Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije...
Transcript of Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije...
![Page 1: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/1.jpg)
Dobivanje i korištenje transgeničnih životinja
Genetski modificirani miševi - modeli za izučavanje humanih fizioloških i
patofizioloških procesa Prof.dr. Bojan Polić
Medicinski fakultet Sveučilišta u Rijeci
Riejka, svibanj 2013.
![Page 2: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/2.jpg)
Humani genom
![Page 3: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/3.jpg)
Pristupi u izučavanju funkcije gena u eukariotskim stanicama
In vitro • Transfekcija eukariotskih stanica - privremena (tranzijentna) - stabilna
In vivo • Transgenične životinje (u užem smislu)
• Ciljana mutacija gena („gene targeting”) – „knock out/in”
mutante miševa - konvencionalna - kondicionalna
![Page 4: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/4.jpg)
Transfekcija ili transdukcija eukariotskih stanica
• Transgen obično sadrži cDNA i regulacijske elemente (promotor , pojačivač, transkripcijski stop signal)
• DNA vektor sadrži i marker gen za pozitivnu selekciju
• Transgen se ubacuje u stanicu transfekcijom ( precipitacija CaCl2, elektroporacija, liposomi) ili transdukcijom (retrovirusni vektori)
• Transfekcija može biti tranzijentna (vektor smješten ekstrakromosomalno) ili stabilna (vektor nasumično integriran u genom stanice)
![Page 5: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/5.jpg)
Transfekcija stanica
![Page 6: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/6.jpg)
Transdukcija stanica
![Page 7: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/7.jpg)
Transfekcija i transdukcija stanica
• Nasumična integracija vektora (pozicioni efekt)
• Često višestruka integracija vektora
• Problematična razina izražaja gena (obično u suvišku)
• Moguća upotreba „dominantno-negativnih” transgena
• Ispitivanje funkcije gena ograničeno na vrstu tranficirane (transducirane) stanice
![Page 8: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/8.jpg)
Ispitivanje funkcije gena in vivo
Najčešći organizam: MIŠ
- sisavac - genom miša je približno velik kao humani (3 x 109 pb, < 25 000 gena) - mišji genom je sekvenciran - oko 99% mišjih gena ima svog homolognog partnera u humanom genomu - vrlo slična fiziologija humanoj - brzo se razmnožava - relativno mali troškovi održavanja (u odnosu na druge sisavce)
![Page 9: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/9.jpg)
Pristupi u izučavanju funkcije gena in vivo
In vitro • Transfekcija eukariotskih stanica - tranzijentna - stabilna
In vivo • Transgenične životinje (u užem smislu)
• Ciljana mutacija gena („gene targeting”) – „knock out/in”
mutante miševa - konvencionalna - kondicionalna
![Page 10: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/10.jpg)
Transgenični miševi
- Jaenisch et al. (1976), Gordon et al. (1980), Brinster et al. (1981), Constantini & Lacy (1981), Gordon & Ruddle (1981), E. Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981)
1. Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije
2. Fenotipska karakterizacija transgena - geni eksprimirani tijekom razvoja (Kessel & Gruss, 1990) - geni za hormone i receptore (Adams & Cory, 1991) - geni u imunološkom odgovoru (Hanahan, 1989; Goodnow,
1992) - virusni geni (Berns, 1991; Skowronski et al. 1993)
![Page 11: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/11.jpg)
Transgenični miševi
![Page 12: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/12.jpg)
Izolacija zigota miša (0.5 dana od oplodnje)
![Page 13: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/13.jpg)
Mikroinjiciranje transgena u muški pronukleus zigote
![Page 14: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/14.jpg)
Dobivanje transgeničnih miševa („klasični način”)
![Page 15: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/15.jpg)
Transgenični miševi („klasični način”)
• transgen obično sadrži cDNA i regulacijske elemente (promotor, pojačivač, transkripcijsku stop sekvencu)
• nasumična integracija transgena (moguće narušavanje funkcije drugih gena ili utjecaj drugih gena na transgen - pozicioni efekt!)
