Diminuarea Emisiilor de Metan Ruminal Prin Controlul Microorganismelor Din Rumen
-
Upload
flaviu-tomuta -
Category
Documents
-
view
26 -
download
0
description
Transcript of Diminuarea Emisiilor de Metan Ruminal Prin Controlul Microorganismelor Din Rumen
Diminuarea emisiilor de metan ruminal prin controlul microorganismelor din rumen
Cuprins:
1. Caracterizarea speciilor de bacterii prezente în rumen2. Clasificarea speciilor metanogene Archaea3. Metode de inhibare a bacteriilor metanogene: utilizarea biotehnologiilor (vaccinare,
serumizare), furaje, aditivi...prezentare pe scurt4. folosirea anticorpilor IgY ca inhibitori ai metanogenezei (prezentare pe larg)
Concluzii
1. Caracterizarea speciilor de bacterii prezente în rumen
A. Facultativ anaerobe- speciile facultativ anaerobe izolate din rumen aparţin genurilor
Flavobacterium, Pseudomonas, Proteus şi Micrococcus.
1. Bacilii coliformi (Coliform bacilli)- aceştia nu par să aibe o importanţă deosebită pentru
rumen deoarece s-au găsit într-un număr mic în lichidul ruminal (103-106 per ml de lichid
ruminal la oi şi vaci şi într-un număr mai mare la viţei de 3 săptămâni). Hobson şi Mann au
găsit foarte puţini bacili coliformi folosind anticorpi fluorescenţi. Heald a sugerat că aceste
bacterii pot fi importante în procesul de fermentare a xilozei deoarece au fost izolate din
lichidul ruminal în prezenţa xilozei şi au început foarte repede să o fermenteze. Cele mai
multe specii de coliformi găsite în rumen aparţin speciei Escherichia coli dar au fost izolate şi
alte specii cum ar fi Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloacae.
E. coli este o bacterie facultativ anaerobă, gram negativă şi nonsporulată. Celulele sunt de
obicei sub formă de bastonaşe şi au aproximativ 2 microni în lungime şi 0,5 microni în
diametru. Bacteria produce acid lactic, succinic, etanol, acetat şi dioxid de carbon.
Fig.1 Escherchia coli (www.remedic.ro)
2. Bacili (Bacilli)- specii de bacili au fost izolate din rumen în număr foarte mic. Aceste
specii sunt B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. circulans. Se pare că aceste bacterii sunt
importante în digestia proteinelor.
3. Propionibacteria- Elseden a izolat tulpini de Propionibacteria care fermentează lactatul
din lichidul ruminal preluat de la oi şi vaci. Mai târziu, Gutierrez a izolat un număr mare de
bacterii proteolitice şi propionice din rumenul unor vaci dar şi din sol şi fân. Aceste bacterii
erau identice cu Corynebacterium acnes cu excepţia că produceau acid lactic.
4. Lactobacilli- Hungate şi colab. au observat că bacterii similare cu Lactobacillus brevis erau
prezente în rumenul unei oi care a fost furajată cu fân şi căreia i-a fost administrat 3 lb de
glucoză. Rodwell a izolat o tulpină de lactobacillus heterofermentativ de la o oaie furajată cu
grâu. Jensen şi colab. au izolat L. brevis, L. buchneri, L. fermenti, L. plantarum, L.
acidophilus şi L. casei de la o vacă furajată cu furaje grosiere. Perry şi Briggs au găsit mai
multe specii de Lactobacillus în rumenul viţeilor dar şi a vacilor mature. L. fermenti era
predominant la viţei furajaţi cu concentrate din fân, L. acidophilus era predominant la vaci
furajate cu concentrate din fân iar L. casei predomina la vaci furajate cu silozuri. Studiile au
arătat că lactobacilii capabili de creştere în condiţii aerobice pot fi de o importanţă funcţională
în rumen dar sub anumite condiţii. Cercetările realizate de Perry şi Briggs demonstrează că
lactobacilii sunt printre cele mai importante bacterii prezente în rumen chiar şi la animale care
sunt furajate cu furaje grosiere. Hobson şi Mann nu au putut demonstra prezenţa speciilor
brevis, fermenti sau acidophilus în lichidul ruminal preluat de la viţei sau oi furajaţi cu furaje
pentru adulţi. Totuşi, o specie de Lactobacillus a fost descoperită la viţei de 7-10 zile care au
avut o dietă bazată pe lapte.
Lactobacillus casei ( www.bioweb.usu.edu)
Chiar dacă Lactobacillus sp. sunt în general inofensive, există câteva excepţii care produc
edeme pulmonare acute şi anemie hemolitică.
5. Streptococci- acestea sunt probabil cele mai studiate şi izolate bacterii din rumen. Cea mai
repezentativă specie este S. Bovis, cu celule gram-pozitive, nemotile, cu formă oviodă până la
formă de coc, formează lanţuri, iar celulele bătrâne pot fi gram-negative. Sunt considerate
facultativ anaerobe, existând tulpini strict anaerobe dar şi tulpini aero-tolerante. Intr-un studiu,
Hungate a comparat caracteristicile a 27 de tulpini izolate din lichidul ruminal preluat de la
câteva vaci furajate cu fân şi concentrate. Numărul era de 0,2-140 de milioane per ml.
Gutierrez a arătat numărul de streptococi amilolitici, facultativ anaerobi creşte foarte mult la
vacile furajate cu cereale. Tulpinile acestor bacterii se asemănau cu S. bovis cu excepţia că
acestea nu aveau toleranţă la temperaturi ridicate, erau puternic gram-pozitive doar 4 sau 6
ore, şi reduceau nitraţii. S-a arătat că aceste culturi, la fel ca şi alte patru tulpini de S. bovis au
abilitatea de a se ataşa de de amidonul din cereale.
