Dijagnostiki znaaj odreivanja aktivnosti alkalne fosfataze leukocita periferne krvi u stanjima sa neutrofilijom

SAETAKUvod: Leukemoidna reakcija je est pratilac oboljenja i nastaje usled pojaanog angaovanja u fagocitozi ili dejstvom inflamatornih citokina koji deluju stimulativno na leukocitopoezu. Kao reaktivni fenomen laboratorijski se detektuje neutrofilija koja, naroito u nehematopoetskim malignitetima, moe biti jako visoka. Uvoenjem specijalnih bojenja na alkalnu fosfatazu leukocita (APL), mogue je razlikovati leukocitozu u ovim oboljenjima od leukocitoze kakvu vidjamo u Hroninoj granulicitnoj leukemiji (HGL) ili neutrofilnoj leukemiji (NL).Cilj: Utvrditi diferencijalno dijagnostiku vrednost aktivnosti APL kod bolesnika sa neutrofilijom razliite etiologije i ispitati korelaciju broja leukocita (neutrofila) i visine skora APL pri postavljanju dijagnoze.Materijali i metode: U periodu od 1. novembra 2011. - 31. januara 2012. godine ispitivano je 14 pacijenata sa neutrofilijom, leenih na Klinici za hematologiju, Klinikog centra u Niu. Svim bolesnicima je uraena krvna slika i razmaz periferne krvi. Za odreivanje aktivnosti APL koristili smo nativne preparate razmaza periferne krvi koje smo bojili metodom po Kaplowu. Odreivanje skora APL vri se tako to se aktivnost enzima (od 0 - 4) odredi u 100 granulocita, a potom njihov broj pomnoi sa odgovarajuim intenzitetom APL. Sabiranjem tih vrednosti dobija se skor APL. Normalne vrednosti skora APL kreu se u rasponu od 20 - 150. Rezultati: Kod deset bolesnika utvren je nizak skor APL u perifernoj krvi, nakon ega je postavljena dijagnoza HGL. Kod preostala etiri bolesnika, vrednosti skora APL su bile u opsegu od 95 do 147 to je upuivao na reaktivni fenomen.Zakljuak: Odreivanje skora APL je jednostavna i pouzdana metoda koja, dopunjena suptilnijim dijagnostikim procedurama, ima vrednost u diferencijalnoj dijagnozi neutrofilije u HGL od stanja praenih reaktivnom neutrofilijom. Kljune rei: leukocitoza, leukemoidna reakcija, neutrofilija, alkalna fosfataza leukocita.

ABSTRACTIntroduction: Leukemoid reaction is a common feature of the disease and it is caused by increased involvement in phagocytosis and the effect of inflammatory cytokines that act as stimulator of leukocitopoesis. As a reactive phenomenon, laboratory detects neutrophilia that, especially in non-hematopoetic malignancies, could be very high. The introduction of special staining of leukocyte alkaline phosphatase (ALP), it is possible to distinguish between leukocytosis in these disease and leukocytosis that we see in Chronic granulocytic leukemia (CGL) or neutrophil leukemia (NL). Objective: To determine the differential diagnostic value of APL activity in patients with neutrophilia with different etiologies and investigate the correlation of the number of leukocytes (neutrophils) and APL score in establishing diagnosis.Materials: In the period from November 1st 2011. January 31st 2012. yr, 14 patients with neutrophilia, treated at the Clinic of Hematology, Clinical Center Nis, have been examined. All patients underwent blood and peripheral blood smear. To determine the activities of APL, we used native preparations of peripheral blood smear, which are coloured stained by the metod of Kaplow. Determination of APL score is done by determine enzyme activity (from 0 to 4) in 100 granulocytes, and then their number is multiplied by the appropriate intensity of APL. Adding these values we obtain APL score. Normal values of APL score are ranging from 20 150.Results: Ten patients identified a low score of APL in the peripheral blood, after which he was diagnosed with CML. In the remaining four patients, APL score values were in the range of 95 to 147 as instructed on a reactive phenomenon.Conclusion: Determination ofAPL scoreis a simpleand reliablemethod which, complemented by subtlediagnosticprocedures,has a valuein the differentialdiagnosis of neutrophiliain theHGLfrom state with reactiveneutrophilia.Keywords: leukocytosis, leukemoid reaction, neutrophilia, leukocyte alkaline phosphatase.UVOD