• često višestruka integracija transgena (na jednom ili više lokusa - pojačani izražaj!)
• Potrebno je pažljivo karakterizirati „foundere” kako bi se pronašla jedinka koja je odgovarajuća za daljnja istraživanja
![Page 16: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/16.jpg)
Pristupi u izučavanju funkcije gena in vivo
In vitro • Transfekcija eukariotskih stanica - privremena (tranzijentna) - stabilna
In vivo • Transgenične životinje (u užem smislu)
• Ciljana mutacija gena („gene targeting”) – „knock out/in”
mutante miševa - konvencionalna - kondicionalna
![Page 17: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/17.jpg)
Ciljana mutacija gena („gene targeting”)
![Page 18: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/18.jpg)
Vektor za ciljanu mutaciju gena
- Područja homologije koja omeđuju nehomolognu sekvencu DNK
- Marker gen za pozitivnu selekciju EMS (rezistencija na G418 (genenticin), higromicin, puromicin, itd.) smješten u području nehomologne sekvence (središnji dio vektora)
- Marker gen za negativnu selekciju (HSV tk; dt) smješten na kraju jedne od homolognih sekvenci – služi za kontraselekciju nasumično (nehomologno) integriranih vektora
![Page 19: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/19.jpg)
Ciljana mutacija gena („gene targeting”)
![Page 20: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/20.jpg)
Ciljana mutacija gena
Ciljanu mutaciju gena postižemo homolognom rekombinacijom vektora u mišjim embironalnim matičnim stanicama (EMS) ili „embryonic stem cells” – (ESC)
![Page 21: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/21.jpg)
Embrionalne matične stanice
- 1981.g. M. Evans et al. – prvi puta izolirali EM stanice iz teratoma, a potom iz blastociste
- 1984.g. A. Bradley – mikroinjicirao EMS u blastocistu i dobio kimere
- 1986.g. M. Capecchi; 1987/88.g. O. Smithies – prve ciljane mutacije u EMS
- 1989.g. O. Smithies i sur. (HPRT)- dobiveni prvi miševi ciljanom mutacijom gena (Jaenisch 1990, Rajewsky 1990)
2007.g. – M. Evans, M. Capecchi i O. Smithies – Nobelova nagrada
![Page 22: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/22.jpg)
Rani embrionalni razvoj miša
![Page 23: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/23.jpg)
Blastocista miša
![Page 24: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/24.jpg)
Potencijal diferencijacije EMS
![Page 25: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/25.jpg)
Izolacija EMS
![Page 26: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/26.jpg)
Uzgoj EMS
![Page 27: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/27.jpg)
Uzgoj EMS
![Page 28: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/28.jpg)
Embrionalne matične stanice (EMS)
Neke od EMS linija koje se koriste za ciljanu mutaciju: - E14, D3, AB1, R1, J1, CCE - izolirane iz 129 podsojeva miševa (H2-
b)
- Bruce 4, ES623, B6-3 – izolirane iz C57BL/6 miševa (H2-b) Albino BL6 EMS iz C57BL/6-tyr(c-2J) - EMS izolirane iz Balb/c miševa
![Page 29: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/29.jpg)
Transfekcija i selekcija EMS
• Pozitivna selekcija: G418 („Genenticin”), Puromicin, Higromicin, i dr. • Negativna selekcija: Ganciklovir, toksin difterije
![Page 30: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/30.jpg)
Mikroinjiciranje homolognih rekombinanti EMS u blastocistu
![Page 31: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/31.jpg)
Priprema donora i primaoca 3.5 dana starih embrija (blastociste)
Donori embrija fertilna ženka
X fertilni mužjak Početak parenja: ponedjeljak Vaginalni plak: utorak Blastociste: petak
Primaoci embrija fertilna ženka
X sterilni mužjak Početak parenja: utorak Vaginalni plak: srijeda Blastociste: petak
![Page 32: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/32.jpg)
Uvjeti pripreme donora i primaoca embrija
• Vivarij mora imati reguliran režim svjetlog i tamnog perioda (npr. 19 h – 5 h mrak i 5 h – 19 h svjetlo)
• Ženke pod konstantnim režimom svjetlog i tamnog perioda ovuliraju svakih 4-5 dana (3-5 h nakon početka mračnog perioda)
• Koncepcija obično nastupa u sredini mračnog perioda
• Ženke moraju biti starije od 6 tj. za prirodno parenje, a mlađe u slučaju hormonski stimulirane superovulacije
• Dobri uvjeti uzgoja (mir, adekvatna hrana, vlažnost, jačina svjetla, odsutnost patogena, higijena, itd.)
