8/16/2019 Discos Para Antifungigrama

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DISCOS PARA ANTIFUNGIGRAMACARTUCHO DE 50 DISCOS

ESTUDIO DE LA SENSIBILIDAD DE LAS LEVADURAS DEL GÉNEROCANDIDA A LOS ANTIFÚNGICOS DE LA FAMILIA DE LOS AZOLES (FLUCONAZOL, VORICONAZOL)

1- INTERÉS CLÍNICOEstos discos permiten determinar la sensibilidad de las levaduras del géneroCandida a los agentes antifúngicos de la familia delos azoles (fluconazol, voriconazol), mediante difusión en agar. Este método sigue un procedimiento normalizado publicado por elCLSI/NCCLS (1)Deberán consultarse los documentos más recientes del CLSI/NCCLS para ver cuáles son las recomendaciones respecto a larealización del antifungigrama y cómo debe interpretarse.

2- PRINCIPIOSe colocan unos discos de papel impregnados con una concentración determinada de antifúngico en la superficie el medioMHGBM (Mueller-Hinton + 2% de glucosa + 0,5 µg/ml de azul de metileno) previamente sembrado con un inóculo calibrado,preparado a partir de un cultivo puro de la levadura sobre la que se desea hacer la prueba. Se establece un grado deconcentración de antifúngico alrededor de los discos dentro del agar. Después de la incubación, el diámetro de las zonas deinhibición observadas alrededor de los discos permite deducir las concentraciones mínimas inhibidoras (CMI) de los diferentesantifúngicos (fluconazol, voriconazol) para la cepa sobre la que se ha hecho la prueba, así como su categorización clínica:resistente (R), sensible dosis-dependiente (SDD), sensible (S).

3- PRESENTACIÓNLos discos, fabricados a partir de papel absorbente de calidad superior, tienen 6,5 mm de diámetro y están impregnados de antifúngicoscon concentraciones precisas.

Estos discos están identificados de forma clara por un símbolo compuesto de 3 letras, seguido de la carga expresada en µg, impreso aambos lados del disco (tabla 1).

Los discos Bio-Rad se presentan en cartucho de 50 discos envasados en recipientes estancos que contienen un deshidratante.

Tabla 1

4- CONSERVACIÓNLa fecha de caducidad es válida únicamente para los discos que se guarden en cartuchos intactos conservados conforme a lasinstrucciones del fabricante. La fecha de caducidad y el número de lote figuran en cada envase (cartucho y recipiente).• Los cartuchos de discos deben conservarse en su recipiente entre +2 y +8ºCen un lugar seco.• Antes de abrir los cartuchos, deje que alcancen una temperatura ambiente (18-30ºC) y vuelva a poner los cartuchos que no se

hayan usado a una temperatura entre +2 y +8ºC una vez terminada la colocación de los discos.• No utilizar los discos caducados.• Si los cartuchos se conservan en el distribuidor después del almacenamiento, es necesario que éste se conserve a una

temperatura entre +2 y +8ºC en un lugar seco y con desecantes en su interior.

• La estabilidad de los discos una vez abiertos los cartuchos y colocados en los distribuidores se ha validado en condiciones derutina durante 6 semanas.

DISCO CARGA DEL DISCO SÍMBOLO ENVASE CÓDIGO DEL PRFluconazole 25 µg FCA25 1 x 50 discos 62802

Voriconazole 1 µg VCZ1 1 x 50 discos 62803

IVD

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5- MATERIAL NECESARIO NO INCLUIDO• distribuidor de discos: 6 discos (código 50271), 8 discos (código 50270), 12-16 discos (código 50295)• medio de cultivo MHGBM (Mueller Hinton + 2% de glucosa + 0,5 µg/ml de azul de metileno)• medio de cultivo: agar Sabouraud (código 56519), agar Sabouraud cloranfenicol-gentamicina (código 63774)• asa de siembra• pipetas Pasteur• escala de turbidez 0,5 McFarland• cepas fúngicas para el control de la calidad• estufa 35°C +/- 2°C• material de laboratorio necesario para la realización de los antifungigramas mediante difusión en agar

6- PRECAUCIONES DE USOSeguir las instrucciones de uso de las recomendaciones en vigor (CLSI/NCCLS)Seguir en todo momento las técnicas y precauciones en vigor en materia de protección contra riesgos microbiológicos.Después de su uso, esterilizar los cultivos y todo el material contaminado.

7- MODO OPERATORIO

a) Medio de cultivoEl documento M44-A del CLSI/NCCLS recomienda la utilización del medio MHGBM: Mueller Hinton con 2% de glucosa y 0,5 µg/ml deazul de metileno.Después de haber preparado este medio de cultivo descrito en el documento, verter 25 ml del mismo en una placa de Petri redonda de 90mm de diámetro, o 60 ml en una placa de Petri cuadrada de 120 mm.Una vez solidificado, secar 15 minutos a 37ºC antes de su utilización.

b) InóculoPreparar un inóculo equivalente al estándar 0,5 de McFarland a partir de un cultivo puro de 24 horas de levadura del géneroCandida ,obtenido sobre un medio de aislamiento (agar Sabouraud con glucosa, Sabouraud cloranfenicol-gentamicina...).El inóculo se prepara mediante la suspensión en suero fisiológico estéril del equivalente a 5 colonias bien aisladas de 1 mm de diámetro.Una vez homogeneizada la suspensión en el vértice, ajustar la turbidez a 0,5 McFarland, ya sea añadiendo suero fisiológico o añadiendocolonias adicionales.

