UNIVERZA V NOVI GORICI

FAKULTETA ZA ZNANOSTI O OKOLJU

DOLOČEVANJE KONCENTRACIJ IN TESTIRANJE

BAKTERICIDNEGA DELOVANJA KOLOIDNEGA SREBRA V

VODI

DIPLOMSKO DELO

Andrej JERKIČ

Mentor: doc. dr. Dorota Korte

Nova Gorica, 2016

II

IZJAVA

Izjavljam, da je diplomsko delo rezultat lastnega raziskovalnega dela. Rezultati, ki so nastali v okviru skupnega raziskovanja z drugimi raziskovalci ali so jih prispevali drugi raziskovalci (strokovnjaki), so eksplicitno prikazani oziroma navedeni (citirani) v diplomskem delu.

Andrej Jerkič

III

ZAHVALA

Iskreno se zahvaljujem mentorici doc. dr. Doroti Korte za vso strokovno pomoč in napotke pri izdelavi diplomske naloge. Velika zahvala gre tudi doc. dr. Mattiji Fanettiju, mag. Franji Prosenc in mag. Andražu Mavriču za pomoč pri izvedbi praktičnega dela meritev in pri laboratorijskem delu.

IV

POVZETEK

Koloidno srebro (Ag0) je vodna suspenzija delcev srebra v velikosti od 1 nm do 100 nm. Zaradi svojih edinstvenih lastnosti, kot so antibakterijsko in antivirusno delovanje, se pogosto uporablja predvsem v medicini in pri postopkih, povezanih z obdelavo vode. Koloidno srebro uvrščamo med težke kovine, ki jih človeško telo ni sposobno presnoviti, zaradi česar pride do nalaganja v ledvicah, koži, jetrih in nevronih, kar lahko vodi do negativnih zdravstvenih posledic. Nalaganje srebra v telesu lahko povzroči pljučni edem, krvavitve, nekrozo kostnega mozga, jeter in ledvic, argirijo, vrtoglavico ter nevrološke motnje. Prav zaradi morebitnih negativnih vplivov na živa bitja je pomembna natančna določitev koncentracije koloidnega srebra v vodi, ki je potrebna za ustrezno baktericidno delovanje in za zagotavljanje ustrezne kakovosti pitne vode, a hkrati ni nevarna zdravju.

V diplomski nalogi smo določevali koncentracije koloidnega srebra v vodi iz 3 različnih virov z uporabo UV-Vis spektrofotometrije (SPEC) in spektroskopije s toplotnimi lečami (TLS). Z izračunom spodnje meje določevanja (LOD) za SPEC in TLS metodo smo pokazali, da je zaradi nižje LOD vrednosti TLS metoda primernejša za detekcijo Ag0 v vodi. Vrednosti koncentracije srebra so lahko nižje od LOD, katero lahko dosežemo s SPEC, zato ta metoda ni primerna za merjenje zelo nizkih koncentracij. S preučevanjem baktericidnega delovanja koloidnega srebra smo dokazali, da njegova prisotnost v koncentracijah, ki so enake maksimalnim dovoljenim koncentracijam (MCL), ni dovolj visoka za uničenje bakterij. Slednja koncentracija je ustrezna le za zaviranje oziroma onemogočanje razmnoževanja bakterij. Dokazali smo tudi, da imajo koncentracije Ag0, ki 300-krat presegajo vrednost MCL v vodi, visoko baktericidno učinkovitost (znižanje logaritemske vrednosti > 3). Baktericidno delovanje koloidnega srebra smo povezali z velikostjo in obliko nanodelcev. To smo določili z metodo, ki temelji na dinamičnem sipanju svetlobe (DLS), in z uporabo vrstičnega elektronskega mikroskopa (SEM). Ugotovili smo, da se povprečna velikost delcev srebra povečuje z višanjem koncentracije Ag0. Največje spremembe smo zaznali med vzorcema s koncentracijo 50 ppb in 1 ppm ter med vzorcema z koncentracijo 1 ppm in 5 ppm. Pri primerjavi povprečne velikosti delcev med koncentracijama 5 in 15 ppm nismo zaznali velikih razlik. Sklepamo lahko, da se pri koncentracijah, višjih od 5 ppm, velikosti nanodelcev srebra ne spreminjajo več značilno s povečevanjem koncentracije Ag0. Z višanjem koncentracije srebra so se tvorili aglomerati, katerih velikost se je z višanjem koncentracije povečevala.

Ključne besede: koloidno srebro, spektrofotometrija, TLS, bakterije, absorbanca, SEM, aglomerati

SUMMARY

Colloidal silver (Ag0) is an aqueous suspension of particles with the size between 1 nm to 100 nm. As a result of its unique properties, colloidal silver is commonly used in medicine and in the water treatment processes, since it provides high bactericidal, antifungal and antiviral efficiency. On the other hand, silver belongs to the group of heavy metals, which cannot be metabolized. It is accumulated in liver, skin, kidneys and neurons and causes different disease, such as pulmonary edema, haemorrhaging, necrosis of the bone marrow, liver and kidneys, argyria, nausea, and different neurological disorders. Because of these harmful side effects of using colloidal silver it is very important to determine very precisely the concentration of Ag0 in water, to determine its optimal amount to ensure its bactericidal efficiency without any harm to living organisms.

V

In the thesis we determined the concentration of colloidal silver in river water from 3 different sources with UV-vis spectrophotometry (SPEC) and thermal lens spectrometry (TLS). By calculating the limit of detection (LOD) of the SPEC and TLS methods, it was shown that TLS is a more suitable method for detecting colloidal silver in water, because its concentrations in the river water may be lower than the LOD of the SPEC method. By studying the bactericidal effects of colloidal silver, we found that the MCL (maximum contamination level) of colloidal silver is not high enough to kill the present bacteria, but is only efficient for inhibiting the bacterial reproduction. Furthermore, we found that the Ag0 concentration of 300 times above the MCL value has high bactericidal efficiency (log. red > 3). We also studied the bactericidal efficiency of colloidal silver in correlation to its size and shape. Thus, the DLS (dinamic light scattering) analysis and SEM (Scanning Electron Microscope) measurement were performed. It was found that the size of the silver nanoparticles increases drastically between the sample of concentration 50 ppb compared to 1 ppm and 1 ppm compared to 5 ppm. For the silver nanoparticles concentration between 5 ppm and 15 ppm only little differences in average particles size were observed. We can conclude that in case of samples with concentrations higher than 5 ppm, the particle size does not increase significantly with the increase of Ag0 concentration as it does for samples of silver nanoparticles concentration lower than 5 ppm. Furthermore, silver nanoparticles form agglomerates, which become larger in samples with higher silver concentrations.

Key words: Colloidal silver, spectrophototermy, TLS, bacteria, absorbance, SEM, agglomerates

VI

KAZALO VSEBINE

1. UVOD ................................................................................................................................... 1

2. TEORETIČNE OSNOVE ...................................................................................................... 2

2.1 Prisotnost srebra v okolju ................................................................................................... 2

2.2 Fizikalne lastnosti in uporaba srebra .................................................................................. 2

2.3 Fizikalne in kemijske lastnosti koloidnega srebra ............................................................... 2

2.4 Baktericidne lastnosti koloidnega srebra ............................................................................ 3

2.5 Standardi za varno uporabo koloidnega srebra .................................................................. 3

2.6 Baktericidno delovanje koloidnega srebra .......................................................................... 4

2.7 Pregled analiznih tehnik za določevanje koncentraciji in lastnosti koloidnega srebra ......... 5

3. METODE DELA.................................................................................................................. 12

3.1 Uporabljene kemikalije in reagenti ............................................................................... 12

3.2 Priprava vzorcev za UV-Vis meritve ................................................................................. 12

3.2.1 Priprava osnovne raztopine ....................................................................................... 12

3.2.2 Priprava raztopine reducenta ..................................................................................... 12

3.2.3 Priprava realnih vzorcev ............................................................................................ 13

3.2.4 Lokacije vzorčnih mest rečnih vod ............................................................................. 13

3.3 Priprava vzorcev za TLS meritve ..................................................................................... 14

3.3.1 Priprava osnovne raztopine in raztopine reducenta ................................................... 14

3.3.2 Priprava realnih vzorcev ............................................................................................ 15

3.4 Priprava vzorcev za preučevanje baktericidnega učinka koloidnega srebra ..................... 15

3.4.1 Priprava gojišč ........................................................................................................... 15

3.4.2 Priprava raztopine bakterij ......................................................................................... 15

3.5 Priprava vzorcev za meritve velikosti in oblike delcev s SEM-om ..................................... 16

3.5.1 Priprava osnovne raztopine in raztopine reducenta ................................................... 16

3.6 Priprava vzorcev za DLS meritve ..................................................................................... 16

3.6.1 Priprava osnovne raztopine in raztopine reducenta ................................................... 16

4. EKSPERIMENTALNI DEL .................................................................................................. 17

4.1 UV-Vis spektrofotometrija ................................................................................................ 17

4.2 Spektroskopija s toplotnimi lečami ................................................................................... 17

4.3 Meritve na osnovi dinamičnega sipanja svetlobe (DLS meritve) ....................................... 19

4.4 Vrstična elektronska mikroskopija (SEM .......................................................................... 20

5. REZULTATI IN RAZPRAVA ............................................................................................... 20

5.1 UV-Vis spektrofotometrija ................................................................................................ 20

VII

5.1.1 Določanje časa, potrebnega za formacijo Ag0 ............................................................ 21

5.1.2 Meritve absorbance vzorcev z različno koncentracijo Ag0 .......................................... 21

5.1.3 Določevanje LOD metode .......................................................................................... 22

5.1.4 Meritve koncentracije realnih vzorcev ........................................................................ 23

5.2 Spektroskopija s toplotnimi lečami (TLS) ......................................................................... 24

5.2.1 TLS signal ................................................................................................................. 24

5.2.2 Določevanje LOD metode .......................................................................................... 25

5.2.3 Določevanje koncentracij srebra v realnih vzorcih ..................................................... 26

5.3 Baktericidno delovanje koloidnega srebra ........................................................................ 27

5.3.1 Zmanjšanje števila bakterij na gojiščih po določenem času z dodatkom določene koncentracije koloidnega srebra ......................................................................................... 28

5.3.2 Izračun logaritemskega zmanjšanja števila bakterij ................................................... 29

5.4 Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) ........................................................................ 30

5.4.1 Preučevanje velikosti in oblike nanodelcev srebra od njihove koncentracije .............. 31

5.4.2 Primerjava velikosti delcev in aglomeratov v vzorcih z različnimi koncentracijami ...... 37

5.5 Metoda dinamičnega sipanja svetlobe (DLS meritve) ...................................................... 39

6. ZAKLJUČKI ........................................................................................................................ 39

7. VIRI .................................................................................................................................... 41

VIII

SEZNAM PREGLEDNIC

Preglednica 1: Vrednosti absorbanc in izračunana vrednost koncentracij vzorcev rečnih vod ter vode iz pipe. .............................................................................................................................. 24 Preglednica 2: Določene koncentracije koloidnega srebra v rečni vodi in vodi iz pipe .............. 26 Preglednica 3: Primerjava vrednosti določenih koncentracij koloidnega srebra v vodah, merjenih z UV-Vis spektrofotometrom in s spektroskopijo s toplotnimi lečami (TLS) ................. 27 Preglednica 4: Zmanjšanje števila bakterij zaradi prisotnosti koloidnega srebra po 24 urah od nacepljanja ................................................................................................................................ 28 Preglednica 5: Logaritemsko zmanjšanje števila bakterij za različne koncentracije Ag0 ........... 30

