin düzeyine bakılan bir

çalışmada kadının yalnızca evde içilen sigaradan etkilenmesi durumunda kotinin/kreatinin

düzeyi 6.2 ng/mg iken bu düzey eğer kadının hem işyerinde hem de evinde sigaradan

etkilenimi mevcutsa 9.0 ng/mg'a çıkmaktadır.2,42

Çevresel sigara dumanının deney hayvanları üzerine karsinojenik, mutajenik ve

kardiyovasküler etkileri çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir. Ayrıca bağışıklık sisteminde

makrafajların sayısında azalma ve fagositik aktivitelerinde azalama yaptığı gösterilmiştir.

Üreme ile ilgili olarak da deney hayvanı yavrularında düşük doğum ağırlına neden olduğu

gösterilmiştir.60

İnsanlarda ise başta solunum sistemi olmak üzere birçok sisteme etkileri mevcuttur.

Başta akciğer olmak üzere larenks, sinonazal, mesane gibi birçok kanserde riski arttırdığı

gösterilmiştir. Akciğerlerde fonksiyonları azaltarak astım gibi kronik obsturiktif akciğer

hastalığına ve respiratuvar semptomlara neden olduğu ilişkilendirilmiştir. Çevresel sigara

dumanı etkilenim sonucunda çocuklarda bronşit, bronşiyolit, pnömoni gibi alt solunum yolu

enfeksiyonları, orta kulak enfeksiyonu, üst solunum yolu irritasyonu, azalmış akciğer

fonksiyonu ve astımlı çocuklarda artmış astım atak sayısı görülmektedir. Sigara içmeyen

ancak Çevresel sigara dumanından etkilenen hamile kadınların bebeklerinin yaklaşık 10-110

gr arasında ortalama 35 gr daha düşük ağırlıkla doğduğunu çalışmalar göstermektedir.

Annenin gebelikte sigara içmesi, anne sütü verilmesi ve diğer tüm karıştırıcı faktörler kontrol

edildiğinde annenin doğumdan sonra sigara içmesi durumunda Ani Bebek Ölümü Sendromu

riski 2.3 kat, babanın sigara içmesi durumunda 3.5 kat arttığı tespit edilmiştir.

10

Kardiyovasküler sistem üzerine ise azalmış oksijen bağlama kapasitesi sonucunda trombosit

agregasyonu, endotel hasarı, ateroskleroz, iskemi ve miyokard enfarktüsüne neden olduğu

gösterilmiştir.60

11

LARENKS EMBRİYOLOJİSİ

Larenks epiteli larengotrakeal tübün kranyal ucunun endoderminden gelişir. Larenksin

kıkırdakları dördüncü ve altıncı brankial yay çiftlerindeki kıkırdaklardan gelişir. Larengeal

kıkırdaklar nöral krista hücrelerinden köken alan mezenkimden gelişirler. Larengotrakeal

tübün kranyal ucundaki mezenkim hızla çoğalarak aritenoid şişkinlik (tuber aritenoideum)

çiftlerini meydana getirir. Dile doğru gelişen bu şişkinlikler yarık şeklindeki deliği (glottis

primitiva- ilkel dil) T harfi biçimli larengeal girişe ve gelişmekte olan larengeal lümeni dar bir

yarığa dönüştürür. Larengeal epitelin hızla çoğalması geçici olarak larengeal lümenin

tıkanmasıyla sonuçlanır. Onuncu haftaya kadar larenks yeniden kanalize olur. Yeniden

kanalize olma işlemi sırasında, larengeal ventriküller oluşur. Bu girintiler ses tellerini (plika

vokalis) ve vestibüler katlantıları (plika vestibularis) oluşturan müköz membran katlantıları ile

sınırlanır. Epiglot üçüncü ve dördüncü farengeal yayların ventral ucunda mezenkim

çoğalmasıyla meydana gelen hipobrankiyal kabartının kaudal kısmından gelişir. Bu kabartının

rostral kısmı dilin orta 1/3 ‘lük kısmı olan farengeal kısmı oluşturur. Larengeal kaslar

farengeal yayların dört ve altıncı çiftlerindeki myoblastlardan geliştiği için, bu yayları

destekleyen nervus vagusun laringeal dalları ile inerve olurlar. Larenks ve epiglotun büyümesi

doğumdan sonraki ilk üç yılda hızlıdır. Bu zaman içinde epiglot yetişkin şeklini kazanır.

Embriyolojik olarak supraglottik bölge, üçüncü ve dördüncü brankiyal arklardan

gelişir. Glottik ve subglottik bölgeler ise altıncı brankiyal arktan gelişir.

LARENKS HİSTOLOJİSİ

Epiglottisin lingual yüzeyi ve larengeal yüzeyin üst kısmı nonkeratinize çok katlı yassı

epitel ile örtülüdür. Yassı epitel, epiglottisin inferior larengeal kısmında solunum tipi epitel ile

birleşir. Epiglottisin inferior larengeal kısmında epitel altında serö-müköz bezler vardır.

Solunum tipi epitel yalancı vokal kordları, ventrikülü ve subglottisi de örtmektedir. Gerçek

vokal kordlar nonkeratinize çok katlı yassı epitel ile döşelidir. (Şekil 3) Sigara içmeyen

erişkinlerin yarısında supraglottik ve subglottik bölgelerdeki silyalı solunum tipi epitel

arasında yassı epitel adaları bulunmaktadır. Sigara içenlerde ise larenksteki silyalı solunum

tipi epitel sıklıkla tamamen yassı epitel ile yer değiştirebilmektedir.12,30,43

Larenksin solunum epiteli yalancı çok katlı silyalı kolumnar tiptedir. Kolumnar epitel

nükleuslarındaki pozisyon farklılığı epitele psödostratifiye bir görünüm verir. Silyalı epitel 1-

2 ile 8-10 hücre arasında değişen kalınlıklarda olabilir. Silyalı epitel yalancı vokal kordlar,

ventrikül ve subglottiste bulumaktadır. Kolumnar epitelin en alt kısmında küçük, yuvarlak

hücrelerden oluşan bazal veya rezerv hücreler bulunur. Epitel altındaki lamina propriada

12

çoğunluğu müköz olan mikst glndlar bulunur. Bu glanların boşaltıcı kanalları epitelyal

yüzeye açılır. Ayrıca lamina propriada lenfoid nodüller mevcuttur. Ayrı olarak submukoza

bulunmaz. (Şekil 1)

Şekil 1: Yalancı çok katlı kolumnar epitel (H&E)

Larenksin çok katlı yassı epitelinde dar sitoplazmalı, ovoid nükleuslu, yüzeye dik

şekilde dizilenim gösteren bir bazal tabaka vardır. Mitoz normalde bu tabakada sınırlıdır.

Laringeal mukoza matürasyonunda skuamöz hücreler yüzeye doğru migrasyon gösterirler. Bu

hücreler poligonal biçimli olup normokromatik nükleus vardır ve nükleolusları izlenebilir.

Eozinofilik sitoplazma geniştir ve fiksasyon sırasında hafif hücre büzüşmesi nedeniyle komşu

hücrelere doğru uzanan çok sayıdaki ince sitoplazmik uzantılar ortaya çıkar. Bu ince

sitoplazmik uzantılar nedeniyle bu zona dikensi-prickle hücre tabakası (malpighi tabakası) adı

verilmektedir. Bu tabaka skuamöz epitelin en geniş bölümüdür. Superfisiyel tabaka küçük

kondanse nükleuslu, bir-üç sıralı, düzleşmiş hücrelerden oluşmaktadır 30 Özellikle siyah ırkta

bazal tabakada dentritik melanositler görülebilir.30,43 Yüzeye doğru ilerledikçe yassı epitel

nükleusları büyür, daha sferik bir hal alır ve veziküler kromatine sahiptir. Larenksin yassı

epiteli 5 ila 25 hücre arasında değişen kalınlıklarda olabilir. Larenkste normalde parakeratozis

yoktur ancak sigara gibi irritanlara maruziyet parakeratozis odaklarına neden olabilir.30

Çok katlı yassı epitel yüzeyi altındaki lamina propria incedir ve glandlar, lenfoid doku

ve kan damarlarından yoksun yoğun bir bağ dokusu mevcuttur. Lamina propria altında vokal

ligamenti oluşturan iri demetler halindeki paralel elastik lifler ve bu liflere paralel olarak

vokal kordların gerilimini düzenleyen iskelet kası demetlerinden oluşan vokal kaslar bulunur.

(Şekil 2)

13

Şekil 2: Çok katlı yassı epitel (H&E)

Şekil 3: Larenksin mikroskopik anatomisinin görüntüsü Yalancı vokal kordlarda serömüsinöz glandlar ve silyalı kolumnar epitel yapısı gözükmektedir. Vokal kas, elastik lif ve Reinke boşluğunu içeren gerçek vokal kordda ise çok katlı yassı epitel gözlenmektedir.38

Reinke mesafesi gerçek vokal kordların lamina propriası için kullanılan bir terim olup

yassı epitel tabanı ile vokal ligament arasında kalan alandır. Bu alan kapiller ve lenfatiklerden

fakirdir. 12,30.38,43

Larenksin çoğu yerinde serömüsinöz glandlar bulunur ve bunlar duktuslar vasıtasıyla

yüzey epiteli ile ilişkilidir. Duktuslar kolumnar epitel, skuamoz epitel veya her iki tipte epitel

ile döşeli olabilir. Bu duktuslardaki epitelde bazal hücre hiperplazisi ya da displazi mevcutsa,

14

tanjansiyenel kesitlerde derin yassı epitel adaları invaziv karsinom ile karışabilir. Glandlar

yaşlı bireylerde onkositik metaplazi göstebilir.30,43

Histopatolojik Terminoloji:

Larenkste görülebilen reaktif ve prekanseröz epiteliyal değişiklikleri tanımlayan

terimler başlıca şunlardır:

Metaplazi: Metaplazi geri dönüşümlü olarak yetişkin bir hücre tipinin yerini diğer bir yetişkin

hücre tipinin almasıdır.

Hiperplazi: Hücre sayısının artması ile paralel giden mukoza epiteli kalınlaşmasıdır. Sitolojik

atipi eşlik edebilir veya etmeyebilir. İnfeksiyonlarda, reaktif olaylarda izlenebilir.

Psödoepitelyomatöz hiperplazi: Maligniteye ilişkin sitolojik bulgu içermeyen, skuamöz

epitelin aşırı derecede reaktif ve reparatif büyümesidir.

Keratozis: Mukoza epiteli yüzeyindeki dikensi hücrelerin sitoplazmasında keratohyalin

granüllerinin oluşmasıdır.

Parakeratozis: Mukoza epiteli yüzeyindeki keratin tabakasının içinde nukleuslar da varsa

parakeratozis adını alır. Larenkste hiperkeratoz sigara içimiyle ilişkilidir ve kord vokallerde

izlenir. Klinik olarak, alttaki stromada artmış belirgin vaskülarite ile birlikte mukoza beyaz,

kalınlaşmış görünümdedir.

Diskeratozis: Epitel hücrelerin anormal keratinizasyonudur. İzole hücrelerdeki prematür

keratinizasyondur. Displastik lezyonlarda ve karsinomlarda izlenir.

Koilositozis: Skuamöz hücrelerdeki sitoplazmik vakuolizasyonu tanımlar. Hücreler köşeli,

pleomorfik ve hiperkromatik nükleusludur. Bu hücreler genellikle süperfisiyel epiteliyal

tabakada izlenir. Human papilloma virüsü (HPV) enfeksiyonunu tanımlayıcı bir bulgudur.

Displazi: Hücre morfolojisinde malignite yönünde değişimi yansıtan görünüm (atipi) ve

anormal hücre maturasyonunu yansıtır.

Müköz membranlardaki beyaz lezyonları tanımlayan "lökoplaki" ve kırmızı lezyonları

belirleyen "eritroplaki" terimleri klinik terimler olup, yukarıda tanımlanan mikroskopik

terimlerle hiçbir şekilde parallellik taşımamaktadır. Klinik olarak eritroplaki olarak

değerlendirilen lezyonların altında bir malign tümörün yatma olasılığı daha yüksek ise de tanı

için mikroskopik inceleme temeldir.38

15

LARENKS ANATOMİSİ

Larenks, boynun ön kısmında, orta hatta kıkırdak iskeletten oluşan, çevresine

ligamentler ve membranlar ile asılı, mobil, boşlukları mukoza ile örtülü, iç kaslarının

çalışması ile öncelikli olarak alt solunum yollarının korunması, solunum ve fonasyon

görevlerini üstlenen bir organdır. Yetişkinlerde 3. ve 6. servikal vertebra, çocuklarda 1. ve 4.

servikal vertebralar arasında yer alır.16

LARENGEAL İSKELET

Larengeal iskelet tiroid, krikoid ve epiglot kıkırdaklardan oluşur. Fonksiyonel önemi

çok fazla olan bir çift aritenoid kıkırdıktan başka üç çift küneiform (Wrisberg), kornikulat

(Santorini) ve sesamoid kıkırdaklar da aksesuar kıkırdaklar olarak yapıda yer alır.16 (Şekil 4)

Şekil 4: Larenks kıkırdakları ve eklemleri41

Tiroid Kıkırdak

Hyalin yapıda olan tiroid kıkırdak larenksin en büyük kıkırdağıdır. Kalkan şeklinde

olup, 25 yaşında kemikleşmeye başlar, 65 yaşında tamamen kemikleşmiş olabilir. İki adet

kanattan (ala-lamina) oluşur. Alalar, ortada birleşmiş olup, arkada açıktır. Erkeklerde alalar

adem elması denilen larengeal çıkıntıyı oluşturacak şekilde 90 derece açıyla birleşmiştir.

