DIPLOMARBEIT - univie.ac.at · Karl-Franzens-Universität Graz Institut für Pharmazeutische...
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Karl-Franzens-Universität Graz
Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Bereich Pharmakognosie
DIPLOMARBEIT
Phytochemische Untersuchung von Drimys winteri
(Winteraceae) und Talauma gloriensis (Magnoliaceae),
sowie von Tilletia spp. (Zwergsteinbrand, Brandpilze)
Zur Erlangung des akademischen Grades einer Magistra der Pharmazie an der
Naturwissenschaftlichen Fakultät der Karl-Franzens-Universität Graz
eingereicht bei Univ.-Prof. Dr. Rudolf Bauer
vorgelegt von
Gröblacher Barbara
Graz, Juni 2008
Die vorliegende Diplomarbeit entstand im Zeitraum von November 2007 bis Juni
2008 am Institut für pharmazeutische Wissenschaften der Karl-Franzens-Universität
Graz im Bereich Pharmakognosie unter der Leitung von Herrn Univ.-Prof. Dr. Rudolf
Bauer, dem ich an dieser Stelle für die Diplomarbeitsstelle und die Betreuung meiner
Arbeit danken möchte.
Mein ganz besonderer Dank geht an Dr. Wolfgang Schühly, der mir stets mit guten
Ratschlägen und Anleitungen sowohl in der Theorie als auch im praktischen Bereich
hilfreich zur Seite stand.
Ebenso möchte ich Dr. Olaf Kunert aus dem Bereich der pharmazeutischen Chemie
für die Durchführung der NMR-Messungen sowie der Hilfe bei deren Auswertung
danken.
Bedanken möchte ich mich auch bei Dr. Herbert Huss für die Anregung Tilletia zu
untersuchen sowie für die Bereitstellung des Drogenmaterials.
Weiters danke ich Dr. Sara Crockett und Dr. Wolfgang Schühly für das Sammeln von
Drimys und Talauma sowie für die Bereitstellung des Drogenmaterials. In ihrem
Namen möchte ich mich auch bei Mag. Eva Schembera, (Station La Gamba, Golfito,
in Costa Rica) für ihre Unterstützung beim Sammeln von Talauma im Urwald von
Costa Rica und bei Dr. Barry Hammel vom INBio (Instituto Nacional de
Biodiversidad) in Costa Rica für die logistische Hilfe bei der Planung der
Sammelexkursion sowie dem INBio selbst für die Benutzung von Herbarium und
Bibliothek bedanken. Die Herbarbelege von Drimys und Talauma sind ebenfalls im
INBio in Santo Domingo, Costa Rica, hinterlegt. Für das verwendete
Pflanzenmaterial liegt eine Sammel- und Exporterlaubnis vor.
Ein ganz besonderer Dank gilt meiner Familie und meinen Freunden, die mich
während meines Studiums immer unterstützt haben.
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ........................................................................................1
2. Allgemeiner Teil ..............................................................................2
2.1 Drimys winteri .............................................................................................2
2.1.1 Allgemeines ...........................................................................................2
2.1.2 Taxonomie.............................................................................................2
2.1.3 Familie der Winteraceae........................................................................2
2.1.4 Pharmakologische Wirkungen ...............................................................5
2.1.5 Anwendung............................................................................................6
2.2 Talauma gloriensis .....................................................................................7
2.2.1 Allgemeines ...........................................................................................7
2.2.2 Taxonomie.............................................................................................7
2.2.3 Familie der Magnoliaceae......................................................................8
2.2.4 Anwendung..........................................................................................10
2.3 Tilletia caries und Tilletia controversa....................................................11
2.3.1 Allgemeines .........................................................................................11
2.3.2 Taxonomie...........................................................................................11
2.3.3 Die Brandpilze .....................................................................................12
2.3.4 Pathogenese der Brandpilze ...............................................................12
2.3.5 Gattung Tilletia.....................................................................................13
3. Spezieller Teil mit Ergebnissen....................................................15
3.1 Strukturaufklärung der isolierten Substanzen .......................................15
3.2 Drimys winteri ...........................................................................................15
3.2.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes..........................................15
3.2.2 Übersicht über die aufgearbeiteten Fraktion........................................16
3.2.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der Substanzen .......................17
3.2.3.1 Fraktion DWR_V1.........................................................................17
3.2.3.2 Fraktion DWR_V2.........................................................................19
3.2.3.3 Fraktion DWR_V10.......................................................................20
3.2.3.4 Fraktion DWR_V12_P1 ................................................................22
3.2.3.5 Fraktion DWR_V12_P2 ................................................................23
3.2.3.6 Fraktion DWR_V12_P3 ................................................................25
Inhaltsverzeichnis
II
3.2.3.7 Fraktion DWR_V12_P4 ................................................................26
3.2.3.8 Fraktion DWR_V17.......................................................................27
3.2.3.9 Fraktion DWR_V18_P3 ................................................................29
3.2.3.10 Fraktion DWR_V19_P6 ................................................................31
3.2.4 Diskussion und Schlussfolgerung........................................................33
3.3 Talauma gloriensis ...................................................................................34
3.3.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes..........................................34
3.3.2 Übersicht über die aufgearbeiteten Fraktionen des Extraktes .............34
3.3.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der Substanzen .......................35
3.3.3.1 Fraktion TGB_S1..........................................................................35
3.3.3.2 Fraktion TGB_S2..........................................................................36
3.3.3.3 Fraktion TGB_S10_P2 .................................................................38
3.3.3.4 Fraktion TGB_S10_P3 .................................................................40
3.3.3.5 Fraktion TGB_S12_P1 .................................................................43
3.3.3.6 Fraktion TGB_S12_P2 .................................................................45
3.3.3.7 Fraktion TGB_S12_P3 .................................................................47
3.3.4 Vergleich von TGB_S10_P2 und TGB_S10_P3..................................49
3.3.5 Vergleich von TGB_S12_P1 und TGB_S12_P3..................................51
3.3.6 Diskussion und Schlussfolgerung........................................................53
3.4 Tilletia caries und Tilletia controversa....................................................54
3.4.1 Extraktion.............................................................................................54
3.4.2 Tilletia caries........................................................................................54
3.4.2.1 Aufarbeitung der Extrakte.............................................................54
3.4.3 Tilletia controversa...............................................................................55
3.4.3.1 Aufarbeitung der Extrakte.............................................................55
3.4.4 Diskussion und Schlussfolgerung........................................................56
4. Experimenteller Teil ......................................................................57
4.1 Material, Methoden und Geräte ...............................................................57
4.1.1 Dünnschichtchromatographie (DC)......................................................57
4.1.2 Präparative Dünnschichtchromatographie...........................................57
4.1.3 Klassische Säulenchromatographie (SC) ............................................57
4.1.4 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) ....................................58
4.1.4.1 Analytische HPLC.........................................................................58
4.1.4.2 Präparative HPLC.........................................................................58
Inhaltsverzeichnis
III
4.1.4.3 Semipräparative HPLC.................................................................59
4.1.5 Reversed Phase (RP) - Festphasenextraktion (SPE®) ........................59
4.1.6 Fast Centrifugal Partition Chromatography - FCPC® ...........................59
4.1.7 LC-MS .................................................................................................60
4.1.8 GC-MS.................................................................................................60
4.1.9 NMR-Spektroskopie.............................................................................61
4.1.10 Circulardichroismus .............................................................................61
4.2 Drimys winteri ...........................................................................................61
4.2.1 Pflanzenmaterial ..................................................................................61
4.2.2 Extraktion.............................................................................................61
4.2.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes ...........................................61
4.2.4 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen ................................................63
4.3 Talauma gloriensis ...................................................................................65
4.3.1 Pflanzenmaterial ..................................................................................65
4.3.2 Extraktion.............................................................................................65
4.3.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes ...........................................66
4.3.4 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen ................................................67
4.4 Tilletia caries und Tilletia controversa....................................................69
4.4.1 Pflanzenmaterial ..................................................................................69
4.4.2 Extraktion.............................................................................................69
4.4.3 Tilletia caries........................................................................................70
4.4.3.1 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes....................................70
4.4.3.2 Aufarbeitung des Methanolextraktes ............................................70
4.4.3.3 Aufarbeitung des alkalischen Extraktes........................................71
4.4.4 Tilletia controversa...............................................................................71
4.4.4.1 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes....................................71
4.4.4.2 Aufarbeitung des alkalischen Extraktes........................................73
5. Zusammenfassung .......................................................................76
6. Literaturverzeichnis ......................................................................79
7. Abbildungsverzeichnis.................................................................83
8. Tabellenverzeichnis ......................................................................86
Einleitung
1
1. Einleitung
Tilletia caries und Tilletia controversa (Basidiomycota) werden unter dem
Organisationstyp der Brandpilze zusammengefasst, da die befallenen Pflanzenteile
wie durch Brand zerstört aussehen. Es wurde angenommen, dass Tilletia caries und
Tilletia controversa ebenso wie der Pilz Claviceps purpurea (Ascomycetes), der
vorwiegend im Roggen die Bildung von Sklerotien und somit des Mutterkorns, Secale
cornutum, bewirkt, die Produktion von Alkaloiden hervorrufen. Ziel war es, die
Alkaloidführung zu überprüfen und die Substanzen gegebenenfalls zu isolieren.
Weiters wurde die Rinde einer costaricensischen Pflanze namens Drimys winteri, die
in die Familie der Winteraceae eingeordnet wird, phytochemisch untersucht.
Besonders charakteristisch für diesen Baum, der auch als magellanischer Zimt
bezeichnet wird, sind die pfeffrig und würzig schmeckenden Rinden und Blätter, die
in der südamerikanischen Volksheilkunde Verwendung finden. Bevorzugt wird die
Rinde zur Behandlung verschiedenster Erkrankungen wie Magenbeschwerden,
Krebs, Schmerzen etc. eingesetzt. Von Interesse war es, die für die Wirkung
verantwortlichen Inhaltsstoffe herauszufinden. Das Ziel bestand darin, die zum Teil
schon bekannten Inhaltsstoffe sowie noch unbekannte Inhaltsstoffe zu isolieren und
in weiterer Folge auch zu identifizieren.
Zusätzlich sollten die Blätter einer aus Costa Rica stammenden
Tieflandregenwaldart, die den Namen Talauma gloriensis trägt und der Familie der
Magnoliaceae angehört, phytochemisch untersucht werden. Zahlreiche verwandte
Arten werden in der Volksmedizin z.B. in Mexiko und Brasilien als Arzneimittel
genutzt. Über die Inhaltsstoffe von Talauma gloriensis war allerdings bis heute nichts
bekannt. Ziel war es daher, diese unbekannten Verbindungen zu isolieren und im
Anschluss daran deren Struktur aufzuklären.
Allgemeiner Teil
2
2. Allgemeiner Teil
2.1 Drimys winteri
2.1.1 Allgemeines
Drimys winteri (L.f.) PITTIER ist auch unter den Synonymen Drimys granadensis L.f.
bzw. Drimys winteri var. granadensis (L.f.) PITTIER
bekannt.
Der botanische Gattungsname Drimys leitet sich
vom griechischen Wort drimys (δριµύς) ab und
bedeutet soviel wie stechend, scharf, herb, was
vermutlich auf den Geschmack der Blätter und
Rinden zurückzuführen ist.
Abb. 1 Drimys winteri
2.1.2 Taxonomie
Abteilung Spermatophyta
Unterabteilung Magnoliophytina (= Angiospermae)
Klasse Magnoliopsida
Unterklasse Magnoliidae
Ordnung Canellales
Familie Winteraceae
Gattung Drimys
Art Drimys winteri (L.f.) PITTIER
2.1.3 Familie der Winteraceae
Die Familie umfasst aromatische, immergrüne Bäume oder Sträucher, deren Hölzer
keine Gefäße aufweisen, sodass sie möglicherweise die ursprünglichsten aller
Blütenpflanzen darstellen.
Generell ist die Familie in den Bergen und eher kühl temperierten Regionen der
Tropen und Südtropen zu finden. In Amerika wird sie durch die Gattung Drimys
vertreten, die sich vom Süden Mexikos nach Guayana, Brasilien, Kap Horn bis auf
die Juan-Fernandez-Inseln erstreckt. Die übrigen Gattungen sind von Neuseeland
Allgemeiner Teil
3
und Tasmanien über Australien und Neukaledonien bis zu den Salomoninseln, auf
Borneo und den Phillipinen vertreten. Selbst auf Madagaskar wurde eine Art
entdeckt. Insgesamt werden der Familie rund 70 verschiedene Arten zugeordnet.
(Heywood et al., 2007)
Abb. 2 Verbreitungskarte der Winteraceae
Die wichtigsten Merkmale der Winteraceae sind der pfeffrige Geschmack der Rinden
und Blätter, das primitive und gefäßlose Holz und die meist zwittrigen Blüten mit
wenig differenzierten Staubblättern. Aber auch der monoporate Pollen, die freien
griffellosen Fruchtblätter mit zum Teil als Narben ausgebildeten Rändern und die
anatropen Samenanlagen stellen besondere Kennzeichen dieser Familie dar.
(Heywood u. Goaman, 1982) Charakteristisch ist auch der Kelch, der bei allen Arten
der Winteraceae eine tubuläre Haube (Calyptra) formt, die die Knospe, wenn auch
nur für eine kurze Zeit während der Entwicklung, gänzlich umschließt (Doust, 2000 u.
Nandi et al., 1998). Die Blätter sind einfach, immergrün, ledrig, ungeteilt, ganzrandig
und wechselständig angeordnet, wobei Nebenblätter gänzlich fehlen. An ihrer
Unterseite sind sie mit einer Wachsschicht überzogen, die zu einer Verstopfung der
Spaltöffnungen führt. Ein auffallendes Charakteristikum sind die aus zwei Zelltypen
bestehenden Markstrahlen, das langgestreckte Kambium sowie das gefäßlose Holz,
an dessen Stelle Spiraltracheiden stehen. Die zwittrigen, teils auch
eingeschlechtlichen Blüten stehen vorwiegend in Büscheln oder Zymen. Ihre Organe
sind hauptsächlich frei, spiralig angeordnet und von unbestimmter Anzahl. Einen
Unterschied zwischen den Kelch- und Kronblättern gibt es allerdings kaum. Die
kurzen und blattartigen Staubblätter tragen seitliche oder apikale Pollensäcke, die
Fruchtblätter sind frei, gestielt und besitzen längs der Öffnung zwei parallele
Narbensäume mit Papillen. Bei den Früchten handelt es sich vorwiegend um
Sammelfrüchte mit beerenartigen Teilfrüchten. (Heywood u. Goaman, 1982)
Allgemeiner Teil
4
Abb. 3 Drimys winteri a.) Habitus b.) Frucht
Folgende Inhaltsstoffgruppen konnten bereits aus den Blättern oder der Rinde isoliert
werden:
Sowohl in den Rinden als auch in den Blättern ist in größeren Mengen ätherisches
Öl, das aus Mono- und Sesquiterpenen besteht, und eine Reihe von bicyclischen
Sesquiterpenen mit Drimangerüst enthalten.
Sesquiterpene stellen die umfangreichste Gruppe der Terpene dar. Ihr
Kohlenstoffskelett besteht aus 15 C-Atomen, die sich in drei Isoprene zerlegen
lassen (regulär gebaute Sesquiterpene) und deren Grundstruktur als 2,6,10-
Trimethyl-n-dodecan bezeichnet wird. Vielfach aber lässt sich durch Wanderung von
Methylgruppen (Pseudoguajane) oder durch sekundäre Spaltung von Ringen
(Xanthane) kein regulärer Aufbau mehr erkennen (irregulär gebaute Sesquiterpene).
Es gibt auch die Möglichkeit, dass Zimtsäurederivate über ihre Carboxylgruppe mit
einem Sesquiterpenalkohol verestert sind. (Hänsel u. Sticher, 2007)
Das Vorkommen von Sesquiterpenen mit Drimangerüst ist eher selten und nur aus
den Familien der Winteraceae, der Canellaceae und der Polygonaceae bekannt
(Hegnauer, 1973).
Abb. 4 Drimangrundgerüst
Beispiele einiger Sesquiterpene mit Drimangerüst, die bereits aus Drimys-Arten
isoliert wurden:
Allgemeiner Teil
5
CH3
H3C
H
OHO
CH3
H
OH
CH3
H3C
H
OHO
CH3
H
H
Abb. 5 Warburganal Abb. 6 Polygodial
O
O CH3
H3C
H
OHO
CH3
H
H
H3CO
O
O CH3
H3C
H
OHO
CH3
H
H
HO
Abb. 7 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial Abb. 8 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial
In der Literatur sind noch weitere Inhaltsstoffe angeführt: So konnten in den Blättern
und Rinden saponinartige Stoffe nachgewiesen werden. Der Gehalt an
Gerbstoffen in den Rinden ist aber eher gering. Außerdem sind in den Blättern
Flavonoide zu finden, aber auch cyanogene Verbindungen, deren phytochemische
Untersuchung noch aussteht, sollen vorkommen. Weiters wird angenommnen, dass
vor allem in jungen Blättern Substanzen enthalten sind, die eine digitalisähnliche
Wirkung hervorrufen. (Hegnauer, 1973) Ein entsprechender Nachweis für die
digitalisähnliche Wirkung wurde jedoch von Jaretzky u. Lier bereits im Jahr 1938
widerlegt.