![Page 33: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/33.jpg)
Hormonski stimulirana superovulacija
• 3 – 5 tj. stare ženke (predpubertetno razdoblje)
• 48 h prije parenja injicira im se 5 i.u. PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) - FSH
• 2 - 6 h prije parenja injicira im se 5 i.u. hCG (humani korionski gonadotropin)
![Page 34: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/34.jpg)
Izolacija blastocisti miša
![Page 35: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/35.jpg)
Izolacija blastocisti miša
![Page 36: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/36.jpg)
Mikroinjiciranje homolognih rekombinanti EMS u blastocistu
![Page 37: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/37.jpg)
Prijenos embrija u uterus pseudotrudne ženke
![Page 38: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/38.jpg)
Prijenos embrija u uterus pseudotrudne ženke
![Page 39: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/39.jpg)
Prijenos embrija (embriotransfer) u uterus pseudotrudne ženke
![Page 40: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/40.jpg)
Kimerični miš
![Page 41: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/41.jpg)
Kimerični miš
![Page 42: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/42.jpg)
Prijenos mutacije („germ-line transmission”)
![Page 43: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/43.jpg)
Ciljana mutacija gena
Rezultat ciljane mutacije gena: • „knock-out” miševi – ciljana delecija ili
inaktivacija gena (potpuna ili parcijalna delecija gena)
• „knock-in” miševi – ciljano ubacivanje nekog
genskog elementa ili (trans)gena u točno određen genski lokus
![Page 44: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/44.jpg)
Ciljana mutacija gena
• Konvencionalna – mutacija gena je prisutna već od ranog embrionalnog razvoja u svim stanicama („klasični” knock-out i knock-in miševi)
• Kondicionalna – mutacija gena se može aktivirati specifično u pojedinim stanicama i/ili u željeno vrijeme
- neinducibilna (specifična i nespecifična) - inducibilna (specifična i nespecifična)
![Page 45: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/45.jpg)
NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)
![Page 46: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/46.jpg)
Zafirova et al. Immunity 2009
NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)
![Page 47: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/47.jpg)
NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)
Zafirova et al. Immunity 2009
![Page 48: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/48.jpg)
Zafirova et al. Immunity 2009
NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)
![Page 49: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/49.jpg)
Zafirova et al. Immunity 2009
NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)
![Page 50: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/50.jpg)
NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)
Zafirova et al. Immunity 2009
![Page 51: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/51.jpg)
NKG2D je važan za formiranje memorijskih CD8+ limfocita T
Felix M. Wensveen et al. submitted, 2013.
![Page 52: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/52.jpg)
Felix M. Wensveen et al. submitted, 2013.
NKG2D je važan za formiranje memorijskih CD8+ limfocita T
![Page 53: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/53.jpg)
NKG2D igra ulogu u atopisjkom odgovoru kože posredovanom γδ limfocitima T
Science, 334:1293, 2011.