Kadınlarda bu çıkıntı 120 derecelik açıyla birleşme nedeni ile yoktur. Ala laminaların arka

kenarlarında üst ve alt kornular yer alır. Uzun olan süperior kornu lateral tirohiyoid ligament

vasıtası ile hiyoid kemiğin büyük boynuzu ile bağlantılıdır. Kısa olan alt kornular, krikoidin

posterolateral yüzüyle krikotiroid eklemi yapar. Bu eklem sinoviyal yapıda olup krikoid

kıkırdağın rotasyonunu sağlar. Bu rotasyon vokal kordlar üzerine uygulanan gerginliği

16

değiştirir. Laminalarn lateral yüzünde, tirohiyoid, sternotiroid ve inferior konstriktör kasların

yapıştığı Linea obliqua adı verilen bir çizgi vardır.44

Tiroid kıkırdağın iç ve dış yüzü, perikondrium ile örtülüdür. Kıkırdağın iç yüzeyi

oldukça düzdür. İç yüzde tiroid notch ile alt kenar arasındaki mesafenin, yaklaşık olarak

ortasına denk gelen yerde küçük bir kabartı vardır. Buraya ön komissür tendonu (Broyle’s

ligamenti) yapışır. Tiroid kıkırdağın üst kenarına tirohiyoid membran, alt kenarına krikotiroid

membran ve ligament yapışır. Bu ligament kan damarları, lenfatik damarlar içerir ve larengeal

kanserlerin yayılmasında önemli bir bariyerdir.27

Krikoid Kıkırdak

Halka seklindedir. Hyalin yapıda ve kalındır. Hava yolunu tamamen çevreleyen tek

destek yapı olup, fonksiyonel larenks için major koruyucu rol üstlenir. Mühür yüzüğü

seklinde olup, öndeki arkı 3 mm yüksekliğinde iken orta laminası 20-30 mm civarındadır. Üst

yüzeyinde aritenoid kıkırdakla eklem yapan iki eklem yüzeyi vardır. Krikoaritenoid eklem

sinoviyal eklemdir. Dışa ve içe rotasyon hareketleri yapar. Kıkırdağın her iki arka yan

yüzlerinde, inferior tiroid kornularyla eklem yapan yüzey mevcuttur. Bu eklem rotasyon

hareketi yaparak, krikoid ve tiroid kıkırdakların aralarında mesafenin azalıp artmasına ve ses

tellerinin gerilip gevşemesine neden olur. Laminanın arka yüzeyinde, özofagusun longitudinal

liflerinin yapıştığı bir çıkıntı vardır. Arkus alt kenar, yanlarda krikotrakeal ligament

vasıtasıyla 1. trakeal halkayla birleşir.44

Epiglot

Yaprak şeklinde, fibroelastik kıkırdaktır. Alt ucu tiroepiglottik ligament ile tiroid

kıkırdak iç yüzüne, incisura tiroideanın hemen altına tutunur. Bu kısmına petiolus denir. Yan

kenarları ariepiglottik kıvrım ile aritenoid kıkırdağa ve ön yüzü hiyoepiglottik ligament ile

hiyoid kemiğe tutunur. Epiglotun üst kenarını döşeyen mukoza ile dil kökü mukozası arasında

lateral ve median glossoepiglottik plikalar bulunur. Bu plikalar arasında oluşan çukurluğa

vallekula denir. Epiglotun hiyoid kemik üzerindeki serbest bölümüne suprahiyoid kısım denir.

Bu kısımdaki lingual ve larengeal yüzeyi mukoza ile örtülüdür. İnfrahiyoid kısımın ise serbest

yüzeyi yoktur ve epiglotun bu kısmı preepiglottik boşluğun posterior sınırını oluşturur.

Epiglot kıkırdağın yüzeyinde çok sayıda mukus glandlarla dolu delik bulunmaktadır. Bunlar

kanserin epiglot yüzeyinde yayılımına izin verir. Fonksiyonu esas olarak yutulan materyelin

larengeal boşluğa kaçmasını engellemektir. Yutma sırasında larenks anterosuperiora kalkar.

Bu hareket epiglotu dil köküne doğru iter ve posteriora doğru yer değiştirmesini sağlar.59

17

Aritenoid Kıkırdaklar

Posterior krikoid laminanın superior yüzünde yerleşmiş, çift kıkrdakların en büyüğü

ve larenksin en hareketli ve en fonksiyonel kıkırdaklarıdır. Hyalin yapıdadır. Tepesi yukarıda,

tabanı aşağıda piramid şeklindedir. Krikoid kıkırdağın posterior arkının superior yüzündeki

fasetlerle eklemleşir. Aritenoidin tabanı eklem yüzünü oluşturduğu gibi musküler ve vokal

çıkıntıları da içerir. Lateralde taban, genişçe musküler çıkıntıyı anteriorde ise daha ince olan

vokal çıkıntıyı oluşturur. Anterolateral yüzey vestibüler ligamenti ve bunun yanında

tiroaritenoid ve vokal kasları alır. Arka yüzeyde kas yapışma yerleri mevcutken yan yüzde ise

belirgin posterior krikoartenoid ligament bağlanır. Medial yüzeyi sadece perikondrium ile

kaplıdır. Bu kıkırdakların hareketi ve vokal kordlarla ilişkisi larenksin kompleks

fonksiyonunu sağlar.44

Kornikulat kıkırdaklar (Santorini kıkırdağı)

İki adettir. Aritenoid kıkırdağın apeksi ile eklem yaparlar.27

Kuneiform kıkırdaklar (Wrisberg kıkırdağı)

Ariepiglottik kıvrım içinde bulunur ve pasif destek sağlarlar.27

LARENKSİN LİGAMENT VE MEMBRANLARI

Larenksin Ligamentleri

Thyroepiglottic ligament: Epiglotu tiroid kıkırdağa bağlar.

Hyoepiglottic ligament: Hiyoid kemiğin posterior yüzeyi ile epiglotun lingual yüzü

arasındadır.

Stylohyoid ligament: Temporal kemik tabanından hiyoidin küçük kornusuna uzanır.

Pharyngoepiglottic ligament: Farenksin yan duvarlarıyla epiglot arasında bulunan

plikanın içerisinde yer alır ve üzeri mukozayla örtülüdür.

Ventriculer ligament: Aritenoid kıkırdaktan anterolateral yüzüyle broyles tendonunun

arasında yer alarak, ventriküler bandın serbest kenarını meydana getirir.

Crikotracheal ligament: Krikoid alt kenarından trakeanın birinci halkasının üst

kenarına ulaşır.27

18

Larenksin Membranları

Tirohiyoid membran

İnferiorda tiroid kıkırdağın üst kenarına ve üst kornunun ön yüzüne, süperiorda ise

hiyoid kemiğin korpusuna ve büyük boynuzuna yapışır. Membranın medialindeki kalınlaşmış

bölümüne median tirohiyoid ligament denir. Her iki tarafta lateralde, tiroid üst kornusunun

yaklaşık 1 cm önünde ve yukarısında superior larengeal damarlar, superior larengeal sinirin

internal dalı ve supraglottik lenfatik pedikül mevcuttur.27

Kuadrangüler membran

Epiglotun lateralinden aritenoide uzanır. Supraglottik larenksi paraglottik alandan ayırır. Üstte

ariepiglottik plika, altta ventriküler ligament yaparak sonlanır. Membranın superior kısmı

serbesttir ve epiglot üst kısmında kornikulat kıkırdağa kadar oblik bir seyir gösterir. İnferior

kısmı epiglotun tiroid kıkırdakla bağlantısının iç noktasından aritenoid kıkırdağın vokal

proçesine kadar uzanır. Superior ve inferior sınırları ise serbesttir. 59 Üst ve alt serbest

kenarları kalınlaşarak ligament halini alır:

- Ariepiglottik fold

- Vestibüler fold

Konus elastikus (Triangüler Membran)

Larenks alt parçasının elastik membranıdır. Krikoid kıkırdak üst kenarından, önde

tiroid kıkırdak alt kenarına, arkada ise aritenoid kıkırdağın vokal çıkıntısına uzanır. Kenarları

serbesttir, medial ve lateral yüzleri kalınlaşıp vokal ligamenti oluşturur.

- Median krikotiroid ligament: Konus elastikus kalın ön parçası tarafından yapılır.

- Vokal ligament: Vokal kord iskeletini yapar. Konus elastikusun serbest, güçlü olan

üst kenarınca oluşturulur.59

LARENKS KASLARI

A) Ekstrensek Kaslar

Ekstrensek larenks kasları bir bütün olarak larenksin hareketini ve fiksasyonunu

sağlarlar. Ekstrensek kaslar fonksiyonel yönden elevatör ve depresör olmak üzere iki gruba

ayrılırlar. (Şekil 5-6)

1. Elevatörler: M. Geniohyoideus, M. Digastricus, M. Mylohyoideus, M. Stylohyoideus.

Larenksi yutma sırasında yukarı çeken bu kaslar epiglotun kapanmasını sağlarlar. 5. , 7. ve 9.

sinirler tarafından innerve edilirler.

19

2. Depresörler: M. Sternohyoideus, M. Thyrohyoideus, M. Omohyoideus, M.

Sternothyroideus.

İnfrahiyoid dışı larenks kasları inspirasyonda larenksi aşağı çekerken bir miktar da vokal

kordları gererler. Asıl tutunma yerleri larenks dışındadır ve hepsi ansa hipoglossi tarafından

innerve edilirler.27

B) İntrensek Kaslar

Anatomik olarak larenksin içine sınırlandırılmış kaslardır. Glottik açıklığın

boyutlarıyla birlikte vokal kıvrımların uzunluk ve gerginliğini ayarlarlar. Multipl adduktör ve

tek bir adet abdüktörden ibarettirler. İnteraritenoid hariç ikişer adettirler ve eş zamanlı hareket

ederler.44

Krikotiroid kas

Larengeal kıkırdakların dış yüzeyine yerleşmiştir. Krikoid kıkırdağın dış yüzünden başlayan

lifler iki demete ayrılarak krikoid ve tiroid kıkırdaklar arasını doldurur. Oblik olarak seyreden

medial kısım, krikoid ark anterolateral kenarından oblik şeklinde yukarı ilerleyerek inferior

kornunun ön kısmına yapışır. Bu kısım krikoid laminasını geriye doğru çekerek, üzerinde

bulunan aritenoidin geriye doğru gitmesini sağlar ve vokal kordu uzatarak gerer. Pars recta

olarak adlandırılan ikinci kısım, krikoid arkı lateral kısımdan tiroid kıkırdağın alt kenarının

posterioruna doğru uzanarak, superior ve laterale yönelir.44

Posterior krikoaritenoid kas

Krikoid kıkırdağın laminasının bütün arka yüzeyine tutunarak başlar, yukarı ve laterale

yönelen lifleri, aritenoid kıkırdağın muskuler kısmna tutunmak üzere bir araya gelir. Üst lifler

horizontal, orta lifler oblik ve alt lifler vertikaldir. Kasılmayla aritenoid kıkırdaklar laterale

döndürülerek, vokal kordlarn abdüksiyonunu sağlar.27

Lateral krikoaritenoid kas

Posterior krikoaritenoidin ana antagonistidir. Krikoid arkusunun dış yüzü ve üst kenarından

ve konus elastikustan başlayıp yukarı arkaya ilerleyerek aritenoidin muskuler çıkıntısının ön

yüzüne yapışır. Kontraksiyonu ile muskuler çıkntı ön ve laterale çekilir. Böylece kord ortaya

yaklaşır.27

İnteraritenoid kas

İntrinsik kasler içinde tek olarak bulunan tek kastır. Her iki aritenoid kıkırdağın posterior

yüzeyi arasnda olup transvers ve oblik lifleri vardr. Oblik parça larenks aditusunu daraltırken,

transvers parça rima glottis daraltmaya yardım eder. Aynı zamanda kord vokallere

adduksiyon yaptırır. Bu kas rekürren larengeal sinirle bilateral olarak innerve edilir. Aynı

zamanda, superior larengeal sinirden de motor dallar alır.27

20

Tiroaritenoid kas

Tiroid kıkırdak ve konus elastikusun iç yüzeyinden çıkarlar ve arkaya dışa ve biraz yukarı

doğru ilerleyerek iki parçaya ayrılırlar.

