Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

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Universidade Estadual do Ceará Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO FRENTE A DIFERENTES CEPAS DE MICROSPORUM CANIS, CANDIDA SPP E MALASSEZIA PACHYDERMATIS Fortaleza-Ceará 2005

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Universidade Estadual do Ceará

Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO

FRENTE A DIFERENTES CEPAS DE MICROSPORUM CANIS,

CANDIDA SPP E MALASSEZIA PACHYDERMATIS

Fortaleza-Ceará 2005

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Universidade Estadual do Ceará

Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO

FRENTE A DIFERENTES CEPAS DE MICROSPORUM CANIS,

CANDIDA SPP E MALASSEZIA PACHYDERMATIS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de

Veterinária da Universidade Estadual do Ceará como

requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre

em Ciências Veterinárias.

Área de concentração: Reprodução e Sanidade

Animal

Orientador: Dra. Selene Maia de Morais

Co-orientador: Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha

Fortaleza - Ceará

2005

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Universidade Estadual do Ceará Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa

Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias

AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIFÚNGICO DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE PLANTAS DO NORDESTE BRASILEIRO FRENTE A DIFERENTES

CEPAS DE Microsporum canis, Candida spp E Malassezia

pachidermatis

Autora: Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle

Defesa em _____/____/________ Conceito:

Nota:

Banca Examinadora

___________________________________________

Selene Maia de Morais, Profa. Dra.

Orientadora (UECE)

Nilberto R. F. do Nascimento, Prof. Dr.

Examinador (UECE)

Marcos Fábio Gadelha Rocha, Prof. Dr.

Co-Orientador/Examinador (UECE)

______________________________________ ______________________________________

Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante, Dra.

Examinadora (UFC)

Page 4: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

iv

F677a Fontenelle, Raquel Oliveira dos Santos

Avaliação do potencial antifúngico de óleos essenciais

de plantas do nordeste brasileiro frente a diferentes cepas de

dermatófitos e leveduras / Raquel Oliveira dos Santos Fontenelle –

Fortaleza, 2005.

102 p.; il.

Orientadora: Profa. Dra. Selene Maia de Morais.

Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) –

Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária.

1. Óleos essenciais 2. Atividade antifúngica 3.

Toxicidade 4. Croton 5. Lippia I. Universidade Estadual do Ceará,

Faculdade de Veterinária. II. Título.

CDD: 815.53

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v

DEDICO,

A Deus, razão do meu existir e ao meu marido Joffre Fontenelle Filho, por estar ao meu lado em todos os momentos.

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vi

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus e a todos aqueles que tanto me ajudaram, durante todo o

curso.

À professora Dra. Selene Maia de Morais, por sua orientação e dedicação na

realização deste trabalho.

Ao professor Dr. Marcos Fábio Gadelha Rocha, pela dedicação, compreensão e

amizade oferecida neste trabalho, e pela co-orientação.

Ao Professor Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento, pela paciência,

orientação e principalmente pela sua simplicidade como ser humano.

A minha banca examinadora composta pela Dra. Selene Maia de Morais, pelos

Dr(s) Marcos Fábio Gadelha Rocha, Nilberto Robson Falcão do Nascimento e pela Dra.

Raimunda Sâmia Nogueira Brilhante.

Aos professores do PPGCV, pela paciência e dedicação.

As Dra. Marta Regina Kerntopf e Adriana Rocha Tomé, pela contribuição à

realização deste trabalho.

A todos os alunos dos laboratórios de Química em Produtos Naturais, em

especial à aluna Cristiane Maria Souza de Castro que muito me ajudou nos

experimentos.

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vii

A todos os amigos do Centro Especializado em Micologia Médica, que me

ajudaram na realização desse projeto e estiveram ao meu lado durante este período

(Carolina Sidrim de Paula Cavalcante, Rossana Aguiar Cordeiro e Francisco Atualpa

Soares Júnior) em especial, a Érika Helena Salles de Brito por todos os ensinamentos e

amizade.

A todos os colegas do mestrado em Ciência Veterinárias do PPGCV, que

fizeram parte da minha vida durante estes dois anos. E aqueles que fazem parte do

PPGCV.

A Alzenira e Adriana Albuquerque, secretárias do PPGCV, que em muito me

ajudaram durante todo o tempo de mestrado.

A CAPES, pelo financiamento da bolsa durante o período de dois anos.

A meu marido, Joffre Fontenelle Filho, pelo grande incentivo e força.

Aos meus pais, Luís Gonzaga Rodrigues dos Santos e Edvirgens Moreira

Oliveira dos Santos, pelo apoio, carinho e incentivo.

A meus irmãos, Rute Oliveira dos Santos e Moisês Oliveira dos Santos por todo

o apoio.

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viii

RESUMO

Produtos naturais à base de plantas medicinais vêm sendo estudados ao longo dos anos e a

constatação de sua eficácia tem sido demonstrada por pesquisadores de todo mundo. As micoses

constituem um sério problema, especialmente em lugares de clima tropical e subtropical, os

dermatófitos e as Candida spp são os patógenos mais freqüentes destas enfermidades. O

objetivo deste trabalho foi investigar a atividade antifúngica de óleos essenciais de plantas do

nordeste brasileiro frente a diferentes cepas de dermatófitos (Microsporum canis) e leveduras

(Candida albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis) que acometem animais;

determinar o grupo de fungos mais sensíveis às plantas utilizadas; averiguar os componentes

químicos que se encontram em maior quantidade nas diversas plantas que apresentaram

atividade antifúngica e avaliar a toxicidade através da dose letal média (DL50) por via

intraperitoneal e oral em camundongos. Para tanto as plantas foram coletadas e identificadas,

posteriormente os óleos essenciais foram obtidos e seus constituintes analisados por

cromatografia de gás e espectrometria de massa. Os fungos foram recuperados da micoteca do

Centro Especializado em Micologia Médica e a viabilidade dos mesmos foi avaliada através de

testes laboratoriais. A atividade antifúngica foi averiguada através do método de difusão em

ágar. Os óleos essenciais obtidos do Croton nepetaefolius e do Croton argyrophylloides

demonstraram atividade apenas contra o M. canis enquanto que os óleos essenciais do Croton

zehntneri e da Lippia sidoides foram efetivos contra todos os fungos testados apresentando dose-

dependência. O óleo essencial da Lippia sidoides foi mais potente que os óleos essenciais das

espécies de Croton. Nas maiores concentrações o óleo essencial da L. sidoides inibiu

completamente o crescimento dos fungos. Este óleo essencial apresentou o timol (59,65%) e o

cariofileno (10,60%) como maiores constituintes. A toxicidade aguda de todos os óleos

essenciais até 3 g/Kg por via oral foi desprovida de qualquer toxicidade. A administração oral de

100 mg/Kg durante 30 dias não induziu nenhuma alteração histopatológica, hematológica ou

bioquímica significativa. Desta forma, devido à alta eficácia e a baixa toxicidade, os óleos

essenciais do Croton zehntneri e da Lippia sidoides constituem fontes importantes de compostos

antifúngicos que podem ser úteis no tratamento de micoses em animais.

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ABSTRACT

Mycoses are serious public health concern specially in subtropical and tropical regions with

dermatophytes and yeast infections being the most common pathogens. This work was

undertaken in order to test whether essential oils extracted from the leaves of Croton species

(Croton nepetaefolius, Croton argyrophylloides and Croton zehntneri) or from Lippia sidoides

would represent a potential therapeutic alternative for this infectious threats. Thase plants are

used in the folk medicine to treat dermatological problems and in the present study were tested

them in vitro against several strains of Microsporum canis, Candida albicans, Candida tropicalis

e Malassezia pachydermatis and also evaluated for its acute and sub-chronic toxicological

effects. The chemical constituents of the essential oils were determined by GL-Chromatography

coupled to mass espectroscopy. The essential oils obtained from Croton nepetaefolius and Croton

argyrophylloides were effective only against M. canis while the essential oils of Croton zehntneri

and Lippia sidoides were effective against all tested strains in a dose-related way. Lippia sidoides

was the most efficient being at the higher doses used (i.e. 75 and 100 mg/mL) as effective as the

positive controls used griseofulvin for M. canis, itraconazol for M. pachydermatis and

amphotericin B. Lippia sidoides essential oil at these doses sometimes completely inhibited fungi

growth. This essential oil has thymol (59.6%) and caryophyllene (10.6%) as major constituents.

The acute administration of all essential oils up to 3 g/Kg by the oral route to mice was devoided

of overt toxicity. The oral administration of 100 mg/Kg to rats during 30 days did not induce

histopathological, haemathological or serum biochemical alterations. Therefore, due to its high

efficacy and low toxicity the essential oils of Croton zehntneri and Lippia sidoides are promising

drugs in the search of new antifungal drugs.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Colônia de Microsporum canis................................................................................. 11

Figura 2: Colônias de Candida spp. ..........................................................................................12

Figura 3: Blastoconídios de levedura. .......................................................................................12

Figura 4: Colônia típica de Malassezia spp. ..............................................................................14

Figura 5: Esquema de uma extração do óleo essencial............................................................. 33

Figura 6: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100 mg/mL) de OECa testada,

perante cepa de Microsporum canis........................................................................................... 47

Figura 7: Halo de inibição produzido pela menor concentração (25 mg/mL) do OELs perante

cepa de Microsporum canis....................................................................................................... 47

Figura 8: Halo de inibição produzido pela maior concentração do OECn (100mg/mL) perante

cepa de Microsporum canis....................................................................................................... 47

Figura 9: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100mg/mL) do OECn perante

cepa de Microsporum canis....................................................................................................... 48

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Classes de toxicidade aguda de substâncias administradas a ratos por diferentes vias e

extrapolação para toxicidade humana ........................................................................................... 17

Tabela 2: Análise química das três espécies de Croton e da Lippia sidoides.............................. 43

Tabela 3: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides

contra M. canis ............................................................................................................................. 45

Tabela 4: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides

contra Candida spp ...................................................................................................................... 46

Tabela 5: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides

contra M. pachydermatis .............................................................................................................. 46

Tabela 6: Peso dos ratos após tratamento com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia

sidoides durante 30 dias................................................................................................................. 49

Tabela 7: Parâmetros Bioquímicos de ratos Wistar antes do tratamento, após 15 dias e 30 dias do

tratamento com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo durante 30

dias................................................................................................................................................ 49

Tabela 8: Parâmetros hematológicos de ratos Wistar antes e depois de tratamento oral com

117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo durante 30 dias.......................... 50

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LISTA DE ABREVIATURAS

ALT Alanina aminotransferase

AST Aspartato aminotransferase

CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular média

DL50 Dose letal média

DMSO Dimetil-sulfóxido

HCM Hemoglobina corpuscular média

K.I. Índice de retenção na coluna do cromatógrafo

IT Inibição total

NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards

OELs Óleo Essencial da Lippia sidoides

OECn Óleo Essencial do Croton nepetaefolius

OECa Óleo Essencial do Croton argyrophylloides

OECz Óleo Essencial do Croton zehntneri

OE Óleo Essencial

TGO Transaminase glutâmica oxalacética

TGP Transaminase glutâmica pirúvica

TW Tween

UFC/mL Unidades Formadoras de Colônia por mililitro

VCM Volume corpuscular médio

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 2

2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................................ 4

2.1 Plantas medicinais......................................................................................................... 4

2.1.1 Importância das plantas medicinais.............................................................................. 4

2.1.2 Óleo essencial............................................................................................................... 6

2.2 Plantas medicinais estudadas nesta dissertação......................................................... 7

2.2.1 Croton spp. .................................................................................................................. 7

2.2.2 Lippia sidoides.............................................................................................................. 8

2.3 Fungos: aspectos gerais ................................................................................................. 9

2.3.1 Dermatófitos................................................................................................................ 10

2.3.2 Leveduras..................................................................................................................... 11

2.4 Estudos de toxicidade................................................................................................... 15

2.4.1 Toxicidade aguda......................................................................................................... 16

2.4.2 Toxicidade sub-crônica ............................................................................................... 18

2.4.2.1 Avaliação Bioquímica.............................................................................................. 18

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xv

2.4.2.2 Avaliação Hematológica.......................................................................................... 21

3 JUSTIFICATIVA .......................................................................................................... 25

4 HIPÓTESE ...................................................................................................................... 27

5 OBJETIVOS.................................................................................................................... 29

5.1 Objetivo Geral.............................................................................................................. 29

5.2 Objetivos Específicos................................................................................................... 29

6 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 32

6.1 Coleta das plantas........................................................................................................ 32

6.2 Obtenção dos óleos essenciais..................................................................................... 32

6.3 Análise da composição química dos compostos vegetais......................................... 33

6.4 Determinação da dose letal média (DL50) ................................................................ 34

6.5 Toxicidade sub-crônica............................................................................................... 34

6.6 Microrganismos.......................................................................................................... 35

6.6.1 Recuperação das cepas.............................................................................................. 35

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xvi

6.6.2 Identificação laboratorial........................................................................................... 36

6.6.2.1 Candida spp............................................................................................................ 36

6.6.2.2 Malassezia pachydermatis...................................................................................... 37

6.6.2.3 Dermatófitos........................................................................................................... 38

6.7 Atividade antifúngica................................................................................................. 40

6.7.1 Método de difusão em ágar....................................................................................... 40

7 RESULTADOS.............................................................................................................. 42

7.1 Análise dos óleos essenciais........................................................................................ 42

7.2 Atividade antimicrobiana .......................................................................................... 44

7.3 Toxicidade.................................................................................................................... 48

8 DISCUSSÃO................................................................................................................... 52

9 CONCLUSÕES.............................................................................................................. 56

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA......................................................................... 57

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xvii

ANEXO.............................................................................................................................. 67

Artigo: Antifungal and Toxicologial evaluation of essential oils from Northeast Brazil.. 68

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Introdução

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1 INTRODUÇÃO

As plantas medicinais, seus óleos essenciais e demais compostos, constituem

fonte viável de medicamentos para enfermidades das mais variadas possíveis. Essas plantas

surgem como alternativa em locais onde a falta de medicamentos é uma constante e o seu

custo é elevado. Aliados a esses fatores, a resistência a antibióticos e a toxicidade durante

tratamentos prolongados com várias drogas antifúngicas têm sido a razão para uma

extensiva procura de novas drogas para a terapêutica de infecções causadas por fungos.

