DOKTORA TEZİ - Hoşgeldinizacikarsiv.ankara.edu.tr/browse/25121/Binder1.pdf · pü ve rektal swab...

ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

Enterococcus faecium KLİNİK İZOLATLARINDA ÇOKLU İLAÇ DİRENÇLİLİK MEKANİZMALARININ GENETİK DOĞASI

Kübra KASAROĞLU

BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

ANKARA 2013

Her Hakkı Saklıdır

i

ÖZET

Doktora Tezi

Enterococcus faecium KLİNİK İZOLATLARINDA ÇOKLU İLAÇ DİREÇLİLİK

MEKANİZMALARININ GENETİK DOĞASI

Kübra KASAROĞLU

Ankara Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü

Biyoloji Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK

İnsanlarda gastrointestinal sistem florasının elemanı olan enterokoklar, önemli hastane

infeksiyonu etkenleri arasındadır. Çalışmamızda Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi

hastanesinde çeşitli klinik servislerde yatmakta olan hastalardan alınan idrar, bos, kan, katater,

pü ve rektal swab örneklerinden elde edilen kültür koleksiyonundan seçilen 64 Enterococcus

faecium suşunda çoklu ilaç dirençliliklerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Suşların

identifikasyonunda Phonex antibiyogram cihazı ve rapid ID 32 Strep APİ kiti kullanılmıştır.

Antibiyogram duyarlılıkları ise Phonex antibiyogram cihazı ve disk difüzyon yöntemleri

kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Suşlardaki direnç yüzdeleri; ampsiline % 100, streptomisine %

87.5, kanamisine % 100, gentamisine % 67.18, kloramfenikole % 32.81, tetrasikline % 21.87,

rifampisine % 100, vankomisine % 96.87, eritromisine % 100 ve teikoplanine % 79.68 olarak

belirlenmiştir. Antibiyotik direncinden sorumlu genlerin belirlenmesi amacıyla polimeraz zincir

reaksiyonu (PZR) yöntemi kullanılmıştır. PZR ürünleri dizi analizi ile doğrulanmıştır.

Çalışmamızda Van B tipi direnç içeren suş saptanmış ve Türkiye’den bildirilen ikinci olgu

olduğu görülmüştür. Ayrıca antibiyotik direnç genlerinin konjugasyon yolu ile aktarımı

araştırılmış vanA direnç geni duyarlı suşlara aktarılabilmiştir.

Şubat 2013, sayfa 116

Anahtar Kelimeler: E. faecium, Antibiyotik Direnç, Konjugasyon

ii

ABSTRACT

Ph.D. Thesis

GENETİC NATURE OF MULTİ DRUG RESİSTANCE MECHANİSMS İN THE CLİNİCAL

ISOLATES OF Enterococcus faecium

Kübra KASAROĞLU

Ankara University

Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Biology

Supervisor: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK

The enterococci which are the elements of gastrointestinal system flora, are some of the

important factors of nosocomial infections. In our study, our intention was to determine muti-

drug resistancy of 64 Enterococcus faecium strains which are chosen from bacterial cultures

obtained from the urine, CSF, blood, catheter, pus and rectal swab specimens taken from

hospitalized patients at various clinical departments of Akdeniz University Faculty of Medicine.

Phonex antibiogram device and rapid ID 32 Strep API kit were used for the identifications of

strains. Antibiogram susceptibilities were carried out by using Phonex antibiogram device and

disc diffusion methods. The percentages of resistance in strains are determined as; ampsiline %

100, streptomycin % 87.5, kanamycin % 100, gentamycin % 67.18, chloramphenicol % 32.81,

tetracycline % 21.87, rifampycin % 100, vancomycin % 96.87, erythromycin % 100 and

teicoplanin % 79.68. Polymerase chain reaction (PCR) method was used in order the determine

the genes responsible for antibiotic resistance. PCR products was confirmed by sequence

analysis. In our study, strains with Van B type resistance are detected and found to be the

second case reported from Turkey. Also transfer of the antibiotic resistance genes by

conjugation was researched, vanA resistance gene were able to transfered to sensitive strains.

February 2013, 116 pages

Key Words: E. faecium, Antibiotic Resistance, Conjugation

iii

TEŞEKKÜR

Lisans eğitimimim başından itibaren tüm çalışmalarımda beni yönlendiren, bilgi, sabır

ve tecrübelerini benden esirgemeyen, yanında çalışmaktan onur duyduğum danışman

hocam Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK’e (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı),

çalışmam süresince yardımını esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Nefise AKÇELİK’e (Ankara

Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü);

Çalışmalarım sırasında tezime önemli katkılarda bulunan Akdeniz Üniversitesi

Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyelerinden Sayın Prof. Dr. Dilara Öğünç’e

Çalışmalarımın deneysel aşamalarında bana yardımcı olan başta Fatma Neslihan

YÜKSEL’e ve Prokaryot Genetiği Laboratuvarındaki arkadaşlarım Arş. Gör. Başar

KARACA (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı), Arş. Gör. Neslihan

KARATUĞ (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı), Özlem GÜNAY, Maryam

DİANİ, Muhammad Nima BADALİ, Barış YAVAŞ’a ve diğer çalışma arkadaşlarıma,

Benden hiçbir zaman destek ve yardımlarını esirgemeyen Akdeniz Üniversitesi Kültür

Laboratuvarındaki arkadaşlarım, Serpil TOSUN, Özlem KARAGÖZ, Bengü ÇAĞLAR,

Sedat KUZU ve diğer çalışma arkadaşlarıma,

Bu günlere gelmemi benden daha çok arzulayan babam İsmail YILDIRIM, annem

Neyran YILDIRIM, kardeşlerim Aslıhan YILDIRIM, Nihal YILDIRIM’a ve beni her

zaman izlediklerini bildiğim sevgili amcam Ali YILDIRIM ve Mehmet YILDIRIM’a

Manevi desteklerini hep yanımda hissettiğim ikinci ailem A. Nurhan KASAROĞLU,

Serap KASAROĞLU ve Z. Müge KASAROĞLU’na

Her anını beraber yürüdüğüm hayatta, elimi hiç bırakmayan ve başarmamı sağlayan ruh

eşim S. Volkan KASAROĞLU’na

Sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Kübra KASAROĞLU

Ankara, Şubat 2013

iv

İÇİNDEKİLER

ÖZET ................................................................................................................................ i

ABSTRACT ..................................................................................................................... ii

TEŞEKKÜR ................................................................................................................... iii

SİMGELER DİZİNİ ..................................................................................................... vii

ŞEKİLLER DİZİNİ ..................................................................................................... viii

ÇİZELGELER DİZİNİ ................................................................................................. ix

1. GİRİŞ ........................................................................................................................... 1

2. KURAMSAL TEMELLER ........................................................................................ 2

2.1 Enterococcus Cinsinin Genel Özellikleri ................................................................ 2

2.2 Enterokok Enfeksiyonlarının Epidemiyolojisi ....................................................... 7

2.3 Enterokok Enfeksiyonları ........................................................................................ 9

2.3.1 Üriner sistem enfeksiyonları ............................................................................... 10

2.3.2 Endokardit ............................................................................................................ 10

2.3.2 Bakteriyemi ........................................................................................................... 10

2.3.4 İntraabdominal ve pelvik enfeksiyonlar ............................................................ 11

2.3.5 Yara ve yumuşak doku enfeksiyonları ............................................................... 11

2.3.6 Neonatal enfeksiyonlar ........................................................................................ 11

2.3.7 Menenjit ................................................................................................................ 12

2.3.8 Solunum yolu enfeksiyonları ............................................................................... 12

2.4 Enterokoklarda Bulunan Virülans Faktörler ve Patojenite ............................... 12

2.5 Enterokoklarda Antibiyotik Direnci ve Direnç Mekanizmaları ......................... 15

2.5.1 Doğal (kromozomal) direnç ................................................................................. 15

2.5.2 Kazanılmış direnç ................................................................................................ 16

2.5.2.1 Beta laktam direnci ........................................................................................... 17

2.5.2.2 Glikopeptit direnci ............................................................................................ 18

2.5.2.2.1 Van A tipi direnç ............................................................................................ 21

2.5.2.2.2 Van B tipi direnç ............................................................................................ 22

2.5.2.2.3 Van C tipi direnç ............................................................................................ 23

2.5.2.2.4 Van D tipi direnç ............................................................................................ 23

2.5.2.3 Aminoglikozitlere direnç .................................................................................. 24

v

2.5.2.3.1 Permeabiliteye bağlı direnç .......................................................................... 24

2.5.2.3.2 Aminoglikozit modifiye edici enzimlere bağlı direnç .................................. 24

2.5.2.3.3 Ribozomal direnç .......................................................................................... 25

2.5.2.4 Kloramfenikole direnç ..................................................................................... 25

2.5.2.5 Tetrasiklinlere direnç ....................................................................................... 25

2.5.2.6 Kinolonlara direnç ............................................................................................ 26

2.3.2.7 Makrolitlere direnç ........................................................................................... 26

3. MATERYAL VE YÖNTEM ................................................................................... 28

3.1 Materyal ................................................................................................................... 28

3.1.1 Bakteriler .............................................................................................................. 28

3.1.2 Besiyerleri ............................................................................................................. 28

3.1.3 Bakterilerin tür teşhisi ......................................................................................... 29

3.1.4 Antibiyotikler ....................................................................................................... 31

3.1.5 Primerler ............................................................................................................... 32

3.2 Yöntem ..................................................................................................................... 33

3.2.1 İzolatlarının saflık kontrolü ve tür teşhisinin doğrulanması ........................... 33

3.2.2 Antimikrobiyal dirençliliğin belirlenmesi ......................................................... 36

3.2.3 İzolatların plazmid profillerinin belirlenmesi ................................................... 37

3.2.3.1 Plazmid izolasyonu ............................................................................................ 37

3.2.3.2 Elektroforez ....................................................................................................... 39

3.2.3.3 Plazmid büyüklüklerinin saptanması .............................................................. 40

3.2.4 Genomik DNA izolasyonu .................................................................................. 41

3.2.5 Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ................................................................... 43

3.2.5.1 Antibiyotik dirençliliği kodlayan gen bölgelerinin PZR ile araştırılması .... 44

3.2.6 DNA dizi analizi ................................................................................................... 54

3.2.7 Konjugasyon denemeleri ..................................................................................... 54

4. BULGULAR VE TARTIŞMA ................................................................................. 55

4.1 Enterococcus faecium Suşlarının Antibiyotik Duyarlılık Düzeylerinin

Tanımlanması .......................................................................................................... 55

4.2 Enterococcus faecium Suşlarının Plazmid Profillerinin Tanımlanması ............. 77

4.3 Antibiyotik Direnç Genlerinin PZR ile Araştırılması ......................................... 82

4.3.1 vanA ve vanB gen bölgeleri .................................................................................. 82

vi

4.3.2 tetM ve tetL gen bölgeleri ..................................................................................... 85

4.3.3 ermB gen bölgesi ................................................................................................... 87

4.3.4 rpoB1 ve rpoB2 gen bölgeleri ............................................................................... 89

4.3.5 cat gen bölgesi ....................................................................................................... 92

4.3.6 Yüksek düzey aminoglikozit direncinden sorumlu gen bölgeleri .................... 94

4.3.7 blaZ gen bölgesi .................................................................................................... 99

4.4 Konjugasyon ............................................................................................................ 99

5. SONUÇ ..................................................................................................................... 103

KAYNAKLAR ............................................................................................................ 104

ÖZGEÇMİŞ ................................................................................................................ 115

vii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

µg Mikrogram

AME Aminoglikozit Modifiye Edici Enzim

Bç Baz Çifti

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CLSI Klinik Laboratuar Standartları Enstitüsü

dNTP Deoksinükleotidtrifosfat

EARSS Avrupa Antibiyotik Direnci Sürveyans Sistemi

EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit

HLR Yüksek Seviyede Direnç

Kb Kilobaz

M Molar

MHB Müller Hinton Broth

MİK Minimal İnhibisyon Konsantrasyonu

mL Mililitre

mM Milimolar

PAI Patojenite Adası

PBP Penisilin Bağlayan Protein

PZR Polimeraz Zincir Reaksiyonu

UV Ultra Viyole

VRE Vankomisin Dirençli Enterokok

viii

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1 Enterokokların diğer Gram pozitif ve katalaz negatif koklardan ayrımı .......... 4

Şekil 2.2 Enterokok türlerinin fenotipik özellikleri ......................................................... 6

Şekil 2.3 Avrupa’da VRE prevalansı (2010) ................................................................... 8

Şekil 2.4 Avrupa’da VRE prevalansı (2011) ................................................................... 8

Şekil 2.5 Vankomisin antibiyotiğinin ve vankomisine direncli enterokoklarda

VanA direncinin hücre duvar öncülerine etki mekanizması .......................... 20

Şekil 2.6 Vankomisin direncinden sorumlu Tn1546 transpozonundaki van A gen

kümesinin genetik haritası .............................................................................. 21

Şekil 3.1 Enterokok izolatlarının tanısında kullanılan testler ......................................... 34

Şekil 3.2 rapid ID 32 Strep Api testi ile Enterococcus faecium suşlarının

doğrulanması……………………………………………………………….....35

Şekil 4.1 Enterococcus faecium suşlarının disk difüzyon testi ..................................... .55

Şekil 4.2 Enterococcus faecium suşlarının antibiyotik dirençlilik yüzdeleri................. 74

Şekil 4.3 Enterococcus faecium suşlarının plazmid içerikleri ....................................... 78

Şekil 4.4 vanA gen bölgesi ............................................................................................. 83

Şekil 4.5 vanB gen bölgesi ............................................................................................. 84

Şekil 4.6 tetM gen bölgesi ............................................................................................. 86

Şekil 4.7 tetL gen bölgesi ............................................................................................... 86

Şekil 4.8 ermB gen bölgesi ............................................................................................ 87

Şekil 4.9 rpoB1 gen bölgesi ........................................................................................... 90

Şekil 4.10 rpoB2 gen bölgesi .......................................................................................... 91

Şekil 4.11 cat gen bölgesi ............................................................................................... 93

Şekil 4.12 aac6-aph2 gen bölgesi ................................................................................... 94

Şekil 4.13 ant6 gen bölgesi ............................................................................................. 96

Şekil 4.14 aphA3 gen bölgesi ......................................................................................... 97

Şekil 4.15 vanA geninin konjugal aktarımı ................................................................... 101

Şekil 4.16 Transkonjugantta vankomisin direncinin disk difüzyon yöntemi ile

doğrulanması ................................................................................................ 101

ix

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 2.1 Enterococcus cinsinde tanımlanan virülans faktörler ................................. 14

Çizelge 2.2 Enterokoklarda glikopeptid direnç tipleri .................................................... 19

Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan bakteriler ve izolasyon materyalleri ......................... 30

Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan antibiyotikler ve disk konsantrasyonları ................... 31

Çizelge 3.3 Antibiyotik direnç genlerinin tespiti için kullanılan primerler .................... 32

Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve MİK testlerine göre antibiyotik

duyarlılıkları ................................................................................................ 56

Çizelge 4.2 Standart E. faecalis ATCC29212 suşunun disk difüzyon ve MİK

testlerine göre antibiyotik duyarlılığı .......................................................... 72

Çizelge 4.3 E. faecium suşlarının antibiyotik gruplarına karşı direnç oranları .............. 73

1

1. GİRİŞ

Enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde karşılaşılan en önemli sorun, antibiyotik

kullanımına bağlı olarak bakterilerde yaygınlaşan antibiyotik dirençlilik olarak

tanımlanmaktadır. Önceleri önemsiz olarak görülen pek çok bakteri şu anda ciddi

hastane enfeksiyonlarına neden olmaktadır. Normal florada bulunan ve ilk

tanımlandıkları yıllarda sadece endokardit etkeni olarak bildirilen enterokoklar,

bakterisidal antimikrobiyal terapiyi gerektiren nozokomiyal patojenler olarak son 20

yılda önem kazanmışlardır (Huycke vd. 1998). Bu artışın en önemli nedeni;

enterokokların hastanelerde sıklıkla kullanılan 3. kuşak sefalosporinler gibi birçok

antibiyotiğe doğal olarak dirençlilik içermeleri ve kullanılabilen tüm antibiyotiklere

karşı direnç geliştirebilme özelliğine sahip olmalarıdır. β-laktamlara ve düşük

konsantrasyonlardaki aminoglikozitlere karşı doğal direnç içermeleri nedeniyle, her iki

sınıfa karşı yüksek düzeyde direnç oluşumu gerçekleştiğinde ilaçların sinerjetik etkisi

ortadan kalkmakta ve tedavi güçleşmektedir.

Enterokoklar klasik virülans faktörlerine sahip olmasa da, çoklu antibiyotik

dirençlilikleri onlara antibiyotik tedavisi altında yaşama ve çoğalma olanağı

sağlamaktadır. Direnç determinantlarının enterokoklar arasında ve özellikle diğer Gram-

pozitif bakterilere plazmid ve transpozonlar aracılığıyla aktarımı, direncin hızla

yayılmasına neden olmaktadır. Enterokoklarda doğru tür teşhisi, antibiyotik duyarlılık

testlerinin optimize edilmesi ve direnç kaynaklarının genetik temelinin araştırılması;

direncin önlenmesi ve yeni antibiyotik kullanım politikaları geliştirilmesi açısından

önemlidir.

Enterokok enfeksiyonları içinde E. faecalis ile oluşan enfeksiyonların oranı diğer türlere

göre 10 kat fazladır. Ancak son yıllarda vankomisin dirençli enterokoklar (VRE)’lerin

ortaya çıkması ile bu oran gittikçe düşmüş ve E. faecium izolatları ön plana çıkmaya

başlamıştır. Bu sebeple çalışmamızda hastane ortamında yaygın olarak bulunan ve

enfeksiyona neden olan E. faecium suşlarının çoklu antibiyotik direnç özellikleri

araştırılmış, bu özelliklerin yatay gen transferi yolu ile aktarımı analiz edilmiştir.

2

2. KURAMSAL TEMELLER

2.1 Enterococcus Cinsinin Genel Özellikleri

İlk defa 1899’da Fransa’da yayınlanan bir yazıda intestinal orjinli Gram- pozitif koklar

‘enterocoque’ olarak tanımlanmıştır (Thiercelin 1899). Streptococcus faecalis ismi

1906’da endokarditli bir hastanın kanından izole edilen organizmaya verilmiştir

(Andrews ve Horder 1906). S. faecium’un ilk olarak tanımlanması ise 1919 yılında

Orlo-Jensen tarafından yapılmıştır (Kandler vd. 1968). 1980’ lerde DNA-DNA ve

DNA-ribozomal RNA hibridizasyon çalışmaları bu bakterilerin Streptococcus

genusunun üyesi olmadığını göstermiş ve Enterococcus genusu içinde yeniden

sınıflandırılmışlardır (Schleifer ve Kilpper-Balz 1984). Enterococcus cinsi, DNA-DNA

hibridizasyon çalışmaları, 16S rRNA dizi analizi ve toplam hücre protein profillerinin

(WCP) belirlenmesi çalışmaları sonucunda 32 farklı türe ayrılmıştır (Facklam 2002).

E. faecalis insan enterokokal enfeksiyonlarının % 80-90’ ına yol açmaktadır. E. faecium

ise geriye kalan enfeksiyonlardan sorumludur. E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E.

gallinorum, E. hirae, E. raffinosus, E. malodoratus, E. dispar ve E. mundtii diğer sık

rastlanan türlerdir (Murray 1990, Ruoff vd. 1990, Jett vd. 1994). Ayrıca son on yıl içinde E. haemoperoxidus, E. villorum, E. phoeniculicola, E. canis, E. moraviensis, E.

columbae ve E. cecorum gibi yeni türler de enterokok cinsi içinde tanımlanmıştır

(Koneman vd. 2005).

Enterokoklar tekli, ikili, ya da kısa zincirler halinde görülebilen, fakültatif anaerob,

Gram- pozitif koklardır. Mikroskopik olarak streptokok türlerinden ayrılamazlar.

Agarda üreyen kolonilerden yapılan Gram boyamada bazen Gram- pozitif kokobasil

şeklinde görülebilirler. İdeal üreme ısıları 35 οC olmakla birlikte 10-45 οC arasında

değişen bir üreme aralığına sahiplerdir. 60 οC’ye 30 dakika dayanıklıdırlar. Optimal

üreme pH’ ları 7.2 ±0.2 dir. Kanlı agarda 0,5-1,5 mm boyutunda, kabarık, gri - beyaz

renkte koloniler oluştururlar. Bazen zayıf bir alfa hemoliz meydana getirebilirlerse de

3

genellikle hemolitik özellik içermezler (Murray 1990, Koneman vd. 1992, Gültekin

2004).

Enterokokların tür düzeyinde identifikasyonu; tedavi yanında, epidemiyolojik ve

enfeksiyonel kontrol amacı ile de yapılmaktadır. Gram- negatif bakterileri de içeren

karışık örneklerden soyutlanmaları için, selektif besiyeri olarak, azid içeren safra-

eskulin-azid veya Enterococcosel agar, Columbia-Kolistin-Nalidiksik asit agar (CNA)

veya feniletil alkol agar (PEA) kullanılabilir. CNA, PEA’ ya göre bakterinin hemoliz

özelliğini değerlendirmede daha değerlidir. Kontamine alanlardan özellikle E. faecium

izolasyonu için de sefaleksin-aztreonam-arabinoz agar kullanılabilir. Vankomisin

dirençli enterokokların büyük bir kısmı E. faecium suşlarıdır. Vankomisin dirençli

enterokok saptanması için 6 µg/mL vankomisin ilave edilmiş brain-heart infüzyon

(BHI) agar veya Enterococcosel sıvı besiyeri kullanılabilir (Facklam ve Sahm 1995).

Enterokoklar bakteriyosin üretirler. Bunların bazıları diğer Gram- pozitif

mikroorganizmalar üzerinde etkilidir (Moreno vd. 2006).

Enterokoklar; sitokrom enzimleri olmadığından katalaz negatiftirler. Fakat E. faecalis

suşları ilk izolasyon sırasında görülüp seri pasajlarda kaybolan “pseudo-katalaz” üretir

ve katalaz testinde zayıf bir pozitiflik gösterebilir. Ayrıca E. haemoperoxidus türlerinde

de katalaz pozitifliği tanımlanmıştır (Ruoff vd. 1990).

Tüm suşlar % 6,5’luk NaCl içeren buyyonda ve % 40 safra varlığında ürerler. L-

pironil-beta-naftilamit (PYR) ve eskulini hidrolize ederler. Enterokoklar, E. cecorum, E.

columbae ve E. saccharolyticus dışında PYR (+) dir (Facklam and Sahm 1995).

Glukozu gaz yapmadan fermente ederler ve laktik asit oluştururlar. DNA’larının G+C

oranı % 37-45 oranındadır. E. flavescens, E. casseliflavus, ve E. gallinarum gibi bazı

suşlar hareketli olup 1-5 flagella içerirler. Endospor ve kapsül gibi yapıları

sentezleyemezler. Bütün enterokok suşları lösin aminopeptidaz (LAP) üretirler (Murray

1990, Ruoff vd. 1990, Koneman vd. 1992). Enterokokların hücre duvar yapısı diğer

Gram- pozitif koklara benzer peptidoglikan, teikoik asit, lipoproteinler ve yüzey protein

antijenlerinden oluşur. E. faecium Lys-Ala 2-3 tipinde bir peptidoglikana sahiptir

(Murray 1990, Korten 2002). Lancefield’ın grup D antijeni, hücre duvarı ile bağlantılı

4

bir gliserol olan teikoik asitten oluşur. Enterokoklar D grubu antiserumlarla % 80

oranında aglütinasyon verirler. Bu sonucu, ekstraksiyon işlemi ve antiserum kalitesi

etkileyebilir. Grup D antijeni tespiti, enterokoklar dışında, S. bovis, S. equinus, S. suis,

Pediococcus spp. ve Leuconostoc spp. gibi diğer Gram- pozitif bakterilerde de

bulunabildiğinden, özellikle doğal olarak glikopeptit direnci bulunan Leuconostoc spp.

ve Pediococcus spp. den ayırımı için PYR hidrolizinden yararlanılır (Şekil 2.1).

