Dizilim Analizi ile HLA Tiplendirimi (SBT) DALVA/KLARA DALVA.pdfaz, ancak otomasyona uygun değil,...
Transcript of Dizilim Analizi ile HLA Tiplendirimi (SBT) DALVA/KLARA DALVA.pdfaz, ancak otomasyona uygun değil,...
Dizilim Analizi ile HLA Tiplendirimi
(Sequence Based Typing, SBT)
Dr Klara Dalva
AÜTF Hematoloji BD DTL Laboratuvarı
Yüksek Çözünürlükte HLA Tiplendirimi
Akraba olmayan vericiden Kök Hücre nakillerinde
Hasta
Bankalara kayıtlı vericiler (adaylar/seçilmişlerde doğrulama)
Akrabadan Kök Hücre Nakillerinde
Ebeveynler incelenemediğinde
Aile verileri ile ailedeki 4 haplotip belirlenemediğinde
Düşük çözünürlük çalışmalarda “homozigot” şüphesi varken
Solid organ Nakillerinde
Özellikle antijen uyumsuzluklarının kabul edilebilir/edilemez olduğunun tespitinde (virtual XM)
Yüksek Çözünürlükte HLA tiplendirimiKullanılan Yöntemler-I
SSOP (daha kapsamlı kitler ile)
SSP (Her alel için ayrı bir çalışma kurarak)
Yukarıdaki yöntemlerin yeni bulunan alellere göre güncellenmesi, çok sayıda
prob, primer, kullanılması gerekir
SBT
Yeni Sekenslama Yöntemleri (Next Generation Sequencing )
Yüksek Çözünürlükte HLA tiplendirimiKullanılan Yöntemler-II
SSOP SSP SBT
(generic)
SBT (group
specifique)
Tüm eksonlar
değerlendirilebilir
- - + +
Rezolüsyon Orta/yüksek Orta/yüksek Yüksek Yüksek ve Allel
düzeyinde
Karmaşık sonuçlar Var * Daha az ** Var *** Nadir***
*: Prob sayısı arttırılarak, tek alel amplifikasyonu ile karmaşık sonuçlar azaltılabilir
**: Düşük çözünürlük yanı sıra her alel için ayrı çalışma(SSP) yapılırsa karmaşaaz, ancak otomasyona uygun değil, daha fazla DNA gerektiriyor, daha zahmetli
*** Ek çalışmalarla eklenen yeni verilerle (GSSP/ HARP, ek ekson, intron sekanslaması) karmaşık sonuçlar çözülebilir
Frederick Sanger
Sekanslama
1980 lerden 1990lara
Yavaş Otomatik Sekanslama
Klonlama PCR ürünü dizi analizi
Radyoizotoplar İzotop kullanmayanEnzim/kimya da iyleşme
“Manuel” Yazılımla Değerlendirme
Zor İnsan Genom Projesiile önemli ilerlemeler
Y2K
Market ufak Lokıus Spes. primerler
Alel sayısı artıyor Otomatik analizplatformları
HLA için kabul Heterozigot sekanslanmagörmesi Grup Spes. sekanslama
Maliyette düşme Yazılımda gelişmeler
Yeni NesilSekanslama
Günümüz
Donanım, Yazılım ,Kimya,Enzimler, Deneyim
Hangi Bölgeler İnceleniyor ?
CLASS I CLASS II
Kaynak: A.M Grenoble – France, R Blasczyk, Hannover – Germany 2007 Teaching Session 2
Antigen Recognition Site , ARS
Antigen Recognition Site , ARS
SBT Yöntemi- Basamaklar
ANALİZ
1 DNA İzolasyonu
Rutin çalışmalarda kan ve ağız çalkantı suyu, «buccal smear» ile toplanan hücreler kullanılabilir
(Hematolojik malinitelerde LOH, alel mutasyonları olabilir. Aile verileri, gerekirse farklı materyalle yeniden tiplendirme önem taşıyor ! )
Farklı yöntemler kullanılabilir
Haplotipe Özgün Ekstraksyon yapılması maliyeti arttırsa dakarmaşayı çok azaltır
DNA miktar/ kalitesi önemli
A260/A280:1,8-2,0 <1,5 iken ≈ %50 prot kontaminasyonu?