Poucos desses produtos, no entanto, foram estudados de acordo com protocolos científicos

modernos e adequados. Portanto, a validação científica é essencial ao seu uso na espécie

humana e animal como medicamentos alternativos. Muitas dessas plantas são

popularmente usadas no tratamento de micoses.

Doenças infecciosas causadas por fungos representam um problema crítico

para a saúde pública. Nos últimos anos, ocorreu uma incidência crescente de infecções

fúngicas em virtude do aumento de indivíduos com o sistema imunológico comprometido

tais como: pacientes transplantados, acometidos por câncer ou infetados com o HIV.

Com o aumento na freqüência das micoses e do reduzido número de drogas

para o tratamento destas enfermidades, a realização de testes de sensibilidade se faz mais

necessária, o que torna a escolha da terapêutica, baseada na droga, mais eficaz, cada vez

mais adequada e eficiente.

Várias drogas já foram e continuam sendo testadas contra diferentes espécies

fúngicas pertencentes aos gêneros Candida e Malassezia, assim como para fungos

filamentosos, dentre elas, terbinafina, itraconazol, fluconazol e cetoconazol. Ademais, bons

resultados são obtidos a partir de estudos desenvolvidos com novas drogas antifúngicas,

como: voriconazol, albaconazol, ravuconazol, posaconazol e caspofungina.

Nos últimos anos, o interesse pela fitoterapia tem crescido acentuadamente em

todo o mundo. Além dos sucessos quase que “miraculosos” e dos aspectos históricos

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fascinantes da medicina tradicional, notícias sobre descobertas de produtos naturais que

beneficiam a sociedade, de uma forma ou de outra, se tornaram cada vez mais freqüentes.

Os inúmeros problemas associados à terapia convencional foram os responsáveis pelo

crescimento nas pesquisas sobre plantas medicinais e seu conseqüente aumento na

produção e venda desses remédios.

Dessa forma, para uma eficiente investigação da atividade de compostos de

plantas usadas na medicina popular do Nordeste, contra espécies de dermatófitos e

leveduras, faz-se necessário a realização de testes de sensibilidade in vitro, correlacionando

com resultados in vivo. Nesta dissertação, foram avaliados a atividade antifúngica dos

óleos essenciais do Croton zenhtneri, Croton nepetaefolius, Croton argyrophylloides e da

Lippia sidoides contra o dermatófito (Microsporum canis) e as leveduras (Candida

albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis) que acometem animais.

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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Plantas medicinais

2.1.1 Importância das plantas medicinais

A fitoterapia pode ser historicamente definida como a ciência que trata dos

problemas de saúde, utilizando os vegetais (fitocomplexos), sendo contemporânea ao início

da civilização. As plantas são tradicionalmente usadas por populações de todos os

continentes no controle de doenças e pragas. Os egípcios já faziam uso medicinal dos

vegetais. Algumas das espécies que eles utilizavam continuam empregadas até os dias de

hoje, tais como: Papaver somniferum (papoula), Scilla maritima (scila), Aloe Vera

(babosa) e Ricinus communis (óleo de rícino) (Lavabre, 1993).

No Brasil, o comércio de ervas medicinais começou com os índios e,

atualmente, em qualquer cidade, é possível comprar plantas, pós e ungüentos em mercados

e também nas ruas. Essa alternativa é utilizada tanto dentro de um contexto cultural, na

medicina popular, quanto na forma de fitoterápicos, pelo fato de essas plantas serem fontes

importantes de produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais constituem

modelos para a síntese de um grande número de fármacos, revelando nestes produtos alta

diversidade em termos de estrutura e de propriedades físico-química e biológica (Wall &

Wani, 1996).

Para enfatizar o benefício de certas plantas com propriedades medicinais, basta

recordar que o princípio ativo do comprimido símbolo da alopatia, a aspirina, ácido acetil-

salicílico (AAS) foi sintetizada, por Gilm, em 1859, baseado na salicina, substância ativa

de Salix alba L. (Calixto et al., 2000).

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22

Apesar do aumento dos estudos sobre plantas medicinais, somente de 15 a 17%

destas foram estudadas quanto ao seu potencial medicinal (Soejarto, 1996). Considerando a

grande biodiversidade do Nordeste brasileiro, esse número poderia ser bem maior (Rabelo,

2003).

A automedicação “milagrosa” com plantas medicinais, chegando ao extremo

de substituir terapias tradicionais em doenças graves, é prática bastante utilizada tanto em

populações de baixa renda, como único lenitivo para seus males, bem como nas camadas

mais privilegiadas que gozam de facilidade sanitária e pronto atendimento médico,

somente por puro modismo ou sob influência de grande exploração comercial. Assim, é

necessária extrema atenção ao uso não controlado das plantas medicinais e seus devidos

estudos de toxicidade para garantir o perfeito uso na espécie humana (Rabelo, 2003).

O Brasil possui sérios problemas de saúde pública, principalmente na região

Nordeste em razão do baixo poder aquisitivo de grande parte da população local, o alto

custo dos remédios torna-os inacessíveis até mesmo nos mais simples casos, como dores

agudas e/ou crônicas, febres e gripes (Rabelo, 2003). Portanto, o uso popular das plantas

medicinais foi o primeiro passo para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos de

baixo custo para uma região tão carente de recursos financeiros e, por outro lado, tão rica

em flora, reunindo milhares de espécies vegetais distintas (Rabelo, 2003). É válido

ressaltar, contudo, que a planta dita medicinal, muitas vezes, chega às mãos do usuário

despojada de qualquer informação fidedigna: há desconhecimento total da época da coleta,

do especialista (se foi um especialista) que a colheu, dos cuidados tomados durante os

processos de armazenamento, secagem e moagem, da ausência de contaminação por

fungos e outros microrganismos, se é tóxica ou não. Tudo isso torna impossível à previsão

de eventuais efeitos colaterais que a planta possa provocar, porém, nada haveria a objetar

ao receituário de plantas integrais ou de seus extratos brutos, desde que se tratasse de

produtos obtidos sob rigoroso controle (Ribeiro, 1993).

Page 23: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

23

2.1.2 Óleo Essencial

Os óleos essenciais (OE) são produtos de composição complexa extraídos de

plantas por vários processos, sendo o mais utilizado a destilação por arraste em vapor

d’água (Craveiro et al., 1976; Bruneton, 1995). Essas plantas têm um conteúdo de óleo

essencial em torno de 0,1 a 0,5% e, raramente, de 1 a 5% do peso verde (Bruneton, 1995).

Embora sua maior utilização ocorra nas áreas de alimentos (condimentos

aromatizantes de alimentos e bebidas), cosméticos (perfumes e produtos de higiene) e

também em farmácias, drogas vegetais ricas em óleos essenciais são empregadas in natura

para a preparação de infusões e/ou sob a forma de outras preparações simples (Lavabre,

1993).

De forma geral, os óleos essenciais são misturas complexas de substâncias

voláteis, lipofílicas, geralmente odoríferas e líquidas. Também podem ser chamados de

óleos voláteis, óleos etéreos ou essências. Essas denominações derivam de algumas de suas

características físico-químicas, como, por exemplo, a de serem geralmente líquidos de

aparência oleosa a temperatura ambiente, advindo daí a designação de óleo. Sua principal

característica, entretanto, é a volatilidade, diferindo dos óleos fixos, misturas de

substâncias lipídicas, obtidos geralmente de sementes. Outra característica importante é o

aroma agradável e intenso, sendo por isso chamados de essências (Bruneton, 1995; Simões

et al., 1999).

Os constituintes químicos desses óleos aromáticos variam desde

hidrocarbonetos terpênicos, álcoois simples, fenóis, aldeídos, éteres, ácidos orgânicos,

ésteres, cetonas, lactonas, cumarinas, até compostos contendo nitrogênio e enxofre. Podem

ser utilizados para a síntese de vitaminas, hormônios, antibióticos e antissépticos (1978;

Lavabre, 1993; Bruneton, 1995).

Page 24: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

24

2.2 Plantas medicinais estudadas nesta dissertação

2.2.1 Croton spp

Uma das famílias mais estudadas no Brasil é a das Euforbiaceas (Brito &

Brito, 1993). Essa família é composta de aproximadamente 290 gêneros, entre eles o

Croton, e cerca de 7.500 espécies, distribuídas em todas as regiões tropicais e subtropicais

do mundo (Barroso, 1991).

Amplamente distribuído na flora do Nordeste brasileiro, principalmente nas

caatingas, o gênero Croton é muito importante pela sua utilidade ao indivíduo que vive

afastado dos grandes centros populacionais (Lorenzi & Matos, 2002). As espécies de

Croton podem ser agrupadas, de acordo com as denominações populares, em canelas

silvestres, marmeleiros, velames, dentre outras (Fernandes et al., 1971). Várias espécies de

Croton têm sido estudadas nesses últimos anos, dentre as quais se destacam o C. zenhtneri,

C. nepetaefolius e C. argyrophylloides.

O Croton nepetaefolius Baill., marmeleiro vermelho ou marmeleiro sabiá é

usado para aliviar distúrbios gastrintestinais, na forma de chás e infusões. Seu óleo

essencial tem o efeito antiespasmódico comprovado sobre a musculatura lisa intestinal

(Coelho de Souza et al., 1997), assim como efeito anti-hipertensivo, que é mais potente em

animais com hipertensão genética ou experimental, o qual se deve a um componente

direto, um relaxamento miogênico do músculo liso vascular, e a um efeito indireto, via

atuação no sistema nervoso autônomo. Ademais, o óleo essencial tem atividade

antiinflamatória, também relatada, sugerindo que o mesmo tenha também atuação sobre as

funções imunológicas do organismo. Essa hipótese é reforçada por dados da literatura,

mostrando que o metil eugenol, um importante constituinte deste óleo, tem propriedade

imunomoduladora e antiinflamatória (Franchomme & Penoel, 1995).

Page 25: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

25

O Croton argyrophylloides Muell. Arg. conhecido como marmeleiro prateado,

é um arbusto de ramos delgados, cilíndricos, cinerescentes e escabros. O fracionamento

dos extratos hexânicos e alcoólicos do lenho do caule e do estrato hexânico da casca do

caule levaram ao isolamento de um ácido carboxílico diterpênico e seu éter metílico

(Monte, 1980). O estudo químico do seu óleo essencial mostrou a presença de .-pineno e

�-guaieno (Craveiro, 1976).

O Croton zehntneri Pax et Hoffm., conhecido popularmente como canela de

cunhã, é uma planta subarbustiva e caducifólia do Nordeste brasileiro, pertencente à

família Euphorbiaceae. A medicina popular emprega esta planta para diversos fins, sendo

alguns desses já validados farmacologicamente. Por exemplo: o tipo químico anetol é

antidispéptico e estomáquico; o tipo metil-eugenol é usado popularmente, em forma de

chás e infusões, contra a insônia e como sedativo, embora seu uso ainda não esteja

validado cientificamente, mesmo estando comprovado que estas propriedades podem ser

atribuídas ao metil-eugenol; o tipo eugenol é utilizado como anti-séptico (Craveiro et al.,

1976).

2.2.2 Lippia sidoides

Lippia sidoides, conhecida popularmente como alecrim-pimenta, é um

arbusto de folhas caducas, bastante aromático e próprio da vegetação nordestina,

pertencente à família Verbenaceae. Seu óleo essencial rico em timol é responsável pelo

alto poder antiséptico de suas folhas. Possui inúmeras aplicações na medicina popular,

sendo muitas delas comprovadas cientificamente. É usada para combater infecções da

garganta e da boca, para o tratamento de ferimentos na pele e no couro cabeludo, para o

tratamento de acne, sarna infectada, panos-brancos, impigens, caspa do mau cheiro nos

pés, nas axilas e virilha (Matos, 2000). Botelho & Soares (1994) testaram extratos de

Page 26: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

26

Lippia sidoides contra bactérias causadoras de cárie, encontrando eficácia por parte

desses extratos.

2.3 Fungos: aspectos gerais

O estudo dos fungos tem aproximadamente 150 anos, porém as manifestações

clínicas ocasionadas por esses microrganismos são conhecidas desde a antigüidade

(Mendes-Giannini & Melhem, 1996). O desenvolvimento do conhecimento das espécies de

fungos brasileiros é relatado por Fidalgo (1968).

Nos últimos anos, a Micologia Médica evoluiu muito como ciência básica.

Diversos fungos foram reclassificados e as infecções fúngicas foram alvo de sensíveis

alterações. Essas mudanças taxonômicas não tiveram bases e/ou razões apenas teóricas e

especulativas, já que encerram conotações práticas nos setores clínico, laboratorial e

terapêutico (Paula, 1998).

Além da capacidade de produzir doença em seres humanos, os fungos também

causam doenças em animais e vegetais, destroem a madeira e materiais sintéticos e

compartilham com as bactérias um importante papel na decomposição de restos orgânicos

do solo (Mendes-Giannini & Melhem, 1996).