Şekil 2.1 Enterokokların diğer Gram- pozitif ve katalaz negatif koklardan ayrımı (Klein 2003, İşleroğlu vd. 2008)

5

Enterokokların karbon metabolizması, solunum, iyon transportu, pirimidin ve folat

yolakları, stres cevapları ve reaktif oksijen türleri metabolizmaları dikkat çekicidir.

Enterokokların bazal metabolik faaliyetleri için, B1, B6 ve B12 vitaminlerine, nükleik

asit bazlarına ve bir karbon kaynağına ihtiyaçları vardır. E. faecalis’in çoğalması için

histidin, izolösin, metionin ve triptofan gerekli iken, diğer bazı türler arjinin, glutamat,

glisin, lösin ve valin’e ihtiyaç duyarlar (Murray vd. 1993, Facklam ve Teixeria 1998).

Ancak bazı türler de bu aminoasitlere ihtiyaç duyulmaz. Vankomisin bağımlı suşlarda

olduğu gibi yoğun antimikrobiyal baskı, metabolik ihtiyaçları etkileyebilir. Bu da farklı

enterokok türlerinin metabolik ihtiyaçlarının suştan suşa bile farklılık gösterdiği

anlamına gelmektedir (Facklam ve Teixeria 1998).

Enterokokların hızlı tanı sistemleri ile teşhis edilmesini sağlayan otomatize (Phonex,

Vitek, MicroScan, API 20 Strep) sistemler mevcuttur. Bu sistemler içerdikleri Gram-

pozitif teşhis kartları ile tür düzeyinde teşhis yapabilirler. Ayrıca tiplendirmede;

bakteriyosin tiplendirmesi, faj tiplendirmesi, biyokimyasal reaksiyon profilleri,

antimikrobiyal direnç paternleri ve serolojik yöntemler de kullanılabilir (Facklam ve

Sahm 1995). Enterokok türlerini teşhis etmede en kolay yol anahtar fenotipik

karakterlere göre tür seviyesinde gruplar oluşturmaktır. Bu şekilde çeşitli test

ortamlarındaki reaksiyonlarına göre 5 grupta toplanmış, ilave testler ve karakteristik

özelliklerine göre de tür ayırımları yapılmıştır (Şekil 2.2). Biyokimyasal, fizyolojik,

serolojik ve antibiyotik direnç paternine dayanarak ayrım yapılamadığı durumlarda

moleküler tekniklere yönelinmektedir. Moleküler olarak enterokokların tiplendirilmesi

çalışmalarında çok sayıda teknikten yararlanılmaktadır. Bu tekniklere; dalgalı alan jel

elektroforezi (PFGE), multilokus sekans tiplendirme (MLST), rastgele çoğaltılmış

polimorfik DNA (RAPD) analizi, gen sekans analizi, çoğaltılmış fragment uzunluk

polimorfizmi (AFLP) ve gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) örnek

olarak verilebilir (Nourse vd. 1998, Mascini vd. 2006, Çelik ve Alhan 2008).

6

Şekil 2.2 Enterokok türlerinin fenotipik özellikleri (Facklam ve Teixeria 1998)

7

2.2 Enterokok Enfeksiyonlarının Epidemiyolojisi

Enterokoklar doğada yaygın olarak (toprakta, suda, bitkilerde, hayvanlarda, kuşlarda ve

böceklerde) bulunurlar. Esas konakları insan ve hayvanların gastrointestinal sistem

florasıdır.

Enterokoklar son yıllarda tüm dünyada giderek artan sıklıkta yol açtıkları hastane

enfeksiyonu salgınları ile dikkatleri üzerlerine çekmişlerdir. İlk yapılan epidemiyolojik

çalışmalar, enterokokların hastadan hastaya ve hatta hastaneler arasında

yayılabilmesinin temelinde, bu bakterilerin normal bağırsak florasında bulunmalarının

yattığı tespit edilmiştir. Yapılan çalışmalarda E. faecalis’in hastane enfeksiyonlarının %

85-95’ inde, E. faecium’un ise % 5-10’unda başlıca etken olduğu saptanmıştır

(Çetinkaya vd. 2000, Zırakzadeh ve Patel 2006). Ancak vankomisin dirençli

enterokokların sebep oldukları enfeksiyonların kliniğine ait ilk bilgilerin açıklanması ve

direnç özelliklerinin tespit edilmesinden sonra enterokoklara bağlı hastane

enfeksiyonları epidemiyolojisinde iki önemli değişiklik yaşanmıştır (Uttley vd. 1988,

Leclercq vd. 1988). Bunlar insidansdaki hızlı artış ve tür dağılımındaki değişimdir.

Özellikle vankomisinin hastanelerde yaygın olarak kullanılmaya başlandığı 1989

yılından itibaren, Avrupa ülkeleri ve ABD’den başta glikopeptit grubu antibiyotikler

olmak üzere beta-laktam ve aminoglikozit grubu antibiyotiklere karşı dirençli çok

sayıda klinik izolat ve vaka bildirimi yapılmış, VRE’lerin özellikle E. faecium’un klonal

seleksiyona uğrayarak hastane ortamına hakim olduğu, ya tek başlarına ya da

stafilokoklarla birlikte hastane enfeksiyonlarındaki insidanslarını hızla artırdıkları tespit

edilmiştir (Çetinkaya vd. 2000).

Avrupa Antibiyotik Direnci Sürveyans Sistemi (EARSS)’nin 2010-2011 verilerine göre

E. faecium izolatları arasında en yüksek vankomisin direnç oranı; İrlanda % 38.7-34.9

(2010-2011), ikinci sırada ise Yunanistan olarak bildirilmiştir (% 22.5-2010 ve % 23.1-

2011) (Şekil 2.3-2.4).

8

Şekil 2.3 Avrupa’da VRE prevalansı (www.earss.rivm.nl- 2010)

Şekil 2.4 Avrupa’da VRE prevalansı (www.earss.rivm.nl- 2011)

9

2000’li yıllarda Uluslararası Hastane Enfeksiyonu Sürveyans Sistemi (NNIS)

sonuçlarına göre Amerika Birleşik Devletleri (ABD)’nde enfeksiyon etkeni olarak izole

edilen enterokoklar içerisinde VRE insidansının % 25’in üzerine çıktığı, hastanede

yatan hastalarda VRE kolonizasyon oranının da % 5-18 arasında değiştiği, ancak

hastane dışındaki popülasyonda intestinal kolonizasyon olmadığı bildirilmiştir.

Ülkemizde ise ilk vankomisin direçli enterokok (VRE) suşu Akdeniz Üniversitesi’nden

bildirilmiştir. Bu suş malign histiyositozis tanısı almış, bronkopulmoner enfeksiyonu

olan bir bebekte plevra sıvısından izole edilmiştir (Vural vd. 1998). Bunu 1999 yılında

İstanbul Üniversitesi, İstanbul Tıp Fakültesi ve Ankara Gülhane Askeri Tıp Akademisi’

nden bildirilen suşlar izlemiştir (Başustaoğlu ve Özyurt 2000). 2003 yılı itibariyle VRE

sorunu ile karşılaşan merkez sayısı onu aşmıştır (Yetkin ve Ateş 2004).

2.3 Enterokok Enfeksiyonları

Hastanede yatan hastalarda, endojen kökenli veya ekzojen kökenli hastane

enfeksiyonları ortaya çıkar. İnfekte hastaların varlığıyla geniş bir alanı enfekte eden

enterokokların, duyarlı hastalarda idrar yolları, kan, bos gibi steril vücut bölgelerine

yerleşerek, üriner sistem enfeksiyonları, endokardit, sepsis veya bakteriyemi, intra-

abdominal enfeksiyonlar, pelvik enfeksiyonlar, menenjit ve cerrahi yara

enfeksiyonlarına yol açabildikleri gösterilmiştir (Yıldırım 2007).

Klinik örneklerden izole edilen suşların % 80-90’ını E. faecalis, % 5-10 kadarını ise E.

faecium oluşturur. Son yıllarda çoklu ilaç direnci gösteren E. faecium suşlarının hastane

enfeksiyonlarında artış gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca nadir olarak E. durans, E.

casseliflavus, E. raffinosus, E. gallinorum, E. mundtii, E. flavescens, E. avium ve E.

hirae gibi diğer enterokok türleri hastane enfeksiyonlarda klinik materyalden izole

edilirken E. malodoratus, E. pseudoavium ve E. sulfureus türleri ile PYR testi negatif

olan ve atipik enterokoklar olarak adlandırılan E. columbae, E. cecorum ve E.

saccharolyticus türleri henüz insanlardan izole edilmemiştir (Sood vd. 2008)

10

2.3.1 Üriner sistem enfeksiyonları

Enterokokların sebep olduğu enfeksiyonların en sık görülen tipi üriner sistem

enfeksiyonlarıdır ve çoğu nozokomiyal kaynaklıdır. ABD’de enterokoklar nozokomiyal

üriner sistem enfeksiyonları arasında ikinci en sık etkendir. Üriner sistemde hastane

kökenli VRE enfeksiyonları; sistit, piyelonefrit, prostatit ve perinefritik apse gibi klinik

tablolarla seyredebilir. Üriner kateterizasyon en sık görülen risk faktörü olmakla

beraber, üriner sistem anomalileri, uzun süreli sonda kullanımı, cerrahi girişim ve

antibiyotik kullanımıda enterokokal risk faktörleri arasında yer alır (Kaye 1982, Krieger

vd. 1983). Toplum kaynaklı üriner sistem enfeksiyonlarında, sağlıklı kadınlarda % 5’

inden azında enterokok izole edilmektedir (Yıldırım 2007). Enterokokal üriner

enfeksiyonlarda bakteriyemi gelişmediği sürece mortalite düşüktür (Linden vd. 1996).

2.3.2 Endokardit

Enterokoklar infektif endokarditlerin S. viridans ve S. aureus’dan sonra en sık

rastlanılan üçüncü önemli etkenidir. En sık görülen tür E. faecalis’ dir. Hastalık cerrahi

yolla veya çeşitli maniplasyonlarla bakterinin gastrointestinal sistemden veya

çoğunlukla genitoüriner sistemden translokasyonu ile endojen kaynaklı subakut

endokardit şeklinde başlar (Anderson vd. 2004). Ayrıca intravenöz ilaç bağımlılarında

da % 5-53 oranında enterokokal endokardit görülebilir. Vakaların çoğunda altta yatan

bir kapak hastalığı veya prostetik kapak bulunmakla beraber, enterokoklar normal

kapaklarda da enfeksiyon oluşturabilir (Yıldırım 2007). Çoğunlukla sol taraf

endokarditine neden olur ve mitral kapak, aort kapağına göre daha sık tutulmaktadır.

2.3.3 Bakteriyemi

Enterokokkal bakteriyemi, endokarditlerden daha sık görülen bir klinik formdur.

Hastane enfeksiyonları içerisinde giderek artan öneme sahip olan VRE bakteriyemileri,

hastane kökenli tüm bakteriyemiler içerisinde Avrupa’da 4. ABD’de ise 3. sıklıkta

görülmektedir. VRE bakteriyemisi için risk faktörleri, hemodiyaliz, organ

11

transplantasyonu, kortikosteroit kullanımı, kemoterapi veya parenteral beslenme, cerrahi

girişimler, ciddi hastalıklar, uzun süreli antibiyotik kullanımı, üriner kateterler,

nötropeni ve mukozittir (Devriese vd. 2006, Yıldırım 2007).

2.3.4 İntraabdominal ve pelvik enfeksiyonlar

İntraabdominal ve pelvik enfeksiyonlar genellikle polimikrobiyaldir. Enterokoklar

bağırsakta normalde bulunan diğer fakültatif ve anaerob bakterilerle birlikte etken

olarak saptanmaktadır ve bu enfeksiyonlarda enterokokların esas rolünün ne olduğu

açıklık kazanmamıştır. Enterokoklar, nefrotik sendrom veya sirozlu hastalarda gelişen

spontan peritonit ve periton diyalizi uygulanan vakalarda gelişen abdominal enfeksiyon

veya intraabdominal abselerde tek mikroorganizma olarak izole edilebilmektir. Ayrıca

salpenjit, endometrit gibi peripartum maternal enfeksiyonlar ve sezeryan sonrası

apselerde de etken olabildikleri gösterilmiştir (Yıldırım 2007).

2.3.5 Yara ve yumuşak doku enfeksiyonları

Enterokoklar nadiren selülit veya derin doku enfeksiyonlarına yol açarlar. Cerrahi yara

enfeksiyonları, dekübitis ülserleri ve diyabetik ayak enfeksiyonlarında çoğunlukla

Gram- negatifler ve anaeroblarla birlikte izole edilirler. Enterokoklar nadiren diyabetik

olan veya olmayan kişilerde kronik osteomiyelite neden olmaktadırlar (Murray 1998).

2.3.6 Neonatal enfeksiyonlar

Enterokoklar yenidoğan için de önemli bir patojendir. Yenidoğanlarda erken ve geç

sepsise neden olur. Yenidoğan sepsisi tablosu menenjit ve/veya bakteriyemi ile birlikte

solunum güçlüğü ve ateşle karakterize bir tablodur. Prematüre veya düşük doğum

ağırlıklı bebeklerde, özellikle de nazogastrik tüple beslenme, intravasküler kateter

bulunması gibi durumlarda E. faecalis veya E. faecium’un etken olduğu sepsis salgınları

bildirilmiştir. Enterokokkal suşların % 82’ si E. faecalis, % 14’ ü E. faecium olarak

12

tespit edilmiştir. Uygun antibiyotik tedavisine iyi cevap vermektedir (Taşova ve İnal

2004).

2.3.7 Menenjit

Enterokokal menenjit nadir olmakla beraber, genellikle santral sinir sisteminde

anatomik bir defekt, geçirilmiş beyin cerrahi girişimi veya kafa travması gibi

predispozan faktörlerin varlığında görülmektedir (Murray 1990, Başustaoğlu 2004).

Menenjit, enterokok endokarditli hastalarda gelişen bakteriyeminin nadir bir

komplikasyonu olarak da oluşabilir. AIDS ve akut lösemi gibi ciddi immün yetmezlikli

hastalarda da VRE menenjiti görülebilir. Etken diğer enterokok enfeksiyonlarında

olduğu gibi sıklıkla E. faecalis olup daha seyrek olmak üzere E. faecium’dur (Zeana vd.

2001, Yıldırım 2007).

2.3.8 Solunum yolu enfeksiyonları

Geniş spektrumlu antimikrobiyal tedavi (özellikle sefalosporinler) ve enteral beslenme

uygulanan hastalarda da nadiren enterokok pnömonisi gelişebilmektedir. Enterokokların

neden olduğu solunum yolu enfeksiyonu sıklığının giderek arttığı bildirilmektedir

(Robert ve Moellering 2005).

2.4 Enterokoklarda Bulunan Virülans Faktörler ve Patojenite

Enterokoklar, düşük virülanslı bakterilerdir. Buna rağmen toplum kaynaklı ve özellikle

hastane kaynaklı enfeksiyonlarda önemli etkenlerdir. Pek çok antibiyotiğe karşı doğal

olarak dirençli olmaları, diğer antibiyotiklere de kolaylıkla direnç geliştirebilmeleri ve

çevreye adaptasyonlarının iyi olması nedeni ile diğer patojenlerden daha avantajlı hale

gelmektedirler.

Enterokoklara özgü virülans faktörlerin büyük bir çoğunluğu plazmidler üzerinde

kodlanır. Gastrointestinal sistem gibi doğal çevredeki suşlar arasında horizontal (yatay)

13

yayılım gösteren bu özellikler, daha az virülanslıktaki endojenik floraya hızla yayılmayı

sağlar (Jett vd. 1994).

Virülans faktörler çoğunlukla multifaktöriyeldir ve Patojenite Adaları (PAI) olarak

adlandırılan ve genom üzerinde farklı bölgelerde kümelenmiş olan virülans genler ile

düzenlenmektedir. PAI’ları virülans genlerin yatay transferinden sorumlu olmaları

nedeniyle patojen bakterilerin evriminde plazmidler, bakteriyofajlar ve transpozonlar

kadar öneme sahiptir (Hacker ve Kaper 2000, Tendolkar vd. 2003).

Enterokokların patojenite adaları ilk kez 1980 yılında nozokomiyal salgına yol açan E.

faecalis’te tanımlanmıştır (Huycke vd. 1991, Shankar vd. 2002). Bu PAI’ın

bulunmasından iki yıl sonra E. faecium suşlarında E. faecalis’dekinden farklı olan bir

PAI varlığı bulunmuştur. E. faecium klinik izolatlarında epidemik yayılma özelliği

kazandıran “esp” geninin görülmesi bu türdeki patojenite adası için bir indikatör olarak

kabul edilmiştir (Leavis vd. 2004). Bunun aynı zamanda nozokomiyal salgınlar ile

ilişkili izolatların ortak özelliği olduğu öngörülmektedir. Farklı VRE suşlarındaki PAI

dizilerinin karşılaştırılması sonucu; yüksek derecede dizi benzerlikleri olduğu ve

spesifik gen bölgelerinin değişen sıklıkta delesyona uğradıkları görülerek, bu

mikroorganizmaların virülans düzenleme yeteneği kazandıkları öne sürülmüştür. Diğer

taraftan bu çalışmalarda PAI’larının en az üçte birinin konjugatif bir plazmidin

kromozoma integrasyonu ile oluştuğu ispatlanmıştır. Ayrıca PAI’larda fonksiyonu izah

edilemeyen 18 ORF bölgesi kodlanmaktadır. Kommensal enterokokların PAI’larında bu

ORF bölgeleri gösterilememiş, bu sebeple de, bunların enterokokların hastane

ortamında yaşamasına veya hastalık geçişine veya patogeneze katkıda bulundukları

düşünülmüştür (Upadhyaya vd. 2009). Enterokoklarda tanımlanan virülans faktörler

çizelge 2.1’de verilmiştir.

14

Çizelge 2.1 Enterococcus cinsinde tanımlanan virülans faktörler (Mundy vd. 2000, Clewell vd. 2000, Eaton ve Gasson 2001, Shankar vd. 2001, Toledo-Arana vd. 2001)

Faktör/Gen Ürünlerin Virülanslıktaki Rolü efaAfm, efaAfs E. faecalis ve E. faecium serumlarıyla ifade olan hücre duvarı ilişkili

adhezinler agg Ökaryotik hücrelere tutunmada gerekli olan agregasyon proteini;

hücresel agregasyon ve konjugasyon

gelE Toksin; ekstraselüler metaloendopeptidaz, jelatin, kollojen ve

hemoglobini hidrolize eder

cylLL, cylLS Sitolizin (hemolizin, bakteriyosin) öncüleri; ökaryotik ve Gram-

pozitif hücrelerin büyük çoğunluğunu lize eden aktif sitolizin

üretiminde gerekli olan cylLL, -LS, -M, -B, ve -A genlerinin ifadesi

ürünleri

cylM Sitolizinin posttranslayonel modifikasyonu

cylB Sitolizinin transportu

cylA Sitolizinin aktivasyonu

esp İmmün cevaptan kaçmada rol oynayan hücre duvarı ilişkili protein;

ptojenite adası üzerinde bulunan cyl genleri ile ilişkili olabilir

cpd, cob, ccf,

cad

Seks feremonları; insan lökositleri için kemotaktiktirler ve

konjugasyonu kolaylaştırırlar

Lipotaykon asidi Üretilmiş insan monositleri yoluyla sitokin üretimin uyarılması

Süperoksit Bakteremi virülanslığı ile ilişkilidir; kültürdeki insan intestinal

epitelyum hücrelerinde hücre-DNA hasarının indüklenmesi

Hiyaluronidaz Bağlayıcı dokularda hücre yüzeyi ile ilişkili enzimlerin yayılmasını

sağlar

15

2.5 Enterokoklarda Antibiyotik Direnci ve Direnç Mekanizmaları

Enterokoklardaki antibiyotik direnci doğal ve kazanılmış olmak üzere iki gruba

ayrılabilir. Doğal direnç türe/cinse özgüdür. Enterokok türlerinin tamamında görülen

kromozomal direnci ifade eder. Doğal direnç kromozomlar üzerindeki genler aracılığı

ile oluşurken, kazanılmış direnç plazmidler veya transpozonlar üzerinde bulunan

genlerle gerçekleştirilmektedir (Sarantinopoulos vd. 2001, İşleroğlu vd. 2008).

Enterokoklarda antibiyotik direnci detaylı olarak araştırılmıştır (Fisher ve Philips 2009).

2.5.1 Doğal (kromozomal) direnç

Enterokok türleri penisilinlere, sefalosporinlere, linkozamidlere, trimetoprim-

sulfametaksazole (TMP-SMX), aminoglikozitlere (düşük düzeyde), polimiksinlere,

vankomisine (E. gallinarum, E. casseliflavus ve E. flavescens gibi bazı türler düşük

seviyede), monobaktamlara ve kinopristin/dalfopristin’e (E. faecalis) karşı kalıtsal

olarak dirençlidir (Poeta vd. 2005).

Enterokoklar β-laktam antibiyotiklere karşı karakteristik olarak tolerans gösterirler yani

tedavi dozunda minimum bakterisidal konsantrasyon/minimum inhibitör konsantrasyon

(MBK/MİK) oranı 1/32’nin üzerindedir. Bu nedenle β-laktam antibiyotikler

enterokoklara karşı bakterisidal değil, bakteriyostatik etkilidir. Enterokoklarda doğal

penisilin direnci, β-laktam antibiyotiklere düşük bağlanma afinitesi gösteren penisilin

bağlayan protein 5 (PBP-5) enziminin varlığına bağlıdır. E. faecalis suşlarında penisilin

MİK değeri streptokoklardan 10-100 kat daha yüksektir. Enterokoklarda yarı sentetik ve

penisilinaza dirençli β-laktam antibiyotiklere karşı da doğal direnç oldukça yüksek

oranda bulunmuştur. Ampisilin direnci E. faecium suşlarının % 85–90’ında, E. faecalis

suşlarının ise % 2-3’ünde görülmektedir (Murray 1998, Çetinkaya vd. 2000, Marothi

vd. 2004).

Enterokoklar düşük düzeyde aminoglikozit direnci de gösterirler. Bu tip dirençte iki

mekanizma söz konusudur. Birinci mekanizma tüm enterokok türlerinde bulunur ve

16

bakteri duvarının bu grupta bulunan antibakteriyel ilaçlara karşı geçirgenliğinin az

olmasından kaynaklanır. İkinci mekanizma sadece E. faecium’da bulunur. E. faecium

aac6’-li geni tarafından kodlanan, 6’ asetiltransferaz (AAC-6’) enzimine sahiptir. Bu

enzim aminoglikozit yapısındaki bir amino grubunun asetil CoA’ya bağımlı olarak

asetilasyonuna yol açar. Böylece sitoplazmaya geçen ilaç inaktive edilir. Enzim

kanamisin, netilmisin, sisomisin, isepamisin ve tobramisini modifiye eder. Ancak

gentamisine etkisi yoktur (Şardan 2004). Aminoglikozit grubu antibakteriyel ilaçlar,

beta-laktam antibiyotik ya da vankomisin gibi hücre duvarı sentezini engelleyen

antibiyotikler ile kombine edilecek olursa, zedelenen hücre duvarından bu gruptaki

antibakteriyeller daha kolay geçeceğinden MİK değerleri önemli ölçüde düşecektir.

Enterokoklara karşı, beta-laktam veya glikopeptit grubu antibakteriyel ilaçlar ile

aminoglikozit grub ilaçların kombinasyonunun sinerjistik mekanizması bu şekilde

açıklanmaktadır (Başustaoğlu 2004).

