Maria Alice DonatiSezione Malattie Metaboliche e Muscolari

EreditarieClinica di Neurologia Pediatrica

AOU “Anna Meyer” Firenze

Come si arriva ad una diagnosi di malattia mitocondriale: Metodi tradizionali, nuove acquisizioni

e diagnosi prenatale

PREVALENZA MALATTIE MITOCONDRIALI CATENA RESPIRATORIA

10-15 in 100.0001 in 7600

Di Mauro et al. NEnglJMed 2003;348:2656-68 Review

Schaefer et al. Biochim Biophys Acta. 2004; 1659:115-20. Review 1 in 5000 Skladal et al. Brain 2003;126:1905

LE MALATTIE MITOCONDRIALI SONO FRA LE PIU’ COMUNI MALATTIE EREDITARIE UMANE

METABOLISMO MITOCONDRIALE

FUNZIONE PRINCIPALE DEI MITOCONDRI :

CONVERSIONE ENERGIA IN ATP

Respirazione 32ATPCiclo Di Krebs 28 ATPGlicolisi Anaerobia 4 ATP

FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA

RAPPRESENTA UN ESEMPIO UNICO NEL MONDO DEI VIVENTI ESSENDO IL RISULTATO DALLE COMPLEMENTAZIONE TRA DUE DISTINTI SISTEMI GENETICI:

IL GENOMA NUCLEAREIL GENOMA NUCLEARE

IL GENOMA MITOCONDRIALEIL GENOMA MITOCONDRIALE

DIFETTI DI COMUNICAZIONE DIFETTI DI COMUNICAZIONE INTERGENOMICAINTERGENOMICA

IL GENOMA MITOCONDRIALE HA PERSO IL GENOMA MITOCONDRIALE HA PERSO LA SUA AUTONOMIA DI ORGINE LA SUA AUTONOMIA DI ORGINE

DIPENDE DAL GENOMA NUCLEARE PER LA DIPENDE DAL GENOMA NUCLEARE PER LA PRODUZIONE DI FATTORI NECESSARI PER PRODUZIONE DI FATTORI NECESSARI PER

LA REPLICAZIONE, TRASCRIZIONE LA REPLICAZIONE, TRASCRIZIONE TRASLAZIONE DEL DNAmitTRASLAZIONE DEL DNAmit

GENETICA DEI DIFETTI DELLA CATENA RESPIRATORIA

EREDITA’ NUCLEARE-MENDELIANA

MALATO 25%

PORTATORI SANI50%

SANO 25%

•AUTOSOMICA RECESSIVA•X-LINKED•AUTOSOMICA DOMINANTE

AUTOSOMICA RECESSIVA

`

(UUR)

N D 1

N D 2

1 6 S

1 2 S

N D 5

C yt. b

N D 4

N D 4 L

N D 3C O I I I8 6

AT Pa se

C O I I

C O I

T

P

N D 6E

QI

M

W

ANCY

OL

S (U C N)

D

K GR

L(C UN )

S(A G Y )

H

LSP

OH

H SP

F

V

L(U UR )

D - LO O P

Complesso IV

Complesso I

Complesso V

Complesso III

rRNA

tRNA

DNA MITOCONDRIALE

16.569 PAIA DI BASI

CONTIENE 13 GENI CODIFICANO: 13 POLIPEPTIDI

2 rRNA

22 tRNA

ASSENZA DI INTRONI E DI ISTONI

ASSENZA DELLE REGIONI 3’ E 5’

CODICE GENETICO DIVERSO

ZIGOTESegregazione Mitotica

EREDITARIETA’ MITOCONDRIALE MATERNA

GENETICA MITOCONDRIALE

•EREDITARIETA’ MATERNA•ETEROPLASMIA•SEGREGAZIONE MITOTICA•EFFETTO SOGLIA

•MENDELIANA

•DNA MITOCONDRIALE

ZIGOTE

VARIAZIONE INTRAFAMILIARE

•ENCEFALO-MIOPATIA

•ENCEFALO-CARDIOMIOPATIA

•ENCEFALO-EPATOPATIA

•ENCEFALO-NEFROPATIA

•MIOPATIA…………CITOPATIA

•MENDELIANA•DNA MITOCONDRIALE

GENETICA MITOCONDRIALE

DIAGNOSI di MALATTIA MITOCONDRIALE

CLINICA STORIA FAMILIARE

ESAMI EMATOCHIMICINEURORADIOLOGIA

BIOPSIA MUSCOLARE/CUTANEA

ANALISI MOLECOLARE

CLASSICHE SINDROMI MITOCONDRIALI

Koening et al. Ped Neurol 2008

NELLA POPOLAZIONE PEDIATRICA

• ETA’ MEDIANA di ESORDIO di ≈3 MESI (RANGE : NASCITA-9 ANNI)