1. M. vocalis veya thyroarytenoideus internus: Konus elastikusun serbest kenarına ve vokal

çıkıntının lateraline yapışır.

2. M. thyroaritenoideus externus: Vokal çıkıntı ile krikoaritenoid kas arasına yapışır. İç

liflerin dışında olarak, ventrikülün dış duvarı boyunca uzanarak aritenoide yapışır. Bu kasın

bazı lifleri yukarı doğru ilerleyerek ariepiglottik plikaya ilerler ve epiglotun yan kenarna

yapışırlar. Bu lifler tiroepiglottik kas adını alırlar. Tiroaritenoid kas, aritenoidi ileri çekip

mediale döndürür. Krikotiroid ve posterior krikoaritenoid kasın antagonistidir. Ventriküler

bandları da transvers aritenoid ile birlikte birbirine yaklaştırarak sfinkter görevi sağlar. Bu kas

vokal kordlara adduksiyon yaptırır. Vokal kordun serbest kenarının gerilimi ve kalınlığını

değiştirir. Bu glottik sfinkter aritenoidi ileri çekerek vokal ligamenti gerip vokal kord

kalınlığını arttırır. Fonasyon için en önemli kasdır.27

Larenksin intrensek kasları fonksiyonel olarak şöyle sınıflandırılır;

A. Adduktor kas

M. Cricoarytenoideus posterior ( N. Laryngeus recurrens)

B. Abduktor kaslar

M. Cricoarytenoideus lateralis (N. Laryngeus recurrens)

M. İnterarytenoideusun transvers parçası (N. Laryngeus recurrens)

M. Thyroarytenoideus (N. Laryngeus recurrens)

C. Tensor kaslar

M. Cricothyroideus (N. Laryngeus superiorun ekstrensek dalı)

M. Thyroarytenoideus (N. Laryngeus recurrens)

D. Konstriktör kaslar

M. İnterarytenoideusun oblik parçası (N. Laryngeus recurrens )

M. Aryepiglotticus (N. Laryngeus recurrens)

21

Şekil 5-6: Larenks kaslarının ön-yan ve arka-yandan görünümü41

LARENKSİN POTANSİYEL BOŞLUKLARI

Reinke Boşluğu

Vokal kord mukozasının altında bulunan, fibröz yapılardan zayıf subepitelyal

konnektif doku tabakasıdır. Kordun serbest kenarından 2 mm uzaklıktadır.

Preepiglottik Boşluk

Bu boşluğun sınırlarını; yukarıda vallekula mukozası ve hiyoepiglottik ligament,

arkada epiglot ve tiroepiglottik ligament, önde tirohiyoid membran ve tiroid laminanın iç yüzü

oluşturur. Yanlarda paraglottik mesafeyle ilişkidedir. Bu alandaki tümörler, supraglottik ve

paraglottik mesafeye yayılmaya meyillidir.

Paraglottik Boşluk

Ventrikül lateralindeki boşluktur. Dışta tiroid laminalar, inferomedialde konus

elastikus, medialde larengeal ventrikül, süperomedialde ise kuadrangüler membran ile

sınırlıdr. Bu boşluk önde, preepiglottik boşluk ile bağlantı kurar. Paraglottik boşluğun arka

duvarı sinüs piriformis mukozası ile kaplıdır.23 (Şekil 7)

22

Şekil 7: Larenks boşlukları ve bölümleri16

LARENKSİN İNTERNAL ANATOMİSİ

Larenks iki müköz membranla (yalancı ve gerçek vokal kordlarla) üç kompartmana

ayrılır. Vestibül, ventrikül ve subglottik boşluklar.

Vestibül

Anteriorda epiglot posterior yüzü, posteriorda aritenoid kıkırdaklar arasındaki internal

ve lateralde ariepiglottik foldların iç yüzü ve yalancı kordların üst sınırı tarafından sınırlanır.

Ventrikül (Sinüs Morgagni)

Yalancı ve gerçek vokal kordlar arasındaki çıkmazdır. Ventrikülün anterior bitiminde

larengeal sakkül olarak bilinen divertikulum bulunur. Hilton sakkülü mukus glandlarla

örtülüdür, bu da vokal kordların ıslaklığını ve kayganlığını sağlar.

Subglottik Boşluk (İnfraglottik Kavite)

Glottisten krikoid kıkırdağın inferioruna doğru uzanır. Lateralde sınırı konus

elastikusla ve krikoid kıkırdak duvarıyla sınırlandırılmıştır.

23

Rima Glottis

Gerçek vokal kordların serbest kenarları arasındaki boşluktur. Vokal kordlar

respirasyon sırasında abduksiyondayken triangüler şekildedir. Fonasyonda ise yarık haline

geçer. Posterior glottik açıklık yetişkinlerde 18-19 mm, yenidoğanlarda ise 4 mm’dir. Total

glottik açıklık yenidoğanlarda 14 mm’dir.

Yalancı Kordlar (Ventriküler Bantlar)

Larengeal kavitede her iki horizontal foldun üst sınırıdır. Tiroid kıkırdak açısından

anteroposterior olarak aritenoid kıkırdağa uzanır. Primitif kasılma fonksiyonuna sahiptir.59

Gerçek Kordlar (Vokal Kordlar)

Vokal kord aritenoidin vokal prosesi ile ön komissür arasındaki yapı olarak kabul

edilir. Vokal kıvrımlar ve rima glottis adı verilen, kıvrımlar arasındaki boşluk glottisi

oluşturur. Glottis, vokal çıkıntıların uçlarından geçen horizontal çizgi ile belirlenir. Bu hayali

çizgi glottisi intermembranöz ve interkartilajinöz bölümlere ayırır. Bu bölümlerin ön arka

uzunlukları oranları 3:2 şeklinde intermembranöz kısım lehine iken, yüzey alanlarında 2:3

şeklindedir. İnterkartilajinöz parça daha geniştir. Bazıları bu alana rimanın respiratuar bölümü

derler. Vokal kıvrımların membranöz ya da vibratuar kısımları 3 adet belirgin yapısal

tabakaya sahiptir: Yüzeyden derine doğru sırasıyla epitel, lamina propria, vokalis kası. Bu

tabakalar gövde örtü konseptine göre bölümlenebilir. Yüzey döşemesi örtücü epitel ve lamina

proprianın jelatinöz tabakalarından oluşur. Gövde ise vokalis kasından ibarettir. Bunların

arasında lamina proprianın intermediate (elastik) ve derin (kollajenöz) tabakalarından oluşan

bir geçiş bölgesi mevcuttur. Bu konsepte göre vokal kıvrımlar yüzeyden gövdeye doğru

giderek artan sertliğe sahip çok tabakalı bir vibratör olurlar. Dolayısıyla yüzey örtüsü vokal

kıvrımların vibratuar aktivitesinin çoğundan sorumludur. Vokal kıvrımların ön ve orta

uçlarında sırasıyla birer anterior ve posterior makula flava mevcuttur. Temelde lamina

proprianın elastik tabakasının kalınlaşmasından ibarettir. Bunların vokal kıvrım uç

bölümlerinin vibratuar hasardan koruyan yastıklar şeklinde fonksiyon gördükleri

düşünülmektedir. Benzer gövde örtü konseptini daha homojenöz yapıdaki lamina propria

nedeni ile çocuk larenksine uyarlamak mümkün değildir. Ergenliğin sonuna kadar laminanın

erişkin formuna matürasyonu tamamlanamaz.44

24

Piriform Sinüs

Piriform sinüs, medialde ariepiglottik kıvrım, aritenoid ve krikoid üst kısmı ile lateralde ise

tirohiyoid membran ve tiroid lamina iç yüzeyi ile oluşan bir oluktur. Superiorda lateral

glossoepiglottik kıvrımdan başlar. İnferiorda sinüs apeksi krikoid üst kenar seviyesinde

özofagus girişi ile iştiraklenir.59

LARENKSİN BÖLÜMLERİ

1. Supraglottis: Epiglot tipinden ventrikül tabanında respiratuar ve skuamöz epitelin

birleşme yerine kadar uzanır. Pratik olarak inferiror sınır ventrikülün tabanının ve lateral

duvarının birleşme yeridir.

2. Glottis: Anterior komissür, gerçek vokal kord ve posterior komissür ile sınırlıdır.

Vokal kordlar posterior sınırda karşılaşmazlar. Gerçek posterior sınır, aritenoid kıkırdaklar ve

krikoid laminanın superior sınırıdır.

3. Subglottis: Skuamöz ve respiratuar epitelin gerçek vokal kordların birleşim

yerinden, krikoid kıkırdak alt sınırına uzanır. Üst sınırı gerçek vokal kordların serbest

kenarının 5 mm aşağısı olarak kabul edilir.59

LARENKSİN DAMARLANMASI

Arteryel Dolaşım

Larenksin arteryel beslenmesi superior ve inferior larengeal arterlerden oluşur.

Superior tiroid arterin dalı olan superior larengeal arter, larenkse girmeden önce

infrahiyoid ve krikotiroid olmak üzere iki dala ayrılır. Superior larengeal arter karotisten

ayrıldıktan sonra tirohiyoid membranın arka bölümünü superior larengeal sinirle beraber

horizontal olarak çaprazlar. Arter tirohiyoid membranı delerek, lateral duvarın ve piriform

sinüsün tabanında submukozal olarak aşağı ilerleyerek, larenks mukoza ve kaslarına dağılır.

Süperior tiroid arter ayrıca tiroid kartilaj altında horizontal olarak seyreden krikotiroid dalı

verir.

İnferior larengeal arter, inferior tiroid arterin bir dalıdır. Bu arter subklavian arterin

tiroservikal trunkusunun dalıdır. Arter, tiroid lobu alt kenar hizasında önde rekürren sinir,

arkada inf. tiroid arterin terminal dalları arasındadır. İnferior tiroid arter, inferior larengeal

sinirle birlikte krikotiroid eklemin gerisinde, inferior konstrüktör kasın alt kenarının

posteriorundaki Killian-Jamieson bölgesindeki aralıktan larenkse girer.27

25

Venöz Dolaşım

Larenksin venöz damarları superior ve inferior larengeal venlerdir. Arterlere paralel

seyrederler. Superior ve inferior tiroid venlere açılırlar. Bunlar da intenal juguler vene

boşalırlar.27

Lenfatik Dolaşım

Larenkste lenfatik kanallar yüzeyel (intramukozal) ve derin (submukozal) olarak

seyrederler ve bölgelere göre farklılıklar gösterirler.

Supraglottik bölgede: Epiglotun serbest kenarları, bant ventriküller ve ventrikül seviyesinde

lenfatik ağ çok zengin olup sinüs piriformisden gelenlerle birleşir. Bu bölgedeki lenfatikler,

bir taraftan diğer tarafa serbestçe geçerek, üst ve orta juguler lenf nodlarına drene olur.

Glottik bölgede: Vokal kordların membranöz parçası lenfatik ağ yönünden fakirdir.

Maligniteler ancak Reinke aralığına invaze olduklarında lenfatik sisteme girmiş olurlar. Ön

kommisür bölgesine uzanan malignitelerde lenfatik yayılım şansı artar.

Subglottik bölgede: İki çeşit drenaj yolu vardır. Bunlardan bir tanesi, krikotiroid membrandan

geçerek trakea önünde prelarengeal (Delphian lenf nodu) pretrakeal ve oradan da orta derin

juguler nodlara gider. Diğeri ise, inferior tiroid arter yakınındaki lenf noduna geçerek

paratrakeal, trakeoözofageal nodlara gider.27

LARENKSİN İNNERVASYONU

Larenks motor ve sensitif uyarımının tamamını N. vagustan alır. N. vagus, superior

laringeal ve inferior laringeal sinirler olmak üzere larenkse dallar gönderir. N. Laryngeus

superiorun internal ve eksternal dalı mevcuttur. İnternal dal daha kalın olup duysal lifleri

içerir. Tirohiyoid membrandan geçip larenksin supraglottik bölgesinin duyusal uyarımını

sağlar. Bu sinirin eksternal dalı ise daha ince olup motor lifler içerir. M. Cricothyroideus’un

motor uyarımını sağlar ve yaralanması durumunda vokal kordların gerginliği azaldığı için ses

kısıklığı oluşur.

