RESUMENDISEÑO DE MODELOS EXPERIMENTALES EN INVESTIGACIÓN QUIRÚRGICA

Introducción: La investigación en Medicina se basa fundamentalmente en tres fuentes de conoci-miento: En primer lugar, el hombre enfermo que es la fuente natural del conocimiento en la Clínica,en segundo lugar el cadáver, que es la fuente de conocimiento de la Anatomía Patológica y, por últi-mo, el animal de experimentación que es la fuente del conocimiento de la Fisiopatología.

Los avances experimentados en el último siglo han determinado que el concepto “animal de expe-rimentación” deba sustituirse por un concepto mucho más amplio, el de “modelo experimental”.

Objetivos: En este artículo trataremos de aclarar éste último concepto, para lo cual deberemoshacer una serie de consideraciones previas sobre el método experimental y las dos herramientas deque dispone, la estadística y el diseño de experimentos.

Palabras clave: Modelos experimentales. Investigación quirúrgica.

ABSTRACTDESIGN OF EXPERIMENTAL MODELS IN SURGICAL INVESTIGATION

Introduction: Research in Medicine is essentially based on three knowledge resources: diseasedpeople (natural and primary), cadaveric bodies (Pathology primary resource) and experimental ani-mals, whom constitutes physiopathologic knowledge resource. Experimental advances reached in thelast century have determined the change of the concept “experimental animal” to a wider term: “expe-rimental model”.

Objetives: This paper tryes to clarify this concept. To attain this goal, we must define previous con-siderations in the meaning of the concept “experimental models” and its two key-elements: statisticsand design of experiments.

Keywords: Experimental models. Surgical research.

Diseño de modelos experimentales en investigación quirúrgica

Del Cañizo López JF*, López Martín D*, Lledó García E**, García Barreno P*.

*Unidad Medicina y Cirugía Experimental. **Servicio de Urología. Hospital General Univ. Gregorio Marañón. Madrid.

Actas Urol Esp. 2008;32(1):27-40

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ACTAS UROLÓGICAS ESPAÑOLAS ENERO 2008ORIGINAL

La investigación en Medicina se basa funda-mentalmente en tres fuentes de conocimien-

to: En primer lugar, el hombre enfermo que es lafuente natural del conocimiento en la Clínica, ensegundo lugar el cadáver, que es la fuente deconocimiento de la Anatomía Patológica y, porúltimo, el animal de experimentación que es lafuente del conocimiento de la Fisiopatología.

Los avances experimentados en el último siglohan determinado que el concepto “animal deexperimentación” deba sustituirse por un con-cepto mucho más amplio, el de “modelo experi-mental”. En este artículo trataremos de aclarar

éste último concepto, para lo cual deberemoshacer una serie de consideraciones previas sobreel método experimental y las dos herramientas deque dispone, la estadística y el diseño de experi-mentos.

EL MÉTODO EXPERIMENTALEl rasgo que caracteriza a una Ciencia es su

Método. Las diferentes ciencias presentan, portanto, ciertas particularidades en la utilización delos diferentes métodos.

Así como las ciencias formales (Lógica yMatemáticas) utilizan sobre todo el método deduc-

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tivo, las ciencias naturales (que pertenecen a lasdenominadas ciencias empíricas o experimenta-les) se han servido principalmente de la demos-tración inductiva. El método de las ciencias natu-rales ha sido denominado “método hipotético-deductivo”.

Los pasos del método hipotético-deductivoson:

1. Punto de partida: se detecta medianteobservación y/o experimentación un problemano resuelto por el saber del que se dispone.

2. Se elaboran una o varias hipótesis explica-tivas del hecho observado o del problema detec-tado. La imaginación para formular hipótesis esindispensable en las ciencias.

3. Una vez formulada una hipótesis se dedu-cen las posibles consecuencias contrastadas porla experiencia. Es el momento deductivo de laciencia empírica.

4. Las consecuencias se someten a contrasta-ción (verificación y falsación) mediante la experi-mentación.

• Verificación. Una hipótesis es verdaderacuando los hechos observados concuerdan conlos hechos deducidos de la hipótesis.

• Falsación. Una hipótesis se refuta o «falsa»cuando los hechos no concuerdan con los hechosdeducidos de la hipótesis.

5. La hipótesis, comprobada en un ciertonúmero de casos, se acepta como ley, es decir,adquiere validez general.

El método experimental, por tanto, exige veri-ficar las hipótesis comprobando que se repiten enun cierto número de casos, para esto cuenta condos herramientas fundamentales: La Estadísticay el Diseño experimental.

LA ESTADÍSTICA Y EL DISEÑOEXPERIMENTAL

La palabra estadística procede del vocablo esta-do, pues era función principal de los gobiernos delos Estados establecer registros de población,nacimientos, defunciones, cosechas, impuestos,etc. Galton (1822-1911) y Pearson (1857-1936) sepueden considerar los padres de la estadísticamoderna. A ellos se debe el paso de la estadísticadeductiva, estudiada hasta su época, a la estadís-tica inductiva, que es la que hoy en día tiene unamayor influencia en todos los campos del saber.

Se puede definir la estadística como el estudiode los métodos y procedimientos para recoger,clasificar y analizar datos y para hacer inferen-cias científicas partiendo de tales datos. Tienedos subcategorías:

• La Estadística descriptiva o deductiva, quetrata de abstraer propiedades de conjuntos deobservaciones mediante el empleo de métodosgráficos, tabulares o numéricos.

