Doç.Dr.Engin DEVECİ

HÜCRE KÜLTÜRÜ

Hücre Kültürü Araştırma Laboratuvarı, çeşitli hücrelerininvitro kültürlerini yaparak araştırmacılara kanser, kökhücre, hücre mekaniği çalışmaları gibi konularda hücre içive hücreler arası biyokimyasal olayların moleküler düzeydeincelenebilmesi için devamlı olarak hücrelerin teminedilmesi ve bu hücrelere istenilen deneysel uygulanmalarınyapılması için kurulmuştur.

•Rahim ağzı kanseri hücreleri doku kültürü mikroskopik görüntüsü.

Hücre kültürü besiyerleri laboratuar ortamında hücrelerin normalmetabolik aktivitelerini sürdürebilmeleri için gerekli olanmikroçevreyi sağlayan besleyici solusyonlardır.

Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki aminoasit, karbonhidrat,vitamin ve iyonlarla hücrelerin gelişimini desteklerler.Laboratuarortamında hücrelerin çoğaltılabilmesi için uygun pH sıcaklık venemin sağlanması çok önemlidir.

Hücre kültürü besiyerleri içeriklerindeki iyonlarla gerekliozmolarite ve pH’ı da sağlarlar

HÜCRE KÜLTÜRÜ Hücre kültür ortamının hazırlanması ve içeriği Beslenme Pasajlama Sayım Dondurma

Katı (agarlı) besiyerinde sayım, canlı hücrelerin kolonioluşturması ve bu kolonilerin sayılarak «her canlı hücre1 koloni oluşturur» prensibi ile materyaldeki canlı hücresayısının hesaplanması esasına dayanır. Bu amaçlasayım yapılacak materyalden belirli bir miktar alınır vebesiyerine aktarılır. Koloni oluşması için gerekliinkübasyon süresinin sonunda Petri kutusundakikoloniler sayılarak materyaldeki canlı hücre sayısıhesaplanır. Ölü hücreler üreyip koloni meydanagetiremeyeceği için bu yöntemde sadece canlı hücrelersayılır.

Hücre Kültür ortamında kullanılan cihazlar Steril çalışma kabini CO2 inkübatörü yada CO2 tankı İnverted mikroskobu Santrifüj Vakum hattı yada pompası Otoklav Sıvı azot tankı

Hücre Kültürü

Primer Kültürler;Doğrudan dokudan elde edilen hücre kültürleridir.Elde edildikleri dokunun özelliklerini taşırlar

Hücre Hatları;Primer hücrelerin spontan mutasyonu,kimyasal madde uygulanması ile mutasyon oluşturularak elde edilen ölümsüz hücre tipleridir.

Kültür Ortamlarının Temel Bileşenleri İnorganik tuzlar Karbonhidratlar Aminoasitler Vitaminler Yağ asitleri ve Lipidler Proteinler ve Peptidler Serum

Hücre Kültür Ortamları DMEM(Dulbecco's Modification of Eagles

Medium);çoğu memeli hücresinin üremesini destekler RPM 1640 (L-glutaminli);Özellikleri hemapoetik

sistem hücrelerinin üretilmesinde kullanılır Ham’s F10 ve F12 (Besleyici karışım) F10-insan diploid hücreler,sıçan,tavşan F12-Sıçan hepatosit,prostat Fischer’s medium-lenfoblast Iscove-Eritroblast,makrofaj

Besleme İşlemi

Ekimi yapılan hücrelerin yapışması beklendikten sonra besleme amacı ile ortam değiştirir.Hücreler zemini kapladığında ise hücreler ya pasajlanır yada dondurulur.

Hücre Kültürlerinin Hazırlanması

A-Pasajlama (subkültür)Hücrelerin pasajlanabilmesi için hücre kültür flakslarının yüzeyini kaplamış olmalıdır.Böyle flakslara konfulent flakslar denir.Pasajlama işlemi hücreler sıkışık konumda olduğu için yapılır.Ve daha geniş alana yayılır.Pasajlama işlemi besi ortamı içerisindeki hücrelerin nutrientleri tüketmesinden dolayı üreme hızlarının düşmesini ölümlerini önlemek amacı ile yapılır

Pasajlama işlemi tutunarak çoğalan hücrelerde ve süspanse kültürlerde farklı yapılır:

Süspanse kültürlerde pasajlama yapılırken; kültür eşit şekilde santrifüj tüplerine dağıtılır ve santrifüj edilerek kullanılmış besi ortamı atılır.Daha sonra uygun besi ortamıyla dilue edilerek platelere ya da flasklara ekim yapılır. Bazı hücre türlerinin pasajlaması yapılırken kullanılmış besi ortamından bir miktar tekrar besi

ortamına eklenir.

B-Hücrelerin Dondurulması Hücre kültürünün uzun süre devam etmesi

kontaminasyon ve üreme hızının düşüşü gibi olumsuzluklara yol açar.Bunun önüne geçebilmek için hücreler dondurulur.

Dondurma işleminin başarısı,çözdürme işleminin sonunda hücre canlılık oranının yüksek olması ile orantılıdır

Dondurma Prosedürü Su banyosu 37C ye ısıtılır. Hücre besi ortamı ve serum su banyosunda 37 C ye ısıtılır Hücre Pasajlanması protokolünde belirtildiği

şekilde hücre pelleti elde edilir. Hücre pelleti, 1 ml dondurma ortamı içinde süspande edilir ve cryovial adı verilen tüplere

konulur.Hücrelerin bulunduğu tüpler dondurma kabına konulur ve -80C ‘de bir gece bekletilir.

Ertesi gün sıvı azot tankına transfer edilir.

C- Hücrelerin çözülmesi Başka laboratuardan gönderilmiş yada üzerinde

yapılan çalışmaya daha sonra devam edilmek üzere dondurulmuş olan hücre kültürleri,yeni kültürler üretilmesi amacı ile tekrar çözülürler

• Kan lenfosit hücreleri için kültür süresi genellikle 72saattir. Fibroblast kültür süresi hücrelerin canlılık oranına,sayısına ve aktivasyonuna bağlı olarak değişmekteortalama 10-12 gün veya daha uzun sürebilmektedir. Kanlenfosit kültürü için 37°C’lik etüv, fibroblast kültürleri için37°C, %5 CO2’li etüv ortamına gerek vardır. Kültürün son2 saatinde hücreleri mitoz aşamasında durdurmak içinkültürlere kolsemid ilavesi yapılırFibroblast kültürlerindehücrelerin flask tabanında tutunarak çoğalmaları beklenir.• Hücre kolonileri belirli bir yoğunluğa ulaşana kadarkontrol edilir ve medium değişimleri yapılır.Yeterli hücreelde edileceğine karar verildiğinde harvest işlemi başlatılır

1. Örnek materyalin (tümör dokusu, biyopsi materyali, kemik iliği, periferik kan, veya “ascite”) laboratuara teslimi. 2. Materyalden enzimatik ve mekanik yollarla tümör hücre süspansiyonunun elde edilmesi.

3. Hücrelerin sayılması, 96 kuyucuklu plaklara (20.000 hücre/kuyucuk) ekimi ve takibinde hücrelerin hekimin karar verdiği veya Karar Lab.ın her tümör tipi için belirlenmiş ilaç panel listesindeki kemoterapötik ilaçların farmakokinetik verilere göre belirlenmiş 6 farklı dozu ile hücre kültür ortamında muamele edilmesi