Dain şi colab. au arătat că mâzga produsă din sucroză (produsă de S. bovis) este o
polizaharidă care conţine glucoză şi arată că este nevoie de dioxid de carbon pentru
producerea ei când microorganismul este crescut în mediu aerob. Trei varietăţi de
Streptococcus bovis au fost descoperite prin folosirea de mâzgă, de fermentaţia manitolului şi
de reacţiile produse în mediul cu agar (sânge de cal) .
Ford şi cloab. au descoperit că nici una dintre cele 26 de tulpini de S. bovis nu are nevoie de
vitamina B când creşte în condiţii anaerobe, cu excepţia tiaminului care a stimulat creşterea a
5 tulpini. În mediu aerob, câteva tulpini au nevoie de acid nicotinic, biotin şi tiamin. S. bovis
este indubitabil implicat în degradarea amidonului şi a altor carbohidraţi solubili din rumen.
Deoarece S. bovis este capabil de producerea unei cantităţi foarte mare de acid lactic, ceea ce
poate duce la diferite boli la rumegaroarele care sunt furajate cu furaje bogate în amidon şi
zaharuri (acidoză, balonare), se recomanda o dietă pe bază de drojdie uscată, astfel acesta nu
este capabil să prolifereze foarte repede.
Alte specii de strptoccoci izolaţi dar găsite în număr mai mic în lichidul ruminal sunt: S.
liquefaciens, S. faecalis şi alte specii neclasificate.
S-au descoperit deasemenea, şi câteva specii de coci facultativ anaerobi care se pare că sunt
implicaţi în procesul de fermentaţie ruminal. Bauman şi Foster au găsit bacterii similare cu
cele din genul Pediococcus în diluaţia lichidului ruminal preluat de la vaci furajate cu cereale.
Câţiva cercetători au observat la microscop şi au izolat o grupare sarcina, gram-negativă din
lichidul ruminal de la oi. Mann a descoperit că sarcina este facultativ anaerobă, care
degradează glucoza şi creşte doar în apă peptonată. A fost numită Sarcina bakeri.
B. Anaerobe
1. Sporulate-cele mai multe studii realizate asupra bacteriilor sporulate, celulolitice, anaerobe
au dus la concluzia că acestea nu se dezvoltă în rumen. Bullen şi colab. au realizat că o specie
de clostridium, C. perfringens a fost foarte repede distrusă când a fost introdusă în rumen. O
altă concluzie care s-a desprins în urma studiilor afost aceea că bacteriile sporulate anaerobe
nu sunt la fel de importante ca şi cele nonsporulate pentru procesul de fermentaţie din rumen.
Totuşi câteva specii au fost caracterizate ca fiind semnificante. Acestea sunt: C. lochheadii, C.
longisporum, C. butyricum, C. sporegenes.
Clostridium perifringens (www.microbewiki.kenyon.edu)
2. Nonsporulate
a. Lactobacilli- Câţiva cercetători au izolat lactobacili anaerobi, homofermentativi din rumen
dar doar câteva specii au fost bine carcaterizate. Mann şi Oxford au descoperit tulpina unei
bacterii (Organismul 123) care produce acid lactic. Au considerat că este o varietate de
Lactobacillus lactis, strict anaerobă. Bryan şi colab. au descoperit aceaşi bacterie care
predomina la viţei de 3 şi 6 săpămâni dar nu a fost găsită şi la animale mai tinere, mai învârstă
sau mature. Mai târziu, cercetătorii au izolat o alta specie anaerobă care produce acid lactic
(grupul +R3), de la viţei de 3-6 săptămâni. Această specie diferă de celelalte specii studiate.
Alte specii izolate sunt: L. ruminis şi L. vitulinis.
b. Ramibacteria-Bryant şi colab. au izolat două specii gram-pozitive de bacterii care aparţin
genului Ramibacterium. Grupul +R1 a fost găsit printre bacteriile izolate de la un viţel de 1
săptămână. Acestă bacterie produce o cantitate mare de acid succinic şi cantităţi mai mici de
acid lactic în mediul cu glucoză. Deasemenea prezenta câteva similarităţi cu L. bifidus.
Cealaltă specie de Ramibacterium izolată din rumenul unor viţei era strict anaerobă, producea
acid lactic, acetic şi formic în mediul cu glucoză şi degrada lactoza.
c.Eubacteria- Bryant şi Burkery au izolat două grupuri de bacterii anaerobe şi gram-pozitive.
Grupul +SR-Ggxc a fost studiat în detaliu şi a fost plasat în genul Eubacterium. Aceste specii
produc gaz şi acid acetic, formic şi lactic în proporţii similare în mediul cu glucoză. Diferă de
unele specii prin faptul că nu produc acid butiric şi propionic sau amoniac şi de altele (E.
biforme şi E. aerofaciens) prin fermentaţia carbohidraţilor, lichefierea în gelatină, şi
producerea unei cantităţi mari de acizi graşi volatili. Celălalt grup izolat de Bryant şi Barkery,
grupul +CR-GXC a fost studiat prin mai multe metode. 20 de tulpini au fost izolate de la 8
vaci furjate diferit. Toate tulpinile erau nonmotile cu multe celule aproape cocoidale. Erau
aranjat în principal câte una, în perechi şi în lanţuri scurte, ocazional în lanţuri de 20 de celule.
Erau slab gram-pozitive în 16 ore de cultură iar multe celule nu reţineau cristalul violet.