Doenças fúngicas ocorrem com relativa freqüência em clínicas de pequenos

animais, sendo que, nos casos crônicos, o tratamento se torna mais difícil e, às vezes,

frustrante. A problemática do tratamento pode ser justificada pelo limitado arsenal de

drogas antifúngicas comparadas com as drogas antibacterianas, pelo aparecimento de

vários efeitos colaterais à terapia com medicamentos convencionais e pela seleção de cepas

resistentes aos fármacos utilizados (Sidrim & Rocha, 2004).

Page 27: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

27

2.3.1 Dermatófitos

O estudo das dermatofitoses teve início juntamente com a história da

Micologia Médica. Em 1839, Robert Remak elucidou a etiologia do favus. Quase um

século depois, os dermatófitos foram classificados por um brilhante dermatologista francês

de nome Raymond Jacques Andrien Sabouraud. Hoje existem muitos fungos pertencentes

aos gêneros Trichophyton, Epidermophyton e Microsporum; entretanto, a denominação

dermatófito é utilizada somente para os fungos pertencentes a esses gêneros e que são

queratinofílicos e capazes de causar doenças em humanos e animais (Sidrim & Rocha,

2004).

Dentre as infecções fúngicas, as micoses superficiais são consideradas

preocupantes para os veterinários. Nos animais domésticos, as dermatofitoses,

consideradas como micoses superficiais, possuem grande interesse pelo seu potencial

zoonótico (Garcia et al., 2000; Crespo et al., 2000).

Os dermatófitos são um grupo de fungos taxonomicamente relacionados que

têm capacidade de invadir tecido queratinizado (pele, pêlos e unhas, do homem e dos

animais), produzindo dermatofitose, que também é conhecida como tínea. A infecção pode

ocorrer em qualquer idade, embora os jovens sejam mais comumente afetados do que os

idosos, assim como pacientes com imunossupressão ou debilitados (Muller et al., 1985;).

O Microsporum canis (Figura 1) é o responsável pela maioria de casos de

micoses em animais de estimação e o mais freqüente dermatófito zoofílico de humanos, em

Page 28: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

28

diversas áreas urbanas (Cabañes, 2000; Brilhante et al., 2002). As enfermidades micóticas

têm importância distinta dentro das enfermidades veterinárias em virtude do seu potencial

zoonótico (Hay, 1995; Nakamura et al., 1999). Vários pesquisadores demonstraram a

importância epidemiológica dos animais nas dermatofitoses. Dentre os animais

domésticos, o gato é o principal disseminador do Microsporum canis (Nakamura et al.,

1999). As dermatofitoses em felinos são clinicamente caracterizadas por áreas de alopecia

e quebra de pêlos e em raros casos o M. canis é associado com o desenvolvimento de

grânulos e nódulos teciduais. O M. canis é cosmopolita, endêmico em criações de felinos, e

todos os animais jovens podem estar clinicamente afetados e, em contraste, os adultos

portadores podem não apresentar lesões (Nakamura et al., 1999).

2.3.2 Leveduras

A história natural das doenças causadas por leveduras é mais bem

compreendida à luz da susceptibilidade do hospedeiro. O indivíduo normal apresenta

mecanismos de defesa inespecíficos e específicos, tais como barreiras anatômicas e

fisiológicas, resposta inflamatória e resposta imunológica, que, juntos, representam

obstáculo ao estabelecimento da infecção fúngica (Sidrim & Rocha, 2004).

Figura 1: Colônia de Microsporum canis. (Fonte: CEMM, 2005)

Page 29: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

29

O gênero Candida é composto por fungos leveduriformes hialinos, que

apresentam duas formas de reprodução: assexuada ou anamorfa e sexuada ou teleomorfa.

Taxonomicamente, são enquadradas no grupo dos ascomicetos, visto que a reprodução

sexuada é caracterizada pela produção de ascos (Sidrim & Rocha, 2004).

Todas Candida spp apresentam colônias de coloração branca, superfície lisa e

textura glabrosa úmida (Raposo et al., 1996; Moretti et al., 2004) (Figura 2), que crescem

bem dentro de 48 horas, entre temperaturas de 25 e 37°C (Sidrim & Rocha, 2004). Com

relação à microscopia, se lâminas forem preparadas diretamente a partir de um fragmento

da colônia ou de uma amostra clínica positiva, apenas estruturas unicelulares, denominadas

blastoconídeos, que podem estar isoladas ou apresentando brotamento, vão ser visualizadas

(Figura 3). Desta forma, torna-se necessário a realização de microcultivo em placa de Petri,

para melhor visualização da disposição das estruturas fúngicas típicas de cada espécie,

sendo este, na maioria das vezes, suficiente para identificar o microrganismo (Moretti et

al., 2004).

A Candida albicans, apesar de fazer parte da microbiota normal do trato

intestinal, pode ser patógeno oportunista das regiões mucocutâneas, trato digestivo e

(Fonte: CEMM, 2005)

Figura 3: Blastoconídios de levedura. (Fonte: CEMM, 2005)

Figura 2: Colônias de Candida spp.

Page 30: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

30

genital de mamíferos e aves, além de envolver pele, unhas e trato respiratório com riscos

de desencadear fungemias. A candidíase como doença primária é extremamente rara, e, via

de regra, está associada a neoplasias, doenças imunomediadas e ao uso prolongado de

corticosteróides, antimicrobianos ou drogas citostáticas (Rippon, 1988; Kwon-Chung &

Bennet, 1992).

As leveduras do gênero Malassezia são associadas ao homem e aos animais,

causando diferentes enfermidades, ou como parte da microbiota de pele e mucosas (Bond

et al., 2000; Midgley, 2000).

Em animais, a primeira descrição de malasseziose, no caso, produzido por M.

pachydermatis data de 1925, quando Weidman isolou leveduras em forma de garrafa, não

lipodependentes, de lesões de pele de rinoceronte indiano, as quais denominou de

Pityrosporum pachydermatis. Desde então, é isolada de grande variedade de animais

homeotermos, particularmente mamíferos domésticos e selvagens (Guillot et al., 1994;

Guillot & Bond, 1999).

As leveduras do gênero Malassezia têm habilidade de utilizar lipídios como

fonte de carbono, sendo lipofílicas, e exigem a presença de ácidos graxos de cadeias longas

para seu desenvolvimento, sendo, portanto, lipodependentes, sendo a M. pachydermatis a

única exceção, pois, embora lipofílica, não é lipodependente, tendo a capacidade de se

desenvolver mesmo em meios sem adição de lipídeos (Midgley, 2000; Sidrim & Rocha,

2004).

As espécies de Malassezia, em geral, apresentam colônias com textura

cremosa, coloração de creme a marron-clara (Figura 4) e propriedades micromorfológicas

semelhantes, caracterizadas pela presença de blastoconídios globosos, ovais e com

presença de uma constrição denominada colarete, que podem ser visualizados em lâminas

confeccionadas a partir de um fragmento da própria colônia ou desde o exame direto de

amostra clínica positiva. Na microscopia, podem também ser visualizados filamentos

Page 31: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

31

curtos de parede grossa, com um ou dois septos (Sidrim & Rocha, 2004; Chen & Hill,

2005).

Embora M. pachydermatis seja microrganismo comensal, algumas condições

podem propiciar seu desenvolvimento exacerbado, levando à subseqüente doença clínica.

O estado de doença, presumivelmente, reflete alterações nos mecanismos físicos, químicos

e/ou imunológicos do animal, que normalmente restringem a colonização da levedura.

Assim, fatores como terapia antibacteriana, emprego de corticóides, alergias, dermatites

seborréicas, distúrbios nutricionais ou hormonais e doenças intercorrentes, como

neoplasias, são considerados fatores predisponentes a malasseziose (Guillot & Bond,

1999).

Figura 4: Colônia típica de Malassezia spp.

(Fonte: CEMM, 2005)

Page 32: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

32

2.4 Estudos de toxicidade

A Farmacologia, como ciência experimental que trata das propriedades das

drogas e seus efeitos em sistemas vivos, envolve o estudo das fontes das drogas

(farmacognosia), a ação das drogas no organismo (farmacodinâmica), o uso de drogas no

tratamento das doenças (terapêutica), e os efeitos tóxicos das drogas ou xenobióticos

(toxicologia) (Brown e Davis, 2001).

A toxicologia é o ramo científico que estuda as propriedades de químicos e

seus efeitos em organismos vivos, com objetivo de assegurar seus potenciais efeitos

adversos, a fim de ajudar a assegurar e proteger a saúde humana ou animal (Roberfroid,

1995).

Um efeito adverso é definido como uma alteração anormal, indesejável ou

nociva após exposição a substâncias potencialmente tóxicas. A morte é o efeito adverso

mais drástico que pode ocorrer, porém, efeitos adversos de menor gravidade incluem

alteração de consumo de alimentos ou água, variação no peso corpóreo ou de órgãos,

alterações anatomopatológicas ou simplesmente de níveis enzimáticos (Barros e Davino,

1996).

Os testes toxicológicos, aplicados em animais de laboratório e sob condições

previamente estabelecidas, permitem determinar os possíveis efeitos das substâncias em

humanos ou animais expostos a estas (Barros e Davino, 1996).

Page 33: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

33

No Brasil, a resolução 1/78 (D.O. 17/10/78) do Conselho Nacional de Saúde,

estabelece como tipos de ensaios de toxicidade: aguda, subaguda (subcrônica), crônica,

teratogenia e embriotoxicidade e estudos especiais (Vasconcelos, 2002).

2.4.1 Toxicidade aguda

A toxicidade aguda de um composto químico é definida como os efeitos

adversos que ocorrem dentro de um período curto após administração de dose única ou

doses múltiplas administradas dentro de 24 horas (Barros e Davino, 1996). A toxicidade

aguda é expressa pela quantidade necessária, em mg/kg de peso corpóreo, para provocar a

morte em 50% de um lote de animais submetidos a experiência, sendo representada pela

dose letal 50 (Eaton e Klaasson, 1995; Barros e Davino, 1996; Repetto, 1997; Larini,

1997). Os valores de dose letal 50 (DL50) são obtidos a partir de índices de mortalidade

observados, empregando-se diversos métodos estatísticos. Entre estes métodos, destaca-se

o método de PROBITOS (termo derivado de PROBITS = probability units) que, além de

determinar o valor de toxicidade aguda e seus limites fiduciais, possibilita a obtenção de

uma reta “dose-resposta” (Larine, 1997).

Os resultados obtidos a partir dos estudos de toxicidade aguda servem também

para conhecimento do mecanismo de ação da substância, identificar possíveis órgãos ou

sistemas sensíveis e determinar se os efeitos são reversíveis ou não. Ainda mais, os

resultados obtidos dos estudos de toxicidade aguda são empregados para o delineamento

dos estudos de toxicidade subcrônica e crônica, particularmente no que se refere à escolha

de doses (Barros e Davino, 1996).

Hadge e Sterner (1949) apresentam uma tabela de toxicidade oral, inalatória e

por contato (pele) para ratos e fazem uma extrapolação para humanos (tab. 2).

Page 34: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

34

Tabela 1: Classes de toxicidade aguda de substâncias administradas a ratos por diferentes

vias e extrapolação para toxicidade humana.

Classe Termo usual DL50 Oral

[ 1 ]

Inalação

[ 2 ]

DL50 Pele

[ 3 ]

DL50

Huma

na

[ 4 ]

1 Toxicidade Elevada ����PJ <10 ����PJ 15 mg

2 Toxicidade Alta 1–50 mg 10 – 102 5 – 43 mg 5 ml

3 Toxicidade Média 50–500 mg 102 – 103 44 – 340 mg 30 g

4 Toxicidade Baixa 0.5–5 g 103 – 104 0,35 – 2,81 mg 250 g

5 Praticamente atóxico 5–15 g 104 – 106 2,82 – 22,59 mg 1000 g

6 Relativ. Inofensivo > 15 g >106 > 22,6 g > 1 Kg

Segundo Repetto (1997), o estudo de toxicidade aguda permite determinar o

grau de toxicidade aproximada de uma substância em quatro categorias conforme a DL50

aproximada por via oral. Estas categorias são:

I. Muito tóxica: DL50 inferior ou igual a 25 mg/kg.

II. Tóxica: DL50 inferior ou igual a 250 mg/kg.

III. Nociva: DL50 inferior ou igual a 2000 mg/kg.

IV Sem toxicidade aguda: DL50 superior a 5000 mg/kg.

Page 35: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

35

2.4.2 Toxicidade subcrônica

Os estudos de toxicidade subcrônica são realizados para obter informações sobre a toxicidade de substâncias químicas, em humanos ou animais, após exposições repetidas a estas (Barros e Davino, 1996).

Os estudos de toxicidade subcrônica e crônica, que objetivam determinar o

efeito tóxico após exposição prolongada a doses cumulativas da substância em teste, não

se diferenciam na sua essência, mas, sim, em sua extensão (Repetto, 1997). Parâmetros

hematológicos e bioquímicos devem ser avaliados no início e final do estudo. Exames

histopatológicos, também, devem ser realizados no final do experimento (Barros e Davino,

1996).

Os estudos de toxicidade subcrônica e crônica são feitos após a administração cumulativa de uma substância e envolvem análise hematológica, análise bioquímica e histopatológica dos animais. Além destes parâmetros, devem ser feitas observações diárias para verificar o comportamento dos animais tratados (Vasconcelos, 2002).

2.4.2.1 Avaliação Bioquímica

A avaliação de alguns parâmetros bioquímicos fornece indicações de alterações fisiológicas que podem estar envolvidas com a ocorrência de efeitos provocados por uma substância e ajudam no diagnóstico de algumas patologias, entre elas podendo-se citar as intoxicações (Vasconcelos, 2002).