c) SiembraEn los 15 minutos posteriores al ajuste del inóculo a 0,5 McFarland, sumergir un hisopo de algodón en la suspensión y remover variasveces. Eliminar el exceso de líquido presionando fuertemente el hisopo contra la pared del tubo por encima del nivel del líquido.Una vez secado el medio 15 minutos a 37ºC, sembrar toda la superficie con ayuda del hisopo según el método estándar.Repetir la operación varias veces girando la placa 60º, de modo que el inóculo quede repartido de forma homogénea por toda lasuperficie, incluidos los bordes.Dejar la placa abierta entre 3 y 5 minutos (sin sobrepasar los 15 minutos) de manera que se absorba el exceso de humedad antes decolocar los discos sobre el medio.

d) Aplicación de los discos de antifúngicosLos discos se aplican sobre el agar con ayuda de un distribuidor de discos (6 discos como máximo sobre una placa redonda de 90 mm dediámetro, 9 discos como máximo sobre una placa cuadrada de 120 mm de lado).

e) Incubación

Incubar a 35ºC (+/-2ºC) en los 15 minutos posteriores a la aplicación de los discos.La duración de la incubación es de 24 horas.

f) Lectura e interpretaciónMedir los diámetros de las zonas de inhibición transcurridas 24 horas de incubación.Colocar la placa sobre fondo negro no reflejante y realizar la lectura bajo una lámpara.Si el cultivo es insuficiente después de 24 horas de incubación, volver a incubar la placaotras 24 horas y realizar la lectura a las 48 horas.Los diámetros de las zonas de inhibición deben medirse hasta las colonias de tamaño normal(fig. 1),

ya que es posible observar en los bordes de las zonas de inhibición una inhibición parcialdel cultivo con presencia de colonias de tamaño pequeño o mediano.Estas colonias no corresponden a mutaciones resistentes y no deben tenerse en cuenta parala medición de los diámetros de las zonas de inhibición.

Fig.1

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g) Observaciones• Muestras: los discos no deben utilizarse para realizar una prueba directamente sobre muestras biológicas• Se recomienda aplicar las buenas prácticas de laboratorio.

8- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS• Medir con precisión los diámetros de las zonas de inhibición• La correspondencia entre diámetro, concentración mínima inhibidora (CMI) y clasificación clínica: resistente (R), sensible dosis-

dependiente (SDD), sensible (S) se resume en la tabla siguiente :

*Fluconazol: documento CLSI/NCCLS M44-A(1)Voriconazol: Artemis Disk Global Antifungal Surveillance Study (3)

9- RENDIMIENTOS / CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBALa tabla siguiente recoge los límites aceptables de diámetros de inhibición obtenidos mediante difusión en agar para las cepas de

referencia citadas anteriormente(1):

10-CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTETodos los productos fabricados y comercializados por Bio-Rad están sujetos a un sistema de garantía de la calidad desde la recepción delas materias primas hasta la comercialización de los productos finales. Cada lote de producto terminado se somete a un control de calidad

y no se comercializa a menos que cumpla con los criterios de aceptación. El fabricante conserva la documentación relativa a la producción

y al control de cada lote.

11-LÍMITES DE USOLos rendimientos de la prueba no dependen sólo de la actividad de los discos, sino también de factores como la utilización de un inóculoestandarizado, de cepas de control adecuadas, de medios de cultivo adaptados a los que se hayan realizado pruebas previas y de unatemperatura adecuada de almacenamiento de los discos.

12-REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. Method for Antifungal Disk Diffusion Susceptibility Testing of Yeasts ; Approved Guideline, M44-A, Vol. 24 N°15, NCCLS, May 2004.

2. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts ; Approved Standard-Second Edition, M27-A2, Vol. 22N°.15, NCCLS, August 2002.

3. M.A. Pfaller, D.J. Diekema, M.G. Rinaldi, R. Barnes, B. Hu, A.V. Veselov, N. Tiraboshi, E. Nagy, D.L. Gibbs, and the Global AntifungalSurveillance Group. 2005. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance Study : a 6.5- Year Analysis of Susceptibilitiesof Candida and Other Yeast Species to Fluconazole and Voriconazole by Standardized Disk Diffusion Testing. J. Clin. Microbiol.43 :p. 5848-5859.

4. M.A. Pfaller, D.J. Diekema, J.H. Rex, A. Espinel-Ingroff, E.M. Johnson, D. Andes, V. Chaturvedi, M.A Ghannoum, F.C. Odds, M.G. RinalD.J. Sheehan, P. Troke, T.J. Walsh, and D.W. Warnock . 2006. Correlation of MIC with Outcome forCandida Species Tested againstVoriconazole ; Analysis and Proposal for Interpretive Breakpoints. J.Clin. Microbiol.44 : p. 819-826.

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Bio-Rad

3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 06/2006Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33

Código Disco Carga SímboloDiámetro de la zona de inhibición en mm* Concentración crítica CMI en µg/ml*

R S-DD S R S-DD S

62802 Fluconazole 25 µg FCA 25 ≤ 14 15–18 ≥ 19 ≥ 64 16–32 ≤ 8

62803 Voriconazole 1 µg VCZ 1 ≤ 13 14–16 ≥ 17 ≥ 4 2 ≤ 1

Código Disco Carga Símbolo C. albicans ATCC 90028

C. parapsilosis ATCC 22019

C. tropicalis ATCC 750

C. krusei ATCC 6258

62802 Fluconazole 25 µg FCA 25 28–39 22–33 26–37 –

62803 Voriconazole 1 µg VCZ 1 31–42 28–37 – 16–25