Culturile mai bătrâne erau gram-negative. Coloniie de suprafaţă formate pe mediul cu agar
erau netede, convexe, translucide până la opace având diametrul de la 2 până la 4 mm după 3
zile de incubare. Toate tulpinile au crescut la 30-37 de grade C şi erau strict anaerobe. Nici o
tulpină nu a produs catalză sau indol, nu a lichefiat în gelatină, nu a hidrolizat celuloza sau
amidonul, nu a descompus glicerolul, manitolul sau lactoza. In urma studiile realizate pe
aceste două grupuri de Eubacteria s-a ajuns la concluzia că ultimul grup aparţine speciei E.
ruminantium.
d. Methanobacteria- producerea metanului este una dintre cele mai cunoscute recţii care se
petrece îm rumen. Culturile de Methanosarcinae, Methanobacterium formicicum şi de
Methanobacterium sohngenii au fost probail obţinute din culturi pure inoculate cu un volum
mare de lichid ruminal. Smith şi Hungate au realizat culturi de bacterii metanogene, anaerobe,
gram-pozitive, nonmotile din conţinutul ruminal de la vaci şi oi aflate în diferite locaţii
geografice. Puritatea unei tulpini a fost foarte evidenţiată prin faptul că utilza hidrogen şi acid
formic în formarea metanului. Tulpina a fost numită Methanobacterium ruminantium.
e. Lachnospirae- Bryant şi colab. au descris genul Lachnospirae ca şi bacterii anaerobe,
nonsporulate, slab gram-pozitive, care degradează glucoza şi produc cantităţi mari de etanol,
acid lactic, formic şi acetic. Specia L. multiparus produce o colonie filementoasă cu unele
celule aranjate în lanţuri lungi cu tendinţa de a se curba. Aceste caracteristici, dar şi reacţia
Gram, sugerează o relaţie cu ordinul Actinomycetales.
Acestă bacterie degradeză pectina, fiind gram-pozitivă, în formă de bastonaş curbat, lat de 0,5
microni şi cu o lungime de 2-4 microni. Pentru dezvoltare are nevoie de vitamine din
complexul B, cerinţa pentru acestea variind de la o tulpină la alta.
f. Cillobacteria- o singură tulpină izolată din conţinutul ruminal diluat de la o vacă furjată
natural pe păşune, care era anaerobă, gram-pozitivă a fost plasată genului Cillobacterium şi a
fost numită C. cellulosolvens. Diferă de alte specii ale genului prin degradarea celulozei şi
prin producerea de acid lactic homofermentativ.
g. Bacterioizi-acid succinic- bacteriile strict anaerobe, nonmotile, gram-negative care produc
o cantitate mare de acid succinic sunt printre cele mai importante bacterii prezente în rumen.
Trei specii aparţinând grupului au fost numite: B. succinogenes, B. amylophilus, B ruminicola.
Primul nume al bacteriei Bacterioides succinogenes nu este prea aproape filogenetic de
Bacterioides sp. şi de aceea a fost redenumit Fibrobacter succinigenes. Aceasta este cea mai
răspândită bacterie din rumen. La vacile furajate cu paie din grâu, F. succinogenes reprezintă
20% din totatul bacteriilor iar la cele furajate cu alte furaje, aceasta reprezintă numai 5%. În
unele studii a fost raportat că aceasta contribuie cu 5-6% din totalul procariotic 16S rRNA din
conţinutul rumenal al vacilor. La prima izolare, celulele sunt predominant sub formă de
bastonaş însă în cultură ele devin cocoidale sau sub formă de lămâie, cu diametrul între 0,8-
1,6 microni. De obicei celulele sunt singulare, dar se pot observa şi lanţuri scurte sau rozete.
Pentru creştere au nevoie de valerat sau izobutirat dra şi de biotină şi acidul p-aminobenzoic
(PABA). Este relativ rezistentă la antibioticele orale dra este sensibilă la metaboliţii secundari
ai plantelor. Are complexe de enzime fibrolitice şi este una dintre microorganismele care
degradează amidonul cristalin.
Bacterioides amylophilus- prin secvenţierea oligonucleotidică 16S r RNA, Stackenbrandt şi
Hippe au propus ca numele de Bacterioides amylophilus săa fie schimbat în Ruminobacter
amylophilus. Chiar dacă se observă destul de rar se spune că este responsabilă de digestia
amidonului. Degradarea amidonului nu necesită amilază extracelulară, moleculele din amidon
aderând la receptori celulari şi sunt transportate în celulă pentru hidroliză. R. amylophilus are
formă de bastonaş de la oval pâmă la lunguiţ. In câteva substraturi produce acid, fermenteză
glicogenul şi dextrinele. Produsele de fermentaţie sunt acetatul şi succinatul, iar dioxidul de
carbon şi amoniacul sunt esenţiale pentru creştere.
h. Bacterioide-acid butiric- Bryant a izolat din rumenul unor viţei bacterii anaerobe, gram-
negative, nonmotile sub formă de bastonaşe care produc gaz, acid butiric, acetic şi propionic
în mediul cu glucoză. Bacteriile aparţin genului Bacterioides dar puteau fi plasate şi genului
Sphaerophorus cu singura diferenţă dintre aceste genuri că Sphaerophorus spp. sunt mai
multe pleomorfice.
Doetsch şi colab. au descoperit nişte bacterii anaerobe, gram-negative, nonmotile, sub formă
de bastonaş care produceau acid butiric şi acetic dar şi acid lactic şi propionic în cantităţi mai
mici în descompunerea xilozei. Această bacterie a fost numită Bacterioides amylogenes.
Forma curbată a celulelor le face să fie asemănătoare cu bacteriile din genul Desulfovibrio dar
absenţa flagelilor şi faptul că nu reduce sulfat elimină această ipoteză.
i.Fusobacteria- Huhtanen şi Gall au descoperit un grup de bacterii gram-negative, anaerobice
sub formă de bastonaş îîtr-un conţinut ruminal diluat. Aceste bacterii produc acid, gaz şi un
miros urât în mediul cu glucoză. Aceste caracteristice indică faptul că bacteria face parte din
genul Fusobacterium. Bryant a izolat, deasemenea, o specie nonmotilă care aparţine genului
Fusobacterium din lichidul ruminal preluat de la viţei de 1 şi 3 săptămâni dar nu a gasit
bacterii asemănătoare la alte animale. Caracteristicile tulpinilor variau în producerea de indol,
lichefierea în gelatină, hidroliza amidonului, creşterea la 22 şi 45 grade Celsius, dar
caracteristicile morfologice şi fiziologice se asemănau. Acest grup era asemănător cu unele
tulpini de Fusobacterium fusiforme .