O fígado tem papel essencial no metabolismo dos nutrientes, incluindo o

controle e a manutenção do nível de glicose sangüínea, na desintoxicação e excreção de

metabólitos, na síntese de muitas proteínas plasmáticas e na digestão mediante a síntese,

secreção biliar e conservação de ácidos biliares, que são essenciais para uma ótima

hidrólise da gordura da dieta e para absorção intestinal de ácidos gordurosos e outros

lipídios, incluindo vitaminas lipossolúveis (Tennant, 1997).

Page 36: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

36

Muitas toxinas induzem danos hepáticos. A suscetibilidade do fígado ao

insulto tóxico é em parte uma conseqüência de sua localização entre o trato digestivo e o

resto do organismo e o papel central que ele desempenha na biotransformação e disposição

de xenobióticos (Turk e Casteel, 1997).

As manifestações clínicas da disfunção hepática são diretamente atribuíveis a

alterações nas funções metabólicas, de excreção, de síntese e digestivas do fígado. O

fígado tem a maior reserva funcional, e sinais de falência hepática freqüentemente não se

desenvolvem até que 70% ou mais da capacidade funcional do fígado esteja perdida. É

importante salientar que, até quando uma fração maior da massa hepatocelular for perdida

em uma injúria aguda, por exemplo, hepatite aguda ou necrótica, a recuperação é possível

em virtude da capacidade única de recuperação do fígado (Tennant, 1997). As enzimas

hepáticas, por ocasião de uma injúria hepática, são liberadas para o plasma e o aumento da

quantidade destas enzimas plasmáticas torna-se de utilidade diagnóstica.

Em todas as espécies domésticas, a atividade da aspartato aminotransferase ou

transaminase glutâmica oxalacética (AST/TGO) é alta no fígado e, na injúria aguda ou

crônica do fígado, a atividade da TGO do plasma é aumentada. Atividade da alanina

aminotransferase ou transaminase glutâmica pirúvica (ALT/TGP) sérica é considerada

específica para injúrias hepáticas em cães e gatos, e em pequenos animais com injúrias

hepatocelulares, um aumento fracional na atividade da TGP é de 4 a 8 vezes maior do que

o aumento correspondente em TGO (Center, 1996).

A albumina é sinterizada pelo fígado como todas as proteínas plasmáticas,

exceto as imunoglobulinas. É a proteína plasmática mais osmoticamente ativa em razão da

sua abundância e tamanho, contribuindo com cerca de 75% da atividade osmótica do

plasma (Kaneko, 1997).

Page 37: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

37

Hipoalbuminemias podem ter origem hepática, no caso da hepatite crônica

difusa especialmente em cirroses, ou podem ter origem não hepática, como no caso das

dietas inadequadas, má absorção, gastroenteropatias com perda de proteínas, diarréias

crônicas etc. (Hagiware, 1983).

Outro parâmetro de avaliação bioquímica é a dosagem das bilirrubinas séricas.

A bilirrubina resulta da degradação da hemoglobina no sistema retículo endotelial, e é

excretada pelo sistema hepatobiliar para a luz intestinal. A determinação do nível sérico

das bilirrubinas tem importância fundamental no diagnóstico das três formas de icterícia:

hemolítica, hepática e pós-hepática ou obstrutiva (Hagiware, 1983). A bilirrubina é

derivada da destruição de eritrócitos danificados ou senescentes por macrófagos do baço,

fígado e medula óssea. Colestase resulta em hiperbilirubinemia conjugada. A bilirrubinúria

pode ocorrer em virtude de regurgitação da bilirrubina conjugada. Hemólise pode resultar

em hiperbilirrubinemia não conjugada (Turk e Casteel, 1997).

Em mamíferos, os rins funcionam como o maior órgão de excreção para

eliminação de resíduos metabólicos do corpo. Perda parcial da função renal resulta em

desvios variáveis do normal, dependendo da quantidade de tecido funcional remanescente.

O termo azotemia refere-se ao acúmulo de resíduos de nitrogênio no sangue. Concentração

sangüínea de uréia e creatinina são medidas como índices de azotemia, embora nenhum

dos dois provoque toxicidade significante em razão do seu acúmulo (Finco, 1997).

A creatinina é formada no metabolismo da creatina e fosfocreatina muscular. O seu nível sangüíneo não é afetado pela dieta, idade ou sexo do animal. É excretada totalmente pelos glomérulos, não ocorrendo reabsorção tubular. Serve, portanto, como índice de filtração glomerular e, por ser facilmente eliminada, o seu aumento na circulação sangüínea ocorre mais tardiamente nos estados de insuficiência renal, quando comparada à uréia sangüínea (Hagiware, 1983). Em muitas espécies domésticas, as concentrações séricas de uréia e creatinina são estimativas grosseiras da taxa de filtração glomerular. Com base no mecanismo de excreção renal destes dois compostos, a creatinina é o melhor indicador (Finco, 1997).

2.4.2.2 Avaliação hematológica

Page 38: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

38

A Hematologia é a ciência que estuda o sangue sob aspecto morfológico,

fisiológico e patológico, e, conseqüentemente, Hematologia clínica veterinária representa o

emprego dos conhecimentos da citada especialidade na interpretação e resolução de

problemas clínicos de âmbito veterinário (Birgel, 1983).

A presença de alterações hematológicas em animais de laboratório expostos a

novos agentes farmacêuticos é um importante elemento na avaliação total de riscos e

perigos de potencial exposição pelo animal (Vasconcelos, 2002).

O sangue e a medula óssea apresentam uma mistura complexa de células que

respondem de maneiras diferentes aos vários insultos tóxicos. Os efeitos de substâncias

nas células sangüíneas não são restritos à destruição celular ou inibição de hematopoiese.

Alguns agentes estimulam a hematopoiese, enquanto outros afetam a função das células do

sangue, resultando em diminuição ou aumento da função (Lund, 2000).

O sangue é constituído por elementos sólidos, ou seja, os corpúsculos celulares

(hemácias, leucócitos e plaquetas), pelo plasma que é composto de 90% de água e dilui as

proteínas e minerais, e, finalmente, pelos elementos gasosos (O2 e CO2 ) (Birgel, 1983).

O hemograma expressa as condições do sangue periférico num certo momento

da vida de um animal, nele aparecendo registrados os valores quantitativos e qualitativos

das células do sangue. Está dividido em eritrograma e leucograma (Souza, 1998).

O eritrograma é o estudo dos glóbulos vermelhos e compreende os seguintes

parâmetros:

⇒ contagem de hemácias/mm3;

Page 39: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

39

⇒ hemoglobina (g/dL);

⇒ hematócrito (%);

⇒ índice hematimétrico - VCM (volume corpuscular médio), HCM

(hemoglobina corpuscular média) e CHCM (concentração de hemoglobina corpuscular

média).

O leucograma é o estudo dos glóbulos brancos e compreende a contagem

global e diferencial dos leucócitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e

monócitos). A contagem diferencial é expressa em valores relativos, que representam a

percentagem de cada leucócito em relação à contagem total, ou em valores absolutos que

significam a quantidade de cada leucócitos por mm3 de sangue. O leucograma, também, faz

referências à morfologia dos leucócitos, como, por exemplo, a presença de granulações

tóxicas nos neutrófilos, linfócitos atípicos ou alguma anomalia leucocitária (Souza, 1998).

Também faz parte do hemograma a avaliação das plaquetas, que consiste da

contagem do número de plaquetas por mm3 de sangue e a análise da morfologia das

plaquetas, verificando se existe alguma anomalia quanto a coloração, tamanho ou

agregação (Vasconcelos, 2002).

Pequenas diferenças nos valores médios nos grupos dos animais tratados

comparados com os valores do grupo-controle são, com freqüência estatisticamente

significantes, e nem todas as pequenas diferenças detectáveis nesta situação estão

diretamente relacionadas aos efeitos tóxicos do composto que está sendo estudado (Lund,

2000).

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40

Justificativa

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41

3 JUSTIFICATIVA

Com o aumento na freqüência das micoses e do reduzido número de drogas

para o tratamento destas enfermidades, os óleos essenciais de plantas constituem fontes

importantes de compostos antifúngicos. No Nordeste do Brasil, várias plantas são

utilizadas pelo povo, principalmente em locais onde a falta de medicamentos é uma

constante e o custo é elevado. Para o seu uso em larga escala, no entanto, estudos que

comprovem estas atividades, associados à determinação da toxicidade, fazem-se

necessários. Um estudo detalhado, abordando os aspectos químicos, micológicos e

farmacológicos dos óleos essenciais do Croton zenhtneri, Croton nepetaefolius, Croton

argyrophylloides e da Lippia sidoiedes é importante para a sua validação como prováveis

substâncias com atividade antifúngica contra dermatófitos (Microsporum canis) e

leveduras (Candida albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis).

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42

Hipótese

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43

4 HIPÓTESE

Os óleos essenciais do Croton zenhtneri, Croton nepetaefolius, Croton

argyrophylloides e da Lippia sidoides constituem fontes de compostos antifúngicos para

combater micoses em humanos e animais.

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44

Objetivos

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5 OBJETIVOS

5.1 Objetivo Geral

O objetivo deste estudo foi investigar a atividade antifúngica ‘in vitro’ dos

óleos essenciais de Croton spp. e Lippia sidoides contra dermatófitos (Microsporum canis)

e leveduras (Candida albicans, Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis).

5.2 Objetivos Específicos

1 Estabelecer a sensibilidade dos microrganismos testados frente aos óleos essenciais

utilizados;

2 averiguar os componentes químicos que se encontram em maior quantidade nas diversas

plantas que apresentam atividade antifúngica;

3 avaliar a toxicidade aguda e subcrônica dos óleos essenciais das plantas.

.

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46

Page 47: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

47

Material e

Métodos

Page 48: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

48

6 MATERIAL E MÉTODOS

6.1 Coleta das plantas

As plantas foram coletadas no Município de Viçosa do Ceará. As exsicatas

foram depositadas no Herbário Prisco Bezerra, no Departamento de Biologia da UFC, onde

foram identificadas taxonomicamente.

6.2 Obtenção dos óleos essenciais

Os óleos essenciais do C. zenhtneri, C. nepetaefolius, C. argyrophylloides e da

Lippia sidoides foram extraídos no Laboratório de Produtos Naturais da Universidade

Estadual do Ceará.

A obtenção dos óleos essenciais foi realizada por destilação a vapor d’água ou

hidrodestilação, de acordo com o método descrito por Craveiro et al. (1976). Esse processo

consistiu na propriedade que as essências possuem de serem miscíveis com água no estado

de vapor. As folhas da planta foram picadas e colocadas em um recipiente, conectado em

uma extremidade a um vaso contendo água em ebulição, e a outra extremidade a um

condensador. O vapor de água arrastou as substâncias voláteis contidas no material,

formando uma mistura de vapores. Após a passagem pelo condensador, ocorreu a

separação das fases hidrofílica e hidrofóbica por decantação que foram coletadas em

erlenmeyer. A fase hidrofóbica constitui o óleo essencial (Figura 5).

Page 49: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

49

Figura 5:. Esquema de uma extração do óleo essencial.

6.3 Análise da composição química dos compostos vegetais

Os óleos essenciais foram analisados por cromatografia de gás acoplada a

espectrometria de massa.

A cromatografia gasosa separa componentes a partir de misturas complexas de

compostos voláteis. Nas aplicações analíticas, é possível o acoplamento com um sistema

de espectrometria de massa que é extremamente útil na separação e identificação de

estruturas, como, por exemplo, de componentes de óleos essenciais (óleos voláteis)

(Craveiro, 1976; Simões, et al., 1999).

Page 50: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

50

6.4 Determinação da dose letal média (DL50)

A dose letal média foi estimada segundo o método de Miller e Tainter, (1944).

Para tanto, foram utilizados camundongos albinos (Mus musculus) pesando entre 20-30 g

que foram divididos (n = 10/grupo). Os camundongos foram tratados por via

intraperitoneal e oral através de cânula de gavagem, com salina (0,01 mL/kg) ou com os

compostos vegetais (100; 300; 500; 750; 1000; 2000 e 3000 mg/kg). Os animais foram

observados por 1 hora para verificação de efeitos hipocráticos, sendo anotados em tabelas

modificadas de Malone. Após 24 horas, o número de mortos foi registrado.

6.5 Toxicidade subcrônica

Para averiguar a toxicidade subcrônica, ratos Wistar de ambos os sexos

divididos em dois grupos (n=10/grupo) tratados pela via oral durante 30 dias com OELs na

concentração determinada pela dose letal média obtidas em estudos prévios em

camundongos com administração intraperitoneal e 1 mL/kg/dia de veículo (salina). Estes

animais foram pesados no início, durante e após os trinta dias para avaliação de ganho de

peso. Amostras de sangue foram coletadas antes, 15 e 30 dias após o tratamento, e a

concentração sérica de uréia, creatinina, transaminase glutâmica oxalacética (TGO) e

transaminase glutâmica pirúvica (TGP) foram comparadas entre e dentro dos grupos. As

amostras de sangue foram coletadas do plexo infraorbital em tubos com gel separador para

soro (Vacuette, São Paulo, Brasil) e centrifugadas a 3000 g e as análises bioquímicas foram

realizadas com o uso de kits disponíveis comercialmente (Labtest, Lagoa Santa, Minas

Gerais, Brasil). No final do período experimental, coração, pulmão, fígado, rins e baço

foram coletados de todos os grupos, fixados em formol, processados e corados para análise

Page 51: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

51

histopatológica. Os valores de contagem total e diferencial de células sangüíneas obtidos

antes e após o tratamento foram comparados.