• La Estadística Inductiva o inferencia esta-dística, que trata de hacer inferencias acerca deuna población o universo a partir de lo averigua-do en un subconjunto del mismo denominadomuestra.

La inferencia estadística proporciona unaherramienta fundamental para el método científi-co en las ciencias naturales, de hecho, una partemuy importante de la inferencia estadística laconstituye el denominado contraste de hipótesis.Las técnicas de contraste de hipótesis nos permi-ten rechazar o aceptar una hipótesis, la denomi-nada hipótesis nula, con una determinada proba-bilidad. La probabilidad de descartar la hipótesiscontrastada cuando en realidad es cierta (Error detipo I) se denomina nivel de significancia.

Los métodos normalmente utilizados en esta-dística se denominan paramétricos y asumen quelos datos utilizados cumplen determinadas condi-ciones, la principal de las cuales es que los datosse distribuyan según una distribución normal.

Cuando los datos no cumplen las exigenciasdel modelo paramétrico deberán utilizarse losdenominados métodos no paramétricos, que ofre-cen las siguientes ventajas:

1. No requieren una distribución determinadade la población de base.

2. Para tamaños de muestra muy pequeñosson los que deben utilizarse a menos que seconozca con certeza la naturaleza de la distribu-ción de la población.

3. No es necesario que los datos se asignen auna escala numérica, basta con una escala clasi-ficatoria.

Las pruebas paramétricas son más potentes,por tanto, si se cumplen todos los supuestos delmodelo paramétrico, debe elegirse una pruebaparamétrica. Otra desventaja de los modelos noparamétricos es que no permiten probar interac-ciones dentro del modelo de análisis de varianza.

Los métodos estadísticos asumen que los úni-cos errores presentes en los datos que se anali-zan son errores aleatorios; y todos los tests esta-dísticos son robustos frente a este tipo de erro-res. Sin embargo si el diseño de las experienciasno es adecuado, pueden introducirse en los datoserrores denominados sistemáticos que los testsestadísticos son incapaces de detectar.

Las técnicas de diseño experimental, que seinician fundamentalmente en la agricultura en laque, por necesidad, los experimentos consumenmucho tiempo, tratan de optimizar los plantea-mientos experimentales sobre todo tratando deeliminar las fuentes de error sistemático.

Antes de definir el concepto de Diseño Expe-rimental se deben clarificar algunos conceptos pre-vios:

Se denominan factores de un experimento aaquellas modificaciones que introducimos en elmaterial experimental y cuyos efectos pretende-mos estudiar. Por ejemplo, podemos estar inte-resados en los efectos de la disminución detemperatura sobre la tensión de un anillo vas-cular durante un tiempo. En este caso debere-mos considerar dos factores: Temperatura yTiempo.

Es muy importante no confundir los factorescon las variables que registramos para medir losrendimientos del experimento. En este caso lavariable que se mide es la tensión en el anillo vas-cular y sus resultados son los que van a permitirdeducir conclusiones acerca de la influencia delos factores en la experiencia.

Se denominan niveles a los rangos en los quese va a aplicar un determinado factor. En el ejem-plo anterior podemos estar interesado en ensa-yar, por ejemplo, dos temperaturas: 37º y 20º, ydos tiempos: 5 min y 10 min. Entonces el factortemperatura tendrá dos niveles: 37 y 20, y el fac-tor tiempo también dos niveles: 5 y 10.

Se denomina tratamiento a una combinaciónde factores con un determinado nivel. En el ejem-plo citado, un tratamiento posible sería: 37º detemperatura y 5 minutos.

Se llama parcela o unidad experimental aaquella partida de material experimental a la quese le aplica un determinado tratamiento. En elejemplo anterior la unidad experimental sería unanillo vascular, pero las unidades experimentales

pueden ser muy variadas, desde animales com-pletos hasta órganos aislados, porciones de tejidoo células.

Se denomina bloque a un conjunto de unida-des experimentales con similares características.El bloque debe tener el mismo número de unida-des experimentales que de tratamientos a consi-derar, de tal forma que el conjunto de tratamien-tos se aplique a unidades experimentales quedifieran entre sí lo mínimo posible, se deberánconsiderar tantos bloques como repeticiones delos tratamientos a realizar.

Se puede entonces definir el diseño experi-mental como aquel conjunto de técnicas encami-nadas a estudiar y definir:

1. El conjunto de tratamientos que va a sercontrastado.

2. Las parcelas o unidades experimentalesque van a utilizarse.

3. Las reglas por las cuales van a asignarse lostratamientos a las distintas unidades expe-rimentales.

Requerimientos de un buen experimentoAusencia de error sistemático. Hay que asegu-

rar que las unidades que reciban un determina-do tratamiento no difieren de forma sistemáticade aquellas que reciben otro tratamiento, o bienque la metodología del experimento no varía deunas a otras.

Las diferencias entre tratamientos deben serpuramente aleatorias. Las unidades deben res-ponder de forma independiente a los diferentestratamientos. La mejor forma de suprimir el errorsistemático es la aleatorización. Es fundamentalconsiderar todas las fuentes posibles de error sis-temático, ya que, como dijimos anteriormente,los tests estadísticos no son robustos ante estetipo de errores y nos podrían conducir a falsasconclusiones.

Precisión. Si se elimina el error sistemático, laestima realizada diferirá de su valor verdaderosólo por errores aleatorios. La medida de los erro-res aleatorios y por tanto de la precisión suelerealizarse por medio del error estándar. La preci-sión depende de:

1. La variabilidad intrínseca del material expe-rimental.

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2. Del número de repeticiones.3. El diseño del experimento y del método de

análisis estadístico.