Enterokoklar linkozomit grubu antibiyotiklere de düşük düzeyde doğal olarak

dirençlidir (Lefort vd. 2000, Şardan 2004).

Enterokokların ekzojen folat kullanma yetenekleri bulunmaktadır. Bu nedenle

trimetoprim-sulfametaksazole (TPM-SMX) de doğal olarak dirençlidirler. Bu

antibiyotik in vitro olarak etkin görünmesine rağmen in vivo etkin değildir. Bu nedenle

antibiyotik duyarlılık deneylerinde TPM-SMX kullanılmamalıdır (Lefort vd. 2000,

Korten 2005).

2.5.2 Kazanılmış direnç

Enterokoklar plazmid ve transpozonlar yoluyla son yıllarda belirgin bir şekilde

kazanılmış direnç geliştirmiştir. Bunlar arasında en önemli olanları yüksek düzey

aminoglikozit direnci, beta laktamaz yapımı veya diğer mekanizmalarla gelişen yüksek

düzey penisilin direncidir. Enterokokların çok önemli bir kısmı bu yol ile eritromisin,

klindamisin ve tetrasiklinlere direnç kazanmış durumdadır (Korten 2002).

17

2.5.2.1 Beta laktam direnci

Enterokokların iki ayrı direnç mekanizması ile beta-laktam antibiyotiklere direnç

kazandığı saptanmıştır. Bunlardan biri E. faecium suşlarında görülen, kromozomal olan

ve penisilin afinitesinin azalması sonucu PBP 5’in miktarının artması ile ortaya çıkan

dirençtir. Bu mekanizmada esas, üremelerini inhibe edecek konsantrasyondaki β-laktam

antibiyotiklerinin varlığında, onlara düşük bağlanma afinitesi gösteren düşük molekül

ağırlıklı PBP5 sentezleyebilmeleridir. Bu sentez PBP değişikliklerini kodlayan DNA

bölgesinde meydana gelen mutasyon sonucu veya plazmid kazanımı ile

gerçekleşmektedir (Derbentli 1998).

İkinci direnç mekanizması ise beta-laktamaz üretimidir. Bu enzimler antibiyotiğin hedef

bölgeye ulaşamadan modifiye edilmesine veya parçalanmasına yol açarlar. Beta

laktamaz oluşturan suş ilk olarak 1981 yılında ABD’de tanımlanmıştır (Derbentli 1998,

Lefort vd. 2000). Ülkemizde yapılan çeşitli çalışmalarda beta-laktamaz üreten

enterokok saptanmamıştır (Moaddab ve Töreci 2000). Enterokoklarda β-laktamaz

enzimini kodlayan gen, transfer edilebilen bir plazmid üzerindedir. Bazı E. faecalis

suşlarında, bu genin kromozomlarda yerleştiği gösterilmiştir (Moellering 1992, Çınar

vd. 1999). Beta laktamaz üreten enterokok suşlarının büyük çoğunluğunda, yüksek

düzeyde gentamisin direnci de tespit edilmiştir (Markowitz vd. 1991).

E. faecium’ un klinik izolatları penisilinlere E. faecalis’den daha dirençlidir (Wax vd.

2008). PBP5 ilişkili düşük seviyeli ampisilin direnci enterokoklarda kromozomal

kökenlidir. Yüksek seviyede (MİK > 100 µg/mL) ampisilin direnci E. faecium’da düşük

afiniteli PBP üretimi, E. faecalis’te ise β-laktamaz üretimi ile oluşmaktadır

(Handwerger vd. 1992, Lavery vd. 1997). Vankomisine dirençli E. faecium penisilin ve

ampisiline daha dirençlidir.

β-laktam antibiyotikler üriner sistem infeksiyonları gibi bazı infeksiyonlarda tek başına

kullanılabilseler de menenjit, endokardit gibi bakterisidal aktivite gerektiren vakalarda

standart kombinasyon tedavisi kullanmak gereklidir. Vankomisin ve teikoplanin gibi

hücre duvarına etkili antibiyotiklerde beta-laktamaz üreten suşların etken olduğu

18

infeksiyonların tedavisinde yer alabilir (Kutlu ve Dokuzoğuz 2004). β-laktam

antibiyotiklerin aminoglikozitlerle kombinasyonu, sinerjistik bakterisidal etki

göstermektedir (penisline duyarlı ve yüksek düzey aminoglikozit direnci yok ise)


2.5.2.2 Glikopeptit direnci

Enterokoklarda glikopeptit direnci, Van A’dan Van G’ye kadar çeşitlilik gösterebilen

farklı direnç fenotipleri ile ifade edilir. Fenotipik sınıflandırmada; bakterinin sadece

vankomisin ya da hem vankomisin hem de teikoplanine dirençli olması, direncin

indüklenebilir veya yapısal olması ve diğer bakterilere geçirilebilir olup olmamasına

göre yapılır. Bu glikopeptit direnç tipleri içerisinde en iyi tanımlanmış olanları Van A,

Van B, Van C ve Van D dirençleridir (Çizelge 2.2).

19

Çizelge 2.2 Enterokoklarda glikopeptit direnç tipleri (Murray 2000, Guardabassi ve Dalsgaard 2004)

Özellik VanA VanB VanC VanD VanE

MİK( µg/mL) Vankomisin Teikoplanin

64 - >1000 16 - > 512

4 - >1000 0.5 - > 32

2 - 32 0.5 - 1

16 - 64 2 - 4

16 0.5

Transfer edilebilme

+ + - - ?

Direnç genlerinin lokasyonu

Plazmidler Kromozom (plazmidler)

Kromozom Kromozom Kromozom

İndüklenme ile ekspresyon Vankomisin Teikoplanin

+ +

+ -

- -

+ -

+ -

Hareketli element

Tn 1546

Tn 1547

-

?

?

Ligaz geni van A van B van C-1 ve

van C-2/van

C-3

van D van E

Direnç tipi Kazanılmış Direnç

Kazanılmış Direnç

Doğal Direnç



Direnç proteinin M.A’lığı(kDa)

39-40 39.5 38 ? ?

Modifiye edilmiş hedef

D-ala-D-lac

D-ala-D-lac

D-ala-D-ser

D-ala-D-lac

D-ala-D-ser

Türler

E. faecalis

E. mundtii

E. faecium

E. raffinossus

E. avium

E. gallinarum

E. durans

E.casseliflavus

E. faecalis

E. faecium

E. gallinarum

E.casseliflavus

E. flavescens

E. faecium

E. faecalis

20

Ortamda vankomisin gibi bir indükleyici bulunduğunda, sensör kinaz enziminin bir

regülatör yanıt proteini ile ilişkiye girmesi sonucu, vankomisin direncinden sorumlu

genlerin transkripsiyonu uyarılır. Transkripsiyona uğrayan genler, translasyona

uğradığında; vankomisinin çok düşük bir ilgi ile bağlanabildiği ve D-ala-D-laktat veya

D-ala-D-serin ile sonlanan hücre duvarı öncülerinin oluşumunu sağlayan ligaz

enzimlerine dönüşürler. Diğer gen ürünleri ise D-ala-D-ala dipeptitlerini keserek hücre

duvarının esas yapısında bulunan glikopeptitlere duyarlı hedefleri ortadan kaldırırlar

(Şekil 2.5). VRE’ lerde peptidoglikan öncülüğündeki bu değişiklikler, glikopeptit

ajanların hedefine 1000 kat daha düşük bir ilgi ile bağlanmasına neden olur ve hücre

duvarı sentezinin inhibisyonu, bu temel mekanizma ile engellenir (Murray 2000,

Guardabassi ve Dalsgaard 2004).

Şekil 2.5 Vankomisin antibiyotiğinin ve vankomisine dirençli enterokoklarda Van A direncinin hücre duvar öncülerine etki mekanizması (V= vankomisin) (Patel 1999)

21

2.5.2.2.1 Van A tipi direnç

Van A tipi direnç en sık karşılaşılan dirençtir. Dirençten 39-40 kDa ağırlığında, Van A

adlı bir membran proteini sorumludur. Van A izolatları hem vankomisine (MIC ≥ 64

µg/mL) hem de teikoplanine (MIC ≥ 16 µg/mL) yüksek düzeyde dirençlidir. Dirence

neden olan membran proteini ancak vankomisin varlığında sentezlenebilir. vanA geni ve

direnç ekspresyonu ile regülasyondan sorumlu vanS, vanR, vanH, vanX ve vanZ gibi

diğer genler, E. faecium’da sıklıkla bir plazmid üzerinde bulunan 10581 bp’lik bir

transpozon (Tn 1546) da yerleşmektedir (Şekil 2.6). Bu genlerin ekspresyonu sonucu,

peptidoglikan terminalinde D-Ala-D-Ala yerine D-Ala-D-Laktat sentezlenmekte ve

vankomisin bu bileşiğe daha düşük ilgi ile bağlanmaktadır (French 1998, Çetinkaya vd.

2000, Reynolds ve Courvalin 2005).

Şekil 2.6 Vankomisin direncinden sorumlu Tn1546 transpozonundaki van A gen

kümesinin genetik haritası (Arthur ve Courvalin 1993) (Açık oklar sekansların kodlanma yönünü; transpozonun başındaki ve sonundaki IRL ve IRR sırasıyla sol ve sağ inverted tekrarlarını; B, BamHI; Bg, BglII; EI, EcoRI; EV, EcoRV; H, HindIII; P, PstI; X, XbaI restriksiyon enzimi kesim bölgelerini göstermektedir.)

Van R ve Van S proteinleri, vanHAX gen kümesinin transkripsiyonunu düzenleyen iki

elemanlı bir regülatör sistem oluşturur. vanS, sensör gendir ve vankomisin varlığını

algılamada veya tanımada rol alan Van S proteinini kodlar. vanR, regulatör gendir ve

diğer direnç genlerinin transkripsiyonel aktivasyonunda görev alan Van R proteini

kodlar. Van S, Van R’ye sinyal verir ve dirençte yer alan Van H, Van A ve Van X gibi

22

diğer bazı proteinlerin sentezi veya aktivasyonu ile sonuçlanan regülatör cevabı

oluşturur. Van A tipi suşlarda hem vankomisin hem de teikoplanin transkripsiyonu

indükleyebilir, ancak kesin sinyaller hala bilinmemektedir. Van A, Van H ve Van X

proteinleri kor proteinleridir

vanA, D-Ala-D-Laktat oluşumunu sağlayan bir ligaz proteini kodlar. vanA tek başına

vankomisin direncini sağlayamaz, çünkü D-Laktat gibi D-hidroksi asitler,

enterokoklarda genellikle sentezlenmez ve enterokokların çevresinde doğal olarak

bulunmazlar. Bu yüzden D-Laktat sentezlemek için enterokoklar, Van A için substrat

üretiminde gerekli olan vanA operonu içindeki genleri kazanmalıdır. vanH, piruvattan

D-Laktat sentezini sağlayan bir dehidrogenaz enzimini kodlar ve D-Laktat havuzunun

oluşumunu sağlar. vanX, bir DD-dipeptidaz enzimi olan Van X proteinini kodlar. D-

Ala- D-Ala havuzunu doğal bir enterokokal ligaz ile azaltarak, yarışma sureti ile normal

pentapeptit sentezini azaltır. D-Ala-D-Laktata karşı aktivitesi yoktur. vanY, DD

karboksipeptidaz olan Van Y proteinin kodlar ve peptidin sonundaki D-Ala’ yı ayırır.

Bu yolla orta düzeyde direnci sağlar. vanZ, ılımlı olarak teikoplanin MİK değerini

arttırır, ancak vankomisinin MİK değeri üzerinde etkili değildir. Bunun mekanizması

henüz aydınlatılmamıştır. vanY ve vanZ genleri dirence katkıda bulunabilir, ancak

direnç fenotipi için zorunlu değildir (Malathum ve Murray 1999, Çetinkaya vd. 2000).

vanA geni ilk olarak E. faecium’da, sonraları ise E. faecalis, E. durans, E. gallinorum,

E. avium, E. mundtii, E. casseliflavus, E. raffinosus gibi diğer enterokok türlerinde de

belirlenmiştir. Van A tipi direnç Avrupa’ da en çok görülen direnç tipidir. ABD’de Van

B suşları oldukça yaygın olmasına rağmen, Van A hala daha baskın direnç tipidir (Clark

vd. 1993).

2.5.2.2.2 Van B tipi direnç

Van B tipi direnç; Tn1547 transpozonunu üzerinde kodlu olan vanB geninin

sentezlediği 39.5 kDa moleküler ağırlıklı Van B membran proteini ile oluşturulur.

Vankomisin direnci orta düzeyde (MİK: 4-1000 µg/mL) olup, teikoplanine duyarlıdır

(MİK: 0.5-1 µg/mL). Modifiye edilmiş hedefi D-ala-D-laktat’dır. E. faecium ve E.

23

faecalis türlerinde görülür. Sadece Van B direncine özgü bir gen dışında diğer altı

genin, vanA kümesindeki genlerle % 77 homoloji gösterdiği saptanmıştır (Arthur ve

Courvalin 1993). Direnç genleri genellikle kromozom üzerinde yerleşmiştir ve

konjugasyon ile aktarılabilir ancak bazı VRE vakalarında plazmidler üzerinde

bulunabileceği de saptanmıştır (Handwerger vd. 1992, Lavery vd. 1997, Leclercq ve

Courvalin 1997, Hanrahan vd. 2000). Van B tipi dirençte vankomisin duyarlılığında

azalma, gentamisin sinerjisinde kaybolma, streptomisin sinerjisinde azalma olmuştur.

Teikoplanin tek başına Van B direnci taşıyan suşlara karşı etkili bulunmuş ama bu

tedavi teikoplanine dirençli suşların seleksiyonuna neden olmuştur. Teikoplanin

gentamisin kombinasyonunun ise dirençli mutant gelişimini engellediği belirlenmiştir.

Buna göre Van B tipi dirençli enterokokkal enfeksiyonlarda teikoplanin aminoglikozit

kombine kullanımı tercih edilmelidir (Çetinkaya vd. 2000, Rice 2001).

2.5.2.2.3 Van C tipi direnç

Van C tipi direnç, E. gallinarum, E. casseliflavus ve E. flavescens türlerinde görülen

doğal bir direnç türüdür. Van C gen kümesi D-ala-D-serin ile sonlanan pentapeptidin

oluşumunu sağlar. Bu direnç türünün üç alt tipi bulunmaktadır: Van C-1, Van C-2, Van

C-3. Bu genlerin türe spesifik olduğu düşünülmektedir (E. gallinorum– vanC-1, E.

casseliflavus– vanC-2 ve E. flavescens– vanC-3). Van A veya Van B ile % 37-39

oranında benzerlik gösterir. Van C tipi dirence sahip olan suşlar teikoplanine duyarlıdır.

Yapısal olarak indüklenemez ve transfer edilemezler (Çetinkaya vd. 2000).

2.5.2.2.4 Van D tipi direnç

Sadece E. faecium’da bildirilmiştir. VanD geni izolatları yapısal olarak hem

vankomisine (MIK 64-128 µg/mL) hem de teikoplanine (MIK 4-64 µg/mL) dirençlidir.

vanD geni kromozomaldir ve konjugasyon yolu ile transfer edilemez (Başustaoğlu

2004, Koneman vd. 2005). Modifiye edilmiş hedef D-ala-D-Laktat’dır. Glikopeptit

direnci gen grubu olan vanD; vanA ve vanB operonları ile benzer organizasyon gösterir

(Perichon vd. 2000).

24

2.5.2.3 Aminoglikozitlere direnç

Enterokoklarda aminoglikozit direnci üç farklı mekanizma ile meydana gelir.

2.5.2.3.1 Permeabiliteye bağlı direnç

Aminoglikozitlere karşı kromozomal mutasyon sonucunda membrandaki

permeabilitenin azalması ile oluşan direnç yüksek düzeyde olmamakla birlikte tüm

aminoglikozitlere karşı çapraz direnç şeklindedir. Bu tip direnç β-laktam antibiyotikler

ile birlikte kullanılarak ortadan kaldırılabilir (Başustaoğlu ve Aydoğan 2002).

2.5.2.3.2 Aminoglikozit modifiye edici enzimlere bağlı direnç

Aminoglikozitlerdeki en sık gözlenen yüksek düzeydeki (MIK ≥ 2000 µg/mL) (HLR)

edinsel direnç, plazmid veya transpozon kaynaklı asetiltransferaz (AAC),

adeniltransferaz (ANT), fosfatransferaz (APH) gibi modifiye edici enzimlerle

antibiyotiğin inaktive edilmesidir (Murray 1998). Yüksek düzey gentamisin direncine

neden olan enzim 6’- asetiltransferaz- 2” fosfo- transferaz enzim kompleksi olup

streptomisin hariç klinik kullanımda olan tüm aminoglikozitlere (gentamisin,

tobramisin, amikasin ve netilmisin) yüksek düzeyli direncin ortaya çıkmasında etkilidir.

Streptomisine, enzimatik yoldan kazanılan yüksek düzey direnç ise adeniltranferaz

(ANT-6’) enzimi ile olmaktadır. Bu enzim varlığında sadece streptomisine karşı yüksek

düzeyde direnç gelişmektedir (Leclercq vd. 1992). E. faecium kökenlerinde yüksek

düzey aminoglikozit direnci bulunmasa da penisilin ile sadece gentamisin ve

streptomisin sinerjik etkili olabilir. Çünkü E. faecium kökenleri doğal olarak tobramisin,

netilmisin, kanamisin ve sisomisini modifiye eden 6’ asetiltransferaz (AAC- 6’)

enzimini oluştururlar. AAC 6’ enzimi aac(6’)- li geni tarafından kodlanır. Bu durumda

yüksek düzey aminoglikozit direnci olmamakla beraber (MIK< 2000 µg/mL) hücre

duvarına etkili antibiyotikler ile sayılan bu 4 aminoglikozit arasındaki sinerji

bozulmaktadır (Simjee ve Gill 1997).

25

2.5.2.3.3 Ribozomal direnç

Bir ribozomal proteinde oluşan tek bir aminoasit değişikliği, o ribozomun antibiyotiğe

karşı düşük ilgi göstermesine neden olur. Yalnız streptomisine karşı gelişen ve transfer

edilemeyen bu tür direnç nadir görülmekte ve diğer aminoglikozitlere karşı çapraz

direnç oluşmamaktadır (Başustaoğlu ve Aydoğan 2002).

2.5.2.4 Kloramfenikole direnç

Yapılan çesitli çalısmalarda enterokokların % 20–42’sinin kloramfenikole dirençli

olduğu ve dirençten en sık sorumlu mekanizmanın kloramfenikol asetil transferaz

üretimi olduğu bildirilmektedir (Murray 1990). Kloramfenikolün aktivitesi,

kloramfenikol asetiltransferaz (CAT) enzimi tarafından inhibe edilir ve direnç gelişir.

Asetillenme sonucu kloramfenikol ribozomlara bağlanamaz ve protein sentezi

engellenemez. Enzimi kodlayan cat geni enterokoklarda konjugatif ve konjugatif

olmayan plazmidler ya da kromozom üzerinde bulunabilir. Streptokokal plazmid

pIP501 üzerinde bulunan kloramfenikol asetiltransferaz direnç geni ile akraba olan gen

dizisi, E. faecalis ve E. faecium izolatlarında bulunmuştur bu da genin yatay gen

transferi ile aktarılabildiğini göstermiştir (Aarestrup vd. 2000). Kloramfenikol

enterokoklara karşı bakteriyostatik etkilidir. Klinikte kloramfenikolün in vitro kullanımı

yaygın değildir çünkü çoklu ilaç direnci gösteren E. faecium’a karşı in vitro aktivitesini

korumaktadır. Ancak bazı VRE suşlarında kloramfenikole karşı da direnç gösterilmiştir


2.5.2.5 Tetrasiklinlere direnç

Tetrasiklin direnci enterokoklarda konjugasyon yolu ile kazanılan direncin en tipik

örneğidir (Murray 1998). Enterokoklarda tetrasiklin grubu antibiyotiklere dirençten

sorumlu olan çok sayıda gen tanımlanmıştır. Bunlardan tetM geni Tn916 transpozonu

üzerinde taşınır ve en yaygın olarak bulunan direnç genidir (Aarestrup vd. 2000, Huys

vd. 2004). tetM, tetO ve tetS genleri tetrasiklinlerin ribozomlar üzerindeki etkisini

26

inhibe eder. tetL geni ise enterokokal bir plazmid üzerinde taşınır. Bu direnç geni

mikroorganizma tetrasiklinle karşılaştığında amplifiye olur. tetL ve tetK geni

tetrasiklinlerin hücre dışına pompalanmasını sağlayan aktif transport sistemini de kodlar

(Murray 1990).

2.5.2.6 Kinolonlara direnç

Direnç gyrA (DNA giraz alt ünitesi) ve parC (topoizomeraz) genlerindeki mutasyonlara

bağlı gelişir. Enterokokal suşların çoğunluğu kinolonlara orta seviyede duyarlılık veya

direnç gösterir (Klare vd. 2003). Kinolonlar üriner sistem infeksiyonlarında tek başına

kullanılabilir. Ancak üriner sistem infeksiyonu dışında başka bir infeksiyon varsa

kullanılmamalıdır. Yeni kinolonlar, özellikle klinafloksasin ve sitafloksasin VRE’lere

karşı, eski kinolonlara göre daha etkilidir. VRE ile oluşturulan deneysel endokarditlerde

klinafloksasin tek başına veya penisilinle birlikte etkili bulunmuştur (Kutlu ve

Dokuzoğuz 2004).

2.3.2.7 Makrolitlere direnç

Makrolidlere direnç genellikle ermB geni ile ilişkilidir. Eritromisin dirençli izolatların

çoğunda belirlenen ermB geni 23 rRNA’yı modifiye eden ve makrolidlere karşı

dirençliliği sağlayan erm metilazı kodlamaktadır (Del Campo vd. 2003). Makrolidler

yanında, linkozamidlere ve streptogramin B’ye karşı da direçlilik sağlayan bu gen söz

konusu antibiyotiklere dirençli enterokok izolatlarında çok yaygın bir şekilde

görülmektedir (Aarestrup vd. 2000, Shepard ve Gilmore 2002).

E. faecalis’te yürütülen analizler sonucu, bu bakteride tanımlanan ermB geninin S.

aureus transpozonu 554 üzerinde taşınan ermB geni ile tamamen aynı olduğu

saptanmıştır (Stovcik vd. 2008). Ayrıca enterokoklarda lakton halkasının hidrolizi veya

efluks mekanizması sonucu antibiyotiğin uzaklaştırılmasıyla da direnç oluşabilir (Klare

vd. 2003).

27

Rifampisin antibiyotikleri DNA-bağımlı RNA polimerazın β-altünitesine

bağlanmaktadır. Pek çok bakteride, rifampisin direnci RNA polimerazın β-altünitesini

kodlayan rpoB genindeki mutasyonlar ile gerçekleşmektedir (Enne vd. 2004). Özellikle

rpoB genleri bakterilerde yüksek düzeyde korunmuş merkezi metabolizmaya ait

genlerdir. Tek başına kullanımında direnç gelişeceğinden klinikte kullanımı önerilmez.

28

3. MATERYAL VE YÖNTEM

3.1 Materyal

3.1.1 Bakteriler

Çalışmada Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi’nde çeşitli klinik servislerde

yatmakta olan hastalardan alınan idrar, bos, kan, katater, pü ve rektal swab

örneklerinden elde edilen bakteri kültür koleksiyonundan sağlanan suşlar kullanılmıştır.

Yapılan araştırmada, daha önce Enterococcus faecium olduğu saptanmış 95 izolat

arasından çoklu ilaç dirençliliği içeren 64 tanesi incelenmiştir (Çizelge 3.1).