6.6 Microrganismos

Foram utilizadas 07 cepas de Candida albicans, 05 de Candida tropicalis, 10

de Microsporum canis, provenientes do estoque em ágar batata à -20ºC com DMSO 10%;

e 10 cepas de Malassezia pachydermatis, estocadas em ágar Dixon modificado, também a

temperatura de -20ºC. As cepas utilizadas foram provenientes do CEMM (Centro

Especializado em Micologia Médica), do Departamento de Patologia e Medicina Legal da

Universidade Federal do Ceará.

6.6.1 Recuperação das cepas

As cepas de Candida albicans, Candida tropicalis e Microsporum canis

estocadas em ágar batata acrescido de DMSO (10%) à –20 ºC foram descongeladas e

repicadas para um tubo contendo ágar batata. Estas foram incubadas a 28 ºC e observadas

diariamente por 04 dias, no caso das Candidas e 10 dias para os dermatófitos, com o

objetivo de verificar a presença de crescimento das colônias e, assim, confirmar a

viabilidade das cepas.

Da mesma forma, as cepas de Malassezia pachydermatis foram descongeladas

e um fragmento da colônia repicado para dois tubos de ensaio, um contendo, ágar Dixon

modificado e outro ágar batata. Os tubos contendo os inóculos foram incubados a 37 ºC e

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52

observados diariamente por um período de até 10 dias, a fim de verificar o crescimento e a

manutenção da viabilidade das cepas.

6.6.2 Identificação laboratorial

6.6.2.1. Candida spp

A identificação laboratorial das espécies de Candida foi feito com o objetivo

de avaliar a viabilidade das cepas após a estocagem, mediante a união de uma série de

testes:

A. Prova do Tubo Germinativo - é um método simples que permite a distinção

entre a C. albicans ou C. dubliniensis, que são positivas para este teste, de outras espécies

de leveduras, consideradas tubo germinativo negativo.

B. Microscopia - o estudo micromorfológico das espécies de Candida é

possível através da prova do microcultivo. Esta é realizada em meio corn-meal-tween 80,

onde, sob baixa tensão de oxigênio, ocorre produção de conídeos e filamentação, sendo

possível sugerir a espécie, isso pela presença e disposição de blastoconídeos, hifas

verdadeiras e pseudo-hifas, que se distinguem de acordo com a espécie.

C. Assimilação de carboidratos - esta representa a habilidade que uma levedura

tem de crescer aerobicamente na presença de determinado carboidrato, fornecido como

única fonte de energia. A positividade é avaliada por meio da observação de halo de

crescimento da levedura em presença do carboidrato fornecido. Os açúcares utilizados são:

Page 53: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

53

dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose, trealose, melobiose, L-arabinose, celobiose,

xilose, rafinose, dulcitol, ramnose, inulina, manitol, inositol, entre outros.

D. Assimilação de nitrogênio - determina a capacidade que uma levedura tem

de crescer aerobiamente na presença de um composto nitrogenado fornecido como fonte de

energia. Em meio ágar sólido, desprovido de qualquer fonte de nitrogênio e adicionado da

suspensão de levedura, são colocadas alíquotas de compostos nitrogenados. A positividade

será avaliada mediante o crescimento da levedura em presença do composto nitrogenado

fornecido. Geralmente, as fontes utilizadas são: a peptona, que será utilizada como controle

positivo, e o nitrato de potássio.

E. Fermentação de carboidratos - por esta prova, será avaliada a capacidade

que cada espécie de Candida tem de crescer, anaerobiamente, na presença de determinado

açúcar fornecido como única fonte de energia. A positividade será avaliada por intermédio

da produção de gás carbônico e alteração do pH. Os carboidratos geralmente utilizados

são: dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose e trealose.

6.6.2.2. Malassezia pachydermatis

Para a avaliação da viabilidade das cepas de Malassezia foram levados em

consideração os seguintes aspectos:

A. Características macroscópicas - as colônias de Malassezia spp., de uma

forma geral, apresentam textura glabrosa seca com coloração no tom de amarelo-creme.

Page 54: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

54

B. Características microscópicas - a microscopia foi analisada por intermédio

da coloração de Gram. O que se observa são blastoconídeos com morfologia oval e

apresentando brotamento em colarete, podendo estar ou não associados a hifas curtas e

tortuosas.

C. Prova da urease - nesta prova, foi analisada a capacidade de o fungo

produzir a enzima urease, apresentado por algumas espécies deste gênero.

D. Assimilação do tween (20, 40, 60 e 80) - frente a este teste, a espécie poderá

ou não assimilar os diversos tween testados.

E. Repique para meios não ricos em lipídio - com o intuito de observar o

crescimento que definirá a espécie.

A capacidade do microrganismo produzir a enzima urease, assimilar o tween

40 e 80, e de crescer em meio pobre em lipídio, dentre todas as espécies do gênero, só é

observada na espécie que será estudada, a Malassezia pachydermatis.

6.6.2.3. Dermatófitos

Para avaliar a viabilidade das cepas fúngicas dermatofíticas, após terem sido

retiradas da micoteca, foram realizados alguns testes, dentre eles:

Page 55: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

55

A. Macromorfologia - na análise das características macromorfológicas, foram

levados em consideração o relevo e a textura, bem como a presença ou ausência de

pigmento (Sidrim & Rocha, 2004).

B. Micromorfologia - o estudo micromorfológico foi feito a partir do

isolamento primário, sendo uma pequena alíquota da colônia retirada do ágar e montada

entre lâmina e lamínula com corante lactofenol azul-algodão. A montagem foi observada

em microscopia óptica em objetiva de 40X. Nestas preparações, podem ser visualizadas

estruturas de reprodução (macroconídios e microconídios), bem como estruturas de

ornamentação (hifas nodulares, pectinadas, entre outras).

C. Perfuração de pêlo - esta prova tem como objetivo visualizar se o fungo

perfura ou não o pêlo, in vitro. Este teste baseia-se em manter cabelos de crianças pré-

púberes esterilizados em ágar - gel, sendo alíquotas de fungos repicadas sobre o pêlo. O

teste foi considerado positivo quando foram observadas perfurações perpendiculares ao

longo do pêlo. Alguns fungos possuem enzimas capazes de degradar a queratina, in vitro,

como fonte de energia (Sidrim & Rocha, 2004).

D. Prova da urease - esta prova bioquímica é processada em meio de

Christensen e detecta a presença ou ausência de enzima urease produzida pelo fungo. O

resultado é considerado positivo quando houver a mudança do meio de amarelo para róseo

e será negativo quando o meio se mantiver amarelo (Sidrim & Rocha, 2004).

E. Prova de requerimento vitamínico - utilizada para diferenciação de cepas

baseadas em exigências nutricionais. Os meios de cultura utilizados foram enriquecidos

com ácido nicotínico, tiamina, histidina e inositol, sendo a base do ágar T1 ao T5 a caseína

e do ágar T6 e T7 o nitrato de amônia (Sidrim & Rocha, 2004).

Page 56: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

56

6.7 Atividade antifúngica

6.7.1 Método de difusão em ágar

A atividade contra dermatófitos e leveduras dos extratos das plantas foi

qualitativamente medida pelo método de difusão em ágar (Camm et al., 1975; Cole, 1994),

onde, o inóculo dos dermatófitos e das leveduras foram adicionados às placas de Petri com

ágar batata com o auxílio de um swab. Um pequeno poço foi feito no centro da placa

usando uma pipeta Pasteur e 100 µL do óleo essencial das plantas juntamente com seu

diluente (óleo mineral) e os controles negativos com água destilada foram adicionados aos

poços nas concentrações de 5%, 10% e 20%; os controles positivos para as leveduras

foram a anfotericina B e o itraconazol enquanto que para as cepas de M. canis, foi utilizada

a griseofulvina. As placas foram guardadas a temperatura ambiente e a leitura foi feita após

07 dias. O diâmetro da zona de inibição ao redor do poço foi medido e registrado nas

quatro direções diferentes.

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57

Resultados

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58

7 RESULTADOS

7.1 Análise dos óleos essenciais

A análise química do óleo essencial das três espécies de Croton e da Lippia

sidoides está mostrada na tabela 1. No óleo essencial do Croton nepetaefolius, observou-se

em maior quantidade a presença de metil-eugenol (15,73%) e biciclogermacreno (14,08%).

O Croton argyrophylloides apresentou o spathulenol (20,33%) e biciclogermacreno

(11,72%) em maiores proporções, enquanto que o Croton zehntneri mostrou o estragol

(72,85%) e o anetol (14,32%) em maiores quantidades. A Lippia sidoides apresentou o

timol (59,65%) e o cariofileno (10,60%) em maiores proporções.

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59

Tabela 2: Análise química das três espécies de Croton e da Lippia sidoides

Composição (%) K.I. Componentes C. a. C. n. C. z. L. s.

931 .-Thujene - - - 1.48 939 .-Pinene 5.55 - - 0.51 976 Sabineno 4.68 - - - 991 Myrceno - - 0.43 5.43 1018 .-Terpinene - - - 1.43 1026 Para Cymene - - - 9.08 1031 Limonene - - - 1.01 1033 1,8-Cineole 11.22 8.00 0.59 - 1050 E-�-Ocimene - - 0.38 0.27 1062 G-Terpinene - - - 3.83 1098 Linalool - - - 0.28 1171 Umbellulone - - - 0.46 1189 .-Terpineol - 3.54 - - 1196 Methyl chavicol - - 72.85 - 1235 Methyl Thymylether - - - 1.79 1285 Anethole - - 14.32 - 1290 Thymol - - - 59.65 1298 Ortho-Vanillin - 5.04 - - 1339 /-Elemene - - 0.16 - 1376 .-Copaene - - - 0.66 1391 �-Elemene 6.24 3.72 0.32 - 1404 Methyl-Eugenol - 15.73 - - 1413 E- .-Bergamotene - 4.56 - - 1419 E-Caryophyllene 5.67 11.38 1.63 10.60 1435 E- .-Bergamotene - 9.09 0.22 - 1439 Aromadendrene - 3.35 - 0.53 1455 .-Humulene - 5.90 0.16 0.56 1459 Dehidroaromadendrane - - - 0.91 1461 Alloaromadendreno - - 0.27 - 1480 Germacrene-D - - 0.93 - 1485 �-Selinene 3.16 - - - 1500 Bicyclogermacrene 11.72 14.08 5.12 - 1505 Cupareno - - 0.17 - 1506 �-Bisabolene - 2.95 0.24 - 1524 / -Cadinene - - 0.20 0.35 1578 Spathulenol 20.33 4.28 0.64 - 1581 Caryophyllene Oxide - 4.37 - 0.72 1593 Veridiflorol - - 0.32 - KI – índice de retenção na coluna do cromatógrafo. Ca = Croton argyrophylloides, Cn = Croton nepetafolius, Cz = Croton zenhtneri, Ls =

Lippia sidoides.

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60

7.2 Atividade antimicrobiana

Os óleos essenciais do Croton nepetaefolius e do Croton argyrophylloides

demonstraram atividade apenas contra o M. canis (figuras 6 e 8). No entanto, os óleos

essenciais do Croton zehntneri e da Lippia sidoides apresentaram atividade contra todos os

fungos testados (tabelas 3, 4 e 5). O óleo essencial do Croton nepetaefolius foi o menos

efetivo, apresentando atividade antifúngica apartir da concentração de 50 mg/ml, enquanto

que o Croton argyrophylloides e o Croton zehntneri (figura 9) inibiram o crescimento do

fungo em todas as doses testadas. As zonas de inibição de crescimento foram relativamente

grandes e com o aumento das concentrações mostraram dose-dependência. Por outro lado,

o óleo essencial da L. sidoides (figura 7) foi claramente mais potente que os óleos

essenciais das espécies de Croton, apresentando grande zona de inibição de crescimento na

menor concentração quando comparado com a máxima resposta obtida com os óleos dos

Croton. Na concentração �����PJ�PO�R�yOHR�HVVHQFLDO�GD�L. sidoides inibiu totalmente o

crescimento do Microsporum canis (tabela 3). Quando comparado com a griseofulvina (1

mg/ml), droga usada como controle positivo, todas as espécies de Croton mostraram baixo

crescimento da zona de inibição. Os valores das médias do crescimento das zonas de

inibição nas maiores concentrações do C. nepetaefolius, C. argyrophylloides e C. zehntneri

e da griseofulvina foram 19,8 ± 7,2; 31,2 ± 9,9; 22 ± 7,3 e 51,6 ± 6,7, respectivamente

(tabela 3).

O óleo essencial do C. nepetaefolius e do C. argyrophylloides foram

inofensivos contra Candida spp mesmo nas mais altas concentrações. A adição destes

óleos nas concentrações de 100 mg/mL não induziu nenhuma inibição no crescimento do

fungo (tabela 4). Por outro lado o C. zehntneri e L. sidoides foram efetivos contra a

Candida spp, sendo a L. sidoides mais potente, e em concentrações superiores a 25 mg/ml

ela apresentou maiores zonas que o controle positivo, anfotericina B (tabela 4). A máxima

inibição da zona de crescimento medido em milímetros para C. zehntneri, L. sidoides e

anfotericina B foi 12,6 ± 1.1; 23,2 ± 1,8 (p<0,05 C. zehntneri e anfotericina B) e 10,8 ±

1,5, respectivamente.