IX

SEZNAM SLIK

Slika 1: Skica delovanja pretočne injekcijske analize .................................................................. 6 Slika 2: Skica delovanja plamenske atomske absorpcijske spektrometrije .................................. 6 Slika 3: Skica 3-elektrodne celice ............................................................................................... 7 Slika 4: Skica delovanja voltametrične metode ........................................................................... 7 Slika 5: Skica delovanja UV-Vis spektrofotometra ...................................................................... 8 Slika 6: Vzpostavitev toplotne leče v vzorcu pri TLS meritvah ..................................................... 9 Slika 7: Skica delovanja inštrumenta na osnovi dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) ............... 10 Slika 8: Skica, ki ponazarja razlike v intenziteti signala v odvisnosti od velikosti delcev ............ 10 Slika 9: Skica delovanja vrstičnega mikroskopa ........................................................................ 11 Slika 10: Vzorčno mesto vode iz Soče ...................................................................................... 13 Slika 11: Vzorčno mesto vode iz Lijaka ..................................................................................... 14 Slika 12: Vzorčno mesto vode iz Vipave ................................................................................... 14 Slika 13: UV-Vis spektrofotometer Perklin Elmer Lambda 650s ................................................ 17 Slika 14: Fotografija spektroskopa s toplotnimi lečami v Laboratoriju za raziskave v okolju Univerze v Novi Gorici ............................................................................................................... 18 Slika 15: Skica delovanja spektroskopa s toplotnimi lečami (TLS) ............................................ 19 Slika 16: DLS inštrument Brook Haven 90 plus/Bi-mas ............................................................. 20 Slika 17: Fotografija vrstičnega mikroskopa na katerem so bile izvedene meritve delcev ......... 20 Slika 18: Graf prikazuje čas, potreben za redukcijo ionskega srebra do koloidne oblike ........... 21 Slika 19: UV-Vis spekter za vzorce koloidnega srebra koncentracij 0,5; 1,0; 5,0; 10; 15 in 20 ppm ........................................................................................................................................... 22 Slika 20: Umeritvena premica za določevanje koncentracij koloidnega srebra v vodi pri uporabi UV-Vis spektroskopije ............................................................................................................... 23 Slika 21: Odvisnost TLS signala od koncentracije vzorca ......................................................... 25 Slika 22: Umeritvena premica za TLS metodo .......................................................................... 26 Slika 23: Raztopine bakterij, gojišča in srebra po inkubiranju za 24 ur pri 37 C ....................... 28 Slika 24: Zmanjšanje števila bakterij zaradi prisotnosti koloidnega srebra po 24 urah od časa nacepljenja ................................................................................................................................ 29 Slika 25: Delci koloidnega srebra v vzorcu s koncentracijo 50 ppb ........................................... 31 Slika 26: Aglomerat in nanodelci srebra v vzorcu s koncentracijo 1 ppm .................................. 32 Slika 27: Aglomerata srebra z izmerjenimi velikostmi posameznih delcev srebra v vzorcu s koncentracijo 1 ppm .................................................................................................................. 32 Slika 28: Aglomerati koloidnega srebra v vzorcu s koncentracijo 5 ppm ................................... 33 Slika 29: Fotografija signala povratno sipanih elektronov za vzorec 5 ppm ............................... 34 Slika 30: Delci srebra v vzorcu 5 ppm pod 100.000-kratno povečavo ....................................... 34 Slika 31: Fotografija delcev srebra v vzorcu 5 ppm z izmerjenimi velikostmi ............................. 35 Slika 32: Delci srebra v vzorcu 15 ppm pod 100.000-kratno povečavo ..................................... 36 Slika 33: Fotografija signala povratno sipanih elektronov za delce v vzorcu 15 ppm ................. 36 Slika 34: Delci koloidnega srebra pod 200.000-kratno povečavo z izmerjenimi velikostmi ........ 37 Slika 35: Povečevanje povprečne velikosti delcev v odvisnosti od zvišanja koncentracije koloidnega srebra ...................................................................................................................... 38 Slika 36: Povečevanje povprečne velikosti aglomeratov z zvišanjem koncentracije koloidnega srebra ........................................................................................................................................ 38

1

1. UVOD

Antibakterijske lastnosti koloidnega srebra so bile poznane že pred več kot 2000 leti. Uporabljene so bile za zdravljenje številnih bolezni in kot razkužilo do odkritja antibiotikov. Nanodelce srebra se dodaja vodi, z namenom da bi ostala dlje časa pitna (National Academy of Sciences, Washington, DC, 2004). Uporaba srebra kot baktericidnega sredstva se je začela zaradi povečanja rezistence bakterij na tedaj poznane antibiotike (Harold B., 2006). Koloidno srebro se je začelo ponovno uporabljati pred nedavnim za zdravljenje različnih bolezni. Dandanes se Ag0 uporablja kot dezinfekcijsko sredstvo v vodi (Solsona F. in Mendez J. P., 2003). Optimalno količino koloidnega srebra, ki je potrebna za kar najboljšo stopnjo dezinfekcije, je zahtevno dokazati. Ta še danes ni dokončno določena. V teku je kar nekaj študij, ki se ukvarjajo s tem, kakšna je še sprejemljiva količina nanosrebra v vodi, ki ne ogroža zdravja organizmov in okolja (McShan D. in sod., 2014). Koncentracija nanodelcev srebra ne sme biti previsoka, ne prenizka. V primeru, da je koncentracija srebra nezadostna, bo dezinfekcija vode slaba in nepopolna. Če pa je koncentracija srebra v vodi previsoka, lahko postane zdravju škodljiva (Korte D in sod., 2011). Zato je potrebno razvijati visoko občutljive tehnike, s katerimi je mogoče hitro in natančno izvajati monitoring, spremljati koncentracijo nanodelcev v vodi ter povezati njihove fizikalne lastnosti, kot so velikost in oblika, z baktericidno učinkovitostjo (Korte D. in sod., 2011). Tehnologije uvajanja koloidnega srebra kot dezinfekcijskega sredstva so se izvajale desetletja na pobudo Svetovne zdravstvene organizacije (WHO), Nacionalne zrakoplovne in vesoljske uprave (NASA) ter Evropske vesoljske agencije (ESA) (Solsona F. in Mendez J. P., 2003). Dva primera trenutno uporabljenih metod za detekcijo koloidnega srebra v vodi sta UV-Vis spektrofotometrija in kalorimetrična ekstrakcija na trdni fazi (C-SPE). UV-Vis spektrometrija je opisana v nadaljevanju naloge, saj smo jo uporabili pri našem delu. Omenjeni tehniki sta hitri in enostavni, a ne dovolj natančni in selektivni za zelo majhne koncentracije srebra v vodnih raztopinah. Zato je bilo potrebno razviti natančnejše metode. Visoko selektivnost in občutljivost pri določevanju nizkih koncentracij snovi v tekočih vzorcih zagotavljajo laserske metode, ki temeljijo na učinku toplotnih leč, kot je spektroskopija s toplotnimi lečami (TLS). S spektroskopijo s toplotnimi lečami so dosegli več kot 50-kratno znižanje spodnje meje detekcije (LOD) (Korte D. in sod., 2011), v primerjavi s prej uporabljenimi tehnikami (Bruzzoniti M. C. in sod., 2009). Prvi del diplomske naloge obsega opis priprave vzorcev koloidnega srebra različnih koncentracij s pomočjo kemijske redukcije ionov srebra z natrijevim borohidridom. Preučevali smo različne lastnosti koloidnega srebra. Preučevali smo valovno dolžino, pri kateri je absorpcija nanodelcev maksimalna, in čas, potreben za popolno redukcijo Ag+ do Ag0. Določili smo koncentracijo Ag0 za realne vzorce iz okolja s SPEC in TLS metodo. Realne vzorce je predstavljala rečna voda Soče, Vipave in Lijaka ter voda iz pipe. Nato smo primerjali izmerjene vrednosti koncentracij realnih vzorcev, merjenih z SPEC in TLS metodo. V drugem delu diplomske naloge smo preučevali baktericidno učinkovitost nanodelcev srebra različnih koncentraciji, katerih vrednosti so bile enake najvišji dovoljeni koncentraciji (MCL) za Ag0 v pitni vodi, minimalni koncentraciji Ag0, ki se uporablja v medicini kot razkužilo, in vrednosti koncentracije srebra med tema dvema vrednostma.

2

Za zaključek eksperimentalnega dela smo določili velikosti nanodelcev srebra v vzorcih koloidnega srebra različnih koncentracij z uporabo metode, ki temelji na osnovi dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) in z vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM). Z uporabo DLS metode smo merili velikost delcev, s SEM metodo pa smo poleg velikosti določevali tudi njihovo obliko.

2. TEORETIČNE OSNOVE Srebro uvrščamo med kovine in elemente v sledovih. Na periodnem sistemu ga najdemo med prehodnimi elementi. Srebro ne spada med elemente v sledovih, ki so nujno potrebni za normalno funkcioniranje človeškega telesa. Ocene kažejo na to, da ga s hrano vnesemo v telo od 22 do 80 mg na dan. Naše telo sestavlja le okrog 1 mg srebra (Kehoe R. A in sod., 1940). 2.1 Prisotnost srebra v okolju Srebro je nasploh redek element, saj koncentracija srebra v zemeljski skorji znaša le okrog 0,1 ppm in 0,3 ppm v tleh. V zrak se srebro sprošča z naravnimi procesi (Agency for toxic substance and disease registry., 1990). Primer takega procesa je preperevanje kamnin. Srebro se nahaja v tleh predvsem v netopni obliki, kot klorid ali sulfid. Dokler sulfid ni oksidiran v sulfitno obliko, je njegova mobilnost majhna in s tem je tudi nevarnost onesnaženja vodnih teles zanemarljiva. Srebro se v rečni vodi raztopi z reakcijami s kloridom in humusnim materialom (Whitlow S. I in Rice D. L., 1985). Koncentracija srebra v zraku je manjša od 1 ppb (US environmental protection agency, 1980). V naravnih vodah je koncentracija srebra od 0,2 do 0,3 ppm. Koncentracija srebra v pitni vodi v ZDA, ki ni obdelana z srebrom, znaša 0–5 ppm. V raziskavi, v kateri so analizirali vodo iz pipe, so ugotovili, da je le 0,1 % vzorcev vode vseboval več kot 50 ppb srebra na liter vode iz pipe (US environmental protection agency, 1980).

2.2 Fizikalne lastnosti in uporaba srebra Električna in toplotna prevodnost srebra je višja kot pri ostalih kovinah. Srebro se v obliki soli, oksidov in halogenidov uporablja za fotografski material, v alkalnih baterijah, v električnih napravah, trdih zlitinah, pri izdelavi ogledal, kemijski katalizi, izdelavi kovancev in izdelavi nakita. Topne srebrove spojine se lahko uporablja kot antiseptično sredstvo za zunanjo uporabo (15–50 ppb), baktericidno sredstvo (do 100 ppb) in kot dezinfekcijsko sredstvo (> 150 ppb) (National Academy of Sciences., 1977). V diplomski nalogi smo imeli opravka s koloidnim srebrom. Koloid je tehnično definiran kot delec, ki ostane suspendiran, ne da bi tvoril ionsko raztopino ali pa se raztopil v določenem mediju (Alberty R. A., 1987). Koloidna raztopina je sestavljena iz dispergirane snovi in disperznega sredstva. Koloidna raztopina je kemijska zmes, kjer je ena snov razpršena enakomerno v drugi snovi.

2.3 Fizikalne in kemijske lastnosti koloidnega srebra Koloidno srebro vsebuje 20–15000 srebrovih ionov. Spada med novejše vrste materialov z izrednimi fizikalno-kemijskimi lastnosti. Med te spadajo optične, elektromagnetne, toplotne, električne, katalitske in baktericidne lastnosti. Najpomembnejša lastnost koloidnih delcev pa je njihova velika površina (Kelly K. L. in sod., 2003). Srebro v obliki nanodelcev je bolj strupeno kot večji delci srebra ravno zaradi večje površine (Choi O. in sod., 2008).