2.1.4 Pharmakologische Wirkungen
In vorklinischen Studien zeigte ein wässrig-alkoholischer Extrakt von Drimys winteri
antiasthmatische, antiallergische, antiinflammatorische und auch antinoziceptive
Wirkungen (Filho et al., 1998). Für die Wirkung sind in erster Linie Sesquiterpene
vom Driman-Typ verantwortlich, die ein breites Wirkungsspektrum aufweisen. So
sollen sie antibakterielle, antifugale, insektizide, cytotoxische, moluscizide Wirkung
besitzen und auch an der Regulation des Pflanzenwachstums beteiligt sein.
(Rodrίguez et al., 2005) Zu diesen Verbindungen zählen u. a. das Warburganal,
Polygodial, 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial, und das 1-β-(p-Cumaroyloxy)-
polygodial.
Allgemeiner Teil
6
Polygodial und 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial führen bei Mäusen zur
Schmerzhemmung bei abdominalen Kontraktionen, die durch Essigsäure
hervorgerufen werden. Im Vergleich mit zwei allseits bekannten entzündungs- und
schmerzhemmenden Arzneimitteln wie Aspirin und Acetaminophen erzielten sie eine
größere Wirksamkeit. (Filho et al., 1998) In einer fortführenden Untersuchung wurde
bestätigt, dass Polygodial sowie 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial und 1-β-(p-
Cumaroyloxy)polygodial auch eine antifungale Wirkung gegen Epidermophyton
floccosum und Tricophyton rubrum ausüben (Malheiros et al., 2004). Polygodial
zeigte auch antibiotische Wirksamkeit gegen Candida albicans (McCallion et al.,
1982). Das bicylische Sesquiterpen Warburganal ist aufgrund seiner zytotoxischen,
antifungalen und antibiotischen Wirkungen bekannt. Es wirkt als Insektizid gegen
Spodoptera littoralis und Spodoptera exempta und soll auch in der Regulation des
Pflanzenwachstums eine Rolle spielen. (Kubo et al., 1977)
2.1.5 Anwendung
Die Rinde von Drimys winteri wird unter dem Namen Winterianae cortex (Synonyme:
Cortex Winteriani veri, Cortex Winteriani aromatici, Cortex Winterianae, Cortex
winteri, Cortex Magellanici, Cinnamonum magelannicum) medizinisch eingesetzt. Sie
wird außerdem als echte Wintersrinde (Synonyme: Magalhaesischer Zimt,
Magellanischer Zimt) bezeichnet. Zum Einsatz kommt die vom Stamm oder stärkeren
Ästen gewonnene, getrocknete Rinde. (Hiller u. Melzig, 1999) Diese wurde bereits im
16. Jahrhundert von Seefahrern zur Vorbeugung von Skorbut eingesetzt (Heywood
et al., 2007).
In der Volksmedizin wird sie zur Behandlung verschiedener Erkrankungen wie bei
Geschwüren, Krebs, Schmerzen, Anfälligkeiten im Bereich des Bronchialtraktes
sowie als Ersatz für Chinin bei Malaria angewendet (Filho et al., 1998). Des Weiteren
wird sie in der südamerikanischen Volksheilkunde bei Zahnschmerzen,
Magenbeschwerden und Dermatiden verwendet. Im Haushalt dient sie als Gewürz
und zum Aromatisieren von Likören. (Hiller u. Melzig, 1999)
Allgemeiner Teil
7
2.2 Talauma gloriensis
2.2.1 Allgemeines
Talauma gloriensis PITTIER wurde in neuerer Zeit aufgrund molekulargenetischer
Untersuchungen zu Magnolia gloriensis (PITTIER) GOVAERTS umbenannt (Frodin u.
Govaerts, 1996). In der aktuellen Ausgabe des „Manual de Plantas de Costa Rica“
jedoch wird mit Rücksicht auf die Fruchtmorphologie und den ökologischen Standort
(Talauma ist eine Tieflandregenwaldart) der Name Talauma gloriensis beibehalten
(Hammel et al., 2007).
Im Azthekischen lautet der Name für Talauma Yoloxochitl, das wörtlich übersetzt
Herzblume bedeutet und auf eine Anwendung der Pflanze in der mexikanischen
Volksheilkunde als Herzmittel schließen lässt (Jaretzky u. Lier, 1938).
Abb. 9 Talauma gloriensis a.) Blätter, b.) Knospe, c u. d.) Frucht
2.2.2 Taxonomie
Abteilung Spermatophyta
Unterabteilung Magnoliophyta
Klasse Magnoliopsida
Unterklasse Magnoliidae
Ordnung Magnoliales
Familie Magnoliaceae
Unterfamilie Magnolioideae
Gattung Talauma
Art Talauma gloriensis PITTIER
Allgemeiner Teil
8
2.2.3 Familie der Magnoliaceae
Die Familie der Magnoliaceae beinhaltet Bäume und Sträucher, die in Amerika und
Asien beheimatet und durch auffällige Blüten gekennzeichnet sind. Etwa 75% der
Gattungen der Familie sind im temperierten Osten und tropischen Südosten Asiens
verbreitet. Andere hingegen trifft man noch in Amerika und zwar im temperierten
Südosten Nordamerikas sowie im tropischen und subtropischen Südamerika an. Alle
amerikanischen Arten zählen zu den Gattungen Magnolia, Talauma und
Liriodendron. Die Gattung Talauma umfasst in etwa 50 Arten, die von einigen
Autoren auch in die Gattung Magnolia gestellt werden. (Heywood et al., 2007)
Abb. 10 Verbreitungskarte der Magnoliaceae
Morphologisch gesehen weist die Familie folgende Merkmale auf: Die Blätter sind
wechselständig, ungeteilt und gestielt mit hinfälligen Nebenblättern, die eine
ringförmige Narbe zurücklassen. Die einzelnen, gestielten Blüten sind zumeist
zwittrig, groß, prächtig und stehen am Ende der Zweige. Die Blütenhülle setzt sich
aus zwei oder mehreren Quirlen freier kronblattartiger Perigonblätter zusammen. Sie
kann aber ebenso in Kelch (oft dreizählig) und Krone (sechs-vielzählig) gegliedert
sein. Sowohl die zahlreichen freien Staubblätter als auch die freien oder teilweise
verwachsenen Fruchtblätter sind spiralig angeordnet. Die Sammelfrüchte bestehen
aus getrennten oder verwachsenen Fruchtblättern, die entweder geschlossen
bleiben, längs oder ringsum aufspringen. (Heywood et al., 2007) Darin liegt auch der
Unterschied der Gattung Talauma und Magnolia. Das Hauptmerkmal von Talauma
stellen die zahlreichen an der Basis verwachsenen Fruchtblätter dar, die sich zu
einer holzigen Sammelfrucht vereinigen, ringsum aufspringen und die aufrecht
stehenden Samen frei geben (Weber et al., 2001). Die Fruchtblätter der Gattung
Magnolia sind indessen frei, bilden genauso eine Sammelfrucht, öffnen sich aber
entlang der Bauch- oder Rückennaht. Die großen Samen weisen in beiden Fällen
Allgemeiner Teil
9
eine gefärbte Sarcotesta (fleischige Samenschale) auf, sind aber nicht mit den
Fruchtblättern verwachsen (Pennington et al., 2004).
Abb. 11 Talauma gloriensis Habitus und Frucht
Zahlreiche Inhaltsstoffe sind für die Familie der Magnoliaceae typisch:
So ist das Vorkommen von ätherischem Öl schon seit geraumer Zeit bekannt. Die
Zusammensetzung ist allerdings von der geographischen Herkunft der Pflanze und
vom verwendeten Pflanzenteil (z.B. Blätter, Blütenknospen, Stamm, etc) abhängig.
Die Stoffklasse der vorkommenden Lignane und Neolignane ist sehr komplex, da
die Variationen im Substitutionsmuster beträchtlich sind. Für viele dieser
Verbindungen existieren Trivialnamen, deren Grundstruktur sich vom Phenylpropan,
einem C6-C3 Körper, ableitet. Durch die unterschiedliche Verknüpfung zweier
Phenylpropanreste erhält man Lignane (Verknüpfung über das β-C Atom der C3
Seitenkette) und Neolignane (Verknüpfung über die Ringe (Biphenyle) oder über die
Kette und den Ring). (Hänsel u. Sticher, 2007)
Abb. 12 Lignangrundgerüst
Abb. 13 3,3'-Neolignan Abb. 14 8,3'-Neolignan
Allgemeiner Teil
10
Besonders charakteristisch sind Sesquiterpenlactone, die als wesentliches
Strukturmerkmal zumeist eine α-Methylen-γ-lacton-Gruppe, teilweise auch eine α,β-
ungesättigte Carbonyl- oder Epoxidgruppe aufweisen. Sie leiten sich von
verschiedenen Grundkörpern wie dem Germacren, Eudesman, Eleman, Guaian und
Pseudoguaian ab und werden daher in Germacranolid-, Eudesmanolid-, Elemanolid-,
Guaianolid- oder Pseudoguaianolidtypen unterteilt. (Hänsel u. Sticher, 2007)
O
O Abb. 15 Guaianolid
Aber auch Protoalkaloide und Alkaloide wie das Liriodendrin und das Magnoflorin
scheinen relativ häufig zu sein. Weitere Verbindungen, die nicht von allzu großer
Bedeutung sind, sind Flavonoide, cyanogene Verbindungen (eher selten) sowie
Lipide. Bei den Lipiden wurden häufig Phytosterine und Phytosteringlykoside isoliert,
Triterpene waren hingegen kaum zu finden. (Hegnauer, 1969)
2.2.4 Anwendung
Informationen über die Anwendung von Talauma gloriensis in der Medizin gibt es
derzeit nicht. Allerdings werden in der Gattung Talauma einige Arten therapeutisch
verwendet. So wird beispielsweise die Rinde von Talauma ovata bei niedrigem
Fieber und ein Tee der Blätter zur Behandlung von Diabetes eingesetzt.
Pharmakologische Studien konnten hingegen eine Normalisierung des
Blutzuckerspiegels nicht nachweisen und fanden zusätzlich heraus, dass auch
Vergiftungserscheinungen auftreten können, weshalb sie vom Gebrauch als
Arzneimittel abraten. (Mors et al., 2000)
Die Rinde, Blätter, Knospen und Blüten von Talauma plumieri werden als
Stomachikum, bei Hydrops und Gicht angewendet. Aus den Früchten wird ein
bitteres Harz gewonnen, das Schleimfluss entgegenwirken soll. Ähnliche Einsatz-
gebiete gibt es auch für Talauma candollii, Talauma rumphii und Talauma
fragrantissima. Die aromatische Rinde von Talauma elegans wird ebenso als
Allgemeiner Teil
11
Stomachikum, die Blätter aber als Antispasmodicum eingesetzt. (Dragendorff, 1967)
Die Abkochung der Rinde von Talauma mexicana (=Talauma macrocarpa) soll wie
Digitalis wirken und wurde deshalb in der mexikanischen Volksheilkunde als
Herzregulierungsmittel sowie als Digitalisersatz verwendet (Jaretzky u. Lier, 1938).
2.3 Tilletia caries und Tilletia controversa
2.3.1 Allgemeines
Tilletia caries (DC.) TUL. & C.TUL. sowie Tilletia controversa J.G. KÜHN gehören zu den
Brandpilzen, den wichtigsten Krankheitserregern unserer Kulturpflanzen, und
befallen überwiegend den Weizen. Für Tilletia caries ist auch das Synonym Tilletia
tritici in Verwendung. Im deutschsprachigen Raum wird er aber als Stein- oder
Stinkbrand, Tilletia controversa als Zwergsteinbrand bezeichnet.
Abb. 16 Tilletia caries und Tilletia controversa
2.3.2 Taxonomie
Abteilung Basidiomycota
Klasse Ustilaginomycetes
Unterklasse Exobasidiomycetidae
Ordnung Tilletiales
Familie Tilletiaceae
Gattung Tilletia
Art Tilletia caries (DC.) TUL. & C. TUL
Tilletia controversa J.G. KÜHN
Allgemeiner Teil
12
2.3.3 Die Brandpilze
Der Begriff Brandpilz wird im neueren Sinn nicht mehr als taxonomischer Begriff
aufgefasst, sondern er beschreibt einen Organisationstyp. Ihren Namen verdanken
die Brandpilze der Bildung schwarzer Sporenlager, wodurch die befallenen Pflanzen
wie durch Brand zerstört aussehen. Die Brandlager entstehen meist in noch
wachsendem Gewebe. Von den Antheren und Ovarien bis zu den Wurzeln können
nahezu alle Pflanzenorgane betroffen sein. Zu den Wirten der Brandpilze gehören
hauptsächlich Angiospermen, denn mit nur wenigen Ausnahmen werden vorwiegend
krautige Pflanzen bzw. Gräser befallen. (Zwetko u. Blanz, 2004)
2.3.4 Pathogenese der Brandpilze
Die wichtigste Sporenform der Brandpilze stellt die Brandspore, eine einzellige, meist
dickwandige Dauerspore (auch Chlamydospore genannt) dar. Ihre Sporenwand
besteht aus mehr oder weniger drei differenzierten Schichten (von innen nach
außen): dem durchsichtigen und dünnen Endospor, dem oft braunen und dicken
Epispor sowie dem daran anliegenden auffälligen und dunkel gefärbten Exospor.
(Blumer, 1963)
Die reife Brandspore enthält einen diploiden Kern und keimt in der Regel mit einem
kurzen Keimschlauch, der auch als Promyzel bezeichnet wird, aus. Das Promyzel
entspricht dabei einer Basidie, die ihren Charakter weitgehend verloren hat, da sie
nicht mehr zur Entwicklung und Abschnürung von Basidiosporen fähig ist.
(Mühle, 1958) An seiner Spitze bildet das Promyzel vier oder mehr sichelförmige
Sporidien, die auch als Kranzkörperchen bezeichnet werden (Blumer, 1963). Die
Sporiden sind den Sprosszellen der Hefepilze ähnlich, liegen einkernig und
gleichzeitig haploid vor. Sie nehmen die Tochterkerne der Reduktionsteilung auf, da
bereits im Keimschlauch oder in der Brandspore die Reduktionsteilung (Meiose)
stattgefunden hat. Vielfach sind sie in der Lage Sprosszellen zu bilden, wodurch
Kopulation eintreten kann. (Mühle, 1958) Aus den paarkernig gewordenen Sporidien
geht das Paarkernmycel hervor, das meist sichelförmige, paarkernige Konidien
abschnürt und die Bildung neuer Brandsporen anregt (Gäumann, 1964). Die junge
Brandspore ist meist noch paarkernig, erst in der reifen Brandspore findet die
Karyogamie der beiden Kerne statt, womit der Entwicklungszyklus abgeschlossen
wird (Mühle, 1958).
Allgemeiner Teil
13
Abb. 17 Pathogenese der Brandpilze
2.3.5 Gattung Tilletia
Als zwei bedeutende Vertreter der Gattung Tilletia sind Tilletia caries (Stein- oder
auch Stinkbrand) sowie Tilletia controversa (Zwergsteinbrand) zu nennen. Beide
Erreger weisen die gleichen Krankheitssymptome auf, die in erster Linie durch das
Ausbleiben der Kornbildung und durch Bildung einer so genannten Brandbutte,
einem dunklen und harten Gebilde, erkennbar sind (Schöber-Butin et al., 1999).
Die Brandbutten enthalten eine dunkle schmierige nach Heringslake (Trimethylamin)
riechende Masse und sind als die Gesamtheit der gebildeten Brandsporen
(Brandsori) anzusehen. Bei beiden Arten sind die Brandsporen von einer mehr oder
weniger deutlichen Schleimhülle umgeben. (Blumer, 1963)
Abb. 18 Tilletia controversa Schleimhülle
Die unreifen Brandbutten bei T. caries sind weich, enthalten eine schmierige
unangenehm riechende Sporenmasse (Stink- oder Schmierbrand) und sind zur
Allgemeiner Teil
14
Körnerreife fest (Steinbrand). Der Befall einer Pflanze ist durch deren höhere
Bestockung und die etwas verkürzte Halmlänge gekennzeichnet. Die Pflanzen
bleiben länger grün und weisen ein kümmerliches Wachstum auf. Die Spelzen
befallener Ähren sind bläulichgrün gefärbt und spreizen im Gegensatz zu gesunden
oft auffällig ab, sodass die Ähren ein schütteres Aussehen bekommen. (Mühle, 1958)
Die Infektion erfolgt zur Zeit der Keimung des Samens (Keimlingsinfektion). Die aus
den Brandbutten beim Dreschen freiwerdenden Brandsporen gelangen auf die
gesunden, reifen Körner, wo sie äußerlich haften bleiben. Die eigentliche Infektion
findet erst im Boden statt, denn während der Keimung des Korns beginnt auch die
Keimung der Brandsporen. (Zogg, 1985)
Die Brandbutten von Tilletia controversa sind im Vergleich zu Tilletia caries
eingebuchtet, rundlicher und bedeutend kleiner. Als Hauptmerkmal ist eine mit einer
starken Bestockung verbundene, auffällige Halmverkürzung befallener Pflanzen zu
beobachten. Oft erreichen kranke Pflanzen nur ein Viertel bis ein Drittel der
Halmlänge gesunder Pflanzen (Zwergsteinbrand). Die Spindellänge der Ähren bleibt
normal, gelegentlich kann jedoch eine Gelbfärbung der Blätter auftreten. (Blumer,
1963) Die Infektion erfolgt beim Zwergsteinbrand nicht über das Saatgut, sondern
geht vom Boden aus (Keimlingsinfektion). Die Brandsporen keimen unter
Lichteinfluss bei tiefen Temperaturen, wodurch sich das Myzel im Boden ausbreiten
und die jungen Keimpflanzen infizieren kann. Für den Grad des Befalls scheint ein
ganzer Faktorenkomplex ausschlaggebend zu sein, insbesondere saure
Bodenreaktion, geringe Temperaturen, Niederschläge, längere Schneebedeckung
bei Wintergetreide, gute Krankheitsbereitschaft des Wirtes aber auch die Düngung
kann den Befall durch den Zwergsteinbrand wesentlich fördern. (Mühle, 1958)
Spezieller Teil
15
3. Spezieller Teil mit Ergebnissen
3.1 Strukturaufklärung der isolierten Substanzen
Die Identifizierung der einzelnen Verbindungen erfolgte durch Zuhilfenahme der
NMR-Spektroskopie. Dafür wurde von den isolierten Substanzen zunächst ein 1H-Spektrum angefertigt, das die chemische Verschiebung der Protonen zeigt.