N. Laryngeus inferior (Nervus recurrens) n. vagustan ayrıldıktan sonra solda arkus

aortayı, sağda ise subklavian arteri geçerek yukarı doğru ilerler. Krikotiroid eklemin hemen

arkasından larenkse girer. Anterior ve posterior dalı vardır. Anterior dal motor lifler içerirken

posterior dal duysal lifler içerir. Larenksin kord vokal altında kalan kısmının duyusal

uyarımını ve m. cricothyroideus dışında kalan internal larenks kaslarının motor uyarımını

sağlar. N. Laryngeus inferorun posterior dalı ile n. laryngeus superiorun internal dalının dorsal

26

dalcıkları, interaritenoid ve posterior aritenoid kaslarının dorsal yüzeyinde lokalize Galen

anastomozu’nu meydana getirirler.59

LARENKSİN FONKSİYONLARI

1) Sfinkter (Koruma) görevi: Yutma sırasında larenksin kapanması larenks fizyolojisinin en

önemli görevi olup sıvı ve katı gıdaların girişinde akciğerleri korur. Larenksin kapanması,

rima glottisin kapanması, larenks vestibülinin kapanması ve epiglotun larenks lümenine doğru

eğilmesi olmak üzere üç adımda gerçekleşir. Glottisin sfinkter görevi larenksin esas ve

primitif fonksiyonudur. Yutma sırasında glottis refleks olarak kapanır. Lokal etkiler ve

larenksin kimyasal sitümulasyonu ile solunum ve kardiyovaküler sistemde değişiklikler

oluşur. Bu değişiklikler apne, bradikardi, hipertansiyon, bronkokonstriksiyon, öksürük ve

periferik vasküler direnç değişiklikleridir. Genetik olarak larenks, yutma esnasında pulmoner

sistemi koruyucu bir sfinkter olarak gelişmiştir. Aşağı solunum yollarının korunması larenksin

ana görevidir. Bu nedenle larenks sabit ve dominant glottik kapanma reflekslerine sahiptir.

Kapanma refleksi, süperior larengeal sinirin sitümulasyonuna cevap olarak tiroaritenoid kasın

aniden kapanmasıdır. Larenksteki sfinkter fonksiyonu larenksteki üç bölgenin koruyucu

adduksiyonu sonucu olur. Bunlar yukarıdan aşağıya doğru epiglot-ariepiglottik plikalar,

ventriküler bantlar ve vokal kordlardır. Larenksin sfinkter görevinin başlaması için iki taraflı

süperior larengeal sinirin stimilasyonu gerekir.

2) Solunum fonksiyonu: Larenks solunum yolunun bir parçası olarak görev yapar. Solunum

medulladaki merkez ile düzenlenir. Epiglot hayvanlarda daha uzun olup havanın

yönlenmesine yardım eder. Ayrıca hayvanda koku duyusunda da rol oynar.

3) Fonasyon: Larenkste sesin meydana gelmesinde çeşitli komponentler rol oynar. Bunlar

havanın basıncı, vokal kordların gerilmesi, rima glottisin şekli, solunum yollarının durumu ve

genişliğidir. Bu olaya fiziksel etkenler de katılır. Özellikle sinir sisteminin etkisi ile kaslarda

uzama ve kısalma meydana gelir. Ses oluşunda işitmenin de önemli rolü vardır.

4) Yutma fonksiyonu: Yutma esnasında kasların sfinkter etkisi ile larenks girişi kapanır.

Epiglotun kenarından lokmanın özofagusa kayması sağlanır. Ayrıca yutma sırasında larenksin

yükselmesi lokmanın özofagusa girişine yardım eder.

5) Öksürük ve Eksploratif fonksiyonu: İntratorasik basıncın artmasına bağlı olarak bronş ve

trakea sekresyonu dışarı atılır. Derin inspiryumla glottis kapanır. Ekspiryum kasları kasılarak

intrapulmoner basınç artar. Glottis aniden açılarak hızla çıkan hava aşağı solunum

yollarındaki sekresyonu veya yabancı partikülü dışarı atar.

27

6) Emosyonel fonksiyonu: Larenks kişinin psikolojik durumun göre heyecan, üzüntü, ağlama

ve esnemede ses değişiklikleri meydana getirir.

7) Dolaşıma yardımcı fonksiyonu: Trakeobronşial sistemde ve akciğer parankimindeki

basınç değişikliklerinin etkisi ile kan dolaşımında pompa gibi etki yapar.

8) Fiksatif fonksiyonu: Rima glottisin kapanması ile toraks içine hava kapatılır. Volanter

olarak yapılan bu işlem ağır kaldırma, ıkınma ve zorlama hareketine yardım eder.27

SIÇAN LARENKSİ ANATOMİSİ

Larenks kıkırdakları, inspirasyon esnasında kollapsı önler ve larenksin şeklini korur.

Altı adet kıkırdaktan oluşmuştur.

1. Epiglot: Triangüler şeklindedir.

2. Tiroid kıkırdak: Larenksin en büyük kıkırdağıdır. Lateral ve ventral duvarları vardır.

Lateral yüzdeki arka boynuzlar krikoid kıkırdak ile eklem yapar. Ön boynuzlar

hipofarenksi destekler.

3. Krikoid kıkırdak: Lateral ve ventral yüzü dar, arka kısmı geniş halka şeklinde bir

kıkırdaktır. Sıklıkla ‘Mühür Yüzüğü’ şeklinde adlandırılır.

4. Aritenoid kıkırdaklar: Çift olup, vokal kordu destekleyen ‘V’ şeklinde kıkırdaklardır.

5. Kuneiform kıkırdaklar: Vokal kordun önünde, ariepiglottik plikanın arkasında bir çift

küçük kıkırdaktır.

6. ‘U’ şeklinde kartilaj: Aritenoid kıkırdakların düzeyinde, larengeal lümenin ön

duvarında bir ventral poş vardır. ‘U’ şeklindeki kıkırdak bu poşun girişinde bulunur.

Larengeal lümen 3 bölgeye ayrılır: Farenkse açılan vestibül bölümü, glottis ve infraglottis.

Vokal kordlar, önde ventral poşun kaudal bölgesinde, aritenoid kıkırdağın vokal proçesinden

tiroid kıkırdak orta hattına uzanım gösterir. Aritenoid kıkırdağın musküler proçesi, krikoid

kıkırdağın önü ile eklem yapar.50

SIÇAN LARENKSİ HİSTOLOJİSİ

Larenksin ışık mikroskobi ile incelenmesinde 5 tip epitel görülür. Bunlar; çok katlı

skuamöz, skuamoid, yalancı çok katlı solunum ve yalancı çok katlı kübik epitelin 2 formudur.

Bu epitel tiplerinin dağılımı karmaşıktır.

Epiglottun büyük çoğunluğunda, aritenoid seviyesinin üzerinde, lateral ventriküllerin

içinde ve dorsal bölgede çok katlı skuamöz epitel mevcuttur. Özellikle epiglotun üstünde

olmak üzere ara ara tat tomurcukları da bulunur. Dorsal bölgede de keratinize küçük alanlar

vardır. Vokal kordlar yaklaşık 2 hücre tabakası kalınlığında ince bir skuamöz epitel ile

kaplıdır.

28

Epiglot kaudalinin ventrolateral bölgesinde respiratuar epitelden oluşan geniş alanlar

mevcuttur. Bu alanlar, büyük subepitelyal serömüköz bezlerin duktuslara açıldığı yeri

çevrelemektedir. Respiratuar epitel, aritenoid seviyesi iç yüzeyi boyunca ve vokal kordların

kaudalinde mevcuttur.

Yalancı çok katlı kübik epitel ise yassı ve solunum epitelinin arasında bir geçiş

bölgesinde mevuttur. Geçiş bölgesinin en geniş olduğu yer aritenoid projeksiyonunun

seviyesinde, ventrolateral bölge ve ventral poşun ventral ve lateralidir.

Yalancı çok katlı kübik epitelin çok olduğu epiglot tabanının ventrolateral yüzünde

epitel 3-4 hücre tabakası yüksekliğindedir. Bu yükseklik ventral poş etrafı kaudalinde ve

vokal kord yakınında 2-3 hücre tabakası yüksekliğine düşmüştür.35

29

MATERYAL VE METOD

Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü (DETAE) hayvan

laboratuvarında gerçekleştirildi. Çalışma esnasında 5199 numaralı “Hayvanları Koruma

Kanunu” ve Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı’nın deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için

kullanılan deney hayvanlarının korunması, deney hayvanlarının üretim yerleri ile deney

yapacak olan laboratuvarların kuruluş, çalışma, denetleme, usul ve esaslarına dair

yönetmeliğine ve Helsinki Nihai Senedi’nin deney hayvanları ile ilgili maddelerine uyuldu.

Çalışma 20 adet sağlıklı erişkin, dişi Wistar Albino sıçan üzerinde yapıldı. Sıçanlar

7-8 aylık olup, ağırlıkları 200-250 gr arasında değişiyordu.

Çalışmada C. F. Palmer’ın tanımladığı duman makinası kullanıldı (Resim 1).

Makinada inspirasyon ve ekspirasyon olmak üzere giriş–çıkış yerleri vardı. İnspirasyon giriş

yerine takılan sigaradan alınan duman, ekspirasyon çıkış yerine bağlı 1.5 m uzunluğunda

polietilen bir hortum aracılığı ile 30x40x50 cm boyutlarında bir pleksiglas kabine veriyordu.

Kabinin üst kapağında 10 adet 2 cm çapında dairesel havalanma ve duman çıkış yeri

bulunuyordu (Resim 2). 200 ml/dk hava akımı sağlanarak her bir sigara, duman makinesinde

yaklaşık 4 dakikada tüketiliyordu. Ancak dumanın kabine dağılımı yaklaşık 6 dakika

sürüyordu. Çalışmamızda 12 dakikada 1 sigara, duman makinasına takılıp 1 saatte 5 sigara,

günde ise 10 adet sigara tüketildi.

Resim 1: C. F. Palmer’in duman makinası

30

Resim 2: Çalışmamızda kullanılan pleksiglastan yapılmış kabin

Çalışmamızda Türk tütününden yapılmış Samsun 216® sigarası kullanıldı. Bu sigarada

katran 10 mg, nikotin 0.8 mg ve karbonmonoksit 10 mg’dır.

20 adet deney hayvanı her bir grupta 10 hayvan olmak üzere 2 gruba ayrıldı:

1. GRUP: 10 adet deney hayvanı kendi içerisinde rastgele 5’erli iki gruba ayrıldı. 5

adet deney grubu sıçan, 45 gün boyunca, sabah ve öğlenden sonra olmak üzere iki farklı saat

diliminde, birer saat sigara dumanına maruz bırakıldı (Resim 3). 5 adet kontrol grubu sıçan

ise sigara dumanına maruz bırakılmayıp, deney saatinde aynı oda koşullarında kabinlerinde

bırakıldı. 1. Gruptaki kontrol hayvanlarından biri çalışmanın 8. gününde bilinmeyen bir

sebepten dolayı öldü. Çalışmaya 4 adet 1. Grup kontrol hayvanı ile devam edildi.

Deney Grubu 5 adet sıçan

45 gün çevresel sigara dumanına maruz bırakılan sıçanlar

1. Grup

10 adet sıçan Kontrol Grubu 5 adet sıçan

1. Grubun kontrolü

Deney Grubu 5 adet sıçan

90 gün çevresel sigara dumanına maruz bırakılan sıçanlar

2. Grup

10 adet sıçan Kontrol Grubu 5 adet sıçan

2. Grubun kontrolü

Tablo 2: Çalışmada kullanılan sıçan grupları

31

Resim 3: Sigara dumanına maruz bırakılan deney grubu sıçanlar

2. GRUP: 10 adet deney hayvanı kendi içerisinde rastgele 5’ erli iki gruba ayrıldı. 5

adet deney grubu sıçan 90 gün boyunca, sabah ve öğlenden sonra olmak üzere iki farklı saat

diliminde, birer saat sigara dumanına maruz bırakıldı. 5 adet kontrol grubu sıçan ise sigara

dumanına maruz bırakılmayıp, deney saatinde aynı oda koşullarında kabinlerinde bırakıldı.

Birinci ve ikinci grup deney ve kontrol grubu sıçanları, 45 ve 90 gün sonunda, yüksek

doz ketamin anestezisi ile sakrifiye edildi. Takiben larenksleri disseke edilerek çıkarıldı.

Diseksiyon sırasında mukoza bütünlüğü bozulmadan glottis bölgesi çıkartılarak % 10’luk

formaldehit solüsyonuna kondu. 2. Gruptaki kontrol sıçanlardan birinin glottis bölgesi disseke

edilirken vokal kord ön kısmı zarar gördüğü için çalışmaya dahil edilmedi. Solüsyonda

bekletilen preparatlar 5 mikron kalınlığında kesitlere bölünerek hematoksilen-eozin ile

boyanarak ışık mikroskobu altında 10, 40, 100’lük büyütme altında muhtemel histopatolojik

değişiklikler açısından incelendi. Değerlendirilen histopatolojik değişikler; epitel dağılımı,

enflamasyon miktarı, hiperplazi ve metaplazi dağılımlarını içermekteydi.

Çalışmaya alınan olgularda Ki-67 ekspresyonunu belirlemek amacıyla parafin

bloklardan 5 mikrometre kalınlığında hazırlanan kesitler ‘Poly-L-Lysine’ li lamlara alındı. Ki-

67 (SP6) (Neomarkers, USA) için, kullanıma hazır tavşan monoklonal antikoru ile

immünohistokimyasal boyama prosedüru uygulandı.