• SOPRAVVIVENZA MEDIANA di 12 ANNI

85-90% MUTAZIONI nDNASchaefer et al. Biochim Biophys Acta 2004Koening et al. Ped Neurol 2008

MALATTIE MITOCONDRIALIad ESORDIO NEONATALE

75 pz IPOTONIA 95%SUPPORTO VENTILATORIO 66%CARDIOMIOPATIA IPERTROFICA 50%RITARDO CRESCITA INTRAUTERINA 40%PREMATURITA’ 36%CONVULSIONI 24%S.di LEIGH 11%

ACIDOSI LATTICA 93%CK ↑ 28%AMMONIEMIA ↑ 22%METABOLITI INTERMEDI C. KREBS ↑ 75%

Honzik et al. JIMD 2010; JIMD 2012

SINTOMI MAGGIORI ESORDIO:DISTRESS RESPIRATORIODIFFICOLTA’ ALIMENTARSIASFISSIA

Muruyamak et al. JIMD 2010;33

SINTOMATOLOGIA MALATTIE MITOCONDRIALI IN ETA’ PEDIATRICA

MANIFESTAZIONI NEUROLOGICHE 45%RITARDO P-M IPOTONIAENCEFALOPATIA AUTISMOCEFALEA ATASSIA

CONVULSIONI COMADISTONIA EMIPARESI

SPESSO NEUROMUSCOLARI INTOLLERANZA ALL’ESERCIZIO DEBOLEZZA MUSCOLARE PTOSI NEUROPATIA

Koening et al. Ped Neurol 2008CK N/<2 VOLTE VNNORMALE EMG

MIOPATIARITARDO MENTALEIPOTIROIDISMO

LATTATO ↑ALANINA ↑Biopsia muscolare:Difetto Complesso IMut gene ACAD9

RIBOFLAVINA

PENSARE MALATTIE MITOCONDRIALI

SINTOMATOLOGIA MALATTIE MITOCONDRIALI IN ETA’ PEDIATRICA

MANIFESTAZIONI NEUROLOGICHE

+EPATOPATIA PROGRESSIVA

VALPROATO → SEGNI EPATICI

Koening et al. Ped Neurol 2008

BASSA STATURA 20%SORDITA’ NEUROSENSORIALE 7-26%PEONEUROPATIA ASSONALEDIABETEACIDOSI TUBULARE RENALECARDIOMIOPATIA

Koening et al. Ped Neurol 2008

ALTERAZIONI EMATOLOGICHE 10% ANEMIA PANCITOPENIA

ALTERAZIONI ENDOCRINEIPOGLICEMIA CHETOTICASINTOMATOLOGIA GASTROINTESTINALEALTERAZIONI CUTANEE IPERTRICOSI, ECZEMA, VITILIGO

tRNA ATPase6

Tissue Symptom/Sign MERRF MELAS NARP MILS

CNS SeizuresAtaxiaMyoclonusPsychomor RetardationPsychomotor RegressionHemiparesis/hemianopiaCortical blindnessMigraine-like headachesDystonia

+++-

+/-----

++

+/--+++++

-+-------

++/--+----+

PNS Peripheral Neuropathy +/- +/- + -

Muscle WeaknessOphthalmoplegiaPtosis

+--

+--

+--

+--

Eye Pigmentory retinopathyOptic Atrophy

--

--

++/-

+/-+/-

Endocrine Diabetes Mellitus -+

+/-+

--

--

Heart Conduction blockCardiomyopathy

--

+/-+/-

--

-+/-

GI Intestinal pseudo-obstruction - + - -

ENT Sensorineural hearing loss + + +/- -

Kidney Fanconi’s Syndrome - +/- - -

Lab Lactic AcidosisMuscle bx: RRF

++

++

--

+/--

Inheritance Maternal + + + +modif. Di Mauro. N Engl J Med 2003;348:2656-68

Short stature

BASSA STATURA

142 cm

BASSA STATURA

138cm

BASSA STATURA

ABORTOABORTO

p<<3° h<<3° CC<3°

G.L.

Prematurità: 29° sett P 860 gr IA: 3-6Deambulazione a 12 mesiScarso accrescimento staturo ponderaleA 4 anni:

Visita cardiologica: DIA, IPVisita gastroenterologica e endocrinologica

28.1.99

BASSA STATURA FAMILIARE

BASSA STATURABASSA STATURA

DECEDUTO ≈ 50 AABASSA STATURA

ABORTOABORTO

p<<3° h<<3° CC<3°

G.L.