Amplio rango de validez. Debe realizarse eldiseño del experimento de tal forma que susconclusiones sean aplicables a un campo lomás amplio posible. Este requerimiento puedeser de poca importancia en el trabajo científicopuro.

Simplicidad. Cuanto más sencilla sea la meto-dología de un experimento menos fuentes deerror introduciremos en el mismo, con lo queaumentaremos su precisión y serán menores suduración y su costo.

Denominamos coste de un experimento a cual-quier valor cuantitativo que exprese el esfuerzototal gastado, bien sea tiempo dinero o cantida-des de materiales. El coste de un experimento esaproximadamente proporcional al número deunidades experimentales utilizadas. Puede divi-dirse el coste en dos partidas fundamentales:

a) Gastos de implantación. b) Gastos por unidad experimental.Con frecuencia hay que llegar a un compromi-

so entre coste y precisión, sobre todo en aquellosexperimentos en los que los costes por unidadexperimental son altos. En estos casos debedeterminarse cuidadosamente el número de uni-dades a utilizar con el fin de que los costes no sedisparen.

Debe realizarse un análisis previo de las fuen-tes por medio de las cuales se va a financiar eltrabajo. En el medio hospitalario es frecuenteencontrar experimentos “gratuitos”.

Por su importancia se describirá someramen-te un tipo especial de diseños que se denominanFactoriales. Se llaman experimentos factoriales aaquellos en los que se estudian cierto número defactores simultáneamente. Cuando los trata-mientos consisten en todas las combinacionesposibles que pueden formarse con los distintosniveles de los factores se dice que es un experi-mento factorial completo.

En un experimento factorial cada efecto prin-cipal se estima con la misma precisión que sitodo el experimento se hubiera dedicado a esefactor.

Además permite estudiar interacciones entrelos factores, por ejemplo adición o potenciaciónde los efectos.

En resumen, el método que utiliza la Fisiopa-tología Quirúrgica para la adquisición de conoci-miento es el denominado Método Experimental oMétodo de las Ciencias Naturales que cuenta condos herramientas fundamentales: La Estadísticay el Diseño Experimental.

MODELOS EXPERIMENTALESLa Fisiopatología se caracteriza precisamente

por tener una fuente de conocimiento propia; elanimal de experimentación. Decíamos en la intro-ducción, que el término animal de experimenta-ción había que interpretarlo en un sentido amplio.Hoy en día el desarrollo de la Ciencia en general yde la Técnica en particular permite la utilizaciónde otros medios además del animal de experimen-tación como fuentes de conocimiento en Fisio-patología; por este motivo se debe sustituir estetérmino por el más amplio de “Modelos Expe-rimentales”. No se debe olvidar, asímismo, que elser humano constituye también una fuente funda-mental para el conocimiento de la disciplina; es enla Clínica donde se plantean los problemas a losque la Fisiopatología debe dar explicación; y es elser humano, considerado como sujeto experimen-tal, en el que finalmente habrá que buscar la con-firmación definitiva de nuestras hipótesis.

Según el método experimental, para consideraralgo como cierto debe repetirse de forma sistemáti-ca. En muchas circunstancias y, sobre todo, enMedicina esto no es posible. Debemos recurrirentonces a modelos experimentales, lo más pareci-dos a la realidad, para reproducir las experiencias.

Definimos, entonces, Modelo Experimentalcomo cualquier sistema, lógico, físico o biológicocapaz de simular total o parcialmente el procesoque pretendemos estudiar.

Podemos considerar los siguientes tipos deModelos Experimentales:

• Los modelos matemáticos (simulación porordenador).

• Los modelos físicos o mecánicos.• Los modelos biológicos.- Celulares y tisulares.- Órganos aislados.- Animales completos.

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• El ser humano como sujeto experimental.Como es lógico, la calidad de la información

que se puede obtener de un modelo estará enrelación directa con su complejidad. Normal-mente la resolución de un determinado proble-ma requiere la utilización de varios modelos,comenzando por los más sencillos como lasimulación por ordenador o los modelos mecá-nicos, para terminar con los más complicados,como son el animal de experimentación o inclu-so el hombre.

LOS MODELOS MATEMÁTICOS.SIMULACIÓN POR ORDENADOR

El desarrollo espectacular que ha experimen-tado la informática en los últimos años ha posi-bilitado que herramientas, inimaginables hacetan sólo unas décadas, estén ahora disponiblesprácticamente para cualquier grupo de investiga-ción.

La situación actual permite que, la contrasta-ción de algunas hipótesis que, anteriormentehubieran requerido el uso de animales de experi-mentación, hoy día puedan contrastarse, almenos en sus estadios iniciales, por medio deprogramas informáticos basados en modelosmatemáticos.

Así, en la actualidad, a nadie se le ocurriríainiciar la experimentación animal con una nuevaválvula cardiaca, sin antes haber estudiado lospatrones de flujo que pueden preverse mediantesu estudio en un programa de simulación dedinámica de fluidos.

Lo mismo puede decirse para el estudio hemo-dinámico de un tipo de estenosisvascular, como para el estudio dela expansión de una determinadaenfermedad infecciosa o del com-portamiento previsto de una nue-va bomba de sangre.

Es difícil prever el desarrollo deestas técnicas de simulación, nisiquiera en el futuro inmediato,pero es de esperar que en pocosaños podamos disponer de pro-gramas que nos permitan simularuna buena parte de los sistemasbiológicos (Fig. 1).