Etüvde bütün gece 50˚C de bırakılan kesitler, deparafinizasyon amacıyla, üç kez 5

dakika ksilende ve iki kez 10 dakika absolü alkolde bekletildi. Daha sonra rehidratasyon için

bir dakika da distile suda bekletildi. 1/10 oranında distile su ile sulandırılan antijen retrieval

solüsyonu (sitrat buffer), önce mikrodalgada 750 watt’da 2 dakika, sonra 350 watt’da otuz

32

saniye bekletildi. Daha sonra 15 dakika boyunca beşer saniye aralar ile 160 watt’da otuz

saniye bekletildi. Mikrodalgadan çıkarılan kesitler oda sıcaklığında 20 dakika tutulduktan

sonra, distile su ile yıkandı. Endojen peroksidaz aktivitesini inhibe etmek için, % 3’lük

hidrojen peroksit ile 20 dakika inkübe edildi.

Kesitler distile su ile iki kez birer dakika yıkandı. Ki-67 monoklonal antikoru ile oda

sıcaklığında 60 dakika inkübe edildi. TBS (Tris buffer saline) ile üç kez beşer dakika

yıkandıktan sonra, LabVision yöntemi ve Mayer hemotoksilenle zıt boyama işlemi yapılarak

boyama tamamlandı.

İmmunreaktivite değerlendirilmesi

Ki-67:

Hücresel proliferatif aktivitenin değerlendirilmesi için x400 büyütmede 100 hücre

sayılmıştır. Bunlar arasında kahverengi nükleer boyanma pozitif kabul edilmiştir ve her olgu

için pozitif boyanan hücrelerin yüzdesi elde edilmiştir.

İstatistiksel Analiz

Verilerin istatistiksel analizinde; kronik mononükleer hücre infiltrasyonunun

karşılaştırılmasında Mann Withney U testi, deney grubu hayvanlarının vokal kordunun Ki-67

ile immunohistokimyasal boyanma yüzdelerinin karşılaştırılmasında ‘Student-T’ testi

uygulanmıştır. P<0.05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. İstatistiktel analiz

için ‘Graphpad Prism 4.0’ bilgisayar programı kullanılmıştır.

33

BULGULAR Çalışmamızda çevresel sigara dumanına maruz bırakılan deney grubu sıçanlarda, maruz

kaldıkları 1 saatin son 15-20 dakikasında kabin içerisinde sıçrama şeklinde agresif davranışlar

gösterdiklerini gözlemledik. Kontrol grubu sıçanlarda ise böyle bir durum gözlenmedi. Her iki

grup deney ve kontrol sıçanlarında yem ve su tüketimi açısından bir fark gözlenmedi.

HİSTOPATOLOJİK BULGULAR

1. VE 2. GRUP KONTROL SIÇANLARI 1. ve 2. Grup kontrol sıçanlarının glottik bölgesinin histopatolojik incelemesinde 3 farklı

tip epitele rastlanılmıştır (Resim 4).

Ventral kısım yalancı çok katlı silli epitel yapısı gösteriyordu. Bu kısmın lamina propriası,

az kollajen ve elastik liflerin olduğu, fibroblast, mast hücresi ve makrofajların olduğu gevşek

bağ dokusu yapısında idi.

Vokal kordların serbest kenarına yakın bölgesi tabakalanması yalancı çok katlı silyasız

kolumnar epitel yapısı gösteriyordu. Lamina propriası daha yoğun bir bağ dokusu yapısında

idi (Resim 5).

Vokal kordun aritenoid kıkırdağa yakın orta kısmı çok katlı yassı epitelden oluşuyordu.

(Resim 6). Bu epitel aritenoid kıkırdak üst kısımda daha ince iken, orta kısımda daha kalındı.

Lamina propria ise az kollajen ve elastik liflerin olduğu, fibroblast, kan damarları ve

makrofajlardan meydana gelen gevşek bağ doku yapısında idi.

Glottisin dorsal bölgesi çok katlı yassı epitel yapısında idi. Bu bölgenin epiteli kesitlerin

geçtiği düzleme göre kübik epitel de olabiliyordu.

1. Grup kontrol sıçanlarının larenks epitelinde değişen derecelerde kronik mononükleer

hücre infiltrasyonu mevcuttu (Tablo 3).

1. Grup 1. Kontrol

hayvanı

1. Grup 2. Kontrol

hayvanı

1. Grup 3. Kontrol

hayvanı

1. Grup 4. Kontrol

hayvanı

++ + +++ +

Tablo 3: 1. Grup kontrol hayvanlarındaki kronik mononükleer hücre infiltrasyonu derecesi

2. Grup kontrol sıçanlarının da larenks epitelinde değişen derecelerde kronik

mononükleer hücre infiltrasyonu mevcuttu ( Tablo 4).

2. Grup 1. Kontrol

hayvanı

2. Grup 2. Kontrol

hayvanı

2. Grup 3. Kontrol

hayvanı

2. Grup 4. Kontrol

hayvanı

+++ + ++ +

Tablo 4: 2. Grup kontrol hayvanlarındaki kronik mononükleer hücre infiltrasyonu derecesi

34

Resim 4: Normal sıçan larenksinin glottis bölgesinin ışık mikroskobik görüntüsü Dışta Tiroid kıkırdak, elips şeklinde çizilen kısım vokal kord serbest kenarı, diktörtgen şeklinde çizilen kısım aritenoid kıkırdak ve vokal kord orta kısmını göstermektedir. (H&E, x 100)

Resim 5: Vokal kord serbest kenarındaki yalancı çok katlı silyasız kolumnar epitel (H&E, x200)

35

Resim 6: Aritenoid kıkırdak medialindeki vokal kord orta kısmında çok katlı yassı epitel (H&E, 200)

1. GRUP DENEY SIÇANLARI (45 GÜN MARUZİYET) Epitel tipi ve dağılımı kontrol grubu sıçanlarla benzerlik gösteriyordu.

Sigara dumanına maruz bırakılan sıçanlarda vokal kord serbest kenarında patolojiye

rastlanılmadı. Bu grubun deney hayvanlarının birinde vokal kord orta kısmındaki çok katlı

yassı epitelde keratinizasyonla karakterize metaplazi mevcuttu (Resim 7, 8). Ayrıca 1 deney

hayvanı kesitinde vokal kord orta kısmında epitelde hafif hiperplazi mevcut idi.

Resim 7: Çevresel sigara dumanına 45 gün maruz bırakılan 1. Grup sıçanların vokal kord orta kısmında gözlenen keratinize metaplazi (H&E, x100)

36

Resim 8: Çevresel sigara dumanına 45 gün maruz bırakılan 1. Grup sıçanların vokal kord orta kısımlarında

gözlenen keratinize metaplazi (H&E, x200)

1. Grup deney sıçanlarının larenks epitelindeki kronik mononükleer hücre infiltrasyonu

dereceleri Tablo 5’ te gösterilmiştir.

1. Grup 1. deney

hayvanı

1. Grup 2. deney

hayvanı

1. Grup 3. deney

hayvanı

1. Grup 4. deney

hayvanı

1.grup 5. deney hayvanı

+ + + + +

Tablo 5: 1. Grup deney hayvanlarındaki kronik mononükleer hücre infiltrasyonu derecesi

2. GRUP DENEY SIÇANLARI ( 90 GÜN MARUZİYET)

Epitel tipi ve dağılımı kontrol grubu sıçanlarla benzerlik gösteriyordu.

Vokal kord serbest kenarında, 1. Grupta olduğu gibi patolojiye rastlanılmadı. Bu grubun

deney hayvanlarının birinde, vokal kord orta kısmındaki çok katlı yassı epitelinde ise sigara

dumanına 45 gün maruz bırakılan sıçanlarda gözlenen keratinize metaplazi değişikliği

mevcuttu (Resim 9). Ayrıca sigara dumanına 45 gün maruz bırakılan gruptaki hayvanlardan

farklı olarak bu gruptaki 2 deney hayvanı kesitinde vokal kord orta kısımda orta derecede

hiperplazi ve 1 deney hayvanı kesitinde parakeratoz mevcut idi (Resim 9-10).

37

Resim 9: Çevresel sigara dumanına 90 gün maruz bırakılan 2. Grup sıçanların vokal kord orta kısımlarında gözlenen keratinize metaplazi ve parakeratoz (H&E, x400)

Resim 10: Çevresel sigara dumanına 90 gün maruz bırakılan 2. Grup sıçanların vokal kord orta kısımlarında

gözlenen hiperplazi (H&E, x400)

2. Grup deney hayvanlarının larenks epitelinde değişen derecelerde kronik mononükleer

hücre infiltrasyonu mevcut idi (Tablo 6).

2. Grup 1. deney

hayvanı

2. Grup 2. deney

hayvanı

2. Grup 3. deney

hayvanı

2. Grup 4. deney

hayvanı

2.grup 5. deney hayvanı

++ ++ ++ +++ ++

Tablo 6: 2. Grup deney hayvanlarındaki kronik mononükleer hücre infiltrasyonu derecesi

38

Kronik mononükleer hücre infiltrasyonu açısından 1. grup deney hayvanları ile 1. grup

kontrol hayvanları arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunamamıştır (p=0.20). 2. grup

deney hayvanları ile 2. grup kontrol hayvanları arasında da istatistiksel olarak anlamlı fark

bulunamamıştır (p=0.41). Ancak 1. grup deney hayvanları ile 2. grup deney hayvanları

arasında istatistiksel olarak ileri derecede anlamlı olarak fark bulunmuştur (p=0.007).

İMMUNOHİSTOKİMYASAL BOYANMA BULGULARI

Hücresel proliferatif aktivitenin değerlendirilmesi için x400 büyütmede 100 hücre

sayılmıştır. Bunlar arasında kahverengi nükleer boyanma pozitif olarak kabul edilmiş ve

pozitif boyanan hücrelerin yüzdesi elde edilmiştir. Normal sıçan vokal kordunda Ki-67

ekspresyonunu hesaplamak için kontrol grubu sıçanlardan biri çalışmaya dahil edildi ve vokal

kordunda 400 büyütmede 7-8 Ki-67 ile boyalı hücre (% 7-8) sayıldı.

Kontrol grubu sıçanlarda Ki-67 ekspresyonunu hesaplamak için yapılan boyamada, vokal

kord epitelinin bazal tabakasındaki boyanmanın bazı alanlarda olduğunu gözlemledik. Oysa

larenks dorsalindeki farenks ve özofagus epitelinde, bütün alanlarda bazal tabakada Ki-67

boyanmasını gördük.

Kontrol grubu sıçanların vokal kord epiteli bazal tabakası tek sıra şeklinde Ki-67 ile

boyanıyordu ve bazal tabakadaki bu boyanma lümende tüm epitel boyunca devam etmiyordu.

Çevresel sigara dumanına maruz bırakılan 1. Grup deney hayvanlarının vokal kord epitelinin

bazal tabakasında 1-2 hücre kalınlığında Ki-67 boyanması gözlendi ve bu boyanma bazal

tabakada devamlılık göstermiyordu (Resim 11). 2. Grup deney hayvanlarının vokal kord

epitelinin bazal tabakasında ise Ki-67 boyanması proliferatif aktivite olan kısımda devamlılık

gösteriyordu ve bazal tabakada 2-3 hücre kalınlığında bir boyanma mevcut idi (Resim 12).

Deney hayvanlarındaki Ki-67 ekspresyonu oranları aşağıda gösterilmiştir (Tablo 6).

Deney grubu sıçanlar Ki-67 ile boyanma yüzdesi Deney grubu sıçanlar Ki-67 ile boyanma yüzdesi

1. grup 1. deney hayvanı % 4 2. grup 1. deney hayvanı % 25

1. grup 2. deney hayvanı % 7 2. grup 2. deney hayvanı % 27

1. grup 3. deney hayvanı % 12 2. grup 3. deney hayvanı % 11

1. grup 4. deney hayvanı % 2 2. grup 4. deney hayvanı % 15

1. grup 5. deney hayvanı % 1 2. grup 5. deney hayvanı % 38

Tablo 7: 1. ve 2. grup deney grubu hayvanların Ki-67 ekspresyon oranları

Ki-67 ekspresyonu açısından 1. ve 2. grup deney hayvanları arasında istatistiksel olarak

ileri derecede anlamlı olarak fark bulunmuştur (p=0.003).

