Die Applikationsfelder optrodengest¼tzter Live-Cell

FRIEDRICH-ALEXANDERUNIVERSITÄT ERLANGEN-NÜRNBERG

TECHNISCHE FAKULTÄT

Die Applikationsfelder optrodengestützter Live‐Cell‐Mikroskopie als HCS‐Plattform im Zellkulturlabor

Der Technischen Fakultät

der Friedrich‐Alexander‐Universität

Erlangen‐Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

Dr.‐Ing.

vorgelegt von

Dipl.‐Ing. Björn Sommerfeldt

aus

Erlangen

Als Dissertation genehmigt

Von der Technischen Fakultät

der Friedrich‐Alexander‐Universität Erlangen‐Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 29.9.2014

Vorsitzende/r des Promotionsorgans: Prof. Dr.‐Ing. habil. M. Merklein

Gutachter/in: Prof. Dr. rer. nat. Rainer Buchholz

Prof. Dr. rer. nat. Andreas Wierschem

„Akzeptiere, was du nicht tun kannst, weil es so vieles gibt, was du stattdessen machen kannst“

Sam Berns (*1996 ‐ 2014)

Danksagung

Diese Dissertation resultiert aus meinen Forschungstätigkeiten am Lehrstuhl für

Bioverfahrenstechnik der Universität Erlangen‐Nürnberg unter der Leitung von Professor Rainer

Buchholz. Ich möchte Herrn Professor Buchholz an dieser Stelle für die Möglichkeit und

Bereitstellung des Themas danken. Der stetigen Diskussionsbereitschaft und dem Interesse an

meinen Forschungsergebnissen gilt dieser Dank im Besonderen.

Herrn Professor Andreas Wierschem, Herrn Professor Joachim Hornegger und Herrn Professor

Antonio Delgado danke ich für die Übernahme des Koreferats, des fachfremden Prüfers sowie des

Prüfungsvorsitzes und, dass sie somit der wissenschaftlichen Aussprache beiwohnten.

Insbesondere möchte ich mich bei den Partnern und Bearbeitern des Projekts „COSIR“ bedanken,

durch welche drei interessante Jahre der Zusammenarbeit gestaltet worden sind. Diese sind

Professor Joachim Hornegger (LME), Firas Muallah (LME), Walter Greul (AstrumIT), Simon Schöll

(AstrumIT &LME), Dr. Gernot John (PreSens), Dr. Sarina Arain (PreSens) sowie Christoph Saller

(PreSens).

Der Firma Memmert aus Schwabach danke ich für die stets sehr gut klimatisierte Unterstützung in

Form eines Inkubators.

Dr. Anna Becker danke ich im Besonderen für die aufbauenden Gespräche und das immer offene

Ohr. Tobias Weidner danke ich für die vielen Jahre, in denen wir zwar Unterschiedliches

bearbeiteten, aber oft das gleiche erlebten und die gleichen Schlüsse zogen. Danke Euch für die

letzten Jahre!

Ein besonderer Dank geht an meine Kollegen Ricarda Friebe, Juliane Richter, Josef Taucher, Ibrahim

Ahmed, Matthias Stach, Stephan Popov, Stefan Ringgeler, Konstantin Präbst, Matthias Schirmer und

Anette Amtmann für die vielen Gespräche und Anregungen.

Ein ebenso herzlicher Dank geht an meine Diplom‐, Bachelor‐ und Masterarbeiter sowie

studentischen Hilfskräfte, die mir mit ihrem Interesse und Engagement einen großen Beitrag

geleistet haben: Hannes Engelhardt, Konstantin Präbst, Fiona Rupprecht, Sophie Bindl, Bertram

Geinitz, Frank Piepenbreier, Marina Zwack, Julia Zieringer, Josef Taucher und Christian Lesko.

Der größte Dank gilt sicherlich meiner Familie und Freundin, die mich immer unterstützt haben.

Dadurch sind mir viele Steine aus dem Weg geräumt worden, wodurch ich mich auf diese Arbeit

fokussieren konnte. Danke für Alles!