Homojen olmalı(Fenol ekstraksyonu ile sorun olabilir)
Genellikle 50-100 ng/mL konsantrasyonda kullanılır
Elüsyon tamponu: Kit ile uyumlu mu? (PCR inhibisyonu?)
2 PCR ile Amplifikasyon
“Generic”: Tek bir tüpte tek bir lokusa özgün problar ile Multiplexamplifikasyon yapılır
Class I için en az Exon 2 ve 3 , 1-6 ya da hepsini içeren kitler
Class II için en az Exon 2, exon 3, hepsini içeren kitler
Generic(biallelik) sekanslamayı takiben
Grup spesifik sekanslama (GSSP, HARPs.. ile mono allelik sekanslama) yapılabilir
Grup spesifik Amplifikasyon (Ör: -B için 16 grup, -DRB1 için 16 grup için amp. yapılır)
Amplifikasyon ürününde tespit edilen alele göre her alel ayrı sekanslanır
Alel spesifik amplifikasyon
Mevcut iki basamaklı sonuçlara göre (ör DRB1*04, DRB1*15 için ayrı ayrı) amplifikasyon ve takiben sekanslama yapılır
Çalışma nasıl olsun? Peşin? Taksitli?
2 PCR ile Amplifikasyon Türü
A*02:01/A*03:01
HLA –A lokus PCR “Multiple” Grup Spesifik PCR
A1- A2+ A3+ A24- A68- A80-A*02:01 ve A*03:01 aynı reaksyonda amplifiye olur
A2 ve A3 e özgün 2 farklı Kalıp ile(homozigot)DNA sekanslaması yapılırHLAA*02:01/A*03:01 değil de A*02:01/A*02:05 olsaydı heterozigotbir sekanslama görülür
A*02:01 A*03:01
İki allel birlikte sekanslanırBazan net, bazan karmaşık sonuçlar
A*02:01/A*03:01 A*02:01/A*03:01veyaA*02:24/A*03:17
SSP veya GSSP
Ile çözülür
Peşin
Taksitli
2 Biallelik Amplifikasyonda kullanılanprimerler : Örnek: Üretici A, Class I
Amplifikasyon primeri (tek tüpte)
Sekanslama primeri (her primer farklı tüpte, 6 tüp)
GSSP primeri (karmaşaya göre yazılım öneriyor ,geniş bir alanda
lokalize olabilir
R1 F13
45 7
69
8 10
a,b,c,d,e,f,g…..
h,ı,j,k,l,m………
2 Piyasada bulunan kitlere örnekler (core kit)
2 PCR ürünlerinin kontrol edilmesi
3 PCR Ürünlerinin Temizlenmesi
Daha sonraki sekanslama basamağını etkilememesi içinkullanılmayan PCR primerleri ve dNTP ler uzaklaştırılır
Bu amaçla
Kolonlar kullanarak filtreleme
ExoSAP-IT™ (20 dk 37°takiben 15-20 dk 80° ile inaktivasyon)
Exonuclease I: Kalan primerleri parçalar
Shrimp Alkaline Phosphatase: Kalan dNTP leri parçalar
****Bu işlemden önce jel elektroforezi ile amplifikasyonkontrol edilmelidir . Amplikon oluşmuşsa temizleme işlemi ile devam edilir Oluşmamışsa PCR işlemi tekrarlanır
3 PCR ürününün temizlenme sorunu
Temizlenmiş
Temizlenmiş
Orijinal
Orijinal
3 PCR ürününün temizlenme sorunu
ExoSAPyetersiz
Temiz
Sekanslama primerlerinin kalitesi ile temizlenmeyen ürünlerin
olumsuz etkisi baskılanabilir
4 Sekanslama Reaksiyonu
Kaynak: Dong -Feng Chen, SBT The gold standart for HLA high resolution typing, ABHI-U sunusu
dNTP/ddNTP: ≈100/1, ddNTP ler floresan işaretli
4 dNTP ve ddNTP Farkı
Kaynak: Dong -Feng Chen, SBT The gold standart for HLA high resolution typing, ABHI-U sunusu