LOS MODELOS FÍSICOS O MECÁNICOSEl siguiente escalón en la complejidad de los

modelos experimentales lo constituyen los quedenominamos modelos físicos, que se puedendefinir como aquellos dispositivos (mecánicos,eléctricos, neumáticos, etc., o una combinaciónde ellos) que permiten simular en todo o en partealgún sistema biológico.

Siguiendo con el ejemplo de las válvulas car-diacas, el paso siguiente a los estudios de simu-lación en el ordenador será su estudio en unsimulador hidrodinámico que permita visualizarel flujo real con técnicas especiales como puedeser el PIV (Particle Image Visualisation).

Una vez comprobado el perfil hidrodinámicode la válvula habrá que estudiar su resistenciamecánica con ensayos de fatiga que se realizanen los llamados duplicadores, que son sistemasen los que se somete a las válvulas a frecuencias(l pm) mucho más altas que las normales con elfin de acortar los ensayos que, de otra manera,deberían durar años.

Otro modelo mecánico muy utilizado, sobre todoen nuestro campo principal de investigación, es elcircuito de simulación del aparato circulatorio quepermite reproducir las condiciones de complianza yresistencia del árbol vascular y por tanto compro-bar las características hidrodinámicas de sistemasde asistencia circulatoria antes de comenzar conlas experiencias en animales (Fig. 2).

Como se puede observar, cuanto más sencilloes un modelo experimental mejor permite simu-lar condiciones y medir parámetros que seríanimposibles de implementar en modelos más com-plicados. Por ejemplo, no es posible visualizar elpatrón de flujo de una válvula implantada en un

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FIGURA 1. Simulación del comportamiento hidrodinámico de una bomba debola en el ordenador.

animal con la precisión que se puede hacer en unsimulador hidrodinámico y, por supuesto, no sepodría conseguir aumentar hasta 10 o 100 vecesla frecuencia cardiaca de un animal, con el fin decomprobar la duración de una válvula, sin afec-tar severamente su estado circulatorio.

Sin embargo, cuanto más sencillos son losmodelos más se alejan de la realidad. Es, portanto, la gradación en la utilización de los mode-los la que va a permitir obtener la máxima infor-mación sobre el proceso fisiopatológico que sepretenda estudiar.

LOS MODELOS BIOLÓGICOSLos modelos biológicos suponen la ascensión

de un nuevo escalón en la complejidad delmodelo, la utilización de material biológicoimplica la incorporación de fenómenos homeos-táticos propios de este material cuyos efectospueden ser difíciles de controlar y predecir. Lavariabilidad intrínseca del material biológico esotro factor a tener en cuenta con lo que las téc-nicas de diseño experimental a las que nos refe-rimos antes comienzan a ser de una importan-cia capital en la utilización de este tipo demodelos.

La utilización de material biológico bien sea deanimales o del ser humano tiene además impli-caciones de orden ético, moral y legal que habráque tener en cuenta a la hora de planificar expe-rimentos con estos modelos y a las que nos refe-riremos más adelante.

Atendiendo a su complejidad se pueden divi-dir en:

• Modelos celulares y tisulares.• Órganos aislados.• Animales de experimentación (animal com-

pleto).

Los modelos celulares y tisularesConstituyen el escalón de menor complejidad

dentro de los modelos biológicos, van desde unasimple célula aislada, pasando por los cultivos detejidos hasta la utilización de porciones de tejidoscompletos.

Las posibilidades de este tipo de modelos sonprácticamente infinitas y dependerán fundamen-talmente del campo de la fisiopatología que este-mos interesados en estudiar. Por ejemplo, la pro-ducción de óxido nítrico por la célula endotelialfrente a diferentes estímulos puede estudiarse encultivos de células endoteliales sometidos a dife-rentes tipos de cizallamiento en un medio líquido,la variación del tono vascular frente a diferentescondiciones de temperatura puede estudiarse conla técnica del anillo de vaso aislado, etc. (Fig. 3).

Los órganos aisladosConstituyen un modelo de gran utilidad en el

estudio de muchos procesos fisiopatológicosentre los que se pueden destacar: el estudio detécnicas de conservación de órganos para tras-plante, el estudio de fenómenos de isquemia-reperfusión, o los efectos de diferentes variableshemodinámicas sobre la perfusión del órgano.

Sobre la utilización del animal completo tie-nen la ventaja de aislar el órgano de los procesoshomeostáticos generales del organismo, permi-tiendo someterlo a condiciones que de otra mane-ra serian imposibles de conseguir y además evi-tan las posibles interferencias de otros mecanis-mos de regulación independientes del órgano.

Implican, sin embargo, la utilización de técni-cas de perfusión y de control que requieren equi-pamiento complejo y personal altamente especia-lizado.

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FIGURA 2. Circuito de simulación de aparato circulatorio.

Las posibilidades de monitorización de estosmodelos son también superiores en general a lasque se podrían practicar en el animal completo,su principal inconveniente es precisamente elalejamiento de la realidad que pueden suponer.

Los modelos más utilizados y más amplia-mente descritos son los de corazón, hígado yriñón aislados (Fig. 4).

Los animales de experimentaciónConstituyen el nivel más alto de compleji-

dad de todos los modelos experimentales y portanto el más próximo a las condiciones reales.Son, por derecho propio, el modelo por exce-lencia y la fuente principal de conocimiento dela Fisiopatología Quirúrgica. Su utilizaciónimplica, sin embargo, la disponibilidad de ins-talaciones y personal especializados sobre todosi se pretende la utilización de animales gran-des.