Prematurità: 29° sett P 860 gr IA: 3-6Deambulazione a 12 mesiScarso accrescimento staturo ponderaleA 4 anni:

Visita cardiologica: DIA, IPVisita gastroenterologica e endocrinologica

Mutazione 3243A>G

28.1.99

BASSA STATURA FAMILIARE

DECEDUTA IN GIOVANE ETA’ (CAUSA NON PRECISATA)

GRAVE RITARDO PSICOMOTORIOEPILESSIA

SORDITA’

CMDIPERTRICOSI

BASSA STATURA SORDITA’ CARDIOMIOPATIA EPILESSIA ENCEFALOPATIA EXITUS PRECOCE

DECEDUTO ≈ 47 AASORDITA’

RM encefalo normaleDiagnosi a 5 anni e 6 mesi

STROKE LIKE

36aah 138cmSordita’CMD

11aah 111cm(<<3°)

7aah 115cm(25-50°)

5aah 106.5cm(25-50°)

BASSA STATURA

EPILESSIACEFALEA

DISTURBI PSICHIATRICI dall’età di 20aa

DIABETE

ENCEFALOPATIA h<<3°percCc<3°perc

DIABETE

BASSA STATURABASSA STATURA

Mutazione A3243>G

DIAB

ETE

DIST

URBI

PSICHI

ATRICI

CEFA

LEA

D.D.

Koller H J Neurol 2003; 250(12):1501-2Kazuno AA Psychiatry Clin Neurosc 2005; 59(4):497-503

BASSA STATURA ENCEFALOPATIA

DECEDUTA ≈ 47 AA

BASSA STATURADIABETE

DIABETEBASSA STATURA

DISTURBI PSICHIATRICI

13.2.01

CARDIOMIOPATIAEPILESSIADIABETE

Diagnosi a 3 anni e 7 mesi

“Diabetes mellitus associated with a pathogenic point mutation in mitochondrial DNA”

Lancet 1992; 5;340:1376-9.

Reardon W.

MNGIEMITOCHONDRIAL NEUROGASTROINTESTINAL

ENCEPHALOMYOPATHY

ESORDIO 20-50 ANNIPTOSI, OFTALMOPLEGIA ESTERNA PROGRESSIVADISMOTILITA’ INTESTINALENEUROPATIA PERIFERICAMIOPATIALEUCOENCEFALOPATIA

HIRANO M. Neurology. 1994 44:721-727 NISHINO I. Ann Neurol. 2000;47:792-800.

ANALISI GENE TIMIDINA FOSFORILASI (TP)ACIDOSI LATTICABIOPSIA MUSCOLARE: MITOCONDRI ABNORMI , RRFsDELEZIONI MULTIPLE DNAMIT E/O DEPLEZIONE DNAMIT

Analisi purine e pirimidine MS/MS:TIMIDINA ↑

DEOXIURIDINA ↑

ASSO

CIAZIO

NE DI

SEGNI C

LINICI

PSEUDO OCCLUSIONI INTESTINALI

NEUROPATIA PERIFERICA

LEUCODISTROFIA

MNGIE

NISHINO I. Ann Neurol. 2000;47:792-800.

COMPLESSO I CATENA RESPIRATORIADEFICIT ISOLATO DEL COMPLESSO I E’ LA PIU’ FREQUENTE CAUSA DI MALATTIA MITOCONDRIALE

32% DEI DIFETTI CATENA RESPIRATORIA

≈45 SUBUNITA’ : 7 CODIFICATE mtDNA

DEFICIT DEL COMPLESSO IPRINCIPALI QUADRI CLINICI

• SINDROME DI LEIGH • CARDIOMIOPATIA NEONATALE • LEUCONCEFALOPATIA PROGRESSIVA • SEVERA ACIDOSI LATTICA NEONATALE • COMBINAZIONE DI SINTOMI