4 PCR Amplifikasyonu - Sekanslama ReaksyonuFarklar
PCR Amplifikasyonu Sekanslama Reaksiyonu
Primer Her reaksyonda bir çift
primer (forward ve reverse
aynı tüpte )
Her reaksiyon için tek
primer (forward ve reverse
ayrı tüpte)
dNTP Kullanılır Kullanılır
ddNTP Kullanılmaz Kullanılır
“Thermal
Cycling”
Uygulanır Uygulanır
Çalışma Alanı Pre-PCR Post_PCR
Ürün Çift sarmal Çift sarmal (denaturasyon
ile tek sarmal hazırlanıp cihaza
yüklenir )
4 Sekanslanan Bölgeler
4 Sekanslamada kullanılan primerler :Örnek: Üretici A, Class I
Amplifikasyon primeri (tek tüpte)
Sekanslama primeri (her primer farklı tüpte, 6 tüp)
GSSP primeri (karmaşaya göre yazılım öneriyor ,
geniş bir alanda lokalize olabilir
R1 F13
4
5 7
6
9
8 10
a,
b,c,d,e,f,g……
…
h,ı,j,k,l,m………
Sekanslanan Bölgeler- Karmaşık Sonuçlar
Karmaşık Sorun Örneği
5 Sekanslanan Ürünün Temizlenmesi
Bağlanmamış floresan işaretli ddNTP ler ortamdanuzaklaştırılır
Kalırlarsa Elektroforez sırasında DNA fragmanları ile birliktehareket ederek veri kirliliğine sebep olurlar
En sık kullanılan iki yöntem
Jel filtrasyonu (Sephadex)
Etanol ile çöktürme
Bağlanmayan “big dye” etanolde kalır fragmanlar çöker
Küçük fragmanlar için sodyum asetat eklenir
6 Ürünlerin Elektroforez için Cihaza
Yüklenmesi
DNA Fragmanlarının polimerdeki hareketi
Floresan Dedektörü (CD kamera)
Katot
6 Kapiller Elektroforez
Cihazın performansı önemli
“Spatial Calibration”
Her kapiller için Sinyal Pixel pozisyonlarının belirlenmesi
“Spectral Calibration”
Floresan sinyallerin ayırımı (üst üste binmemesi) için gerekli
Verilerin Analizi: Prensip
Elde edilen dizilimler, HLA veri tabanında bulunan sekanslar (Consensus) ile karşılaştırılarak olası aleller tespit edilir
Analiz aşamasında tüm dizilimin gözden geçirilmeli (genellikle hata /tutarsızlık şüphesi olan yerlerde kılavuz işaretler var)
“Concensus” ile farklı olan pozisyonların kontrolü, düzeltilmesi
Heterozigot pozisyonların kontrolü
“forward” ve “reverse” dizilimler arasında tutarsızlık kontrolü, bazların gerekiyorsa güvenilir olan veriye göre düzeltilmesi
International Union of Biochemistry
Nomenclature Committee (IUB) Kodları
R= A ve G (puRine)
Y= C ve T (pYrimidine)
K= G ve T (Keto)
M= A ve C (aMino)
S= G ve C (Strong, 3 Hidrojen bağı)
W= A ve T (Weak, 2 Hidrojen bağı)
N= aNy base (A veya T veya C veya T)
Verilerin Analizi
Kullanılan yazılım Programları farklılıklar taşır
Olası Alel seçenekleri özetleniyor (varsa MM sırasına göre)
Yapılan tüm müdahaleler izlenebiliyor
Bir sonuç raporu oluşturulur
Önerilen ek çalışmalar bildirilebilir ( ek olarak hangi lokus bilgisi gerekli, kullanılması önerilen GSSP)
Sık (CWD) ve sık görülmeyen alellere göre veriler sınıflanabilir !
Sonuçlar NMDP kodları ile verilebilir !
ARS bölgesi ortak olan aleller birlikte sınıflanabilir(G group) !