Page 61: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

61

Similarmente, os óleos essenciais do C. nepetaefolius e do C. argyrophylloides

foram inofensivos contra Malassezia pachydermatis. A incubação destes óleos na

concentração de 100 mg/ml novamente foi inofensivo e não demonstrou nenhum efeito no

crescimento do fungo. Contudo, a incubação do C. zehntneri e mais eficientemente da L.

sidoides induziram zonas de inibição de crescimento do fungo de forma dose-dependente.

Na concentração de 100 mg/ml a L. sidoides induziu uma inibição total do crescimento do

fungo com maiores zonas de inibição que do itraconazol (controle positivo) em

concentração acima de 25 mg/ml (tabela 5). As zonas máximas de inibição do C. zehntneri

e do itraconazol foram 22,6 ± 6,7 e 29,7 ± 9,0, enquanto a L. sidoides tem similar zona na

concentração de 25mg/ml e 41,2 ± 9,5 (p<0,05 vs. C. zehntneri e itraconazol) a 50 mg/ml

(tabela 5).

Tabela 3: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides contra M. canis

Zona de inibição de crescimento (mm)

Espécie de fungo dermatofítico - Microsporum canis

Drogas

25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (1 mg/ml)

Croton nepetaefolius 10.2±1.7 18.6±4.6a 18.7±4.2a 19.8±7.2a - Croton argyrophylloides 14.8±4.0 21.1±4.2a 26.2±5.5a 31.2±9.9b -

Croton zehntneri 11.8 ±3.0 16.8±5.8 18.7±4.4 22±7.3a - Lippia sidoides 33.4±12.4c IT IT IT -

Griseofulvina - - - - 51.6 ± 6.7d

IT= Inibição total do crescimento do fungo a p<0.05 vs. 25mg/ml b p<0.05 vs. 50 mg/ml c p<0.05 vs. Croton species tested at 25 mg/ml d p<0.05 vs. Todas as concentrações das espécies de Croton testadas e L. sidoides em 25 mg/ml

Page 62: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

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Tabela 4: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides contra Candida spp.

Zona de inibição de crescimento (mm)

Espécie de fungo leveduriforme – Candida spp.

Drogas 25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (5 �g/ml)

Croton nepetaefolius NI NI NI NI - Croton argyrophylloides NI NI NI NI -

Croton zehntneri 7.4±1.1 9.0±1.4 10.0±1.5 12.6±1.1 - Lippia sidoides 9.8±0.9 16.4±2.1a 21.5±4.2a,b 23.2±1.8a,b -

Anfotericina B - - - - 10.75 ± 1.5 NI= Não ocorreu inibição do crescimento do fungo a p<0.05 vs. 25mg/mL b p<0.05 vs. Anfotericina B

Tabela 5: Atividade antifúngica dos óleos essenciais das espécies de Croton e da Lippia sidoides contra M. pachydermatis

Zona de inibição de crescimento (mm)

Espécie de fungo leveduriforme – Malassezia pachydermatis

Plants

25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (8 �g/ml)

Croton nepetaefolius NI NI NI NI - Croton argyrophylloides NI NI NI NI -

Croton zehntneri 11.6 ± 2.9 13.2 ± 2.7 17.2 ± 3.9a 22.6 ± 6.7a - Lippia sidoides 30.0 ± 10.0 41.2 ± 9.5b 50.0 ± 8.3a,b IT -

Itraconazol - - - - 29.7 ± 9.0 IT= Inibição total do crescimento do fungo NI= Não ocorreu inibição no crescimento do fungo a p< 0.05 vs. 25 mg/mL b p< 0.05 vs. Itraconazol

Page 63: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

63

Figura 6: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100 mg/mL) de OECa testada, perante cepa de Microsporum canis.

(Fonte: Fontenelle, 2005)

(Fonte: Fontenelle, 2005)

Figura 7: Halo de inibição produzido pela menor concentração (25 mg/mL) do OELs perante cepa de Microsporum canis.

(Fonte: Fontenelle, 2005)

Figura 8: Halo de inibição produzido pela maior concentração do OECn (100mg/mL) perante cepa de Microsporum canis.

Page 64: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

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7.3 Toxicidade

A administração dos óleos essenciais nas doses de 100 a 3000 mg/kg não

induziu uma notável alteração no comportamento padrão dos ratos. Todos os óleos

essenciais induziram miotonia, taquipnéia e dispnéia. A DL50 calculada foi de 168,6

(160,5-176,7) mg/kg para o Croton argyrophylloides de 163.8 (155.3-172.3) mg/kg para o

Croton nepetaefolius e de 117,95 (110,61-125,29) mg/kg para a Lippia sidoides. O Croton

zehntneri não apresentou toxicidade nas concentrações testadas for i.p. administração e

depois da administração oral nenhum óleo essencial demostrou toxicidade até 3 g/kg.

Além disso a avaliação toxicológica do óleo essencial, mais eficiente, com

atividade antifúngica, que também foi o mais abundante, foi administrado durante 30 dias

por gavagem, oralmente, nas doses correspondente a DL50 estimado pela rota

intraperitoneal. A administração subcrônica do óleo essencial da L. sidoides foi destituído

de toxicidade. O peso corporal não foi afetado pelo tratamento, estando com 322,9 ± 18,96

g no primeiro dia e 328,3 ± 22,67 g no 30o. dia quando comparado com o veículo de

tratamento dos animais 331,1 ± 24.0 g vs. 357,2 ± 21,2 (p>0,05) (tabela 6).

(Fonte: Fontenelle, 2005)

Figura 9: Halo de inibição produzido pela maior concentração (100mg/mL) do OECn perante cepa de Microsporum canis.

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Tabela 6: Peso dos ratos após tratamento com 117,95 mg/kg de óleo essencial da Lippia

sidoides durante 30 dias.

Grupo Peso inicial Peso final Tratado com Lippia sidoides 322,9 ± 18,96 g 328,3 ± 22,67 g

Controle 333,1 ± 24,.02 g 357,2 ± 21,19 g

Os parâmetros bioquímicos analisados, creatinina, uréia e TGO e TGP, não

foram significativamente afetados (tabela 7). Os perfis séricos dos vários marcadores não

foram alterados quando comparados com o controle interno, i.e., os valores obtidos antes

dos tratamentos ou com os grupos tratados com salina (tabela 8). Adicionalmente a

avaliação histopatológica do fígado, rins, pulmões, coração e baço não revelou alterações

na estrutura padrão dos tecidos estudados. Por isso, a administração da DL50 do óleo

essencial da Lippia sidoides a ratos durante 30 dias não induziu manifestações significantes

sistêmicas de toxicidade. Similarmente, os perfis hematológicos de ratos Wistar não foram

significativamente afetados.

Tabela 7: Parâmetros Bioquímicos de ratos Wistar antes do tratamento, após 15 dias e 30 dias do tratamento com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo.

Parâmetros Bioquímicos/Toxicidade Sub Crônica

Grupo Uréia Creatinina TGO TGP

Antes de OELs

88,71 ± 19,85 (n=10)

0,87 ± 0,09 (n=10)

100,2 ± 15,89 (n=10)

52,1 ± 9,98 (n=10)

OELs (15 dias)

55,96 ± 4,87 (n=09)

0,87 ± 0,16 (n=08)

125,7 ± 10,33 (n=09)

55,54 ± 9,15 (n=09)

OELs (30 dias)

46,56 ± 8,65 (n=09)

0,84 ± 0,06 (n=09)

135,3 ± 12,94 (n=09)

41,86 ± 10,52 (n=09)

Antes do veículo

51,8 ± 18,65 (n=10)

1,04 ± 0,05 (n=10)

138,3 ± 15,89 (n=10)

37,02 ± 13,68 (n=10)

Veículo (15 dias)

64,4 ± 9,53 (n=10)

0,89 ± 0,13 (n=10)

120,3 ± 10,33 (n=10)

66,36 ± 13,77 (n=10)

Veículo (30 dias)

48,4 ± 7,68 (n=10)

0,97 ± 0,15 (n=10)

122,2 ± 12,94 (n=10)

50,25 ± 14,25 (n=10)

Page 66: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

66

Tabela 8: Parâmetros hematológicos de ratos Wistar antes e depois de tratamento oral com 117.95 mg/Kg de óleo essencial da Lippia sidoides ou veículo durante 30 dias.

Dia zero 30 dias após tratamento com OELs

Parâmetros Média ± EP IC (95%) Média ± EP IC (95%)

Hemáceas MM3 3,6 ± 1,75 3,5 – 3,7 3,5 ± 178000 3,3 - 3.,6

Hemoglobina g/dL 8, 9 ± 1,3 8,08 – 9,69 8,4 ± 1,28 7,47 – 9,32

Hematócrito % 28,7 ± 1,2 27,84 – 29,62 28,45 ± 1,17 27,61 – 29,29

Leucócitos totais 6820 ± 877 6121 - 7519 6590 ± 967,8 5898 - 7282

Page 67: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

67

Discussão

Page 68: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

68

8 DISCUSSÃO

Os óleos essenciais são fontes potenciais de componentes antimicrobianos

(Lemos et al., 1990; Souza et al., 2003; Gurgel et al., 2005; Phongpaichit et al., 2005;

Yayli et al., 2005). Os resultados de pesquisas anteriores, contudo, dificilmente podem ser

correlacionados com estudos atuais, visto que os métodos empregados para testar a

atividade destes compostos não são padronizados. A composição dos óleos essenciais varia

grandemente na dependência da região geográfica, devido a variedade e idade da planta,

bem como pelo método de secagem e de extração empregados (Jerkovic et al., 2001).

Nosso estudo mostrou que o óleo essencial do Croton zehntneri e da Lippia

sidoides foram efetivos contra Microsporum canis, uma das mais comuns espécies de

dermatófito causador de infecções fúngicas superficiais em humanos, gatos e cachorros

(Brilhante et al., 2005; Sidrim & Rocha, 2004; Brilhante et al., 2005a,b).. Eles também

foram ativos contra foram ativos contra Candida spp. e Malassezia pachydermatis, que são

leveduras importantes, envolvidas em micoses de humanos e animais (Sidrim & Rocha,

2004). Os óleos essenciais do C. argyrophylloides e C. nepetafolius foram pouco efetivos

e não mostraram um perfil de concentração-relação.

Os maiores componentes dos óleos essenciais que foram mais eficientes com

relação à atividade antifúngica foram identificadas como o estragol e o anetol para o C.

zehntneri e o timol para a L. sidoides.

A ausência de atividade contra leveduras pelos óleos essenciais do C.

argyrophylloides e C. nepetafolius contrastando com a eficácia do C. zehntneri e da L.

sidoides pode ser explicada pela presença do estragol e do anetol em altas quantidades no

C. zehntneri e do timol na L. sidoides. Estes componentes não estão presentes no óleo

essencial do C. argyrophylloides e do C. nepetafolius e tais compostos foram previamente

registrados por serem efetivos como antifúngico incluindo leveduras (?).

Page 69: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

69

Lopes Júnior et al. (2005) determinaram que o óleo essencial do Croton

zehntneri tinha ação antibacteriana contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli e

Klebisiella pneumoniae, bem como ação antifúngica contra Cryptococcus neoformas e

Candida albicans. No presente estudo, o estudo fitoquímico feito com o óleo essencial do

Croton zehntneri usado, demonstrou a presença de estragol e anetol, sendo este último uma

substância que previamente mostrou atividade antifúngica (Lopes Júnior et al., 2005).

Lacoste et al., 1996 registraram o potencial antimicrobiano da L. sidoides contra

microrganismo da microflora da pele, bem como seus principais componentes, timol e

carvacrol (Lacoste et al., 1996)

O presente estudo revelou que a administração por até 30 dias de uma dose

correspondente a DL50 não afetou qualquer parâmetro bioquímico, hematológico ou

histopatológico estudado. Uma vez que o OELs está sendo testado quanto a sua eficácia

antifúngica e quanto a sua segurança com relação ao tratamento, o período de

administração é suficiente para comprovar que este óleo essencial é seguro para

administração oral em protocolos com dosagens simples ou repetidas como proposta

terapêutica até o limite da DL50.

A contagem de células vermelhas do sangue também foi normal após

tratamento durante 30 dias com OELs e nenhuma alteração foi observada no hematócrito

ou valores de hemoglobina. As plaquetas também permaneceram inalteradas em número e

forma. Por isso, é improvável que a administração por longo prazo de OELs cause danos

diretos nas células sangüíneas, na medula óssea ou anormalidades na absorção ou

incorporação de nutrientes necessários para a eritropoiese, pelo menos em grau suficiente

para causar anemia. Similarmente, a administração durante 30 dias de OELs não causou

efeitos significantes na contagem total ou diferencial das células sangüíneas da linhagem

branca. Assim, estes efeitos dão suporte à falta de efeitos tóxicos induzidos por OELs

diretamente nas células sangüíneas e nenhum dano direto à medula óssea. Além do mais,

uma atividade imunodepressora deste extrato é também improvável.

Page 70: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

70

Os resultados sugerem a importância e a necessidade de pesquisas do potencial

no uso dos os óleos essenciais no tratamento de infecções fúngicas. O pequeno número de

antifúngicos disponíveis para o tratamento de micoses, a maioria fungistáticos, juntamente

com a resistência emergente induz a pesquisa de terapêuticos alternativos combinado com

o baixo custo e baixa toxicidade, como os óleos essenciais.

Os resultados deste estudo explicam e justificam, em parte, o uso popular

destas plantas para o tratamento de micoses e destacam o potencial antifúngico que podem

ser explorados para propósitos terapêuticos como uma alternativa para o tratamento de

micoses superficiais.

Os óleos essenciais do C. zehntneri e da L. sidoides podem ter uma eficiente

aplicação como medicamento tópico para a pele no o tratamento de infecções fúngicas e

bacterianas superficiais, particularmente em micoses cutâneas.