INHALTSVERZEICHNIS

‐Seite I‐

INHALTSVERZEICHNIS

Inhaltsverzeichnis ..................................................................................................................................... I

Abkürzungen ........................................................................................................................................... V

Zusammenfassung .................................................................................................................................. IX

1. Einleitung ......................................................................................................................................... 1

2. Stand des Wissens ........................................................................................................................... 2

2.1. Metabolismus der eukaryotischen Zelle ................................................................................. 2

2.1.1. Glykolyse.......................................................................................................................... 3

2.1.2. Citratzyklus ...................................................................................................................... 8

2.1.3. Atmungskette ................................................................................................................ 10

2.1.4. Regeneration von zytosolischem NADH ........................................................................ 13

2.1.5. Antioxidantien ............................................................................................................... 14

2.1.6. Hypoxie .......................................................................................................................... 16

2.1.7. Zellteilung ...................................................................................................................... 19

2.1.8. Zytoskelett ..................................................................................................................... 21

2.1.9. Zelltod ............................................................................................................................ 21

2.1.10. Der Warburg‐Effekt ....................................................................................................... 25

2.1.11. Metabolischer Phänotyp von Krebszellen ..................................................................... 25

2.2. Analytik .................................................................................................................................. 26

2.2.1. Molekulare Analytik ...................................................................................................... 27

2.2.2. Instrumentelle Analytik ................................................................................................. 32

2.3. Modeltoxine .......................................................................................................................... 36

2.3.1. Ionomycin ...................................................................................................................... 37

2.3.2. Kupfer ............................................................................................................................ 37

2.3.3. Kobalt ............................................................................................................................ 37

2.3.4. Inhibition der Atmungskette ......................................................................................... 37

3. Zielsetzung ..................................................................................................................................... 40

4. Material und Methoden ................................................................................................................ 41

4.1. Allgemeine Methoden Zellkultivierung ................................................................................. 41

4.1.1. Verwendete Medienvarianten ...................................................................................... 41

4.1.2. Stammhaltung ............................................................................................................... 42

4.2. Spezielle Methoden Zellkultivierung ..................................................................................... 42

4.2.1. Trypanblauzählung ........................................................................................................ 42

4.2.2. SDR‐Messungen ............................................................................................................. 43

4.2.3. WST‐8 Proliferationsassay ............................................................................................. 43

INHALTSVERZEICHNIS

‐Seite II‐

4.2.4. Zytotoxizitäts‐Tests ........................................................................................................ 43

4.2.5. Durchflusszytometrie .................................................................................................... 44

4.2.6. Fluoreszenzmikroskopie ................................................................................................ 45

4.2.7. Wachstumskurven ......................................................................................................... 45

4.2.8. ATP‐Bestimmung ........................................................................................................... 49

4.3. Parametrisierung von Bilddaten ............................................................................................ 49

4.3.1. Bildergenerierung .......................................................................................................... 49

4.3.2. Bildauswertung .............................................................................................................. 49

4.4. Spezielle Methoden der Bioanalytik ...................................................................................... 55

4.4.1. Standards ....................................................................................................................... 56

4.4.2. Probenvorbereitung ...................................................................................................... 56

4.4.3. HPLC Methode ............................................................................................................... 57

4.4.4. MS Methode .................................................................................................................. 57

4.5. Berechnung abgeleiteter Größen .......................................................................................... 58

4.5.1. Parameter aus Rohdaten ............................................................................................... 58

4.5.2. Berechnung der Sauerstoffaufnahmerate .................................................................... 59

4.5.3. Berechnung von CORE‐Parametern .............................................................................. 59

4.5.4. Berechnung der zellbezogenen WST‐Bildung ............................................................... 60

5. Ergebnisse ..................................................................................................................................... 61

5.1. Der Sensor Dish Reader (SDR) ............................................................................................... 61

5.1.1. Kultivierung im SDR ....................................................................................................... 61

5.1.2. Bestimmung kla‐Wert für 24‐Multiwell Platten ............................................................ 65

5.2. Untersuchung des Metabolismus .......................................................................................... 66

5.2.1. Wachstumskurven‐bezogene Parameter ...................................................................... 66

5.2.2. Online‐Parameter des Metabolismus ........................................................................... 72

5.2.3. Offline‐Parameter des Metabolismus ........................................................................... 81

5.3. Beeinflussung des Metabolismus .......................................................................................... 91