FARK GÖSTERENLER
TÜMÜNDE ORTAK
Karşılaşılan Problemlerin Kaynakları
Bir alelin tercihli amplifikasyonu
Kullanılan Sekanslama primerlerinin bağlanmasını etkileyen yeni bir polimorfizm
farklı bir kit ile farklı verim alınabilir
HLA genlerindeki somatik mutasyonlar LOH ( tüm bir haplotip ya da tek bir lokusta olabilir, farklı
yöntemlerle farklı sonuçlar alınabilir SBT daha duyarlı)
HLA Allel polimorfizmi ( ör: indel mutasyonları, ortaya çıkan Null bir alel)
Karmaşık Sonuçlar (ambiguity)
Tercihli amplifikasyon örneği: C*7 ve 17 olan bir bireyde C*17 de amp. avantajı var
Karmaşık Sonuçların Sebepleri
Dizilim analizi yapılan bölgede gen sekanslarının ortak olması (Ör: C*04:01-C*04:01N DRB1*14:01-14:54
Bu durum “ ifade edilen iki alel” ya da “ifade edilen bir alel ile null bir alel” olarak karşımıza çıkabilir
Bu sorun genellikle diğer eksonları/intronları sekanslayarak çözülür
Serolojik tipleme, SSP ile ek testler yardımcı olur
Belli motiflerin yer değiştirmiş olabilmesi olasılığı (cis-trans) nedeniylegörülen karmaşalar
Mono allelik sekanslama (haplotip spesifik ekstraksyon)
Allelerden birine özel primerlerin kullanılması (monoalleliksekanslama)
grup spesifik amplifikasyona ek olarak HARP; GSSP kullanımı
En başından seçilmiş bir alelle özgün sekanslama reaksiyonu
Ortak Gen Sekansları
Agnés Moine, Grenoble - France 2007 Teaching Session 2
ARS de Ortak Gen Sekansı -Örnekler
Alel 1 Null Alel Polimorfizmyerleşimi
A*0101 A*01010102N Intron 2
A*0301 A*01010102N İntron 4
A*2901 A*29010102N İntron 4
A*6801 A*6811N Exon 1
B*1501 B*15010102N Intron 1
B*1801 B*1817N Exon
B*4402 B*4419N Exon 1
C*0301 C*0303N Exon 1
C*0401
C*0409N Exon 7
Agnés Moine, Grenoble - France 2007 Teaching Session 2
Alel 1 İfade edilenAlel 2
Polimorfizmyerleşimi
A*7401 A*7402 Exon 1
B*0705 B*0706 Exon 5
B*2705 B*2713 Exon 1
B*8101 B*8102 Exon 1
C*0501 C*0503 Exon 4
C*0701 C*0706, 0718 Exon5,6
C*0704 C*0711 Exon7
DRB1*1201 DRB1*1206, 1210
Exon 1 ve3
DRB1*1401 DRB1*1454 Exon 3
Motif Pozisyonlarının Önemi
Motiflerin yer değiştirme olasılığı
“Generic” Karmaşa Allelik Karmaşa
A B C DRB1
01/3604 07/4808 05/0802 03/1327
03/3204 35/53 05/0709 11/13
25/6601 38/39 07/0802 13/14
25/2603 4418/4501/5002
25/2601 4901/5001
32/7406 51/78
51/5301
52/7805
5602/5610
%9,7 %5,77 %4,34 %2,7 AM, Grenoble – France 2007 EFI Teaching Session 2
A B C DRB1
%79,7 %80,46 %54,6 %96,7
Özet
SBT, halen Yüksek çözünürlükte HLA tiplendirimi için kabuledilen Referans Yöntemdir
Seçilecek olan yöntem ve kullanılacak donanım, amaca/kaynaklara göre farklılıklar gösterebilir
Seri çalışmalar için Otomasyon mümkündür
SBT ile çözülmesi zaman alan soruların çok yakın gelecekte NGS ile çözümlenmesi mümkün olabilecektir
Diğer HLA tiplendirme yöntemlerinde olduğu gibi Çalışma-Analiz ve Sonuçların Onaylanmasında başarılı olmak,deneyim- konu ve incelenen toplumlar hakkında bilgisahibi olmayı gerektirir