j.Butyrivibrio- într-un studiu realizat asupra bacteriilor celulolitice din rumen, Hungate a
izolat bacterii sub formă de bastonaş curbat, gram-negative care degradau o gamă variată de
carbohidraţi şi produceau dioxid de carbon, hidrogen, acid butiric şi formic. A fost stabilit că
bacteriile aparţin genului Butyrivibrio şi speciei B. fibrisolvens. Genul include bacterii
anaerobe, nonsporulate, gram-negative, având formă de bastonaş curbat care degradează
glucoza şi formează acid butiric. B.fibrisolvens este una dintre cele mai comune specii de
bacterii din rumen. Pe lângă rolul pe care îl are în degradrea granulelor
de amidon, ea degradează şi fibrele vegetale, mai ales a xilanelor datorită conţinutului de
xilanază. Are cea mai mare activitate metabolică putând utiliza glucide simple, amidon de
toate tipurile, polizaharide pectinice dar şi alţi polimeri necelulotici.
k. Succinivibrio- bacteriile care fac parte din acest gen sunt anaerobe, nonsporulate, gram-
negative, sub formă de bastonaş curbat, monotrihe, şi care produc o cantitate mare de acid
succinic. Bryant şi Small au studiat 7 tulpini preluate de la o vacă şi pe toate le-au inclus în
aceaşi specie, S. dextrinosolvens.
l. Desulfovibrio- în timpul unui studiu asupra bacteriilor din rumen care degradează lactoza,
Gutierrez a izolat bacterii gram-negative, sub formă de bastonaş curbat care produceau colonii
negre în prezenţa sulfatului feros. Deoarece au fost găsite în număr foarte mic nu s-au
considerat importante pentru rumen.
m. Selenomonas
Selenomonas ruminantium- se întâlnesc cel mai des la animale furajate cu seminţe de
cereale, acestea reprezentând 22-51% din numărul total de nicroorganismele viabile. Celulele
sunt gram-negative, curbate în formă de banană, bastonaşele având 0.9-1.1 microni şi 3-3.6
microni, iar motilitatea este rezultatul flagelilor (în număr de 6) aflaţi în mijlocul părţii
concave a celulelor. În unele condiţii, cum ar fi excesul de glucoză sau deficienţa de fosfor, se
poate observa pierderea de flageli şi o morfologie spiralată. Chiar dacă sunt strict anaerobe,
câteva tulpini de S. ruminantium sunt tolerante la cantităţi mici de oxigen şi cel puţin o tulpină
posedă oxidaza NADH solubilă, aceasta fiind capabilă de reducerea oxigenului la apă. În
ciuda faptului că are o structură celulară specifică pentru bacterii gram-negative, prezintă
asemănări în secvenţa 16S r ADN cu bacteria gram-pozitivă Clostridium. Cerinţele
nutriţionale depind de tulpină şi de sursa de energie, dar de obicei includ n-valeratul, dioxidul
de carbon şi vitaminele din complexul B. Tulpinile care utilizează lactatul au cerinţe crescute
pentru aminoacizi, în special pentru aspartat şi p-aminobenzoat. Chiar dacă nu pot să
degradeze pectinele sau xilanele, cele mai multe tulpini pot să utilizeze pentru creştere
produşii de descompunere ai acestor polimeri. Tulpina S. ruminantium HD4 utilizează
oligozaharide maltozice însă are o capacitate redusă pentru degradarea amidonului. În cultură,
unele tulpini pot să utilizeze amidonul solubil pentru creştere.
S. ruminantium produce cantităţi mici de hidrogen în cultură pură, dar adevărata
metanogeneză se desfăşoară în co-cultură cu metanogeni. (Henderson, 1980) O altă activitate
importantă a S. ruminatium este decarboxilarea succinatului la propionat. (Strobel şi Russel,
1991)
La S. ruminantium este evidenţiată prezenţa plasmidelor. Abilitatea de a utiliza lactatul este
transmisibilă, acest fapt fiind evidenţiat în câteva studii, chiar dacă plasmidele mari erau
prezente în tulpina donoare, acestea aparent nu erau transferate la receptori utilizatori de
lactat, mecanismeul de transfer rămânând necunoscut. Bacteria se poate găsi şi în alte
ecosisteme anaerobe şi are un rol important în formarea de granule în reactoare anaerobe.
n. Borrelia- Bryant a izolat câteva tulpini de microorganisme din lichidul ruminal colectat de
la oi şi vaci şi a studiat din punct de vedere fiziologic şi caracteristic o singură tulpină pe care
a plasat-o genului Borrelia. Microorganismul era strict anaerob, care avea nevoie de substanţe
necunoscute din rumen pentru a creşte. Fermentază glucoza şi în urma aestui proces se
formează o cantitate mare de acid succinic şi acetic şi o cantitate mai mică de acid lactic,
formic, etanol şi dioxid de carbon.
o. Succinimonas- Succinimonas amylolytica a fost izolată din lichidul ruminal de la vaci
furajate cu amestecuri de cereale.
3. Cocci
a. Peptostreptococci- P. Elsdenii-
b. Ruminococci- cele mai importante microorgansime din rumen aparţin cocilor anaerobi
celulolitici. Foarte mulţi au cercetat aceste microorgansime şi au stabilit ca genul
Ruminococci include bacterii gram-pozitive, nonmotile, nonsporulate, sub formă de coci
anaerobi, care fermenteză celuloza şi produc cantităţi mari de acid succinic. Cele trei tulpini
studiate au aparţinut speciei R. flavefacines. Aceştia sunt ruminococci care produc acid
succinic şi un pigment galben pe stratul de celuloză, fermentează celuloza şi celobioza. O a
doua specie, Ruminococcus albus include tulpini care nu produc acid succinic. Caracteristicile
acestei specii sunt variabile dar cele mai multe tulpini diferă prin producerea sau nu a
pigmentului galben. Celulele sunt singulare sau aranjate în perechi sunt gram-negative dar şi
gram-variabil, şi de obicei noniodofilice. Produşii de fermentaţie sunt hidrogenul, dioxidul de
carbon, etanol, acid acetic, acid formic şi acid lactic. (articol)
Celulele de R. albus şi R. flavefaciens prezintă protuberanţe când sunt crescute pe substrat de
perete celular de la plante şi absente la celulele crescute pe celobioză, ele putând reprezenta
complexe se enzime asemănătoare celulosomelor altor bacterii celulozolitice. (Miron şi colab.