Stok kültürler -80 °C’de % 15 gliserol ilave edilen Trypton Soy Broth (TSB) sıvı besi

ortamında saklanmıştır. Çalışma süresince denenecek kültürler, TSB besi ortamında 37

°C’de 1 gece geliştirildikten sonra denemeye alınmıştır.

3.1.2 Besiyerleri

Trypton Soy Broth (Oxoid, UK) Kazein hidrolizat 17 g

Soya hidrolizat 3 g

Glukoz 5 g

NaCl 5 g

K2 HPO4 2.5 g

Destile su 1 lt

pH 7.3 ± 0.2 (sterilizasyondan önce)

30 Gram toz besiyeri 1 litre saf su ile eritilerek karıştırıldı ve 121 °C otoklavda 15

dakika sterilize edildi.

29

Müller-Hinton Broth (Oxoid, UK)

Et ekstraktı 30 g

Kazein hidrolizat 17.5 g

Nişasta 1.5 g


38 Gram toz besiyeri 1 litre saf su ile karıştırıldı ve 121 °C otoklavda 15 dakika sterilize

edildi.

Trypticase Soy Agar (Oxoid, UK)

Kazein hidrolizat 15 g

Soya hidrolizat 5 g

NaCl 5 g

Agar 15.0 g


40 Gram toz besiyeri 1 litre distile su ile karıştırıldı ve 121 °C otoklavda 15 dakika

sterilize edildi. 50 °C’ye kadar soğutuldu ve % 5 steril defibriniz koyun kanı ilave

edildi.

3.1.3 Bakterilerin tür teşhisi

Klinik izolatlardan enterokokların teşhisi ve MİK testleri için BD (Becton Drive, USA)

firmasına ait Phonex sistemi, Enterococcus faecium olarak tür teşhisini doğrulamak

amacıyla da Rapid ID 32 Strep Api (Biomerıeux, France) testi kullanılmıştır.

30

Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan bakteriler ve izolasyon materyalleri

Kod Bakteri Türü İzolasyon

materyali

Bakteri Türü Kod İzolasyon

materyali

1

2

3

4

5

6

8

11

12

13

15

17

19

21

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

41

42

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

Rektal

Kan

İdrar

Kan

İdrar

Kan

İdrar

Kan

Kan

Rektal

Rektal

Rektal

Rektal

Kan

İdrar

İdrar

İdrar

Pü

Kan

İdrar

İdrar

Katater

İdrar

İdrar

Bos

İdrar

Rektal

İdrar

Rektal

Rektal

Rektal

Rektal

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faeciums

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

E. faecium

43

46

48

49

50

52

55

56

57

59

60

63

64

65

67

68

69

70

71

74

75

76

77

79

80

81

84

87

89

90

94

95

İdrar

Kan

Pü

İdrar

İdrar

İdrar

Rektal

İdrar

İdrar

Rektal

İdrar

Rektal

Pü

Rektal

İdrar

Rektal

Kan

Rektal

Kan

İdrar

rektal

İdrar

Kan

İdrar

İdrar

Kan

Rektal

Rektal

Rektal

Rektal

İdrar

Rektal

31

3.1.4 Antibiyotikler

Antibiyotik duyarlılık deneylerinde kullanılan antibiyotikler SİGMA (Oxoid, UK)

firmasından satın alınmıştır. Araştırmada kullanılan antibiyotiklerin disk

konsantrasyonları çizelge 3.2’de verilmiştir. Antibiyotik duyarlılık deneylerinde

standart suş Enterococcus faecalis ATCC 29212 kullanılmıştır.

Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan antibiyotikler ve disk konsantrasyonları (Oxoid, UK)

Antimikrobiyal Madde Sembol Grubu Disk konsantrasyonu

(µg)

Ampisilin AMP β -laktam 10

Streptomisin STR Aminoglikozit 300

Kanamisin KAN Aminoglikozit 30

Gentamisin GEN Aminoglikozit 120

Kloramfenikol CHL Fenikol 30

Tetrasiklin TET Tetrasiklin 30

Rifampin RIF Ansamisin 5

Vankomisin VA Glikopeptit 30

Eritromisin

Teicoplanin

ERT

TEC

Makrolid

Glikopeptit

15

30

32

3.1.5 Primerler

Çizelge 3.3 Antibiyotik direnç genlerinin tespiti için kullanılan primerler

Gen

Primer dizisi

Bant

büyüklüğü

(bç)

Referans

van A

Vankomisin

5’ GGGAAAACGACAATTGC 3’

732

Dutka-Malen

vd. 1995 3’ GTACAATGCGGCCGTTA 5’

ant(6) - la

Streptomisin

5’ ACTGGCTTAATCAATTTGGG 3’

577

Kobayashi vd.

2001 3’ GCCTTTCCGCCACCTCACCG 5’

aac(6’)-aph(2’’)

Gentamisin

5’ CCAAGAGCAATAAGGGCATACC 3’

675

Kobayashi vd.

2001 3’ ACCCTCAAAAACTGTTGTTGC 5’

aphA-3

Kanamisin

5’ GCCGATGTGGATTGCGAAAA 3’

292

Braak vd.

1999 3’ GCTTGATCCCCAGTAAGTCA 5’

rpoB1

Rifampisin

5’ GTCCGTTTCGGCTTTAATATA 3’

1000

Enne vd. 2004 3’ AAGAAACGAGCATTCAGCAA 5’

rpoB2

Rifampisin

5’ CGCAAGCGACTCAAGAACAG 3’

1000

Enne vd. 2004 3’ GAGCAAATGTTCCATCTTCA 5’

bla(Z)

Ampisilin

5’ TACAACTGTAATATCGGAGGG 3’

778

Stovcik vd.

2008 3’ CAATAGGTTCAGATTGGCCC 5’

ermB

Eritromisin

5’ CATTTAACGACGAAACTGGC 3’

422

Aarestrup vd.

2000 3’ GGAACATCTGTGGTATGGCG 5’

catpIP

Kloramfenikol

5’ GGATATGAAATTTATCCCTC 3’

486

Aarestrup vd.

2000 3’ CAATCATCTACCCTATGAAT 5’

tet M

Tetrasiklin

5’ GTTAAATAGTGTTCTTGGAG 3’

657

Aarestrup vd.

2000 3’ CTAAGATATGGCTCTAACAA 5’

tet L

Tetrasiklin

5’ CATTTGGTCTTATTGGATCG 3’

475

Aarestrup vd.

2000 3’ ATTACACTTCCGATTTCGG 5’

vanB

vankomisin

5’ ATGGGAAGCCGATAGTC 3’

635

Mcgregor ve

Young 2000 3’ GATTTCGTTCCTCGACC 5’

33

3.2 Yöntem

3.2.1 İzolatlarının saflık kontrolü ve tür teşhisinin doğrulanması

Daha önce E. faecium olarak tanımlanmış ve antibiyotik duyarlılıkları incelenmiş olan

95 izolat arasından çoklu ilaç dirençli oldukları bilinen 64 izolat seçilmiş ve tekrar saflık

kontrolü yapmak için % 5 koyun kanlı TSA besiyerine ekilmiştir. E. faecium izolatları α

hemolitik olabilir yada hemolitik özellik göstermeyebilir. Bu nedenle suşlar öncelikle

besiyeri üzerinde α-hemolitik, β-hemolitik veya hemolitik olmama özelliklerine göre

incelenmiştir. Daha sonrasında spesifik koloniler seçilerek Gram boyamaları

yapılmıştır. Tekli, ikili veya kısa zincirler halinde görünen Gram- pozitif koklar

değerlendirmeye alınmıştır. Katalaz testi; öze ile temiz bir lam üzerine alınan bakteri

kolonisine % 3’lük H2O2 damlatılarak yapılmıştır. Hava kabarcığı oluşturmayan lamlar

katalaz negatif olarak değerlendirilmiştir. % 6.5 NaCl’de üremelerine ve lateks

yöntemine göre serolojik olarak D grubu yüzey antijeni içerip içermediklerine

bakılmıştır (Şekil 3.1). Bu özelliklerine göre yeniden Enterokok cinsine ait oldukları

saptanan 64 bakterinin tür teşhisi yapılmıştır (Facklam vd. 1997).

Teşhis işlemi ve MİK (Minimal İnhibisyon Konsantrasyonu) için Gram- negatif ve

Gram- pozitif bakterilerin otomatik tanı ve antibiyogram duyarlılık testlerinde

kullanılan, Akdeniz Üniversitesi Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarına ait Phonex

cihazı (Becton Drive, USA) kullanılmıştır. Phonex panelinin ID kısmı, kurutulmuş

kimyasal substratlı 45 kuyu ve 2 floresans kontrol kuyusu içerir. Bakteri tiplendirmesini

saptamak için bir seri konvansiyonel, kromatojenik ve florejenik biyokimyasal

maddeler kullanır. Üreme tabanlı ve enzimatik maddelerin her ikiside taksonomi

sınırları içinde çeşitli reaktif tiplerine döner. Testler bakteri tarafından kullanım ve

indirgeme olaylarının çeşitli indikatörlerle gösterilmesi presibine dayanır. Phonex ID

paneli ile çalışmada kullanılan tüm suşların E. faecium olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca tür

teşhisini doğrulamak amacıyla rapid ID 32 Strep Api testinden de yararlanılmıştır (Şekil

3.2). Tür teşhisi doğrulanan bakterilerden % 15 gliserol içeren TSB besiyerine stok

kültürler hazırlanmıştır.

34

Şekil 3.1 Enterokok izolatlarının tanısında kullanılan testler (Faclam vd. 1997)

%5 koyun kanlı Tripticase soya agar

Gram Boyama

Gram- pozitif koklar (katalaz(-)

%40 safralı ortamda üreme ve escülini hidrolize etme

D grubu Streptekok

%6.5 NaCl’de üreme

PYR (+)

Enterococcus spp.

Rapid ID 32 Strep Api ile tür teşhisi

Enterococcus faecium

35

Şekil 3.2 rapid ID 32 Strep Api testi ile Enterococcus faecium suşlarının doğrulanması

36

3.2.2 Antimikrobiyal dirençliliğin belirlenmesi

Antibiyotik duyarlılık testinde kullanılan Phonex cihazı AST paneli buyyon tabanlı bir

mikrodilüsyon testidir ve kuru antimikrobiyal ajanları içeren 84 kuyu ile üreme kontrol

kuyusu içerir. Bakteriyel bulanıklık, bakteriyel üremenin belirlenmesinde kullanılır.

Phonex sistemi, organizmanın üremesinin belirlenmesi için redox göstergesini kullanır.

Phonex VRE, yüksek düzey aminoglikozit direnci testleri NCCLS standart broth mikro

seyreltme ve NCCLS taramalı agar testi ile geliştirilerek optimize edilmiştir

(Anonymous 2000).

% 5 koyun kanlı TSA plaklarında saf olarak elde edilen enterokok kolonilerinden ID

broth içerisine steril eküvyonla BBL CrystalSpec nefelometre (Becton Drive, USA) ile

0.5-0.6 Mac Farland ölçülecek şekilde bakteri süspansiyonu hazırlanmıştır. Hazırlanan

süspansiyondan 25 µl indikatör çözeltisi eklenen AST broth içerisine alınmıştır. Bu

şekilde hazırlanan panel cihaza yerleştirilmiştir. Panel üzerindeki kuyucuklarda oluşan

biyokimyasal reaksiyonlara göre her bir izolatın türü teşhis edilmiş ve belirli

antibiyotiklere karşı MİK değerleri saptanmıştır. Ayrıca suşların antibiyotik

dirençlilik/duyarlılık profillerinin araştırılmasında disk difüzyon yöntemi de

kullanılmıştır. Kültürler 5mL MHB ortamına inoküle edilerek 37 °C’de inkübasyona

bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra kültür süspansiyonunun bulanıklılığı McFarland 0.5

standardının absorbansı 625 nm’de 0.08 - 0.1 değerinde olacak şekilde ayarlanmıştır.

Absorbansı ayarlanan kültürler % 0.7 oranında agar içeren 5 mL yumuşak agar (MHB)

ortamına 100 µl inoküle edilerek, Müller Hinton (Oxoid, UK) agar plakları üzerine

homojen bir şekilde yayılmıştır. Antimikrobiyel ajanlar emdirilmiş 6 mm’ lik kağıt

diskler, agar yüzeyine yerleştirilmiş ve 37 ºC’de 18 saat inkübe edilmiştir. Vankomisin

antibiyotiği için ise 24 saat inkübasyon uygulanmıştır. Disk difüzyonu için, 10 farklı

antimikrobiyel madde kullanılmıştır. Kullanılan antimikrobiyel diskler ve içerikleri

çizelge 3.2’de verilmiştir. İnkübasyon sonrası, disklerin etrafındaki zon çapları

ölçülmüş ve Klinik Laboratuar Standartları Enstitüsü (CLSI)’ nün belirlediği kırılma

noktaları ile karşılaştırılmıştır. Buna göre sonuçlar duyarlı (S), orta dirençli (I) ve

dirençli (R) olarak belirlenmiştir (Anonymous 2011).

37

3.2.3 İzolatların plazmid profillerinin belirlenmesi

3.2.3.1 Plazmid izolasyonu

TSB broth besiyerinde 37 °C’de 18 saat geliştirilen E. faecium kültürlerinden, 10 mL’

lik TSB ortamlarına 1 mL’lik inokülasyonlar yapılarak, kültürler 37 °C’de 3–3.5 saat

inkübasyona tabi tutulmuştur. Bu süre bitiminde santrifüj tüplerine aktarılan bakteri

kültürleri, 6000 devirde 15 dakika santrifüj edilmiştir. Hücre çökeltisi kurutulduktan

sonra, 380 µL sakkaroz tamponunda çözülmüş ve steril mikrosantrifüj tüplerine

aktarılmıştır. 37 °C’ye kadar ısıtılan bu ortama 96.5 µL lizozim çözeltisi ilave edilerek

37 °C su banyosunda 5 dakika bekletilmiştir. 48.5 µL Tris-EDTA–1 uygulamasından

sonra, mikrosantrifüj tüplerine % 20 sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisinden 28 µL

aktarılarak karıştırılmıştır. Bu aşamada ortamda viskozitenin artışı, lizizin başladığını

göstermektedir. Lizizin tamamlanması için, mikrosantrifüj tüpleri 37 ºC su banyosunda

10 dakika bekletilmiştir. Bu süre sonunda tüpler mekanik karıştırıcıda ve yüksek

devirde 30 saniye karıştırılarak kromozomal DNA’nın kırılması sağlanmıştır. Ortama,

yeni hazırlanmış 3 N NaOH çözeltisinden 28 µL ilave edilmiş ve tüpler düz bir zemin

üzerinde 10 dakika süre ile yavaş bir şekilde çevrilerek kromozomal DNA’nın alkali

denatürasyon koşulları oluşturulmuştur. Ortam pH’sının uygulama sırasında 12.1 – 12.3

arasında olup olmadığı kontrol edilmiştir. Denatürasyon aşamasının sonunda

mikrosantrifüj tüplerine 50 µL 2 M Tris-HCl çözeltisi aktarılarak, 3 dakika süre ile yine

düz bir zeminde karıştırılmıştır. Ortam pH’ sının 8.5–9.0 arasına düşüşü ile

nötralizasyonun sağlandığı belirlenmiştir. Mikrosantrifüj tüplerine, +4 °C’ de tutulan 5

M NaCl çözeltisinden 72 µL ve % 3 NaCl ile doyurulmuş fenol çözeltisinden 700 µL

ilave edilerek +4 °C’de 12500 devirde 20 dakika santrifüj işlemi uygulanmıştır.

Tüplerde oluşan üst faz, mikropipet ile yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarılmış ve

deproteinasyonun sağlanması için kloroform/izoamilalkol (24:1) çözeltisinden 700 µL

ilave edilmiştir. Tüpler +4 ºC’de 12500 devirde 20 dakika santrifüj edilerek üst faz

alınmış ve 500 µL etanol ilave edilmiştir. Ekstraktlar - 20 ºC’de 1 gece bekletilmiş ve

plazmid DNA, 12500 devirde 20 dakika santrifüj edilmek suretiyle çöktürülmüştür. Son

aşamada sıvı faz akıtılarak DNA çökeltisi kurutulmuştur. Çökeltiler, 20 µL Tris-EDTA-

38

2 içerisinde çözülmüş ve elektroforez uygulamasından önce RNaz A stok çözeltisinden

2 µL ilave edilerek 37 ºC’de 45 dakika inkübe edilmiştir (Anderson ve McKay 1983).

Sakkaroz Çözeltisi

Tris 0.655 g

EDTA 0.0372 g

Sakkaroz 6.7 g

Distile su 100 mL

pH 8.0 ± 0.02

Kaba filtreden geçirildi ve 121 °C’de sterilize edildi.

Lizozim Çözeltisi

Tris 0.3 g

Lizozim 0.1 g

Distile su 10 mL

pH 8.0 ± 0.02

Membran filtre ile sterilize edildi.

Tris-EDTA-1

Tris 0.6 g

EDTA 9.31 g

Distile su 100 mL

pH 8.0 ± 0.02


Tris-HCl

Tris-HCl 31.52 g

Distile su 100 mL

pH 7.0 ± 0.02


39

SDS Çözeltisi

Tris 0.6 g

EDTA 0.74 g

SDS 20 g

Distile su 100 mL

pH 8.0 ± 0.02


Tris_EDTA-2

Tris 0.121 g

EDTA 0.037 g

Distile su 100 mL

pH 7.5 ± 0.02


%3 NaCI ile Doyurulmuş Fenol Çözeltisinin Hazırlanışı: 100 g fenol üzerine 20 mL

destile su ve 3 g NaCl aktarılarak 45 ºC’deki su banyosunda çözülmüştür. Ortama 0.1 g

hidroksiguinolin ilave edilmiş ve karıştırılarak oda sıcaklığında tutulmuştur.

RNaz A Çözeltisinin Hazırlanışı: 5 mL steril destile su içinde hazırlanan 0.05 M

sodyum asetat çözeltisinin pH’sı, asetik asit ile 5’e ayarlanmış ve üzerine 5 mg RNaz A

ilave edilmiştir. Kaynar su içerisinde 5 dakika tutulduktan sonra, ortam –20 ºC’de

saklanmıştır.

3.2.3.2 Elektroforez

DNA örneklerinin elektroforezi, % 0.7 agaroz içeren jellerde yapılmıştır (Meyers vd.

1976). Yatay jel sistemleri için agaroz, 100 mL tris-asetat elektroforez tamponu

içerisinde ve kaynar su banyosunda çözülmüştür. 45 ºC’ye kadar soğutulan ortam

elektroforez plakalarına 30–50 mL olacak şekilde aktarılmış ve jel tarakları

yerleştirilerek 30 dakika bekletilmiştir. Bu süre sonunda tampon çözelti, jeli kapatacak

40

şekilde elektroforez tanklarına dökülmüş ve taraklar dikkatlice çıkartılmıştır. 37 ºC’de

45 dakika inkübe edilen DNA örnekleri su banyosundan alınarak, 2 µL marker boya

çözeltisi ile karıştırılmış ve mikropipet aracılığı ile jel kuyucuklarına aktarılmıştır.

Elektroforez, 80 voltta 2–2.5 saat süreyle yapılmıştır. Marker boyanın jel sistemleri terk

etmesinden sonra, elektrik akımı kesilmiş ve ortamdan alınan jeller, kullanılan

elektroforez tamponunun yeni hazırlanmış 0.2 µg/mL etidyum bromit içeren

çözeltisinde 30 dakika boya işlemine tabi tutulmuştur. Boyama işlemi bitiminde jeller,

366 nm dalga boyunda ultraviyole ışıkta incelenmiş ve Kodak Gel Logic 200 Imaging

System kullanılarak fotoğrafları alınmıştır (Macrina vd. 1982).

TRİS-Asetat Tampon

Tris 4.84 g

Sodyum asetat 4.08 mL

EDTA 0.37 mL

Distile su 1000 mL

pH 8.0 ± 0.02

Marker Boya

Bromfenol blue 0.25 g

Sakkaroz 40 g

Distile su 100 mL

3.2.3.3 Plazmid büyüklüklerinin saptanması

E. faecium suşlarından izole edilen plazmidlerin büyüklüklerinin belirlenmesinde;

moleküler büyüklükleri bilinen (Sigma Chem. Co. D5292) ve 2.067-16.210 baz çifti

arasında değişen 11 süpersarmal parça içerikli ccc DNA marker’larının elektroforetik

hareketlilikleri ile büyüklüklerinin logaritmaları arasında tanımlanan doğrusal ilişkiden

yararlanılmıştır (Macrina vd. 1978, Southern 1979, Schaffer ve Sederof 1981). Marker

ccc DNA moleküllerinin agaroz jel fotoğrafları üzerinde ölçülen göç aralıkları ile

41

bilinen büyüklüklerinin logaritmik değerlerine bağlı olarak eğrileri çıkarılmıştır.

İstatistik analizlerle her farklı jel için korelasyon katsayısı ve eğrinin eğimi belirlenerek,

bakterilerden izole edilen plazmidlerin büyüklükleri saptanmıştır (Campbell 1974, Elder

ve Southern 1983, Elder vd. 1983).

Moleküler Büyüklük (W) = Antilog10 [ I. (α-G) + H ]

X = marker DNA moleküllerinin agaroz jel üzerindeki göç aralığı (mm)

Y = Marker DNA moleküllerinin büyüklüğü (kb)

A = X1 + X2 + X3 + ...........................+ Xn

B = X12 + X2

2 + X32 + ...........................+ Xn

2

C = log10Y1 + log10Y2 + log10Y3 + .....................+ log10Yn

D = (log10Y1 )2+ (log10Y2 )

2+ (log10Y3 )2+ .....................+( log10Yn)

2

E = X1 (log10Y1 )+X2 ( log10Y2 ) + X3 ( log10Y3 )+ .....................+Xn ( log10Yn)

G = Ortalama X = A/N

H = Ortalama Y = C/N

αααα = Moleküler büyüklüğü bilinmeyen plazmidin jel üzerindeki göçü (mm)

Eğrinin Eğimi (I) =

Korelasyon Katsayısı (J) =

3.2.4 Genomik DNA izolasyonu

TSB besiyeri ortamında 37 °C’de 18 saat geliştirilen E. faecium kültürleri, 10 mL’lik

steril santrifüj tüplerine aktarılmış ve 6000 rpm’de 15 dakika santrifüj işlemine tabi

tutulmuştur. Hücre çökeltisi 500 µl TE tampon içerisinde çözülerek 14000 g’de 1

dakika oda sıcaklığında tekrar çöktürülmüştür. Oluşan hücre çökeltisi SET (Sakkaroz-

EDTA-TrisHCl) tampon içerisinde çözüldükten sonra 50 µl lizozim eklenmiş ve 30 dk

37 °C’de inkübe edilmiştir. Bu içerik üzerine 200 µl TE tampon ve 30 µl % 20’ lik SDS

).(

).(

AGB

CGE

−

−

)]._()].[._([

).(

AGBCHD

CGE

42

eklenip, birkaç kez elde çevrilerek karıştırılmıştır. Karışım üzerine 100 µl 5 M NaCl

ilave edilip tekrar karıştırılmıştır. Daha sonra ortama eşit hacimde (~500 µl) fenol

aktarılmış ve emülsiyon oluşana kadar karıştırılmıştır. Ortam 14000 g’de 15 dk +4 °C’

de santrifüj edilerek fazların ayrılması sağlanmıştır. Üst faz mikropipet aracılığı ile yeni

bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılmış ve üzerine eşit hacim (~500 µl) kloroform/izoamil

alkol eklenerek karıştırılmıştır. Karışım, 14000 g’de 15 dk oda sıcaklığında santrifüj

işlemine tabi tutulmuş ve oluşan üst faz yeni mikrosanrifüj tüplerine aktarılmıştır. Daha

sonra bu tüpte bulunan üst sıvının iki katı hacminde % 100’lük etanol tüpe ilave

edilmiştir. Bu karışım, 12000 rpm’ de +4 °C’de 15 dk santrifüj edilmiştir. Oluşan

çökelti havada kurutulduktan sonra 100 µl TE tampon ile çözülerek 2 µl RNaz A

eklenmiş ve 37 °C’de 45 dk inkübe edilmiştir. DNA saflığı spektrofotometrede

A260/A280 oranına bakılmak suretiyle ölçülmüştür.