3

Srebrovi nanodelci so lahko različnih oblik (okrogli, podolgovati, trikotni), prevlek/premazov (peptidni, polimerni, citratni) in različnih velikosti (1–100 nm) (Oldenburg J., 2015). Zaradi njihovih ugodnih toplotnih, optičnih in električnih lastnosti se nanosrebro uporablja v raznih premazih za izboljšanje prevodnosti materialov. Optične lastnosti nanosrebra omogočajo njihovo uporabo v proizvodnji senzorjev, saj so nanodelci srebra zelo učinkoviti pri zbiranju in razpršitvi svetlobe, zaradi velikega števila prevodnih elektronov na svoji površini. Ta lastnost nam omogoča, da lahko nanodelce srebra zaznamo že pod navadnim svetlobnim mikroskopom, če so obsevani s svetlobo določene (ustrezne) valovne dolžine. V primeru osvetlitve z belo svetlobo Ag0 vidimo kot modre svetleče pike na temni podlagi mikroskopa. Jakost absorpcije in sipanja svetlobe nanosrebra lahko reguliramo s spremembo valovne dolžine svetlobe (med 400 in 530 nm), s katero obsevamo srebro, s spremembo velikosti Ag0 delcev in s spremembo kota osvetljevanja površine delca (Oldenburg J., 2015).

2.4 Baktericidne lastnosti koloidnega srebra Nanodelci srebra se zaradi svojih baktericidnih lastnosti zmeraj pogosteje in obsežneje uporabljajo v najrazličnejših produktih. Uporabljajo se v tekstilnih proizvodih (pri proizvodnji oblačil, spodnjega perila in nogavic), prehranski industriji, pri izdelkih za vsakdanjo uporabo (sobnih dišavah v sprejih, detergentih, barvah) in v ortopedski industriji (številne proteze) in medicinskih pripomočkih (obveze, kontracepcijski pripomočki, kirurški pripomočki). Naloga koloidnega srebra pri naštetih produktih je, da konstantno oddajajo majhne količine nanosrebra in tako preprečujejo rast ter razmnoževanje bakterij (Chen X. in Schleuesener H. J., 2008). Nanosrebro se že vrsto let uporablja za dezinfekcijo pitne vode, saj ne spremeni njenega okusa, vonja, barve, pa tudi nobeni stranski produkti se ne oblikujejo kot posledica njegove uporabe (Li Q. in sod., 2008).

2.5 Standardi za varno uporabo koloidnega srebra Napotke za varno uporabo koloidnega srebra za dezinfekcijo vode je izdala Svetovna zdravstvena organizacija (WHO), ki je določila ustrezne koncentracije Ag0 v vodi za učinkovito dezinfekcijo.

Gibljejo se med 25 g/l in 75 g/l. Največja dovoljena vrednost koloidnega srebra v vodi (MCL) pa

je med 50 g/l in 100 g/l, odvisno od posamezne države (Solsona F. in Mendez J. P., 2003). Največja dovoljena vrednost (MLC) srebra je določena s sekundarnim standardom o pitni vodi. Ta standard je narejen na podlagi vrednosti tistih parametrov, ki lahko vplivajo na vizualno stanje vode, na okus in vonj vode. Sekundarni standard o kakovosti pitne vode poudarja, da tudi v primeru preseženih vrednosti parametrov, voda ni škodljiva za zdravje. Obratno je pri primarnem standardu, kjer presežene vrednosti parametrov lahko pomenijo grožnjo za zdravje v primeru zaužitja vode (Goldberg A. A in sod., 1950). Zakonska omejitev glede največje količine srebra v vodi je potrebna, saj se srebro akumulira v telesu za nedoločen čas. Čeprav še ni jasno, na kakšne načine vse vpliva srebro v telesu, je znano, da velike količine srebra v telesu povzročajo modro obarvanje kože (argyria), nalaganje srebra v očeh, poškodbe na tkivih in organih, lahko tudi smrt (McShan D. in sod., 2014). Vrednosti za srednji smrtni odmerek pri zaužitju (LD50) je med 50 in 100 mg srebra na kilogram telesne teže osebka (Goldberg A. A. in sod., 1950). Srednja smrtna vrednost (LD50) predstavlja količino snovi, ki ubije polovico osebkov v testni populaciji po določenem času.

4

S širjenjem uporabe nanosrebra v vsakdanjem življenju se posledično povečuje tudi število študij, v katerih se ukvarjajo z vprašanjem, kako kemijske in fizikalne lastnosti koloidnega srebra vplivajo na zdravje človeka in kako vpliva nasploh na vse organizme in okolje. Največ nanosrebra se v okolje sprosti s pranjem tekstila, raznimi medicinskimi pripomočki, dezodoranti in spreji ter nasploh z vso kozmetiko. Spreji z nanosrebrom so še posebej zanimivo področje, saj se nanodelci, ki preidejo v okolje iz sprejev, z lahkoto vnašajo v telo z dihanjem. To je glavna pot vnosa nanosrebra. Ugotavljanje količine in posebej učinka nanosrebra na okolje ter organizme je in bo posebej zahtevno, saj je težko predvideti, koliko nanodelcev se sprosti v okolje. Tudi veliko izdelkov, ki naj bi vsebovali nanosrebro, ga sploh niso vsebovali, so pokazale študije (Reidly B. in sod., 2013). Nadzorovanje količine nanodelcev, sproščene v okolje, je zato zelo zahtevno.

2.6 Baktericidno delovanje koloidnega srebra Za razumevanje delovanja nanosrebra je potrebno natančno poznati njegove fizikalne in kemijske lastnosti, ki so odvisne od oblike in velikosti nanodelcev. Danes je v teku veliko raziskav, ki poizkušajo raziskati vpliv nanodelcev srebra na okolje in zdravje ter oceniti njegovo koncentracijo v okoljski vzorcih (McShan D. in sod., 2013). Nanodelci koloidnega srebra imajo veliko površino (McShan D. in sod., 2013), ki se zlahka oksidira z O₂ , pri reakcijah še z nekaterimi drugimi elementi iz okolja ali organizmov pa se začnejo sproščati strupeni kationi Ag⁺ . Strupenost nanosrebra je torej odvisna od hitrosti sproščanja Ag⁺ . Dokazano je bilo, da nanodelci koloidnega srebra vstopajo v celico in sproščajo katione Ag⁺ znotraj celice (McShan D. in sod., 2013). Sproščeni kationi Ag⁺ povzročajo oksidativni stres v celicah in jih na ta način poškodujejo. Poškodujejo lahko celične membrane, onemogočajo aktivacijo antioksidativnih encimov in uničujejo antioksidativne molekule. Še vedno pa ni jasno, koliko prispevajo k sproščanju ionska oblika srebra in koliko koloidna oblika (McShan D. in sod., 2014). V bioloških in okoljskih medijih so nanodelci koloidnega srebra podvrženi določenim razmeram. Površinska prevleka nanodelcev je sestavljena iz citronske kisline, aminokislin in še nekaterih drugih spojin. Ti premazi so nekovaletno vezani na delce. Na nekatere delce se vežejo močneje, na nekatere šibkeje, zato nekateri delci izgubijo tovrstni površinski premaz in tako postanejo nestabilni v okolju. Zaradi izgube površinskega premaza se na delce srebra vežejo druge molekule, kot so voda ali anorganski ioni, in tako postanejo nanodelci srebra nestabilnejši. Pod določenimi pogoji v biološkem ali okoljskem mediju pride do površinske oksidacije in sproščanja Ag⁺ . Kationi Ag⁺ nastanejo, kadar atomi srebra na površini nanosrebra reagirajo s kisikom in pri tem nastane srebrov oksid. Srebrov oksid v interakciji z medijem sprošča Ag⁺ , ki je močno toksičen ( McShan D. in sod., 2014). Baktericidni učinek delcev koloidnega srebra temelji na poškodovanju bakterijske membrane in zunajceličnih proteinov. Količina in hitrost vezave nanodelcev na površino bakterije ali zunajcelične proteine je odvisna od pH raztopine, elektrokinetskega potenciala in koncentracije NaCl (Duran N. in sod., 2007). Dodajanje nanosrebra v vodo povzroča zmanjšanje encimske aktivnosti znotraj celice bakterije. Poleg tega se nanodelci srebra drugače vežejo v primeru gram pozitivne in gram negativne bakterije (Duran N in sod, 2007). Pri gram negativni bakteriji (npr. Salmonella typhhimurium) se nanosrebro veže na zunanjo membrano celice, medtem ko se pri gram pozitivni bakteriji (npr. Staphyloccocus aureus) veže na celično steno. Manjši delci (s premerom 1–10 nm) so zaradi večje skupne površine uspešnejši pri baktericidnem delovanju (Duran N. in sod, 2007). V študiji (Pal S. in sod., 2007) so preučevali antibakterijske lastnosti nanodelcev različnih oblik pri gram negativni bakteriji Escherichia coli v tekočem mediju in na trdih agar gojiščih. Prišli so do zaključka, da so imeli nanodelci srebra v obliki trikotne prizme najmočnejšo baktericidno aktivnost

5

v primerjavi z nanodelci sferične in podolgovate (cevaste) oblike ter Ag+ (v AgNO₃ obliki). Uspešnost baktericidnega delovanja nanosrebra je odvisna od njegove koncentracije (Sondi I. in Salopek-Sondi B., 2004 in Pal S. in sod., 2007). Ugotovljeno je bilo, da je učinek nanosrebra večji na gram negativne bakterije kot na gram pozitivne bakterije (Shrivastava S. in sod., 2007). Shrivastava in sod. (2007) trdijo, da je antibakterijski učinek neodvisen od pridobitve odpornosti bakterij na antibiotik. Rast bakterijskih celic se je močno povečala po zmanjšanju koncentracije nanosrebra. Tukaj je potrebno omeniti, da je inhibicija rasti bakterij odvisna od koncentracije nanosrebra, kot tudi od začetnega bakterijskega števila. S postopnim zniževanjem koncentracije nanosrebra se omogoči nadaljevanje rasti bakterij. Proces rasti bakterij je uravnavan z interakcijo nanodelcev srebra z znotrajceličnimi snovmi v propadli celici. Z interakcijo med delci in znotrajceličnimi snovmi pride do koagulacije delcev in njihove odstranitve iz tekočega medija. Ti delci imajo omejene zmožnosti delovanja kot biocidni material zaradi nizke stabilnosti koloidov (Sondi I. in Salopek-Sondi B., 2004 in Pal. S in sod., 2007).

2.7 Pregled analiznih tehnik za določevanje koncentraciji in lastnosti koloidnega

srebra Kalorimetrična ekstrakcija na trdni fazi

Kalorimetrična trdo-fazna ekstrakcija je preprosta in hitra metoda za ugotavljanje ionskega ter koloidnega srebra v vodnih vzorcih. Metoda temelji na ekstrakciji srebra iz vodne raztopine na način, da raztopina potuje skozi membrano, ki je impregnirana s kolorimetričnim reagentom 5-[4-(dimetilamin)benzidilen]rodanin (DAMBR). Srebro reagira z DAMBR reagentom, kar povzroči obarvanje spojine, ki je nato kvantificirana s spektrofotometrom. S tem postopkom se ionsko srebro določa v vodni raztopini. Celokupno srebro se določa tako, da gre raztopina najprej skozi komoro, ki vsebuje ozon. Tukaj se koloidno srebro oksidira v ionsko srebro. Nadaljnji postopek je enak kot pri določanju ionskega srebra. Ta metoda je zelo hitra (manj kot 2 minuti), zanjo potrebujemo majhno količino vzorca (1 ml) (Hill A. A. in sod., 2010).

Pretočna injekcijska analiza (FIA) Metoda temelji na redukcijski reakciji z borohidridom, pri čemer se formirajo koloidi srebra, ki jih določimo pri valovni dolžini 390 nm. S to metodo se lahko določa srebro v vzorcu v koncentracijah 0,050–5 mg/l. Metoda deluje na principu vbrizgavanja nosilnega medija in natrijevega borohidrida v rekcijsko tuljavo. Voda in borohidrid sta vbrizgana v reakcijsko tuljavo po ločenih poteh z dvema črpalkama. Približno 20 cm pred združitvijo curka vode in borohidrida se v curek z vodo vbrizga določeno koncentracijo Ag+ . Ko se tokova združita, sta usmerjena v reakcijsko tuljavo, kjer se formira koloidno srebro. Nato je vzorec koloidnega srebra določen s svetlobo valovne dolžine 390 nm in z uporabo detektorja z diodnim nizom (DAD). Največja prednost te metode je hitrost analize vzorcev. (Bruzzoniti M. C. in sod., 2010).