Estas instalaciones deben incluir al menos:• Instalaciones para la estabulación y el cui-

dado postoperatorio de los animales y en ocasio-nes para su reproducción. Es decir, animalarioscorrectamente equipados y atendidos por perso-nal cualificado y calificado para esta labor.

• Instalaciones de quirófanos experimentalessuficientemente equipados y atendidos por perso-nal adecuado que permitan la realización de estetipo de experiencias con todas las garantías.

Todos los procedimientos e instalaciones rela-cionados con la experimentación con animalesestán sujetos, en nuestro país y en toda la UniónEuropea, a una estricta reglamentación que re-sumimos en el apartado siguiente (Fig. 5).

Legislación aplicable a la experimentacióncon seres vivos• DIRECTIVA DEL CONSEJO DE EUROPA

86/609/CEE, sobre aproximación de las disposi-ciones legales, reglamentarias y administrativasde los Estados miembros respecto a protección delos animales utilizados para experimentación yotros fines científicos. 24 de Noviembre de 1986.

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FIGURA 3. Vaso aislado en baño.

FIGURA 4. Riñón perfundido en baño.

• REAL DECRETO 223/1988, de 14 de Marzosobre protección de los animales utilizados paraexperimentación y otros fines científicos. B.O.E.de 18 de Marzo de 1988.

• ORDEN de 4 de Agosto de 1989 el Consejerode Agricultura y Cooperación de la C.A.M., por laque se dan normas sobre protección de los anima-les utilizados para experimentación y otros finescientíficos. B.O.C.M. de 24 de Agosto de 1989.

• ORDEN de 13 de Octubre de 1989 por la quese establecen las normas de registro de los esta-blecimientos de cría, suministradores y usuariosde animales de experimentación de titularidadestatal, así como las de autorización para elempleo de animales en experimentos, en desarro-llo del Real Decreto 223/1988, de 14 de Marzo.B.O.E. 18 de Octubre de 1989.

• INSTRUMENTO de Ratificación del ConvenioEuropeo sobre protección de los animales verte-brados utilizados con fines experimentales y otrosfines científicos, hecho en Estrasburgo el 18 deMarzo de 1986. B.O.E. 25 de Octubre de 1990.

• REAL DECRETO 1201/2005, de 10 de octu-bre, sobre protección de los animales utilizadospara experimentación y otros fines científicos.B.O.E. 21 de Octubre de 2005.

Este último Real Decreto afecta de forma muyimportante a toda la experimentación con anima-les tanto a nivel de instalaciones como de proce-dimientos y, sobre todo, de acreditaciones delpersonal que realiza los experimentos.

Consideraciones sobre la investigación conanimalesSe harán ahora una serie de consideraciones

que los investigadores han de tener en cuenta ala hora de plantear experiencias con animales.

En primer lugar, los fines que puede perseguirla experimentación con animales, son:

• La prevención de enfermedades.• El diagnóstico o tratamiento de enfermedades.• El conocimiento de condiciones fisiológicas.• La protección del medio ambiente.• La investigación científica.• La educación y formación.• Las investigaciones forenses.Además, los investigadores deben tener en

cuenta que:• No se deben utilizar animales si puede recu-

rrirse a otro medio científicamente satisfactorio.• Dentro de las posibles especies, se utilizará

la más inferior en la escala filogenética.• Se utilizarán el menor numero de animales

posible y los procedimientos que causen menosdolor y sufrimiento.

• Todos los procedimientos se realizarán bajolas condiciones idóneas de anestesia y analgesia.

• Si al final del experimento el animal ha deser sacrificado, se emplearán métodos eutanási-cos humanitarios. No se mantendrá con vida aun animal si es posible que sufra dolor o angus-tia duraderos.

• En general, no se permitirá utilizar a un ani-mal en más de un proyecto de investigación.

• Los animales utilizados en investigacióndeberán proceder de establecimientos registradosdedicados a la cría de animales de experimenta-ción. No se utilizarán animales vagabundos deespecies domésticas.

En el planteamiento de un proyecto experi-mental con animales es además importante teneren cuenta lo que los expertos denominan la “reglade las tres erres” tendente a que el investigadorconsidere técnicas alternativas relacionadas con:Reemplazar los animales en la investigación,Reducir el número de animales utilizados, y/oRefinar la metodología para minimizar el dolor yel sufrimiento de los animales.

Reemplazar:1. Utilizando otros sistemas vivos.2. Usando Sistemas Inertes.3. Utilizando técnicas de simulación por orde-

nador.Estas consideraciones ya se hicieron anterior-

mente al describir los diferentes modelos experi-mentales.

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FIGURA 5. Experiencia con cerdo.

Reducir:1. Animales compartidos.- Una buena organi-

zación puede permitir reducir el número de ani-males utilizados, coordinando los proyectos deinvestigación que utilizando la misma especieanimal y las mismas condiciones sanitarias, die-téticas, etc, puedan compartir los animales obje-to del estudio sin que esto altere los resultadosfinales.

2. Mejora de los diseños experimentales.- Unbuen diseño experimental puede posibilitar lareducción del número de animales necesariospara conseguir los objetivos.

3. Descenso en la escala filogenética. Los ani-males seleccionados deberán ser de la especiemenor en la escala filogenética que permita obte-ner resultados validos, si bien, para esta selec-ción requerirá un estudio riguroso y un amplioconocimiento de las necesidades de la especieelegida.