5.3.1. Hemmung der Atmungskette ........................................................................................ 91

5.3.2. Induktion der ROS‐Bildung durch Kupfer .................................................................... 110

5.3.3. Induktion von Hypoxie ................................................................................................ 112

5.3.4. Störung der Calcium‐Homöostase durch Ionomycin .................................................. 114

5.3.5. Induktion von Stoffwechselwegen .............................................................................. 117

5.4. Datenerhebung aus Mikroskop‐Bildern .............................................................................. 124

5.4.1. Fluoreszenzmarkiertes Imaging ................................................................................... 124

5.4.2. Parametrisierung ungefärbter Einzelbildaufnahmen .................................................. 127

6. Fehlerbetrachtung ....................................................................................................................... 139

6.1. Allgemeine Laborgeräte ...................................................................................................... 139

6.2. Zellkultur .............................................................................................................................. 139

6.3. Wirkstoff‐Tests .................................................................................................................... 140

INHALTSVERZEICHNIS

‐Seite III‐

6.4. Durchflusszytometrie .......................................................................................................... 140

6.5. Sensor Dish Reader .............................................................................................................. 140

6.6. Probenaufbereitung für LC‐MS ........................................................................................... 140

6.7. Detektion der Analyten mit der LC‐MS ............................................................................... 141

7. Diskussion .................................................................................................................................... 142

7.1. Vergleichbarkeit der Basis‐Systeme .................................................................................... 142

7.1.1. Verhalten von Zellen in SDR und originalen Greiner Platten ...................................... 142

7.1.2. Sensitivität der SDR‐Messung ..................................................................................... 144

7.1.3. Abgleich mit Literaturdaten ........................................................................................ 145

7.2. Ableitung metabolische Phänotypen .................................................................................. 145

7.2.1. Allgemeine Phänomene .............................................................................................. 145

7.2.2. Variation von Glutamin ............................................................................................... 146

7.2.3. Serumentzug und Suspensions‐Zwang ........................................................................ 148

7.2.4. ACD und pO2,min als Indikator der Nährstofflimitierung .............................................. 149

7.2.5. ACR als Maß der Laktat‐Anreicherung ........................................................................ 150

7.2.6. OUR als Maß für die OXPHOS ...................................................................................... 153

7.2.7. Implikationen der NADH‐Regeneration ...................................................................... 155

7.2.8. Glykolyse und Zellteilung ............................................................................................. 156

7.2.9. Der Stoffwechsel von Leberzellen ............................................................................... 158

7.2.10. Oxidativer Phänotyp ‐ „primäre Zellen“ ...................................................................... 160

7.3. Optische Ausprägung metabolischer Phänotypen .............................................................. 161

7.3.1. Auswertung der Standbilder ....................................................................................... 161

7.3.2. Beurteilung der mikroskopischen Färbungen ............................................................. 173

7.4. Beeinflussung des Metabolismus ........................................................................................ 174

7.4.1. Inhibierung der individuellen Komplexe der OXPHOS ................................................ 174

7.4.2. Bestimmung des Todesmechanismus ......................................................................... 179

7.4.3. Induktion von ROS durch Kupfer ................................................................................. 182

7.4.4. Kobalt‐abhängige Hypoxie ........................................................................................... 183

7.4.5. PCD‐abhängige Hypoxie .............................................................................................. 184

7.4.6. Störung der Calcium‐Homöostase ............................................................................... 186

7.4.7. C‐Quellen Variation und gehemmte OXPHOS ............................................................. 189

7.4.8. Hypoxie‐Indikatoren durch Hemmung mit Oligomycin .............................................. 191

7.5. Zusammenfassung ............................................................................................................... 192

8. Ausblick ....................................................................................................................................... 193

9. Verzeichnisse ............................................................................................................................... 194

9.1. Abbildungsverzeichnis ......................................................................................................... 194

9.2. Tabellenverzeichnis ............................................................................................................. 199

9.3. Literaturverzeichnis ............................................................................................................. 201