Tris (Tris Hidroksimetil Amino Metan) / EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetik Asit)

Tris 1,21g

EDTA 0.37g

Distile su 1000mL

pH 2N HCl kullanılarak 7.4’ e ayarlandı. 121 °C’de sterilize edildi.

SET (Sakkaroz-EDTA-Tris HCl) Tampon

Tris HCl 0,788g

EDTA 1,86g

Sakkaroz 20g

Distile su 100mL

pH 8’ e ayarlanıp 121 °C’de sterilize edildi.

% 20 SDS Çözeltisi

SDS 20g

Steril distile su 100mL

43

Kloroform/İzoamil Alkol Çözeltisi

Kloroform 24mL

İzoamil Alkol 1mL

3.2.5 Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)

PZR amplifikasyonları için Techne TC-512 Thermal Cycler (England) cihazı

kullanılmıştır. Ta (bağlanma sıcaklığı, °C) her bir primer için ayrı ayrı Ta= 2 x (A+T) +

4 x (G+C) formülü kullanılarak hesaplanmıştır. PZR sonrasında, elde edilen ürünlerden

5µl alınarak 2µl 6x yükleme boyası ile karıştırılmış ve % 1 oranında agaroz içeren jelde

100 volt elektrik akımı altında koşturulmuştur. Bant büyüklüklerinin belirlenmesi amacı

ile 1 kb DNA Marker’dan (Fermentas, Finland) yararlanılmıştır. Elektroforez sonrası

jeller, 0.2 µg/mL etidyum bromit (BioShop, Canada) çözeltisinde 20 dk süre ile boyama

işlemine tabi tutularak ve 366 nm dalga boyunda UV ışık altında translüminatör

kullanılarak görüntülenmiş ve fotoğrafları çekilmiştir (Kodak Gel Logic 200 Imaging

System).

44

3.2.5.1 Antibiyotik dirençliliği kodlayan gen bölgelerinin PZR ile araştırılması

rpoB1 ve rpoB2 gen bölgelerinin çoğaltılması (Enne vd. 2004)

PZR karışım içeriği Reaksiyon hacmi Son hacim

Steril distile su 29,75 µl

5X PZR tamponu* 10 µl 1 X

dNTP (2mM)** 1 µl 0,04 mM

İleri primer 1 µl 0,2 µM

Geri primer 1µl 0.2 µM

MgCl2 (25mM)* 4 µl 2 mM

Taq DNA Polimeraz (5u/mL)* 0,25 µl 0.025u/mL

DNA 3 µl

Toplam 50µl

* Promega, USA ** Fermentas, Finland

PZR koşulları

95 0C …………………………………… 5 dakika

95 0C …………………………………… 1 dakika

57 0C …………………………………... 1 dakika 35 döngü

72 0C …………………………………... 1 dakika

72 0C …………………………………… 10 dakika

+ 4 0C ………………………………….. ∞

45

bla Z gen bölgesinin çoğaltılması (Stovcik vd. 2008)




dNTP (10mM)** 0.2 µl 0,04 mM





DNA 2 µl

Toplam 50µl


PZR koşulları

94 0C …………………………………… 5 dakika

94 0C …………………………………… 1 dakika

58 0C …………………………………... 30 saniye 35 döngü

72 0C …………………………………... 2 dakika

72 0C …………………………………… 10 dakika

+ 4 0C ………………………………….. ∞

46

tetM ve tetL gen bölgelerinin çoğaltılması (Aarestrup vd. 2000)




dNTP (2mM)** 1 µl 0,04 mM





DNA 3 µl

Toplam 50µl


PZR koşulları

94 0C …………………………………… 5 dakika

94 0C …………………………………… 1 dakika

53.5 0C ………………………………... 30 saniye 35 döngü

72 0C …………………………………... 2 dakika

72 0C …………………………………… 10 dakika

+ 4 0C ………………………………….. ∞

47

aphA3 gen bölgesinin çoğaltılması (Braak vd. 1999)




dNTP (10mM)** 0.2 µl 0,04 mM





DNA 3 µl

Toplam 50µl


PZR koşulları

94 0C …………………………………… 5 dakika

94 0C …………………………………… 30 saniye

54.5 0C ………………………………... 45 saniye 32 döngü

72 0C …………………………………... 2 dakika

72 0C …………………………………… 10 dakika

+ 4 0C ………………………………….. ∞

48

aac6’-aph2’’ gen bölgesinin çoğaltılması (Kobayashi vd. 2001)




dNTP (10mM)** 0.2 µl 0,04 mM





DNA 3 µl

Toplam 50µl


PZR koşulları

94 0C …………………………………… 5 dakika

94 0C …………………………………… 1 dakika

58 0C ……………….………………...... 1 dakika 30 döngü

72 0C …………………………………... 2 dakika

72 0C …………………………………… 10 dakika

+ 4 0C ………………………………….. ∞

49

vanA gen bölgelerinin çoğaltılması (Dutka-Malen vd. 2005)




dNTP (10 mM)** 0.2 µl 0,04 mM





DNA 2.5 µl

Toplam 50µl


PZR koşulları

94 0C …………………………………… 5 dakika

94 0C …………………………………… 1 dakika

54 0C ……………….………………...... 1 dakika 30 döngü

72 0C …………………………………... 1 dakika

72 0C …………………………………… 10 dakika

+ 4 0C ………………………………….. ∞

50

vanB gen bölgelerinin çoğaltılması (Mcgregor ve Young 2000)




dNTP (10 mM)** 0.2 µl 0,04 mM





DNA 3µl

Toplam 50µl


PZR koşulları

94 0C …………………………………… 5 dakika

94 0C …………………………………… 1 dakika

53 0C ……………….………………...... 1 dakika 30 döngü

72 0C …………………………………... 2 dakika

72 0C …………………………………… 10 dakika

+ 4 0C ………………………………….. ∞

51

ant6 gen bölgesinin çoğaltılması (Kobayashi vd. 2001)




dNTP (10 mM)** 0.2 µl 0,04 mM





DNA 3 µl

Toplam 50µl


PZR koşulları

95 0C …………………………………… 10 dakika

94 0C …………………………………… 30 saniye

54 0C ……………….………………...... 30 saniye 30 döngü

72 0C …………………………………... 30 saniye

72 0C …………………………………… 10 dakika

+ 4 0C ………………………………….. ∞

52

cat gen bölgesinin çoğaltılması (Aarestrup vd. 2000)




dNTP (2 mM)** 1 µl 0,04 mM





DNA 3 µl

Toplam 50µl


PZR koşulları

94 0C …………………………………… 5 dakika

94 0C …………………………………… 1 dakika

50 0C ……………….………………...... 1 dakika 30 döngü

72 0C …………………………………... 2.5 dakika

72 0C …………………………………… 7 dakika

+ 4 0C ………………………………….. ∞

53

ermB gen bölgesinin çoğaltılması (Aarestrup vd. 2000)




dNTP (2 mM)** 1 µl 0,04 mM





DNA 2 µl

Toplam 50µl


PZR koşulları

93 0C …………………………………… 5 dakika

93 0C …………………………………… 1 dakika

56 0C ……………….………………...... 1 dakika 35 döngü

72 0C …………………………………... 1 dakika

72 0C …………………………………… 10 dakika

+ 4 0C ………………………………….. ∞

54

3.2.6 DNA dizi analizi

Antibiyotik dirençliliğini kodlayan gen bölgelerine özel olarak tasarlanan primerler

kullanılarak PZR gerçekleştirilmiştir. Elde edilen PZR ürünleri saflaştırılmış ve dizi

analizi REFGEN (ODTÜ Teknokent, Ankara) firması tarafından yapılmıştır. Sonuçlar

PSI-BLAST programı kullanılarak değerlendirilmiştir.

3.2.7 Konjugasyon denemeleri

Konjugal verici ve alıcı suşlar antibiyotik ilaveli TSB ortamlarında 37 ºC’de 18 saat

geliştirilmiş ve aynı ortamlarda 10–1 düzeyinde dilüsyonları hazırlanmıştır. Bu

dilüsyonlardan alınan 2 mL verici ve 3 mL alıcı suş kültürleri karıştırıldıktan sonra,

filtrasyon işlemi ile steril membran filtreler (0.45 µm, Sartorius, Germany) üzerinde

toplanmıştır. Alıcı ve verici suş kültür karışımlarını içeren filtreler TSA plaklarına

yerleştirilerek, 37 ºC’de 18 saat inkübe edilmiştir. Bu süre bitiminde TSA plaklarından

alınan filtreler, 1 mL steril fizyolojik su içerisinde çözülmüş ve 10–8 düzeyine kadar seri

dilüsyonları hazırlanmıştır. Her bir dilüsyondan alıcı ya da verici suşun duyarlı olduğu

her iki antibiyotiği içeren agar plaklarına sürme ekim yapılarak 37 ºC’de 18 saat

inkübasyona bırakılmıştır (Lampkowska vd. 2008).

55

4. BULGULAR VE TARTIŞMA

4.1 Enterococcus faecium Suşlarının Antibiyotik Duyarlılık Düzeylerinin Tanımlanması

Araştırmada kullanılan Akdeniz Üniversitesi Hastanesi Mikrobiyoloji Laboratuvarı

kültür koleksiyonundan sağlanan 64 E. faecium izolatının 25’ini idrar, 22’sini rektal,

12’sini kan, 3’ünü pü ve geri kalan 2 tanesini bos ve katater kültürlerinden elde edilen

suşlar oluşturmaktadır. Enterokokların her tür nozokomiyal enfeksiyonlardan, özellikle

üriner sistem enfeksiyonlarından izolasyon sıklığı gittikçe artmaktadır. Ülkemizde

yapılan araştırmaların çoğunda enterokoklar en sık idrardan izole edilmişlerdir (Gür

1997, Esen vd. 2001). Çalışmamızda da diğer çalışmalarla uyumlu olarak E. faecium

izolatlarına en sık idrarda rastlanmıştır.

E. faecium suşlarının antibiyotik duyarlılık profillerinin belirlenmesinde bölüm 3.2.2’de

anlatıldığı gibi Phonex sistemi ve disk difüzyon yöntemi kullanılmıştır. Phonex

antibiyogram sisteminde çalışılan antibiyotik disklerinin MİK konsantrasyonları

sonuçlarına göre direnç özellikleri incelenecek 10 farklı antibiyotik disk difüzyon

yöntemi ile de doğrulanmıştır (Şekil 4.1). Çalışmada kullanın suşların antibiyotik

duyarlılık sonuçları çizelge 4.1’de verilmiştir.

Şekil 4.1 Enterococcus faecium suşlarının disk difüzyon testi

56

Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve MİK testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları

Bakteri Adı= E. faecium (1) Bakteri Adı= E. faecium (2)

ANTİBİYOTİK DİSKLERİ R S I

ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X - R>16 Vankomisin X - R>16

Ampicilin X - R>8 Ampicilin X - R>8

Eritromisin X - R>4 Eritromisin X - R>4

Rifampin X - Rifampin X -

Kanamicin X - Kanamicin X -

Kloramfenikol X 20mm Kloramfenikol X 24mm

Gentamicin SYN X 24mm S<=500 Gentamicin SYN X - R>500

Streptomicin SYN X 4mm R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000

Tetrasiklin X 28mm S<=0.5 Tetrasiklin X 24mm S<=0.5

Teikoplanin X 5mm R>16 Teikoplanin X - R>16


ANTİBİYOTİK DİSKLERİ

R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX



Eritromisin X 10mm R>4 Eritromisin X - R>4

Rifampin X - Rifampin X 13mm



Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X - R>500

Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000

Tetrasiklin X - R>8 Tetrasiklin X 27mm S<=0.5

Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X R>16

*Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. MİK=Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli

57

Çizelge 4.1 E. faecium suşlarının disk difüzyon ve MİK testlerine göre antibiyotik duyarlılıkları (devam)



ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX



Eritromisin X - R>4 Eritromisin X 17mm I 4




Gentamicin SYN X - R>500 Gentamicin SYN X 23mm S<=500

Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X 23mm S<1000

Tetrasiklin X 10mm R>8 Tetrasiklin X 30mm S<=0.5

Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X - R>16



R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X 14mm R>16 Vankomisin X - R>16










Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. MİK=Minimal İnhibisyon Konsantırasyonu R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli

58




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX




Rifampin X 12mm Rifampin X 16mm









R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX



Eritromisin X 16mm I 4 Eritromisin X - R>4


Kanamicin X 10mm Kanamicin X -



Streptomicin SYN X 26mm S<=1000 StreptomicinSYN X - R>1000




59




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X 13mm R>16 Vankomisin X 14mm R>16



Rifampin X 17mm Rifampin X -



Gentamicin SYN X 22mm S<=500 Gentamicin SYN X 24mm S<=500

Streptomicin SYN X 20mm S<=1000 StreptomicinSYN X - R>1000





R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X - R>16 Vankomisin X 10mm R>16








Tetrasiklin X 18mm R>8 Tetrasiklin X 27mm S 2



60




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X - R>16 Vankomisin X 23mm S<=1









Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X 20mm S<=1



R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X - R>16 Vankomisin X 15mm I 8







Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X 6mm R>1000




61




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X 10mm R>16 Vankomisin X 12mm R>16







Streptomicin SYN X 6mm R>1000 StreptomicinSYN X - R>1000





R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X 22mm S<=1 Vankomisin X 22mm S<=1









Teikoplanin X 23mm S<=1 Teikoplanin X 20mm S<=1


62




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X 24mm S<=1 Vankomisin X - R>16




Kanamicin X - Kanamicin X 12mm





Teikoplanin X 22mm S<=1 Teikoplanin X - R>16



R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X 11mm R>16 Vankomisin X 23mm S 2











63




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX













R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX









Tetrasiklin X 29mm S<=0.5 Tetrasiklin X 9mm R>4

Teikoplanin X 13mm I 16 Teikoplanin X - R>16


64




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX



Eritromisin X - R>4 Eritromisin I 20mm I 4










R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X 24mm S<=1 Vankomisin X 14mm R>16







Streptomicin SYN X - R>1000 StreptomicinSYN X 22mm S<=1000


Teikoplanin X 21mm S<=1 Teikoplanin X 8mm R>16


65




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX

Vankomisin X 21mm S 2 Vankomisin X 21mm S 2









Teikoplanin X 22mm S<=1 Teikoplanin X 20mm S<=1



R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX












66




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX










Teikoplanin X 6mm R>16 Teikoplanin X 16mm R>16



R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX












67




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX













R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX



Eritromisin X - R>4 Eritromisin X 15mm I 2









68




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX













R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX









Tetrasiklin X - R>4 Tetrasiklin X 10mm R>8



69




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX






Kloramfenikol X 16 mm Kloramfenikol X 15mm

Gentamicin SYN X 26 mm S<=500 Gentamicin SYN X - R>500


Tetrasiklin X - R>8 Tetrasiklin X 36mm S<=0.5




R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX






Kloramfenikol X 16 mm Kloramfenikol X 15mm



Tetrasiklin X 9mm R>4 Tetrasiklin X 9mm R>8



70




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX







Gentamicin SYN X 26 mm S<=500 Gentamicin SYN X - R>500



Teikoplanin X - R>16 Teikoplanin X 11mm I 16



R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX










Teikoplanin X 6mm R>16 Teikoplanin X 8mm R>16


71




ZON ÇAPI

MİK PHONEX


ZON ÇAPI

MİK PHONEX













R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX


R S I ZON ÇAPI

MİK PHONEX












72

Çizelge 4.2 Standart E. faecalis ATCC29212 suşunun disk difüzyon ve MİK testlerine göre antibiyotik duyarlılığı

Bakteri Adı= E. faecalis ATCC 29212 (Kontrol)

ANTİBİYOTİK DİSKLERİ R S I ZON ÇAPI MİK PHONEX

Vankomisin X 18mm S 2

Ampicilin X 26mm S<=2

Eritromisin X 17mm I 2

Rifampin X 12mm

Kanamicin X -

Kloramfenikol X 18mm

Gentamicin SYN X 17mm S<=500

Streptomicin SYN X 15mm S<=1000

Tetrasiklin X 17mm I 8

Teikoplanin X 17mm S<=1


64 adet E. faecium suşunun tamamı ampsiline, kanamisine, eritromisine ve rifampisine;

52 tanesi vankomisine, 56 tanesi yüksek düzey streptomisine, 43 tanesi yüksek düzey

gentamisine, 22 tanesi kloramfenikole, 14 tanesi tetrasikline ve 51 tanesi teikoplanine

dirençli bulunmuştur (Çizelge 4.3).

73

Çizelge 4.3 E. faecium suşlarının antibiyotik gruplarına karşı direnç oranları

ANTİBİYOTİK GRUBU ANTİBİYOTİK ADI

DİSK İÇERİĞİ DUYARLILIK (%)

GLİKOPEPTİDLER S I R

Vankomisin 30 µg 18.75 1.56 79.6

Teicoplanin 30 µg 20.3 3.1 76.5

Grup Ortalaması 19.5 2.33 78.05

MAKROLİDLER

Eritromisin 15 µg - 6.25 93.75

Kloramfenikol(Fenikoler)

30 µg - 34.3 -

Rifampin (Ansamisinler) 5 µg - 1.56 98.4

Grup Ortalaması - 14.03 64.05

TETRASİKLİNLER

Tetrasiklin 30 µg 78.1 - 21.8

Grup Ortalaması 78.1 - 21.8

AMİNOGLİKOZİDLER

Gentamisin 120 µg 32.8 - 67.18

Kanamisin 30 µg - 1.56 98.4

Streptomisin 300 µg 12.5 - 87.5

Grup ortalaması 15.1 1.56 84.36

β - LAKTAMLAR

Ampicilin 10 µg - - 100

Grup ortalaması - - 100

Sadece disk difüzyon testi yapılmıştır. R=Dirençli, S=Duyarlı, I=Orta Dirençli

Suşlarının toplam antibiyotik dirençlilik yüzdeleri; ampsiline % 100, streptomisine %

87.5, kanamisine % 100, gentamisine % 67.18, kloramfenikole % 32.81, tetrasikline %

21.87, rifampisine % 100, vankomisine % 96.87, eritromisine % 100 ve teikoplanine %

79.68 olarak belirlenmiştir (Şekil 4.2).

74

Şekil 4.2 Enterococcus faecium suşlarının antibiyotik dirençlilik yüzdeleri

Çalışmada kullanılan 3, 5, 24, 57, 64, 74, 77 ve 79 numaralı suşların tamamı test edilen

tüm antibiyotiklere dirençli bulunmuştur. Bu suşlar yüksek düzeyde aminoglikozit, β-

laktam, glikopeptit, makrolit ve tetrasiklin direnci içermektedir. Çalışmada elde edilen

sonuçlara göre glikopeptit antibiyotiklere karşı oluşan direnç yüzdesi % 79.68’dir.

Sadece 29 numaralı suş vankomisine orta düzeyde direnç göstermiştir. Klinik

izolatlarda düşük düzey vankomisin direnci önemlidir. Ancak bu direncin saptanması

disk difüzyon gibi klasik metodlarla gözden kaçırılabilir. Bu nedenle direnç

fenotiplerinin araştırılmasında PZR etkili bir yöntemdir (Dutka-Malen vd. 1995). Son

yıllarda yapılan çalışmalar vankomisin dirençli E. faecium suşlarının, E. faecalis’e göre

çok daha yüksek oranlarda olduğunu göstermiştir (Rudy vd. 2005). Türkiye’de 2001

yılına kadar yapılan çalışmalarda sadece 3 VRE vakasına rastlanmıştır (Altay 1996,

Şekercioğlu vd. 1998, Vural vd. 1998). Ancak son yıllarda yapılan çalışmalar direncin

75

ne derece tehlikeli boyutlara ulaştığının göstergesidir. Aygün vd. (2008) yapmış

oldukları çalışmalarda 467 hastanın % 1.9’unda VRE kolonizasyonu belirlenmiş ve

bunların tamamının vankomisin ve teikoplanine dirençli E. faecium olduğu

tanımlanmıştır. Ergani- Özcan vd. (2008) pediatri bölümünde yatan hastalarla yaptığı

bir yıllık sürveyans taraması sonucunda, 586 hastadan sadece 10 tanesinde VRE suşu

saptamıştır. Aynı yılda Sayıner (2008) 250 hastada aldığı rektal sürüntü örneğinde VRE

oranını % 15 olarak bildirmiştir. Yiş vd. (2010) 123 perirektal sürüntü örneği ile yaptığı

çalışmada VRE kolonizasyon oranını % 14.6 olarak belirlemiştir. Brezilya’da

D’azevedo ve Furtado (2008) tarafından yapılan bir çalışmada 81 hastanın fekal

sürveyans kültürlerinde, tamamı vankomisin ve teikoplanine dirençli, 37 VRE suşu

izole edilmiş ve bunların 20 tanesi (% 54,05) E. faecium olarak tanımlanmıştır. Bu

oranlarla kıyaslandığında çalışmamızda elde edilen veriler oldukça yüksek olup, elde

ettiğimiz bulgular vankomisin dirençli enterokok sayısının ülkemizde artığını

göstermektedir. Çalışmada kullandığınız 32 numaralı suş, hem vankomisine ve hem de

yüksek düzey gentamisin direncine sahiptir. Vankomisine dirençli suşlar genellikle

diğer antibiyotiklere de dirençlilik içermektedir (French 1998, Gordon vd. 1998).

Yüksek düzey aminoglikozit direncinin giderek yaygınlaşması, enterokokların neden

olduğu, aminoglikozitlerin sinerjik etkisi ile tedavi edilen enfeksiyonlar için önemli bir

sorundur. Çünkü böyle bir direncin varlığında penisilin ve aminoglikozit

kombinasyonunun etkisi ortadan kalkar. Bu nedenle enterokoklar ile oluşan ağır

enfeksiyonlarda yüksek düzey aminoglikozit direncinin belirlenmesi gerekmektedir

(Robert ve Moellering 2000). Çalışmamızda aminoglikozit antibiyotiklerden yüksek

seviyede gentamisin direnci (HLGR) içeren suşlar % 67.18, yüksek seviyede

streptomisin direnci (HLSR) içeren suşlar ise % 87.5 olarak bulunmuştur. Hem HLGR

hem de HLSR gösteren suşların yüzdesi % 62.5 oranındadır. Çalışmamızda kanamisine

yüksek düzey direnç oranı % 98.4 olarak bulunmuştur. Sadece 46 numaralı suş orta

düzeyde kanamisin direnci göstermiştir. Karadenizli vd. (2002) enterokok türlerine göre

yüksek düzey aminoglikozit düzeyleri üzerine yaptığı çalışmada, E. faecium suşları için

direnci; HLGR % 25.6 ve HLSR % 11.6 olarak belirlenmiştir. Mert-Dinç vd. (2009)’

nın yaptığı çalışmada aynı antibiyotiklere direnç oranlarını E. faecium suşunda sırasıyla

% 52 ve % 61.5 bulunmuştur. Aral vd. (2011) klinik kökenli enterokoklarla yaptıkları

76

çalışmada, izole ettikleri 96 E. faecium suşunun % 60’ında HLGR, % 65’inde HLSR

direnci saptamıştır. Kobayashi vd. (2001) yaptıkları çalışmada E. faecium için HLGR’

yi % 43 olarak saptamıştır. Mounir vd. (2011) ise HLGR oranını % 29.5, HLSR oranını

ise % 25 olarak belirlemiştir. Çalışmamızda elde edilen yüksek düzey aminoglikozit

direnç oranları, bu konuda yapılan çalışma bulgularıyla uyumlu bulunmuştur.