6

Slika 1: Skica delovanja pretočne injekcijske analize Plamenska atomska absorpcijska spektrometrija (FAAS) Ugotavljanje koncentracije srebra v vzorcih s plamensko atomsko absorpcijsko spektrometrijo (FAAS) je primerna za vzorce z višjimi koncentracijami. Vzorec se vodi v plamen, kjer se ga pod visoko temperaturo (> 2000 ⁰C) atomizira, da dobimo proste atome. V uplinjene atome vodimo svetlobo, ki jo atom absorbira. Posamezni atomi nato emitirajo svetlobo valovnih dolžin, ki so značilne za določen element. Emitirana svetloba vzorca potuje skozi monokromator na detektor. Vsak delec emitira svetlobo določene valovne dolžine, na podlagi katere se prepozna naravo delca (Bianchin J. N., 2011).

Slika 2: Skica delovanja plamenske atomske absorpcijske spektrometrije Stripping (ločevalna) voltametrična metoda Voltametrične metode analize vključujejo aplikacije, ki temeljijo na vzpostavitvi potenciala v mediju in merjenju spremembe jakosti toka pri potovanju skozi medij. Veliko različnih voltametričnih metod je bilo razvitih na tem principu. Te metode so se izkazale za zelo uporabno orodje pri analiziranju kovin v sledovih v različnih raztopinah (organskih, anorganskih).

V voltametriji se kot elektrokemijska celica uporablja 3-elektrodna celica (Slika 3). Ta celica je sestavljena iz + in – elektrode (referenčne in števne elektrode). Napetost se ustvari in uravnava med + in – elektrodo (referenčna in delovna elektroda), medtem ko se med števno in delovno elektrodo meri električni tok.

7

Slika 3: Skica 3-elektrodne celice

Stripping (ločevalna) voltametrija je dvostopenjska metoda, ki omogoča simultano določanje različnih anorganskih in organskih delcev. Prvo stopnjo sestavlja elektrolitsko odlaganje kemijskih delcev na inertno elektrodno površino ob konstantni napetosti. Pri ločevalni voltametriji se najpogosteje uporablja katodne procese za odlaganje, pri katerih se kovinski ionski delci reducirajo iz raztopine na površino elektrode. V drugem koraku se ob specifični napetosti zgodi ločevanje (stripping) specifičnih delcev akumuliranih na površini elektrode v tanki plasti nazaj v raztopino. To pomeni, da z določeno napetostjo ločimo le določeno vrsto delcev s površine elektrode. Z analizo napetostnega vrha lahko določimo naravo elementa v vzorcu, iz grafa nivoja napetosti pa lahko razberemo koncentracijo kovinskih delcev v vzorcu. Dobljeni faradični tok je sorazmeren koncentraciji delcev v raztopini (Biosensors 2015).

Na Sliki 4 lahko vidimo prvo in drugo stopnjo voltametrične metode. Na levi skici (Slika 4) lahko vidimo odlaganja delcev na elektrodno površino. Skica prikazuje tudi ločevanje/odvzemanje delcev iz površine elektrode nazaj v tekočino vzorca s pomočjo spreminjanja napetosti.

Slika 4: Skica delovanja voltametrične metode

8

Voltametrična metoda za določevanje srebra z izboljšanim elektrodnim ogljičnim premazom (CPE). CPE elektroda je zelo primerna zaradi svojih dobrih lastnosti, kot so hitra priprava, večkratna uporaba, nizka cena in stabilnost. S premazom iz srebrovih nanocevk in kelatnega reagenta so naredili ta premaz še uspešnejši za zbiranje ionov v vzorcu. Elektroda, na kateri se zbirajo srebrovi ioni, je prevlečena z ogljičnim premazom, modificiranim z dodatkom večplastnih nanocevk in kelatnega reagenta. Kelatni reagent povečuje občutljivost in prevodnost. Nanocevke pa povečujejo površino in s tem občutljivost zaradi povečane površine. Okrog elektrode, prevlečene s tem premazom, je bila zaznana večja količina srebrovih ionov kot na običajni elektrodi (Cheraghi S. in sod., 2015). UV-Vis spektrofotometrija UV-Vis spektrometrija je metoda, ki temelji na absorpciji ultravijolične in vidne svetlobe v vzorcih. Spektrofotometer je sestavljen iz vira svetlobe, monokromatorja, nosilca vzorca, detektorja in računalnika oziroma digitalnega prikazovalnika. V našem primeru vir svetlobe oddaja svetlobo valovne dolžine od 190 nm do 800 nm. Svetloba potuje do monokromatorja. Osnovni del monokromatorja je prizma. Stranici prizme sta pod kotom 60°. Na tej ploskvi se bela svetloba, ki ima valovne dolžine od 190 do 800 nm, lomi pod takim kotom, da nastane cel spekter barv. Naprej potuje svetloba do vzorca v obliki le ene barve določene valovne dolžine. Za vzorcem se nahaja detektor. Detektor zaznava količino svetlobe, ki je prišla skozi vzorec in ni bila absorbirana na delcih v vzorcu. Bistvo je, da na vzorec ne pride svetloba v obliki bele barve, ampak posamezne barve oziroma barve posameznih valovnih dolžin, za kar poskrbi monokromator. Za vzorcem se nahaja detektor. Detektor zaznava količino svetlobe, ki je prišla skozi vzorec in ni bila absorbirana na delcih v vzorcu. Za detektorjem se nahaja zaslon, na katerem se izpisujejo vrednosti absorbance.

Slika 5: Skica delovanja UV-Vis spektrofotometra

Absorbanca snovi predstavlja količnik med količino svetlobe, ki je prišla na vzorec, in količino svetlobe, ki je prišla skozi vzorec na detektor.

𝐴 = 𝑙𝑜𝑔 𝐼 / 𝐼ₒ (1) A – absorbanca I – intenziteta vse sprejete svetlobe vzorca Iₒ – intenziteta presevane svetlobe skozi vzorec

9

Spektroskopija s toplotnimi lečami (TLS) Spektroskopija s toplotnimi lečami temelji na optotermičnem pojavu. Optotermični pojav se zgodi, ko se energija elektromagnetnega valovanja (vzbujevalni žarek), ki se v vzorcu absorbira, pretvori v toploto. Kot posledica tega se pojavijo spremembe lastnosti vzorca (gostota, temperatura, lomni količnik) in nastane tako imenovana toplotna leča (Franko M in Tran C. D., 1996). Spremembe lastnosti vzorca zaznavamo z drugim laserskim žarkom (poskusni žarek), ki se ob prehodu skozi toplotno lečo razprši. Velikost spremembe njegove intenzitete je odvisna od koncentracije določevane snovi v vzorcu.

Slika 6: Vzpostavitev toplotne leče v vzorcu pri TLS meritvah

Metoda dinamičnega sipanja svetlobe (DLS) Delovanje inštrumenta na osnovi dinamičnega sipanja svetlobe je prikazano na Sliki 7. Laser usmerja snop svetlobe na vzorec. Svetloba se na delcih v vzorcu razprši. Sipanje svetlobe na molekulah je odvisno od njihove velikost in hitrosti gibanja.

10

Slika 7: Skica delovanja inštrumenta na osnovi dinamičnega sipanja svetlobe (DLS)

Slika 8: Skica, ki ponazarja razlike v intenziteti signala v odvisnosti od velikosti delcev

Analize nihanja intenzitete sipane svetlobe podajo informacije o velikosti delcev v vzorcu. V primeru, da svetloba zadene večji delec, bo intenziteta sipanja svetlobe nihala z majhno frekvenco zaradi počasnejšega gibanja delca. V primeru, da snop svetlobe zadene manjši (hitreje se gibajoči) delec, se bo intenziteta svetlobe, ki ga bo delec sipal, spreminjala s večjo frekvenco (Slika 8). Časovno spremembo intenzitete sipanja svetlobe se eksperimentalno določi z izračunom tako imenovane funkcije korelacije g(t), s čimer ugotovimo difuzijsko konstanto D, ki je odvisna od polmera (R) delcev, kar opisuje enačba Stokesa – Einsteina:

𝐷 = 𝑘𝐵𝑇/6𝜋𝜂𝑅, (2) kjer je,

kB – Boltzmanova konstanta, T – temperatura,

11

Ƞ – viskoznost. Meritve pri uporabi DLS inštrumenta zahtevajo, da so delci sferični in da se gibljejo neodvisno eden od drugega, kar pomeni, da ne smejo aglomerirati v večje strukture.

Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) Vrstični elektronski mikroskop deluje na način, da usmerja curek elektronov v brezzračnem prostoru na površino vzorca. Interakcije elektronov z materialom vzorca ustvarja sliko njihove površine. Ker imajo elektroni mnogo nižjo valovno dolžino od vidne svetlobe, so povečave s SEM mikroskopom do 1000-krat višje kot s svetlobnimi mikroskopi. Resolucija SEM mikroskopa je 1 nm–20 nm.

Slika 9: Skica delovanja vrstičnega mikroskopa Bistvo vrstičnega elektronskega mikroskopa je, da za opazovanje majhnih struktur uporabljamo snope elektronov namesto svetlobe. Vzorec se nahaja v vakuumu. To dosežemo z mehanskim izsesavanjem zraka iz komore. Tlak v vakuumski komori mora biti izredno nizek (10⁻⁵ Pa). V primeru, da bi bil v komori standardni tlak, ustrezno potovanje elektronov po prostoru od elektronske puše do vzorca ne bi bilo mogoče (zaradi majhne mase elektrona). Elektronska puša je vir elektronov. Puša se nahaja na vrhu komore, ki je usmerjena navzdol proti dnu komore, kjer se nahaja vzorec. Med elektronsko pušo in vzorcem se nahajajo leče, ki fokusirajo curek elektronov na vzorec. Elektroni v elektronski puši so izsevani s pomočjo katode in pospešeni z anodo, dokler ne dosežejo energije 1–50 keV. Snop elektronov je usmerjen in fokusiran (1–5 nm) s kondenzorskimi lečami. Mikroskop je lahko opremljen z eno ali dvema kondenzorskima lečama. Elektroni, ki so bili izsevani iz elektronske puše na vzorec, so primarni elektroni. Ko ti elektroni zadenejo vzorec, nastanejo številni signali kot posledica sipanja primarnih elektronov na površini vzorca. Signali, ki nastanejo pri trkih primarnih elektronov s površino vzorca (npr. povratno sipane elektrone, sekundarni elektroni), so zajeti z detektorjem in nato preoblikovani v sliko vzorca ter nosijo informacijo o kemijski zgradbi vzorca. Na podlagi barvnega kontrasta vzorca lahko ločimo,

12

ali je vzorec zgrajen iz težjih kovinskih atomov ali lažjih organskih molekul. V primeru, da je kontrast vzorca svetlejši, lahko predvidevamo, da je vzorec sestavljen iz kovinskih delcev.

3. METODE DELA

3.1 Uporabljene kemikalije in reagenti

- AgNO₃ (99,8 %, Carlo Erba); - Na0H (97 %, Carlo Erba); - NaBH₄ (98 %, Acros Organics); - 2x dH₂O (18 MΩ x m⁻¹, Nanopure); - Agar (Tryptic Soy agar, Fluka); - Gojišče (Nutrient broth No.1, Fluka).

3.2 Priprava vzorcev za UV-Vis meritve

3.2.1 Priprava osnovne raztopine

Stehtali smo 15,7 mg AgNO₃ in ga raztopili v 10 ml dvakrat deionizirane vode. Dobili smo raztopino srebra s koncentracijo 1 ppm. V naslednjem koraku smo redčili to raztopino do koncentracije 10 ppm, tako da smo vzeli 100µl 1 ppm raztopine AgN0₃. To smo prenesli v 10-mililitrsko merilno stekleničko, ki smo napolnili z deionizirano vodo tako, da je skupni volumen AgNO₃ raztopine in vode znašal 10 ml. To smo storili zaradi lažje priprave vzorcev koloidnega srebra z nizkimi koncentracijami.