,1989).
c. Veillonellae- folosind un mediu de lactat, Johns a izolat Veillonella alcalescens din
rumenul unei oi. Deoarece a fost găsită în număr mic (to 7.4 X 106 per ml,) microorganismul
nu prezintă importanţă pentru rumen.
Alte specii de bacterii întâlnite în rumen
Megasphaera elsdenii aparţine speciilor fermentative de lactat şi glucide din rumen şi intestin
dar poate fi întâlnită şi în intestinele omului şi porcului. Acest coc gram-negativ, fără
motilitate, întâlnit în perechi sau în lanţ pănă la 20 de bucăţi, poate să utilizeze atât
carbohidraţi cât şi acizi organici, fiind considerat unul dintre cele mai importante
microorganisme cu rol în catabolismul acidului lactic. (Hungate,1966)
Mitsoukella multiacidus, aparţinând iniţial speciei Bacterioides ruminicola a fost redenumită
deoarece aceste tulpini posedau citocrom b şi erau capabile să utilizeze hidrogen (Hendelson,
1980). Tulpinile au secvenţe asemănătoare cu cea 16S r ARN a Selenomonas ruminantium,
utilizează substraturi asemănătoare şi produc lactat. Celulele sunt sub formă de bastonaşe
drepte, gram-negative, fără flageli.
Anaerovibrio lipolytica- are două propietăţi importante, cum ar fi hidroliza lipidelor şi
utilizarea lactaţilor, aceste având importanţă ecologică. Hobson şi Mann au izolat-o de la oi
furajate cu turte din seminţe de in. În acelaşi timp, Slyter şi colab. au izolat-o în timpul
schimbării de la furaje concentrate, când utilizarea acidului lactic se măreşte în organism. A
mai fost izolată de la animale furajate cu furaje grosiere (Henderson, 1975)
Celulele au formă de bastonaşe bombate, gram negative de aproximativ 0,5 ori 1,2-3,6
microni, cu motilitate normală, dată de un singur flagel polar. Henderson a descris o bacterie
lipolitică asemănătoare cu A. lipolytica, însă flagelul era localizat pe parte concavă a celulei.
Substratele specifice utilizate sunt riboza, triacilgliceridele şi fosolipidele, fiind fermentaşi şi
câţiva aminoacizi. Cei mai importanţi produşi de fermentaţie depind de substrat. Glicerolul
este fermentat în propionat şi succinat şi în cantităţi mici în hidrogen şi lactat. Riboza şi
fructoza sunt fermentate în acetat, propionat şi dioxid de carbon cu cantităţi mici de succinat,
hidrogen şi lactat. DL-lactatul este fermentat deobicei în acetat, propionat şi dioxid de carbon
cu cantităţi mici de succinat şi hidrogen (Henderson, 1975). Bulele membranare eliberate de
la suprafaţa celulară reprezintă activitatea lipazică extracelulară.
Spirochetele
Microorganismele spiralate au fost observate de multe ori în compoziţia lichidului ruminal, în
special când bacteriile celulolitice au fost izolate şi studiate (Cheng şi colab., 1984). Stanton şi
Canale-Parola (1979) au calculat că Spirochetele se află în pondere de la 1 % până la 6% în
totalul viabil de lichid ruminal. Paster şi Canale-Parola (1982) au descris specii din rumen
formatoare de succinat şi etanol.
Spirochetele din rumen sunt treponeme, care formeză una sau şase grupuri filogetenice de
spirochete (Paster, 1991).
Treponema bryantii este gram-negativă, în formă de bastonaşe helicale cu lungimea tipică de
3-8 microni, cu flagl periplasmatic aflat la un capăt al celulei. Pentru creştere au nevoie de
dioxid de carbon, izobutirat, 2-metilbutirat şi vitamine din complexul B.
T. saccharophilum a fost izolată din lichidul ruminal de la o vacă de către Paster şi Canale-
Parola (1985). Sunt celule helicoidale, mari, late de până la 0,7 microni şi lungi de 20 microni,
cu un manunchi de flagele periplasmatice, care de obicei sunt în număr de 16.
Comunitatea Archaea din rumen
Comunităţile care aparţin domeniului Archaea din rumen contribuie la subunitatea 16S r RNA
cu aproximativ 0,3-3,3%. Archaea are specii care se găsesc în mai multe habitate, dar cele din
rumen sunt strict metanogene anaerobe. Multe specii metanogene pot creşte folosindu-se de
hidrogen şi deasemenea cu ajutorul lui reduc dioxidul de carbon la metan. Unele specii pot
creşte cu ajutorul unor grupări metil şi pot produce electroni care sunt folosiţi pentru
reducerea grupăriloe metil la metan. Alte specii pot creşte cu acetat, reducându-l la metan şi
dioxid de carbon.
În funcţionarea normală a rumenului, proteinele şi carbohidraţii reprezintă cea mai mare sursă
de hrană introdusă şi sunt fermetaţi de comunităţile bacteriene la acizi graşi volatili, metan,
dioxid de carbon şi hidrogen. Acizii graşi volatili sunt preluaţi de către pereţii rumenului şi
servesc ca sursă de carbon şi energie pentru rumegătoare.
Bacteriile metanogene din rumen se prind de particulele materiale, de protozoare şi se prind
de epiteliul rumenului. Aceste specii de bacterii metanogene se pare că au o rată de creştere
diferită din moment ce se eliberează din rumen treptat.