Makrolit grubu antibiyotiklere karşı E. faecium için belirlenen direnç oranları oldukça

yüksektir. Aarestrup vd. (2000) yaptıkları çalışmada E. faecium klinik örneklerde

eritromisin direnç oranını % 20, kloramfenikol direnç oranını % 12, tetrasiklin direnç

oranını ise % 12 olarak bulmuşlardır. Trieu-Cuot vd. (1993) klinik E. faecium suşlarının

yaklaşık % 50’sini kloramfenikole dirençli bulmuştur.

Çalışmamızda direnç yüzdeleri eritromisin ve rifampisin için % 100, kloramfenikol için

% 32.8’dir. Çalışmadaki 5 numaralı suş dışında tüm suşların kloramfenikole orta

düzeyde direnç göstermeleri dikkat çekicidir. Araştırmamızda, test edilen E. faecium

suşlarında tetrasiklin antibiyotiklerine direnç oranı % 21.87 bulunmuştur. Klinik

enfeksiyonlardan, gıda maddelerinden ve hayvansal gıdalardan izole edilen E. faecium

suşları arasında söz konusu dirençlilikler yaygın bir şekilde bulunmaktadır (Aarestrup

vd. 2000).

Beta laktamaz üreten enterokoklar ilk olarak 1983 yılında tespit edilmiştir. Bazı

araştırıcılar, penisiline dirençli izolatların hiçbirinin β-laktamaz üreticisi olmadığını

saptamıştır (Murray ve Mederski –Samaroj 1983, Aarestrup vd. 2000). Bu durum

enterokoklarda penisilin dirençliliğin farklı bir mekanizma ile sağlandığını

kanıtlamaktadır. Ülkemizde yapılan çalışmalarda beta- laktam antibiyotiklere dirençli

enterokokların giderek arttığına dikkat çekilerek, bu artışta penisilinlere dirençli, beta-

laktamaz üretmeyen suşların rol aldığı ileri sürülmüştür (Gür 1997). Çalışmamızda grup

temsilcisi olan ampisilin incelenmiş ve tüm suşlar ampisiline dirençli bulunmuştur.

77

4.2 Enterococcus faecium Suşlarının Plazmid Profillerinin Tanımlanması

64 adet E. faecium suşunun ve kontrol olarak kullanılan E. faecalis ATCC 29212

suşunun plazmid içerikleri alkali denatürasyon yöntemi kullanılarak araştırılmıştır

(Anderson ve McKay 1983). Plazmid izolasyonu ve agaroz jel elektroforezi çalışmaları

sonucu incelenen suşlarda; sayıları 1 ile 10 arasında değişen farklı moleküler

büyüklüklere sahip plazmid içerikleri belirlenmiştir. Saptanan plazmidlerin en küçüğü

2.2 kb en büyüğü ise 35.8 kb moleküler büyüklükte bulunmuştur (Şekil 4.3 ).

Enterokok suşları ile yürütülen diğer çalışmalarda; 2-8 adet arasında değişen sayıda

plazmid içerdikleri saptanmıştır. Bu plazmidlerin büyüklükleri ise 4-111 kb arasında

bulunmuştur. Son vd. (1999) vankomisin dirençli 19 E. faecium suşuna ait plazmid

profillerini ve antibiyotik dirençliliklerini incelemiş ve bu suşların 15’inde büyüklükleri

1.5-34 kb arasında değişen 5 ile 8 adet arasında plazmid tanımlamıştır. Rosvoll vd.

(2010), 93 E. faecium izolatının 88’inde 1-7 adet plazmidin olduğunu belirlemiştir.

Çöleri vd. (2004), klinik enterokok izolatlarında büyüklükleri 2.08 ile 56.15 kb arasında

olan ve sayıları 1 ile 11 adet arasında değişen plazmid içeriği saptamıştır. Ayrıca bu

araştırmada enterokoklarda plazmid üzerinde kodlanan bir antibiyotik direnci tespit

edilmiştir.

Bu çalışmada 36 ve 38, 50 ve 52, 77 ve 79, 80, 84 ve 90 numaralı suşlarının aynı

plazmid içeriğine sahip oldukları belirlenmiştir. Diğer tüm suşlarda plazmid içerikleri,

sayı ve büyüklük bakımından değişim göstermiştir. Aynı plazmid içeriğine sahip

suşların farklı hastalardan izole edilerek tanımlanması, söz konusu izolatların klonal

yayılımına işaret etmektedir. Özellikle çoklu antibiyotik direncine sahip suşların klinik

yayılımının araştırılması açısından bu veriler önem taşımaktadır.

78

Şekil 4.3 Enterococcus faecium suşlarının plazmid içerikleri. M; Süper Sarmal ccc DNA Marker,

1 E. faecium (kb) 35.3, 27.2, 16.5, 14.8, 12.3, 10.8, 7.9, 5.5, 3.5, 2.8

2 E. faecium (kb) 31.5, 23.6, 16.8, 2.8

3 E. faecium (kb) 32.9, 23.2, 17.0, 12.5, 3.4

4 E. faecium (kb) 35.8, 25.9, 17.1, 12.4, 7.7, 6.4, 2.2

5 E. faecium (kb) 29.5, 16.8, 11.5, 6.9, 5.4, 3.6, 2.3

6 E. faecium (kb) 35.0, 21.9, 17.2, 12.9, 7.3, 6.1, 4.4, 3.4, 2.2

8 E. faecium (kb) 29.6, 20.1, 15.8, 13.1, 9.7, 3.7, 2.2

11 E. faecium (kb) 31.5, 28.6, 17.7, 13.1, 10.2, 5.9, 3.6, 2.9

12 E. faecium (kb) 33.8, 27.7, 17.9, 13.5, 10.4, 5.2, 4.3, 2.2

13 E. faecium (kb) 29.7, 20.1, 16.5, 12.7, 7.8, 4.4, 3.8, 2.2

15 E. faecium (kb) 21.1, 18.4, 12.7, 8.8, 6.1, 4.8, 4.1, 2.4

17 E. faecium (kb) 26.8, 19.3, 18.0, 13.5, 3.4, 2.3

19 E. faecium (kb) 4.6

21 E. faecium (kb) 25.7, 22.4, 18.0, 16.2, 13.7, 7.1, 6.2, 3.9

24 E. faecium (kb) 23.9, 17.2, 13.5, 3.8

25 E. faecium (kb) 24.6, 17.5, 13.3, 8.3, 5.7, 4.8, 2.4

26 E. faecium (kb) 24.4, 17.7, 13.1, 7.9, 4.7, 2.4

27 E. faecium (kb) 21.2, 18.1

28 E. faecium (kb) 21.2, 19.6, 14.1, 4.2, 2.5

29 E. faecium (kb) 24.6, 17.5, 15.2, 4.1

30 E. faecium (kb) 24.8, 18.9, 14.5, 7.8, 5.6, 4.8, 3.2, 2.5

M Marker (bç) 16210, 14174, 12138, 10102, 8066, 7045, 6030, 5012, 3990, 2972, 2067

Supercolied ccc DNA marker (Sigma Chem. Co., USA, D 5292)

1 2 3 4 5 6 8 11 12 13 15 17 19 21 24 25 26 27 28 29 30 M

79

Şekil 4.3 Enterococcus faecium suşlarının plazmid içerikleri (devam). M; Süper sarmal ccc DNA Marker

31 E. faecium (kb) 20.2, 18.9, 17.1, 10.5, 7.6, 4.8, 3.7, 2.8

32 E. faecium (kb) 34.5, 23.2, 21.2, 15.8, 5.3, 3.4

33 E. faecium (kb) 21.7,19.6, 16.7, 14.5, 9.6, 6.8, 3.4

34 E. faecium (kb) 20.8, 19.1, 16.4, 8.7, 6.4, 4.6

35 E. faecium (kb) 22.7, 20.6, 18.7, 16.3, 11.5, 6.9, 5.4, 3.2, 2.2

36 E. faecium (kb) 22.5, 19.4, 17.9, 16.2, 13.4, 7.0, 6.3, 3.1

37 E. faecium (kb) 21.9, 18.6, 15.8, 5.8, 2.9

38 E. faecium (kb) 22.5, 19.4, 17.9, 16.2, 13.4, 7.0, 6.3, 3.1

39 E. faecium (kb) 18.8, 15.3, 2.9

41 E. faecium (kb) 21.3, 18.9, 14.9, 11.7, 6.1, 4.5, 3.7, 2.8

42 E. faecium (kb) 18.7, 14.8, 7.9, 5.9, 2.7

43 E. faecium (kb) 18.6, 14.7, 10.4, 6.1, 2.7

46 E. faecium (kb) 20.5, 17.4, 14.3, 5.8, 3.6, 2.6

48 E. faecium (kb) 20.6, 18.7, 17.5, 14.3

49 E. faecium (kb) 21.2, 17.9, 8.9, 5.0, 3.2

50 E. faecium (kb) 20.0, 16.8, 14.4, 2.6

52 E. faecium (kb) 20.0, 16.8, 14.4, 2.6

55 E. faecium (kb) 18.6, 17.1, 13.4, 7.7, 5.6, 3.5,2.4

56 E. faecium (kb) 16.3, 14.4, 9.1, 6.2, 2.4

57 E. faecium (kb) 13.7, 8.7, 5.3, 3.0, 2.2

59 E. faecium (kb) 13.8, 8.2, 5.5, 3.4

M Marker (bç) 16210, 14174, 12138, 10102, 8066, 7045, 6030, 5012, 3990, 2972, 2067


31 32 33 34 35 36 37 38 39 41 42 43 46 48 49 50 52 55 56 57 59 M

80

Şekil 4.3 Enterococcus faecium suşlarının plazmid içerikleri (devam). M; Süper sarmal ccc DNA Marker

M Marker (bç) 16210, 14174, 12138, 10102, 8066, 7045, 6030, 5012, 3990, 2972, 2067

63 E. faecium (kb) 21.4, 17.5, 15.7, 14.2, 11.3, 9.7, 6.5, 5.3

64 E. faecium (kb) 20.7, 18.3, 15.6, 11.4, 6.5, 5.3

65 E. faecium (kb) 21.1, 15.4, 10.0, 6.9, 5.3

67 E. faecium (kb) 21.2, 19.0, 14.8, 10.4, 9.6, 6.3

68 E. faecium (kb) 23.2, 17.6, 15.0, 11.4, 7.2, 6.3, 5.2

69 E. faecium (kb) 17.6, 14.9,12.1

70 E. faecium (kb) 24.5, 21.2, 17.6, 14.9,12.3, 5.1

71 E. faecium (kb) 21.2, 16.8, 14.8, 10.4, 4.9, 3.3

74 E. faecium (kb) 28.0, 21.2, 16.8, 14.8, 11.4, 8.2, 4.9, 3.3

75 E. faecium (kb) 35.8, 28.0, 21.2, 18.5, 14.7, 11.4, 4.2, 3.3,2.3

76 E. faecium (kb) 33.1, 27.1, 21.2, 4.2, 3.3,2.3

77 E. faecium (kb) 28.0, 26.5, 21.2, 16.8, 9.6, 5.5, 2.5

79 E. faecium (kb) 28.0, 26.1, 22.5, 16.6, 9.6, 5.5, 2.5

80 E. faecium (kb) 18.5, 13.4, 12.1, 5.8

81 E. faecium (kb) 28.0, 26.1, 19.0, 17.3, 13.7, 9.7, 6.4, 4.8

84 E. faecium (kb) 18.5, 13.4, 12.1, 5.8

87 E. faecium (kb) 24.5, 15.5, 13.4, 9.7, 7.2, 5.8

89 E. faecium (kb) 24.3,15.9, 13.5, 9.6, 7.8,4.7

90 E. faecium (kb) 18.5, 13.4, 12.1, 5.8

94 E. faecium (kb) 24.2, 15.8, 13.1, 5.7, 4.7

95 E. faecium (kb) 15.6, 13.1, 5.8


M 63 64 65 67 68 69 70 71 74 75 76 77 79 80 81 84 87 89 90 94 95

81

Şekil 4.3 Enterococcus faecium suşlarının plazmid içerikleri (devam). M; Süper sarmal ccc DNA Marker K; Standart suş E. faecalis ATCC 29212

M Marker (bç) 16210, 14174, 12138, 10102, 8066, 7045, 6030, 5012, 3990, 2972, 2067

K E. faecalis

ATCC29212(kb)

35.8, 30.4, 28.0

60 E. faecium (kb) 33.1, 30.4, 26.1, 12.6, 10.4, 9.6, 6.3


M K 60

82

4.3 Antibiyotik Direnç Genlerinin PZR ile Araştırılması

64 adet E. faecium suşunda, çoklu antibiyotik dirençlilik genlerinin varlığı, antibiyotik

dirençlilik genine özgü tasarlanan primerlerle gerçekleştirilen PZR çalışmaları ile

araştırılmıştır (Çizelge 3.3). Elde edilen PZR ürünleri ile dizi analizi gerçekleştirilmiş,

nükleotit dizileri NCBI Blast programı kullanılanarak karşılaştırılmıştır

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/, 2012).

4.3.1 vanA ve vanB gen bölgeleri

Vankomisin direnç primerleri ile gerçekleştirilen PZR sonucunda vanA gen bölgesine

spesifik primerlerle 732 bç’lik gen bölgesi çoğaltılmıştır. Yüksek düzeyde vankomisine

direnci gösteren suşların hepsinin van A tipi direnç içerdiği belirlenmiştir. Fenotiple

uyumlu olarak tüm suşlar teikoplanine duyarlı bulunmuştur. Negatif kontrol olarak E.

faecalis ATCC 29212 kullanılmıştır. PZR ürünlerinin dizi analizleri sonucunda

çoğaltılan bölgelerin vankomisin direnç gen bölgesi olduğu doğrulanmıştır (Şekil 4.4).

Van A direnç fenotipine neden olan vanA geni kromozom veya plazmidler üzerinde

bulunabilir (Fisher ve Phillips 2009). Kazanılmış antibiyotik direnci genellikle

plazmidler üzerinde lokalize olur ve transpozonlar aracılığı ile aktarılır (Hanrahan vd.

2000) Çalışmamızda elde edilen bulgulara göre; 29 numaralı suş dışında tüm suşlarda

vanA genine kromozom üzerinde; 31, 67, 76 numaralı suşlar dışında geriye kalan 48

suşta hem kromozom hem de plazmid üzerinde rastlanmıştır. 29 numaralı suşun

vankomisine orta düzey dirençli olması Van B direncine işaret etmiştir.

Yapılan çalışmalarda glikopeptit dirençli E. faecium izolatlarının süratle arttığı

belirlenmiştir. Özellikle hastane enfeksiyonu olarak oranının artması ve stafilokoklar

gibi diğer türlere konjugasyon yoluyla aktarılabiliyor olması, vankomisin direncinin

gelecekte de önemli bir risk faktörü olduğunun göstergesidir. Vankomisin direncinin

öneminin artmasındaki nedenlerden biri de E. faecium’da yüksek derecede

indüklenebilir glikopeptit direnci gösteren Van A fenotipi içerikli Tn1546

transpozonunun tanımlanmasıdır (Leclercq vd. 1988).

83

Şekil 4.4 vanA gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

Şekil 4.4 vanA gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

Şekil 4.4 vanA gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

M 1 2 3 4 5 6 8 11 12 13 15 17 19 21 24 25 26 28 K N M

732 bç

M 30 31 35 36 38 39 41 42 43 46 49 55 57 59 60 63 64 65 67 K N M

M 68 70 74 75 76 77 79 80 81 84 87 89 90 94 95 K N M

732 bç

732 bç

84

Fenotipik olarak vankomisine orta düzeyde direnç gösterip, teikoplanine duyarlı olan 29

numaralı suş Van B tipi direnç açısından incelenmiştir. Vankomisin direnç primerleri ile

gerçekleştirilen PZR sonucunda vanB gen bölgesine spesifik primerlerle 635 bç’lik

bölge çoğaltılmış ve sonuçlar DNA dizi analizi verileri ile doğrulanmıştır (Şekil 4.5).

Vankomisin dirençlilik determinantları kromozom üzerinde bulunmakla birlikte

konjugasyon yolu ile aktarılabilir özelliktedir (Hanrahan vd. 2000). Tn1547, Tn1549 ve

Tn5382 transpozonları vanB operonunu içerir. Türkiye’den bildirilen ilk Van B tipi

direnç 2012 yılında Ankara Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi’den bildirilmiştir

(Coşkun vd. 2012). Çalışmamızda tanımlanan idrar izolatı 29 numaralı suş, vanB direnç

geni içeren ikinci suş olması açısından önemlidir. Ayrıca Van B tipi direncin

saptanması, ülkemizde de glikopeptit direncinin geliştiğini göstermektedir. Ülkemizde

yaygın olmamakla birlikte Amerika ve diğer gelişmiş ülkelerde Van B tipi direnç

önemli hastane enfeksiyonu nedenleri arasındadır (Mcgregor ve Young 2000).

Şekil 4.5 vanB gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

635 bç

M 29 K N M

85

4.3.2 tetM ve tetL gen bölgeleri

Tetrasiklin direnci enterokoklarda konjugasyon yolu ile kazanılan direncin en tipik

örneğidir (Murray 1998). Enterokoklarda tetrasiklin grubu antibiyotiklere dirençten

sorumlu olan çok sayıda gen tanımlanmıştır. Bunlardan tetM geni Tn916 transpozonu

üzerinde taşınır ve en yaygın olarak bulunan direnç genidir (Aarestrup vd. 2000, Huys

vd. 2004). tetM, tetO, tetK ve tetS genleri tetrasiklinlerin ribozomlar üzerindeki etkisini

inhibe eder. tetL geni ise enterokokal bir plazmid üzerinde taşınır.

Tetrasiklin direnci enterokoklar arasında oldukça yaygındır. En sık bulunan gen tetM

genidir. Aarestrup vd. (2000) tarafından klinik, gıda ve hayvan kökenli örneklerden elde

edilen suşlarla yapılan çalışmada, 81 E. faecium izolatının 77’sinde (% 95) tetM geni,

% 16’sında tetL geni saptanmıştır. tetO ve tetK direnç genlerine ise rastlanmamıştır.

tetM geninin plazmid aracılı yatay gen transferi yolu ile aktarımının tanımlanması, bu

genin klinik önemini arttırmıştır (Poeta vd. 2005).

tetM ve tetL gen bölgelerine özgü primerler kullanılarak yürütülen PZR sonucunda,

tetrasikline dirençli 14 E. faecium suşunun kromozomu üzerinde tetM direnç geni

belirlenmiş ve sonuçlar DNA dizi analizi verileri ile doğrulanmıştır (Şekil 4.6). 74

numaralı suşta ise hem tetM hem de tetL direnç geni belirlenmiştir (Şekil 4.7). Her iki

direnç geninin aynı suş üzerinde bulunması litaratür verileri ile uyum göstermektedir

(Aarestrup vd. 2000).

86

Şekil 4.6 tetM gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

Şekil 4.7 tetL gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

M 3 5 24 28 42 43 57 64 71 74 75 77 79 94 K N M

475 bç

657 bç

M 74 K N M

87

4.3.3 ermB gen bölgesi

Makrolidlere direnç genellikle 23S rRNA’nın metilasyonundan sorumlu ermB geni ile

ilişkilidir ve metilasyon sonucu eritromisin ribozomlara bağlanamaz. ermB geni Tn917

transpozonu ile çeşitli plazmidler üzerinde taşınabilmektedir. Ancak kromozomal

lokasyonlu olanları da belirlenmiştir (Jensen vd. 1999, Wax vd. 2008).

Çalışmadaki ermB geni tüm suşlarda kromozomal DNA üzerinde pozitif olarak

bulunmuştur. Çoğaltılan 422 bç’lik gen bölgesi dizi analiz sonuçları, PZR ürününün

ermB gen bölgesine ait olduğunu doğrulamıştır (Şekil 4.8).

Şekil 4.8 ermB gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

M K 1 2 3 4 5 6 7 8 11 12 13 15 17 19 21 24 25 26 N M

422 bç

88

Şekil 4.8 ermB gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

Şekil 4.8 ermB gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

422 bç

M K 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 41 42 43 46 48 49 N M

M K 50 52 55 56 57 59 60 63 64 65 67 68 69 70 71 74 75 76 N M

422 bç

Şekil 4.8 ermB gen bölgesi29212, N; Negatif

4.3.4 rpoB1 ve rpoB2

rpoB1 ve rpoB2 gen bölgelerine spesifik primerlerle gerçekleştiri

sırasıyla 1000 bç ve 1094

ATCC 29212 suşu pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Dizi analizleri sonuçlarıyla PZR

ürünlerinin rpoB1 ve

kullanılan suşların tamamı

numaralı suşlar dışındaki diğer suşlarda

Rifampisinin E. faecium

olacağından tercih edilmez. Antibiyotik baskısının yarattığı mutasyonlar ile gerçekleşen

rifampisin dirençliliği tüm bakteri gruplarında görülmüştür. Klinik kökeni örneklerde

yüksek oranda rifampisin direnç genotipinin bulunması, kontrolsüz antibiyotik

kullanımına işaret etmektedir. Söz konusu mutasyonların bakterilerde oluşum ve

yayılma sıklığı yaln

taşımaktadır. Bu nedenle bu mutasyonların enterokoklarda taranması, patojen ilişkili

suşların tespiti açısından zorunludur (

M K 77

422 bç

89

gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş 29212, N; Negatif kontrol (su)

rpoB2 gen bölgeleri

gen bölgelerine spesifik primerlerle gerçekleştiri

sırasıyla 1000 bç ve 1094 bç’lik gen bölgeleri çoğaltılmıştır (Şekil 4.9


ve rpoB2 gen bölgelerinden çoğaltıldığı doğrulanmıştır. Çalışmada

kullanılan suşların tamamı rpoB2 tipi direnç genini bulundururken, 43, 49, 50, 55,

numaralı suşlar dışındaki diğer suşlarda rpoB1 genine rastlanmıştır.

E. faecium klinik örneklerin tedavisinde kullanımı, dirençli suşlara neden


sin dirençliliği tüm bakteri gruplarında görülmüştür. Klinik kökeni örneklerde



yayılma sıklığı yalnız klinik açıdan değil, bakteri evrimi açısından da önem


suşların tespiti açısından zorunludur (Enne vd. 2004).

79 80 81 84 87 89 90 94 95 N M

. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC

gen bölgelerine spesifik primerlerle gerçekleştirilen PZR sonucunda

l 4.9- 4.10). E. faecalis


gen bölgelerinden çoğaltıldığı doğrulanmıştır. Çalışmada

tipi direnç genini bulundururken, 43, 49, 50, 55, 56

genine rastlanmıştır.

klinik örneklerin tedavisinde kullanımı, dirençli suşlara neden


sin dirençliliği tüm bakteri gruplarında görülmüştür. Klinik kökeni örneklerde



ız klinik açıdan değil, bakteri evrimi açısından da önem


81 84 87 89 90 94 95 N M

90

Şekil 4.9 rpoB1 gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

Şekil 4.9 rpoB1 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)


M K 1 2 3 4 5 6 8 11 12 13 15 17 19 21 24 25 26 27 N M

M K 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 41 42 46 48 52 57 N M

M K 59 60 63 64 65 67 68 69 70 71 74 75 76 77 79 80 81 84 N M

1000 bç

1000 bç

1000 bç

91


Şekil 4.10 rpoB2 gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)


M K 87 89 90 94 95 N M

M K 1 2 3 4 5 6 8 11 12 13 15 17 19 21 24 25 26 27 N M

M K 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 41 42 43 46 48 49 N M

1094 bç

1094 bç

1000 bç

92



4.3.5 cat gen bölgesi

cat gen bölgesine spesifik primerlerle gerçekleştirilen PZR sonucunda 506 bç’lik gen

bölgesi çoğaltılmıştır. Negatif kontrol olarak E. faecalis ATCC 29212 kullanılmıştır

(Şekil 4.11). DNA dizi analizi sonuçları PZR ürünlerinin cat gen bölgesine ait olduğunu

doğrulamıştır.