39

Resim 11: 1. Grup deney hayvanları vokal kord orta bölümünde bazal tabakadan yukarıya doğru artan Ki-67

aktivitesi. Ki-67 ekspresyonu: % 12 ( x400)

Resim 12: 2. Grup deney hayvanları vokal kord orta bölümünde bazal tabakadan yukarıya doğru artan Ki-67

aktivitesi. Ki-67 ekspresyonu: % 27 ( x400)

40

TARTIŞMA

Dünya Sağlık Örgütü’ne göre tütün kullanımı, dünyada ölümlerin 2. büyük nedenidir

ve tütün kullanımı dünya çapında her on yetişkinden birinin ölümünden sorumludur. Bu

şekilde devam ederse 2020 yılına kadar her yıl 10 milyon kişinin ölümüne sebep olacaktır.62

1985’te uluslararası uzman çalışma grubu, sigara içme ile akciğer, oral kavite, farenks,

larenks, özofagus, pankreas, mesane ve renal pelvis kanserleri arasında pozitif bir korelasyon

kurmuştur.20 Onyedi yıl sonra, yeni epidemiyolojik kanıtlara dayanarak, başka bir uluslararası

uzman çalışma grubu, sigara içmenin ek olarak nazal kavite, paranazal sinüs, nazofarenks,

karaciğer, mide, böbrek ve serviks kanserine neden olabileceğini ifade etti.21

İstemsiz sigara içme, pasif içicilik veya çevresel sigara dumanı sigara içmeyen kişinin

sigara dumanına maruz kalması olarak tanımlanır. Çevresel sigara dumanı ana akım ve yan

akım dumanından oluşmaktadır. Çevresel sigara dumanının kimyasal içeriği aktif içicilerin

çektiği sigara dumanından farklıdır. Bazı kanserojenler yan akım dumanında ana akım

dumanına göre daha yüksek konsantrasyonda bulunmaktadır. Çevresel sigara dumanının

insanlarda birçok zararlı etkisi vardır. Sigara içmeyen eşlerin evde sigara içen kişilerin

dumanına maruz kaldığı durumda % 20-30 oranda akciğer kanseri olma riskinin arttığı

saptanmıştır.45

Vineis ve arkadaşları çevresel sigara dumanı ve sigarayı bırakan ve hiç sigara

kullanmayanlarda respiratuvar kanser ve KOAH riskini araştırmışlardır. Bu çalışmaya

katılanların % 40.8’i sigara içmemiş ve sigara içmiş ama 10 yıldır kullanmayanlardan

oluşmaktaydı. Bu grubun 7 yıllık takiplerinde 97 kişide akciğer kanseri, 20 kişide farenks ve

larenks kanseri geliştiğini, 14 kişinin de KOAH’dan öldüğünü bildirmişlerdir. Ayrıca

çocukluk çağında çevresel sigara dumanına maruz kalma sıklığı ile yetişkin dönemde akciğer

kanseri olma riski ilişkisi göstermişlerdir.56

Çalışmamızda, deney grubu sıçanlar günde 2 kez boyunca birer saat çevresel sigara

dumanına maruz bırakıldı. İlk grup 45, ikinci grup 90 gün sonunda sakrifiye edilip çevresel

sigara dumanının vokal kordlar üzerine etkileri kontrol grubu ile karşılaştırılarak araştırıldı.

Bu çalışmada deney hayvanı olarak kullanılan sıçanların larenksleri, deneysel model olarak

oldukça sık kullanılmaktadır. Kurita ve arkadaşlarına göre insan ve sıçan vokal kordlarının

yoğunluğu ve membranöz kısımları arasında farklılıklar mevcuttur; ancak her ikisinin de

lamina propriası 3 kısma ayrılır. Bunlar; az fibröz bileşeni olan süperfisyel tabaka, süperfisyel

tabakaya göre daha çok fibröz bileşeni olan intermediate tabaka ve daha fazla kollajen ve

elastik liflere sahip derin tabakadır.33

41

Larenks üzerine çalışan araştırmacılar arasında tartışmalı olan bir diğer konu da glottis

bölgesinin farklı epitel çeşitlerinin dağılımıdır. 1977’de Smith, sıçan larenks anatomi ve

histolojisini araştırdığı çalışmada vokal kordlarda çok katlı yassı epitel ve silyasız kolumnar

epitel varlığını fark etmiş ve silyasız kolumnar epitelin vokal kord dorsal kısımda

bulunduğunu gözlemlemiştir.50 1980 yılında Lewis ve arkadaşları sıçan larenks epitelini

incelediği çalışmada, vokal kordun 2 hücre tabakası kalınlığında yassı epitelle döşeli

olduğunu ve vokal korda yakın bazı yerlerde yalancı çok katlı kübik epitel olduğunu

göstermiştir.35 Walker ve arkadaşları yaptıkları çalışmada larenksteki değişik epitel tipleri

arasındaki farklı geçişleri incelemişlerdir. Yalancı çok katlı silyasız kolumnar epiteli, tiroid

kıkırdağa yakın olarak gözlemlemişler ve bu alanın vokal kordun serbest kenarını içerdiğini

göstermişlerdir. Vokal kord orta kısmının çok katlı yassı epitele değiştiğini, bu epitelin

kalınlığının ince olduğunu, dorsal bölgede ise kalınlaştığını göstermişlerdir.57 Duarte ve

arkadaşlarının pasif içiciliğin sıçan vokal kordları üzerine etkilerini araştırdıkları çalışmada,

larenks kesitlerinde vokal kord lokalizasyonunda 3 farklı tip epitel gözlemiştir: Vokal kord

orta kısım ve larenks dorsalinde çok katlı yassı epitel; vokal kord serbest kenarında yalancı

çok katlı kolumnar epitel ve larenks ventralinde yalancı çok katlı silyalı kolumnar epitel.8

Bizim çalışmamızda da glottis bölgesinde 3 tip epitel gözlemledik:

Vokal kordların serbest kenarına yakın bölgesi yalancı çok katlı silyasız kolumnar epitel;

vokal kord orta bölümünde 2-3 tabakalı yassı epitel gözlendi ve bu epitel dorsal kısımda da

mevcuttu. Larenks ventralinde ise yalancı çok katlı silyalı kolumnar epitel mevcuttu.

Sıçan larenksindeki her bölge çok küçük olduğundan ve epitel tipleri geçiş

bölgelerinde değişkenlik gösterdiğinden epitel tiplerinin sınıflandırılmasına ihtiyaç

duyulmaktadır.8 Biz de deneysel çalışmamızda, histolojik kesit düzlemleri konusunda

zorluklar yaşadık. Larenks piyeslerinde glottik bölgeyi çıkarıp histopatolojik olarak

incelediğimizde, bu bölgenin çok küçük bir bölge olduğunu gördük. Ayrıca parafin bloklardan

alınan kesitlerin hepsinde aynı düzlemin bulunması konusunda zorluklar yaşadık. Hatta bazı

bloklardan aynı histolojik düzlemi bulmak için birden fazla kesit aldık ve bu kesitlerde

epitelin hızlı geçiş özelliğini saptadık.

Duarte ve arkadaşlarının sıçanlarda pasif içiciliğin vokal kordlar üzerine etkilerini

inceledikleri çalışmalarında deney hayvanlarını maruziyet süresi açısından 3 gruba

ayırmışlardır. 25, 50 ve 75 gün pasif sigara dumanına maruz bırakılan sıçanlarda, vokal

kordlarda hiperplazi ve metaplazi saptanmıştır. Vokal kord orta kısım skuamöz epitelinde

hiperplazi 3 çalışma grubunda da gözlenmiştir. Vokal kord serbest kenarında metaplazik

değişim yine 3 çalışma grubunda da saptanmıştır. Vokal kord orta kısımdaki epitelde

42

keratinizasyonla karakterize skuamöz metaplazi 50 ve 75 gün maruziyetten sonra

gözlenmiştir.8

Meade ve arkadaşlarının, sigara dumanına maruz bırakılan sıçanlarda A vitamininin

etkilerini araştırdıkları çalışmada, maruziyetten 6 hafta sonra sıçan larenksinde skuamöz

metaplazi görmüşler ve bu durumun A vitamini eksikliğinde daha erken olabileceğini rapor

etmişlerdir.37

Haussmann ve arkadaşlarının sıçanlarda 3 farklı konstantrasyonda karbonmonoksid

kullanarak yaptıkları çalışmada vokal kord serbest kenarındaki hiperplazi ve skuamöz

metaplazinin doz bağımlı olmadığını, vokal kord orta kısımdaki skumöz hiperplazinin doz

bağımlı olduğunu göstermişlerdir.15

Işık ve arkadaşlarının çevresel sigara dumanının sıçanlar üzerine etkilerini

araştırdıkları çalışmada sıçanlar 2 ay boyunca günde 2 saat çevresel sigara dumanına maruz

bırakılmış ve vokal kordları üzerine etkileri elektron mikroskobuyla incelenmiştir. Sigaraya

maruz kalan sıçanların tümünün vokal kordunun epitelinde katmanlaşmada bozulma

saptanmıştır. Bazı hücrelerde hücreler arası desmosom bağlantılarında kayıp ve intersellüler

aralıkta genişleme sergilenmiştir. Lüminal yüzeydeki süperfisyal hücrelede bozulma ve

keratinizasyon gözlenmiştir.22

Smith ve arkadaşlarının sigara dumanına maruz bırakılan sıçanların larenks ve

trakealarını inceledikleri elektron mikroskobu çalışmasında sıçanlar, 3 ile 4 hafta farklı

konsantrasyonda sigara dumanına maruz bırakılmış ve vokal kordlarda skuamöz metaplazi

gözlenmiştir.49

Bizim çalışmamızda ise 45 ve 90 gün maruz bırakılan 1. ve 2. Gruptaki sıçanların

vokal kord orta kısımdaki epitelde keratinizasyonla karakterize skuamöz metaplazi saptadık.

Vokal kord orta kısmında ise 1. Grupta hafif, 2. Grupta orta derecede hiperplazi ve

parakeratoz gözlemledik. Fakat vokal kord serbest kenarında herhangi bir patolojiye

rastlamadık.

Hücre proliferasyonunu değerlendirmede immunohistokimya, uygulamadaki kolaylık

ve sonuçların daha hızlı elde edilmesi nedeniyle diğer yöntemlerden daha üstündür.

Anti-PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) ve Ki-67 proliferatif aktivite

değerlendirilmesinde en yaygın kullanılan iki antikordur.5,64

Çalışmamızda Ki-67 immunohistokimyasal belirleyicisi kullanarak çevresel sigara

dumanının sıçan vokal kordlarına etkilerini, objektif veriler sağlayarak değerlendirmeyi

amaçladık.

43

Normal larengeal epitelde Ki-67 ekspresyonu yaygın olarak bazal tabaka çevresinde

izlenirken, Lin ve arkadaşları, şiddetli displazi içeren olgular ile yaptıkları çalışmada, Ki-67

ekspresyonunun kontrolsüz hücre proliferasyonu gösteren larengeal epitelin tüm kalınlığı

boyunca olduğunu saptamışlardır.36

Homann ve arkadaşlarının sıçanlarda asetaldehitin üst gastrointestinal sistem

mukozasında hücre rejenerasyon ve farklılaşması üzerine etkilerini incelemiş ve sıçanlara

asetaldehit vererek dil, epiglot ve mide mukozasındaki epitel kalınlığı ve proliferasyon

aktivitesini analiz etmiştir. Proliferasyon işaretleyicisi olarak sitokeratin 14 ve Ki-67

kullanmıştır. Kontrol grubu sıçanlarda epiglot epitelinde bazal tabakada tek hücre kalınlığında

Ki-67 boyanması görülmüştür ve bu boyanma epitelin tüm bazal tabakası boyunca devam

etmemiştir.17 Bizim çalışmamızda da kontrol grubu sıçanların vokal kord epitelinin bazal

tabakasında tek hücre kalınlığında Ki-67 ile boyanmış bazal hücreler görülmüştür ve yine

boyanma tüm lümen epiteli boyunca devamlılık göstermiyordu. Aynı çalışmada asetaldehit

içirilen sıçanlarda ise epiglot epiteli bazal tabakasında 2-3 hücre kalınlığında Ki-67

boyanması gözlenmiştir. Bizim çalışmamızdaki boyanma paterni de bu çelışmaya benzerlik

gösteriyordu.

Zidar ve arkadaşlarının Kambic-Lenart sınıflamasını kullanarak basit, anormal ve

atipik hiperplazi olarak derecelendirilmiş; larengeal epiteliyal hiperplastik-displastik

lezyonlarda Ki-67 ekspresyonu konusunda yaptıkları bir çalışmada, basit hiperplazide sadece

bazal tabakada, anormal ve atipik hiperplazide ise epitelin suprabazal kısmında da belirgin

olan anlamlı bir boyanma gözlemişlerdir. Çalışma sonucunda epitelin proliferatif bölümünün

hiperplazinin derecesiyle paralel bir artış gösterdiği izlenmiştir.64

Krecicki ve arkadaşlarının larenksin epitelyal lezyonlarında EGFR (Epidermal Growth

Factor Receptor), PCNA ve Ki-67 antijeni ekspresyonunu araştırdıkları çalışmada normal,

hiperplastik ve displastik lezyonlarda Ki-67 ve PCNA nın pozitif boyanmasının epitelin bazal

ve parabazal hücrelerle sınırlı olduğunu ve PCNA ve Ki-67 skorunun displazinin şiddeti ile

arttığını gözlemlemişlerdir. Ayrıca tümör dokusunda heterojen hücre topluluğu olduğundan

dolayı hücre proliferasyon işaretleyicilerinin tümörün proliferatif hızını yansıtamayacağını

saptamışlardır. Bu nedenle değişik antijen çeşitlerini tanıyan farklı antikorları kullanarak

değişik sonuçlar elde edilebileceğini düşünmüşlerdir.32

Chatrath ve arkadaşlarının larenksin skuamöz epitelyal lezyonlarında Mcm-2

(Minichromosome Maintenance Deficient 2) ve Ki-67 nin ekspresyonunu araştırmışlardır.