Erwiesen sich die Substanzen als interessant und lagen sie mehr oder weniger rein
vor, so wurde zusätzlich ein 13C-Spektrum, mit welchem die Anzahl der
Kohlenstoffatome bestimmt wird, erstellt. Diese beiden Spektren waren zur genauen
Identifizierung bzw. Zuordnung der Molekülgruppen meist nicht ausreichend,
weswegen auch die zweidimensionalen Spektren wie HSQC, HMBC und COSY
vermessen wurden. Anhand des HSQC-Spektrums wird die Zuordnung der Protonen
zu den direkt an ihnen gebundenen Kohlenstoffatomen ermöglicht. Im HMBC werden
die Korrelationen von Protonen mit benachbarten Kohlenstoffatomen über mehr als
eine Bindung (bis zu vier Bindungen) hinweg angezeigt. Das H,H-COSY-Spektrum
gibt Auskunft über die Wasserstoff/Wasserstoff-Kopplungen zweier direkt
benachbarter Gruppen innerhalb einer Verbindung. (Kleinpeter, 1992)
Von allen Reinsubstanzen wurde ein HPLC-Chromatogramm erstellt und LC-MS
Analysen durchgeführt, erstens um ihre Reinheit zu überprüfen und zweitens um
Informationen bezüglich ihres Molekulargewichts zu erhalten.
3.2 Drimys winteri
3.2.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes
Zur Isolierung der Inhaltsstoffe wurde von der pulverisierten Rinde mittels Perkolation
ein Dichlormethanextrakt hergestellt. Dieser wurde mittels Vakuum-Liquid-
Chromatographie aufgearbeitet, indem er über Kieselgel mit einem n-Hexan-
Ethylacetat-Methanol Gradienten eluiert wurde.
Die daraus resultierenden Fraktionen wurden mittels DC-Analyse verglichen und
solche mit ähnlichen bzw. identischen Banden zu insgesamt 20 Fraktionen vereinigt.
Die vielversprechendsten Fraktionen wurden dann mit HPLC untersucht und einige
wurden mittels NMR-Spektroskopie und LC-MS näher betrachtet.
Spezieller Teil
16
3.2.2 Übersicht über die aufgearbeiteten Fraktion
Da es sich bei DWR_V1 und DWR_V2 um ätherisches Öl handelte, erfolgte die
Auftrennung der einzelnen Komponenten mit Hilfe der GC-MS Analyse.
Fraktion DWR_V10 war bereits eine Reinsubstanz und konnte mit der NMR-
Spektroskopie identifiziert werden.
Die Fraktion DWR_V12 wurde mittels präparativer HPLC aufgearbeitet, wobei ein
Gradient bestehend aus Acetonitril/Wasser eingesetzt wurde.
Auch Fraktion DWR_V17 lag als Reinsubstanz vor, wodurch sie mittels NMR-
Spektroskopie identifiziert werden konnte.
Fraktion DWR_V18 und DWR_V19 wurden durch Einsatz der präparativen HPLC
aufgetrennt. In beiden Fällen wurde ein Gradient aus Acetonitril/Wasser in
unterschiedlicher Zusammensetzung verwendet.
Die restlichen Fraktionen wurden wegen ihres HPLC-Profils nicht eingehender
untersucht, da sie keine Informationen über neue Verbindungen lieferten.
Daten über die verwendeten Geräte, Methoden und Fließmittelgemische finden sich
in Kapitel 4.
Abb. 19 Isolierschema von Drimys
Spezieller Teil
17
3.2.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der Substanzen
3.2.3.1 Fraktion DWR_V1
17.00 17.50 18.00 18.50 19.00 19.50 20.00 20.50 21.00 21.50 22.00 22.50 0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
Zeit
Intensität
13
4
852 6
12
11
10
7
9
Abb. 20 GC-Chromatogramm von DWR_V1
Die Prozentzahlen beziehen sich auf die Wahrscheinlichkeit der Peakidentifikation
unter Zuhilfenahme der Datenbanken Nistos und Wiley Aetherolea.
Peak 1: α-Cubeben, 98 % Peak 2: α-Copaen, Aglaien, 99 %
CH3
CH3H3C
CH3
HH
R
R
R
S
S
H
CH3
CH3
CH3
H3C
SS
S
S
R
Peak 3: β-Elemen, 99 % Peak 4: α-Bergamoten, 98 %
CH2
CH3
H3C CH2
H2CCH3
R
SS
H3C CH3CH3
CH3
Spezieller Teil
18
Peak 5: β-Caryophyllen, 99 % Peak 6: β-Cubeben, 95 %
CH3CH3
H3C
CH2
H
H
R
SE
CH3
CH3H3C
CH2
HH
R
R
R
S
S
Peak 7: β-Farnesen, 94 % Peak 8: γ-Muurolen, 99 %
H2C
CH2 CH3
CH3
CH3
E
CH3
CH2
H
H
H3C CH3
R
R
S
Peak 9: Germacren D, 98 % Peak 10: β-Bisabolen, 95 %
CH2
CH3
CH3
CH3E
E S
CH3
CH3CH2
H3C
S
Peak 11: γ-Cadinen, 97 % Peak 12: (-)-Calamenen, 96 %
S
CH3
CH2
H
H3C CH3
RS
H CH3
H3C CH3
CH3
S
S
Spezieller Teil
19
3.2.3.2 Fraktion DWR_V2
17.50 18.00 18.50 19.00 19.50 20.00 20.50 21.00 21.50 22.00 22.50 23.00 23.50 24.00
5000
0
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
60000
65000
70000
Intensität
Zeit
7
6
23
4
5
1
Abb. 21 GC-Chromatogramm von DWR_V2
Peak 1: 1-Methyl-2,4-di(prop-1-en-2-yl)-1-vinylcyclohexan, 91 %
CH3
CH2CH3H2C
CH3H2C
Peak 2: β-Farnesen, 93 %
H2C
CH3CH2
CH3
CH3
E
Peak 3: Germacren D, 98 % Peak 4: β-Elemen, 93 %
CH2
CH3
CH3
CH3E
E S
CH2
CH3
H3C CH2
H2CCH3
R
SS
Spezieller Teil
20
Peak 5: trans-9-Octadecen, 91 %
CH3H3C E
Peak 6: n-Hexadecan, 93 %
H3CCH3
Peak 7: Cadalin, 97 %
CH3
H3C CH3
CH3
3.2.3.3 Fraktion DWR_V10
Bei DWR_V10 und DWR_V12_P6 handelt es sich um Polygodial, dessen
Identifizierung auf dem Vergleich mit Literaturdaten (Rodrίguez et al., 2005) basierte.
Polygodial ist ein bicyclisches Sesquiterpen vom Drimantyp, das als Inhaltsstoff
bereits aus Polygonum hydropiper (Polygonaceae), Pseudowintera colorata
(Winteraceae) sowie aus Drimys winteri bekannt ist.
2
3 45
10
1
67
CH3
15
H3C13
8 12 H
O9
11HO
CH314
H
H
Abb. 22 Polygodial Abb. 23 UV-Spektrum von Polygodial
Summenformel: C15H22O2
Masse: 234,16
Die Masse wurde mittels LC-MS bestätigt. [M+H]+= 235,0
Spezieller Teil
21
2
3 45
10
1
67
CH3
15
H3C13
8 12 H
O9
11
HO
CH314
H
H
Abb. 24 1H-NMR-Spektrum von Polygodial (CDCl3, 298K, TMS)
Position δ 1H (ppm) δ 13C (ppm) δ 1H Lit. (ppm)
δ 13C Lit. (ppm)
C1 1,38 1,83
39,9 1,36 1,82
39,50
C2 1,52 1,52
18,3 1,47 1,52
17,96
C3 1,24 1,49
41,8 1,21 1,47
41,65
C4 - 33,0 - 33,07
C5 1,27 49,0 1,24 48,89
C6 2,50 2,30
25,4 2,49 2,20
25,17
C7 7,13 154,2 7,12 154,30
C8 - 138,2 - 138,19
C9 2,84 60,3 2,80 60,24
C10 - 36,8 - 36,80
C11 9,54 201,8 9,51 201,95
C12 9,45 193,3 9,44 193,23
C13 0,92 32,9 0,90 33,07
C14 0,94 22,0 0,94 21,89
C15 0,95 15,4 0,93 15,22
Tab. 1 NMR-Daten von Polygodial in CDCl3
Spezieller Teil
22
3.2.3.4 Fraktion DWR_V12_P1
Diese Substanz wurde als Allylsyringol identifiziert, das das typische Grundelement
der Lignane, den Phenylpropanrest, aufweist. Bereits das 1H-Spektrum ließ
vermuten, dass ein symmetrisch substituierter Aromat mit möglicherweise zwei
Methoxygruppen in Position 3 und 5 vorliegt. Letzteres wurde durch Integration des 1H-Spektrum auch bestätigt. Sein Vorkommen in Drimys wurde in der Literatur noch
nicht beschrieben.
6
54
3
2
OH
H3CO OCH3
1
7 8
9
Abb. 25 Allylsyringol Abb. 26 UV-Spektrum von Allylsyringol
Summenformel: C11H14O3
Masse: 194,09
Die Bestätigung der Masse erfolgte mittels LC-MS. [M+H]+= 195,0
6
54
3
2
OH
H3CO OCH3
1
7 8
9
Abb. 27 1H-NMR-Spektrum von Allylsyringol (CDCl3, 298K, TMS)
Spezieller Teil
23
Position δ1H (ppm) δ
13C (ppm)
C1 - 131,1
C2, C6 6,42 105,1
C3, C5 - 147,0
C4 - 133,1
C7 3,33 40,4
C8 5,96 137,6
C9 5,09 trans 5,07 cis
115,9
OCH3 3,88 56,3
OCH3 3,88 56,3
OH 5,39 -
Tab. 2 NMR-Daten von Allylsyringol in CDCl3
3.2.3.5 Fraktion DWR_V12_P2
Bei dieser Verbindung handelt es sich um Polygonal, ein Norsesquiterpen (eine C14-
Verbindung) vom Driman-Typ. Die Aldehydgruppe in Position 9 wurde abgespalten
und führte zur Verlagerung der Doppelbindung an die Positionen 8 und 9.
Gleichzeitig wurde an Position 7 eine Hydroxylgruppe angehängt. Erstmals wurde es
im Jahr 1984 erwähnt, als es aus Polygonum hydropiper (Polygonaceae) isoliert
wurde. Es gibt noch keinen Literaturnachweis für das Vorkommen in Drimys.
2
3 45
10
1
6
7
CH3
15
H3C13
8 12 H
O9
CH314
HOH
Abb. 28 Polygonal Abb. 29 UV-Spektrum von Polygonal
Summenformel: C14H22O2
Masse: 222,16
Spezieller Teil
24
2
3 45
10
1
6
7
CH3
15
H3C13
8 12 H
O9
CH314
HOH
Abb. 30 1H-NMR-Spektrum von Polygonal (CDCl3, 298K, TMS)
Position δ 1H (ppm) δ 13C (ppm)
C1 1,62 1,39
37,8
C2 1,75 1,58
18,7
C3 1,51 1,28
41,8
C4 - 33,1
C5 1,54 45,5
C6 1,91 1,66
26,8
C7 4,62 62,5
C8 - 138,7
C9 6,51 164,8
C10 - 37,4
C12 9,44 195,7
C13 0,90 21,3
C14 0,98 32,7
C15 1,02 18,6
OH 2,64 -
Tab. 3 NMR-Daten von Polygonal in CDCl3
Spezieller Teil
25
3.2.3.6 Fraktion DWR_V12_P3
Durch den Vergleich mit Literaturdaten (Ayer u. Talamas, 1988) konnte festgestellt
werden, dass diese Verbindung unter dem Namen Warburganal bekannt ist.
Warburganal gehört zu den Drimansesquiterpenen und beide α-
Hydroxyaldehydgruppen sowie die Doppelbindung sitzen an ein und demselben
Ring. Es wurde zuvor schon aus Warburgia stuhlmannii, Warburgia ugandensis
(beide Canellaceae), Polygonum hydropiper und auch aus Drimys winteri isoliert.
2
3 45
10
1
67
CH3
15
H3C13
8 12 H
O9
11HO
CH314
H
OH
Abb. 31 Warburganal Abb. 32 UV-Spektrum von Warburganal
Summenformel: C15H23O3
Masse: 250,16
2
3 45
10
1
67
CH3
15
H3C13
8 12 H
O9
11
HO
CH314
H
OH
Abb. 33 1H-NMR-Spektrum von Warburganal (CDCl3, 298K, TMS)
Spezieller Teil
26
Position δ 1H (ppm) δ 13C (ppm) δ 1H Lit. (ppm)
δ 13C Lit. (ppm)
C1 1,69 1,04
31,1 1,22-1,75 31,2
C2 1,51 1,51
17,7 1,22-1,75 17,7
C3 1,45 1,27
41,3 1,22-1,75 41,3
C4 - 33,0 - 33,0
C5 1,91 41,7 1,9 41,7
C6 2,59 2,35
25,9 2,59 2,35
25,9
C7 7,28 157,5 7,28 157,2
C8 - 140,3 - 140,5
C9 - 77,7 - 77,1
C10 - 41,4 - 41,4
C11 9,74 202,2 9,76 202,0
C12 9,43 192,6 9,43 192,5
C13 0,95 33,0 0,95 33,0
C14 1,0 22,1 1,0 22,0
C15 1,1 17,1 1,1 17,0
OH 4,08 - 4,09 -
Tab. 4 NMR-Daten von Warburganal in CDCl3
3.2.3.7 Fraktion DWR_V12_P4
Die Identifizierung des Lignans Sesamin beruhte auf dem Vergleich mit
Literaturdaten (Roy et al., 2002). Charakteristisch ist das Tetrahydrofurofurangerüst,
an dem zwei identische Piperonylreste sitzen. Durch seine Symmetrie wird auch die
geringe Anzahl an Signalen im 1H-Spektrum erklärt. Sein Vorkommen in Drimys ist
bereits bekannt.
15
6O
8
2O4
O
O
HHO
O
Abb. 34 Sesamin Abb. 35 UV-Spektrum von Sesamin
Spezieller Teil
27
Summenformel: C20H18O6
Masse: 354,11
Durch eine LC-MS Analyse wurde die Masse bestätigt. [M+H]+= 355,0
15
6 O8
2O4
O
O
HHO
O
Abb. 36 1H-NMR-Spektrum von Sesamin (CDCl3, 298K, TMS)
Position δ 1H (ppm) δ 1H Lit. (ppm)
C1,C5 3,04 3,02-3,06
C2,C6 4,71 4,70
C4;C8 3,87 (ax) 3,86 (ax)
C4,C8 4,22 (eq) 4,23 (eq)
Aromat 6,76-6,86 6,75-6,85
OCH2O 5,93 5,92
Tab. 5 NMR-Daten von Sesamin in CDCl3
3.2.3.8 Fraktion DWR_V17
Sowohl DWR_V17 und DWR_V18_P11 konnten durch Literaturdaten (Della Monica
et al., 2007) als 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial identifiziert werden. Die
Verbindung besteht aus einer Zimtsäure, die in para-Position eine Methoxygruppe
enthält und über die Carboxylgruppe mit dem Drimangerüst verbunden ist. Ihr
Vorkommen in Drimys ist bekannt.