Bela krvna zrnca ili leukociti, su elije imunog sistema koje su ukljuene u odbrambeni mehanizam od zaraznih bolesti i stranih materija. Postoje pet razliitih i ranovrsnih tipova laukocita, ali su proizvedeni i potiu iz multipotentne elije kostne sri poznate kao matine elije hematopoeze (1). One proseno ive oko 3 do 4 dana u ljudskom telu. Leukociti se nalaze u celom telu, ukljuujui i krv i limfni sistem (2).Broj leukocita u krvi esto je pokazatelj prisustva nekog oboljenja. Normalno postoji izmeu 4-10109 belih krvnih zrnaca u litru krvi. Smanjen broj leukocita se oznaava kao leukopenija, a povean broj kao leukocitoza.Leukocitoza koja prelazi 50 000109/L krvi, sa signifikantnim poveanjem neutrofilnih prekursora se oznaava kao leukemoidna reakcija (3). U razmazu periferne krvi mogu se nai mijelociti, metamijelociti, promijelociti i retko mijeloblasti. Meutim, postoji meavina ranih zrelih neutrofilnih prekursora, za razliku od nezrelih oblika koji se obino javljaju u akutnoj leukemiji.Leukemoidna reakcija je est pratilac brojnih inflamatornih, sistemskih, infektivnih i neoplastinih oboljenja i nastaje usled pojaanog angaovanja u fagocitozi (bakterije, strano telo, nekrotini detritus) ili dejstvom inflamatornih citokina koji deluju stimulativno na leukocitopoezu (graviditet, neki tumori, sistemske bolesti). Kao posledicu, tj. reaktivni fenomen laboratorijski se detektuje neutrofilija koja, naroito u nehematopoetskim malignitetima, moe biti jako visoka (u karcinomu plua i preko 100 000 109/L krvi). Uvoenjem specijalnih bojenja na alkalnu fosfatazu leukocita (APL), mogue je razlikovati leukocitozu u ovim oboljenjima od leukocitoze kakvu vidjamo u hroninoj granulocitnoj leukemiji (HGL) ili neutrofilnoj leukemiji (NL).

CILJ RADA

Utvrditi diferencijalno dijagnostiku vrednost aktivnosti alkalne fosfataze leukocita (APL) kod bolesnika sa neutrofilijom razliite etiologije i ispitati da li postoji korelacija broja neutrofila i aktivnosti APL izraenog u vidu "skora", pri postavljanju dijagnoze.

MATERIJAL I METODE

Nau grupu inilo je 14 ispitanika sa neutrofilijom (11 mukaraca, 3 ene), prosene starosti 60,7817,73 god., ispitivanih u Klinici za hematologiju, Klinikog centra u Niu u periodu od 1. novembra 2011. - 31. januara 2012. godine.

Grafik 1. Distribucija ispitanika po polu

Svim bolesnicima je, nakon uzimanja anamnestikih podataka i klinikog pregleda, uraena krvna slika, razmaz periferne krvi, kao i dodatne dijagnostike procedure, zavisno od indikacija. Za odreivanje aktivnosti APL koristili smo svee nativne preparate razmaza periferne krvi koje smo bojili metodom po Kaplowu (5)(6). Ova metoda se zasniva na hidrolizi reagensa, alfa-naftil-fosfata alkalnom fosfatazom poreklom iz granula leukocita. Osloboeni alfa-naftil spaja se sa bojom Fast-red koju dodajemo i nastaje talog mrko crvene boje u citoplazmi neutrofila. Obojene preparate smo gledali pod svetlosnim mikroskopom sa imerzionim objektivom, pod uveanjem x 100. Ocena aktivnosti APL je kvantitativna i vri se na sledei nain: bezbojna citoplazma obeleava se sa 0, lako mrko obojena sa 1, jasno mrko obojena sa par granula sa 2, citoplazma sa brojim crvenim granulama sa 3 i citoplazma sa mrkim talogom koji prekriva jedro sa 4. Odreivanje skora APL vri se tako to se aktivnost enzima (od 0 - 4) odredi u 100 granulocita, a potom njihov broj pomnoi sa odgovarajuim intenzitetom APL. Sabiranjem tih vrednosti dobija se skor APL. Normalne vrednosti skora APL kreu se u rasponu od 20 - 150. U hroninoj granulocitnoj leukemiji (HGL), paroksizmalnoj nonoj hemoglobinuriji (PNH) i relapsu akutne mijeloidne leukemije (AML), skor APL je nizak ( 20), dok je u reaktivnim leukocitozama kakve viamo u nehematopoetskim malignitetima, infekcijama i sistemskim bolestima vezivnog tkiva, ovaj skor vii.