Anormal veya atipik hiperplazi lezyonlarında Ki-67 ekspresyonunu epitelin alt ve orta 1/3’

nde, karsinoma in situda epitelin yüzeyel tabakasına uzandığı ve solunum epiteli olan

44

bölgelerde gözlenen skuamöz metaplazide ekspresyonun epitelin tüm katlarına ulaştığını

gözlemlemişlerdir.4

Bizim çalışmamızda çevresel sigara dumanına maruz bırakılan hayvanlarda gözlenen

hiperplazide bazal tabada ve kısmen suprabazal tabakada Ki-67 boyanması mevcut idi ve bu

boyanma 2. grupta 1. Gruba göre istatistikel olarak daha anlamlı idi.

Ioachim ve arkadaşlarının larenksin benign, premalign ve malign lezyonlarında

glikoprotein CD44 ekspresyonunun Rb (Retinoblastom), p53, Ki-67 ve PCNA ile ilişkisini

araştırdıkları çalışmada Ki-67 ve PCNA için patolojik lezyonlar arasında istatistik olarak

anlamlı farklılıklar bulmuşlardır. Bu anlamlı farkın in sutu ve invazif lezyonlarda en yüksek

değere ulaştığını gözlemlemişler.18 Yine aynı yazarın larengeal epitelyal lezyonlarda Siklin

D1 ve E ekspresyonunun p53, pRb, Ki-67 ve PCNA ile ilişkisini araştırdıkları çalışmada

keratoz vakalarındaki hücre proliferasyonunda, Siklin D1 ile Ki-67 ve PCNA ekspresyonu

ilişkili saptanmıştır.19

Bizim çalışmamızda ise 1. grupta gözlenen keratinize metaplazide Ki-67 ekspresyonu

düşük saptanmıştır. Bunu epitelin metaplazi olduktan sonra proliferasyon yapmayıp stabil

hale geldiği şeklinde yorumladık. Oysa 2. grup hayvanların vokal kordlarında maruziyete

devam ettiği için bu grupta Ki-67 ekspresyonu yüksek saptanmıştır.

Gallo ve arkadaşlarının çalışmasında, larenksin preneoplastik lezyonlarının

progresyonunu tahmin etmek için Ki-67 ve p53 proteini kullanılmıştır. Çalışmada Ki-67

ekspresyonunun maligniteye transforme olan ve olmayan lezyonlarda epiteliyal hiperplazi ve

displazinin artan derecesine paralel olarak artış gösterdiği gözlenmiştir.10

Cör ve arkadaşlarının larenksin epitelyal hiperplastik lezyonlarının kantitatif

patolojisini araştırdıkları çalışmada Ki-67 immunreaktivitesi de basit, anormal, atipik

hiperplazi ve karsinoma in situ vakalarında karşılaştırılmıştır. Sonuçta Ki-67 pozitif hücre

sayısı açısından basit ve atipik hiperplazi, anormal ve atipik hiperplazi ve karsinoma in situ ile

basit veya anormal hiperplazi arasında istatistiksel olarak anlamlı fark olduğu gösterilmiştir.5

Şengiz ve arkadaşlarının larenksin preinvaziv epitelyal lezyonlarında uygulanan

Dünya Sağlık Örgütü ve Ljubljana sınıflandırmalarının Ki-67, p53 ve CD34 kullanılarak

karşılaştırdığı çalışmada Ki-67 ekspresyonu ile artan histolojik dereceler arasında anlamlı bir

sonuç etmişlerdir. Ayrıca Ki-67 ve p53 ekspresyonları ile olguların artan histolojik dereceleri

arasında benzer şekilde pozitif yönlü bir korelasyonun saptanması, bu antikorların larenksin

preneoplastik lezyonlarının progresyonunu tahmin etmede yardımcı belirleyici olarak

kullanabileceğimizi göstermişlerdir.52

45

Çalışmamızdaki deney grupları arasında Ki-67 ekspresyonu açısından istatistiksel

olarak anlamlı bir fark bulunmuştur.

Biz, çevresel sigara dumanının sıçanlarda vokal kord üzerine etkilerini literatür

bilgileri ile tartıştık ve çıkan sonuçları proliferasyon işaretleyicilerinden biri olan Ki-67 ile

analiz ettik.

Çalışmamızın sonucunda çevresel sigara dumanının masum olmadığını, içerdiği

birçok toksik ve kanserojen maddenin etkisiyle deney hayvanlarının vokal kordunda patolojik

değişikliklere yol açtığını gözlemledik. Bu maruziyetin devam etmesi durumunda kanserojen

etki yapabileceğini düşündük. Deney hayvanlarında gözlenen patolojik değişiklikleri Ki-67

immunohistokimyasal işaretleyicisi ile analiz edip proliferatif aktiviteyi değerlendirdiğimizde

de uzun süreli maruziyette vokal kordlarda, bazal tabakadaki aktivitenin patolojiyle beraber

arttığını gözlemledik. Buradan yola çıkarak insanlarda gözlenen hiperplazi, displazi,

karsinoma in situ gibi larengeal epitelyal lezyonlarda Ki-67 ekspresyonu bakılarak lezyonun

agresivitesi hakkında bilgi edinilebilir.

46

SONUÇ

Çalışmamızda vokal kordlarda metaplazi, hiperplazi, parakeratoz ve kronik iltihap

mevcudiyeti histopatolojik olarak araştırıldı. Kronik iltihap açısından 1. ve 2. Grup deney ve

kontrol hayvanları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı (p=0.20, p=0.41).

Fakat 1. ve 2 Grup deney hayvanları arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark bulunmuştur

(p=0.007). Hiperplazi 1. Grupta 1 deney hayvanı kesitinde, 2. Grupta ise 2 deney hayvanı

kesitinde gözlendi. Parakeratoz, 2. Deney grubu sıçanların birinde parakeratoz gözlenirken 1.

Gruptaki deney hayvanlarının hiçbirinde bu patolojiye rastlanılmadı. Metaplazi 1. ve 2. deney

grubunda 1 deney hayvanında gözlendi.

Çalışmamızda ayrıca vokal kordlardaki proliferatif aktivite tayini için Ki-67 ile

immunohistokimyasal boyanma yapıldı. Ki-67 ile immunohistokimyasal incelemede ise kısa

süreli sigara dumanına maruz kalan deney hayvanlarının vokal kordu epitelinin bazal

tabakasında proliferatif aktivite pek artmazken, uzun süreli sigara dumanına maruz kalan

deney hayvanlarının vokal kordu epitelinin bazal tabakasında proliferatif aktivitenin arttığını

gözlemledik ve bu artış istatistiksel olarak gruplar arasında anlamlı bir fark olarak gözlendi.

(p=0.03).

47

ÖZET

Amaç: Çevresel sigara dumanının vokal kordlar üzerine etkilerinin sıçanlarda histopatolojik

ve immunohistokimyasal yöntemle araştırılması.

Materyal ve Metod: Çalışma 20 adet sağlıklı, dişi, Wistar Albino sıçan üzerinde yapıldı. 20

adet deney hayvanı her bir grupta 10 hayvan olmak üzere iki gruba ayrıldı. Bu iki grup ta

kendi içerisinde deney ve kontrol olmak üzere iki alt gruba ayrıldı. 1. Grup deney sıçanları 45

gün, 2. Grup deney sıçanları 90 gün duman makinesi yardımıyla çevresel sigara dumanına

maruz bırakıldı. Çalışma sonunda deney ve kontrol grubu sıçanların larenksleri disseke edilip,

%10’luk formaldehit çözeltisinde fikse edilerek, rutin takip sonrası ışık mikroskopunda vokal

kordlardaki muhtemel histopatolojik değişiklikler açısından incelendi. Bu incelemede deney

grubundaki sıçanların vokal kordundaki epitel dağılımı, enflamasyon miktarı, hiperplazi ve

metaplazi varlığı ve şiddeti kontrol grubu ile karşılaştırılmak üzere incelendi. Takiben

çalışmaya alınan olgularda Ki-67 ekspresyonunu belirlemek amacı ile parafin bloklardan 5

mikrometre kalınlığında hazırlanan kesitler peroksidaz yöntemiyle Ki67 antikoru ile boyama

yapılarak proliferatif aktivite ışık mikroskopunda incelendi.

Bulgular: Çalışmamızdaki her iki deney grubu sıçanların vokal kordlarında metaplazi,

hiperplazi ve kronik iltihap gözlendi. Parakeratoz ise sadece 2. Grup deney sıçanlarında

gözlendi. Kronik iltihap açısından 1. ve 2. Grup deney ve kontrol hayvanları arasında

istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı (p=0.20, p=0.41). Fakat 1. ve 2. Grup deney

hayvanları arasında istatistiksel açıdan anlamlı bir fark bulunmuştur (p=0.007). Metaplazi ve

hiperplazi her iki grupta gözlenirken, hiperplazi 2. grupta daha fazla gözlendi.

Çalışmamızda ayrıca vokal kordlardaki proliferatif aktivite tayini için Ki-67 ile

immunohistokimyasal boyanma yapıldı. Gruplar arasında Ki-67 ekspresyonu açısından

istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptandı (p=0.03).

Sonuç: Çevresel sigara dumanının içerdiği birçok toksik ve kanserojen maddenin etkisiyle

deney hayvanlarının vokal kordunda patolojik değişikliklere yol açtığını gözlemledik. Ki-67

ile immunohistokimyasal incelemede ise uzun süreli maruziyette vokal kordlarda, bazal

tabakadaki proliferatif aktivitenin arttığını gözlemledik.

Anahtar kelimeler: Sigara, vokal kord, sıçan.

48

SUMMARY

Purpose: The aim of this study was to investigate the effects of environmental tobacco smoke

on vocal cords of rats through histopathological and immunohistochemical methods.

Materials and Method: The study was performed on a total of 20 healthy, female Wistar-

Albino rats. 20 test animals were divided into two groups of 10 rats in each group. Both

groups were then divided into two sub-groups: experimental and control groups. Both were

exposed to environmental tobacco smoke through a smoke machine: Group 1 rats for 45 days

and Group 2 rats for 90 days. At the end of the study all rats in the experimental and control

groups were subjected to laryngeal dissection. The dissected larynxes were fixated in a 10%

formalin solution and after routine examinations, light-microscope examination was

performed to observe possible histopathological changes in the vocal cords of the animals.

During the examination, epithelial distribution, the amount of inflammation, the presence and

severity of hyperplasia and metaplasia in the vocal cords of the experimental group rats were

evaluated in comparison with those of the control group. Then, in order to determine the Ki-

67 expression in cases included in the study, five-micrometre-thick sections cut from the

parafin blocks were stained with Ki-67 antibody using the peroxidase method and examined

for proliferative activity under a light microscope.

Results: Metaplasia, hyperplasia and chronic inflammation were identified in the vocal cords

of both groups of rats. Parakeratosis was observed in only Group 2. In terms of chronic

inflammation, no statistically significant difference was observed between Group 1 and 2

experimental and control animals (p=0.20, p=0.41). However, a statistically significant

difference was found between Group 1 and 2 experimental animals (p=0.007). While

metaplasia and hyperplasia were observed in both groups, the amount of hyperplasia was

higher in Group 2.

We also studied the proliferative activity in the vocal cords by an

immunohistochemical staining with Ki-67. A statistically significant difference was identified

between the groups in terms of Ki-67 expression (p=0.03).

Conclusion: We observed that, due to its high toxic and carcinogen content, environmental

tobacco smoke caused some pathological changes in the vocal cords of the animals. During

the immunohistochemical examination with Ki-67, it was observed that long-term exposure

increased the proliferative activity in the basal layer of vocal cords.

Keywords: Cigarette, vocal cord, rat.

49

KAYNAKLAR

1. A US Public Health Service Report. A clinical practise guideline for treating tobacco use

and dependence. JAMA 2000; 283:3244-54.

2. Becher H, Zatonski W, Jockel K. Passive smoking in Germany and Poland: Comparison of

exposure levels, sources of exposure, validity, and perception. Epidemiology 1992; 3:509–

14.