3.2.2 Priprava raztopine reducenta 5 g 97% Na0H smo raztopili v 95 ml dvakrat deionizirane vode, da smo dobili 5% raztopino NaOH. Nato smo pripravili deionizirano vodo s pH 12,5, tako da smo v 100 ml 2 dH₂0 dodali 1,64 ml 5% NaOH. Vrednosti dobljenega pH smo nadzirali s pH-metrom (Hana Instruments HI 8417). V naslednjem koraku smo stehtali 95 mg NaBH₄ in pripravili 0,1 M NaBH₄ tako, da smo stehtano količino NaBH₄ raztopili v 25 ml vode s pH 12,5. To raztopino NaBH₄ smo redčili tako, da smo dobili 0,6 mM raztopino. Redčili smo tako, da smo 300 µl 0,1M raztopino NaBH₄ razredčili v 50 ml vode s pH 12,5.

Ko smo imeli pripravljeno raztopino srebra v vodi in raztopino NaBH₄ v vodi s pH 12,5, smo v 10-mililitrsko merilno stekleničko dodali ustrezno količino pripravljene raztopine AgNO₃ (odvisno od končne željene koncentracije koloidnega srebra), 1 ml 0,6 mM raztopine NaBH₄ in dodali 2 dH₂O do vrha merilne stekleničke, torej tako, da je celotni volumen raztopine koloidnega srebra znašal 10 ml. Za spektrofotometrične meritve smo pripravili 6 različnih vzorcev po zgoraj opisanem protokolu. Pripravili smo slep vzorec, ki je vseboval 1 ml raztopine NaBH₄ in do 10 ml dvakrat deionizirane vode. Nato smo pripravili raztopino koloidnega srebra s koncentracijo 0,3 ppm, tako da smo v 10ml merilno stekleničko dodali 0,3 ml 10 ppm raztopine koloidnega srebra, 1 ml NaBH₄ in dopolnili merilno stekleničko do 10 ml z dvakrat deionizirano vodo. Enako smo storili pri pripravi 0,5 ppm, 1,0 ppm, 1,5 ppm in 2,0 ppm vzorcev, le da smo v vzorec s koncentracijo 0,5 ppm dodali 0,5 ml raztopine koloidnega srebra, za 1,0 ppm dodali 1 ml, za 1,5 ppm 1,5 ml in v vzorec s koncentracijo 2,0 ppm dodali 2 ml raztopine Ag0. Raztopine smo ovili z aluminijevo folijo, da smo vzorce zaščitili pred svetlobo in s tem preprečili razpad nanodelcev srebra. Slednjih 6 vzorcev smo uporabili za merjenje absorbance na UV-Vis spektrofotometru, pripravo umeritvene premice

13

in določevanje LOD in določevanje koncentracije koloidnega srebra v realnih vzorcih, in sicer vode iz rek Soče ter Vipave in potoka Lijaka.

3.2.3 Priprava realnih vzorcev Določevali smo koncentracije Ag0 v rečnih vodah. Imeli smo vodo iz reke Soče, reke Vipave in potoka Lijaka. Vzorcem vod smo merili absorbanco brez predhodne obdelave. Rečno vodo smo le vlili v kiveto in vstavili v spektrofotometer.

3.2.4 Lokacije vzorčnih mest rečnih vod Na Slikah 6, 7, 8 lahko vidimo lokacije vzorčnih mest za analizirane rečne vode

Slika 10: Vzorčno mesto vode iz Soče

14

Slika 11: Vzorčno mesto vode iz Lijaka

Slika 12: Vzorčno mesto vode iz Vipave

3.3 Priprava vzorcev za TLS meritve

3.3.1 Priprava osnovne raztopine in raztopine reducenta Pri pripravi vzorcev za TLS meritve smo potrebovali enake reagente in kemikalije kot pri pripravi vzorcev za merjenje absorbance na spektrofotometru. Koloidno srebro smo pripravili po enakem postopku, kot je bil opisan pri pripravi vzorcev za spektrofotometrične meritve. Pripravili smo 10

vzorcev koloidnega srebra različnih koncentracij, slepi vzorec, ki je vseboval 1 ml NaBH₄

15

raztopine, in deionizirano vodo. Skupni volumen vsakega vzorca je znašal 10 ml. Nato smo

pripravili še 9 vzorcev, ki so vsebovali ustrezno količino raztopine AgNO₃, 1 ml NaBH₄ in deionizirano vodo do napolnitve 10ml merilne stekleničke. Koncentracije vzorcev koloidnega srebra so bile 0,01 ppm, 0,02 ppm, 0,03 ppm, 0,04 ppm, 0,05 ppm, 0,06 ppm, 0,07 ppm, 0,08 ppm in 0,10 ppm. Za vzorec s koncentracijo 0,01 ppm smo dodali 0,01 ml 10 ppm raztopine Ag+

v deionizirani vodi, 1 ml raztopine NaBH₄ in dopolnili z deionizirano vodo do končnega skupnega volumna 10 ml. Po enakem postopku smo pripravili še ostalih 8 vzorcev. Raztopine smo ovili z aluminijevo folijo, da smo jih zaščiti pred svetlobo in tako preprečili razpad nanodelcev srebra. Poleg opisanih vzorcev smo pripravili še 3 vzorce vode iz rek in vzorec vode iz pipe. Vsi vzorci so bili volumna 10 ml. Pripravljene vzorce smo uporabili za pripravo umeritvene premice in določanje LOD metode ter določanje koncentracije koloidnega srebra v realnih vzorcih vod iz pipe in rek Soče in Vipave ter potoka Lijaka.

3.3.2 Priprava realnih vzorcev Pri pripravi realnih vzorcev vod iz rek smo naše vzorce redčili z 2 dH₂O v razmerju 50:50, tako da smo vrednosti koncentracije koloidnega srebra določili na podlagi linearnega dela umeritvene premice. Vzorec vode iz pipe pa smo merili brez predhodne priprave ali obdelave. Vodo smo vlili iz pipe v kiveto in izvedli meritve TLS.

3.4 Priprava vzorcev za preučevanje baktericidnega učinka koloidnega srebra Za preučevanje baktericidnega učinka koloidnega srebra smo pripravili 4 vzorce koloidnega srebra različnih koncentracij po enakem postopku kot pri vzorcih, ki smo jih pripravili za meritve s SPEC in TLS metodama. Pripravili smo slepi vzorec, ki ni vseboval raztopine AgNO₃, temveč le 1 ml raztopine NaBH₄ in toliko 2 dH₂0, da je skupni volumen v merilni steklenički znašal 10 ml. Naslednji trije vzorci so bili koncentracij 200 ppb, 20 ppm in 60 ppm. V 200 ppb vzorec smo dodali 200 µl 10 ppm raztopine AgNO3, v 20 ppm vzorec 2 ml 100 ppm raztopine AgNO3, v 60 ppm

vzorec pa 6 ml 100 ppm raztopine AgNO3. V vse 3 vzorce smo dodali 1 ml NaBH₄ raztopine in dopolnili merilne stekleničke z vodo do 10 ml. Tukaj je potrebno opozoriti, da so bile te koncentracije tako pripravljenega koloidnega srebra v nadaljnji pripravi 4-krat razredčene v kulturi bakterij. To pomeni, da so končne koncentracije koloidnega srebra znašale 50 ppb, 5 ppm in 15 ppm.

3.4.1 Priprava gojišč Naslednja naloga je bila priprava gojišč za bakterije. Pripravili smo dve različni gojišči, tekoče gojišče (Agar) in trdo gojišče (Nutrient broth). Tekoče gojišče smo pripravili tako, da smo 16 g agarja raztopili v 400 ml vode. Za pripravo trdega gojišča pa smo raztopili 5 g prahu Nutrient Broth v 200 ml vode. Obe gojišči smo segrevali na plinskem gorilniku toliko časa, da sta se raztopini zbistrili in postali homogeni. Pri segrevanju je bilo pomembno, da se je topljenec raztopil, da ni prišlo do posedanja le-tega. Gojišči v steklenicah smo nato avtoklavirali 1 uro. Trdno gorišče smo razlili na petrijevke in pustili, da se je ohladilo in strdilo.

3.4.2 Priprava raztopine bakterij Nato smo pripravili bakterije z agarjem in ustrezno koncentracijo koloidnega srebra (razen v kontroli) v 5 epruvet. Prva epruveta je bila za kontrolo. V njo smo dodali 2 ml gojišča in 2 µl bakterij E.coli. V naslednje 4 epruvete smo dodali 1,5 ml gojišča, 2 µl bakterij in 500 µl raztopine

16

koloidnega srebra ustrezne koncentracije. To pomeni, da smo v drugo epruveto primešali 500 µl raztopine koloidnega srebra s koncentracijo 200 ppb, v tretjo 500 µl raztopine s koncentracijo 8 ppm. V četrto in peto epruveto smo ravno tako dodali 500 µl raztopine koloidnega srebra, in sicer koncentracije 20 in 60 ppm. Ker smo 500 µl koloidnega srebra pomešali v 1,5 ml gojišča, smo

dobili 4-krat manjše koncentracije koloidnega srebra. Epruvete smo nato dali inkubirati na 37 C za 24 ur. Raztopine bakterij iz epruvet smo ustrezno redčili. Redčitve za vsako koncentracijo bakterij smo naredili v epicah. Za redčitve do 10⁻⁷ smo uporabili 7 epic. Najprej smo vlili v vseh 7 epic 900 µL pripravljenega tekočega gojišča. Iz epruvete, ki je vsebovala raztopino bakterij in koloidnega srebra s koncentracijo 200 ppb, smo odpipetirali 100 µl in jo dodali v prvo epico, v kateri je bilo 900 µL gojišča. Tako smo dobili prvo redčitev 10⁻¹. Raztopina v vsaki naslednji epici je vsebovala 10-krat manjšo koncentracijo bakterij, saj smo iz prve epice odpipetirali 100 µl raztopine bakterij redčitve 10⁻¹ in jo dodali v drugo epico, ki je vsebovala 900 µl gojišča, ter tako dobili redčitev 10⁻². Po enakem principu smo naredili redčitve do 10⁻⁷. Na trda gojišča v petrijevkah smo nacepili raztopine bakterij treh redčitev, in sicer, 10⁻⁷, 10⁻⁶ in 10⁻⁵. Iz vsake epice omenjenih treh redčitev smo odpipetirali 100 µl raztopine bakterij, koloidnega srebra in tekočega gojišča ter jo vlili na petrijevke. Za vsako redčitev smo nacepili bakterije na 3 petrijevke. Iz vsake od petih epruvet, ki so vsebovale določeno koncentracijo koloidnega srebra, bakterij in gojišča, smo torej nacepili bakterije na 9 petrijevk. Petrijevke smo inkubirali 24 ur na 37 ⁰C.

3.5 Priprava vzorcev za meritve velikosti in oblike delcev s SEM-om Priprava vzorcev za meritve z mikroskopom SEM je potekala na enak način kot priprava vzorcev za meritve absorbance, baktericidnega učinka na bakterije, TLS in DLS meritve. Uporabili smo enake kemikalije in reagente.

3.5.1 Priprava osnovne raztopine in raztopine reducenta

Ponovno smo pripravili osnovno raztopino AgNO₃ in raztopino NaBH₄ v vodi s pH 12,5. Pripravljene koncentracije so bile identične tistim, ki smo jih pripravili za preučevanje baktericidnega učinka koloidnega srebra. Pripravili smo vzorce koloidnega srebra koncentracij 50 ppb, 1 ppm, 5 ppm in 15 ppm. Za opazovanje in merjenje delcev z mikroskopom SEM je bilo potrebno vzorce ustrezno nadalje pripraviti. Na silikonsko podlago velikosti 3x2 cm2 smo nanesli eno kapljico vsakega vzorca. Nato smo silikonsko podlago postavili na električni grelec in segrevali vzorce pri 50 ⁰C toliko časa, dokler se niso kapljice naših vzorcev posušile. Tedaj so bili naši vzorci na silikonski podlagi pripravljeni.