Spezieller Teil
28
6'
7'8'
9'
4'
5'3'
2' 1'
O
O
2
3 45
101
67
CH3
15
H3C13
8 12 H
O9
11HO
CH314
H
H
H3CO
Abb. 37 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial Abb. 38 UV-Spektrum von 1-β-O-(p-
Methoxycinnamoyl)polygodial
Summenformel: C25H30O5
Masse: 410,21
Die Masse wurde durch LC-MS bekräftigt. [M+H]+= 411,0
6'
7'8'
9'
4'
5'3'
2' 1'
O
O
2
3 45
101
67
CH3
15
H3C13
8 12 H
O9
11HO
CH314
H
H
H3CO
Abb. 39 1H-NMR-Spektrum von 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial (CDCl3, 298K, TMS)
Position δ 1H (ppm) δ 13C (ppm) δ 1H Lit. (ppm)
δ 13C Lit. (ppm)
C1 4,88 81,5 4,87 81,5
C2 1,69 1,90
24,2 1,68 1,88
24,1
C3 1,54 1,57
39,3 1,47-1,60 39,3
C4 - 32,8 - 32,8
C5 1,44 48,9 1,42 48,9
Spezieller Teil
29
C6 2,46 2,43
24,5 2,35-2,51 24,5
C7 7,07 151,9 7,06 151,9
C8 - 140,5 - 140,4
C9 3,35 59,2 3,34 59,2
C10 - 42,4 - 42,3
C11 9,81 200,5 9,81 200,4
C12 9,34 192,3 9,33 192,3
C13 0,97 32,7 0,96 32,6
C14 1,02 22,2 1,01 22,2
C15 1,07 10,7 1,06 10,6
C1’ - 166,4 - 166,4
C2’ 6,27 115,3 6,26 115,2
C3’ 7,62 145,4 7,62 145,4
C4’ - 127,0 - 126,9
C5’ 7,49 130,0 7,48 130,0
C6’ 6,90 114,3 6,90 114,3
C7’ - 161,6 - 161,5
C8’ 6,90 114,3 6,90 114,3
C9’ 7,49 130,0 7,48 130,0
OCH3 3,84 55,4 3,84 55,4
Tab. 6 NMR-Daten von 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial in CDCl3
3.2.3.9 Fraktion DWR_V18_P3
Durch Literaturdaten (Evcim et al., 1986 u. Gözler et al., 1996) wurde
herausgefunden, dass es sich bei dieser Substanz um Haplomyrfolin, ein
Dibenzylbutyrolacton, handelt. Es gehört zur Klasse der Neolignane und wurde zum
ersten Mal 1986 in Haplophyllum myrtifolium (Rutaceae) gefunden. Aus Drimys
wurde bisher nur das ähnlich aufgebaute Cubebin, das im Gegensatz zum
Haplomyrfolin zwei Piperonylreste aufweist, isoliert.
Spezieller Teil
30
3'
4'
5'6'
1'2' 7'
8'
89
O
9'
7
16
54
3
2
OO
OHO
H3CO
H
H
Abb. 40 Haplomyrfolin Abb. 41 UV-Spektrum von Haplomyrfolin
Summenformel: C20H20O6
Masse: 356,13
25][
Dα = -32° (CH2Cl2, c 0,125g/100ml), Lit.: 25
][D
α = -31,6° (CHCl3, c 0,11g/100ml)
Die Bestätigung der Masse wurde durch LC-MS durchgeführt. [M+H]+= 356,9
3'
4'
5'6'
1'2' 7'
8'
89
O
9'
7
16
5
4
3
2
O
O
OHO
H3CO
H
H
Abb. 42 1H-NMR-Spektrum von Haplomyrfolin (CDCl3, 298K, TMS)
Position δ 1H (ppm) δ 13C (ppm) δ 1H Lit. (ppm)
δ 13C Lit. (ppm)
C1 - 131,6 - 131,33
C2 6,61 109,5 6,61 109,41
C3 - 147,9 - 147,78
C4 - 146,4 - 146,37
C5 6,73 108,1 6,72 108,12
Spezieller Teil
31
C6 6,58 122,2 6,59 122,19
C7 2,86 2,97
34,7 2,85 2,97
34,68
C8 2,56 46,4 2,57 46,37
C9 - 178,6 - 178,46
C1’ - 129,2 - 129,68
C2’ 6,47 110,9 6,47 110,98
C3’ - 146,5 - 146,54
C4’ - 144,5 - 144,37
C5’ 6,82 114,4 6,81 114,44
C6’ 6,52 121,2 6,52 121,22
C7’ 2,50 2,61
38,2 2,50 2,60
38,22
C8’ 2,49 41,3 2,47 41,23
C9’ 3,88 4,15
71,2 3,88 4,15
71,15
OCH2O 5,94 5,94
100,9 5,93 5,94
100,93
OCH3 3,85 55,7 3,85 55,75
Tab. 7 NMR-Daten von Haplomyrfolin in CDCl3
3.2.3.10 Fraktion DWR_V19_P6
Die Verbindung wurde als 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial identifiziert. Der
Unterschied zu 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial besteht darin, dass anstelle
der Methoxygruppe an der para-Position der Zimtsäure eine Hydroxylgruppe
eingeführt ist. Ein Literaturnachweis für diese Verbindung wurde in Drimys
brasiliensis von Vichnewski et al., 1986 erbracht.
6'
7'8'
9'
4'
5'3'
2' 1'
O
O
2
3 45
101
67
CH3
15
H3C13
8 12 H
O9
11HO
CH314
H
H
HO
Abb. 43 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial Abb. 44 UV-Spektrum von 1-β-(p-
Cumaroyloxy)polygodial
Spezieller Teil
32
Summenformel: C24H28O6
Masse: 396,19
Die Masse wurde mittels LC-MS bekräftigt. [M+H]+= 396,8
6'
7'8'
9'
4'
5'3'
2' 1'
O
O
2
3 45
101
67
CH3
15
H3C13
8 12 H
O9
11HO
CH314
H
H
HO
Abb. 45 1H-NMR-Spektrum von 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial (CDCl3, 298K, TMS)
Position δ 1H (ppm) δ 13C (ppm)
C1 4,85 81,4
C2 1,85 1,69
24,2
C3 1,54 1,57
39,2
C4 - 32,8
C5 1,42 48,8
C6 2,44 2,42
24,6
C7 7,09 152,5
C8 - 140,2
C9 3,32 59,2
C10 - 42,4
C11 9,81 201,5
C12 9,35 192,5
C13 0,98 32,6
C14 1,01 22,2
Spezieller Teil
33
C15 1,07 10,6
C1’ - 166,4
C2’ 6,20 114,7
C3’ 7,56 145,8
C4’ - 126,5
C5’ 7,37 130,2
C6’ 6,79 115,9
C7’ - 158,5
C8’ 6,79 115,9
C9’ 7,37 130,2
OH 1,77 -
Tab. 8 NMR-Daten von 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial in CDCl3
3.2.4 Diskussion und Schlussfolgerung
In der Rinde von Drimys winteri sind zahlreiche Substanzklassen vertreten. Darin
beinhaltet ist auch ätherisches Öl, das offenbar nur aus Sesquiterpenen besteht. In
erster Linie gehören die isolierten Verbindungen jedoch zur Klasse der
Sesquiterpene vom Driman-Typ (C15-Verbindungen), die sich aus drei
Isopreneinheiten zusammensetzen und ein Decalinsystem bilden. Sie zeichnen sich
durch eine Doppelbindung in Position 7 und zwei α-Aldehydgruppen in Position 8 und
9 aus, die im selben Ring enthalten sind. Über die Carboxylgruppe der Zimtsäure
findet häufig eine Verknüpfung mit einem derartigen Sesquiterpen statt. Zu diesen
Verbindungen zählen u. a. das Polygodial, 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial,
1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial und Warburganal, deren Vorkommen in Drimys in der
Literatur schon vielfach beschrieben wurde.
Neu ist die Anwesenheit eines Norsesquiterpens, einer C14-Verbindung, die zuvor
schon aus Polygonum hydropiper isoliert und Polygonal genannt wurde. Weiters
wurde neben dem bereits bekannten Sesamin und Cubebin auch das Vorkommen
eines bisher unbekannten Phenylpropans und Neolignans in Drimys belegt. Bei
diesen Verbindungen handelt es sich um das Allylsyringol und Haplomyrfolin, wobei
letzteres ein Dibenzylbutyrolacton ist und somit der Klasse der Neolignane angehört.
Aufgrund des eher seltenen Vorkommens von Lignanen und Neolignanen in Drimys
wurde erneut aufgezeigt, dass der Phenylpropanoid-Stoffwechselweg eine Rolle
spielt. Weiters wurde durch die Isolierung von Verbindungen, die der Klasse der
Spezieller Teil
34
Sesquiterpene vom Drimantyp angehören und zugleich Inhaltsstoffe der Canellaceae
und auch Polygonaceae sind, erneut die enge Verwandtschaft der Winteraceae und
Canellaceae unter Beweis gestellt.
3.3 Talauma gloriensis
3.3.1 Extraktion und Aufarbeitung des Extraktes
Die gemahlenen Blätter wurden durch Perkolation mit Dichlormethan zur
Extraktherstellung herangezogen. Der Dichlormethanextrakt wurde dann durch
klassische Säulenchromatographie über Kieselgel mit n-Hexan-Ethylacetat-Methanol
Mischungen in Grobfraktionen aufgetrennt.
Die dabei gewonnenen Grobfraktionen wurden dünnschichtchromatographisch
untersucht und anhand der Ähnlichkeit ihrer Banden zu insgesamt 16 Fraktionen
vereinigt. Alle interessanten Fraktionen wurden mittels HPLC und zum Teil auch
mittels NMR-Spektroskopie eingehender betrachtet. Von einigen Fraktionen wurden
auch LC-MS Analysen durchgeführt.
3.3.2 Übersicht über die aufgearbeiteten Fraktionen des Extraktes
Die Fraktionen TGB_S1 und TGB_S2 bestanden aus einem Gemisch aus
ätherischem Öl, dessen Hauptkomponenten mittels GC-MS identifiziert wurden.
Die Aufarbeitung der Fraktionen TGB_S7, TGB_S10 und TGB_S12 erfolgte durch
Verwendung der präparativen HPLC. Es wurden grundsätzlich Fließmittelgradienten
bestehend aus Acetonitril/Wasser in unterschiedlicher Zusammensetzung eingesetzt.
Die übrigen Fraktionen wurden mit Ausnahme eines HPLC-Profils nicht detaillierter
untersucht, da sie keinerlei Hinweise auf noch unbekannte und neuartige
Verbindungen ergaben.
Genaue Daten bezüglich der verwendeten Methoden, Gerätedaten und verwendeten
Fließmittelgemische befinden sich in Kapitel 4.
Spezieller Teil
35
Abb. 46 Isolierschema von Talauma
3.3.3 Identifizierung und Strukturaufklärung der Substanzen
3.3.3.1 Fraktion TGB_S1
19.00 19.50 20.00 20.50 21.00 21.50 22.00 22.50 23.00 23.50 0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000 3
Zeit
Intensität
1 2
4
Abb. 47 GC-Chromatogramm von TGB_S1
Die Prozentangaben entsprechen der Wahrscheinlichkeit der Peakidentifizierung
durch Vergleich der Massenspektren mit denen der Datenbanken Nistos und Wiley
Aetherolea.
Spezieller Teil
36
Peak 1: β-Farnesen, 93 % Peak 2: α-Curcumen, 95 %
H2C
CH2 CH3
CH3
CH3
E
CH3
CH3CH3
H3C
Peak 3: β-Bisabolen, 95 % Peak 4: β-Sesquiphellandren, 94 %
CH3
CH3CH2
H3C
S
CH3
CH3CH3
H2C
H
R S
3.3.3.2 Fraktion TGB_S2
18.00 18.50 19.00 19.50 20.00 20.50 21.00 21.50 22.00
20000
0
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
220000
240000
260000
280000
300000
320000
340000
360000
1
57
3 4
Zeit
Intensität
9
2
8
6
Abb. 48 GC-Chromatogramm von TGB_S2
Peak 1: α-Bergamoten, 97 % Peak 2: β-Caryophyllen, 99 %
CH3CH3
CH3
H3C
CH3CH3
H3C
CH2
H
H
R
SE
Spezieller Teil
37
Peak 3: γ-Muurolen, 99 % Peak 4: β-Farnesen, 96 %
CH3
CH2
H
H
H3C CH3
R
R
S
H2C
CH3CH2
CH3
CH3
E
Peak 5: α-Selinen, 99 %
CH3
CH3
HCH2
CH3
R
R R
Peak 6: (1R,4aR,8aS)-1-Isopropyl-4,7-dimethyl-1,2,4a,5,6,8a-hexahydronaphthalen,
98 %
CH3
CH3
H
H
H3C CH3
R
R
S
Peak 7: δ-Guaien, 97 %
CH3
HCH3CH2
H3C R SS
Peak 8: 1-Isopropyl-4,7-dimethyl-1,2,4a,5,6,8a-hexahydronaphthalen, 97 %
CH3
CH3
CH3H3C
Spezieller Teil
38
Peak 9: δ-Cadinen, 96 %
CH3
CH3
CH3
CH3H3C
SR
3.3.3.3 Fraktion TGB_S10_P2
Diese Verbindung ist ein Lignan vom Dibenzoylcyclooctadien-Typ. Bis jetzt gibt es
keinen Literaturnachweis für diese Verbindung, weshalb sie als Pyramidatin I
bezeichnet wurde.
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3OO
O O
O
CH3
O
CH3
Abb. 49 Pyramidatin I Abb. 50 UV-Spektrum von Pyramidatin I
Summenformel: C22H22O7
Masse: 398,14
25][
Dα = -73,21° (CH2Cl2; c 0,68g/100ml)
Die Masse wurde mittels LC-MS bestätigt. [M+H]+= 399,0
TGB_S10_P2_po s # 1572 R T: 21.87 AV: 1 NL: 2.9 5E9T: + c ESI Full ms [ 100.00-1200.00]
140 1 60 180 2 00 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 4 60 480m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
10 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nce
399
400
314
369
381351313 401341315300283269 382352338256241235212 40219 0161 431 460169150 491
Abb. 51 Massenspektrum von Pyramidatin I
Spezieller Teil
39
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3OO
O O
O
CH3
O
CH3
Abb. 52 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin I (CDCl3, 298K, TMS)
Abb. 53 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin I (CDCl3, 298K, TMS)
Position δ 1H (ppm) J (Hz) δ 13C (ppm)
C1 - 136,1
C2 - 119,5
C3 - 140,9
C4 - 136,5
C5 - 148,5
C6 6,68 s 105,8
Spezieller Teil
40
C7 4,66 s 87,3
C8 2,30 qu 6,6 35,2
C9 0,94 d 6,6 19,3
C1’ - 132,6
C2’ - 121,4
C3’ - 141,9
C4’ - 135,0
C5’ - 148,8
C6’ 6,34 s 102,0
C7’ 2,73 2,45
dd dd
13,2; 9,0 13,2; 9,6
37,7
C8’ 1,97 trd 9,6; 4,2 46,3
C9’ 4,00 3,86
dd d
7,8; 4,2 7,8
74,3
OCH2O 5,94 5,97
m 101,2
OCH2O 5,94 5,97
m 100,9
OCH3 3,69 s 59,8
OCH3 3,88 s 59,7
Tab. 9 NMR-Daten von Pyramidatin I in CDCl3
3.3.3.4 Fraktion TGB_S10_P3
Die Identifizierung der Substanz beruhte auf dem Vergleich der chemischen
Verschiebung (in ppm) mit Literaturdaten (Song et al., 2000). Dadurch wurde
festgestellt, dass es sich um Pyramidatin H, ein Lignan vom Dibenzoylcyclooctadien-
Typ handelt. Zum ersten Mal wurde es aus Magnolia pyramidata isoliert und erhielt
daher seinen Namen.
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3O
O
OO
O
O
CH3 CH3
Abb. 54 Pyramidatin H Abb. 55 UV-Spektrum von Pyramidatin H
Spezieller Teil
41
Summenformel: C22H22O7
Masse: 398,14
24][
Dα = 166,67° (CH2Cl2; c 0,6g/100ml)
Die Bestätigung der Masse erfolgte durch LC-MS. [M+H]+= 399,0
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3O
O
OO
O
O
CH3 CH3
Abb. 56 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin H (CDCl3, 298K, TMS)
Abb. 57 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin H (CDCl3, 298K, TMS)
Spezieller Teil
42
Position δ 1H (ppm)
J (Hz) δ 13C (ppm)
δ 1H Lit. (ppm)
δ 13C Lit. (ppm)
C1 - 137,4 - 137,38
C2 - 118,3 - 118,31
C3 - 142,2 - 142,16
C4 - 135,6 - 135,40
C5 - 148,6 - 148,57
C6 6,36 s 100,5 6,36 100,45
C7 4,72 s 88,9 4,71 88,89
C8 2,02 m 51,2 2,03 51,17
C9 1,17 d 20,3 1,17 20,36
C1’ - 131,7 - 131,65
C2’ - 122,9 - 122,87
C3’ - 141,4 - 141,36
C4’ - 135,4 - 135,59
C5’ - 147,2 - 147,18
C6’ 6,41 s 105,1 6,41 105,08
C7’ 2,84 2,27
t d
13,2 13,2
38,7 2,85 2,48
38,70
C8’ 2,04 m 41,8 2,03 41,77
C9’ 3,62 3,33
dd d
9,0; 4,2 9,0
70,7 3,62 3,33
70,64
OCH2O 5,94 m 100,8 5,96 100,77
OCH2O 5,96 m 101,1 5,96 101,01
OCH3 3,75 s 59,8 3,75 59,65
OCH3 3,75 s 59,7 3,65 59,80
Tab. 10 NMR-Daten von Pyramidatin H in CDCl3
Spezieller Teil
43
3.3.3.5 Fraktion TGB_S12_P1
Diese Substanz ist ebenfalls ein so genanntes Dibenzoylcylooctadien-Lignan, das in
der Literatur bislang noch nicht beschrieben wurde und infolgedessen den Namen
Pyramidatin K erhielt.