NEUROLOGICI NON ASCRIVIBILE A NESSUNA SINDROME SPECIFICA

Zeviani et al. Biochim Biophys Acta 2004

LA NOSTRA CASISTICADIAGNOSI DI DIFETTO DEL COMPLESSO I

IN 20 PAZIENTI

9 PAZIENTI CON MUTAZIONE nDNA

4 PAZIENTI CON MUTAZIONE mtDNA

7 PAZIENTI CON MUTAZIONE NON NOTA

PAZIENTI P3 P4 P5

ESORDIO 1 ANNO E 10 MESI NASCITA 2 ANNI RITARDO P-M IPOTONIA GEN. RITARDO P-M

CRISI DI APNEADIAGNOSI 2 ANNI E 4 MESI 1 MESE 10 ANNI E 3 MESI

RITARDO P-M ++ --- +

IPOTONIA GEN. --- +++ ---

IPOTONIA ASS. ++ +++ +

IPERTONO ARTI ++ --- ---

DISTONIE ++ --- ---

INTOL. ESERCIZIO --- --- +++

IPOACUSIA ++ --- ---

CEFALEA --- --- ++

DIST. LINGUAGGIO ++ --- +

CARD. IPERTROFICA --- --- ++

APNEA --- +++ ---

NEFROPATIA --- --- ++

DEFICIT S-PONDERALE + + +++

RM ENCEFALO N. BASE NORMALE SB PV SB PV POST

SPETTROSCOPIA ↑↑ ↑↑↑ N

EXITUS --- 2 MESI ---

FOLLOW UP 6 ANNI E 8 MESI --- 12 ANNI E 6 MESI

ANALISI MOLECOLARE 3697G>A GENE ND1 c.14709T>C tRNAGlu 12200A>G tRNA

ANAMNESI FAMILIARE BASSA STATURA DIABETE LINEA CEFALEA, MIOP., MADRE MATERNA STROKE

DIFETTO COMPLESSO I CON MUTAZIONE DEL mtDNA

MALATTIE MITOCONDRIALI

MUTAZIONI GENE SCO2; COX 15

CARDIOMIOPATIA FATALE (HCM) ENCEFALOPATIA tipo Sindrome di Leigh

DIFETTO COMPLESSO IV CATENA RESPIRATORIA

MITOCHONDRIAL MEDICINE 2006S. Di Mauro, M. Hirano, E.A.SchonCARDIOENCEFALOPATIA

CARDIOMIOPATIA (HCM)LEUCODISTROFIA

DIFETTO COMPLESSO I CATENA RESPIRATORIAMUTAZIONI GENI NDUF S2; NDUF V2; NDUF S8; NDUF S4

MALATTIE MITOCONDRIALI

CARDIOMIOPATIA (HCM)ACIDOSI LATTICA NEONATALEENCEFALOPATIAMIOPATIAESORDIO PRIMI GIORNIEXITUS PRECOCE

Gene TMEM70 Cizkova A. Nat Gen 2008;40:1288

3-METILGLUTACONICO ACIDURIA

Gene ATP5E Mayr JA. Hum Mol Genet 2010; 19:3430

TMEM70 FATTORE ESSENZIALE IN BIOGENESI COMPLESSO V

FENOTIPO NEONATALE SEVERO → ENCEFALOCARDIOMIOPATIA

FENOTIPO TARDIVO PIU’ LIEVE → ENCEFALOPATIA NON PROGRESSIVA

LATTATO ↑↑IPERAMMONIEMIA ↑INTERMEDI Ciclo KREBS ↑

Acido 3-METILGLUTACONICO urine ↑Tort et al. JIMD 2010;33 (suppl)Honzik et al Arch Dis Child 2010.

Alta frequenzaetnia Rom

Am J Hum Genet. 1997,61:862-7

IV: 5

III:7

II:1 II:2 II:3 II:4 II:5 II:6

I:1 I:2

II:7

III:5III:4 III:6

IV: 4

III:2III:1 III:3

IV: 3IV: 2IV: 1

mutazione gene TAZc.877G>A p.G197RM.A.Donati et al. J Inherit Metab Dis. 2006;29:684.

SINDROME DI BARTH

X-LINKEDCARDIOMIOPATIA INFANTILEMIOPATIA NEUTROPENIA ciclica3-METILGLUTACONICO ACIDURIA(Kelley, J Pediatr 1991, 119, 738)

IV: 6

ANALISI MOLECOLARE GENE TAZ (G 4.5) Xq28 PROTEINA TAFAZZINA

(Bione, Nat Genet, 1996,12, 385) (D’Adamo, Am J Hum Genet 1997, 61, 862)

SINDROME DI BARTH

ANALISI MS/MS SPOT SANGUE

MONOLISOCARDIOLIPINA/CARDIOLIPINA Kulik W. Clin Chem. 2008;54:371

ACILTRANSFERASI coinvolta nel metabolismo della cardiolipinaMONOLISOCARDIOLIPINA ↑ CARDIOLIPINA ↓

ESORDIO PRIMO ANNO DI VITA INSUFFICIENZA CARDIACA:

DILATAZIONERIDOTTA CONTRATTILITA’LIEVE-MODERATA IPERTROFIA VS o VS + VD

MORTE IMPROVVISA (FIBRILLAZIONE VENTRICOLARE ?)