Bacteriile metanogene din rumen
Bacteriile metanogene au fost clasificate în 28 de genuri şi 113 specii dar mult mai multe specii se aşteaptă să fie în natură. Totuşi, foarte puţine specii au fost izolate din rumen, acestea fiind în număr de 7 specii: Methanobacterium formicicum, Methanobacterium
bryantii, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter millerae, Methanobrevibacter olleyae, Methanomicrobium mobile, şi Methanoculleus olentangyi. Deasemenea a fost izolată şi Methanosarcina spp. dar aceste bacterii nu sunt aşa numeroase în comunitatea Archaea.
Studiul microorganismelor metanogene din rumen, dar şi a întregului domeniu Archaea a fost realizat cu ajutorul tehnicilor PCR. Acestea au ajutat la definirea secveţei 16S r Rna de la Archaea iar apoi a urmat clonarea, folosind ca şi gazdă Escherichia coli. O evaluarea a grupurilor dominante de archaea din rumen poate fi realizată prin compararea secvenţelor şi a a genelor 16S r RNA.
2.Clasificarea speciilor metanogene Archaea
Studiile realizate asupra speciilor metanogene din rumen au fost separate în două categorii: studii privind numărul total de specii archaea şi studii privind protozoarele asociate cu archaea. (tabel 1). Pentru studiul comunităţilor archaea s-au realizat nouă studii, incluzând celulele libere, particulele asociate cu celule şi particule asociate cu alte microorganisme din rumen. Aceste 9 studii au fost divizate în 12 seturi de date care conţin 294 de secvenţe combinate folositoare, acestea reprezentând 1.026 de gene 16S r RNA clonate. Cinci alte studii se referă la protozoarele asociate cu archaea şi cuprind 187 de secvenţe care reprezintă 2.717 gene 16S r RNA clonate. Secvenţele de gene 16S r RNA au fost descărcate din baza de date GenBank într-o altă altă bază de date globală întreţinută cu ARB. (!) In plus, au fost incluse ca şi secveneţe de referinţă alte 138 de secvenţe de gene 16S r RNA preluate de la metanogene. Aceste secvenţe de referinţă aveau lungimea de 1.300 de nucleotide. În urma analizelor realizate asupra secvenţelor a rezultat o dendogramă (fig 1) care a permis alinierea finală a tuturor secvenţelor şi a clonelor asociate a microorganismelor archaea din rumen. (tabelul 2)
TABEL 1. Numărul de clone şi de secvenţe din studiu (sinteză)Obiect de studiu şi autor Nr. set de
dateNr. secvenţe Nr.
clone>870pb <800pb
Archaea în rumenShin et al. 1 104 0 104Skillman et al. 1 10 0 10Tajima et al. 1 8 0 23
Whitford et al. 1 41 0 41Wright et al. 3 43 la a 0 405Wright et al. 1 26 0 78Wright et al. 2 28 0 241
Wright et al. 1 14 0 104Yanagita et al. 1 0 20 20Protozoare asociate cu archaeaChagan et al. 1 0 8 91Irbis and Ushida 1 0 14 2.398Ohene-Adjei et al. 1 0 139 139
Regensbogenova et al. 1 11 9 20Tokura et al. 1 0 6 69
a- 26 de secvenţe adiţionale care reprezintă 328 de clone nu au fost incluse
Abundenţa comunităţii archaea în rumen
In urma analizei datelor din bazele de date, majoritatea speciilor archaea (92,3%) prezente în rumen pot fi repartizate în trei grupuri sau genuri. Acestea sunt Methanobrevibacter (61,6%), Methanomicrobium (14,9), şi un grup mare de specii neculturate plasate în clusterul C sau RCC (15,8%). Genul Methanobrevibacter este cel mai numeros din rumen iar secvenţele clonate se împart în două calde majore: o cladă definită de speciile M. gottschalkii, M. thaueri şi M. millerae acestea conţinând cele mai multe clone de Methanobrevibacter. Aceste grupuri formează clada M. gottschalkii. O altă cladă majoră este dată de M. ruminantium şi M. olleyae, conţinând 27,3% din totalul speciilor archaea din rumen. Acestea aparţin cladei M.ruminantium şi au fost găsite aproape în toate seturile de date (tabel2). Alte specii care aparţin genului Methanobrevibacter sunt M. smithii şi M. wolinii, dar aceste specii sunt rare.
Speciile care aparţin altor grupuri de metanogene printre care Methanimicrococcus spp., Methanosphaera spp. şi Methanobacterium spp. au apărut în seturile de date în abundenţă mică. Două grupuri de archaea neculturate, care aparţin grupului Qld26 şi cladei Crenarchaeota au fost deasemenea găsite. Grupul Qld26 conţine secvenţele CSIRO-Qld26 şi Ven-04 ale 16S r RNA şi 9 secveneţe asociate cu particule mari din rumen, detectate de Shin şi colab. Caracteristicile fiziologice ale acestor grupuri nu sunt cunoscute.
Variaţiile în compoziţia secvenţelor la majoritatea cladelor sunt foarte mari. Cele mai multe variaţii apar la M. gottshalkii din cauza erorilor de secvenţiere şi a diversităţii genetice a tulpinilor de Methanobrevibacter spp. Alte variaţii majore apar şi la alte subgrupuri, cum ar fi: Methanomicrobium, Methanosphaera, Qlde 26, Methanomicrococcus şi majoritatea la M. ruminantium. Grupul RCC prezintă variaţii considerabile în tipurile de secvenţe. Diferenţa de 3% a secvenţelor 16S r RNA de la procariote este foarte des folosită ca şi indicator de separare a două tulpini. Dacă diferenţa este mai mică de 3% nu se poate folosi secevenţa genică 16S r RNA pentru a putea determina care tulpini aparţin aceleaşi specii şi care nu. Dighe şi colab. susţin că o diferenţă de 2 % la secvenţa genică 16S r RNA corelată cu similarităţile de 70% a hibridării ADN-ADN de la Methanobrevibacter poate fi folosită pentru a separa secvenţele în două specii. Speciile care aparţin cladei Methanobrevibacter au diferenţe de 3 % la secveneţele genice 16S r RNA iar decizia de a separa mai multe specii s-a bazat pe diferenţele multiple în genom. Totuşi, bazându-se pe diferenţele prezente la rezultatele hibridării ADN-ADN poate exista un număr mai mare de specii care aparţin genului Methanobrevibacter sau chiar un număr mic (aproximativ patru). Analiza detaliată a genomului poate susţine crae interpretare este corectă, deşi sfârţitul analizei depinde foarte mult de definirea speciilor procariote, în special dacă genomul formeză genotipuri. Este mult mai important să se detremine câte grupuri funcţionale fac parte din aceste clade şi care sunt diferenţele biochimice şi ecologice.