REZULTATI ISTRAIVANJA

Kod deset bolesnika utvren je nizak skor APL u perifernoj krvi, nakon ega je, na osnovu nalaza u mijelogramu i citogenetskih analiza (prisustvo Ph hromozoma), postavljena dijagnoza HGL. Kod preostala etiri bolesnika, vrednosti skora APL su bile visoke i kretale se u opsegu od 95 do 147. Ovakav nalaz je upuivao na reaktivni fenomen i indikovao dopunska ispitivanja radi rasvetljavanja uzroka neutrofilije.

Tabela 1. Vrednosti skora APL u odnosu na dijagnozu kod ispitanika nae grupe

Pacijent brSkor APLDijagnoza

116HGL

216HGL

320HGL

410HGL

511HGL

65HGL

719HGL

818HGL

913HGL

1014HGL

1198Abscessus mandibulae

1295Arthritis rheumatoideus

13129Sepsis

14147Ca pulmonum

Na grafiku 2 je prikazana distribucija naih ispitanika u zavisnosti od dijagnoze bolesti.

Grafik 2. Distribucija bolesnika po dijagnozi

U nastavku, ispitivali smo da li postoji korelacija izmeu broja leukocita i izraunatog skora APL. Sve ispitanike podelili smo na osnovu broja leukocita u perifernoj krvi u dve grupe: grupu I, sa umereno povienim brojem leukocita (Le 50 000 109/L) i grupu II, sa hiperleukocitozom (Le >50 000 109/L), to je prikazano na tabeli 2.

Tabela 2. Vrednosti skora APL u odnosu na broj leukocita Grupa I(No = 9 bolesnika)Grupa II(No = 5 bolesnika)

Broj leukocita(x 109/l)Skor APLBroj leukocita(x 109/l)Skor APL

38209816

181010416

31116118

161914413

1814675

1798--

2595--

43129--

50147--

Iako je evidentno broj ispitanika sa niskim vrednostima APL vei u grupi sa hiperleukocitozom, Pearsonovim 2 testom (2= 2,89, p=0,0892), nije utvrena statistiki znaajna razlika u zastupljenosti niskih vrednosti APL izmeu ispitanika sa i bez hiperleukocitoze.

DISKUSIJA

U naoj grupi ispitanika imali smo 10 bolesnika sa skorom APL 20, kod kojih je, dodatnim dijagnostikim procedurama, (punkcijom kostne sri i citogenetskim analizama), potvrdjena dijagnoza HGL. Nije bilo bolesnika sa dijagnozom PNH i AML. Kod preostala etiri ispitanika iz grupe utvren je visok skor APL. Kao razlog neutrofilije sa visokim skorom APL, kod jedne bolesnice je uvtren karcinom plua, kod druge reumatoidni artritis, dok su preostala dva bolesnika imala leukemoidnu reakciju u sklopu lokalne infekcije (apsces donje vilice), odnosno sistemske infekcije (sepsa). U naoj grupi ispitanika, na osnovu Pearsonovog testa, nismo uvtrdili korelaciju izmeu vrednosti skora APL i broja leukocita u perifernoj krvi.

ZAKLJUAK

Odreivanje skora APL je jednostavna i pouzdana metoda koja, dopunjena suptilnijim dijagnostikim procedurama, ima znaaj u diferencijalnoj dijagnozi neutrofilije u HGL od stanja praenih reaktivnom neutrofilijom. Visina skora APL u zavisnosti je iskljuivo od uzroka neutrofilije i ne korelira sa brojem leukocita periferne krvi.

LITERATURA

. LaFleur-Brooks, M. (2008).Exploring Medical Language: A Student-Directed Approach, 7th Edition. St. Louis, Missouri, USA: Mosby Elsevier. pp.398.

2. Maton, D., Hopkins, J., McLaughlin, Ch. W., Johnson, S., Warner, M. Q., LaHart, D., & Wright, J. D., Deep V. Kulkarni (1000008).Human Biology and Health. Englewood Cliffs, New Jersey, USA: Prentice Hall

3. Ronald Hoffman et al. (2005). Hematology: basic principles and practice. St. Louis, Mo: Elsevier Churchill Livingstone.

4. Stefanovi S., urednik. Hematologija. Drugo izdanje. Beograd - Zagreb: Medicinska knjiga; 1989.

5. Stefanovi S, Risti M, Jani M: Hematoloki atlas. Tree izdanje. Beograd - Zagreb: Medicinska knjiga; 1991.

6. Catovsky D. Leucocyte cytochemical and immunological techniques. In: Dacie JV, Lewis SM, editors. Practical Hematology. New York: Churchill Livingstone; 1991. p130-131.