SINDROME DI BARTHCARDIOMIOPATIA

AUTOPSIA: FIBROELASTOSI ENDOCARDICA

DILATAZIONE- INSPESSIMENTO MIOCARDIO M.E.: STRUTTURA FIBRILLARE NORMALE - MITOCONDRI ALTERATI

X-LINKED ISOLATED NON COMPACTION OF LEFT VENTRICULAR MYOCARDIUM (INVM)

(Bleyl Am J Med Genet 1997, 61,868)(Bleyl Am J Med Genet 1999, 85,190)

MUTAZIONE GENE TAZ

Spencer CT et al. Pediatrics. 2006; 118:337

D.D.MIOCARDITE VIRALE

ALPERS BJ DIFFUSE PROGRESSIVE DEGENERATION OF GRAY MATTER OF CEREBRUM

Arch Neurol Psychiatr 1931;25:469-505

ESORDIO A 3 MESICONVULSIONIMALATTIA NEURODEGENERATIVA PROGRESSIVAEXITUSAUTOPSIA → DEGENERAZIONE NEURONI CORTICALI

HUTTENLOCHER PR “ INFANTILE DIFFUSE CEREBRAL DEGENERATION WITH HEPATIC CIRROSIS”

Arch Neurol 1976;33:186-92

EPILESSIA FARMACO-RESISTENTERITARDO PSICOMOTORIOINSUFFICIENZA EPATICA

TOSSICIT

A’ VALPRO

ATO

Sindrome di AlpersPoliodistrofia infantile progressiva con insufficienza epatica

COMPOUND ETEROZIGOTEL.S e L.A.ANALSI GENE POLG 1

CONVULSIONI FARMACO RESISTENTI-EPCENCEFALOPATIA PROGRESSIVA

CECITA’ CORTICALEEPATOPATIA /INSUFFICIENZA EPATICA PROGRESSIVA

S. di ALPERS

Esone 13: c.2243G>C (p.W748S) Esone 22: c.3629Ains (p.Y1210X)

MUTAZIONI PATOGENETICHE POLGLocus: 15q25, (MIM 174763)

SINDROME DA DEPLEZIONE DNAmit QUADRI CLINICI

MIOPATICO GENE TK2 GENE RRM2B

ENCEFALO-MIOPATICOGENE SUCLA2GENE SUCLG1

EPATO-CEREBRALEGENE POLG1GENE TWINKLEGENE DGUOKGENE MPV17

Spinazzola et al. JIMD 2009

SINDROME DI ALPERSRM ENCEFALO

NORMALE IN FASE INIZIALE

IPERINTENSITA’ (T2/FLAIR)REGIONI OCCIPITALINUCLEI CEREBELLARI PROFONDITALAMIGANGLI BASALI

Tzoulis C 2006 Brain. 2006;129:1685-92

ATROFIA CORTICALE EVIDENTE LOBO PARIETALE e REGIONI PERISILVIANELESIONI BILATERALI NEL TALAMO, GLOBO PALLIDO E NUCLEO CAUDATO

Ferrari G Brain 2005;128:723-731

DEFICIT ARGINIL tRNA SINTETASI

GENE RARS2

ESORDIO NEONATALE

GRAVE ACIDOSI LATTICA

IPOPLASIA PONTOCEREBELLARE

PROGRESSIVA ATROFIA CEREBELLARE

VARIABILE DISFUNZIONE CATENA RESPIRATORIAEdvardson et al. AmJHumGenet 2007Cassandrini et al J Inherit Metab Dis 2012

DIAGNOSINEUROIMMAGINI : RM ENCEFALO

MELASEtà 4aa e 6 mesi

S.di LEIGH/MUT SURF1Età 8 mesi

DIAGNOSINEUROIMMAGINI : RM ENCEFALO

LEUCOENCEFALOPATIADIFETTO COMPLESSO IGENE NON NOTOEtà 20 mesi

LEUCOENCEFALOPATIADIFETTO COMPLESSO IGENE NDUFS1Età 8 mesi

DIAGNOSINEUROIMMAGINI : RM SPETTROSCOPICA

49 BAMBINI AFFETTI16 LATTATO ↑ (7 in PARENCHIMA NORMALE)

(7 LATTATO pl NORMALE)

SE PERSISTE LATTATO ↑ DOPO FASE ACUTA → IPOTESI METABOLICA

NEUROIMMAGINI NORMALI NON ESCLUDONO MALATTIA MITOCONDRIALE

Dinopoulos et al. Neuroped 2005

STATO REDOX SANGUE T0-T60LATTATO LIQUORALEAMINOACIDEMIA : ALANINA ↑ACIDI ORGANICI URINEACILCARNITINE PLASMAAMMONIEMIA ↑

CLINICA e ANAMNESI FAMILIARE

LABORATORIO

DIAGNOSI

ACIDOSI LATTICA in 50-73% pz

in 30% pz su 235 BAMBINI affetti

VALORI NORMALI LATTATO NON ESCLUDONO MALATTIA MITOCONDRIALE

Koening et al. Ped Neurol 2008

Munnich et al. JIMD 1996

B.I.Scotomi, cefalea,mioclonie,vomito,disartria, cecità transitoriaBiopsia mm.: R.R.F.Studio DNAmt: mutazione 3243 del tRNA Leu(UUR)