TABELUL 2Clada Detectarea în conţinutul
total ruminalDetectarea în protozoarele asociate cu archaea
Mean%
Maxim%
Nr. set de date(n 12)
Mean%
Maxim%
Nr. set de date(n 5)
Methanomicrobium 14,9 85,6 4 20,1 80,0 3Methanimicrococcus 2,4 14,6 3 4,0 20,0 1M. gottschalkii 33,6 81,2 10 42,9 98,6 3M. smithii 0,1 0,8 1 0 ND la
c0
M. ruminantium 27,3 60,0 10 12,5 62,6 1M. wolinii 0,1 1,0 1 2,6 12,8 1AlteMethanobrevibacter
0,5 5,6 1 0,6 2,9 1
Methanosphaera 3,7 26,8 5 1,9 4,0 4Methanobacterium 0,2 2,9 1 0,4 1,1 2RCC 15,8 80,8 5 15,1 74,1 2Qld26 1,3 8,7 3 0 ND 0Crenarchaeota 0,2 2,9 1 0 ND 0
Alte metode de identificare
Probe de ARN au fost utilizate pentru a analiza comunitatea archaea din rumen, folosind hibridarea şi nu extragerea de ARN sau a hibridării fluorescente in situ (FISH). Aceste studii au ca rezultat faptul că membrii familiei Methanobacteriaceae (care include Methanobrevibacter spp., Methanobacterium spp. Şi Methanosphaera spp.) erau membrii dominanţi ai comunităţii archaea din rumen (30-99%). Membrii ordinului Methanomicrobiales sunt cei mai puţini (0-54%) iar membrii ordinului Methanosarcinales apar foarte rar (2-3%). Separarea genelor 16S r RNA în gelul electroforetic amplificate prin PCR confirmă prezenţa în număr mare a speciilor de M. ruminantium, M. gottschalkii şi a grupului RCC în lichidul ruminal preluat de la oi şi vaci furajate pe păşune. Deasemenea s-au descoperit şi membrii ai Methanimicrococcus şi Methanosphaera. Abundenţa speciilor se asemăna cu cea din bazele de date globale. Specii de Methanococcales nu au fost determinate.Tatsuoka şi colab. şi Denman şi colab. au evidenţiat prezenţa genei metil-coenzima M reductaza (mcrA) în rumenul vacilor. Această enzima şi gena ei sunt buni evidenţiatori ai metanogenezei în rumen. În ambele studii, genele mcrA de la Methanobrevibacter spp. au dominat librăriile şi au fost generate cu ajutorul prime-rilor care au ca ţintă secvenţele mcrA. Denman şi colab. au descoperit şi un grup de secvenţe mcrA care aparţineau unui grup nedefinit de archaea care a fost deasemenea descoperit şi de Luton. Nu este cunoscut dacă aceste secvenţe sunt derivate din unul dintre grupurile nedefinite de archaea detectate în librăriile 16S r RNA. În cele două studii relizate nu au fost găsite gene mcrA pentru Methanococcales.
Bacteriile metanogene care au fost găsite în rumen aparţin cladei majore din bazele de date globale, cu excepţia speciilor de Methanosarcina şi a Methanoculleus olentangyi. Izolarea unui microorgansim dintr-un mediu anume indică prezenţa acestuia în acel mediu în timpul recoltării, dar dacă abundenţa acestuia este cuantificată, nu este posibil să se declare semnificaţia numerică pe care microorganismul o are în comunitatea din care a fost preluat. Cu ajutorul secvenţei 16S r RNA se pot detecta populaţiile mari. Se poate considera faptul că Methanosarcina spp. şi Methanoculleus spp. au fost găsite în probele preluate din rumen dar nu par să aibe o semnificaţie numerică pentru comunitatea archaea din rumern.
Structura comunităţii Archaea
Structura comunităţii Archaea variază în funcţie de specie, de dietă sau de metodele de extragere de AND şi de primerii PCR folosiţi. Două studii au fost realizate cu ajutorul aceloraşi metode de extragere AND şi au folosit aceeaşi primeri PCR. Deasemenea au evaluat diversitatea Archaea din rumenul oilor. Comunitatea Archaea din rumenul acestor oi (crescute la Centrul de Cercetare CSIRO Yalanbee din vestul Australiei) era dominată de M. gottschalkii (75,3%) şi de M. ruminantium (19,5%). In contrast, un studiu realizat pe oi din Queensland, Australia a evidenţiat prezenţa cladei RCC (80,8%), a M. gottschalkii (9 %) şi a cladei de Methanomicrobium (7,7 %). Aceste diferenţe mari apărute între comunităţi pot fi din cauza dietei, mediului, sănătăţii animalelor, genotipului şi a vârstei. Alte studii realizate de Shin şi Tajima au evidenţiat dominanţa speciilor de Methanomicrobium (85,6%, respectiv 60,9%) în rumenul unor vaci. Witford, în urma unor studii a realizat că speciile de Methanosphaera (26,8%) şi de Methanomicrococcus (14,6%) erau speciile abundente în rumenul vacilor iar speciile dominante aparţineau de Methanobrevibacter (58,5%). Wright şi colab. au descoperit, în urma unor studii realizate în Canada asupra unor vaci furajate cu loturi, că speciile dominante de archaea aparţin grupurilor Methanobrevibacter (50-51,9%) şi a grupului RCC (37,8-50%).