9.4. Betreute wissenschaftliche Arbeiten und Ergebnisse ......................................................... 212

INHALTSVERZEICHNIS

‐Seite IV‐

10. Anhang..................................................................................................................................... 212

10.1. Geräte und Chemikalien .................................................................................................. 212

10.2. Wachstumskurven ........................................................................................................... 217

10.3. OUR Graphen ................................................................................................................... 263

10.4. ACR Graphen ................................................................................................................... 266

10.5. WST Graphen ................................................................................................................... 270

10.6. Glucose ............................................................................................................................ 276

10.7. Laktat ............................................................................................................................... 282

10.8. FACS Daten ...................................................................................................................... 285

ABKÜRZUNGEN

‐Seite V‐

ABKÜRZUNGEN

2PG 2‐Phosphoglycerat

3PG 3‐Phosphoglycerat

7‐AAD 7‐Aminoactinomycin

ACD area cell density; Flächenzelldichte

ACR acidification rate; Ansäuerungsrate

ADP Adenosindiphosphat

Akt Protein Kinase B

AMP Adenosinmonophosphat

AMPK AMP‐aktivierte Proteinkinase

Asc/AscH Ascorbat/Ascorbinsäure

atm Atmosphärendruck

ATP Adenosintriphosphat

Bcl‐2 B‐cell lymphoma 2

BPG Bisphosphoglycerat (1,3 und 2,3BPG)

CA Carboanhydrase

CdK Cyclin‐dependent kinase; Zyklinabhängige Kinase

CHO chinese hamster ovary

CK Creatin‐Kinase

CoA Coenzym A

COSIR Combination of Optical Sensors and Image Recognition

Cr Creatin

CrP Creatin‐Phosphat

DDR Discoidin domain receptor

DHAP Dihydroxyacetonphosphat

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNP 2,4‐Dinitrophenol

ER Endoplasmatisches Reticulum

F1,6BP Fructose‐1,6‐bisphosphat

F2,6BP Fructose‐2,6‐Bisphosphat

F6P Fructose‐6‐phosphat

FIH Factor Inhibiting HIF

FKS Fötales Kälberserum

FMN Flavinmononukleotid

G3P, Glyc‐3P Glycerin‐3‐phosphat

G6P Glucose‐6‐phosphat

G6PD Glucose‐6‐phosphat‐Dehydrogenase

GDP Guanosindiphosphat

GIDH Glutamatdehydrogenase

Glc Glucose

Gln Glutamin

GLS Glutaminase

GLUT Glucosetransporter

GOT Glutamat‐Oxalacetat‐Transaminase

ABKÜRZUNGEN

‐Seite VI‐

GPT Glutamat‐Pyruvat‐Transaminase

GSH Glutathion, reduzierte Form

GSSG Glutathion, oxidierte Form

GTP Guanosintriphosphat

GZZ Gesamtzellzahl

Ha Hatta‐Modul

HeLA Henrietta Lacks, Zelllinie aus Epithelzellen eines Zervixkarzinoms

HepG2 Hepatocellular carcinoma, Zelllinie

HIF‐1 Hypoxie‐induzierter Faktor

HMP‐Shunt Hexose‐Monophosphat‐Shunt

HX Hypoxanthin

IC Inhibitorische Konzentration

IDH Isocitrat‐Dehydrogenase

ILGF Insulin‐like growth factor; insulinähnlicher Wachstumsfaktor

kla volumenbezogener Stoffübergangskoeffizient

Lac Laktat

LC Letale Konzentration

LDH Laktatdehydrogenase

LZZ Lebendzellzahl

MCF‐7 Michigan Cancer Foundation ‐ 7, Zelllinie

MCT Monocarboxylat‐Transporter

mPMS 1‐Methoxy Phenazinmethosulfat

MPTP Mitochondrial Permeability Transition Pore

MTT 3‐(4,5‐Dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐diphenyltetrazoliumbromid

NAD+/NADH Nicotinamidadenindinukleotid oxidierte/reduzierte Form

NADP+/NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat oxiderte/reduzierte Form