STATO REDOX T0 T60

Ac Lattico (0.63-2.44 mmol/L) 4.5 4.7Ac Piruvico (0.045-0.19 mmol/L) 0.077 0.096 L/P 58 49Ac βOHbutirrico (0.02-0.09 mmol/L) 0.122 0.175Ac Acetoacetico (0.01-0.04 mmol/L) 0.046 0.043

β-OHB/AA 2.65 4.00

Piruvico AcetilCoA Acetoacetico

Ossalacetico

Malato/Fumarato

α-chetoglutarato

Citrato

Succinico

HBDH

β−OHbutirrico

PDH

NADH+H+

NADH+H+

NAD+

Glucosio NAD+

NADH+H+

ac. Piruvico NADH+H+

NAD+

ac. Lattico

LDH

IPERLATTACIDEMIE con AUMENTATO RAPPORTO L/P• deficit di Piruvico Carbossilasi (PC) - deficit di Biotinidasi• deficit del ciclo di Krebs• deficit della Catena Respiratoria

PC

Catena Respiratoria

CHETOSI PARADOSSA

DIAGNOSIBIOPSIA MUSCOLARE : ANALISI ULTRASTRUTTURALE ISTOCHIMICA BIOCHIMICA MOLECOLARE

ANALISI BIOCHIMICA CATENA RESPIRATORIABIOPSIA CUTANEA → COLTURA FIBROBLASTI

ANALISI BIOCHIMICA CATENA RESPIRATORIA

PROCEDURA INVASIVA/STATO CLINICO INSTABILESCARSA MASSA MUSCOLAREDIFFICILE INTERPRETAZIONE ANALISI ENZIMATICAMANCANZA CONTROLLI PER ETA’ in NEONATO

BIOPSIA MUSCOLARECriticità:

DIAGNOSI

DIFETTI ESPRESSI SOLO IN MUSCOLO/TESSUTO SPECIFICI

NORMALITA’ STUDI BIOCHIMICO/MOLECOLARI SU MUSCOLO NON ESCLUDONO

MALATTIA MITOCONDRIALE

TEST SPECIFICO IN FAMILIARI A RISCHIO

CONSIGLIO GENETICO/RISCHIO RICORRENZA

DIAGNOSI PRENATALE POSSIBILE SEMPRE in DIFETTI NUCLEARI

STUDI di RICERCA/TERAPIA SPECIFICA

DIAGNOSI PRECISA

DIAGNOSI MOLECOLARE mtDNA e GENI NUCLEARI

GENI MITOCONDRIALI NOTI Koopman WJH. N Engl J Med 2012;366:1132

Geni

228 nDNA

13 mtDNA

MELAS 80% pz mut A3243G tRNALEU(UUR)

ANALISI MOLECOLARE: mtDNA e GENI NUCLEARI

Wong LJ Mol Genet Metab 2010;100:111

Wong LJ Mol Genet Metab 2010;100:111

Honzik T et al, JIMD 2012

Variants AnalysisVariants Analysis

The DNA sequence of each individual was aligned with GRCh37 human reference to identify single-nucleotide variants (SNVs) and short insertions or deletions.

Rare Nuclear variant were identify using dbSNP135 and classified as:1) Known deleterious2) Likely deleterious: mutations predicted to modify protein function in

high conserved sites3) Unknown (not known or unlikely deleterious)

Recessive model of pathogenesis mtDNA variants were prioritized using MITOMAP

Diagnosi prenatale

• DIAGNOSI BIOCHIMICA NON AFFIDABILE

• IN MALATTIE CON MUTAZIONI DI nDNA

• IN MALATTIE CON MUTAZIONI DI mtDNA

DIFETTI mtDNA

• ANALISI MUTAZIONE nella MADRE

SANGUE

URINECAPELLI

• MUCOSA ORALE

• POSITIVA

• NEGATIVA

• NO DIAGNOSI PRENATALE

• SI DIAGNOSI PRENATALE SU:

• NEGATIVA

• ANALISI MUTAZIONE SU DNA estratto da :

• VILLI CORIALI

• NEGATIVA

• PROSECUZIONE DELLA GRAVIDANZA

Diagnosi prenatale

Genetic Counseling: mtDNA• La diagnosi prenatale per tRNAs, incluse le comuni MELAS e

MERRF, è di fatto impossibile per due motivi:

– 1) La mutazione su amniociti o su villi coriali non corrisponde – a quella degli altri tessuti fetali.

– 2) Il grado di mutazione riscontarto sui tessuti prenatali può modificarsi in utero o dopo la nascita a causa della segregazione mitotica.