Wright a realizat un studiu în urma căruia s-a stabilit că dieta animalelor are un efect asupra compoziţiei comunităţii metanogene din rumen. Trei grupuri de oi au fost furajate diferit cu treo diete: păşune, ovăz şi lucernă. A rezultat o variaţie a cladelor de Archaea în aceste trei cohorte. Se cunoaşte faptul că dieta afectează compoziţia bacteriană din rumen, dar se aşteaptă ca bacteriile să intercţioneze mai mult cu furajul din moment ce îl folosesc ca şi substrat de energie. Majoritatea speciilor Archaea din rumen folosesc hidrogenul şi formatul ca şi sursă de energie, acestea fiind formate în timpul primei fermentaţii a furajului de către bacteriile ruminale, fungi şi protozoare. Dieta poate avea un efect major asupra metanogenezei datorită schimbării pH-ului care poate afecta direct activitatea metanogenezei.
Abundenţa speciilor Archaea asociate cu protozoareleBazându-se pe analiza librăriilor de clone, majoritatea protozoarelor asociate cu archaea (93,8%) pot fi amplasate grupurilor dominante, adică genurilor Methanobrevibacter şi Methanomicrobium şi a grupului RCC. (tabel 2)
Rolul în rumenDintre cele 11 clade de Archaea detectate, 9 utilizează hidrogenul în metanogeneză. Acestea aparţin genurilor Methanobrevibacter, Methanomicrobium, Methanobacterium, Methanospaera şi Methanomicrococcus. Nu este clar cum acestea coexistă în rumen, dar se pare că există diferenţe în abundenţa lor în diferite studii, acest lucru indicând o influenţă dată de specia animalului şi de hrană. Speciile archaea din rumen deasemenea interacţioneză cu protozoare, cu alte bacterii şi cu fungi. Fiziologia speciilor cladei Qld26 şi a grupului C din clada RCC nu este cunoscută. Deoarece clada Qld26 se aseamănă cu speciile de Methanobrevibacter, Methanobacetrium şi Methanosphaera acestea pot fi utilizatoare de hidrogen. Grupul C din clada RCC a fost descoperit şi în tractul digestiv dar şi în alte medii anaerobe. Clada RCC a fost etichetată ca fiind parte din grupul metanogenelor dar sunt foarte puţine dovezi care să evidenţieze acest lucru.
Limitarea activităţii metanogenezei în rumenul animalelor domestice poate avea rezultate pozitive asupra productivităţii animalelor dacă procesul de fermentaţie nu este afectat direct. Aceste strategii de limitare a cantităţii de metan pot fi efectuate numai după cunoaşterea comunităţilor de bacterii, în special a celor metanogene din rumen.
4.Folosirea anticorpilor IgY ca inhibitori ai metanogenezei (prezentare pe larg) + Avian (IgY) anti-methanogen antibodies for reducing ruminal methane production: in vitro assessment of their
effects (experimentele lui Cook-am gasit doar abstractul)
Oul de găină este cea mai mare celulă cunoscută care provine ditr-o singură diviziune celulară şi care este compusă din substanţe importante pentru viaţă (nutrienţi, proteine, lipide, carbohidraţi şi alţi compuşi biologici). Când un ou fertilizat este ţinut la o temperatură de 37 de grade Celsius pentru 21 de zile eclozează. Totuşi, acest mediu optim pentru ecloziune este şi un mediu optim pentru creşterea bacteriilor şi a virusurilor (Mujo Kim et al., 2000).
Se cunoaşte foarte bine faptul că albuşul şi gălbenuşul oului au proprietăţi antibacteriale şi antivirale. În cadrul imunologiei, anticorpii pe bază de ou au devenit forate studiaţi. Imunizarea pasivă, orală cu anticorpi pe bază de ou are efecte asupra infecţiilor gastrointestinale.
Anticorpii se referă câteodată la imunoglobuline (Igs) şi sunt găsiţi în fluidele umorale (sânge, salivă, lapte) ale vertebratelor. La oameni sunt cunoscute cinci clase de imunoglobuline (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE) care sunt distincte în structură şi funcţie. Animalele produc anticorpi IgG aproape pentru toţi antigenii (bacterii, virusuri, proteine). Acestă imunitate umorală este un sistem biologic de apărare stabilit în evoluţia animalelor. Păsările prezintă trei tipuri de imunoglobuline (IgG, IgA, IgM) care sunt transferate de către pasăre la ouăle sale. IgA şi IgM sunt secretate împreună cu alte proteine şi fac parte din albuş iar IgG este transferat prin membrana gălbenuşului în gălbenuş în perioada de maturare. Anticorpii IgG din ou au o iminitate pasivă deoarece anticorpii originari de la găină sunt folosiţi pentru protecţia puilor de unele boli. Anticorpii IgG de la gaină sunt găsiţi în sângele puilor iar anticorpii IgA şi IgM
sunt prezenţi în tracul digestiv (Mujo Kim et al., 2000).gg Yolk Antibody
Anticorpii IgY sunt folosiţi în mai multe câmpuri de cercetare, imunizare şi diagnosticare. Deasemena sunt folosiţi şi în modularea microflorei intestinale sau ruminale pentru a reduce
cantitatea de metan şi a formării acidozei ruminale (Christopher et al., -Keep bacteria under control: Dietary modulation of gut microflora in farm animals by use of hen egg yolk antibodies)
S-au realizat foarte multe studii cu privire la diferenţele structurale dintre anticorpii IgG mamalieni şi cei aviari. Printre aceste diferenţe se numără: greutatea moleculară a IgG aviar (1,8 ori 10 la a 4) este mai mare decât greutatea moleculară a IgG mamalieni (1,5,ori 10 la 4); punctul izoelectric este mai mic la IgG aviar decât cel al IgG-ului; IgG aviar nu se asociază cu complemenţii mamiferi; IgG aviar nu se leagă de proteina A de la Staphylococcus sau cu un factor reumatoid din sânge. Bazându-se pe aceste diferenţe, IgG provenit din galbenuşul de ou se numeşte IgY (Mujo Kim et al., 2000).