Çalışmada kullanılan 5 numaralı suş dışında tüm suşlar kloramfenikole orta düzeyde

dirençli bulunmuştur. Klinik enterokok suşlarında kloramfenikol dirençlilik oldukça

yaygın bir özellik olarak belirlenmiştir. Enzimi kodlayan genler enterokoklarda

M K 77 79 80 81 84 87 89 90 94 95 N M

M K 50 52 55 56 57 59 60 63 64 65 67 68 69 70 71 74 75 76 N M

1094 bç

1094 bç

93

konjugatif ve konjugatif olmayan plazmidler ya da kromozom üzerinde bulunabilir.

Streptokokal plazmid pIP501 üzerinde bulunan kloramfenikol asetiltransferaz direnç

geni ile akraba olan gen dizisi, E. faecalis ve E. faecium izolatlarında bulunmuştur bu da

genin yatay gen transferi ile aktarılabildiğini göstermiştir (Aarestrup vd. 2000).

Şekil 4.11 cat gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

Şekil 4.11 cat gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

M K 3 4 5 6 12 13 24 26 57 59 60 N M

M K 64 74 75 76 77 79 80 81 87 90 95 N M

506 bç

506 bç

94

4.3.6 Yüksek düzey aminoglikozit direncinden sorumlu gen bölgeleri

Yüksek düzeyde aminoglikozit direnci (AME); gentamisin, streptomisin ve kanamisin

antibiyotiklerine yüksek düzeydeki direnci ifade eder. Enterokokların düşük düzeyde

doğal olarak aminoglikozitlere dirençli olması tedavide sinerjistik etki oluşturmak

amacıyla hücre duvarı sentezini inhibe eden bir antibiyotikle aminoglikozit grubu

antibiyotiğin kombine kullanımını gerektirir. Ancak plazmid ve transpozonlar aracılığı

ile kazanılmış direnç gelişimi nedeniyle yüksek düzey aminoglikozit direncinin ortaya

çıkışı tedavide aminoglikozitler ile kombine olarak hücre duvarı sentezini inhibe eden

ajanların kullanılması ile elde edilen sinerjistik etkiyi de ortadan kaldırmaktadır

(Shepard ve Gilmore 2002). Bu nedenle AME direncinin belirlenmesi önemlidir.

Çalışmamızda AME grubuna ait genlerin spesifik primerleriyle PZR yapılmıştır. PZR

ürünlerinin dizi analizleri sonucunda çoğaltılan bölgelerin aminoglikozit direnç gen

bölgeleri olduğu saptanmıştır. Yüksek düzey gentamisin direncinden sorumlu aac(6’)-

aph(2’’) gen bölgesinin spesifik primerlerle gerçekleştirilen PZR sonucunda 675 bç’lik

gen bölgesi çoğaltılmıştır. Negatif kontrol olarak E. faecalis ATCC 29212 suşu

kullanılmıştır (Şekil 4.12).

Şekil 4.12 aac(6’)-aph(2’’) gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

M 2 3 4 5 8 12 13 17 24 25 26 27 29 30 32 33 34 35 K N M

675 bç

95

Şekil 4.12 aac(6’)-aph(2’’) gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

Şekil 4.12 aac(6’)-aph(2’’) gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

ant6 gen bölgesine spesifik primerlerle gerçekleştirilen PZR sonucunda 596 bç’lik gen

bölgesi çoğaltılmıştır. Negatif kontrol olarak E. faecalis ATCC 29212 kullanılmıştır

(Şekil 4.13). Bu PZR ürünleri ile yürütülen dizi analizi sonucunda çoğaltılan bölgenin

ant6 gen bölgesi olduğu saptanmıştır.

Enterokoklarda streptomisin direnci diğer aminoglikozit grubu antibiyotiklerden farklı

olarak ribozomal mutasyonlar veya Adenil transferaz sentezlenmesi sonucu

oluşmaktadır.

M 37 39 41 42 43 48 49 50 52 55 56 57 59 60 64 65 67 69 K N M

M 71 74 76 77 79 81 94 K N M

675 bç

675 bç

96

Şekil 4.13 ant6 gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

Şekil 4.13 ant6 gen bölgesi (devam). M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)


M 31 32 33 34 35 36 37 38 39 42 43 46 48 50 52 55 56 57 K N M

M 60 63 64 65 67 69 71 74 75 76 77 79 80 81 84 87 89 90 K N M

M 1 2 3 4 5 8 11 12 13 17 21 24 25 26 27 28 29 30 K N M

596 bç

596 bç

596 bç

97


aphA3 gen bölgesine spesifik primerlerle gerçekleştirilen PZR sonucunda 292 bç’lik

gen bölgesi tüm suşlarda çoğaltılmıştır. Çalışmada pozitif kontrol olarak E. faecalis

ATCC 29212 kullanılmıştır (Şekil 4.14). Dizi analizi sonuçları PZR verilerini

doğrulamıştır.

Şekil 4.14 aphA3 gen bölgesi. M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC 29212, N; Negatif kontrol (su)

M 94 95 K N M

596 bç

M K 1 2 3 4 5 6 8 11 12 13 15 17 19 21 24 25 26 27 N M

292 bç

Şekil 4.14 aphA3 gen bölge29212, N; Negatif kontrol (su)



M K 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 41 42 43 46 48 49 N M

M K 50 52 55 56 57 59 60 63 64 65 67 68 69 70 71 74 75 76 N M

M K 70 79

98




28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 41 42 43 46 48 49 N M

50 52 55 56 57 59 60 63 64 65 67 68 69 70 71 74 75 76 N M

79 80 81 84 87 89 90 94 95

M; Marker, K; Kontrol suş E. faecalis ATCC



28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 41 42 43 46 48 49 N M

50 52 55 56 57 59 60 63 64 65 67 68 69 70 71 74 75 76 N M

94 95 N M

292 bç

292 bç

292 bç

99

4.3.7 blaZ gen bölgesi

blaZ gen bölgesinin araştırılması için S. aureus NCTC 8325 suşu pozitif kontrol olarak

kullanılmıştır. Pozitif kontrol ile belirlenen 831 bç’lik bölge, PZR analizi sonucunda

tüm suşlar fenotipik olarak dirençli olmasına karşın direnç geni E. faecium suşlarında

saptanmamıştır. Enterokok türlerini de içeren Gram- pozitif koklarda plazmid kodlu

blaZ geninin genellikle β-laktamaz üretiminden sorumlu olmasına karşın, çalışmamızla

benzer olarak ulusal ve yurt dışı çalışmalarda blaZ geni tespit edilememiştir.

Stovcik vd. (2008), ampisilin dirençli izolatlarda PZR analizleri sonucunda β-laktamaz

genlerinin saptanamadığını ileri sürmüştür. Aynı zamanda Türkiye’de yapılan

çalışmalarda beta-laktam antibiyotiklere dirençli enterokokların giderek arttığına dikkat

çekilerek, bu artışta penisilinlere dirençli, beta-laktamaz üretmeyen suşların rol aldığı

gösterilmiştir (Gür 1997). Bu sebeple β-laktam direnç mekanizmalarının daha detaylı

olarak incelenmesi gerekmektedir.

4.4 Konjugasyon

Yatay gen transferi, mikrobiyal evrimin en önemli unsurlarından biri olarak kabul

edilmektedir. Yatay gen transferinin doğal mekanizmaları; konjugasyon,

transformasyon ve transdüksiyondur. Konjugasyon; bakteriyel genlerin, verici ve alıcı

hücrelerin fiziksel yüzey teması yolu ile oluşan konjugasyon köprülerinden tek yönlü

aktarımı olarak tanımlanmaktadır. Enterococcus türleri arasındaki genetik değişim

transdüksiyonla olsa da, en yaygın mekanizma konjugasyondur. Bunun yanında

enterokoklarda; kromozomlar veya plazmidler üzerinde bulunan, hareketli genetik

determinantlar olan transpozonlar ile yapılan gen atarımı da gösterilmiştir (Simjee ve

Gill 1997). VRE’lerde yüksek seviyede glikopeptit direnç fenotipi gösteren genler

çoğunlukla yüksek kopya sayısına ve yüksek stabiliteye sahip plazmidler ve plazmidlere

ilave olmuş transpozonlar üzerinde bulunurlar. Plazmid veya kromozomlara ilave olmuş

konjugatif transpozonlar aracılığıyla kazanılmış glikopeptit direnci de yine insersiyon

dizileri içeren transpozonun başka bir konukçu DNA’ya ilave olabilmesi ile kolaylıkla

aktarılabilir. Direnç genini içeren plazmidin stabilitesinin ve kopya sayısının yüksek

100

olması da direncin sürdürülebilme ve transfer edilebilme olasılığını sağlamlaştırır

(Clewell 1993, Dunny vd. 1995). Handwerger vd. (1990) nozokomiyal bir E. faecium

suşu ile yaptıkları çalışmada hem vankomisin direnci hem de beta hemoliz ile feromon

cevaptan sorumlu 55 kb’lık bir pHKK100 konjugatif plazmidi izole etmişlerdir.

Bozdoğan ve Leclercq (1999) E. faecium ile yaptıkları araştırmada, 60 kb’dan büyük

bir plazmid aracılı vankomisin ve streptogramin direnci saptanmışlardır.

Çalışmamızda E. faecium suşların konjugatif özelliklerinin belirlenmesi için antibiyotik

duyarlı suşlar alıcı, dirençli suşlar ise verici suş olarak kullanılarak filtre eşleşme

yöntemi ile konjugasyon denemeleri yürütülmüştür. Konjugasyon denemelerinde

tetrasiklin, vankomisin ve kloramfenikol antibiyotik direnç genlerinin aktarım

özelliklerine bakılmıştır. Çalışmamızda direncin aktarımının belirlenmesinde alıcı suşlar

gentamisin duyarlı olarak seçilmiştir. Eritromisin ve kanamisin antibiyotik direnç

genlerinin aktarılabilirliği literatürde bulunmuş ancak çalışma yaptığımız tüm suşların

bu antibiyotiklere dirençli olmasından dolayı konjugasyon denemelerine alınmamıştır

(Clewell 1993, Dunny vd. 1995). Sadece vankomisin direnç geninin aktarımına bakılan,

6 (vanAR/GenS) ve 32 (vanAS/GenR) numaralı suşlarla yapılan konjugasyon

denemesinde transkonjugant elde edilmiştir (Şekil 4.15). vanA genini içeren plazmidinin

konjugasyon sıklığı, verici hücre başına 18.9 x 10-3 olarak belirlenmiştir. 4.6 kb plazmid

alıcı suşta bulunmazken konjugant üzerinde bulunmuştur. Bu plazmidin vankomisin

direncini kodladığını doğrulamak için disk difüzyon testi yapılmış ve 37 oC de 24 saat

inkübasyon sonunda konjugantlar hem vankomisine hem de gentamisine dirençli olarak

bulunmuştur (Şekil 4.16).

101

Şekil 4.15 vanA geninin konjugal aktarımı M; Marker, 32; Alıcı suş, 6; Verici suş, 32/6; Konjugant

M Marker (bç) 16210, 14174, 12138, 10102, 8066, 7045, 6030, 5012, 3990, 2972, 2067

32 Alıcı suş 25.6, 21.9, 15.8, 5.6, 3.4

6 Verici suş 22.6, 16.2, 12.5, 9.9, 5.7, 4.6,3.3

32/6 Konjugant 25.6, 22.0, 15.8, 5.6, 4.6


Şekil 4.16 Transkonjugantta vankomisin direncinin disk difüzyon yöntemi ile doğrulanması

Vankomisin

Gentamisin

M 32 6 32/6 M

4.6 kb

102

Enterokokların diğer patojenlere nazaran glikopeptit direnç genlerinin konjugal

transferinde başarılı olmasının ve konjugasyon transfer sıklığının daha yüksek

olmasının pek çok sebebi mevcuttur. Konjugatif özellik içeren plazmidlerin

bulundukları konakçılardaki stabiliteleri, yüksek sıklıkta aktarım yetenekleri ile

doğrudan ilişkilidir. Bu nedenle tanımlanan plazmidlerde konjugatif yeteneğin

biyokimyasal ve genetik doğasının belirlenmesi de önem taşımaktadır (Clewell 1993).

Çalışmada elde edilen plazmidin büyüklüğünün litaratür bulgularına göre çok daha

düşük olması dikkat çekicidir. Bu nedenle söz konusu plazmidin DNA dizi analizinin

yapılması, evrimsel kökeni hakkında daha detaylı bilgi sunabilir.

103

5. SONUÇ

Çalışmamızda Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi’nde yatmakta olan

hastalardan sağlanan kültür koleksiyonundan elde edilen klinik kökenli 64 Enterococcus

faecium suşunda antibiyotik direnç determinantlarının genetik doğası ve bu özellikleri

aktarım yolları incelenmiştir. Bu suşların, çoklu ilaç fenotipi gelişimini indükleyen

determinantlar bakımından incelenmesi sonucu; kazanılan antibiyotik dirençliğine sebep

olan gen bölgelerini içerdikleri belirlenmiştir.

Elde edilen veriler; gelişen çoklu antibiyotik dirençliliği içeren bu suşların yol açacağı

enfeksiyonların tedavisinde antibiyotik kullanımının girerek ekinliğini yitirdiğine işaret

etmektedir. Özellikle yüksek oranlarda bulunan glikopeptit dirençi tedavinin son

basamağında kullanılan vankomisin gibi önemli antibiyotikleri devre dışı bırakacaktır.

Yüksek oranda bulduğumuz ampisilin ve yüksek düzey aminoglikozit direnci de bu iki

antibiyotik grubu ile oluşturulan kombinasyon tedavi olasılığını ortadan kaldırmaktadır.

1990’lı yıllardan bu yana yapılan çalışmalarda direnç yüzdelerinin giderek artmış

olması, doğru antibiyotik kullanım politikaları oluşturulmaması sonucunda sadece

varolan antibiyotiklere değil, yeni nesil ilaçlara da hızla direncin gelişebileceğinin

göstergesidir. Ayrıca çalışmamızda Van B tipi direncin tespit edilmiş olması sadece

direnç oranlarının artmadığının aynı zamanda şekillendiğinin de işaretidir.

Enterokoklarda direnç genlerinin aktarımı özellikle plazmid aracılığıyla olmaktadır.

Yapılan konjugasyon denemeleri sonucunda sadece vanA geninin aktarımı

gerçekleştirilmiş ve konjugasyon sıklığı çok yüksek bulunmuştur. Ancak özellikle

enterokoklarda konjugasyon yoluyla kazanılan direncin en tipik örneği olarak tetrasiklin

direncinin konjugasyonla aktarılamamış olması, yatay gen transferi mekanizmalarını

etkileyen koşulların doğru incelenmesi ve belirlenmesi gerektiğine işaret etmektedir.

104

KAYNAKLAR

Andrews, F. and Horder, T. 1906. A study of streptococci pathogenic for man. Lancet ii: pp. 708-713.

Aarestrup, F. M., Agerso, Y., Gerner– Smidt, P., Madsen, M., Jensen, L.B. 2000. Comparison of antimicrobial resistance phenotypes and resistance genes in Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium from humans in the community, broilers, and pigs in Denmark. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, vol. 37, pp. 127–137.

Altay, F. M. 1996. Hastanede yatan hastaların dışkı kültürlerinde Enterokok kolonizasyonu ve vanomisin direncinin araştırılması. Ankara Eğitim Hastanesi (Uzmanlık tezi), s. 1-57.

Anderson, D. G. and McKay, L.L. 1983. Simple and rapid method for ısolating large plasmid dna from lactic streptococci. Applıed and Envıronmental Mıcrobıology, vol. 3, pp. 549-552.

Anderson, D. J., Murdoch, D.R., Sexton, D.J. 2004. Risk factors for infective endocarditis in patients with enterococcal bacteremia: a case-control study. Infection, vol. 32, pp. 72-77.

Anonymous, 2000. NCCLS. Performance Standarts for AntimicrobialSuspceptibility Testing; Tenth İnformational Supplement. January, M100-S10.

Anonymous, 2011. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: 30th informational suplement. CLSI, M100-S21 Clinical and Laboratory Standards Institute, PA, USA, 940.

Aral, M., İsmihan, N., Paköz, E., Aral, İ., Doğan, S. 2011. Antibiotic resistance of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium strains isolated from various clinical samples. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi Cilt 68, (2); s. 85-92.

Arthur, M., and Courvalin, P. 1993. Genetics and mechanisms of glycopeptide resistance in Enterococci. Antimicrob Agents Chemotherapy, vol. 37, pp. 1593-1571.

Aygün, H., Memikoğlu, O.K., Tekeli, A., Azap, A., Yörük, F. 2008. Hastanede Yatan Riskli Hasta Gruplarında Vankomisine Dirençli Enterokok Kolonizasyonunun Sürveyansı. Türk Anest Rean Dergisi, (36); s. 168-173.

Başustaoğlu, A. ve Özyurt, M. 2000. Kan kültürlerinden izole edilen glikopeptit dirençli E. faecium. 3118-3120. Flora, 5, s. 142-7.

Başustaoğlu, A. ve Aydogan, H. 2002. Enterokoklar. Infeksiyon Hastalıkları Serisi. 5, s. 45-60.

105

Başustaoğlu, A. 2004. Enterokoklarda antibakteriyel direnç mekanizmaları ve direnç sorunu. Ed: Ulusoy S, Usluer G, Ünal S. Gram Pozitif Bakteri İnfeksiyonları. Bilimsel Tıp Yayınevi Ankara, s. 141-158.

Bozdoğan, B. and Leclercq, R. 1999. Plasmid-mediated coresistance to streptogramins and vancomycin in Enterococcus faecium HM103. Antimicrobial Agents Chemotherapy, 43, s. 2097-2098.

Braak, N., van Belkum, A., Kreft, D., Witt, R., Verbrugh, H. A., Endtz, H. 1999. The prevalence and clonal expansion of high-level gentamicin-resistant enterococci isolated from blood cultures in a Dutch university hospital. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol. 44, pp. 795-798.

Campbell, R.C. 1974. Statistics for biologists. Cambridge University Pres, Second Edition, pp. 385.

Clewell, D.B. 1993. Bacterial sex pheromone-induced plazmid transfer. Cell, vol. 73; pp. 9-12

Clewell, D.B., An, F.Y., Flannagan, S.E., Antiporta, M. and Dunny, G., M. 2000. Enterococcal sex pheromone precursors are part of signal sequences for surface lipoproteins. Molecular Microbiology, vol. 35(1), pp. 246-247.

Clark, C. N., Cooksey, R.C., Hill, C. B., Swenson, M. J., Tenover, F. C. 1993. Characterization of glycopeptide resistant Enterococci from U.S hospitals. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, November, pp. 2311-2317

Coleri, A., Cokmus, C., Ozcan, B., Akcelik, M. and Tukel, C. 2004. Determination of antibiotic resistance and resistance plasmids of clinical Enterococcus species. The Journal of General and Applied Microbiology, vol. 50, pp. 213–219.

Coşkun, A.F., Mumcuoğlu, İ., Aksu, N., Karahan, C.Z. vd. 2012. Phenotypic and Genotypic Traits of Vancomycin-Resistant Enterococci in a Public Hospital: The First vanB-Positive Enterococcus faecium Isolates Mikrobiyol Bul, 46(2); s. 276-282

Çelik, Ü., Alhan, E. 2008. Pediatrik Enfeksiyonlarda Zorlu Patojen: Enterokoklar. Çocuk Enfeksiyonları Dergisi, 2, s. 58-66.

Çetinkaya, Y., Falk, P., Mayhall, C.G. 2000. Vancomycin-Resistant Enterococci. Clinical Microbiology Reviews, vol. 13, pp. 686-707.

Çınar, T., Leblebicioglu, H., Eroglu, C., Sünbül, M. 1999. Enterokoklarda penisilin aminoglikozit sinerjizminin araştırılması. Klimik Dergisi, 12 (1); s. 39-42.

D’azevedo, P.A., Furtado, G.H.C. 2008. Molecular characterization of Vancomycin Resistant Enterococci strains eight years apart from its first isolation in Sao Paulo, Brazil. Revista do Instituto de Medicina tropical de Sao Paulo, vol. 50, pp. 195-198.

106

Del Campo, R., Ruiz-Garbajosa, P., Sa´nchez-Moreno, M., P., Baquero, F., Torres, C., Canto´ n, R., and Coque, T., M. 2003: Antimicrobial resistance in recent fecal enterococci from healthy volunteers and food handlers in Spain: genes and phenotypes. Microbial Drug Resistance, vol. 9, pp. 47–60.

Derbentli, Ş. 1998. Nozokomiyal enterokok infeksiyonları. Galenos, 23, s. 14-17

Devriese, L., Baele M., Butaye P. 2006. The Genus Enterococcus: Taxonomy. Prokaryotes, vol. 4, pp. 163-174.

Dunny, G.M, Leonard, B.A.B. and Heberg PJ. 1995. Pheromoneinducible conjugation in Enterococcus faecalis: interbacterial and host-parasite chemical communication. Journal Bacteriology, vol. 177, pp. 871-876.

Dutka-Malen, S., Evers, S.,Courvalın, P. 1995. Detection of Glycopeptide Resistance Genotypes and Identification to the Species Level of Clinically Relevant Enterococci by PCR: Journal of Clınıcal Mıcrobıology, January, pp. 24–27

Eaton, T., J., and Gassaon, M., J. 2001. Molecular screening of Enterococcus virulence determinants and potential for genetic exchange between food and medical ısolates. Applıed and Envıronmental Mıcrobıology, vol. 67, pp. 1628–1635.

Elder, J.K. and Southern, E.M. 1983. Measurement of DNA length by gel electrophoresis (II): comparison of methods for planting mobility of fragment length. Analytical Biochemistry, vol. 170, pp. 38–44.

Elder, J.K., Amos, A., Southern, E.M. and Shippey, G.A. 1983. Measurement of DNA length by electrophoresis (I). Analytical Biochemistry, vol. 128, pp. 223–226.

Enne, V. I., Delsol, A. A., Roe, J. M., Bennett, P. M. 2004. Rifampicin resistance and its fitness cost in Enterococcus faecium. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol. 53, pp. 203–207.

Ergani-Ozcan, A. Naas, T., Ozhak Baysan, B., Ogunc,D., Inan, D., Colak, D and Nordmann, P. 2008. Nosocomial outbreak of vancomycin-resistant Enterococcus faecium in a paediatric unit at a Turkish university hospital Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol. 61, pp. 1033–1039

Esen, Ş., Sünbül, M., Şener, B., Eroğlu, C., Saniç, A., Leblebicioğlu, H. 2001. Glikopeptit, beta-laktam ve aminoglikozit grubu antibiyotiklerin enterokoklara in-vitro etkinliği. ANKEM Dergisi, 15(1); s. 59-63.

Facklam, R.R., Sahm, F.D 1995. Enterococcus. Manual of Clin. Microbiol. 6th edition. Washington D.C. American Society for Microbiology, pp. 308 – 14.

Faclam, R.R., Sahm, D.S and Teixera, L.M. 1997. Enterococci, Chapter 18, Manual of Clinical Microbiology, 7th Edition, ASM Press,Washington DC.

107

Facklam R.R., Teixeria L.M. 1998. Enterococcus. In: Collier L, Bolows A,Sussman (eds). Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial infections. Vol 2 (Systematic Bacteriology). Ed: Edvard Arnold, 9th edition. London, pp. 669-682.

Facklam, R.R. 2002. What happened to the streptococci: overview of taxonomic and nomenclature changes. Clinical Microbiology Reviews, vol. 15, pp. 613-630.

Fisher, K. and Phillips, C. 2009. The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. Microbiology, vol. 155, pp. 1749-1757.