– Per le comuni mutazioni MILS (ATPase6 mt. 8993T>G/C) il rapporto alti/bassi livelli di genoma mutato corrisponde al grado di severità della malattia nel SNC (NARP)

Genetic Counseling: mtDNA

• Macrodelezioni mtDNA non sono di regola né ereditate né trasmesse, ma de novo nell'oogenesi e

nelle fasi precoci dell'embriogenesi.

• In una donna con una alta percentuale di mtDNA mutato, non si può escludere la possibilità di

trasmissione come riportato in letteratura.

Embrioni umani liberati da mtDNA mutato. No in Italia

IUGRAcidosi Lattica

neonatale

Analisi molecolare mtDNA e nDNA geni noti: Negativa

Anemia macrociticaRitardo linguaggio

Scarso accrescimento

DIAGNOSI EXOME SEQUENCING

Biopsia muscolareDifetto Complesso I

?La medicina mitocondriale

NEUROIMMAGINIRM ENCEFALO

• 3 PAZIENTI LEUCOENCEFALOPATIA PROGRESSIVA

• 2 PAZIENTI QUADRO LEIGH-LIKE

• 3 PAZIENTI SFUMATA ALT. SB ENCEFALICA

• 4 PAZIENTI NORMALE

RM SPETTROSCOPICA• 2 ↑↑PICCO DI LATTATI;

1 NON ESEGUITA

• 2 ↑↑ PICCO DI LATTATI

• 1 ↑ PICCO DI LATTATI; 2 NORMALE PICCO DI LATTATI

• 1 ↑↑↑ PICCO DI LATTATI; 3 NORMALE PICCO DI LATTATI

DIFETTO COMPLESSO CON MUTAZIONE DEL nDNA

Aritmia cardiaca (Pace Maker)Sordità

Diabete

Mutazione 3243A>G

LipotimiaSindrome nefrosica → IRC

Terapia steroidea

DIABETEEpilessiaSorditàIrsutismo

Biopsia Renale → Glomerulosclerosi focale segmentale

Percentuale

Sterilità

SINDROME NEFROSICASTERILITA’?

B.M. 13.8.70

SANGUE 43%MUSCOLO 67%

RENE 73%

Lowik MM. Mitochondrial tRNALeu(UUR) mutation in a patient with steroid-resistant nephrotic syndrome and focal segmental glomerulosclerosis.Nephrol Dial Transplant. 2005;20:336-41.

% Mut 3243A>GSANGUE 39%

% Mut 3243A>GSANGUE 38%

Matsuzaki M HYPOTHALAMIC GROWTH HORMONE DEFICIENCY and SUPPLEMENTARY GH THERAPY IN TWO PATIENTS WITH MITOCHONDRIAL MYOPATHY ENCEPHALOPATHY, LACTIC ACIDOSIS and STOKE LIKE EPISODESNeuropediatrics 2002; 33:271-3

Morava ETALL STATURE and PROGRESSIVE OVERWEIGHT IN MITOCHONDRIAL ENCEPHALOPATHYJ Inherit Metab Dis 2003; 7:720-722

ENCEFALOPATIA BASSA STATURA

MALATTIA MITOCONDRIALE ENCEFALOPATIA OVERGROWTH

Mutazione 3243A>GBASSA STATURA

Mutazione 8993T>COVERGROWTH

SEVERA ENCEFALOPATIA X-LINKED ASSOCIATA a MUTAZIONI NEL FATTORE

PROAPOPTOTICO1° pz: GRAVE IPOTONIA

FASCICOLAZIONE LINGUATREMORI ARTINEUROPATIARM ENCEFALO LEIGH-LIKE

1°pz fibroblasti: DIFETTO CIII E IV

2°pz muscolo: difetto CI e IVfibroblasti: difetto CIII e IV

Utziel et al. JIMD 2010;33 (suppl)

2° pz: REGRESSIONE PSICOMOTORIAIPOTONIANISTAGMO

POSSIBILE RISPOSTA a RIBOFLAVINA

Deficit di CoQ10: Spettro Clinico• Miopatia (Ogasahara S. PNAS 1989, Lalani S. Arch Neurol 2005)

Intolleranza all’esercizio, mioglobinuria ricorrenteSegni SNC: convulsioni, atassia, ritardo mentaleRagged-Red Fibers, accumulo di lipidi

“Pura” Miopatia• Atassia (Boitier E. JNeurol Sci 1998; Musumeci O. Neurol 2001)

Atassia, atrofia cerebellareAltri segni SNC: convulsioni, segni piramidali, ritardo mentaleDebolezza: biopsia muscolare non specifica

• Encefalomiopatia e Insufficienza renale (Rötig A. Lancet 2000;