4. Animales de calidad. El costo de los anima-les no debe hacernos olvidar la importancia de uti-lizar grupos uniformes de animales con condicio-nes idóneas: sanitarias, normas de cría, estabula-ción y mantenimiento. La utilización de animalesde calidad garantizan la ausencia de factores des-conocidos que puedan invalidar las experiencias.La utilización de animales de baja calidad puedenhacer inútil el posible sufrimiento de los animales.

Refinar:1. Procedimientos quirúrgicos. El investigador

debe utilizar los procedimientos menos agresivospara la integridad del animal de experimentación.Así como conocer y tener experiencia en las téc-nicas propias de la especie utilizada, como pue-den las de cateterización de vías centrales.

2. Mejora en la instrumentación. Sobre todo larelacionada con la monitorización del animal(menor duración de las experiencias) y con los pro-cedimientos de análisis de muestras que requieranmenor volumen (menor tamaño del animal).

3. Mejora en el control del dolor. Los investi-gadores deben conocer las técnicas anestésicas yanalgésicas adecuadas para la especie animalobjeto del estudio.

4. Mejora en las técnicas de control. Los inves-tigadores elaborarán protocolos de actuación pre-cisos para prevenir el dolor y malestar de los ani-

males, el veterinario responsable del Centrosupervisará la idoneidad de los protocolos y seencargará de controlar la ejecución de estos.

Sensibles a la preocupación social por el bie-nestar de los animales de experimentación, unimportante grupo internacional de investigadoresformado tras el Simposio Internacional sobre “Elanimal de laboratorio al servicio del hombre” cele-brado en Lyon (Francia) en septiembre de 1978,con motivo del centenario de la muerte de ClaudeBernard, estableció en 1979 en el Centro Europeode la Tuffs University en Taillories (Francia) losdenominados “Principios de ética de la experimen-tación animal”, que reproducimos a continuación:

Principios básicos:Artículo 1. Los progresos del conocimiento

humano son necesarios, especialmente los de labiología, la medicina humana y la de los ani-males.

Artículo 2. El hombre tiene necesidad de utili-zar el animal, tanto en su búsqueda del conoci-miento como para nutrirse, vestirse y trabajar.De ahí el deber de respetar al animal, ente auxi-liar y ser vivo como él.

Artículo 3. Toda persona que emplee animalescon fines experimentales debe tener presente queestán dotados de sensibilidad y memoria y sonsusceptibles al dolor y al sufrimiento.

Responsabilidades del experimentador: Artículo 4. El experimentador es moralmente

responsable de sus actos en el marco de la expe-rimentación animal.

Artículo 5. Las experiencias que afecten aseres vivos y las extracciones de tejidos de suje-tos vivos con fin de investigación deben ser reali-zadas por un científico cualificado o bajo su con-trol directo. Las condiciones de mantenimientode los animales de experimentación deben serdefinidas y controladas por un veterinario o porun científico competente.

Artículo 6. En los ensayos que impliquen lautilización de animales debe existir una probabi-lidad razonable de que estos estudios contribu-yan de manera importante a la adquisición deconocimientos que desembocarán eventualmenteen la mejora de la salud y del bienestar del hom-bre y de los animales.

Artículo 7. Los métodos estadísticos, los mode-los matemáticos y los sistemas biológicos in vitro

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deben ser empleados cuando sirvan para comple-tar la experimentación animal y para reducir elnúmero de sujetos utilizados.

Articulo 8. El experimentador debe utilizar elanimal mejor adaptado a su investigación y tener encuenta los grados sensoriales y psíquicos propios decada especie. Los animales en peligro de extinciónno deberán ser utilizados más que en circunstan-cias excepcionales bien definidas. Siempre que seaposible, los animales utilizados en el laboratorioprovendrán de criaderos especializados que asegu-ren las mejores condiciones de equilibrio biológico.

Articulo 9. El experimentador debe velar paraque las condiciones de mantenimiento del animalde laboratorio sean las más adecuadas y parasuministrarle los cuidados necesarios antes,durante y después de las intervenciones.

Artículo 10. El experimentador tiene el deberde evitar al animal todo sufrimiento físico o psí-quico inútil. Debe llevar a cabo los métodos quepermitan limitar el sufrimiento y los dolores en elcaso en que éstos sean inevitables.

El ser humano como sujeto experimentalEl objetivo final de toda investigación en

Medicina es su aplicación al ser humano. Portanto cualquier procedimiento experimental, des-pués de su correcta contrastación, siguiendo lasreglas del método científico y utilizando los mode-los experimentales apropiados, debe terminar porensayarse en el hombre.

El ser humano constituye el escalón más eleva-do y más complejo de los modelos experimentalesque hemos ido describiendo. Por sus especialísi-mas características y por las implicaciones éticas,morales y de toda índole que supone su utilizacióncomo sujeto experimental, el investigador debe serespecialmente riguroso en sus planteamientos.

Toda investigación que precise la utilización deseres humanos debe regirse por reglas éticas es-trictas reconocidas internacionalmente adoptadaspor la 18ª Asamblea Médica Mundial Helsinki,Finlandia, Junio 1964 (Declaración de Helsinki) yenmendadas por las:

• 19ª Asamblea Médica Mundial, Tokio,Japón, Octubre 1975,

• 35ª Asamblea Médica Mundial, Venecia,Italia, Octubre 1983,

• 41ª Asamblea Médica Mundial, Hong Kong,Septiembre 1989,

• y la 48ª Asamblea General, Somerset West,Sudáfrica, Octubre 1996

Como dice la propia declaración, los investi-gadores están además obligados al cumplimien-to de las leyes concretas del país donde se rea-lice el protocolo referentes a la investigación enhumanos.