Page 71: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

71

Conclusões

Page 72: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

72

9 CONCLUSÕES

1 Os óleos essenciais do Croton zehntneri e da Lippia sidoides apresentaram

atividade contra cepas de M. canis, Candida spp e Malassezia pachydermatis;

2 os óleos essenciais do Croton nepetaefolius e do Croton argyrophylloides

demonstraram atividade apenas contra o M. canis;

3 a administração, por longo prazo, de OELs é relativamente segura e,

provavelmente, desprovida de toxicidade significativa;

4 os óleos essenciais das plantas estudadas constituem fontes importantes de

compostos antifúngicos que podem ser úteis no tratamento de micoses em

animais.

Page 73: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

73

10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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82

Anexo

Artigo científico

Page 83: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

83

JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY

ANTIFUNGAL AND TOXICOLOGIAL EVALUATION OF ESSENTIAL

OILS FROM NORTHEAST BRAZIL

R. O. S. Fontenelle1; S. M. Morais1.4. * ; E. H. S. Brito1; M. R. Kerntopf1; R. S. N.

Brilhante2; A. J. Monteiro5; A. R. Tomé1; M. G. R. Queiroz6; N. R. F. Nascimento1;

J.J.C. Sidrim 2; M. F. G. Rocha1.2.

1Faculty of Veterinary; Post-Graduation Program in Veterinary Sciences; State

University of Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.

2Departament of Pathology and Legal Medicine. Faculty of Medicine. Medical

Mycology Specialized Center. Federal University of Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.

3Departament of Biology. State University of Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.

4Departament of Chemistry. State University of Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.

5Departament of Statistics. Federal University of Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.

6Departament of Clinical Biochemistry. College of Pharmacy, Federal University of

Ceará. Fortaleza – CE. Brazil.

Page 84: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

84

Author for correspondence: Selene Maia de Morais. Rua Ana Bilhar. No. 601. Apto

400: Meireles. CEP: 60 160-110. Fortaleza. CE. Brazil. Phone: 55 (85) 3232-3834.

Fax: 55 (85) 3495-8692. E. mail: [email protected]

Page 85: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

85

Abstract

Mycoses are serious public health concern specially in subtropical and tropical regions

with dermatophytes and yeast infections being the most common pathogens. This work

was undertaken in order to test whether essential oils extracted from the leaves of Croton

species (Croton nepetaefolius, Croton argyrophylloides and Croton zehntneri) or from

Lippia sidoides would represent a potential therapeutic alternative for this infectious

threats. This plants are used in the folk medicine to treat dermatological problems and we

tested them in vitro against several strains of Microsporum canis, Candida albicans,

Candida tropicalis e Malassezia pachydermatis and also evaluated its acute and sub-

chronic toxicological effects. The chemical constituents of the essential oils were

determined by GL-Chromatography coupled to mass espectroscopy. The essential oils

obtained from Croton nepetaefolius and Croton argyrophylloides were effective only

against M. canis while the essential oils of Croton zehntneri and Lippia sidoides were

effective against all tested strains in a dose-related way. Lippia sidoides was the most

efficient being at the higher doses used (i.e. 75 and 100 mg/mL) as effective as the

positive controls used griseofulvin for M. canis, itraconazol for M. pachydermatis and

amphotericin B. Lippia sidoides essential oil at these doses sometimes completely inhibited

fungi growth. This essential oil has thymol (59.6%) and caryophyllene (10.6%) as major

constituents. The acute administration of all essential oils up to 3 g/Kg by the oral route to

mice was devoided of overt toxicity. The oral administration of 100 mg/Kg to rats during

30 days did not induce histopathological, haemathological or serum biochemical

alterations. Therefore, due to its high efficacy and low toxicity the essential oils of Croton

zehntneri and Lippia sidoides are promising drugs in the search of new antifungal drugs.

Key-words:Croton spp, Lippia sidoides, dermatophytes, yeasts, antifungal activity.

Page 86: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

86

Introduction

Mycoses constitute a common health problem, especially in tropical and

subtropical developing countries; dermatophytes and Candida spp. being the most

frequent pathogens. In recent years, there has been a quest for new antifungal

compounds due to lack of efficacy, side effects, and resistance associated with the

existing drugs. Much attention has been drawn to plant-derived fungicides, based on

the knowledge that plants have their own defense against fungal pathogens. Plants are

capable of sensing the presence of potential phytopathogens including fungi and can

produce antifungal compounds to protect themselves from biotic attack, that could be

essential against fungal infection (Wojtaszek, 1997).

Essential oils obtained from many plants have recently gained popularity and scientific

interest. Many plants have been used for different purposes, such as food, drugs and

perfumery (Fostel and Lartey, 2000; Giordani et al, 2001).

Researchers have been interested in biologically active compounds isolated from

plants species for the elimination of pathogenic microorganisms, because of the

resistance that microorganisms have built against many synthetic antibiotics (Essawi &

Srour, 2000; Gurgel et al., 2005). In traditional medicine, many essential oils were

claimed to be effective against fungal pathogens and therefore, research on this field

may lead to the development of effective drugs against pathogenic fungi (Ezoubeiri et

al., 2003; Rasooli et al., 2005; Gurgel et al., 2005; Yayli et al., 2005; Baldovini et al.,

2005).

Widely spread in Brazilian Northeast flora, mainly in the caatinga region, Croton

species are used for several indication in the folk medicine (Lorenzi and Matos, 2002).

Some pharmacological activities of Croton essentil oils were validated such as intestinal

Page 87: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

87

antispasmodic for C. nepetaefolius and C. zehntneri, (Magalhães et al., 1998 and 2003),

antimicrobial for C. argyrophylloides (De Albuquerque et al., 1974) and

antihypertensive for C. nepetaefolius (Lahlou et al., 1999).

On the other hand, Lippia sidoides Cham. is a Verbenaceae known as “alecrim-

pimenta” used in folk medicine (the aerial parts) as antiseptic. The essential oil

extracted from the leaves, which has thymol and carvacrol as major constituents, was

shown in preliminary studies, to have bactericidal and antifungal activity (Lemos et al.,

1990) as well as larvicidal activity against Aedes aegypti Linn (Carvalho et al., 2003).

The specific aim of the present study was to examine, in vitro, the antifungal activity of

essential oils from C. nepetaefolius, C. zehntneri, C. argyrophylloides and Lippia

sidoides against Microsporum canis, Malassezia pachydermatis, Candida albicans and

Candida tropicalis, as well as study its chemical composition and evaluate acute and

subchronic toxicity in mice and rats.

2. Materials e Methods

2.1. Botanic identification

Croton species (Croton nepetaefolius, Croton argyrophylloides and Croton zehntneri)

and Lippia sidoides were haversted in Viçosa-Ceará, Brazil located at 3Û��¶��¶¶�6�(latitude) and e 41Û��¶��¶¶�:��ORQJLWXGH���LGHQWLILHG�E\�ERWDQLVWV�DW�WKH�3ULVFR�%H]HUUD�Herbarium in the Departament of Biology of the Federal University of Ceará where a

voucher sample is deported at the references number #32448, #32444, #32446 and

#25149, respectively.

Page 88: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

88

2.2. Essential oil extraction

The essential oil from the three Croton species studied (Croton nepetaefolius, Croton

argyrophylloides and Croton zehntneri) was extracted by steam distillation in a

clevenger apparatus (Craveiro et al., 1979).

2.3. Chemical analysis of the essential oil

The chemical composition of the essential oil was determined by GL-Chromatography

coupled to mass espectroscopy performed on a Hewlett – Packard 5971 CG/MS

instrument employing the following conditions: polydimethylsiloxano-DB-5 (30 mm x

0.25 �m film thickness) fused silica capillary column; the carrier gas was helium

(1mL/min). The column temperature ranged from 35 to 180�&�PLQ��DW���&�PLQ��WKem

from 180 to 280�&��DW����&�PLQ��PDVV�HVSHFWUR�ZDV�REWDLQHG�E\�HOHWURQLF�LPSDFW����eV. The identification of constituents was done by using computer-based library search,

with retention indices and visual interpretation of the mass spectro (Adams, 2001).

2.4. Antifungal Activity

The fungi employed in this study (Candida albicans {n=05}, Candida tropicalis

{n=03}, Malassezia pachydermatis {n=10} and Microsporum canis {n=10}) were

obtained from the culture collection of the Specialized Center of Medical Mycology,

Federal University of Ceará, Fortaleza, Ceará, Brazil.

The antifungal activity of essential oils from Croton spp. and from Lippia

sidoides were evaluated against dermatophytes and yeast by the agar-well diffusion

Page 89: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

89

method (Camm et al., 1975; Cole, 1994). Briefly, Petri dishes (diameter, 15 cm) were

prepared with Potato Dextrose Agar (Biolab); all oils were weighed and dissolved in

mineral oil to obtain test concentrations of 25, 50, 75 and 100 mg/ml. Griseofulvine,

itraconazole and Anfotericine B were used as positive controls. These drugs were

dissolved in saline at concentration of 0.005mg/ml, 0.008mg/ml and 1mg/ml,

respectivelly. Each fungal strain was suspended in sterile saline and diluted at 1x106 -

5x106 colony forming unit (cfu) per ml. They were “flood-inoculated” onto the surface

of agar of the dish. The wells (6 mm in diameter) were cut from the agar and 0.100 ml

of essential oil were delivered into them. After incubation during 3-5 days for yeasts

and 5-8 days for M. canis, at 28Û&��DOO�dishes were examined for any zones of growth

inhibition and diameters of these zones were measured in milimeters.

2.5. Acute and subchronic toxicity

The essential oil was administered to albino Swiss (Mus musculus) mice

weighing 20-30g by oral route or intraperitoneally at doses ranging from 100 to 3000

mg/kg (n=10 per group). The results obtained were compared to those for animals

treated with Tween 80 (3% in saline v/v; 0.1 ml/100g). The Lethal Dose 50 (LD50) was

calculed by the probit method (Miller and Tainter, 1944) by using SPSS 7.0 for

windows. The animals were observed for an additional period of 1 h and the general

effects were noted in a table modified from Malone (Malone and Robichaud, 1962).

Since, in preliminary studies, the essential oil of Lippia sidoides was shown

to be more potent and efficacious against all tested fungi strains and it was the most

available we decided to study its toxicological (hematological, histopathological and

serum biochemistry in rats by 30 days oral administration. For this, Wistar rats from

Page 90: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

90

both sexes were separated in two groups (n=10/group) and treated with 117.95

mg/Kg/dia Lippia sidoides essential oil or Tween 3% in saline (v/v) by oral gavage.

Blood samples were collectd by punction in the infraorbital plexus at day 0 (one day

before starting oil or vehicle administration) and then in day 15 and 30. The serum

concentration of urea, creatinine, glutamic oxalacetic (GOT) and piruvic transaminases

(GPT) were determined by using commercially kits (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brazil)

and compared inside and between groups.

At the end of the experimental period (30 days), histopathological analysis of

heart, lungs, liver, kidneys and spleen were performed by optical microscopia.

Additionaly, the blood samples collected at day 0 and 30 were used for hematological

examination for red blood cell count, hemoglobin, hematocrit, mean corpuscular

hemoglobin and white blood cell count. The values obtained were compared inside and

between groups.

.2.5. Statistical analysis

The antifungal activity was expressed as mean ± SD of the diameter of zones of

growth inhibition (mm). The antifungal activity of essential oils were analysed by linear

correlation for individual analysis and bicaudal paired Student's t Test to evaluate

differences among essential oils and against positive control.

The LD50 and 95% confidence intervals were calculated using SPSS 1.0 for

Windows. The data obtained from subchronic toxicological studies were expressed as

mean ± 95% confidence intervals and data range. The differences inside and between

groups were evaluated by the analyses of variance ANOVA followed by the correction of

Tukey-Kramer with significance level set at 5%.

Page 91: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

91

3. Results

3.1. Chemical composition of the essential oils

The chemical analysis of the three species of Croton studied and Lippia sidoides

are shown in table 1. Croton nepetaefolius has methyl-eugenol (15.73%) e

bicyclogermacrene (14.08%) as major constituents, while Croton argyrophylloides

presented spathulenol (20.33%) and biciclogermacrene (11.72%) as main components.

Croton Zehntneri analysis revealed estragol (72.85%) and anethol (14.32%) as major

constituents.

The essential oil of Lippia sidoides has thymol (59.65%) and caryophyllene

(10.60%) as major compounds.