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3OO
O
O
O
O
CH3 CH3 CH3
CH3
Abb. 58 Pyramidatin K Abb. 59 UV-Spektrum von Pyramidatin K
Summenformel: C23H26O7
Masse: 414,17
25][
Dα = -42,12° (CH2Cl2; c 0,52g/100ml)
Die Masse wurde durch LC-MS bekräftigt. [M+H]+= 415,0
TGB_S12P1_pos #1 132 RT: 18.21 AV: 1 NL: 2 .54 E9T: + c ESI Full ms [ 150.00-2000.00]
1 80 200 220 24 0 2 60 280 300 32 0 3 40 360 380 400 4 20 440 460 480m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
10 0
Re
lati
ve
Ab
un
da
nce
415
416
330
41 7299257 38 5 397285255 366278 315 335 342241 398226 367219 386213 45 4195181 429165 460 474 483446
Abb. 60 Massenspektrum von Pyramidatin K
Spezieller Teil
44
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3OO
O
O
O
O
CH3 CH3 CH3
CH3
Abb. 61 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin K (CDCl3, 298K, TMS)
Abb. 62 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin K (CDCl3, 298K, TMS)
Position δ 1H (ppm) J (Hz) δ 13C (ppm)
C1 - 135,6
C2 - 119,5
C3 - 140,9
C4 - 136,6
C5 - 148,6
C6 6,68 s 105,6
Spezieller Teil
45
C7 4,68 s 87,4
C8 2,29 qu 7,2 35,3
C9 0,95 d 6,8 19,5
C1’ - 134,0
C2’ - 122,6
C3’ - 152,3
C4’ - 140,2
C5’ - 153,0
C6’ 6,42 s 106,1
C7’ 2,50 2,77
dd dd
13,2; 10,0 13,2; 8,4
37,8
C8’ 2,00 trd 9,2; 4,4 46,3
C9’ 4,01 3,89
dd
7,6; 4,4
74,4
OCH2O 5,94 5,97
d 10,0 101,2
OCH3 3,71 s 59,8
OCH3 3,59 s 60,6
OCH3 3,88 s 61,1
OCH3 3,88 s 55,8
Tab. 11 NMR-Daten von Pyramidatin K in CDCl3
3.3.3.6 Fraktion TGB_S12_P2
Auch in diesem Fall handelt es sich um ein Dibenzoylcyclooctadien-Lignan. Die
Verbindung ist bis jetzt in der Literatur nicht erwähnt und wurde Pyramidatin L
genannt.
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3O
O
OO
O
CH3CH3
O
CH3
H3C
Abb. 63 Pyramidatin L Abb. 64 UV-Spektrum von Pyramidatin L
Spezieller Teil
46
Summenformel: C23H26O7
Masse: 414,17
Die Bestätigung der Masse wurde mittels LC-MS durchgeführt. [M+H]+= 415,1
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3O
O
OO
O
CH3CH3
O
CH3
H3C
Abb. 65 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin L (CDCl3, 298K, TMS)
Position δ 1H (ppm) J (Hz) δ 13C (ppm)
C1 - 137,0
C2 - 120,2
C3 - 151,8
C4 - 141,4
C5 - 152,2
C6 6,74 s 109,9
C7 4,72 s 87,6
C8 2,39 35,1
C9 0,96 d 6,6 19,3
C1’ - 132,4
C2’ - 121,8
C3’ - 141,8
C4’ - 135,2
C5’ - 148,8
Spezieller Teil
47
C6’ 6,34 s 101,9
C7’ 2,75 2,49
dd dd
13,8; 9,4 13,8; 10,2
37,6
C8’ 2,00 m 46,4
C9’ 4,02 3,89
m 74,3
OCH2O 5,97 d 6,6 100,9
OCH3 3,38 s 60,6
OCH3 3,88 s 61,0
OCH3 3,88 s 55,6
OCH3 3,88 s 59,7
Tab. 12 NMR-Daten von Pyramidatin L in CDCl3
3.3.3.7 Fraktion TGB_S12_P3
Diese Verbindung ist ebenfalls ein Lignan vom Dibenzoylcyclooctadien-Typ. In der
Literatur wurde es bislang nicht erwähnt und daher mit Pyramidatin J bezeichnet.
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3OO
OO
CH3
CH3
O
CH3
O
CH3
Abb. 66 Pyramidatin J Abb. 67 UV-Spektrum von Pyramidatin J
Summenformel: C23H26O7
Masse: 414,17
24][
Dα = -17,97° (CH2Cl2; c 0,61g/100ml)
Die Masse wurde durch LC-MS bestätigt. [M+H]+= 415,0
Spezieller Teil
48
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3OO
OO
CH3
CH3
O
CH3
O
CH3
Abb. 68 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin J (CDCl3, 298K, TMS)
Abb. 69 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin J (CDCl3, 298K, TMS)
Position δ 1H (ppm) J (Hz) δ 13C (ppm)
C1 - 137,0
C2 - 118,5
C3 - 142,2
C4 - 135,8
C5 - 148,6
C6 6,37 s 100,4
C7 4,71 s 89,1
Spezieller Teil
49
C8 2,06 m 51,3
C9 1,18 d 6,6 20,5
C1’ - 133,2
C2’ - 123,8
C3’ - 151,7
C4’ - 140,3
C5’ - 151,2
C6’ 6,48 s 109,5
C7’ 2,89 2,36
dd d
13,8 10,8
39,0
C8’ 2,08 m 41,8
C9’ 3,62 3,27
dd d
8,4; 4,2 8,4
70,7
OCH2O 5,96 s 101,1
OCH3 3,76 s 59,8
OCH3 3,50 s 60,4
OCH3 3,91 s 61,2
OCH3 3,88 s 55,9
Tab. 13 NMR-Daten von Pyramidatin J in CDCl3
3.3.4 Vergleich von TGB_S10_P2 und TGB_S10_P3
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3OO
O O
O
CH3
O
CH3
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3O
O
OO
O
O
CH3 CH3
Abb. 70 Pyramidatin I Abb. 71 Pyramidatin H
Bei den Verbindungen Pyramidatin I (TGB_S10_P2) und Pyramidatin H
(TGB_S10_P3) handelt es sich stereochemisch gesehen um so genannte
Diasteromere. Sie gehören zur Klasse der Stereoisomere, deren Atome in gleicher
Weise verknüpft, aber räumlich unterschiedlich angeordnet sind. Diastereomere sind
nicht spiegelbildlich zueinander, haben an einem oder mehreren Stereozentrum
dieselbe Konfiguration, unterscheiden sich jedoch durch die Konfiguration der
Spezieller Teil
50
übrigen Stereozentren. (Hart et al., 2002) Isomere, die sich durch die Verdrehung
von Biphenylsystemen ergeben, werden auch als Atropisomere bezeichnet. Im
obigen Fall sind diese Atropisomere durch die Verbindungsachse 2-2’ festgelegt. Zur
Ermittlung der absoluten Konfiguration dieser zwei Stereozentren wurde der
Circulardichroismus gemessen. Anhand der aufgezeichneten Kurve ist ersichtlich, ob
die Verbindung die R- bzw. S-Konfiguration einnimmt. Geht die Kurve im hinteren
Abschnitt des Diagramms nach unten, so ergibt sich daraus die R-Konfiguration.
Steigt sie jedoch nach oben an, erhält man die S-Konfiguration. Dadurch konnte
festgestellt werden, dass Pyramidatin I (TGB_S10_P2) die S-Konfiguration und
Pyramidatin H (TGB_S10_P3) die R-Konfiguration zu zuordnen ist. Die Zuordnung
der CD-Spektren zur absoluten Konfiguration wurde erstmals am Schizandrin, einem
sehr ähnlich aufgebauten Dibenzoylcyclooctadien, von Ikeya im Jahr 1979 und 1991
durchgeführt.
Abb. 72 CD-Spektrum von Pyramidatin I Abb. 73 CD-Spektrum von Pyramidatin H
Die Auswirkung der Konfiguration dieser Achse kann man auch an den
Verschiebungswerten der NMR-Spektren (1H und vor allem 13C) erkennen. Betroffen
von dieser Verschiebung ist die Position 8 im Cyclooctanring. Herrscht im
Biphenylsystem die S-Konfiguration vor, so kommt es zur geringeren Verschiebung
der ppm Werte an Position 8 im 13C-Spektrum (35,2 ppm). Weist sie hingegen eine
höhere Verschiebung in Position 8 auf (51,2 ppm), ist die R-Konfiguration im
Biphenylsystem vorhanden. Besonders gut erkennbar ist der Unterschied der
absoluten Konfiguration im dargestellten HSQC-Ausschnitt.
Spezieller Teil
51
Abb. 74 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin I Abb. 75 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin H
Auch dürfte es sich in diesem Fall um Konformationsisomere handeln, die durch
Einwirken von hoher Energie durch Rotation einer Einfachbindung theoretisch
ineinander überführbar sind (Hart et al., 2002).
3.3.5 Vergleich von TGB_S12_P1 und TGB_S12_P3
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3OO
O
O
O
O
CH3 CH3 CH3
CH3
5
4
2
6 12'
7 88'
7'
1'
3' 4'
5'
6'9'O
HH
H
H CH39 H
3OO
OO
CH3
CH3
O
CH3
O
CH3
Abb. 76 Pyramidatin K Abb. 77 Pyramidatin J
Hier verhält es sich wie im bereits oben beschriebenen Fall. Pyramidatin K
(TGB_S12_P1) und Pyramidatin J (TGB_S12_P3) sind Diastereomere, Atropisomere
und vermutlich auch Konformationsisomere. Ihr einziger Unterschied zu den
Pyramidatinen der Fraktion 10 liegt im Substitutionsmuster, denn anstelle einer
zweiten Methylendioxogruppe sind zwei Methoxygruppen eingeführt. Die absolute
Konfiguration ist wiederum durch die 2-2’ Achse der Biphenyle festgesetzt und wurde
durch Messung des Circulardichroismus bestimmt. Daraus ergab sich für
Spezieller Teil
52
Pyramidatin K (TGB_S12_P1) die S-Konfiguration und Pyramidatin J (TGB_S12_P3)
die R-Konfiguration.
Abb. 78 CD-Spektrum Pyramidatin K Abb. 79 CD-Spektrum Pyramidatin J
Die absolute Konfiguration der Biphenyle wirkt sich entscheidend auf die chemische
Verschiebung im 1H- und 13C-Spektrum aus, wovon letztendlich die Position 8 im
Cyclooctanring betroffen ist. Bei der R-Konfiguration findet eine höhere Verschiebung
der ppm Werte statt, bei der S-Konfiguration eine niedrigere Verschiebung. Ganz
gleich ob nun der entsprechenden Verbindung die R oder S-Konfiguration zu
zuordnen ist, die Werte der Pyramidatine der Fraktion 10 liegen mit denen aus
Fraktion 12 um nur 0,1 ppm auseinander. Deutlich zu erkennen ist der Unterschied
der absoluten Konfiguration im unten gezeigten HSQC-Ausschnitt.
Abb. 80 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin K Abb. 81 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin J
Spezieller Teil
53
3.3.6 Diskussion und Schlussfolgerung
Neben dem ätherischen Öl, das sich ausschließlich aus Sesquiterpenen
zusammensetzt, und einem Sterolgemisch konnten aus Talauma gloriensis noch fünf
Reinsubstanzen isoliert werden, wovon vier in der Literatur noch nicht beschrieben
waren.
Die Reinsubstanzen gehören zur Klasse der Neolignane und werden als
Dibenzoylcyclooctadiene bezeichnet. Die Benennung erfolgte analog zu den aus
Magnolia pyramidata isolierten Pyramidatinen A-H und wurde für die neu gefundenen
Verbindungen mit Pyramidatin I-L fortgeführt.
Stereochemisch sind diese Verbindungen Diastereomere, Atropisomere und
Konformationsisomere. Jeweils zwei der Verbindungen Pyramidatin H und I sowie
Pyramidatin J und K bilden Diastereomerenpaare. Die Atome eines Diastereomeren-
paares sind auf dieselbe Weise verknüpft und unterscheiden sich nur durch ihre
räumliche Anordnung voneinander. Sie weisen abgesehen von der 2-2’ Verknüpfung
der Biphenyle an allen Stereozentren dieselbe Konfiguration auf. Die absolute
Konfiguration wird durch Messung des Circulardichroismus bestimmt. Je nachdem,
ob die R oder S Konfiguration entlang der 2-2’ Achse vorliegt, wirkt sich das
dementsprechend auf die chemische Verschiebung (in ppm) im 1H- und
insbesondere im 13C-Spektrum aus. Erkennbar ist dieser Unterschied an der Position
8 im Cyclooctanring. Liegt im Biphenylsystem die S-Konfiguration vor, tritt eine
niedrige Verschiebung bei rund 35 ppm ein. Herrscht die R-Konfiguration vor, ist mit
einer höheren Verschiebung im Bereich von 51 ppm zu rechnen. Dadurch wurde
festgestellt, dass Pyramidatin H und J die R-Konfiguration, Pyramidatin I, K und L die
S-Konfiguration einnehmen. Auch Pyramidatin L ist ein Atropisomer, aber sein
atropisomeres Gegenstück (Diastereomer) konnte nicht isoliert werden. Für die Art
der Stereoisomerie, wie sie bei Biphenylderivaten auftritt, trifft auch die Bezeichnung
Atropisomerie zu. Beide Ringe liegen in verschiedenen Ebenen und die Drehbarkeit
um die Einfachbindung ist stark eingeschränkt, infolgedessen eine Trennung erst
möglich gemacht wird. Atropisomere können somit bei Raumtemperatur isoliert
werden, da ihre Stabilität von der Höhe der Rotationsbarriere abhängt. (Hauptmann
u. Mann, 1996) Bei den Bedingungen der Aufarbeitung (40-45 ° C) ist nicht damit zu
rechnen, dass die Atropisomere ineinander übergeführt werden können. Ein
dynamischer Prozess hätte sich in den NMR-Spektren durch Linienverbreiterung
oder durch das Vorhandensein eines 2. Signalsatzes erkennbar machen müssen.
Spezieller Teil
54
3.4 Tilletia caries und Tilletia controversa
3.4.1 Extraktion
In beiden Fällen wurden vom gemahlenen Drogenmaterial auf analoge Weise mittels
Ultraschallextraktion ein Dichlormethan-, ein Methanolextrakt und ein alkalischer
Extrakt (mit 15%igen Ammoniak befeuchten und mit Chloroform versetzen)
hergestellt. Auf die Herstellung eines sauren Extraktes (mit 10%iger Salzsäure
ansäuern und Chloroform zugeben) wurde verzichtet, da mehrere Vorversuche im
Gegensatz zu den anderen drei Extrakten kaum Hinweise auf Verbindungen zeigten.
3.4.2 Tilletia caries
3.4.2.1 Aufarbeitung der Extrakte
Der Dichlormethanextrakt und der Methanolextrakt wurden durch Verwendung der
FCPC® aufgearbeitet. Als Fließmittel wurde n-Hexan-Ethylacetat-Methanol-Wasser
im Verhältnis 9:1:9:1 bzw. 7:3:5:5 eingesetzt. Leider konnte lediglich die Anwesenheit
von Triglyceriden und Fettsäuren nachgewiesen werden.
Die Auftrennung des alkalischen Exraktes erfolgte durch die präparative HPLC mit
einem Fließmittelgradienten aus Acetonitril/Wasser. Hierbei kam nur eine mehrfach
ungesättigte Fettsäure zum Vorschein, da die Ausbeuten der übrigen Fraktionen so
gering waren, dass keine Identifizierung der Substanzen möglich war.
Abb. 82 Isolierschema von Tilletia caries
Spezieller Teil
55
3.4.3 Tilletia controversa
3.4.3.1 Aufarbeitung der Extrakte
Die Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes und des alkalischen Extraktes erfolgte
mit der FCPC®. Die Fließmittel setzten sich in beiden Fällen aus Petrolether-
Diethylether-Ethanol-Wasser im Verhältnis 4:0,5:5:1 zusammen.
Der Dichlormethanextrakt wurde mit verschiedensten chromatographischen
Methoden (präparative DC, präparative und semipräparative HPLC) bearbeitet,
brachte aber wiederum nur Fettsäuren und Sterole als Ergebnisse hervor.
Der alkalische Extrakt wurde ebenfalls mittels päparativer DC und semipräparativer
HPLC bearbeitet. Er enthielt jedoch eine gelb gefärbte Verbindung mit auffälligem
UV-Spektrum. Letztendlich war es aber wegen der geringen Menge unmöglich, die
chemische Struktur dieser Verbindung durch NMR-Spektroskopie aufzuklären. Auch
von den restlichen isolierten Substanzen konnte aufgrund der geringen Menge die
Struktur nicht aufgeklärt werden.
Abb. 83 UV-Spektrum der gelb gefärbten Verbindung in T. controversa
Der Methanolextrakt wurde abgesehen von einem HPLC-Profil nicht untersucht, da
er keine Informationen hinsichtlich neuer Verbindungen enthielt.
Spezieller Teil
56
Abb. 84 Isolierschema von Tilletia controversa
Informationen hinsichtlich der verwendeten Methoden, Geräte und Fließmittel finden
sich in Kapitel 4.
3.4.4 Diskussion und Schlussfolgerung
Sowohl aus Tilletia caries als auch aus Tilletia controversa wurden ausschließlich
Fettsäuren und Triglyceride isoliert. Tilletia controversa beinhaltete jedoch eine
Substanz mit interessantem UV-Spektrum, deren Menge nicht ausreichte, um die
Struktur zu ermitteln. Es besteht allerdings die Möglichkeit, dass diese Substanz aus
dem noch anhaftenden Grasmaterial (Spelzen) stammen könnte. Die chemische
Zusammensetzung der isolierten Fettsäuren und Triglyceride wurde nicht weiter
untersucht, da darüber bereits eine Arbeit vorliegt (Beattie et al., 1993).
Die Vermutung, dass Tilletia caries und Tilletia controversa ebenfalls wie Claviceps
purpurea die Produktion von Alkaloiden bewirken, konnte somit nicht bestätigt
werden.