3.6 Priprava vzorcev za DLS meritve Za pripravo vzorcev za določevanje velikosti delcev koloidnega srebra z uporabo DLS tehnike smo potrebovali enake kemikalije in reagente kot pri pripravi raztopin koloidnega srebra za meritve na SPEC in TLS. Pripravili smo osnovno raztopino AgNO₃ v deionizirani vodi in pripravo reducenta, ki je vsebovala raztopino NaBH₄ v deionizirani vodi s pH 12,5.

3.6.1 Priprava osnovne raztopine in raztopine reducenta

Za pripravo osnovne raztopine AgNO₃ in raztopine NaBH₄ smo uporabili enake količine AgNO₃, NaBH₄, NaOH in deionizirane vode kot pri pripravi vzorcev za spektroskopske meritve. Razlika je

17

le v tem, da smo za potrebe DLS meritev pripravili drugačne koncentracije koloidnega srebra. Pripravili smo koncentracijo 0,05 ppm, 1 ppm in 5 ppm. Vzorce smo pred merjenjem filtrirali skozi celulozno membrano, ki je onemogočala prehod delcem, večjih od 0,45 µm. Filtrirali smo zato, da smo se znebili aglomeratov, ki onemogočajo meritve z DLS metodo. V vzorcih smo si želeli le delce, katerih velikosti nismo uspeli izmeriti s SEM metodo.

4. EKSPERIMENTALNI DEL

4.1 UV-Vis spektrofotometrija Absorbanco vzorcev koloidnega srebra smo merili na UV-Vis spektrofotometru Perkin Elmer Lambda 650s v Laboratoriju za raziskave v okolju Univerze v Novi Gorici.

Slika 13: UV-Vis spektrofotometer Perklin Elmer Lambda 650s

S spektrofotometrom smo merili absorpcijo svetlobe z valovno dolžino med 300 nm in 800 nm v vzorcih. Vsako meritev smo ponovili trikrat.

4.2 Spektroskopija s toplotnimi lečami TLS meritve smo opravili na spektrometru s toplotnimi lečami v Laboratoriju za raziskave v okolju Univerze v Novi Gorici.

18

Slika 14: Fotografija spektroskopa s toplotnimi lečami v Laboratoriju za raziskave v okolju Univerze v Novi Gorici Spektroskop s toplotnimi lečami sestavljata dva laserja, ki oddajata žarke modre in rdeče svetlobe. Prvi laser (Innova 300C, Coherent), katerega moč je 130 mW, oddaja svetlobo valovne dolžine 407 nm (vzbujevalni žarek). Svetlobo z valovno dolžino 407 nm smo izbrali kot vzbujevalni žarek zato, ker imajo vzorci koloidnega srebra največjo absorbanco pri tej valovni dolžini. Drugi laser (Uniphase, Model 1103P) oddaja svetlobo z valovno dolžino 633 nm, ki ni absorbirana v vzorcu (poskusni žarek). Modra svetloba iz laserja potuje do ogledala (Edmund Optics), ki preusmeri celoten žarek skozi mehanični modulator (Scientic instruments) in lečo do dikroničnega ogledala (Thorlabs). Naloga mehaničnega modulatorja je, da določeno časovno obdobje omogoča prehod svetlobe vzbujevalnega žarka, naslednje časovno obdobje pa onemogoča prehod svetlobe vzbujevalnega žarka skozi vzorec. V času, ko je prehod svetlobe vzbujevalnega žarka skozi mehanični modulator omogočen, se ta svetloba preko odboja od dikroničnega ogledala prenaša do vzorca koloidnega srebra, kjer je absorbirana, in sproščena v obliki toplote, kar vodi do segrevanja vzorca. Vzbujevalni žarek je bil moduliran na frekvenco 40 Hz. Leča (Edmund Optics) se nahaja med laserjem in vzorcem zato, da lahko po želji premikamo goriščno razdaljo snopa svetlobe. Namen leče je v tem, da svetlobo vzbujevalnega žarka zbira tako, da je ta fokusirana na vzorec. Naloga dikroničnega ogledala pa je, da svetlobo določene valovne dolžine prepušča, določene valovne dolžine pa odbija. V našem primeru je svetlobo poskusnega žarka prepuščal, tako da je svetloba

prišla do vzorca raztopine, plavo svetlobo pa je pod kotom 45 odbijal ravno tako v vzorec. Drugi laser oddaja svetlobo valovne dolžine 633 nm (poskusni žarek), ki tudi tukaj potuje skozi lečo. Leča (Edmund Optics) med vzpodbujevalnikom rdeče svetlobe in vzorcem omogoča, da se najtanjši pas žarka (najbolj fokusiran del snopa svetlobe) nahaja za razdaljo √3 f˪ oddaljen od

19

vzorca. F˪ je razdalja, enaka goriščni razdalji. Svetloba poskusnega žarka nato potuje mimo dikroničnega ogledala, ki prepušča svetlobo valovne dolžine 633 nm. Naloga poskusnega žarka je, da zaznava spremembe v vzorcu, ki nastanejo zaradi periodičnega segrevanja in ohlajanja vzorca s pomočjo vzbujevalnega žarka. V vzorcu koloidnega srebra se po obsevanju s svetlobo vzbujevalnega žarka spremeni lomni količnik in nastane tako imenovana toplotna leča, zaradi katere se svetloba poskusnega žarka v vzorcu razprši. Kot posledica razpršitve žarka se poveča njegov polmer in s tem tudi njegova intenziteta, kar zazna fotodioda (Thorlabs). Sprememba lomnega količnika vzorca pa je odvisna od količine srebra, ki absorbira svetlobo vzbujevalnega žarka in jo nato sprosti v obliki toplote. Skozi vzorec potujeta snopa svetlobe obeh žarkov, naprej preko zrcala in nato filtra do fotodiode. Ta filter je sestavljen iz barvnega (oranžnega) in interferenčnega dela (Thorlabs). Ta prepušča le svetlobo poskusnega žarka. Svetloba vzbujevalnega žarka in svetloba iz okolice ne moreta prehajati tega filtra in vplivati na vrednosti merjenega signala. Pomembno je, da pride do fotodiode le svetloba poskusnega žarka, saj ta nosi informacije o količini srebra v vzorcu. Ko enkrat pride svetloba poskusnega žarka, ki se je ustrezno razpršila na vzorcu sorazmerno z količino srebra do fotodiode, se ta pretvori v napetost, ki jo meri merilnik napetosti z ojačevalnikom (Stanford Research Model SR830 DSP).

Slika 15: Skica delovanja spektroskopa s toplotnimi lečami (TLS)

4.3 Meritve na osnovi dinamičnega sipanja svetlobe (DLS meritve) DLS meritve smo opravili v Laboratoriju za raziskave materialov Univerze v Novi Gorici na DLS inštrumentu Brook Haven 90 plus/Bi-mas, ki omogoča določevanje velikosti nanodelcev v območju med 2–2000 nm, pri čemer je pomembno, da je raztopina/suspenzija stabilna, z namenom preprečevanja aglomeriranja in posedanja delcev.

20

Slika 16: DLS inštrument Brook Haven 90 plus/Bi-mas

4.4 Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) Meritve na vrstičnem elektronskem mikroskopu (The JEOL JSM 7001 TTLS) smo opravili v Laboratoriju za raziskave materialov Univerze v Novi Gorici.

Slika 17: Fotografija vrstičnega mikroskopa na katerem so bile izvedene meritve delcev

5. REZULTATI IN RAZPRAVA

5.1 UV-Vis spektrofotometrija Nastanek koloidnega srebra temelji na kemijski redukciji ionskega srebra z borohidridom, ki jo opisuje enačba:

21

2𝐴𝑔𝑁𝑂₃ + 2𝑁𝑎𝐵𝐻₄ + 6𝐻₂𝑂 → 2𝐴𝑔 + 7𝐻₂ + 2𝑁𝑎𝑁𝑂₃ + 2𝐻₃𝐵𝑂₃ . (3)

Z analizo spektra svetlobe, ki jo nanodelci srebra absorbirajo, ko jih obsevamo s svetlobo določene valovne dolžine, lahko ugotovimo fizikalne lastnosti teh delcev.

5.1.1 Določanje časa, potrebnega za formacijo Ag0

V prvem koraku smo določili čas, potreben za formacijo Ag0. Za vzorec koloidnega srebra s koncentracijo 1 ppm smo izdelali graf, ki prikazuje čas, potreben za redukcijo ionskega srebra do koloidne oblike z uporabo borohidrida (Slika 18).

Slika 18: Graf prikazuje čas, potreben za redukcijo ionskega srebra do koloidne oblike

Iz grafa lahko vidimo, da se je Ag0 v celoti formiral po približno 1200 sekundah (okoli 20 minut). Do tega časa se je absorbanca logaritemsko povečevala v odvisnosti od časa. Po približno 1200 sekundah se je absorbanca vzorca ustalila in od tedaj naprej je bila konstantna. Iz prej opisanih razlogov smo meritve absorbance izvedli 20 minut po pripravi vzorcev (dodanju reduktanta BH4- do določene koncentracije Ag+).

5.1.2 Meritve absorbance vzorcev z različno koncentracijo Ag0

Na Sliki 19 lahko vidimo vrednosti absorbanc vzorcev koloidnega srebra s koncentracijami 0,5 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm in 20 ppm. Absorpcijski vrh je okrog 420 nm kot rezultat interakcije optičnega polja z nanodelci srebra, kar povzroča nihanje oblaka elektronov. Absorpcijski vrh srebrovih nanodelcev se poveča tako v višino kot v širino s povečanjem koncentracije srebrovih ionov. Vzorci z večjo koncentracijo (10, 15 in 20 ppm) imajo zamaknjen absorpcijskih vrh v smeri večje valovne dolžine (maksimum je pri 430 nm), kar kaže na prisotnost večjih delcev, kot v primeru koncentracji 0,5–5 ppm. Poleg tega so prisotni absorpcijski »repi«, ki kažejo na to, da se v teh vzorcih vrši intenzivnejša aglomeracija. Iz tega lahko sklepamo, da imamo v vzorcih z višjo koncentracijo večje delce in aglomerate srebra, zato imajo ti vzorci maksimalno absorpcijo pri večjih valovnih dolžinah kot vzorci z nižjo koncentracijo srebra (0,5, 1, 5 ppm), kjer ne poteka aglomeracija oziroma poteka počasneje in nastajajo manjši delci in aglomerati

0.050

0.055

0.060

0.065

0.070

0.075

0.080

0.085

0.090

0.095

0.100

0

51

10

2

15

3

20

4

25

5

30

6

35

7

40

8

45

9

51

0

56

1

61

2

66

3

71

4

76

5

81

6

86

7

91

8

96

9

10

20

10

71

11

22

11

73

Ab

sorb

anca

(a.

u.)

Čas(s)

22

koloidnega srebra. Oblikovanje aglomeratov je naključen proces, ki poteka zaradi vzpostavitve Van der Waalsovih vezi med bližnjimi molekulami v vzorcu, kar vodi do njihove anizotropije.