ODD oxygen dependent domain

OUR oxygen uptake rate; Sauerstoffaufnahmerate

OXPHOS Oxidative Phosphorylierung; Atmungskette

PCD peak cell density; maximale Zelldichte in Wachstumskurve

PDH Pyruvatdehydrogenase

PDK Pyruvatdehydrogenase‐Kinase

PEP Phosphoenolpyruvat

PFK1 Phosphofructokinase 1

PGAM Phosphoglyceratmutase

PGK Phosphoglyceratkinase

PHD Prolylhydroxylase‐Domain

pHe extrazellulärer pH‐Wert

pHi intrazellulärer pH‐Wert

Pi Phosphat‐Rest

PI3K Phosphoinositid‐3‐Kinase

PJ Propidiumjodid

PK Pyruvatkinase

PMET Plasma Membrane Electron Transport; Elektronen‐Transport über Plasmamembran

PPP Pentosephosphatweg

PS Phosphatidylserin

ABKÜRZUNGEN

‐Seite VII‐

pVHL Von Hippel‐Lindau Tumor Supressor

Pyr Pyruvat

qO2 Sauerstoffaufnahmerate, vgl. OUR

REACH Registration, Evaluation, Authorisation and Ristriction of Chemicals

ROS reactive oxygen species; reaktive Sauerstoffspezies

SDH Sorbitdehydrogenase

Sf Spodoptera frugiperda

SMAC Second mitochondria‐derived activator of caspases

TNFα Tumor Nekrose Faktor α UA uric acid; Harnsäure

UPR Unfolded Protein Response

Vit. Vitalität

WST‐8 (2‐(2‐methoxy‐4‐nitrophenyl)‐3‐(4‐nitrophenyl)‐5‐(2,4‐disulfophenyl)‐2H‐tetrazolium)