Experimenteller Teil
57
4. Experimenteller Teil
4.1 Material, Methoden und Geräte
4.1.1 Dünnschichtchromatographie (DC)
Stationäre Phase: DC-Alufolie 20 x 20 cm Kieselgel 60 F254; Fa. Merck
Mobile Phase: es wurden verschiedene Fließmittelgemische verwendet, n-Hexan-
Ethylacetat im Verhältnis 95:5, 75:5, 50:50 sowie Chloroform-Methanol-Wasser im
Verhältnis 80:20:2 erwiesen sich jedoch als die besten.
Detektion: erfolgte im Vis als auch im UV durch Fluoreszenzminderung bei 254 nm
und Eigenfluoreszenz bei 366 nm. Weiters wurde mit Vanillin-H2SO4-Reagens
besprüht and anschließend im Trockenschrank für wenige Minuten bei 100 ° C
erhitzt. Die weitere Auswertung wurde dann im Vis durchgeführt. Die Dünnschicht-
chromatogramme von Tilletia wurden zur Prüfung auf Alkaloide mit Dragendorff-
Reagens besprüht und abschließend im Vis ausgewertet.
4.1.2 Präparative Dünnschichtchromatographie
Stationäre Phase: PSC-Platten 20 x 20 cm Kieselgel 60 F254 + 366; 2 mm, Fa. Merck
Mobile Phase:
Tcon_D_B6: n-Hexan-Ethylacetat 60:40, Zusatz von 1 % Methanol
Tcon_A_A2: Chloroform-Methanol-Wasser 75:25:2, Zusatz von 1 % Ameisensäure
Die Proben wurden in Methanol gelöst, strichförmig auf die Platte aufgetragen und im
UV bei 366 nm detektiert. Die Banden wurden abgekratzt und mit Dichlormethan/
Methanol extrahiert.
4.1.3 Klassische Säulenchromatographie (SC)
Stationäre Phase: Kieselgel 60 (0,040-0,063 mm) Fa. Merck
Mobile Phase: verschiedene Fließmittelgradienten bestehend aus n-Hexan-
Ethylacetat-Methanol wurden eingesetzt.
Das Kieselgel wurde mit der entsprechenden Menge an Hexan aufgeschlemmt, auf
das Ultraschallbad gegeben und möglichst blasenfrei in die Säule gegossen. Den
jeweiligen Extrakten wurde Kieselgel (Korngröße: 0,063-0,200 mm) zugegeben, um
sie in trockener Form auf die Säule aufzubringen.
Experimenteller Teil
58
4.1.4 Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)
4.1.4.1 Analytische HPLC
Gerät: Agilent 1100 Series
Stationäre Phase: Agilent, Zorbax SB - C18; 3,5 µm; 2,1 x 150 mm
Mobile Phase: Acetonitril/Wasser
Probenvorbereitung: in Methanol lösen
Verwendeter Fließmittelgradient (Standardmethode):
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 10 90
25 90 10
30 100 0
45 100 0
46 10 90
Tab. 14 HPLC-Standardmethode (Gradient)
Fließgeschwindigkeit: 0,3 ml/min
Detektion: erfolgte durch einen Dioden-Array-Detektor (DAD). Mit diesem Detektor ist
es möglich, bei mehreren Wellenlängen gleichzeitig zu messen. Es wurden stets
Chromatogramme bei 205, 220, 254 und 280 nm aufgenommen.
4.1.4.2 Präparative HPLC
Gerät: Varian R PrepStar Model SD-1
Dynamax R Solvent Delivery System Model SD-1
Dynamax R Absorbance Detector Model UV-1
Stationäre Phase: Varian Dynamax 250 x 21,4 mm (L*ID)
S/N 3106 Microsorb 100-5 C18
Mobile Phase: Acetonitril/Wasser-Mischungen
Probenvorbereitung: in Methanol lösen (c = 40 mg/ml) und zur Vorreinigung über
eine RP-18-Säule eluieren
Fließgeschwindigkeit: 14 ml/min
Einspritzmenge: 100 - 500 µl
Detektion: bei einer Wellenlänge von 205, 210, 218, 220 oder 280 nm
Experimenteller Teil
59
4.1.4.3 Semipräparative HPLC
Gerät: Agilent 1100 Series
Stationäre Phase: LiChroCart 250-10
HPLC-Kartusche Lichrosorb RP-18 (7 µm); Fa. Merck
Mobile Phase: Acetonitril/Wasser in unterschiedlichen Mischungen
Fließgeschwindigkeit: 2,6 ml/min
Probenvorbereitung: entsprechende Probenmenge in Methanol in Lösung bringen
(c = 40 mg/ml) und mittels SPE über eine RP-18-Säule vorreinigen
Einspritzmenge: 10 - 80 µl
Detektion: mittels Dioden-Array-Detektor (DAD) bei Wellenlängen von 205, 220, 254
und 280 nm
4.1.5 Reversed Phase (RP) - Festphasenextraktion (SPE®)
Säule: ISOLUTE TM SPE COLUMNS
100 mg C18 (EC) 3 ml oder 1 g C18 (EC) 6 ml
Fa. IST (International Sorbent Technology)
Elutionsmittel: Methanol oder Methanol/Wasser-Gemische
4.1.6 Fast Centrifugal Partition Chromatography - FCPC®
Die Auftrennung der einzelnen Verbindungen erfolgt hierbei auf dem Prinzip der so
genannten Flüssig-flüssig-Verteilungschromatographie. Sie dient vor allem zur
Aufreinigung von wenigen mg bis zu 5 g Probe je Injektion.
Gerät: Kromaton 201
Fließmittel: in unterschiedlichen Zusammensetzungen wurden eingesetzt
Stationäre Phase Mobile Phase Verhältnis
Methanol Wasser n-Hexan Ethylacetat 9 : 1 : 9 : 1
Methanol Wasser n-Hexan Ethylacetat 5 : 5 : 7 : 3
Petrolether Diethylether Ethanol Wasser 4 : 0,5 : 5 : 1
Tab. 15 FCPC-Fließmittelsysteme
Probenvorbreitung: die Extrakte immer in 10 ml des verwendeten Fließmittels lösen
Fließgeschwindigkeit: 2 ml/min
Druck: 20 - 26 bar; 800 oder 1000 Umdrehungen/Minute
Experimenteller Teil
60
Detektion: UV/Vis Detektor bei einer Wellenlänge von 220 nm
4.1.7 LC-MS
Gerät: Thermo Finnigan Surveyor Liquid Chromatograph LCQ DECA XP
Finnigan LCQ DECA XP plus Massendetektor im ESI Modus
ThermoFinnigan: Autosampler Surveyor
ThermoQuest: MS-Pump Surveyor
ThermoQuest: PDA Detector Surveyor
Stationäre Phase: Agilent, Zorbax SB - C18; 3,5 µm; 2,1 x 150 mm
Mobile Phase: Acetonitril/Wasser mit Zusatz von 0,1 % Ameisensäure
Probenvorbereitung: in Methanol lösen
Fließmittelgradient: entspricht der analytischen HPLC
Fließgeschwindigkeit: 0,3 ml/min
Einspritzvolumen: 10 µl
4.1.8 GC-MS
Gerät: Agilent Technologies 7890A GC-System
Agilent Technologies 7683B Series Injector
Agilent Technologies 5975C VL MSD
Stationäre Phase: Agilent 19091S-433: 325° C: 30 m x 250 µm x 0,25 µm
HP-5MS 5 % Phenyl Methyl Siloxane: 208. 58019
Mobile Phase: Helium
Temperaturprogramm: zu Beginn 45 ° C für 2,25 min, dann mit 6 ° C/min auf 250 ° C
Injektionsvolumen: 1 µl
Injektortemperatur: 240 ° C
Druck: 0,8145 bar
Modus: Split
Split Ratio: 50:1
Probenvorbereitung: etwas Probe in 500 µl Hexan lösen
Experimenteller Teil
61
4.1.9 NMR-Spektroskopie
Gerät: Varian Unitylnova 600 MHz Spectrometer
Messfrequenz: 599 MHz
Verwendete Lösungsmittel: d1 - Chloroform
d5 - Pyridin
Interner Standard: Tetramethylsilan (TMS)
4.1.10 Circulardichroismus
Gerät: Jasco Spektropolarimeter J - 175
Methode: Standardanalyse Jasco
Wellenlänge: 300 - 350 nm
Verwendetes Lösungsmittel: Methanol
Probenvorbereitung: 1 - 1,5 g Probe in Methanol lösen und Verdünnungsschritte
durchführen
4.2 Drimys winteri
4.2.1 Pflanzenmaterial
Das entsprechende Pflanzenmaterial wurde von Dr. Wolfgang Schühly und Dr. Sara
Crockett im Jahr 2007 bei Ojo de Agua, einem Bergnebelwald, in Costa Rica
gesammelt und auch identifiziert. Die Herbarbelege befinden sich im INBio (Instituto
Nacional de Biodiversidad) in Santo Domingo, Costa Rica.
4.2.2 Extraktion
Aus 450 g gemahlener Rinde wurde durch Perkolation bei Raumtemperatur ein
Dichlormethanextrakt hergestellt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum
wurden 11,3 g Extrakt erhalten.
4.2.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes
Die Auftrennung des Extrakts in einzelne Grobfraktionen erfolgte durch Vakuum-
Liquid-Chromatographie (VLC). Der Extrakt wurde zum Trocknen mit 23 g Kieselgel
(Korngröße: 0,063-0,200 mm) versetzt und auf eine mit 149 g Kieselgel (Korngröße:
Experimenteller Teil
62
0,040-0,063 mm) gefüllte Säule (h = 12 cm, d = 7,5 cm) aufgebracht. Zur Eluierung
wurde ein Fließmittelgradient bestehend aus n-Hexan, Ethylacetat und Methanol
verwendet.
Menge (ml)
n-Hexan (%)
Ethylacetat (%)
Methanol (%)
Fraktionsgröße (ml)
300 100 0 0 250
300 98 2 0 250
300 96 4 0 25
300 94 6 0 25
300 90 10 0 25
300 87 13 0 25
300 81 19 0 25
300 71 29 0 25
300 50 50 0 25
300 41 57 2 25
300 33 63 4 25
300 25 69 6 25
300 9 81 10 25
300 0 80 20 200
300 0 60 40 300
Tab. 16 Fraktionierung des DCM-Extraktes von Drimys
Die einzelnen Grobfraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie untersucht
und jene mit ähnlichen Banden zu insgesamt 20 Fraktionen vereinigt.
Fraktion Vereinigte Fraktionen Ausbeute (g)
DWR_V1 1’, 2’, 1-5 0,631
DWR_V2 6-24 0,039
DWR_V3 25-28 0,357
DWR_V4 29-31 0,188
DWR_V5 32-35 0,117
DWR_V6 36-40 0,129
DWR_V7 41-44 0,383
DWR_V8 45-52 0,588
DWR_V9 53-59 1,649
DWR_V10 60-63 1,520
DWR_V11 64-69 0,931
Experimenteller Teil
63
DWR_V12 70-75 0,649
DWR_V13 76-78 0,150
DWR_V14 79-81 0,197
DWR_V15 82-84 0,184
DWR_V16 85-91 0,668
DWR_V17 92-97 1,276
DWR_V18 98-100 0,204
DWR_V19 101-111 0,645
DWR_V20 112-137 0,979
Tab. 17 Fraktionen des DCM-Extraktes von Drimys
Von allen vereinigten Grobfraktionen wurde vorerst zur Übersicht ein
Dünnschichtchromatogramm erstellt und jene Fraktionen, die als interessant
erschienen, wurden mittels HPLC eingehender betrachtet.
4.2.4 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen
Fraktion DWR_V1 und DWR_V2 (631 bzw. 39 mg):
In beiden Fällen bestanden diese Fraktionen aus einer klaren, etwas zähflüssigen
aber aromatisch riechenden Flüssigkeit. Deswegen wurde angenommen, dass es
sich dabei um ein Gemisch aus ätherischem Öl handelt. Eine GC-MS Analyse wurde
vorgenommen und die einzelnen Komponenten an Hand ihrer Massenspektren mit
denen von Datenbanken (Nistos, Wiley Aetherolea) verglichen. Dadurch war es
möglich die Verbindungen mit einer Wahrscheinlichkeit von über 90 % als
Bestandteile des ätherischen Öls zu ermitteln.
Fraktion DWR_V10 und DWR_V17 (1,5 bzw.1,3 g):
Diese zwei Fraktionen erschienen nach der VLC am HPLC-Chromatogramm bereits
als rein und wurden mit der NMR-Spektroskopie identifiziert.
Zur Aufarbeitung der Fraktionen DWR_V12, DWR_V18 und DWR_V19 kam
ausschließlich die präparative HPLC zum Einsatz. Die Proben wurden jeweils in
Methanol gelöst und mittels Festphasenextraktion über eine RP-18-Säule
vorgereinigt, um möglich enthaltene Schwebstoffe zu entfernen. Es wurden immer
Fließmittelgradienten bestehend aus Acetonitril/Wasser in unterschiedlicher
Zusammensetzung eingesetzt.
Experimenteller Teil
64
Fraktion DWR_V12 (649 mg):
Der Gradient enthielt folgende Prozente an Acetonitril und Wasser:
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 58 42
25 58 42
35 80 20
36 100 0
40 100 0
Tab. 18 präp. HPLC-Methode von DWR_V12
Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 210 nm. Die damit isolierten
Substanzen konnten mittels NMR-Spektroskopie identifiziert werden.
Fraktion DWR_V18 (204 mg):
Da diese Fraktion eine nicht eluierbare, wasserunlösliche Substanz beinhaltete,
wurde vor der Festphasenextraktion über eine RP-18-Säule 10 % Wasser
zugegeben, um diese auszufällen. Jedoch war es in weiterer Folge nicht möglich,
diese Substanz zu isolieren und auch zu identifizieren. Der Überstand wurde mit
einem Gradienten aus Acetonitril/Wasser in den angegebenen Verhältnissen
aufgetrennt:
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 53 47
25 53 47
35 80 20
40 100 0
50 100 0
Tab. 19 präp. HPLC-Methode von DWR_V18
Detektiert wurde bei einer Wellenlänge von 205 nm. Die Identifizierung der isolierten
Substanzen wurde mittels NMR durchgeführt.
Fraktion DWR_V19 (650 mg):
Dieses Substanzgemisch wurde mit folgendem Fließmittelgradienten aufgearbeitet:
Experimenteller Teil
65
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 58 42
25 80 20
30 100 0
40 100 0
Tab. 20 präp. HPLC-Methode von DWR_V19
Die Wellenlänge, bei der detektiert wurde, lag bei 220 nm. Von den isolierten
Verbindungen wurden zwei Fraktionen nochmals aufgereinigt, da sie
Verunreinigungen enthielten. Betroffen war die Fraktion DWR_V19_P1, die mittels
semipräparativer HPLC weiter aufgereinigt wurde, wobei isokratisch vorgegangen
und Acetotnitril/Wasser im Verhältnis 50:50 für 15 Minuten eingesetzt wurde.
Auch die Fraktion DWR_V19_P6 wurde nochmals über semipräparative HPLC
aufgetrennt. Allerdings wurde ein Acetonitril/Wasser-Gradient mit zu Beginn 58 %
Acetonitril für 15 Minuten und 100 % Acetonitril ab der 20. Minute verwendet. Auch in
diesen Fällen erfolgte die Strukturaufklärung mit der NMR-Spektroskopie.
Die restlichen Grobfraktionen wurden nicht weiter bearbeitet, da ihre Komponenten
zum Teil bereits aus den aufgearbeiteten Fraktionen isoliert und auch identifiziert
werden konnten bzw. sie laut HPLC-Profil keinen Hinweis auf neuartige
Verbindungen lieferten.
4.3 Talauma gloriensis
4.3.1 Pflanzenmaterial
Das Pflanzenmaterial wurde gemeinsam von Dr. Wolfgang Schühly, Dr. Sara
Crockett und Mag. Eva Schembera im Frühjahr 2007 im Esquinas Regenwald von
Costa Rica gesammelt, wobei die Identifizierung durch Mag. Eva Schembera
erfolgte. Die Herbarbelege sind auch in Santo Domingo, Costa Rica, im INBio
(Instituto Nacional de Biodiversidad) hinterlegt.
4.3.2 Extraktion
Der aus 150 g pulverisiertem Drogenmaterial gewonnene Dichlormethanextrakt
wurde durch Perkolation bei Raumtemperatur hergestellt. Nach Entfernen des
Lösungsmittels am Rotavapor wurde eine Extraktmenge von 3,7 g erhalten.
Experimenteller Teil
66
4.3.3 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes
Der Extrakt wurde mit 8 g Kieselgel (Korngröße: 0,060-0,200 mm) vermengt und
durch klassische Säulenchromatographie SC (h = 10 cm, d = 4,5 cm) über 61 g
Kieselgel (Korngröße: 0,043-0,060 mm) durch einen Fließmittelgradienten bestehend
aus n-Hexan, Ethylacetat und Methanol aufgetrennt.
Menge (ml)
n-Hexan (%)
Ethylacetat (%)
Methanol (%)
Fraktionsgröße (ml)
150 100 0 0 100
150 98 2 0 100
150 96 4 0 15
150 94 6 0 15
150 90 10 0 15
150 83 17 0 15
150 70 30 0 15
150 60 40 0 15
150 50 50 0 15
150 38 60 2 15
150 26 70 4 15
150 12 80 8 15
150 0 84 16 15
150 0 76 24 15
150 0 68 32 15
150 0 60 40 150
150 0 20 80 150
Tab. 21 Fraktionierung des DCM-Extraktes von Talauma
Die daraus resultierenden Grobfraktionen wurden nach dünnschicht-
chromatographischer Untersuchung an Hand der Ähnlichkeit ihrer Banden zu
insgesamt 16 Fraktionen vereinigt.