UN EJEMPLO PRÁCTICOEn nuestro laboratorio hemos trabajado

durante muchos años en técnicas de perfusiónhipotérmica de riñón aislado con fines de preser-vación.

Un hecho comprobado y recogido ampliamen-te en la literatura es que la resistencia vasculardel riñón prefundido en hipotermia desciendegradualmente durante la perfusión, éste hecho,además, se considera un signo de buena perfu-sión (Fig. 6).

Sin embargo, la idea que todos tenemos encuanto a la exposición al frío, es que su efectodetermina vasoconstricción. Entonces surgierondos preguntas:

• ¿Cómo podemos explicar que el lecho vascu-lar del riñón prefundido a bajas temperaturas(alrededor de 4 ºC) se vasodilate?

• ¿La vasodilatación se debe a algún efectometabólico o es simplemente un efecto pasivode la presión de perfusión sobre la pared vas-cular?

Obviamente, antes de plantear cualquierexperiencia, tratamos de encontrar en la literatu-ra una explicación a éste hecho y, aunque elfenómeno de la vasodilatación estaba descrito enmultitud de publicaciones, nadie parecía haberseplanteado el problema del por qué de dicha vaso-dilatación.

La posibilidad de que se debiera a un efectometabólico vasodilatador era baja ya que a esastemperaturas (4 ºC) muy pocos sistemas metabó-licos están funcionantes. Por tanto lo primeroque teníamos que comprobar era si la vasodilata-ción se debía a un efecto pasivo de la presión deperfusión.

Por nuestra experiencia previa con la perfu-sión sabíamos que el descenso mayor de lasresistencias intrarrenales se producía durante laprimera hora (Fig. 6). Planteamos entonces lasiguiente experiencia:

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A los 40 minutos de una perfusión hipotérmi-ca habitual, detenemos la perfusión durantemedia hora y la reiniciamos posteriormente.

Si el efecto se debiera a la presión de perfu-sión, habría que pensar que la resistencia intra-rrenal cuando reiniciásemos la perfusión seríamás alta o, al menos, igual que cuando la inte-rrumpimos.

Sin embargo, cuando realizamos las experien-cias observamos que le evolución de la resisten-cia seguía una curva similar a la de la perfusiónnormal como si el proceso no se hubiera inte-rrumpido (Fig. 7).

Parecía claro, entonces, que la vasodilataciónno se debía al efecto pasivo de la presión de per-fusión sobre el lecho vascular renal.

Debíamos pensar, por tanto, que el efectovasodilatador se debía únicamente al descensode la temperatura, aunque también sabíamosque si se perfundía un riñón previamente enfria-do las resistencias al inicio de la perfusión eranaltas.

Parecía que la vasodilatación, de algunaforma, se desencadenaba con la perfusión, peroque su mantenimiento dependía del descenso dela temperatura y no estaba ligada con el mante-nimiento de la perfusión.

El modelo que estábamos utilizando hastaentonces, el riñón aislado perfundido en hipoter-mia, es un modelo complejo en el que intervienenmultitud de sistemas metabólicos y diferentestejidos, que podrían interferir en el fenómeno queestábamos tratando de estudiar, que, en el fondo,era el tratar de explicar por qué los vasos intra-rrenales se dilataban con el descenso de la tem-peratura.

Decidimos entonces cambiar el modelo experi-mental a uno más sencillo, la técnica de vaso ais-lado, que se utiliza habitualmente en farmacolo-gía. Una nueva revisión de la literatura nos indi-có que, al parecer, nadie se había preocupado deestudiar el efecto de temperaturas tan bajassobre el tono vascular.

Como el vaso más utilizado en esta técnica esla aorta de rata decidimos comenzar con estevaso. La técnica consiste en montar un anillo delvaso a estudiar entre dos ganchos metálicos fijos,uno de los cuales está unido a un transductor defuerza, el vaso permanece introducido en unbaño cuya temperatura se puede controlar. Lasvariaciones de tensión de la pared del vaso se tra-ducen en cambios de la fuerza que detecta eltransductor y estos cambios junto con los detemperatura se registran en un ordenador.

Los primeros estudios con la aorta de rata,que realizamos disminuyendo la temperatura delbaño desde 37º a 4º, nos mostraron que la dis-minución de la temperatura se acompañaba deuna relajación manifiesta de la pared del vaso(Fig. 8).

Este fenómeno se repetía de forma sistemáti-ca, de forma tan evidente que llegamos a pensarincluso que podíamos tener una fuente de errorsistemático que desconocíamos y que no podía-mos controlar. Para descartar esto realizamos el

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Pres (mmHg) Flujo (ml/min) Res (mmHg/ml/min)

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2

1

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0 20 40 60 80 100 120

FIGURA 6. Evolución de la resistencia intrarrenal (enrojo) durante una perfusión hipotérmica a presión cons-tante.

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0

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2

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0 60 120 180

Presión F/gr (x100) Resistencia

FIGURA 7. Comportamiento de la resistencia intrarrenalen una perfusión interrumpida durante 30 min.

experimento con un anillo de plástico, con el finde descartar que el fenómeno estuviera produci-do por algún problema del método. Sin embargoel anillo de plástico, como era de esperar, se con-traía con la temperatura (Fig. 9).

Parecía claro, entonces, que la aorta de rata serelajaba cuando la temperatura descendía. Sinembargo, nosotros queríamos aclarar la vasodila-tación del lecho vascular del riñón, por tanto,decidimos repetir las experiencias utilizandoarteria renal de cerdo.