X Xanthin

XO Xanthinoxidase, O2 abhängig

XOH Xanthinoxidase, NAD+ abhängig

YP YO‐PRO®‐1

Einheiten

µ 1/h spezifische Wachstumsrate

A µm² Flächeninhalt

ACD h/ml flächenbezogene Zelldichte

ACRges amol l∙h⁄ Ansäuerungsrate gesamt

ACRZelle amol Zelle·h⁄ Ansäuerungsrate pro Zelle

AZI ‐ Populationen

C ‐ Circularity

c mol/l Konzentration

‐ Variationskoeffizient von

d cm Schichtdicke

, µm Abstand zwischen Zt und Zt+1

ε l mol·cm⁄ molarer Extinktionskoeffizient

‐ Ergebnis / Charakteristikum

F µm Feret Durchmesser

‐ Gewichtungsvektor

GZZ 1/ml Gesamtzellzahl

i ‐ Zeilenindex

‐ Intervall j

‐ Koordinaten Matrix

kla 1/h volumetrischer Stoffübergangskoeffizient

‐ aritm. Mittel aller p ,

, ‐ Normierte Distanz

‐ Größter Spaltenvektor aus

µm Länge zwischen Pm3 und Pm1

LZZ 1/ml Lebendzellzahl

ABKÜRZUNGEN

‐Seite VIII‐

‐ Gewichtungsmatrix

‐ Gewichtete Häufigkeitsmatrix

n mol Stoffmenge

ni mol Zelle·h⁄ CORE‐Parameter

OTR mol l·h⁄ Sauerstofftransferrate

OURges mol l·h⁄ Sauerstoffaufnahmerate gesamt

OURZelle /qO2 pmol Zelle·h⁄ Sauerstoffaufnahmerate pro Zelle

p ‐ Anzahl eindeutiger Werte

PCD 1/ml maximale Zelldichte

Pm1 ‐ Punkt 1 von Dreieck m

pO2 %atm Sauerstoffpartialdruck

po2,min %atm minimaler Sauerstoffpartialdruck

Px px Pixel

R ‐ Roundness

‐ Punkt‐Längen Matrix

ra µm Radius gemäß kleine Achse Ellipse

rf µm halber Feret Durchmesser

rk µm Radius des flächengleichen Kreises

rR µm Radius gemäß Roundness

S(x,y) ‐ Flächenschwerpunkt

SI ‐ SI‐Index

‐ Standardabweichung von ,

td h Verdopplungszeit

‐ Ergebnismatrix tri

‐ normierter Mittelwertsvektor

, ‐ Formvektor

‐ normierter Mittelwertsvektor

‐ Gewichtungsvektor

‐ Gewichtungsfaktor AZI

X ‐ Anteilsvektor

‐ Anteil von Population AZI

Xt 1/ml Zellkonzentration zum Zeitpunkt t

, ‐ Häufigkeit von , in

, ‐ normierte Häufigkeit

Zt ‐ Zelle t

ZUSAMMENFASSUNG

‐Seite IX‐

ZUSAMMENFASSUNG

Auf Grund sinkender Zahlen neu zugelassener Medikamente setzt ein Umdenken in der Wirkstoffforschung ein. Ein Trend geht hierbei zur Intensivierung von High‐Content‐Screening Verfahren. Durch den Einsatz lebender Zellkulturen ist eine Target‐Identifizierung nachranging und es können gleichzeitig mehrere Zielstrukturen mit einem Wirkstoffkandidaten angesprochen werden. Komplett automatisierte Zellkulturplattformen sind erhältlich, jedoch auf Grund der Kosten und Komplexität nicht für alle Labore ökonomisch sinnvoll einzusetzen. Diesen Bedarf versuchen neu entwickelte Systeme zu decken. Dabei ist es ein Ansatz, existierende Strukturen dieser Labore zu nutzen und somit Inkubator taugliche Kleinst‐Mikroskope zu konzipieren. Das von der Bayerischen Forschungsstiftung geförderte Projekt „COSIR“ greift diese Thematik auf. Ziel des Projektes ist die Entwicklung eines Inkubator‐tauglichen Mehrkanal‐Mikroskops, welches darüber hinaus mit Sauerstoff und pH‐Sensoren ausgestattet ist.

Um mögliche Applikationen eines solchen COSIR‐Gerätes aufzuzeigen, werden für diese Arbeit zwei Arbeitsschwerpunkte gewählt und durch weiterführende analytische und instrumentelle Methoden in den Labor‐Alltag integriert. Zum einen werden Medienvariationen an verschiedenen Zelllinien und zum anderen exemplarische Wirkstoffscreenings durchführt, um die grundsätzliche Eignung zu belegen.

Thematisch orientiert sich das an der aktuellen Diskussion des Warburg‐Effektes. Hiervon lassen sich gemäß der Hypothese metabolische Phänotypen ableiten, die sich nach oxidativen und proliferativen Typen unterscheiden lassen. Gemäß des Warburg‐Hypothese verhalten sich immortalisierten Krebszelllinien stark proliferativ. Dies äußert sich durch eine starke Korrelation des beobachteten Wachstums mit dem gemessenen Glucoseverbrauch und der entsprechenden Laktat‐Bildung. Es kann hier gezeigt werden, dass diese Messwerte indirekt über den Sauerstoffbedarf einer Zelle und deren Ansäuerungsverhalten abgeleitet werden können. Denn es ergibt sich für viele der eingesetzten Zelllinien ein Zusammenhang zwischen der oxidativen Phosphorylierung und dem gemessenen Partialdruck. Eine Ausnahme bilden Zellen, welche einen starken extrazellulären Sauerstoffbedarf über den PMET (Plasma Membrane Electron Transport) zeigen. Ebenso ergibt sich ein tendenzieller Zusammenhang zwischen der Ansäuerungsrate und der daraus resultierenden Laktatbildung über den zugehörigen Protonen‐Symport. Es kann gefolgert werden, dass die Zellen des proliferativen Typs ein sehr starkes Wachstum bei hohem Substratverbrauch zeigen. Entsprechend der notwendigen schnellen NADH‐Regenerierung wird Laktat gebildet. Oxidative Phänotypen zeigen kein bzw. ein geringes Wachstum, wobei der Sauerstoffbedarf pro verbrauchtes Substrat erhöht ist. Das lässt den Schluss einer gesteigerten Nutzung der Atmungskette zu.