Fraktion Vereinigte Fraktion Ausbeute (g)
TGB_S1 1’, 2’, 1-11 0,129
TGB_S2 12-22 0,018
TGB_S3 23-26 0,337
TGB_S4 27-30 0,067
TGB_S5 31-38 0,170
Experimenteller Teil
67
TGB_S6 39-42 0,223
TGB_S7 43-45 0,190
TGB_S8 46-49 0,274
TGB_S9 50-53 0,190
TGB_S10 54-56 0,198
TGB_S11 57-61 0,147
TGB_S12 62-66 0,385
TGB_S13 67-70 0,105
TGB_S14 71-87 0,386
TGB_S15 88-95 0,453
TGB_S16 96-98 0,096
Tab. 22 Fraktionen des DCM-Extraktes von Talauma
Vorab wurde ein Übersichts-DC der vereinigten Fraktionen erstellt, worauf die viel-
versprechendsten Fraktionen mittels analytischer HPLC und NMR ausführlicher
untersucht wurden.
4.3.4 Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen
TGB_S1 und TGB_S2 (129 bzw. 18 mg):
Bei diesen zwei Fraktionen handelte es sich um eine farblose und intensiv riechende
Flüssigkeit. Diese wurde mit GC-MS Analyse untersucht, wobei die Identifizierung
der Komponenten durch Vergleich ihrer Massenspektren mit Hilfe von Datenbanken
(Nistos und Aetherolea) stattfand.
Die Aufarbeitung der Fraktionen TGB_S7, TGB_S10 und TGB_S12 erfolgte hierbei
mittels präparativer HPLC. Zuvor wurden die Proben in einem Gemisch aus
Methanol/Wasser im Verhältnis 9:1 gelöst (c = 40 mg/ml) und im Anschluss daran
eine Festphasenextraktion (SPE) durchgeführt, um etwaigen Verunreinigungen der
Säule vorzubeugen.
Fraktion TGB_S7 (190 mg):
Ein Fließmittelgradient aus Acetonitril und Wasser wurde zur Auftrennung der
einzelnen Verbindungen verwendet:
Experimenteller Teil
68
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 68 32
20 68 32
30 80 20
40 100 0
50 100 0
Tab. 23 präp. HPLC-Methode von TGB_S7
Detektiert wurde bei einer Wellenlänge von 220 nm. Wegen der geringen Ausbeuten
konnte die chemische Struktur der isolierten Verbindungen nicht ermittelt werden.
Fraktion TGB_S10 (192 mg):
Zur Auftrennung der Komponenten wurde ein Gradient aus Acetonitril und Wasser in
folgender Zusammensetzung verwendet:
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 75 25
15 75 25
16 100 0
30 100 0
Tab. 24 präp. HPLC-Methode von TGB_S10
Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 205 nm und die dadurch erhaltenen
Fraktionen wurden durch NMR-Spektroskopie identifiziert.
Fraktion TGB_S12 (385 mg):
Wiederum wurde ein Fließmittelgradient aus Acetonitril und Wasser eingesetzt. Die
Zusammensetzung war folgendermaßen:
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 75 25
15 75 25
16 100 0
20 100 0
Tab. 25 präp. HPLC-Methode von TGB_S12
Detektiert wurde hier bei 280 nm. Alle isolierten Substanzen wurden mittels NMR-
Spektroskopie analysiert.
Experimenteller Teil
69
Bei den übrigen Grobfraktionen wurde auf Grund des erstellten HPLC-Profils nicht
detaillierter auf ihr Inhaltsstoffspektrum eingegangen, da kein Grund zur Annahme
bestand, dass noch unbekannte, nicht identifizierte Verbindungen in ausreichender
Menge enthalten sind.
4.4 Tilletia caries und Tilletia controversa
4.4.1 Pflanzenmaterial
Der gewöhnliche Steinbrand (Tilletia caries) stammt von einer künstlichen Infektion
auf Winterweizen und wurde im Sommer 2006 an der Versuchstation in Grabenegg
in NÖ gesammelt. Der Zwergsteinbrand (Tilletia controversa) stammt ebenfalls von
künstlich infiziertem Weizen von der Versuchsstation Lambach/Stadl-Paura in ÖÖ.
Die Auslese wurde von Mitarbeitern von Dr. Herbert Huss, Bundesanstalt für
alpenländische Landwirtschaft (Gumpenstein), durchgeführt.
4.4.2 Extraktion
Zur Ermittlung eines geeigneten Extraktionsmittels wurde vorerst 0,5 g Droge mit 10
ml des jeweiligen Lösungsmittels versetzt und am Ultraschall extrahiert, um
Referenzlösungen zu erhalten. Als Lösungsmittel wurden Dichlormethan, Methanol,
Chloroform (zuvor mit 15%igen Ammoniak befeuchten - alkalischer Extrakt) und
abermals Chloroform (vorher aber mit 10%iger Salzsäure anfeuchten - sauerer
Extrakt) verwendet. Mit den Referenzlösungen wurden Dünnschichtchromatogramme
in unterschiedlichen Fließmittelgemischen angefertigt. Die Direktauswertung wurde
im UV bei 366 nm durchgeführt. Zur Prüfung auf Alkaloide wurde noch mit dem
Dragendorff-Reagens besprüht und anschließend im Vis ausgewertet. Es stellte sich
heraus, dass anhand der DC-Banden der Dichlormethan-, der Methanolextrakt und
der alkalische Extrakt die bestmöglichen Ausbeuten erzielten.
140 g gemahlenes Drogenmaterial von Tilletia caries und 190 g von Tilletia
controversa wurden mit je 300 bzw. 350 ml des entsprechenden Lösungsmittels
versetzt und für 20 Minuten mittels Ultraschall extrahiert. Der Drogenrückstand wurde
dann getrocknet und zur weiteren Extraktion herangezogen. Von beiden wurden je
ein Dichlormethan-, ein Methanol- und ein alkalischer Extrakt (in dieser Reihenfolge)
auf analoge Weise hergestellt. Zur Entfernung von Schwebstoffen wurden sie
Experimenteller Teil
70
zusätzlich über Celite 545 filtriert und das jeweilige Lösungsmittel dann unter
Vakuum abrotiert.
4.4.3 Tilletia caries
4.4.3.1 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes
Für die Aufarbeitung von 4,5 g Extrakt kam die FCPC® zum Einsatz. Als
Fließmittelgemisch wurde n-Hexan-Ethylacetat-Methanol-Wasser im Verhältnis
9:1:9:1 eingesetzt, wobei n-Hexan-Ethylacetat die mobile Phase und Methanol-
Wasser die stationäre Phase bildete. Fraktionen zu je 4 ml wurden gesammelt, im
Anschluss daran dünnschichtchromatographisch untersucht und solche Fraktionen
mit ähnlichen oder identischen Banden wurden vereinigt.
Fraktion Vereinigte Fraktion Ausbeute (mg)
Tcar_D_A1 19-21 361,5
Tcar_D_A2 22-27 58,6
Tcar_D_A3 28-33 40,9
Tcar_D_A4 34-42 68,2
Tcar_D_A5 43-51 14,2
Tcar_D_B1 2-5 38,5
Tcar_D_B2 6-11 40,7
Tcar_D_B3 12-21 17,5
Tab. 26 Fraktionen des DCM-Extraktes von Tilletia caries
Von allen vereinigten Fraktionen wurde ein HPLC-Chromatogramm angefertigt und
die Fraktionen Tcar_A2 und A4 sowie Tcar_B1 und B2 wurden durch NMR-
Spektroskopie untersucht. Als Ergebnisse erhielt man nur Fettsäuren und Glyceride,
weswegen dieser Extrakt nicht weiter aufgearbeitet wurde.
4.4.3.2 Aufarbeitung des Methanolextraktes
Die Ausbeute des Extraktes betrug nur 1,1 g, wodurch die Aufarbeitung mittels
FCPC® nahe lag. Der Extrakt enthielt eine Komponente, die im angegebenen
Fließmittelgemisch jedoch unlöslich war. Durch Zugabe von Diethylether wurde sie
ausgefällt und der restliche Extrakt zur Auftrennung verwendet. Es war aber nicht
möglich, diese Substanz mit Hilfe der NMR-Spektroskopie aufzuklären. Das
Experimenteller Teil
71
Fließmittelgemisch bestand wie bereits zuvor aus n-Hexan-Ethylacetat-Methanol-
Wasser im Verhältnis 7:3:5:5. Abermals wurden Fraktionen zu 4 ml aufgefangen, mit
Dünnschichtchromatographie untersucht und vereinigt.
Fraktion Vereinigte Fraktion Ausbeute (mg)
Tcar_M_A1 19-23 149,8
Tcar_M_A2 24-45 16,3
Tcar_M_B1 3-6 180,3
Tcar_M_B2 7-17 10,1
Tab. 27 Fraktionen des MeOH-Extraktes von Tilleta caries
Die Fraktionen wurden mittels HPLC überprüft, enthielten laut UV-Spektrum nur
Fettsäuren und wurden deswegen nicht weiter bearbeitet.
4.4.3.3 Aufarbeitung des alkalischen Extraktes
Zur Auftrennung der einzelnen Komponenten wurde die präparative HPLC
verwendet. Die Probe (275 mg) wurde in 2 ml Methanol gelöst und über eine RP-18-
Säule (SPE) vorgereinigt. Als Fließmittelgradient wurde Acetonitril/Wasser in
folgenden Konzentrationen verwendet:
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 40 60
15 40 60
35 100 0
40 100 0
Tab. 28 präp. HPLC-Methode des alkalischen Extraktes von Tilletia caries
Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 205 nm. Da die Mengen der
isolierten Verbindungen zu gering waren, konnte nur Tcar_A8 mittels NMR als
mehrfach ungesättigte Fettsäure identifiziert werden.
4.4.4 Tilletia controversa
4.4.4.1 Aufarbeitung des Dichlormethanextraktes
Die insgesamt 2,1 g Extrakt wurden mittels FCPC® aufgearbeitet. Ein Fließmittel
bestehend aus 4 Teilen Petrolether, 0,5 Teilen Diethylether, 5 Teilen Ethanol und 1
Experimenteller Teil
72
Teil Wasser wurde zusammengemischt. Die stationäre Phase nahm dabei das
Petrolether-Diethylether-Gemisch, die mobile Phase die Ethanol-Wasser
Komponente ein. Fraktionen zu je 4 ml wurden erfasst, per DC hinsichtlich der
Ähnlichkeit ihrer Banden überprüft und dann vereint.
Fraktion Vereinigte Fraktion Ausbeute (mg)
Tcon_D_A1 21-25 39,0
Tcon_D_A2 26,27 11,4
Tcon_D_A3 28-38 35,7
Tcon_D_A4 39-41 3,9
Tcon_D_A5 42-54 13,1
Tcon_D_B1 2-4 259,2
Tcon_D_B2 5 39,4
Tcon_D_B3 6-8 80,0
Tcon_D_B4 9-11 33,1
Tcon_D_B5 12-13 14,7
Tcon_D_B6 14-19 95,3
Tcon_D_B7 20,21 70,2
Tcon_D_B8 22-28 155,5
Tcon_D_B9 29-33 51,7
Tab. 29 Fraktionen des DCM-Extraktes von Tilletia controversa
Ein HPLC-Profil aller vereinigten Fraktionen wurde erstellt und anschließend wurden
die interessantesten weiter bearbeitet.
Fraktion Tcon_D_B6 (95 mg):
Die Auftrennung dieser Fraktion wurde mit präparativer Dünnschichtchromatographie
vorgenommen. Die Probe wurden in 1,2 ml Methanol gelöst und als Fließmittel wurde
n-Hexan-Ethylacetat (60:40) mit Zusatz von 1 % Methanol eingesetzt. Die drei bei
366 nm fluoreszierenden Banden wurden abgekratzt und mit einem Dichlormethan-
Methanol Gemisch eluiert. Mit Hilfe vom NMR fand man heraus, dass es sich bei
jeder Fraktion um ein Gemisch aus Fettsäuren und Sterolen handelte, deren genaue
chemische Zusammensetzung jedoch nicht ermittelt wurde.
Experimenteller Teil
73
Fraktion Tcon_D_B7 (70 mg):
Zur Isolierung der einzelnen Substanzen dieser Fraktion wurde die präparative HPLC
eingesetzt. Die Probe wurde in 1,2 ml Methanol gelöst und über eine RP-18-Säule
vorgereinigt. Ein Fließmittel bestehend aus Acetonitril und Wasser ermöglichte die
Auftrennung in ihre Komponenten.
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 75 25
15 75 25
16 100 0
20 100 0
Tab. 30 präp. HPLC-Methode von Tcon_D_B7
Es wurde bei 218 nm detektiert und die erhaltenen Substanzen wurden per NMR
analysiert, wobei Tcon_D_B7-3 und Tcon_D_B7-4 ebenfalls als Fettsäuren
identifiziert wurden.
4.4.4.2 Aufarbeitung des alkalischen Extraktes
Zur Isolierung der Inhaltsstoffe in 1,4 g Extrakt wurde erneut die FCPC verwendet.
Als Fließmittel fungierte dabei Petrolether-Diethylether-Ethanol-Wasser im Verhältnis
4:0,5:5:1. Fraktionen zu 4 ml wurden aufgefangen, mit DC untersucht und
anschließend wurden die Fraktionen, die einander ähnlich oder sogar identisch
waren, vereinigt.
Fraktion Vereinigte Fraktion Ausbeute (mg)
Tcon_A_A1 35,36 83,1
Tcon_A_A2 37-40 125,2
Tcon_A_A3 41-44 18,4
Tcon_A_A4 45-57 20,2
Tcon_A_B1 8 739,9
Tcon_A_B2 9 16,5
Tcon_A_B3 10-14 51,9
Tcon_A_B4 15-17 16,5
Tcon_A_B5 18-20 14,5
Tcon_A_B6 21,22 24,3
Tcon_A_B7 23-28 55,1
Experimenteller Teil
74
Tcon_A_B8 29-41 60,3
Tcon_A_B9 46 0,6
Tab. 31 Fraktionen des alkalischen Extraktes von Tilletia controversa
Von den vereinigten Fraktionen wurde ein HPLC-Chromatogramm gemacht und die
interessantesten unter ihnen wurden weiter bearbeitet.
Fraktion Tcon_A_A2 (125 mg):
Ein Teil (62,5 mg) dieser Fraktion wurde mittels präparativer Dünnschicht-
chromatographie aufgetrennt. Das Fließmittel bestand aus Chloroform-Methanol-
Wasser (75:25:2), wobei 1 % Ameisensäure zugegeben wurde. Die Extraktion
erfolgte mit einer Mischung aus Methanol und Dichlormethan. Mit der daraus
gewonnenen Fraktion Tcon_A_A2-1 wurde eine semipräparative HPLC durchgeführt.
Diese führte zu keinen Ergebnissen, da die Mengen für ein NMR nicht ausreichend
waren.
Auf Grund dessen wurde der Rest der Fraktion Tcon_A_A2 (62,7 mg) auch auf der
semipräparativen HPLC aufgearbeitet. Der verwendete Gradient setzte sich aus
Acetonitril/Wasser in den unten angegebenen Konzentrationen zusammen:
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 68 32
20 68 32
21 100 0
25 100 0
Tab. 32 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_A2 Detektiert wurde mit dem Dioden-Array-Detektor. Von den isolierten Substanzen
konnte wegen der zu geringen Mengen keine identifiziert werden.
Fraktion Tcon_A_A3 und Tcon_A_A4 (39 mg):
Die beiden Fraktionen waren laut HPLC identisch und wurden somit vereinigt. Zur
Vorreinigung wurde die in 1 ml Methanol gelöste Probe über eine RP-18-Säule (SPE)
eluiert. Danach wurde eine semipräparative HPLC mit Acetonitril/Wasser als
Fließmittel durchgeführt.
Experimenteller Teil
75
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 55 45
15 55 45
20 80 20
25 80 20
26 100 0
30 100 0
Tab. 33 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_A3 u. A4
Für die Detektion wurde ein Dioden-Array-Detektor verwendet. Auch in diesem Fall
waren die Mengen, die für ein NMR-Spektrum benötigt werden, zu gering.
Fraktion Tcon_A_B8 (60 mg):
Diese Fraktion wurde in 1,5 ml Methanol gelöst und mit einer Festphasenextraktion
über eine RP-18-Säule vorgereinigt. Im Anschluss daran wurde sie mit
semipräparativer HPLC durch einen Acetonitril/Wasser Gradienten aufgetrennt.
Zeit (min) Acetonitril (%) Wasser (%)
0 68 32
15 68 32
18 80 20
23 80 20
24 100 0
30 100 0
Tab. 34 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_B8
Die Detektion wurde mit einem Dioden-Array-Detektor durchgeführt. Die damit
gewonnenen Substanzen waren in zu geringen Mengen vorhanden als dass sie
näher untersucht werden konnten.
Der Methanolextrakt (303 mg) wurde nach Erstellung eines HPLC-Profils nicht auf
seine Inhaltsstoffe untersucht, da es keine Hinweise auf neue Verbindungen gab.
Zusammenfassung
76
5. Zusammenfassung
Im Zuge dieser Diplomarbeit wurden die Brandbutten von Tilletia caries und Tilletia
controversa, sowie die Rinde von Drimys winteri und die Blätter von Talauma
gloriensis phytochemisch untersucht.