3. Brunneman KD, Yu L, Hoffmann D. Assessment of carcinogenic volatile N-nitrosamines in

tobacco and in mainstream and sidestream smoke from cigarettes. Cancer research 1977;

37:3218–22.

4. Chatrath P, Scott IS, Morris LS, Davies RJ, Rushbrook SM, Bird K, Vowler SL, Grant JW,

Saeed IT, Howard D, Laskey RA, Coleman N. Aberrant expression of minichromosome

maintenance protein-2 and Ki67 in laryngeal squamous epithelial lesions. Br J Cancer 2003;

89:1048-54.

5. Cör A, Gale N, Kambic V. Quantitative pathology of laryngeal epithelial hyperplastic

lesions. Acta Otolaryngol 1997; 527:57-61.

6. Dabakoğlu T, Kukner S, Vicdan K, Keleş G, Ergin T, Gökmen O. Smoking, drinking and

drug use in female adolescent. Tr J Med Sci 1993; 19:157-64.

7. Development and Organization of the 1986 Report.

http://www.cdc.gov/TOBACCO/sgr/sgr_1986/SGR1986-Chapter1.pdf.

8. Duarte JL, de Faria FA, Ceolin DS, Cestari TM, de Assis GF. Effects of passive smoke

inhalation on the vocal cords of rats. Rev Bras Otorrinolaringol 2006; 72:210-6.

9. Franceschi S, Bidoli E, Herrero R, Munoz N. Comparison of cancers of the oral cavity and

pharynx worldwide: Etiological clues. Oral Oncol 2000; 35:106- 15.

10. Gallo O, Franchi A, Chiarelli I. Potential biomarkers in predicting progression of epithelial

hyperplastic lesions of the larynx. Acta Otolaryngol 1997; 527:30-8.

11. Gerdes J, Schwab U, Lemke H, Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody

reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer 1983;

31:13-20.

12. Gnepp DR. Diagnostic Surgical Pathology of the Head and Neck. 1st ed. Philadelphia: WB

Saunders; 2000.

13. Golding Jf. Smoking. In Gibson GJ, Geddes DM, Cosabel U, Sterk PJ, Corrin B,editors.

Respiratory Medicine, 3rd revised ed. United Kingdom: Saunders; 2003. p. 445-60.

14. Hastürk S, Yüksel M. Akciğer Kanseri. İstanbul: Özlem Grafik Matbaacılık; 2000.

50

15. Haussmann HJ, Anskeit E, Becker D, Kuhl P, Stinn W, Teredesai A, Voncken P, Walk RA.

Comparison of fresh and room-aged cigarette sidestream smoke in a subchronic inhalation

study on rats. Toxicol Sci 1998; 41:100-16.

16. Hızalan İ. Larenks Kanserleri. Anatomik özellikler ve klinik gidiş. Engin K, Erişen L,

editörler. Baş-Boyun Kanserleri’nde. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri; 2003. p. 345-52.

17. Homann N, Kärkkäinen P, Koivisto T, Nosova T, Jokelainen K, Salaspuro M. Effects of

acetaldehyde on cell regeneration and differentiation of the upper gastrointestinal tract

mucosa. J Natl Cancer Inst 1997; 89:1656-7.

18. Ioachim E, Assimakopoulos D, Goussia AC, Peschos D, Skevas A, Agnantis NJ.

Glycoprotein CD44 expression in benign, premalignant and malignant epithelial lesions of

the larynx: An immunohistochemical study including correlation with Rb, p53, Ki-67 and

PCNA. Histol Histopathol 1999; 14:1113-8.

19. Ioachim E, Peschos D, Goussia A, Mittari E, Charalabopoulos K, Michael M, Salmas M,

Vougiouklakis T, Assimakopoulos D, Agnantis NJ. Expression patterns of cyclins D1, E in

laryngeal epithelial lesions: Correlation with other cell cycle regulators (p53, pRb, Ki-67

and PCNA) and clinicopathological features. J Exp Clin Cancer Res 2004; 23:277-83.

20. IARC, Tobacco smoking. IARC Monographs on the evaluation of the carcinogenic risks of

chemicals to humans. Vol. 38. Lyon: IARC; 1986.

21. IARC, Tobacco Smoke and Involuntary Smoking. IARC Monographs on the evaluation of

the carcinogenic risk of chemicals to humans. Vol. 83. Lyon: IARC; 2004.

22. Işık AC, Kalender Y, Yardimci S, Ergün A. Environmental tobacco smoke in rats. J

Otolaryngol 2004; 33:382-6.

23. Janfaza P, Nadol J, Galla JR, Faban LR, Montgomery WW, editors. Cansız H, çev. ed. Baş

ve Boyunun Cerrahi Anatomisi. İstanbul: Nobel Kitapevleri; 2002.

24. Jha P. Curbing the Epidemic: Governments and the Economics of tobacco control.

Washington: World Bank Publication; 1999.

25. Karlıkaya C. Edirne’de orta öğrenim öğrencilerinde sigara içme prevelansı. Toraks Dergisi

2002; 3:6-12.

26. Kaufman N, Yach D. Tobacco control-chalence and prospects. Bull World Health Organ

2000; 78:867.

27. Kaya S. Larenks Hastalıkları. İzmir: Bilimsel tıp yayınevi; 2002.

28. Kayaalp O. Rasyonel Tedavi Yönünden Tıbbi Farmakoloji 10th rev. Ankara: Hacettepe-Taş;

2002.

29. Kıyak M, Dağoğlu T. Lise öğrencileri arasında sigara kullanımı. İstanbul Halk Sağlığı

Bülteni 1990; 11:14-7.

51

30. Kirchner JA, Carter D. Pathology of the Larynx. In: Mills SE, Carter D, Greenson JK,

Oberman HA, Reuter V, Stoler MH, editors. Sternberg's Diagnostic Surgical Pathology. 4th

ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2004. p. 1007-31.

31. Kocabaş A. Orta dereceli okul öğrencilerinde sigara içme alışkanlığı. Ankara Tıp Mecmuası

1988; 41:9-22.

32. Krecicki T, Jeleń M, Zalesska-Krecicka M, Rak J, Szkudlarek T, Jeleń-Krzeszewska J.

Epidermal growth factor receptor (EGFR), proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and

Ki-67 antigen in laryngeal epithelial lesions. Oral Oncol 1999; 35:180-6.

33. Kurita S, Nagata K, Hirano MA. Comparative study of the layer structure of vocal fold. In:

Bless DM, Abbs JH, editors. Vocal fold physiology. San Diego: College-Hill; 1983. p. 3-

21.

34. Lee PN. An assesment of the epidemiological evidence relating lung cancer risk in never

smokers to environmental tobacco smoke exposure. In Kasuga H, editor. Environmental

Tobacco Smoke. Newyork: Springer-Verlag; 1993. p. 28-70.

35. Lewis DJ, Prentice DE. The ultrastructure of rat laryngeal epithelia. J Anat 1980; 130:617-

32

36. Lin K, Westra WH, Kashima HK. Coinfection of HPV-11 and HPV-16 in case of laryngeal

squamous papillomas with severe dysplasia. Laryngoscope 1997; 107:942-47.

37. Meade PD, Yamashiro S, Harada T, Barsur PK. Influence of vitamin A on the laryngeal

response of hamsters exposed to cigarette smoke. Prog Exp Tumor Res 1979; 24:320-9.

38. Mills SE, Fechner ER. Larynx and Pharynx. In Sternberg SS, editor. Histology for

Pathologists. 2nd ed. Philadelphia: Lippincott – Raven; 1997. p. 391-403.

39. Nikotin ve Nikotin sağlayan ürünlerle ilgili bazı özellikler. Sağlık için sigara alarmı. 1994;

1:42.

40. PIAR Araştırma Ltd. Şti. Sağlık ve Sosyal Yardım Bakanlığı, sigara alışkanlıkları ve sigara

ile mückas kampanyası kamuoyu araştırması raporu. İstanbul. 1988.

41. Putz R, Pabst R. Sobotta insan anatomi atlası. 1. cilt. Çev. Ed. Arıncı K. İstanbul: Beta

Basım Yayım Dağıtım A. Ş; 1994.

42. Riboli E, Preston-Martin S, Saracci R, Saracci R, Haley NJ, Trichopoulos D, Becher H,

Burch JD, Fontham ETH, Gao YT, Jindal SK, Koo LC, Marchand LL, Segnan N, Shimizu

H, Stanta G, Williams AH, Zatonski W. Exposure of non-smoking women to environmental

tobacco smoke: a 10- country collaborative study. Cancer causes & control 1990; 1:243–52.

43. Rosai J. Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. 9th ed. Toronto: Mosby Inc. ; 2004.

44. Sasaki CT, Driscoll BP, Gracco C. Larenks anatomi ve fizyolojisi. In Ballenger JJ, Snow

JB, editors. Şenocak D, çeviri editörü. Otorinolaringoloji baş ve boyun cerrahisi. 16. Baskı.

İstanbul: Nobel Tıp Kitapevleri; 2000. p. 422-37.

52

45. Sasco AJ, Secretan MB, Straif K. Tobacco smoking and cancer: A brief review of recent

epidemiological evidence. Lung Cancer 2004; 45:3-9.

46. Satman I, Yılmaz T, Şengül A . Population-based study of diabetes and risk characteristics

in Turkey: Results of the Turkish Diabetes Epidemiology Study (TURDEP). Diabetes Care

2002; 25:1551-6.

47. Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: From the known and the unknown. J Cell Physiol

2000; 182:311-22.

48. Sherman CB. Health effect of cigarette smoking. Clin Chest Med 1991; 12:643.

49. Smith G. Scanning Electron Microscope Study of the Response of the Larynx and Trachea

of the Rat to Smoke Exposure. BAT Co Ltd. Minnesota tobacco litigation 1977; 105466214-

35.

50. Smith G. Structure of the normal rat larynx. Laboratory Animals 1977; 11:223-8.

51. Şahin M, Arslandağ M. Kardiyovasküler sistem ve sigara. In: Tür A, editor. Sigaranın

bilimsel yüzü. İstanbul: Logos Yayıncılık; 2005. p. 154-8.

52. Şengiz S, Pabuççuoğlu U, Sarıoğlu S. Immunohistological comparison of the World Health

Organization (WHO) and Ljubljana classifications on the grading of preneoplastic lesions of

the larynx. Pathol Res Pract 2004; 200:181-8.

53. Türk Kardiyoloji Derneği. Türkiye Kalp Raporu 2000. İstanbul: Yenilik Basımevi; 2000.

54. US Environmental Protection Agency, Respiratory health effects of passive smoking: Lung

cancer and other disorders. Washington: 1992.

http://www.tabakkontrolle.de/pdf/respiratory%20health%20effects.pdf.

55. US Department of Health and Human services. A Report of the Surgeon General: The health

consequences of smoking. Washington (DC): 1982.

http://profiles.nlm.nih.gov/NN/B/C/D/W/_/nnbcdw.pdf

56. Vineis P, Airoldi L, Veglia F, Olgiati L, Pastorelli R, Autrup H, Dunning A, Garte S,

Gormally E, Hainaut P, Malaveille C, Matullo G, Peluso M, Overvad K, Tjonneland A,

Clavel-Chapelon F, Boeing H, Krogh V, Palli D, Panico S, Tumino R, Bueno-De-Mesquita

B, Peeters P, Berglund G, Hallmans G, Saracci R, Riboli E. Environmental tobacco smoke

and risk of respiratory cancer and chronic obstructive pulmonary disease in former smokers

and never smokers in the EPIC prospective study. BMJ 2005; 330:277.

57. Walker D, Wilton LV, Binns R. Inhalation toxicity studies on cigarette smoke (VII) 6-week

comparative experiments using modified fluecured cigarettes: Histopathology of the

conducting airways. Toxicol 1978; 10:241-59.

58. Warren CW, Riley L, Asma S et al. Tobacco use by youth: A surveillance report from the

Global Youth tobacco survey project. Bull World Health Organ 2000; 78:868-76.

53

59. Weir N. Anatomy of the Larynx and Tracheobronchial tree. In: Alan GK, Michael G, editor.

Scott-Brown’s Otolaryngology. Vol 1, 6th ed. London: Butterworth-Heinemann Int; 1997.

p. 12/1-27.

60. WHO, Environmental Tobacco Smoke. Air Quality Guidelines-Second Edition. 2000.

http://www.euro.who.int/document/aiq/8_1ets.pdf.

61. WHO, The tobacco epidemic rages on in Eastern and Central Europe. 1997. Fact Sheet No.

156.

62. WHO, Tobacco Free Initiative (TFI). Why is tobacco a public health priority?

http://www.who.int/tobacco/health_priority.

63. WHO, World Healt Report. 1999; Genova. http://www.who.int/whr/1999/en/whr99_en.pdf.

64. Zidar N, Gale N, Kambic V. Expression of Ki-67 antigen and proliferative cell nuclear

antigen in benign and malignant epithelial lesions of the larynx. The Journal of Laryngology

and Otology 1996; 110: 440-5.