![Page 54: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/54.jpg)
TCR konck-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)
![Page 55: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/55.jpg)
TCR knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)
Razvoj limfocita T u timusu
![Page 56: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/56.jpg)
TCR knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)
P. Mombaerts et al. Nature, 1992.
![Page 57: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/57.jpg)
Konvencionalna ciljana mutacija
Problem: • Izražaj mnogih gena je esencijalan za razvoj
embrija ili pojedinih stanica
• Inaktivacija (mutacija) istih u ranoj embrionalnoj fazi zaustavlja razvoj embrija ili stanica
• To onemogućava istraživanje fukcije istih gena u odraslom organizmu ili zrelim stanicama
![Page 58: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/58.jpg)
Ciljana mutacija gena
• Konvencionalna – mutacija gena je prisutna već od ranog embrionalnog razvoja u svim stanicama miša („klasični” knock-out i knock-in miševi)
• Kondicionalna – mutacija gena se može aktivirati specifično u pojedinim stanicama i/ili u željeno vrijeme
- neinducibilna (specifična i nespecifična) - inducibilna (specifična i nespecifična)
![Page 59: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/59.jpg)
Ciljana mutacija gena
Konvencionalna mutacija
Kondicionalna inducibilna mutacija
Kondicionalna neinducibilna mutacija
![Page 60: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/60.jpg)
Kondicionalna ciljana mutacija
Koriste se najčešće dva sustava: • Cre / loxP sustav (bakteriofag P1)
• Flp / FRT sustav (kvasac)
![Page 61: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/61.jpg)
Kondicionalna ciljana mutacija
Cre / loxP sustav: • Cre rekombinaza • loxP mjesta
loxP mjesto
![Page 62: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/62.jpg)
Kondicionalna ciljana mutacija
Da bismo ostvarili kondicionalnu mutaciju gena moramo imati dva miša (alela): • Miš koji sadrži gen ili dio gena omeđenog loxP
sekvencama („floksiran” gen)
• Miš koji sadrži Cre transgen (specifični i nespecifični, inducibilni i neinducibilini promotor)
Kondicionalnu mutaciju gena možemo ostvariti onda kada križamo ova dva miša, odnsno kada imamo oba alela (cre i flox) u istoj životinji
![Page 63: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/63.jpg)
Kondicionalna ciljana mutacija
Kondicionalna neinducibilna mutacija gena
![Page 64: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/64.jpg)
Kondicionalna ciljana mutacija (mutacija IKK kompleksa)
NF-κB
NF-κB
Akitvacija NF-κB puta
![Page 65: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/65.jpg)
Kondicionalna ciljana mutacija (neinducibilna)
IKK - kompleks
![Page 66: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/66.jpg)
Kondicionalna ciljana mutacija (neinducibilna)
![Page 67: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/67.jpg)
Incontinentia pigmenti
Incontinentia pigmenti • X vezano svojstvo • mutacija u Nemo
genu (Nemo dio IKK kompleksa
• rana smrtnost muške djece
![Page 68: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/68.jpg)
Nemo knock-out (konvencionalna ciljana mutacija)
M. Schmidt-Supprian et al., Mollecular Cell 2000
![Page 69: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/69.jpg)
Kondicionalna ciljana mutacija (neinducibilna)
![Page 70: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/70.jpg)
M. Pasparakis, Nature 2002
Kondicionalna ciljana mutacija IKK2 (neinducibilna)
K14 – Cre X
IKK2 fl/fl
![Page 71: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/71.jpg)
M. Pasparakis, Nature 2002
Kondicionalna ciljana mutacija IKK2 (neinducibilna)
![Page 72: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/72.jpg)
Kondicionalna ciljana mutacija
„Cre Zoo”
![Page 73: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/73.jpg)
Kondicionalna inducibilna ciljana mutacija
Science, 269:1427-1429, 1995
![Page 74: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/74.jpg)
Kondicionalna inducibilna ciljana mutacija
• Miš sa „floxiranim” željenim alelom x • Miš sa MxCre ili nekim drugim
inducibilnim transgenom (npr. CreERt2)
Mx promotor – inducira ga IFNα CreERt2 – aktivira se Tamoksifenom
![Page 75: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/75.jpg)
TCR knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)
P. Mombaerts et al. Nature 360:225, 1992.
![Page 76: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/76.jpg)
Kondicionalna inducibilna ciljana mutacija
Kako istražiti ulogu TCR-a u homeostazi zrelih naivnih i memorijskih limfocita T?