Cuando ensayamos la arteria renal de cerdo,vimos que éste vaso se contraía con la tempera-tura (Fig. 10).

Había que estudiar entonces el por qué delcomportamiento diferente de estos dos vasosfrente al descenso de la temperatura.

Estudiamos diferentes factores que pudieraninfluir en este comportamiento tales como: laintegridad del endotelio vascular, la conservaciónfría del vaso o el bloqueo de la fibras muscularescon un quelante del calcio.

Vimos entonces que el bloqueo de las fibrasmusculares y la conservación fría de los vasosinhibían la contracción de la renal de cerdo mien-tras que no afectaban la relajación de la aorta.

Esto nos hizo sospechar que la causa del com-portamiento de la tensión de estos vasos frente aldescenso de la temperatura podría deberse a ladiferente estructura histológica de los mismos.La aorta de rata es un vaso fundamentalmenteelástico con muy pocas fibras musculares, mien-tras que la arteria renal de cerdo es un vaso emi-nentemente muscular.

Encontramos además en la literatura que laelastina es un material peculiar que tiene un coe-ficiente negativo de temperatura, es de los pocosmateriales que se dilata cuando la temperaturadesciende.

Parecía claro entonces que la elastina podríaser la responsable de la vasodilatación de losvasos renales con el descenso de la temperatura,sin embargo este fenómeno no se reproducía cla-ramente con la arteria renal, en algunas condi-

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0 2 4 6 8

Tiempo (min)

Tem

p. (

ºC)

Tens

ión

(g)

Temp. TensiónA1

FIGURA 8. Evolución de la tensión con respecto a la tem-peratura de un anillo de aorta de rata.

Tiempo (min)

F (g

)

Tem

p. (

ºC)

Plástico Temp.

0 2 4 6 8 10

0,65

0,6

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0,4

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0,3

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5

FIGURA 9. Evolución de la tensión con respecto a la tem-peratura de un anillo de plástico.

Tiempo (min)

Tem

p. (

ºC)

Tens

ión

(g)

Temp. Tensión

40

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30

25

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1

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0 2 4 6 8

B1

FIGURA 10. Evolución de la tensión con respecto a la tem-peratura de un anillo de arteria renal de cerdo.

ciones la contracción de la arteria con la hipoter-mia desaparecía pero no llegaba a dilatarse enningún caso.

Pensamos entonces que el modelo de vaso ais-lado podría no reproducir fielmente las condicio-nes que se daban en la perfusión, de hecho, elvaso está sometido normalmente a condicionesisotónicas, esto es, la presión media en su inte-rior es más o menos constante, sin embargo en elmodelo de vaso aislado el anillo vascular estásometido a condiciones isométricas, está fijado ados puntos fijos y lo que se mide es la tensión.

Conseguir un modelo que reprodujera las con-diciones isotónicas no era fácil, decidimos entoncesestudiar el comportamiento de ambos vasos frenteal descenso de la temperatura en un baño y medirel tamaño del vaso con técnicas de video. En estecaso el vaso no está sometido a ninguna tensión.

Comprobamos entonces que, en estas con-diciones, ambos vasos se comportaban deforma similar (Fig. 11), tanto la aorta de ratacomo la arteria renal de cerdo disminuyen detamaño con el descenso de la temperatura, loque nos hace suponer que muy probablemen-te, la vasodilatación que experimentan losvasos renales durante la perfusión hipotérmicade riñón aislado se deba únicamente al pecu-liar comportamiento de la elastina frente a latemperatura y sea un fenómeno completamen-te pasivo.

Con este ejemplo se pone de manifiesto laimportancia de los diferentes modelos experi-mentales en el estudio de un determinado pro-blema y, sobre todo, que en muchas ocasiones unúnico modelo experimental puede no ser sufi-ciente para su resolución.

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FIGURA 11. Evolución del tamaño de la aorta de rata (arriba) y la arteria renal de cerdo (abajo) con respecto a la tem-peratura.

UN COMENTARIO FINAL SOBRELOS MODELOS

Se ha visto que los interrogantes que se plan-tean en la Clínica Quirúrgica Humana constitu-yen el principal objeto de la FisiopatologíaQuirúrgica que, basándose en el método experi-mental, utiliza como fuente principal de conoci-miento lo que se han denominado modelos expe-rimentales.

Estos modelos experimentales se ordenansegún una escala de menor a mayor complejidadhasta alcanzar al propio ser humano como suje-to de experimentación.

Cuanto más complejo es el modelo y, portanto, más se parece a la realidad, menores gra-dos de libertad ofrece al investigador a la hora defijar los factores que pretende estudiar. Por tanto,a la hora de enfrentarnos con el estudio de unproblema concreto, probablemente habrá queplantear diferentes modelos experimentales quenos vayan acercando a la solución final delmismo, para finalmente terminar confirmándoloen el ser humano.

La utilización del ser humano como sujeto expe-rimental exige planteamientos tremendamenterigurosos por parte del investigador, que debencumplir con los principios establecidos en ladeclaración de Helsinki y ajustarse a la legisla-ción del país donde se realice la investigación.

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Sanitaria. Ed. Del Castillo S.A., Madrid. 1974.2. Siegel S. Estadística no paramétrica. Ed. Trillas, México.

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Correspondencia autor: Dr. J.F. del Cañizo LópezUnidad Medicina y Cirugía ExperimentalHospital General Universitario Gregorio MarañónDoctor Esquerdo, 46 - 28007 MadridTel.: 915 868 000E-mail autor: caniño39mce.hggm.esInformación artículo: Original

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