Docente:

Dr. Stefania Bortoluzzi

Dipartimento di BiologiaUniversita' di Padova viale G. Colombo 3, 35131, Padova Tel. 0039 049 8276214Email: stefibo@bio.unipd.it

Corso di Laurea in Biotecnologie SanitarieUniversita' di Padova

Corso di Bioinformatica

16 ore

IV LEZIONE

Uso di Genome Browser per l'annotazione di sequenze genomiche.

Allineamento di sequenze trascritte con sequenze genomiche: BLAT.

PROGETTO GENOMA UMANO Milestones:

• 1990: Inizio (U.S. Department of Energy and the National Institutes of Health)

• Giugno 2000: Completamento della sequenza “working draft” dell’intero genoma umano

• Febbraio 2001: Pubblicazione prime analisi sul genoma completo

• Aprile 2003: Completamento della sequenza•

Una sequenza viene detta “finita” quando presenta un livello di errore inferiore a 1/10000 basi e non ha gaps.

Il Progetto Genoma Umano era complesso dal punto di vista tecnico ma anche dal punto di vista computazionale.

L’output di una singola reazione di sequenza (read) = 500-800 bp Tutti i singoli frammenti devono essere assemblati in una singola stringa lineare.

NCBI fornisce ora l’assembly di riferimento per i 3 principali “portali genomici”:• MapWiew• Ensembl• Genome Browser

La sequenza primaria del genoma non è sufficiente…

Annotazione del genoma• E’ necessario riportare sull’assembly le informazioni e i dati

sperimentali già ottenuti.• Riconciliare e integrare l’assembly con le mappe fisiche, genetiche e

citogenetiche • Gli STS sono mappati sulla sequenza usando e-PCR• La corrispondenza con la mappa citogenetica utilizzando FISH

sistematica di BAC.

L’annotazione dei geni è attuata con metodi leggermente diversi dai 3 “genome browser”– L’NCBI allinea mRNA di RefSeq, mRNA di GenBank utilizzando

MegaBlast. – Ensembl allinea tutte le proteine umane note di SP/Trembl

utilizzando un suo algoritmo– UCSC allinea mRNA di Refseq e GenBank e dalle ultime release

SP/Trembl con BLAT

Annotazione dei geni

• ab initio, in base a “sensori”, funzioni che tentano di dedurre la presenza di una caratteristica genica in base a motivi o proprietà statistiche del DNA.– Sensori per TSS (G+C)– Sensori per siti splicing (AG-GT)– Sensori che misurano la composizione in basi di esoni putativi

L’output dei vari sensori è combinato per generare un “modello genico”

• metodi basati sulla similarità: l’allineamento di una regione genomica con un cDNA o un EST sono una buona evidenza.

Lo splicing alternativo complica l’interpretazione degli allineamenti tra DNA genomico, cDNA e ESTs

I dati di similarità sono incompleti: trascritti poco espressi o espressi transientemente sono assenti…

I programmi di ultima generazione come Grail/Exp, Genie EST, GenomeScan combinano predizioni ab inizio con dati di similarità ottenendo risultati migliori

Viral Genomes

3 milioni di basi in formato testo = nessuna utilita’Servono:•Annotazione dell’informazione sulla sequenza•Possibilita’ di recuperare velocemente la sequenza di regioni specifiche del genoma in base a criteri di

• Contenuto di informazione• Caratteristiche di sequenza

Genomi disponibili

HumanHomo sapiens assembly• 99% delle regioni contenenti geni• accuratezza 99.99% • 2.84 Gb finite “highly contiguous”

SpeciesA. gambiaeA. melliferaC. briggsaeC. elegansC. intestinalisChickenChimpCowD. ananassaeD. erectaD. grimshawiD. melanogasterD. mojavensisD. persimilisD. pseudoobscuraD. sechelliaD. simulansD. virilis

UCSC Genome Browser

Sistema per la “navigazione” della sequenza e dell’annotazione di genomi, che permette la visualizzazione dell’informazione a “diverso ingrandimento” ed il recupero di porzioni di sequenza con associate le informazioni di annotazione, come:Geni noti e geni predettiESTs, mRNAsIsole CpGassembly gaps e coverage, bande cromosomicheOmologia con altri genomi…

D. yakubaDogFuguHumanMouseOpossumRatRhesusS. purpuratusSARSTetraodonX. tropicalisYeastZebrafish

UCSC Genome BrowserMolte possibilita’ per la ricerca di una regione specifica:

• chr7 un cromosoma intero• 20p13 una regione (banda p13 del cr. 20)• chr3:1-1000000 il primo milione di basi del cr. 3 dal ptel• D16S3046 regione intorno al marcatore (100,000 basi per lato)• RH18061;RH80175 regione tra i due marcatori• AA205474 regione genomica che si allinea con la sequenza con

questo GB accession number• PRNP regione del genoma che comprende il gene PRNP • NM_017414• NP_059110 • 11274 (LLID)

Oppure di liste di regioni:• pseudogene mRNA Lists transcribed pseudogenes, but not cDNAs• homeobox caudal Lists mRNAs for caudal homeobox genes• zinc finger Lists many zinc finger mRNAs• huntington Lists candidate genes associated with Huntington's

disease

Categorie di annotazione:

• Mapping and Sequencing Tracks

• Genes and Gene Prediction Tracks

• mRNA and EST Tracks

• Expression and Regulation

• Comparative Genomics

• ENCODE Tracks

• Variation and Repeats

Genome Browser

Known Genes HideGenome Browser: display mode

Known Genes DenseGenome Browser: display mode

Known Genes SquishGenome Browser: display mode

Known Genes PackGenome Browser: display mode

Known Genes FullGenome Browser: display mode

Genome Browser

Categorie di annotazione: Expression and Regulation

CpG Islands, ISOLE CpGRegioni in cui seqenze CpG sono significativamente piu’ frequenti che nel resto del genoma. Associate ai geni, soprattutto agli housekeeping. Di solito si trovano vicino ai TSS, associate ai promotori. Nei vertebrati le sequenze CpG sono rare, e le C nelle isole CpG tendono ad essere metilate e, nel tempo, le C metilate tendono a mutare a T per deaminazione spontanea. Percio’ sono rare e di solito “vengono mantenute solo per ragioni regolative”.Metodo: Finestra a scorrimento per dinucleotidi (punteggio +17 per CG, -1 tutti gli altri) e successiva identificazione dei segmenti con punteggi massimali. Poi, per ogni segmento, calcolo contenuto in GC (>= 50%), lunghezza (> 200), e rapporto tra frazione di dinucleotide CG osservato e atteso in base al contenuto in GC del segmento (> 0.6).

GNF Gene Expression Atlas Ratios Using Affymetrix GeneChipsDati d’espressione ottenuti dall’analisi di Affymetrix GeneChips GNF (The Genomics Institute of the Novartis Research Foundation).I colori mostrano il segnale medio tra diversi esperimenti su scala logaritmica: colore scuro segnale forte.

FirstEF: First-Exon and Promoter PredictionPredizioni del programma First Exon Finder: primi esoni, promotori e isole CpG.Due predizioni consecutive a distanza inferiore a 1000 bp sono rappresentate come primi esoni alternativi.Metodo: FirstEF is a 5' terminal exon and promoter prediction program. It consists of different discriminant functions structured as a decision tree. The probabilistic models are optimized to find potential first donor sites and CpG-related and non-CpG-related promoter regions based on discriminant analysis.

Genome Browser

5-Way Regulatory PotentialTraccia che mostra il punteggio RP lungo la sequenza in esame, computato in base all’analisi dell’allineamento multiplo di regioni ortologhe dei genomi consideratiDescriptionThis track displays regulatory potential (RP) score, computed from alignments of human (hg17), chimpanzee (panTro1), mouse (mm5), rat (rn3), and dog (canFam1).

Genome Browser

Categorie di annotazione: Comparative Genomics

Genome BrowserMouse Net

Mouse Net è la traccia che mostra l’insieme degli allineamenti ottimali tra il genoma umano e quello di topo, ottenuti attraverso BLASTZ.BOX = ungapped alignmentsLINEE = gaps

Genome BrowserMouse Net

Genome Browser

Categorie di annotazione: Variation and Repeats

1. Variation and Repeats2. SNPs3. Overlap SNPs4. Random SNPs5. Affy 120K SNPs6. Affy 10K SNPs7. RepeatMasker8. Simple Repeats9. Self Chain

Genome Browser

SNPs, Simple Nucleotide Polymorphisms

Traccia che mostra

• diversi tipi di polimorfismi: SNPs propri, inserzioni e delezioni, duplicazioni

• polimorfismi osservati in base alla comparazione di cloni, polimorfismi inclusi nei kit per il Genotyping dell’Affimetrix (10K e 120K).