Slika 19: UV-Vis spekter za vzorce koloidnega srebra koncentracij 0,5; 1,0; 5,0; 10; 15 in 20 ppm

5.1.3 Določevanje LOD metode

Umeritveno premico smo naredili zato, da smo lahko določili LOD metode in izračunali vrednosti koncentracije koloidnega srebra v realnih vzorcih. Realne vzorce so predstavljale 3 različne rečne vode in voda iz pipe. Za pripravo umeritvene premice smo merili absorbanco vzorcem koloidnega srebra s koncentracijami 0,3 ppm, 0,5 ppm, 1 ppm in 2 ppm. Za izdelavo umeritvene premice (Slika 20) smo morali izbrati takšne koncentracije koloidnega srebra, katerih absorbanca linearno narašča z večanjem koncentracije, da velja Beer-Lambertov zakon. Iz Slike 20 lahko vidimo, da se absorbanca povečuje linearno z višanjem koncentracije vzorca. Absorbanco vseh vzorcev smo izmerili 3-krat in izračunali njihove povprečne vrednosti in standardne deviacije. Enačba odvisnosti absorbance od koncentracije je bila izračunana s pomočjo metode najmanjših kvadratov odstopanj. S tem postopkom smo lahko določili parametre regresijske premice in izračunali najmanjšo mejo detekcije (LOD) za določevanje koncentracije koloidnega srebra v vodi z UV-Vis metodo.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

300 350 400 450 500 550 600 650 700

Ab

sorb

anca

Valovna dolžina (nm)

0,5 ppm 1 ppm

5 ppm 10 ppm

15 ppm 20 ppm

23

Slika 20: Umeritvena premica za določevanje koncentracij koloidnega srebra v vodi pri uporabi UV-Vis spektroskopije Računanje meje zaznavnosti (LOD) Ag0 v vzorcih smo izvedli po enačbi:

𝐿𝑂𝐷 = 3x𝑆𝐷/𝑎, (4) kjer je a smerni koeficient umeritvene premice, SD pa standardna deviacija slepega vzorca, izračunana po enačbi:

𝑆𝐷 (𝜎) = √Ʃ (𝑥−𝑀)²

𝑁,

(5) pri čemer so x – posamezne vrednosti absorbance za določene koncentracije koloidnega srebra, M – aritmetična sredina dobljenih vrednosti absorbance za slepi vzorec N – število ponovitev meritve. Enačba umeritvene premice je y = 0,067x, korelacijska konstanta R2 pa je 0,9962. Izračunana LOD vrednost za meritve na spektrofotometru je znašala 8 ppb. To predstavlja teoretično najmanjšo vrednost koncentracije koloidnega srebra v vzorcu, ki jo lahko še izmerimo na UV-Vis spektrofotometru.

5.1.4 Meritve koncentracije realnih vzorcev Naš cilj je bil izmeriti koncentracijo koloidnega srebra v vodi iz pipe in reke Vipave, reke Soče in potoka Lijaka na podlagi umeritvene premice, ki jo opisuje premica:

𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏, (6) pri čemer je

y = 0.067xR² = 0.9962

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Ab

sorb

anca

Koncentracija vzorca (ppm)

24

y – absorbanca vzorca koloidnega srebra, x – koncentracija vzorca koloidnega srebra (ppb), a – smerni koeficient enačbe premice umeritvene premice, b – začetna vrednost enačbe umeritvene premice (v tem primeru je vrednost 0, ker premica poteka skozi koordinatno izhodišče). Z izpostavljanjem vrednosti absorbance na eni strani enačbe smo dobili končno obliko enačbe za izračun koncentracije srebra v vzorcu,

𝐾𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑗𝑎 (𝑥) =𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑎 (𝑦)−𝑧𝑎č𝑒𝑡𝑛𝑎 𝑣𝑟𝑒𝑑𝑛𝑜𝑠𝑡 (𝑏)

𝑆𝑚𝑒𝑟𝑛𝑖 𝑘𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡 (𝑎). (7)

Meritve za vsak vzorec smo opravili 3-krat, nato smo za vsako meritev določili koncentracijo koloidnega srebra v vodi iz enačbe 7 in izračunali njihove standardne deviacije iz enačbe 5. Dobljeni rezultati so predstavljeni v Preglednici 1. Preglednica 1: Vrednosti absorbanc in izračunana vrednost koncentracij vzorcev rečnih vod ter vode iz pipe.

Absorbanca vzorca Koncentracija vzorca (ppb)

Vzorec 1 (Vipava) 0,0071 ± 0,0002 105 ± 2

Vzorec 2 (Soča) 0,0040 ± 0,0002 60 ±2

Vzorec 3 (Lijak) 0,0052 ± 0,0003 78 ± 5

Vzorec 4 (voda iz pipe) 0,0017 ± 0,0001 23 ± 2

Zanesljivost spektrometrijskih meritev smo preverili s še bolj občutljivo tehniko – s spektroskopijo s toplotnimi lečami (TLS).

5.2 Spektroskopija s toplotnimi lečami (TLS)

5.2.1 TLS signal TLS signal je sorazmeren z absorbanco vzorca, močjo vzbujevalnega žarka in tako imenovanega faktorja ojačenja signala, kar omogoča zaznavanje zelo nizkih koncentracij snovi v vzorcih. Opisuje ga enačba:

I

𝐼= 2.30 𝐸𝐴 +

(2,303𝐸𝐴)²

2+ ⋯ , (8)

kjer je faktor E podan kot:

𝐸 =−𝑃

𝑑𝑛

𝑑𝑇

1,91𝜆𝑘 , (9)

25

pri čemer je:

I/I – relativna sprememba intenzitete poskusnega žarka, A – absorpcija vzorca, λ – valovna dolžina poskusnega žarka, P – moč vzbujevalnega žarka, k – toplotna prevodnost vzorca, dn/dT – temperaturni gradient lomnega količnika vzorca.

5.2.2 Določevanje LOD metode Za določitev najmanjše meje detekcije (LOD) za spektroskopijo s toplotnimi lečami (TLS) smo zopet naredili umeritveno premico, tako kot pri spektroskopskih meritvah. Naprej smo izmerili vrednosti absorbance slepega vzorca, ki je vseboval deionizirano vodo in NaBH₄. Nato smo izmerili še 8 ostalih vzorcev, ki so vsebovali ustrezno koncentracijo koloidnega srebra, od 10 do 80 ppb. Vsak vzorec smo izmerili 3-krat in nato izračunali njegovo povprečno vrednost ter standardno deviacijo. Slika 21 prikazuje graf odvisnosti TLS signala od koncentracije koloidnega srebra. TLS signal narašča z višanjem koncentracije Ag0. Nizke koncentracije koloidnega srebra (do 40 ppb) imajo nizke absorpcije (A < 0,1). Absorpcija narašča linearno z višanjem koncentracije vzorca, zaradi česar lahko drugi člen v enačbi 8 zanemarimo. Za koncentracije > 40 ppb pa začne signal naraščati kot kvadratna funkcija in je zato potrebno upoštevati oba člena v enačbi 8.

Slika 21: Odvisnost TLS signala od koncentracije vzorca Za pripravo umeritvene premice in določanje LOD metode smo izbrali take koncentracije koloidnega srebra, za katere TLS signal narašča linearno s koncentracijo vzorca (Slika 21), in sicer 10, 20, 30 in 40 ppb. Enačba umeritvene premice je y = 61x, korelacijska konstanta R2 pa znaša 0,986. Vrednost LOD smo izračunali po enačbah 4 in 5.

y = 1472.9x2 + 17.486xR² = 0.9906

0

2

4

6

8

10

12

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09

TLS

sign

al (

mV

)

koncentracija(ppm)

26

Določena vrednost LOD je bila 1,8 ppb, kar je več kot 4-krat nižje kot pri spektrofotometričnih meritvah.

Slika 22: Umeritvena premica za TLS metodo

5.2.3 Določevanje koncentracij srebra v realnih vzorcih Ko smo določili umeritveno premico in LOD metode smo pripravili še 4 vzorce, 3 vzorce rečne vode in vzorec vode iz pipe. Vzorce rečne vode smo pripravili v deionizirani vodi v razmerju 50:50 (v/v), zato da smo vrednosti koncentracije Ag0 lahko prebrali iz linearnega dela grafa odvisnosti TLS signala od koncentracije vzorca koloidnega srebra (Slika 21). Vzorec vode iz pipe je bil merjen brez predhodne obdelave. Vrednosti koncentracij vzorcev smo izračunali s pomočjo umeritvene premice (Slika 22) in enačbe 7 po identičnem postopku, kot je bil opisan pri računanju koncentracij pri vzorcih rečnih vod pri meritvah s spektrofotometrom. Dobljene vrednosti koncentracij koloidnega srebra v vzorcih vode iz rek smo morali zaradi predhodne redčitve z deionizirano vodo pomnožiti z 2, da smo dobili realne koncentracije. Voda iz pipe ni bila redčena z deionizirano vodo, zato je bila že prva izračunana vrednost ustrezna. V Preglednici 2 so prikazane vrednosti dobljenih koncentracij Ag0 v realnih vzorcih pri uporabi TLS metode. Preglednica 2: Določene koncentracije koloidnega srebra v rečni vodi in vodi iz pipe

Vipava Soča Lijak Voda iz pipe

TLS signal (mV) 3,08 ± 0,15 1,37 ± 0,13 2,54 ± 0,10 1,36 ± 0,04

Ag0 konc, ppb 100 ± 3 44 ± 3 82 ± 2 22 ± 1

y = 61.011xR² = 0.9863

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0.05 0.055

TLS

sign

al (

mV

)

koncentracija (ppm)

27

Če primerjamo vrednosti koncentracij rečnih vod in vode iz pipe, merjene z UV-vis spektrofotometrom in TLS metodo, lahko vidimo, da se rezultati ujemajo. To pomeni, da smo uspeli tudi s spektrofotometrom relativno natančno izmeriti vzorce z nizko koncentracijo srebra. V Preglednici 3 lahko vidimo primerjavo rezultatov, izmerjenih s TLS metodo in UV-vis spektrofotometrom. Preglednica 3: Primerjava vrednosti določenih koncentracij koloidnega srebra v vodah, merjenih z UV-Vis spektrofotometrom in s spektroskopijo s toplotnimi lečami (TLS)

Uv-vis meritve TLS meritve

Koncentracija Ag0 (ppb)

Soča 60 ± 2 44 ± 3

Vipava 105 ± 2 100 ± 3

Lijak 78 ± 5 82 ± 2

Voda iz pipe 23 ± 2 22 ± 1

Potrebno je poudariti, da realni vzorci vsebujejo poleg koloidnega srebra tudi različne druge ione, snovi, komplekse, ki lahko absorbirajo svetlobo pri valovni dolžini okrog 400 nm in s tem vplivajo na povečanje TLS signala, zaradi česar je določena koncentracija Ag0 višja, kot je realna vrednost (dodatna interferenca). Določene vrednosti Ag⁰ v vodi iz Vipave so verjetno nekoliko višje od mejne vrednosti (MLC = 50–100 ppb) zaradi drugih prisotnih ionov v vzorcu (poleg koloidnega srebra), ki absorbirajo pri enaki valovni dolžini. V vzorcu so lahko prisotni tudi ioni, ki ovirajo oblikovanje Ag0 oziroma povzročajo pretvarjanje tega v ionsko obliko (negativna interferenca), kar zniža vrednosti koloidnega srebra v vzorcu (Korte D in sod., 2011).

5.3 Baktericidno delovanje koloidnega srebra V 5 sterilnih epruvetah smo pripravili raztopine bakterij, tekočega gojišča in ustrezne koncentracije koloidnega srebra, kot je bilo opisano v Poglavju 3. V prvi epruveti ni bilo srebra (kontrola), v naslednjih 4 epruvetah pa so bile naslednje koncentracije koloidnega srebra: 50 ppb, 0,5 ppm, 5

ppm in 15 ppm. Tako pripravljene raztopine bakterij smo inkubirali 24 ur pri 37 C. Po tem času smo lahko videli že s prostim očesom, da je le v epruveti s koncentracijo 15 ppm prišlo do uničenja bakterij. To smo lahko opazili, saj raztopina ni bila motna za razliko od ostalih 4 epruvet z nižjimi koncentracijami srebra (Slika 23).

28

Slika 23: Raztopine bakterij, gojišča in srebra po inkubiranju za 24 ur pri 37 C

5.3.1 Zmanjšanje števila bakterij na gojiščih po določenem času z dodatkom določene

koncentracije koloidnega srebra Pri štetju števila bakterij na petrijevkah smo upoštevali, da iz ene celice zraste ena kolonija (CFU). Če želimo ugotoviti število bakterij na petrijevki, je potrebno število bakterij množiti z obratno vrednostjo redčitve.