![Page 77: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/77.jpg)
Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi
PNAS 98:8744, 2001
![Page 78: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/78.jpg)
Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi
![Page 79: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/79.jpg)
Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi
![Page 80: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/80.jpg)
Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi
![Page 81: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/81.jpg)
Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi
![Page 82: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/82.jpg)
Ciljana mutacija gena
Rezultat ciljane mutacije gena: • „knock-out” miševi – ciljana nul-mutacija
gena
• „knock-in” miševi – ciljano ubacivanje nekog genskog elementa ili (trans)gena u točno određen genski lokus
![Page 83: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/83.jpg)
Knock-in miševi
• Ciljano ubacujemo neki genski element ili transgen u određeni genski lokus (ili želimo ekspresiju nekog ektopičnog gena pod specifičnim promotorom ili želimo kontroliran broj kopija i ekspresiju nekog transgena)
• Obično mijenjamo postojeću strukturu genskog lokusa
• Reporter miševi (GFP, RFP, YFP i dr.) ili Cre (Flp) ili DT(R) miševi su obično knock-in miševi
• Za knock-in transgena se često koriste Rosa-26 ili HPRT lokus, ali se može koristiti i bilo koji drugi genski lokus
![Page 84: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/84.jpg)
„Reporter” miševi
STOP GFP Rosa26 lokus knock-in
Cre CD19
CD19 Cre transgen
Specifična ekspresija GFP na limfocitima B
![Page 85: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/85.jpg)
GFP miš
Nespecifično izražen GFP (Deleter Cre + Reporter GFP)
![Page 86: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/86.jpg)
Kondicionalni transgen (knock-in)
„Brainbow” vektor
![Page 87: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/87.jpg)
Kondicionalni transgen (konck-in) („Brainbow”)
![Page 88: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/88.jpg)
Specifična i kondicionalna deplecija stanica in vivo
STOP DTR Rosa26 lokus knock-in
Cre CD19
CD19 Cre transgen
Specifična ekspresija difterija toksin receptora (DTR) na limfocitima B (miševi nemaju DTR!)
• Injiciranje difterija toksina (DT) dovodi do deplecije limfocita B
![Page 89: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/89.jpg)
Genetski modificirani miševi
http://www.emmanet.org/
European Mouse Mutant Archive (EMMA)
http://mousemutant.jax.org/
The Mouse Mutant Resource – The Jackson Laboratory
http://www.mmrrc.org/
Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC) – supported by NIH
http://www.findmice.org/
International Mouse Strain Resource (IMSR)
![Page 90: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/90.jpg)
Kloniranje miševa
![Page 91: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/91.jpg)
Miševi s klonalnim TCR i BCR dobiveni nuklearnim transferom
Nature, 415:1035, 2002
![Page 92: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/92.jpg)
Monokonski TCR i BCR miš dobiven nuklearnim transferom
![Page 93: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/93.jpg)
Kloniranje miševa
![Page 94: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/94.jpg)
Potencijal diferencijacije EMS
![Page 95: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/95.jpg)
Ciljani popravak gena
![Page 96: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/96.jpg)
Terapeutsko kloniranje miševa i popravak Rag2 mutacije
![Page 97: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/97.jpg)
Da li možemo upotrebom određenih faktora reprogramirati bilo koju somatsku stanicu čime bismo mogli zaobići nuklearni transfer?
![Page 98: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/98.jpg)
Inducirane pluripotentne matične stanice (iPMS)
![Page 99: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/99.jpg)
Inducirane pluripotentne matične stanice (iPMS)
![Page 100: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/100.jpg)
Miševi dobiveni komplementacijom tetraploidnih blastocisti s iPMS
![Page 101: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/101.jpg)
Inducirane pluripotentne matične stanice (iPMS)
Nobelova nagrada 2012.g. - Shinya Yamanaka - John B. Gurdon
![Page 102: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/102.jpg)
Reprogramiranje u iPMS je univerzalno
![Page 103: Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska](https://reader033.fdocuments.net/reader033/viewer/2022060416/5f144363a5842562742ad819/html5/thumbnails/103.jpg)
Primjena iPMS
Cell Stem Cell, 2012