Dispersin de luz (light scattering)

Dispersin de luz

11Dispersin de luz

2John William StruttLord Rayleigh

2Dispersin de luz

3El fotn incidente induce un dipolo oscilante en la nube electrnica. Al cambiar el dipolo, la energa se irradia-dispersa en todas direcciones. 3Dispersin de luzSe puede analizar de diferentes maneras:

Intensidad promedio (Esttica)(SLS, static light scattering)

Fluctuaciones en la intensidad (Dinmica)(DLS, dynamic light scattering)44Dispersin de luz estticaMedida de masas molecularesIntensidad promedio de dispersin es funcin de la masa molecular y el 2do coeficiente virial5

K = constante pticaMM = masa molecularA2 = 2do coeficiente virial

C = Concentracin (g/L)Rq = relacin de Rayleigh (trmino que incluye la intensidad)

5Dispersin de luz esttica

6ConstanteFactor de forma, = 1 si r < 60 nmRelacin de Rayleigh

6Dispersin de luz estticaLa intensidad de luz dispersada que produce una macromolcula es proporcional al producto de la masa molecular promedio y la concentracin de la macromolcula (I MMC)

Si no hay dependencia entre la intensidad de dispersin y el ngulo de medida, se puede determinar MM con medidas en un solo ngulo

Un grfico de Debye permite la determinacin de:MM absoluta2do coefciente virial (A2)77Dispersin de luz esttica2do Coeficiente Virial Propiedad termodinmica que describe la fuerza de interaccin entre la molcula y el solvente

Si A2 > 0, las molculas tienden a permanecer en solucin (la protena prefiere el buffer)Si A2 = 0 la fuerza de la interaccin protena-solvente es equivalente a la fuerza de la interaccin protena-protena (el solvente se llama solvente theta)Si A2 < 0, la protena tiende a precipitar o agregar88Dispersin de luz estticaSeal de dispersin Rq MM C

Debido a alta MM, los agregados dispersan fuertemente

Variacin angular en la Intensidad de luz dispersada se relaciona con el tamao de la molculaLa luz dispersada por agregados muestra dependencia angular, mientras que la luz dispersa por monmeros y dmeros no.99Dispersin de luz estticaProsDeterminacin de MM rpida y exacta (promedio) de macromolculas en solucinCombinando SEC-MALS se puede determinar MM con una precisin 5%Dependencia angular de seal de LS detecta agregadosSEC-MALS permite detectar y cuantificar poblaciones de protenas segn sus MMPuede determinar estado oligomerico de polipeptidos modificados (prot-cidos nucleicos, glicosilados, etc.

10ContrasPara medir MM promedio, necesita separacin para distinguir estados oligomricos.Posible perdida de muestra durante filtracin y fraccionamiento.

10Dispersin de luz Dinmica11

Permite determinar el tamao de molculas y nanopartculas

La velocidad de fluctuaciones depende del tamao de la partcula - molcula11Dispersin de luz Dinmica12

Fluctuaciones son resultado del movimiento browniano y puede correlacionarse con el coeficiente de difusin y el tamao 12Dispersin de luz DinmicaLa temperatura tiene que ser estable y exactamente determinada (regular la viscosidad y evitar la conveccin)Las partculas ms grandes se mueven ms lentamenteA mayor temperatura, ms rpido se mueven las molculasLa velocidad del movimiento Browniano est definido por el coeficiente de difusin translacional (D)13

13Dispersin de luz DinmicaProsEn cubeta, muy rpida deteccin de agregados y evaluacin de la polidispersin de la muestra con un amplio rango dinmicoAdecuado para estudiar cintica de agregacinDetector disponible para placas, parara screening

ContrasMide radio hidrodinmico, es cual es afectado por la forma de la partculaNo puede distinguir entre cambios de forma o estado de oligomerizacinNecesita fraccionamiento para resolver oligmeros presentes en una mezcla

1414Preparacin de la muestraLas molculas de polmeros son normalmente pequeas comparadas con las partculas de polvo o de otros materiales extraos a la muestra o disolvente.

Los disolventes y soluciones de polmeros deben clarificarse por filtracin o por ultra centrifugacin.

15Preparacin de la muestraLa diferencia entre el ndice de refraccin del disolvente y del polmero debe de ser la mayor posible.

El disolvente debe producir por s mismo una dispersin relativamente baja, y el sistema polmero-disolvente no debe poseer un segundo coeficiente de virialidad demasiado elevado.

Disolventes mixtos deben evitarse, a no ser que posean ambos el mismo ndice de refraccin.

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Esquema de los componentes esenciales de un fotmetro de dispersin de luzRango de aplicacinLa dispersin de luz por las disoluciones se ha utilizado para medir pesos moleculares tan bajos como el de la sacarosa y tan elevados como los de las protenas.

En la prctica, pesos moleculares de polmeros comprendidos entre 10000-10000000 pueden medirse con relativa facilidad, con posibilidades de ampliar el rango en ambos sentidos en casos favorables.

Existen restricciones a la aplicabilidad del mtodo de dispersin de luz a sistemas formados por copolimeros.

18Rango de aplicacin19BibliografaBillmeyer W.Fred, Ciencia de los Polmeros, Revert, 1975, pp 76-79Seymour B. Raimond, Carraher E. Charles, Introduccin a la qumica de los polmeros, Revert, 1995, pp 105-107Protein sizing by light scattering, molecular weight and polydispersity, Malvern Instruments presentation.http://nanoparticles.org/pdf/nobbmann.pdf

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