Slika 24 prikazuje graf, ki predstavlja zmanjšanja števila bakterij na gojišču z redčitvijo 10⁻⁶ in določeno količino srebra (postopek priprave opisan v Poglavju 3). Kolonije so bile preštete po 24 urah od trenutka nacepljanja bakterij na plošče. Zmanjšanje števila bakterij po določenem času smo izračunali po slednji formuli:

% 𝑧𝑚𝑎𝑛𝑗š𝑎𝑛𝑗𝑎 = (𝑁(0)−𝑁(𝑡)

𝑁(0) 𝑥 100, (10)

N(0) – število bakterij ob času 0, N(t) – število bakterij po času t. Rezultati zmanjšanja števila bakterij v vzorcih zaradi prisotnosti koloidnega srebra po 24 urah od nacepljanja so predstavljeni v Preglednici 4. Preglednica 4: Zmanjšanje števila bakterij zaradi prisotnosti koloidnega srebra po 24 urah od nacepljanja

Koncentracija Ag0, ppm

0 (kontrola) 0,05 5 15

zmanjšanje, % -23,3 2,2 32,1 100

29

Vidimo lahko, da se je v kontroli število bakterij v 24 urah povečalo za 23,3 %. V gojišču, v katerem je bila koncentracija srebra 50 ppb, se je število bakterij zmanjšalo za 2,2 %, pri koncentraciji 5 ppm se je število bakterij zmanjšalo za 32 %, pri koncentraciji 15 ppm pa se je število bakterij zmanjšalo za 100 %. To pomeni, da na petrijevki nismo prešteli nobene kolonije.

Slika 24: Zmanjšanje števila bakterij zaradi prisotnosti koloidnega srebra po 24 urah od časa nacepljenja

5.3.2 Izračun logaritemskega zmanjšanja števila bakterij Za ugotavljanje efektivnosti delovanja določene kemikalije na bakterije, mikrobe in viruse se efektivnost običajno podaja kot logaritemsko zmanjšanje števila bakterij (LR). Z LR lahko izračunamo in opišemo delež mikroorganizmov (virusi, bakterije), ki se je zmanjšal zaradi dodatka določene kemikalije, v našem primeru koloidnega srebra. LR = 1 predstavlja 90% stopnjo smrtnosti mikroorganizmov. Če imamo v vzorcu 1.000.000 celic, predstavlja logaritemsko zmanjšanje števila bakterij za 1, da se populacija zmanjša za 90 %, torej imamo v vzorcu še 100.000 celic. Zmanjšanje logaritemskega števila bakterij za vrednost 2 pomeni, da je od začetnih 1.000.000 celic, ostalo še 10.000 celic, torej je bilo 99% zmanjšanje števila bakterij. LR vrednosti 3 pomeni, da se število bakterij zmanjša še za 10-krat. Tako nam od začetnih 1.000.000 celic, ostane le še 1.000 celic, kar pomeni, da se je število bakterij zmanjšalo za 99,9 %. V naslednjem koraku smo izračunali logaritemsko zmanjšanje števila (log of reduction) bakterij po enačbi:

𝐿𝑜𝑔𝑎𝑟𝑖𝑡𝑒𝑚𝑠𝑘𝑜 𝑧𝑚𝑎𝑛𝑗š𝑎𝑛𝑗𝑒 š𝑡𝑒𝑣𝑖𝑙𝑎 𝑏𝑎𝑘𝑡𝑒𝑟𝑖𝑗 = 𝑙𝑜𝑔𝑁(0)

𝑁(𝑡), (11)

N(0) – število bakterij ob času 0, N(t) – število bakterij po času t (v našem primeru t = 24 h).

-40

-20

0

20

40

60

80

100

120

Zman

jšan

je š

tevi

la k

olo

nij

(%)

Koncentracija vzorca (ppb, ppm)

50 ppb

5 ppm

15 ppm

kontrola, 0 ppb

30

Izračunane vrednosti logaritemskega zmanjšanja števila bakterij za vsako koncentracijo so prikazane v Preglednici 5. Za vzorec s koncentracijo Ag0 50 ppb je bilo logaritemsko zmanjšanje števila bakterij 0,01; za vzorec 5 ppm je bilo 0,17; za vzorec s koncentracijo 15 ppm pa je bilo > 3 (Preglednica 5). Preglednica 5: Logaritemsko zmanjšanje števila bakterij za različne koncentracije Ag0

50 ppb 5 ppm 15 ppm

Logaritemsko zmanjšanje števila bakterij 0,01 0,17 > 3

Logaritemsko zmanjšanje števila bakterij za vrednost 1 pomeni, da se je za 90 % zmanjšalo število bakterij, vrednost 2 pomeni 99% zmanjšanje števila bakterij, 3 pa predstavlja 99,9% zmanjšanje števila bakterij. V našem primeru smo za koncentracijo 15 ppm dobili logaritemsko zmanjšanje števila bakterij > 3, kar pomeni, da je ta koncentracija koloidnega srebra uničila več kot 99,9 % bakterij. Iz dobljenih rezultatov lahko vidimo, da koncentraciji srebra 50 ppb in 5 ppm nimata dovolj močnega baktericidnega potenciala, da bi uničile bakterije. Navedeni koncentraciji sta dovolj visoki le za preprečevanje razmnoževanja bakterij. Koloidno srebro v koncentraciji 15 ppm pa ima dovolj baktericidnega potenciala za skoraj 100% uničenje bakterij. V primeru, da se pitna voda kontaminira z bakterijami, virusi ali mikrobi, koncentracije koloidnega srebra, ki se jih uporablja za dezinfekcijo vode (50–200 ppb), nikakor niso dovolj visoke za uničenje bakterij. S koncentracijami 50–200 ppm Ag0 se le prepreči nadaljnje razmnoževanje bakterij, ne pa uniči že obstoječih bakterij v vodi, zato so te koncentracije Ag0 uporabne le v primerih neokužene vode (koncentracije bakteriji < MCL). Za uničenje bakterij v kontaminirani vodi je potrebno uporabljati koncentracije koloidnega srebra, višje od 15 ppm. Takšne koncentracije se uporablja v zdravilih za odpravljanje raznih okužb.

5.4 Vrstična elektronska mikroskopija (SEM) S SEM metodo smo želeli določiti velikosti in oblike nanodelcev srebra, dobljenih pri redukciji Ag+ do Ag0 pri uporabi BH4- (enačba 3). Želeli smo določiti velikost in obliko nanodelcev, ki imata velik vpliv na baktericidno učinkovitost. Čim manjši je delec in tem bolj naključna je njegova oblika, boljše je njegovo baktericidno delovanje. SEM omogoča opazovanje nanodelcev srebra pri povečavi od 20.000 do 200.000-krat. Za natančno in jasno določitev oblike, velikosti in narave delcev pod mikroskopom smo analizirali signal povratno sipanih elektronov. Na ta način lahko jasno razločimo med nanodelci srebra in drugimi atomsko lažjimi delci ter organskimi delci. V primeru, da primarni elektroni iz elektronske puše zadenejo težje (kovinske) delce vzorca, bo signal močnejši, to se bo videlo na monitorju kot svetlejši delec. V primeru, da elektroni zadenejo lažje delce, bo signal šibak in se na monitorju ti delci ne bodo videli oziroma bodo zelo bledi. Torej, s preučevanjem signala povratno sipanih elektronov smo se lahko prepričali, ali opazujemo nanodelec srebra ali delce drugih snovi. Pri opazovanju naših vzorcev smo lahko videli, kako uporabno je preverjanje narave delca z zbiranjem signala povratno sipanih elektronov. Opazili smo večje strukture, ki niso pripadale nanodelcem srebra. A brez opazovanja signala povratno sipanih elektronov tega ne bi mogli z gotovostjo trditi. Z merjenjem signala povratno sipanih elektronov smo ugotovili, da so bile te strukture različne soli in ne aglomerati srebra. Na podlagi šibke jakosti signala smo ugotovili, da gre za soli. Zato smo vsak vzorec analizirali z opazovanjem signala povratno sipanih elektronov. Za vsak vzorec smo posneli fotografijo, s čimer smo se prepričali, da opazovani delci pripadajo srebru.

31

5.4.1 Preučevanje velikosti in oblike nanodelcev srebra od njihove koncentracije Najprej smo si ogledali vzorec z najnižjo koncentracijo koloidnega srebra, ki je znašala 50 ppb (Slika 25) pri povečavi 50.000-krat. Pri preučevanju vzorca s koncentracijo 50 ppb smo zaznali mnogo majhnih delcev s premerom okrog 3 nm. Ta vrednost velikosti je na meji detekcije inštrumenta, zato je zahtevalo dodatno preverjanje z drugo analizno metodo. Velikosti delcev v vzorcu smo preverili še z DLS metodo. Med delci velikosti okrog 3 nm smo opazili tudi posamezne večje delce velikosti okrog 10 nm, a teh je bilo zanemarljivo malo. Delcev srebra je bilo manj v primerjavi s številom delcev v vzorcih z višjimi koncentracijami. Delci koloidnega srebra se pri tej koncentraciji niso združevali v aglomerate.

Slika 25: Delci koloidnega srebra v vzorcu s koncentracijo 50 ppb Naslednji analizirani vzorec s SEM mikroskopom je bil vzorec koncentracije 1 ppm. Pregledali smo ga tudi z opazovanjem signala povratno sipanih elektronov. Tudi v tem vzorcu smo zaznali večje število majhnih delcev velikosti okrog 3–10 nm. Za razliko od vzorca s koncentracijo 50 ppb je bilo tukaj več aglomeriranih srebrovih struktur, a še vedno razmeroma malo (v primerjavi z vzorci višjih koncentracij). Posamezni delci v aglomeratih so bili povprečne velikosti 20 nm. Slike so bile posnete pod 200.000-kratno povečavo. Na Sliki 26 lahko vidimo aglomerat srebra, sestavljen iz več delcev nanosrebra velikosti okrog 30 nm. Aglomerati srebra so najrazličnejših oblik, posamezni delci pa so večinoma okrogle oblike. Na Sliki 27 lahko vidimo isti aglomeriran delec kot na Sliki 26, le da je tukaj prikazana velikost posameznih nanodelcev srebra v aglomeratu. Pregledali smo več različnih aglomeratov, kot tudi posameznih delcev srebra, in izračunali povprečno velikost aglomeratov, ki je znašala 83 nm. Večja kot je bila koncentracija koloidnega srebra v vzorcu, večji so bili aglomerati Ag0. Pri tej koncentraciji so bili aglomerati večinoma okroglih oblik. Pri višjih koncentracijah pa bomo lahko videli, da so strukture aglomeratov veliko bolj razgibanih oblik. Sliki 26 in 27 sta bili posneti pod 50.000-kratno povečavo.

32

Slika 26: Aglomerat in nanodelci srebra v vzorcu s koncentracijo 1 ppm

Slika 27: Aglomerata srebra z izmerjenimi velikostmi posameznih delcev srebra v vzorcu s koncentracijo 1 ppm

33

Slike 28–31 prikazujejo velikosti in oblike delcev v vzorcu koloidnega srebra koncentracije 5 ppm. Tukaj lahko vidimo že večje aglomerate in posamezne delce z izračunano povprečno vrednostjo 39 nm. Zaznali smo tudi večjo gostoto delcev kot pri vzorcu s koncentracijo 1 ppm. Vmes lahko vidimo nekaj struktur, ki ne pripadajo srebrovim delcem, ampak so verjetno različne soli ali organski material, saj z analizo signala povratno sipanih elektronov niso bili zaznani.

Slika 28: Aglomerati koloidnega srebra v vzorcu s koncentracijo 5 ppm Slika 29 predstavlja fotografijo signala povratno sipanih elektronov, na kateri vidimo, da kar nekaj struktur, ki so bile vidne na Sliki 28, tukaj ni mogoče zaznati. To pomeni, da ti delci niso srebro. Sliki 30 in 31 prikazujeta prav tako vzorec s koncentracijo 5 ppm, le da pod 100.000-kratno povečavo, saj smo tako lahko lažje izmeriti velikosti posameznih delcev nanosrebra. Vidimo lahko, da so aglomerati delcev