Page 92: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

92

Table 1. Chemical analysis of three Croton species and Lippia sidoides

essential oil

Composition (%) K.I. Components C. argyrophylloides C. nepetaefolius C. zehntneri Lippia

sidoides

931 ù-Thujene - - - 1.48 939 ù-Pinene 5.55 - - 0.51 976 Sabineno 4.68 - - - 991 Myrceno - - 0.43 5.43 1018 ù-Terpinene - - - 1.43 1026 Para Cymene - - - 9.08 1031 Limonene - - - 1.01 1033 1,8-Cineole 11.22 8.00 0.59 - 1050 E-�-Ocimene - - 0.38 0.27 1062 G-Terpinene - - - 3.83 1098 Linalool - - - 0.28 1171 Umbellulone - - - 0.46 1189 ù-Terpineol - 3.54 - - 1196 Methyl chavicol - - 72.85 - 1235 Methyl Thymylether - - - 1.79 1285 Anethole - - 14.32 - 1290 Thymol - - - 59.65 1298 Ortho-Vanillin - 5.04 - - 1339 û-Elemene - - 0.16 - 1376 ù-Copaene - - - 0.66 1391 ú-Elemene 6.24 3.72 0.32 - 1404 Methyl-Eugenol - 15.73 - - 1413 E- .-Bergamotene - 4.56 - - 1419 E-Caryophyllene 5.67 11.38 1.63 10.60 1435 E- .-Bergamotene - 9.09 0.22 - 1439 Aromadendrene - 3.35 - 0.53 1455 ù-Humulene - 5.90 0.16 0.56 1459 Dehidroaromadendrane - - - 0.91 1461 Alloaromadendreno - - 0.27 - 1480 Germacrene-D - - 0.93 - 1485 ú-Selinene 3.16 - - - 1500 Bicyclogermacrene 11.72 14.08 5.12 - 1505 Cupareno - - 0.17 - 1506 ú-Bisabolene - 2.95 0.24 - 1524 û -Cadinene - - 0.20 0.35 1578 Spathulenol 20.33 4.28 0.64 - 1581 Caryophyllene Oxide - 4.37 - 0.72 1593 Veridiflorol - - 0.32 -

Page 93: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

93

3.2. Antimicrobial activity

The essential oils from C. nepetaefolius and C. argyrophylloides were only

effective against M. canis. Nevertheless, the essential oils from Croton zehntneri and

Lippia sidoides were effective against all tested fungi strains (table 2, 3 and 4). In this

regard, C. nepetaefolius essential oil was the least effective with saturation of maximal

antifungal activity achieved in the concentration of 50 mg/mL while C. argyraphylloides

and C. zenhtneri inhibited fungal growth in a dose-related fashion. The zones of growth

inhibition were larger with increasing doses showing dose-dependency. On the other hand,

L. sidoides essential oil was clearly more potent than Croton essential oil with higher

growth inhibition zones in the lower concentration when compared with maximal response

obtained with Croton oils. In concentrations ≥ 50 mg/mL L. sidoides essential oil totally

inhibited M. canis growth in culture (table 2). When compared to the positive control drug

used, i.e., griseofulvin (1 mg/mL) all Croton species showed lower maximal growth

inhibition zones. The mean values of growth inhibition zones for the higher concentration

of C. nepetafolius, C. argyraphylloides and C. zehntneri and for griseofulvin were 19.8 ±

7.2, 31.2 ± 9.9, 22 ± 7.3 and 51.6 ± 6.7, respectively (table 2).

Surprisingly, the essential oil obtained from C. nepetafolius or C. argyraphylloydes

were innefective against Candida spp. even in higher concentrations. The addition of these

oils up to 100 mg/mL did not induced any inhibition of fungal growth (table 3). On the

other hand, C. zenthtneri and Lippia sidoides were effective against this strain with L.

sidoides being more potent and in concentrations above 25 mg/mL with higher zones than

the positive control amphotericin B (table 3). The maximal inhibition of fungal growth

measured as zones of inhibition in milimeters for C. zenthneri, L. sidoides and

Page 94: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

94

amphotericin B were 12.6±1.1, 23.2±1.8 (p<0.05 vs. C. zenthneri and amphotericin B) and

10.8±1.5, respectively.

Similarly, C. nepetafolius and C. argyraphylloides essential oils were ineffective

against Malassezia pachydermatis. The incubation of these oils up to 100 mg/mL agains

was devoided of any effect in fungal growth. Although, the incubation of C. zenthneri and

most efficiently L. sidoides essential oil induced a dose-related inhibition of fungal growth.

At 100 mg/mL concentration L. sidoides induced a total inhibition of fungal growth in

culture with higher zones than itraconazole (positive control) in concentrations above 25

mg/mL (table 4). The maximal zones of inhibition for C. zenthneri and itraconazole were

22.6±6.7 and 29.7±9.0 while L. sidoides had similar zones at 30 mg/mL concentration and

41.2±9.5 (p<0.05 vs. C. zenthneri and itraconazole) at 50 mg/mL (table 4).

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95

Table 2 Antifungal activity of the essential oil from Croton species and of the Lippia sidoides against M. canis in agar-well diffusion assay

Growth inhibition zones (mm)

Dermatophytic fungal specie - Microsporum canis

Drugs

25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml (1 mg/ml)

Croton nepetaefolius 10.2±1.7 18.6±4.6a 18.7±4.2a 19.8±7.2a - Croton argyrophylloides 14.8±4.0 21.1±4.2a 26.2±5.5a 31.2±9.9b -

Croton zehntneri 11.8 ±3.0 16.8±5.8 18.7±4.4 22±7.3a - Lippia sidoides 33.4±12.4c TI TI TI -

Griseofulvin - - - - 51.6 ± 6.7d

TI= Total inhibition of fungal growth a p<0.05 vs. 25mg/mL b p<0.05 vs. 50 mg/mL c p<0.05 vs. Croton species tested at 25 mg/mL d p<0.05 vs. All concentrations of Croton species tested and L. sidoides at 25 mg/mL

Table 3 Antifungal activity of the essential oil from Croton species and of the Lippia sidoides against Candida spp. in agar-well diffusion assay

Growth inhibition zones (mm)

Yeast fungal species – Candida spp.

Plants

25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml ����J�PO�

Croton nepetaefolius NI NI NI NI - Croton argyrophylloides NI NI NI NI -

Croton zehntneri 7.4±1.1 9.0±1.4 10.0±1.5 12.6±1.1 - Lippia sidoides 9.8±0.9 16.4±2.1a 21.5±4.2a,b 23.2±1.8a,b -

Amphotericin B - - - - 10.75 ± 1.5 NI= None inhibition of fungal growth a p<0.05 vs. 25mg/mL b p<0.05 vs. Amphotericin B

Page 96: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

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Table 4 Antifungal activity of the essential oil from Croton species and of the Lippia sidoides against M. pachydermatis in agar-well diffusion assay

Growth inhibition zones (mm)

Yeast fungal specie – Malassezia pachydermatis

Plants

25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml ����J�PO�

Croton nepetaefolius NI NI NI NI - Croton argyrophylloides NI NI NI NI -

Croton zehntneri 11.6 ± 2.9 13.2 ± 2.7 17.2 ± 3.9a 22.6 ± 6.7a - Lippia sidoides 30.0 ± 10.0 41.2 ± 9.5b 50.0 ± 8.3a,b TI -

Itraconazole - - - - 29.7 ± 9.0 TI= total inhibition of fungal growth NI= None inhibition of fungal growth a p< 0.05 vs. 25 mg/mL b p< 0.05 vs. Itraconazole

3.3. Toxicity

The administration of essential oils at doses ranging from 100 to 3000 mg/Kg

induced no remarkable alterations in the behavior pattern of mice. All essentials oils

induced myotonia, tachypnea, and dyspnea. The calculated LD50 and 95% confidence

interval for Croton argyrophylloides were 168.6 (160.5-176.7) mg/Kg, for Croton

nepetaefolius were 163.8 (155.3-172.3) mg/Kg and for Lippia sidoides were 117.95

(110.61-125.29) mg/Kg. Croton zehntneri was devoided of any overt toxicity after

intraperitoneal administration. None of the essential oil tested presented remarkable signs

of toxicity after ora administration up to 3 g/Kg.

In further toxicological evaluation the most efficient antifungal essential oil, which

was the most abundant too, was administered during 30 days by oral gavage in a dose

correpondent to the LD50 estimated for the intraperitoneal route. The sub-chronic

administration L. sidoides essential oil was devoided of overt toxicity. The body weight

was not affected by the treatment being 322.9 ± 18.96 g in the first day and 328.3 ± 22.67

Page 97: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

97

g at the 30th day as compared to 331.1± 24.0g vs. 357.2 ± 21.2 in vehicle treated animals

(P>0.05).

Moreover, the serum biochemical parameters observed, i.e., creatinine, urea and

oxalacetic-piruvic and glutamic-piruvic transaminases were not significantly affected

(table 5). Additionally, the histopathological evaluation of liver, kidney, lungs, heart,

spleen revealed no structural alterations in these organs obtained from L. sidoides essential

oil reated animals as well as in vehicle treated animal. Similarly, the evaluation of red and

white blood cell reveal no remarkable sign of hematological toxicity induced by L. sidoides

essential oil.

Page 98: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

98

Table 6

Serum Biochemical parameters of Wistar rats during sub-chronic oral administration of Lippia sidoides essential oil

Groups Urea Creatinine GOT GPT

L. sidoides

Day 0 88.71 ± 19.85

(n=10) 0.87 ± 0.09

(n=10) 100.2 ± 15.89

(n=10) 52.1 ± 9.98

(n=10)

L. sidoides

15th day 55.96 ± 4.87

(n=09) 0.87 ± 0.16

(n=08) 125.7 ± 10.33

(n=09) 55.54 ± 9.15

(n=09) L. sidoides

30th day 46.56 ± 8.65

(n=09) 0.84 ± 0.06

(n=09) 135.3 ± 12.94

(n=09) 41.86 ± 10.52

(n=09) Vehicle Day 0

51.8 ± 18.65 (n=10)

1.04 ± 0.05 (n=10)

138.3 ± 15.89 (n=10)

37.02 ± 13.68 (n=10)

Vehicle 15th day

64.4 ± 9.53 (n=10)

0.89 ± 0.13 (n=10)

120.3 ± 10.33 (n=10)

66.36 ± 13.77 (n=10)

Vehicle 30th day

48.4 ± 7.68 (n=10)

0.97 ± 0.15 (n=10)

122.2 ± 12.94 (n=10)

50.25 ± 14.25 (n=10)

Table 7

Hematological Parameters of Wistar rats during sub-chronic oral administration of Lippia sidoides essential oil

Day 0 30th day

Parameters Média ± EP IC (95%) Média ± EP IC (95%)

Red Cells x 10 6/mm3 3.6 ± 1.75 3.5 x 106 - 3.7 x 106 3.5 x 106 ± 178000 3.3 x 106 - 3.6 x 106

Hemoglobin g/dL 8.9 ± 1.3 8.08 - 9.69 8.4 ± 1.28 7.47 - 9.32 Hematocrit % 28.7 ± 1.2 27.84 - 29.62 28.45 ± 1.17 27.61 - 29.29

Leucocytes x 103 / mm3 6820 ± 877 6121 - 7519 6590 ± 967.8 5898 - 7282

Page 99: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

99

4. Discussion

This study shows that the essential oil of C. zenthneri of Lippia sidoides are quite

effective against Microsporum canis, one of the most common species of dermatophytes

that cause superficial fungal infection in humans, cats and dogs. They were also active

against Candida spp. and Malassezia pachydermatis, which one important yeasts envolved

in diseases (Brilhante et al., 2004). The essential oils of C. argyraphylloides and C.

nepetafolius were mildly effective and did not show a good concentration-relation profile.

The major components of the more efficient antifungal essential oils were

identified as estragol and anethol for C. zenhtneri and thymol for L. sidoides.

The absence of activity against yeast by the essential oils from C. nepetafolius and

C. argyraphylloides contrasting to the efficacy of C. zenthneri and L. sidoides may be

explained by the presence of estragol and anethol in high amounts in C. zenthneri and of

thymol in L. sidoides. These compounds are not present in the essential oil of C.

argyraphylloides or C. nepetafolius and were previously reported to be effective as

antifungals including against yeasts (Shin and Pyun, 2004; Giordani et al., 2004; Shin and

Kim, 2004; Mimica-Dukic et al., 2003; Lachowicz et al., 1998; Wan et al., 1998).

Plant essential oils are a potentially useful source of antimicrobial compounds.

Results reported from different studies are difficult to compare, presumably, because of

different test methods, bacterial strains and sources of antimicrobial samples used. The

compositions of the essential oil of herbs and spices can vary greatly depending upon the

geographical region, the variety, the age of the plant, the method of drying and the method

of extraction of the oil (Jerkovic et al., 2001).

Page 100: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

100

For instance, Lopes Júnior et al., 2005 found that the essential oil from Croton

zehntneri reveal antibacterial action against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and

Klebisiella pneumoniae and antifungal action against Cryptococcus neoformas and

Candida albicans. In addition phytochemical studies carried out on essential oil used in

this study demonstrated the presence of estragole and anethole, which were previously

shown to exert antifungal activity (Lopes Júnior et al., 2005). Lacoste et al., 1996 reported

the antimicrobial potential of L. sidoides against microorganisms from skin microflora as

well as its main components, thymol and carvacrol (Lacoste et al., 2006).

On the other hand, this study shows that the oral administration of L. sidoides

essential oil during 30 days at a 117 mg/Kg dose regime (equivalente to the calculated

LD50 after intraperitoneal injection in mices) did not induce any significant alteration in the

biochemical or hematological parameters analyzed, nor altered weight gain or structural

pattern of main organs as revealed by the histopathologic analysis. Despite additional tests,

as reproductive toxicity analysis, cytotoxic and mutagenesis evaluation must be

performed, the present results show that L. sidoides essential oil is probably safe for acute

use to treat superficial mycoses.

The results underline the importance and the need for research into the potential

use of essential oils in the management of fungal infections. The relatively small number

of antifungals available for the treatment of mycoses, most of them fungistatic, together

with emerging resistance, led us to search for therapeutic alternatives combining low cost

and low toxicity, such as essential oils.

The result of this study explain and justify, at least in part, the popular use of this

plants for the treatment of mycoses and points out the potential antifungal effect of them

Page 101: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

101

that can be explored for therapeutic purposes as an alternative treatment for superficial

mycoses.

The essential oils of C. zenthneri and L. sidoides may find efficient application as

a topical skin ointment for the treatment of superficial fungal and bacterial infection,

particularly in cutaneous mycoses.

Page 102: Dissertação Raquel Oliveira dos Santos

102

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