French, G.N. 1998. Enterococci and Vankomycin resistance Clinic İnfection Disseases, vol. 27 (suppl 1); pp. 75-83

Gordon, S., Swenson, J.M., Hill, B.C. 1998. Antimicrobial susceptibilitiy patterns of common and unysyal species of enterococcus caming infections in the US. Journal of Clinic Microbiology, vol. 9, pp. 372-8

Guardabassi, L. and Dalsgaard, A. 2004. Occurence, structure, and mobility of TN1546-

like elements in environmental isolates of vancomycin-resistant enterococci. Applied and Environmental Microbiology, vol. 70, pp. 984-990.

Gültekin, M. 2004. Enterokoklar: Mikrobiyoloji, epidemiyoloji ve patogenez. Önemli

ve Sorunlu Gram Pozitif Bakteri İnfeksiyonları, Bilimsel Tıp Yayınevi, 121 s. 40.

Gür, D. 1997. Flora Betalaktamazlar. Ek, 2; s. 1.

Hacker, J. and Kaper, J. B. 2000. Pathogenicity islands and the evolution of microbes. Annual Review of Microbiology, vol. 54, pp. 641–679.

Handwerger, S., Pucci, M.J. and Kolokathis, A. 1990. Vancomycin resistance is encoded on a pheromone response plasmid in Enterococcus faecium 228. Antimicrob Agents Chemotherapy, vol. 34, pp. 358-360.

Handwerger, S., Perlman, D.C., Altarac, D. and McAuliffe, V. 1992. Concominant high-level vancomycin and penicillin resistance in clinical isolates of Enterococci. Clinical Infection Disseases, vol. 14, pp. 655-661.

Hanrahan, J., Hoyen, C. and Rice, L.B. 2000. Geographic distribution of a large mobile element that transfers ampicillin and vancomycin resistance between Enterococcus faecium strains. Antimicrobial Agents Chemotherapy, vol. 44, pp. 1349-1351.

Huycke, M. M., Spiegel, C. A., Gilmore, M. S. 1991. Bacteremia caused by hemolytic, high-level gentamicin-resistant Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 35, pp. 1626–1634.

108

Huycke, M. M., Sahm, D., Gilmore, M. 1998. Multiple drug resistant enterococci: The nature of the problem and an agenda for the future. Emerging Infection Disseases, vol. 4, pp. 239-49.

Huys, G., D’Haene, K., Collard, J., M., Swings, J. 2004. Prevalence and molecular characterization of tetracycline resistance in Enterococcus ısolates from food. Applıed and Envıronmental Mıcrobıology, vol. 70, pp. 1555–1562.

İşleroğlu, H., Yıldırım, Z., Demirpençe, Y., Yıldırım, M. 2008. Enterokoklar: biyokimyasal, fizyolojik ve fonksiyonel özellikleri ile patojenitesi. Akademik Gıda, 6(3), s. 16-26.

Jensen, L. B., Frimodt-Möller, N., Aarestrup, F.M. 1999. Presence of erm gene classes in Gram-positive bacteria of animal and human origin in Denmark. FEMS Microbiology Letters, vol. 170, pp. 151-158.

Jett, B. D., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. 1994. Virulence of Enterococci. Clinical Microbiology Reviews, vol. 7, pp. 462-478.

Kandler, O., Schleifer, K.H., Dandl, R. 1968. Differantiation of Streptococcus fecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the Amino acid composition of their murein. Journal of Bacteriology, vol. 96, pp. 1935-1939.

Karadenizli, A., Kolaylı, F. 2002. Kocaeli Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesinde izole edilen enterokok türleri ve antibiyotiklere duyarlılıkları. Türk Mikrobiyol Cem Dergisi, 32(3-4); s. 212-5.

Kaye, D. 1982. Enterococci. Biologic and epidemiologic characteristics and in vitro suspectibility. Archives of Internal Medicine, vol. 142, pp. 2006 – 9.

Klare, I., Konstabel, C., Badstubner, D., Werner, G., Witte, W. 2003. Occurrence and spread of antibiotic resistances in Enterococcus faecium. International Journal of Food Microbiology, vol. 88, pp. 269–290.

Klein, G. 2003. Taxonomye, cologya nd antibiotic resistance of enterococci from food and the gastrointestinal tract. International Journal of Food Microbiology, vol. 88, pp. 123-131.

Kobayashi, N., Alam, M., M., Nıshımoto, Y., Urasawa, S., Uehara, N. and Watanabe, N. 2001. Distribution of aminoglycoside resistance genes in recent clinical isolates of Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium and Enterococcus

avium. Epidemiology and Infection, vol. 126, pp. 197-204.

Koneman, E. W., Allen, S. D., Janda, W. M. Screckenberger, P. C., Winn, W. C. 1992. The gram positive cocci part 2: Streptococci and streptococcus-like bacteria. Diag. Microbiol. 4th edition. Philadelphia, J. B. Lippincott Company, pp. 431 – 66

109

Koneman, E.W, Allen, S.D, Janda, W.M, Schreckenberger, P.C, Winn, W.C. Procop, G., Woods, G. 2005. Color Atlas and Textbook of Diagnostik Microbiology, (Sixth edition) Philadelphia Lippincott Co; pp. 700-711

Korten, V. 2002. Enterokoklar. In Willke TA, Söyletir G, Doganay M (eds). Infeksiyon Hastalıkları. İkinci baskı, İstanbul. Nobel Tip Kitabevleri Ltd. Sti, 2, s. 1497-1506.

Korten, V. 2005. Enterokok infeksiyonları. In: İliçin G, Ünal S, Biberoğlu K, Akalın S, Süleymanlar G (eds). Temel İç Hastalıkları. İkinci baskı. Güneş Kitabevi Ltd. Şti, Ankara.

Krieger, J. N., Kaiser, D. L., Wenzel, R. P. 1983. Urinary tract etiology of bloodstream infections in hospitalize patients. Jornal Infection Disseases, vol. 148, pp. 57 –62.

Kutlu, S.S., Dokuzoğuz, B. 2004. Enterokok infeksiyonlarında tedavi seçenekleri. Ed:

Ünal S,Vahapoğlu H. Yeni ve Yeniden Gündeme Gelen İnfeksiyonlar. Bilimsel Tıp Yayınevi. Ankara, s. 23-32.

Lampkowska, J., Feld, L., Monaghan, A., Toomey, N., Schjorring, S., Jacobsen, B., van der Voet, H., Andersan, S., R., Bolton, D., Aarts, H., Krogfelt, K., A., Wilcks, A., Bardowski, J. 2008. A standardized conjugation protocol to ases antibiotic resistance transfer between lactococcal species. International Journal of Food Microbiology, vol. 127, pp. 172-175.

Lavery, A., Rossney, A.S., Morrison, D., Power, A. and Keane, C.T. 1997. Incidence and detection of multi-drug-resistant Enterococci in Dublin hospitals. Journal Medical Microbiology, vol. 46, pp. 150-156.

Leavis, H., Top, J., Shankar, N., Borgen, K., Bonten, M., Embden, J.V., Willems, R.J.L. 2004. A Novel Putative Enterococcal Pathogenicity Island Linked to the esp Virulence Gene of Enterococcus faecium and Associated with Epidemicity. Journal of Bacteriology, vol. 186, pp. 672-682.

Leclercq, R., Derlot, E., Duval, J., Courvalin, P. 1988. Plasmid-mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium. New England Journal of Medicine, vol. 319, pp. 157-161.

Leclercq R., Dutka-Malen S., Brisson-Noel A., Molinas C., Derlot E., Arthur M., Duval J., Courvalin P. 1992. Resistance of enterococci to aminoglycosides and glycopeptides. Clinic Infection Disseases, vol. 15, pp. 495-501.

Leclercq, R., and Courvalin, P. 1997. Resistance to hglycopeptides in enterococci. Clinic Infection Disseases, vol. 24, pp. 545-554.

Lefort, A., Mainandi, J.L., Tod, M., Lortholory, O. 2000. Antienterococcal antibiotics. Med Clin North Ame, vol. 6, pp. 1471-1495.

110

Linden, P.K., Pasculle, A.W., Manez, R. 1996. Differences in outcomes for patients with bacteremia due to vancomycin-resistant E. faecium or vancomycin suspectible E. faecium. Clinic Infection Disseases, vol. 22, pp. 663 -70.

Macrina, F.L., Kopecko, D.J., Jones, K.R., Ayers, D.S. and McCoven, S.M. 1978. A multiple plasmid containing Escherichia coli strain: convenient source of size reference plasmid molecules. Plasmid, vol. 1, pp. 417–420.

Macrina, F.L., Tobian, J.A., Jones, K.R., Evans, R.P. and Clewell, D.B. 1982. A cloning

vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sangius. Gene, vol. 19, pp. 345–353.

Malathum, K., Murray, B. E. 1999. Vancomycin-resistant enterococci: recent advances

in genetics, epidemiology and therapeutic options drug resistance updates. vol. 2; pp. 224-43.

Markowitz, S. M., Wells, V. D., Williams, D. S., Stuart, C. G. 1991. Antimicrobial susceptibility and moleculer epidemiology of β-lactamase-producing aminoglycoside resistant isolates of Enterococcus faecalis. Antimicrob. Agents Chemother, 35 (6); pp. 1075- 80.

Marothi, Y.A., Agrihotri, H., Dubey, D. 2004. Enterococcal resistance –An overview. Indian Journal of Medical Microbiology, vol. 23, pp. 214-219.

Mascini, E. M., Troelstra, A., Beitsma, M. 2006. Genotyping and preemptive isolation to control an outbreak of vancomycin-resistant Enterococcus faecium. Clinical Infectious Diseases, vol. 42, pp. 739-46.

Mcgregor, K. F. and Young, H. K. 2000. Identification and characterization of vanB2 glycopeptide resistance elements in enterococci ısolated in Scotland. Antımıcrobıal Agents and Chemotherapy, vol. 44, pp. 2341–2348.

Mert-Dinç, B., Aykut-Arca, E., Yağcı, S., Karabiber, N. 2009. Çeşitli Klinik örneklerden izole edilen Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarında in-vitro antibiyotik duyarlılığı. Türk Hij Den Biyol Dergisi, 66 (3); s. 117-21.

Meyers, J.A., Sanches, D., Elwell, L.P. and Falkow, S. 1976. Simple agarose gel electrophoretic method for the identification and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology, vol. 127, pp. 1529-1537.

Moaddab, S., Töreci, K,. 2000. Enterokok suşlarında tür tayini, vankomisin ve diğer bazı antibiyotiklere direnç aranması. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi, (30); s. 77-84.

Moellering R. C. 1992. Emergance of Enterococcus as a significant pathogen. Clin. Infect. Dissease, vol. 14, pp. 1173-78.

Moreno, M., Sarantinopoulos, P., Tsakalidou, E., De Vuyst, L. 2006. The role and application of enterococci in food and health. International Journal of Food Microbiology, vol. 106, pp. 1 – 24.

111

Mounir, M., Salem-Bekhit, M.I., Moussa, I., Muharram M. M. 2011. Increasing prevalence of high-level gentamicin resistant enterococci: An emerging clinical problem African Journal of Microbiology Research. 23 December, 5(31) ; pp. 5713-5720.

Mundy, L.M., Sahm, D.F. and Gilmore, M. 2000. Relationships between enterococcal virulence and antimicrobial resistance. Clinical Microbiology Reviews, vol. 13, pp. 513– 522.

Murray, B.E., Mederski–Samaroj, B. 1983. Transferable β-lactamase. A new mechanism for in vitro penicillin resistance in Streptococcus faecalis. Journal of Clinical Investigation, vol. 72, pp. 1168–1171.

Murray, B. E. 1990. The life and times of the Enterococcus. Clinical Microbiology Reviews, vol. 3, pp. 46–65.

Murray, B.E., Singh, K.V., Ross, R.P., Don Heath, J., Dunny, G.M., Weinstock, M.G. 1993. Generation of Restriction Map of Enterococcus faecalis OG1 and Investigation of Growth requirements of Growth requirements and regions encoding biosynthetic function. Journal of Bacteriology, vol. 175, pp. 5216-5223.

Murray, B.E. 1998. Enterococci. In: Gorbach, Bartlett, Blacklow (ed). Infectious Diseases Philadelphia. WB Saunders, pp.1723-1730.

Murray, B.E. 2000. Vancomycine-resistant Enterococcal infections. The New England J Medical, vol. 342, pp. 710-721.

Nourse, C., Murphy, H., Byrne, C. 1998. Control of a nosocomial outbreak of vancomycin resistant Enterococcus faecium in a paediatric oncology unit: risk factors for colonisation. European Journal of Pediatrics, vol. 157, pp. 20-7.

Patel, R. 1999. Vancomycine-resistant enterococci in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplantation, vol. 4, pp. 271-280.

Perichon, B., Casadewall, B., Reynolds, P. and Courvalin, P. 2000. Glycopeptide Resistant Enterococcus faecium BM4416 Is a Van D-Type Strain with an Impaired D-Alanine:D-Alanine Ligase. Antimicrob. Agents Chemotherapy, vol. 44, pp. 1346-1348.

Poeta, P., Costa, D., Sa´enz, Y., Klibi, N., Ruiz-Larrea, F., Rodrigues, J., Torres, C. 2005. Characterization of antibiotic resistance genes and virulence factors in faecal enterococci of wild animals in Portugal. The Journal of Veterinary Medical, vol. 52, pp. 396–402.

Reynolds, P.E., Courvalin, P. 2005. Vancomycin Resistance in Enterococci Due to Synthesis of Precursors Terminating in D-Alanyl-D-Serine. Antımicrobıal Agents And Chemotherapy, vol. 49, pp. 21–25.

112

Rice, L. B. 2001. Emergence of vancomycin-resistant enterococci. Emerging Infectious Diseases. vol. 7, pp. 183-7

Robert, C., Moellering J. R. 2000. Enterococcus species, Streptococcus bovis and

Leuconostoc species. Principles and Practise of Infectious Disease 5th edition. Churchill – Livingstone, pp. 2147 – 53.

Robert C., Moellering R.C. 2005. Enterococcus species, Streptococcus bovis and Leuconostoc spesies. In: Mandell GL, Bennet JE, Dolin R (edc). Principles and Practice of Infectious Disease. Vol 2. Sixth edition. Elsevier Churchıll Livingstone, pp. 2411-2417.

Rosvoll, T., C., Pedersen, T., Sletvold, H., Johnsen, P., J., Sollid, J., E., Simonsen, G., S., Jensen, L., B., Nielsen, K., M., Sundsfjord, A. 2010. PCR-based plasmid typing in Enterococcus faecium strains reveals widely distributed pRE25-, pRUM-, pIP501- and pHTbeta-related replicons associated with glycopeptide resistance and stabilizing toxin-antitoxin systems. FEMS Immunology & Medical Microbiology, vol. 58, pp. 254-268.

Rudy, M., Zientara, M., Bek, T. 2005. Occurrence of antibiotic resistant enterococci in clinical specimens from a pediatric hospital. Pol J Microbiology, vol. 54, pp. 77-80.

Ruoff, K. L., Maza, L., Murtagh, M. S. 1990. Species identities of enterococci isolated from clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology, vol. 28, pp. 435-7.

Sarantinopoulos, P., Andrighetto, C., Georgalaki, M. D., Rea, M. C., Lombardi, A., Cogan, T. M., Kalantzopoulos, G., Tsakalidou, E. 2001. Biochemical properties of enterococci relevant to their technological performance. International Dairy Journal, vol. 11, pp. 621-647.

Sayıner, H.S. 2008. Sürveyansla saptanan VRE’ lerin dağılımı, antibiyotik duyarlılıkları ve kolonize hastalarda risk faktörlerinin değerlendirilmesi. Okmeydanı Eğitim ve Araştırma Hastanesi (uzmanlık tezi ), s. 1-66

Schaffer, H.E. and Sederof, R.R. 1981. Improvement estimation of DNA fragment lengths from agarose gels. Analytical Biochemistry, vol. 115, pp. 122–133.

Schleifer, K. H. and R. Kilpper-Balz. 1984. Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the genus Enterococcus nom. rev. As Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov. nt. J.Syst. Bacteriology, vol. 34, pp. 31–34.

Shankar, N., Lockatell, C. V., Baghdayan, A. S., Drachenberg, C., Gilmore, M. S., Johnson, D. E. 2001. Role of Enterococcus faecalis surface protein Esp in the pathogenesis of ascending urinary tract infection. Infection and Immunity, vol. 69, pp. 4366-4372.

113

Shankar, N., Baghdayan, A. S., Gilmore, M. S. 2002. Modulation of virulence within a pathogenicity island in vancomycin resistant Enterococcus faecalis. Nature, vol. 417, pp. 746– 750.

Shepard, B.D., Gilmore, M.S. 2002. Antibiotic-resistant enterococci: the mechanisms and dynamics of drug introduction and resistance. Microbes and Infection, vol. 4, pp. 215–224.

Simjee, S., Gill, M.J. 1997. Gene transfer, gentamicin resistance and enterococci. Journal of Hospital Infection, vol. 36, pp. 249-259.

Son, R., Nimita, F., Rusul, G., Nasreldin, E., Samuel, L., and Nishibuchi, M. 1999. Isolation and molecular characterization of vancomycin-resistant in Enterococcus faecium Malaysia. Letters in Appl Microbiology, vol. 29, pp. 118-122.

Sood, S., Malhotra, M., Das-Arti Kapil, B.K. 2008. Enterococcal infections - antimicrobial resistance. Indian Journal of Medical Research, vol. 128, pp. 111-112.

Southern, E.M. 1979. Measurement of DNA lengths by gel electrophoresis. Analytical Biochemistry, vol. 100, pp. 319–323.

Stovcik, V., Javorsky, P., Pristas, P. 2008. Antıbıotıc resıstance patterns and resıstance genes in Enterococcı isolated from sheep gastroıntestınal tract in Slovakıa. Bulletin of the Veterinary Institue in Pulavy, vol. 52, pp. 53-57.

Şardan, Y.Ç. 2004. Enterokoklarda direnç sorunu. Ed: Şardan YÇ. Yeni ve Yeniden Gündeme Gelen İnfeksiyonlar. Bilimsel Tıp Yayınevi. Ankara, s. 10-16.

Şekercioğlu, A.O., Vural, T., Öğünç, D.,Çolak,D. ve Örgüt, G. 1998. Klinik örneklerden izole edilen Enterokok türlerinin identifikasyonu, antibiyotik duyarlılıkları, yüksek düzeyde gentamisin direnç özelliklerinin ve Beta laktamaz aktivitelerinin araştırılması. XXVII. Türk Mikrobiyoloji Kongresi, Antalya, Serbest bildiri,12-182.

Taşova, Y., İnal, A.S. 2004. Enterokok infeksiyonlarında klinik. E. faecium Yeni ve Yeniden Gündeme Gelen İnfeksiyonlar. Bilimsel Tıp Yayınevi, s. 17-22.

Tendolkar, P. M., Baghdayan, A. S., Shankar, N. 2003. Pathohenic enterococci: new developments in the 21st century. Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 60, pp. 2622-2636.

Thiercelin, M. E. 1899. Sur un diplocoque saprophyte del’intestin susceptible de devenir pathogene. C. R. Seances Soc. Biol Fil. vol. 51, pp. 269-271.

Toledo-Arana, A., Valle, J., Solano, C., Arrizubieta, M. J., Cucarella, C., Lamata, M., Amorena, B., Leiva, J., Penadés, J. R., Lasa, I. 2001. The enterococcal surface protein, Esp, is involved in Enterococcus faecalis biofilm formation. Applied and Environmental Microbiology, vol. 67, pp. 4538–4545.

114

Trieu–Cuot, P., de Cespedes, G., Bentorcha, F., Delbos, F., Gaspar, E., & Horaud, T. 1993. Study of heterogeneity of chloramphenicol acetyltransferase (CAT) genes in streptococci and enterococci by polymerase chain reaction (PCR): characterization of a new CAT determinant. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol. 37, pp. 2593–2598.

Upadhyaya, P.M.G., Ravikumar, K.L., Umapathy, B.L. 2009. Review of virulence factors of enterococcus: An emerging nosocomial pathogen. Indian Journal of Medical Microbiology, vol. 27, pp. 301-305.

Uttley, A.H.C., Collins, C.H., Naidoo, J. and George, R.C. 1988. Vancomycin resistant enterococci. Letter. Lancet; vol. 1, pp. 57-58.

Vural, T, Şekercioğlu, A.O., Öğünç, D., Gültekin, M., Çolak, D., Yeşilipek, A., Kocagöz, S., Ünal, S., Mutlu, G. 1998. Vankomisine dirençli Enterococcus

faecium suşu. ANKEM Dergisi, l2; s. 113.

Wax, R. G., Lewis, K., Salyers, A., Taber, H. 2008. Bacterial Resistance to Antimicrobials. Taylor and Francis Group, LLC.

Yetkin, M.A., Ateş, A.N. 2004. Vankomisine direncli enterokok bakteremisi: Olgu sunumu. Hastane İnfeksiyonları Dergisi, 8 (4); s. 310-4.

Yıldırım, M. 2007. Enterokoklar ve Enterokoklarla Gelisen Infeksiyonlar. Düzce Üniversitesi Tip Fakültesi Dergisi, (2); s. 46-52.

Yiş, R., Aslan, S., Çıtak, Ç., Değirmenci, S. 2010. Evaluation of Vancomycin-Resistant Enterococcus Colonization at Gaziantep Children’s Hospital, Turkey. Bu çalışma XXXIV. Türk Mikrobiyoloji Kongresi poster olarak sunulmuştur.

Zeana, C., Kubin, J.C., Della-Latta, P., Hammer, S.M. 2001. Vancomycin-resistant Enterococcus faecium meningitis successfully managed with linezolid: case report and review of the literature. Clinic İnfection Diseases, vol. 33, pp. 477-482.

Zırakzadeh, A., Patel, R. 2006. Vancomycin-Resistant Enterococci: Colonization, Infection, Detection, and Treatment. Mayo Clinic Proceedings, vol. 81, pp. 529-536.

115

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı: Kübra KASAROĞLU

Doğum Yeri: Ankara

Doğum Tarihi: 26.08.1983

Medeni Hali: Evli

Yabancı Dili: İngilizce

Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)

Lise : Ankara Cumhuriyet Lisesi (1998-2001)

Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü (2001-2005)

Yüksek Lisans: Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı (2005-2007)

Çalıştığı Kurum/Kurumlar ve Yıl:

Akdeniz Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi Merkez Laboratuvarı (2007-)

YAYIN LİSTESİ

1. KASAROĞLU, K., AKÇELİK, N., ŞANLIBABA, P., AKÇELİK, M.

2012.Nisin üreticisi Lactococcus lactis subsp. Lactis LL27 suşunun beyaz

peynirde Listeria monocytogenes’in gelişiminin engellenmesi üzerine etkisi.

Selçuk Tarım ve Gıda Bilimleri Dergisi, 26(1); 77-83

2. OZHAK BAYSAN, B., KILINÇKAYA, H., ÖĞÜNÇ, D., ÖNGÜT, G.,

KASAROĞLU, K., GUNSEREN, F., ÇOLAK, D. 2013. Evaluation of

Brilliance VRE agar for detection of vancomycin-resistant enterococci (VRE) in

rectal swab specimens. Journal of Medical Microbiology, January, 25.

116

Sempozyum Tebliğleri

1. ŞİMŞEK, Ö., UYMAZ, B., AKKOÇ, N., YILDIRIM, K., AKÇELİK, M.

2007. L. lactis subsp. lactis LL27 Suşunda Nisin Üretiminin Artırılmasına

Yönelik Bir Genetik Yaklaşım. 15. Biyoteknoloji Kongresi (Ekim 2007,

Antalya) Bildiri Kitabı, 363-366.

DOKTORA TEZİ - Hoşgeldinizacikarsiv.ankara.edu.tr/browse/25121/Binder1.pdf · pü ve rektal swab...

Documents

Transcript of DOKTORA TEZİ - Hoşgeldinizacikarsiv.ankara.edu.tr/browse/25121/Binder1.pdf · pü ve rektal swab...