Université dOrléans Pragmatique 1 SDL502 2007-2008 François Nemo.
Directeur de Thèse: Dr. Sabine CARPIN, LBLGC Université dOrléans Co-encadrement: Dr. Audrey...
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Directeur de Thèse: Dr. Sabine CARPIN, LBLGC Université d’Orléans
Co-encadrement: Dr. Audrey OUDIN , BBV Université de Tours
Identification et caractérisation de facteurs de transcriptions appartenant à la famille des régulateurs de réponse de type B, impliqués dans la réponse à
la sécheresse chez le peuplier
Laboratoire de Biologie des Ligneux et des Grandes Cultures - UPRES EA 1207
par
Inès DJEGHDIR
Problématique de l’équipe d’accueil du LBLGC Equipe ARCHE 3 équipes dont l’équipe ARCHE: Arbres et Réponses aux
Contraintes Hydriques et Environnementales
Réponse des arbres aux contraintes environnementales:
Différentes approches:EcophysiologiqueÉpigénétiqueProtéomiqueSignalisation Voie commune aux végétaux et
aux levure: Phosphorelais Multiple
sécheressepeuplier
Le phosphorelais multiple
3 partenaires:
Récepteur ou Histidine-aspartate Kinase : HK
Protéines de relais de phosphate ou Histidine Phosphotransfer protein : HPt
Régulateurs de Réponse : RR RR
HPt
N
C
H
D
Partenaires du phosphorelais multiple chez Populus sp.
10 HPt
12 RR-B
Chefdor et al., 2006, Bertheau et al., 2012, Héricourt et al., 2013
Paroi cellulaire
Membrane plasmique
Noyau
N
C
H
HK1
D
N
C
N
C
H
HK1
D
N
C
Cytokinines
1 HK22 HK32 HK4
N
C
H
D
NH
C
D
Contrainte osmotique
Partenaires du phosphorelais multiple chez Populus sp.
RR-B
Paroi cellulaire
Membrane plasmique
Noyau
Contrainte osmotique
N
C
H
HK1
D
N
C
N
C
H
HK1
D
N
C
P
P
Chefdor et al., 2006, Bertheau et al., 2012, Héricourt et al., 2013
HPt
HPt P
HPt
Etat de l’Art au laboratoire
HK1 analogue de AHK1 d’Arabidopsis (Chefdor et al., 2006)
Récepteur HK1 isolé = osmosenseur potentiel (Chefdor et al., 2006)
capable de dimériser (Héricourt et al., 2013)
H
AHK1
D
N
C
H
HK1
D
N
C
65% d’identité
82% de similarités
Etat de l’Art au laboratoire 3 HPt sont les partenaires préférentiels de HK1 (Héricourt et al., 2013)
HPt 2, 7 et 9 sont les HPt majoritairement impliquées dans l’osmosensing
Etat de l’Art au laboratoire Les 8 RR-B isolés interagissent avec les 3 HPt précédentes (Bertheau et
al., 2012)
Ces RR sont-ils fonctionnels chez le Peuplier?
Stage de Master II Choix du RR13 :
Homologue Arabidopsis : rôle prépondérant dans le développement de la plante
Chez Peuplier : RR le plus fortement exprimé et présentant de fortes interactions avec les 3 HPt partenaires de HK1 (Bertheau et al., 2012)
importance probable de ce RR
Stratégie de recherche:
Evaluer la fonctionnalité du RR13 Fixation du GARP-RR13 sur l’ADN Activation de la transcription de gènes régulés par la contrainte
osmotique: HK1 et dhn1
Caractériser la régulation de l’expression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte osmotique
Stage de Master II Stratégie de recherche:
Evaluer la fonctionnalité du RR13 Fixation du GARP-RR13 sur l’ADN
CC
N N
Domaine receveur : Motif DDK
Domaine GARP, fixation à l’ADN : reconnaissance de boites spécifiques chez Arabidopsis (Sakai et al., 2000 ; Sakai et al., 2001)
Domaine de transactivation
Evaluer la fonctionalité du RR13Fixation du GARP-RR13 sur l’ADN
AV0+ -
AV0 GST-GARP : + -
ERF+ -
ERF + -
Fixation spécifique sur les sondes AVO et AV2 possédant des boites spécifiques
Evaluer la fonctionalité du RR13Activation de la transcription de gènes régulés par la contrainte osmotique: HK1 et dhn1
Test de transactivation d’un gène de RRA Arabidopsis (ARR6) par fixation du RR13 sur son promoteur (ARR2 (RR-B) d’ Arabidopsis utilisés en contrôle)
Augmentation de l’activité du promoteur ARR6 avec le même niveau d’efficacité que le contrôle positif (ARR2)
Le RR13 est un facteur de transcription fonctionnel
prom ARR6 35S-ARR2 35S-RR130
2
4
6
8
10
12
Acti
vité
rela
tive
Luc/
Gus p
ar m
g de
pro
téin
e
* *
Luc
ARR2 RR13
Promoteur ARR6
Caractériser la régulation de l’expression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte
osmotique
T0 T15
T30
T45
T65
T80
T95T1
10T1
30T1
45T1
60T1
75T1
90T2
05T2
20T2
35T2
50T2
65T2
80T2
95T3
10T3
25T3
40T3
550.0
100.0
200.0
300.0
400.0
500.0
600.0
700.0
Cond
ucta
nce
stom
atiqu
e(m
mol
es H
2O m
-2 s-1
)
Temps (min)
* **
***
*** ***
Diminution de la conductance stomatique = fermeture des stomates, perception de la contrainte et mise en place d’une réponse
Caractériser la régulation de l’expression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte
osmotique
T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T3600
0,5
1
1,5
2
2,5
Expression de HK1 dans les feuilles au cours du temps
**
** **
0
5
10
15
20
25
30
****
*****
** ****
**
T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T360
Expression de HK1 dans les racines au cours du temps
0
5
10
15
20
25
30
T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T360
Expression du RR13 dans les racines au cours du temps
**
*
***** **
*** * **
0
2
4
6
8
10
T0 T5 T10 T20 T40 T60 T120 T180 T360
*
***
****** *
* ***
Expression du RR13 dans les feuilles au cours du temps
Objectifs :
1. Identification des RR de type B spécifiquement impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique
2. Caractérisation de l’activité transcriptionnelle des RR de type B candidats
3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels
Projet de recherche
Identification des RR de type B spécifiquement impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique
Technique: qPCR sur les 8 RR-B sur des échantillons stressés
Projet de recherche
Caractérisation de l’activité transcriptionnelle des RR de type B candidats
Techniques: - Gel retard ou EMSA
- Délétion de promoteurs et mutagénèse des boites de fixation
Projet de recherche
+GARP
?
Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels
Techniques: Double hybride après criblage de banque ou interaction ciblée
Projet de recherche
1 2
Merci de votre attention