Ritardo psicomotorio, atassia, segni piramidali,ritardo mentaleSindrome nefrosica, insufficienza renale Cardiomiopatia

Rahman S. J Pediatr 2001; Salviati L. Neurol 2005)

GENITORI CONSANGUINEI2 MESI: NISTAGMO12 MESI: SINDROME NEFROSICA

IRDIALISI

NEGATIVARITARDO PSICOMOTORIO, IPOTONIAATROFIA OTTICA

ELETTRORETINOGRAMMA ALTERATOEPILESSIA

RIDOTTA ATTIVITA’ COMPLESSO II + III su FIBROBLASTI

ELIGIBILITA’ A TRAPIANTO RENALE?

ANALISI MOLECOLARE NEFRINA (PPHS2) E PODOCINA (NPHS1)

BUONA RISPOSTA A TERAPIA CoQ10 su SINTOMATOLOGIA NEUROLOGICANO RISPOSTA SU MANIFESTAZIONE RENALE

Salviati L Neurol 2005, 65:606-8

BIOPSIA RENALE: GLOMERULO SCLEROSI FOCALE SEGMENTALE

ACIDO VALPROICO

• ESORDIO “ACUTO” PRIMI ANNI DI VITA

• CONVULSIONI FARMACO RESISTENTICONVULSIONI FOCALI-CLONICHECONVULSIONI FOCALI COMPLESSEEPILESSIA PARZIALE CONTINUAEEG: ALTERAZIONI OCCIPITALI RHADS (rythmic high-amplitude delta with superimposed polyspikes)

Wolf NI Epilepsia 2009;50:1586-1607

SINDROME DI ALPERS

• RITARDO-REGRESSIONE

• IPOTONIA

• ATASSIA

• CECITA’ CORTICALE

• INSUFFICIENZA EPATICA

• EXITUS Gordon N Dev Med Child Neurol. 2006;48:1001-3Horvath R Brain. 2006;129:1674-84

DEPLEZIONE DNA mit FEGATO/MUSCOLO

ACIDO VALPROICO

SINDROME DI ALPERS GIOVANILE

CRISI PARZIALI CON AUREA VISIVA SCOTOMI SCINTILLANTI CEFALEA EMICRANIA-LIKEVOMITO-NAUSEACONVULSIONI TONICO-CLONICHE STATO EPILETTICO

INSUFFICIENZA EPATICA BASSA STATURA

W748S/W748SA467T/A467TA467T/W748S

Wiltshire JArch Neurol 2008;65:121-4Uusimaa J Epilepsia 2008;49:1038-45

Engelsen BA Brain 2008;131:818-28

SINTOMI VISIVI

EPILESSIALOBO-OCCIPITALE

RISPOSTA A TERAPIA ORALE CON CoQ10

IMPORTANZA DELLA DIAGNOSI PRECOCE

DIAGNOSI NON FACILE

NO ACIDOSI LATTICASINTOMATOLOGIA NEUROLOGICA ASPECIFICASINDROME NEFROSICA STEROIDO RESISTENTE

DIAGNOSI IN PROPOSITUS

DIAGNOSI PRECLINICA IN FRATELLO PRESINTOMATICO

ESORDIO PRECOCE

6 ore di vita:IPOTONIA, IPOTERMIADIFFICOLTA’ AD ALIMENTARSILATTICOACIDEMIA ↑CONVULSIONICARDIOMIOPATIA (HCM)DISFUNZIONE TUBULARE RENALE

BIOPSIA MUSCOLARE: ACCUMULO LIPIDICODIFETTO I+III e II+III CATENA RESPIRATORIADIFETTO CoQ 10MUTAZIONI NUOVO GENE CoQ 9

DOSAGGIO CoQ 10 in MUSCOLO FIBROBLASTILEUCOCITI

EXITUS ≅ 2 ANNI

TERAPIA

TERAPIA VITAMINICA

QUINONE DERIVATI

CREATINA

CARNITINA

ACIDO LIPOICO

DICLOROACETATO

L-ARGININA

TRAPIANTO DI MIDOLLOChinnery et al. 2006Di Mauro et al. 2006

• Possibilità che l’analisi fornisca un risultato ambiguo.

contaminazione materna:

presenza di due linee cellulari, potenzialmente non differenziabili se il feto è di sesso femminile, facilmente evidenziabili se il feto è di sesso maschile.

seconda linea cellulare originata da una mutazione in vitro:

indispensabile riuscire a differenziare i campioni che contengono artefatti della coltura (pseudomosaicismo) dai mosaicismi veri, in quanto le implicazioni per il feto sono completamente diverse (rispettivamente sano e ammalato).

Problemi nella diagnosi prenatale