Der erste Teil der Arbeit beinhaltete die phytochemische Untersuchung von Tilletia
caries und Tilletia controversa, zwei Arten der Gattung Tilletia. Sie zählen zu den
Brandpilzen, die sich über Brandsporen durch Keimlingsinfektion vermehren und
vorzugsweise krautige Pflanzen und Gräser befallen. In unseren Regionen ist davon
vermehrt der Weizen betroffen, wodurch es vielfach zu einem hohen wirtschaftlichen
Schaden sowie zu Ertragseinbußen kommt. Da der Pilz Claviceps purpurea im
Roggen die Entwicklung des Mutterkorns, Secale cornutum, und damit einhergehend
die Produktion von Alkaloiden hervorruft, lag es nahe Tilletia caries und Tilletia
controversa auf das Vorhandensein von Alkaloiden zu untersuchen.
Zur Untersuchung wurden mittels Ultraschallextraktion je ein Dichlormethan-, ein
Methanolextrakt und ein alkalischer Extrakt in derselben Weise hergestellt. Die
Aufarbeitung der einzelnen Extrakte erfolgte durch chromatographische Methoden
wie der FCPC® und der präparativen HPLC. Die daraus erhaltenen Fraktionen
wurden durch Verwendung derselben Verfahren (präparative DC, präparative und
semipräparative HPLC) weiter bearbeitet. Da mit Ausnahme von Fettsäuren und
Triglyceriden keine weiteren Verbindungen isoliert und auch identifiziert wurden,
konnte die Vermutung, dass möglicherweise Alkaloide enthalten sind, demnach nicht
bestätigt werden. Die Identifizierung der einzelnen Fettsäuren und Triglyceride
mittels HPLC und GC wurde nicht vorgenommen, da dies bereits vor Jahren erfolgte.
(Beattie et al., 1993)
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rinde von Drimys winteri, die in die Familie der
Winteraceae einzuordnen ist, auf ihre Inhaltsstoffe untersucht. Die bedeutendsten
Charakteristika der Familie sind der pfeffrige Geschmack der Rinden und Blätter, das
gefäßlose Holz sowie die primitiv ausgebildeten Narben, weshalb sie möglicherweise
auch die ursprünglichsten aller Blütenpflanzen darstellen.
Für die Untersuchung der Rinde wurde durch Perkolation ein Dichlormethanextrakt
hergestellt, der über Vakuum-Liquid-Chromatographie (VLC) mit Kieselgel als
Zusammenfassung
77
stationärer Phase und n-Hexan-Ethylacetat-Methanolmischungen als mobiler Phase
aufgetrennt wurde. Die interessantesten Fraktionen wurden über Festphasen-
extraktion vorgereinigt, mit präparativer HPLC über eine RP-18-Säule mit
Acetonitril/Wasser Gradienten aufgearbeitet und gegebenenfalls noch über eine
semipräparative HPLC gereinigt. Die Strukturaufklärung der Reinsubstanzen fand
durch die NMR-Spektroskopie (1H, 13C, HMBC, HSQC, COSY) und LC-MS Analysen
statt.
Aus Drimys wurden die verschiedensten Substanzklassen isoliert, worunter
ätherisches Öl, Sesquiterpene vom Driman-Typ, Norsesquiterpene sowie ein
einfaches Phenylpropan und Neolignane zu finden waren. Im ätherischen Öl sind
Sesquiterpene wie das Germacren D, β-Farnesen, Calamenen und β-Elemen
vorherrschend. Nahezu alle isolierten Verbindungen enthielten jedoch die typische
Struktur der Sesquiterpene mit Drimangerüst. Dazu gehören das Polygodial,
Warburganal, 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial und 1-β-(p-Cumaroyloxy)-
polygodial.
Erstmals aus Drimys wurde das Norsesquiterpen Polygonal isoliert, dessen
Vorkommen bislang nur aus Polygonum hydropiper bekannt war. Neben dem Lignan
Sesamin wurde auch die Anwesenheit von einem Phenylpropan und einem
Neolignan nachgewiesen. Eine dieser Verbindungen ist das Allylsyringol, die andere
ein Dibenzylbutyrolacton namens Haplomyrfolin, das dasselbe Grundgerüst wie das
aus Drimys bekannte Cubebin besitzt, und in Haplophyllum myrtifolium (Rutaceae)
enthalten ist.
Interessanterweise wurden in kleinen Mengen Lignane und Neolignane gefunden,
die einen Hinweis liefern, dass auch der Phenylpropanoid-Stoffwechsel in Drimys
eine Rolle spielt. Außerdem konnte durch die Isolierung der Sesquiterpene vom
Drimantyp, die besonders charakteristisch für die Familie der Canellaceae und auch
der Polygonaceae sind, neuerlich das enge Verwandtschaftsverhältnis zwischen den
Winteraceae und Canellaceae aufgezeigt werden.
Im dritten Teil der Arbeit wurden die Blätter von Talauma gloriensis, einer
Tieflandregenwaldart, die der Familie der Magnoliaceae angehört, phytochemisch
untersucht. Zur Analyse der Blätter wurde durch Perkolation ein
Dichlormethanextrakt hergestellt, der durch klassische Säulenchromatographie (SC)
über Kieselgel und einem n-Hexan-Ethylacetat-Methanol-Gradienten aufgearbeitet
Zusammenfassung
78
wurde. Die vielversprechendsten Fraktionen wurden über Festphasenextraktion
(SPE) vorgereinigt und mit präparativer HPLC über eine RP-18-Säule mit
Acetonitril/Wasser Gradienten aufgetrennt. Die vollständige Strukturaufklärung der
Reinsubstanzen erfolgte durch die NMR-Spektroskopie (1H, 13C, HMBC, HSQC,
COSY) und LC-MS Analysen sowie die Bestimmung der absoluten Konfiguration
durch Messen des Circulardichroismus.
Abgesehen von ätherischem Öl, das Sesquiterpene enthielt, und einem Gemisch aus
mehreren Sterolen konnten fünf Reinsubstanzen isoliert werden. Bei diesen
Verbindungen handelt es sich um Neolignane, die über die Ringe miteinander
verknüpft (Biphenyle) sind, einen 8-Ring bilden und als Dibenzoylcyclooctadiene
bezeichnet werden. Die Benennung mit Trivialnamen erfolgte in Anlehnung an die
aus Magnolia pyramidata isolierten Pyramidatine A-H und wurde für die vier
unbekannten Verbindungen mit Pyramidatin I-L fortgesetzt.
Stereochemisch betrachtet sind diese Verbindungen Diastereomere, Atropisomere
und sehr wahrscheinlich auch Konformationsisomere. Die Feststellung der absoluten
Konfiguration, die in diesem Fall durch die 2-2’ Verbindungsachse des
Biphenylsystems festgelegt ist, erfolgte durch Messung des Circulardichroismus. Aus
dem Verlauf der Kurve kann man auf die absolute Konfiguration der Verbindung
schließen. Die Auswirkungen der Konfiguration entlang der 2-2’ Achse ist in der
Änderung der chemischen Verschiebung im 1H- und besonders im 13C-Spektrum
erkennbar. Denn je nach R- oder S-Konfiguration kommt es zur höheren oder
niedrigeren Verschiebung der ppm-Werte an der Position 8 im Cyclooctanring.
Dadurch wurde festgestellt, dass Pyramidatin H und J die R-Konfiguration und
Pyramidatin I, K und L die S-Konfiguration einnehmen. Die jeweils erhaltenen Sätze
an NMR-Messwerten stimmen mit dem Kurvenverlauf des Circulardichroismus
überein, womit die absolute Konfiguration der Verbindungen bestätigt werden konnte.
Insgesamt ist die Stoffklasse der vorkommenden Dibenzoylcyclooctadiene eher
selten anzutreffen und ausschließlich aus den Gattungen Schizandra und Magnolia
bekannt.
Literaturverzeichnis
79
6. Literaturverzeichnis
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Abbildungsverzeichnis
83
7. Abbildungsverzeichnis
Abb 1. Drimys winteri ..................................................................................................2
Abb. 2 Verbreitungskarte der Winteraceae ..................................................................
(Quelle:http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/orders/canellalesweb.ht
m#Winteraceae)...................................................................................................3
Abb. 3 Drimys winteri a.) Habitus b.) Frucht (Quelle: Pennington et al., 2004) ...........4
Abb. 4 Drimangrundgerüst ..........................................................................................4
Abb. 5 Warburganal ....................................................................................................5
Abb. 6 Polygodial ........................................................................................................5
Abb. 7 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial ...........................................................5
Abb. 8 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial........................................................................5
Abb. 9 Talauma gloriensis a.) Blätter, b.) Knospe, c u. d.) Frucht ................................
(Quelle:http://www.sura.ots.ac.cr/lokal/florula3/en/fr_galeria.php u. Foto Schühly,
2008)....................................................................................................................7
Abb. 10 Verbreitungskarte der Magnoliaceae ..............................................................
(Quelle:http://www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/orders/magnolialesweb.
htm#Magnoliaceae) .............................................................................................8
Abb. 11 Talauma gloriensis Habitus und Frucht (Quelle: Hammel et al., 2007)..........9
Abb. 12 Lignangrundgerüst .........................................................................................9
Abb. 13 3,3'-Neolignan................................................................................................9
Abb. 14 8,3'-Neolignan................................................................................................9
Abb. 15 Guaianolid....................................................................................................10
Abb. 16 Tilletia caries und Tilletia controversa (Quelle: Schöber-Butin et al., 1999 u.
Foto Huss, 2005) ...............................................................................................11
Abb. 17 Pathogenese der Brandpilze............................................................................
(Quelle:www.dapp.boku.at/fileadmin/_/H950-Pflanzen/H953-bilder/pdf-lehre/
953303-Teil02.pdf).............................................................................................13
Abb. 18 Tilletia controversa Schleimhülle (Quelle: Foto Huss, 2007)........................13
Abb. 19 Isolierschema von Drimys ............................................................................16
Abb. 20 GC-Chromatogramm von DWR_V1.............................................................17
Abb. 21 GC-Chromatogramm von DWR_V2.............................................................19
Abb. 22 Polygodial (DWR_V10) ................................................................................20
Abb. 23 UV-Spektrum von Polygodial .......................................................................20
Abb. 24 1H-NMR-Spektrum von Polygodial...............................................................21
Abb. 25 Allylsyringol (DWR_V12_P1) .......................................................................22
Abbildungsverzeichnis
84
Abb. 26 UV-Spektrum von Allylsyringol.....................................................................22
Abb. 27 1H-NMR-Spektrum von Allylsyringol ............................................................22
Abb. 28 Polygonal (DWR_V12_P2) ..........................................................................23
Abb. 29 UV-Spektrum von Polygonal........................................................................23
Abb. 30 1H-NMR-Spektrum von Polygonal................................................................24
Abb. 31 Warburganal (DWR_V12_P3)......................................................................25
Abb. 32 UV-Spektrum von Warburganal ...................................................................25
Abb. 33 1H-NMR-Spektrum von Warburganal...........................................................25
Abb. 34 Sesamin (DWR_V12_P4) ............................................................................26
Abb. 35 UV-Spektrum von Sesamin..........................................................................26
Abb. 36 1H-NMR-Spektrum von Sesamin .................................................................27
Abb. 37 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial (DWR_V17)...................................28
Abb. 38 UV-Spektrum von 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial ..........................28
Abb. 39 1H-NMR-Spektrum von 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial..................28
Abb. 40 Haplomyrfolin (DWR_V18_P3) ....................................................................30
Abb. 41 UV-Spektrum von Haplomyrfolin..................................................................30
Abb. 42 1H-NMR-Spektrum von Haplomyrfolin .........................................................30
Abb. 43 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial (DWR_V19_P6) .........................................31
Abb. 44 UV-Spektrum von 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial.......................................31
Abb. 45 1H-NMR-Spektrum von 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial ..............................32
Abb. 46 Isolierschema von Talauma .........................................................................35
Abb. 47 GC-Chromatogramm von TGB_S1..............................................................35
Abb. 48 GC-Chromatogramm von TGB_S2..............................................................36
Abb. 49 Pyramidatin I (TGB_S10_P2) ......................................................................38
Abb. 50 UV-Spektrum von Pyramidatin I...................................................................38
Abb. 51 Massenspektrum von Pyramidatin I .............................................................38
Abb. 52 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin I ..........................................................39
Abb. 53 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin I .........................................................39
Abb. 54 Pyramidatin H (TGB_S10_P3).....................................................................40
Abb. 55 UV-Spektrum von Pyramidatin H .................................................................40
Abb. 56 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin H.........................................................41
Abb. 57 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin H .......................................................41
Abb. 58 Pyramidatin K (TGB_S12_P1) .....................................................................43
Abb. 59 UV-Spektrum von Pyramidatin K .................................................................43
Abb. 60 Massenspektrum von Pyramidatin K............................................................43
Abb. 61 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin K .........................................................44
Abb. 62 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin K........................................................44
Abbildungsverzeichnis
85
Abb. 63 Pyramidatin L (TGB_S12_P2) .....................................................................45
Abb. 64 UV-Spektrum von Pyramidatin L..................................................................45
Abb. 65 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin L .........................................................46
Abb. 66 Pyramidatin J (TGB_S12_P3)......................................................................47
Abb. 67 UV-Spektrum von Pyramidatin J..................................................................47
Abb. 68 1H-NMR-Spektrum von Pyramidatin J..........................................................48
Abb. 69 13C-NMR-Spektrum von Pyramidatin J ........................................................48
Abb. 70 Pyramidatin I................................................................................................49
Abb. 71 Pyramidatin H ..............................................................................................49
Abb. 72 CD-Spektrum von Pyramidatin I ..................................................................50
Abb. 73 CD-Spektrum von Pyramidatin H.................................................................50
Abb. 74 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin I...................................................................51
Abb. 75 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin H .................................................................51
Abb. 76 Pyramidatin K ..............................................................................................51
Abb. 77 Pyramidatin J ...............................................................................................51
Abb. 78 CD-Spektrum Pyramidatin K........................................................................52
Abb. 79 CD-Spektrum Pyramidatin J ........................................................................52
Abb. 80 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin K .................................................................52
Abb. 81 HSQC-Ausschnitt Pyramidatin J ..................................................................52
Abb. 82 Isolierschema von Tilletia caries ..................................................................54
Abb. 83 UV-Spektrum der gelb gefärbten Verbindung in T. controversa ..................55
Abb. 84 Isolierschema von Tilletia controversa .........................................................56
Tabellenverzeichnis
86
8. Tabellenverzeichnis
Tab. 1 NMR-Daten von Polygodial in CDCl3 .............................................................21
Tab. 2 NMR-Daten von Allylsyringol in CDCl3...........................................................23
Tab. 3 NMR-Daten von Polygonal in CDCl3 ..............................................................24
Tab. 4 NMR-Daten von Warburganal in CDCl3 .........................................................26
Tab. 5 NMR-Daten von Sesamin in CDCl3................................................................27
Tab. 6 NMR-Daten von 1-β-O-(p-Methoxycinnamoyl)polygodial in CDCl3 ................29
Tab. 7 NMR-Daten von Haplomyrfolin in CDCl3........................................................31
Tab. 8 NMR-Daten von 1-β-(p-Cumaroyloxy)polygodial in CDCl3.............................33
Tab. 9 NMR-Daten von Pyramidatin I in CDCl3.........................................................40
Tab. 10 NMR-Daten von Pyramidatin H in CDCl3 .....................................................42
Tab. 11 NMR-Daten von Pyramidatin K in CDCl3 .....................................................45
Tab. 12 NMR-Daten von Pyramidatin L in CDCl3 ......................................................47
Tab. 13 NMR-Daten von Pyramidatin J in CDCl3 ......................................................49
Tab. 14 HPLC-Standardmethode (Gradient).............................................................58
Tab. 15 FCPC-Fließmittelsysteme ............................................................................59
Tab. 16 Fraktionierung des DCM-Extraktes von Drimys ...........................................62
Tab. 17 Fraktionen des DCM-Extraktes von Drimys .................................................63
Tab. 18 präp. HPLC-Methode von DWR_V12...........................................................64
Tab. 19 präp. HPLC-Methode von DWR_V18...........................................................64
Tab. 20 präp. HPLC-Methode von DWR_V19...........................................................65
Tab. 21 Fraktionierung des DCM-Extraktes von Talauma ........................................66
Tab. 22 Fraktionen des DCM-Extraktes von Talauma ..............................................67
Tab. 23 präp. HPLC-Methode von TGB_S7..............................................................68
Tab. 24 präp. HPLC-Methode von TGB_S10............................................................68
Tab. 25 präp. HPLC-Methode von TGB_S12............................................................68
Tab. 26 Fraktionen des DCM-Extraktes von Tilletia caries .......................................70
Tab. 27 Fraktionen des MeOH-Extraktes von Tilleta caries ......................................71
Tab. 28 präp. HPLC-Methode des alkalischen Extraktes von Tilletia caries .............71
Tab. 29 Fraktionen des DCM-Extraktes von Tilletia controversa ..............................72
Tab. 30 präp. HPLC-Methode von Tcon_D_B7.........................................................73
Tab. 31 Fraktionen des alkalischen Extraktes von Tilletia controversa .....................74
Tab. 32 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_A2 .................................................74
Tab. 33 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_A3 u. A4........................................75
Tab. 34 semipräp. HPLC-Methode von Tcon_A_B8 .................................................75