Die variablen Größen der Medienoptimierung sind Glutamin und FKS in verschiedenen Basismedien. Eine Erhöhung der Glutamin‐Konzentration bedingt zunächst eine Steigerung der Wachstumsrate. Durch weitere Erhöhung dieser Aminosäure tritt eine Minderung ein, was auf das Folgeprodukt Ammonium zurückzuführen ist. Da Glutamin oft als Laktat ausgeschleust bzw. als Bausteinmolekül benötigt wird, führt eine Erhöhung in vielen Fällen zu einer gesteigerten PCD bzw. zu einem geringeren pHmin, wodurch die Versuche stimmig mit der Literatur sind.

Durch die gezielte Beeinflussung des Metabolismus ist es möglich einzelne Sensoren des COSIR‐Systems gezielt anzusprechen. So zeigen die Ergebnisse eine erhöhte Ansäuerung, wenn die Kultur unter dem Einfluss von Kobalt steht und Hypoxie‐ähnliche Mechanismen ausgelöst werden. Durch die Anwendung von Ionomycin wird die Stoffwechselleistung durch Steigerung des intrazellulären Calciums erhöht. Die anzunehmende Ursache liegt in der Calcium‐Abhängigkeit von den Dehydrogenasen des Citratzyklus. Eine übermäßige Steigerung des Ca2+ führt zum induzierten Zelltod, welcher ebenso nachgewiesen worden ist.

ZUSAMMENFASSUNG

‐Seite X‐

Die Hemmung der individuellen Komplexe der Atmungskette wirkt sich auf die gemessene Sauerstoffaufnahmerate (OUR) aus. Durchflusszytometrische Methoden zeigen zudem die Initiierung Apoptose‐bezogener Signalkaskaden.

Hierdurch kann Oligomycin weiter charakterisiert und zur Beeinflussung von Stoffwechselwegen herangezogen werden. Die Zelle wird durch die inhibierte Atmungskette bspw. zur Energiegewinnung über die Glykolyse gezwungen. Das beeinflusst den ATP‐Level der Zellen in einer frühen Phase nach der Wirkstoffgabe. Eine eigens für die Untersuchung von Hypoxie‐Markern entwickelte LC/MS‐Methode zeigt, dass Oligomycin zwar die Zelle inhibiert, jedoch keine typische (gesteigerte) Hypoxie auslöst. Denn bspw. der Umsatz von Hypoxanthin zu Harnsäure bleibt intakt.

Aus dem projektierten Aufbau haben sich für das Live‐Cell‐Imaging Herausforderungen ergeben. Es wird ausschließlich auf durchlichtmikroskopische Techniken mit einer einfachen Optik zurückgegriffen. Somit stehen der Auswertung ausschließlich Hellfeldbilder zur Verfügung. Eine Motivation dieser Arbeit ist es gewesen, Möglichkeiten zu entwickeln, welche biologischen Daten aus den vorliegenden Bilddaten erhoben werden könnten. Dabei zeigt sich, dass durch die Auswertung von Zellform und Zelldistanz (Einzelzell‐, Monolayer‐ und Agglomerations‐Charakteristikum) interessante Aspekte extrahiert werden können. Diese lassen sich mit den Wachstumsphasen und wichtigen Eckdaten der Medien‐ und Zellanalytik kombinieren. In einigen Fällen ähnelt das gemessene Agglomerat‐Charakteristikum den Vitalitätsdaten. Zwar sind die absoluten Daten unterschiedlich, doch besitzen die zeitlichen Änderungen Kohärenz. Somit können auffällige Zeitpunkte in Verbindung mit wirksamen Konzentrationen identifiziert und in der Folge der weiterführenden Analytik zugeführt werden.

Somit sind in dieser Arbeit relevante Beispielfälle dargelegt, die die Tauglichkeit dieser Sensor‐Kombination belegen und zur weiteren Entwicklung im Bereich der Automatisierung motivieren. Ein für das HCS wichtiger Aspekt ist die Merkmals‐Extraktion aus Mikroskop‐Bildern. Hier könnten zukünftige Arbeiten die Datenverarbeitung intensivieren.

ZUSAMMENFASSUNG

‐Seite XI‐

Abstract

Due to the fact that the quantity of newly approved drugs is decreasing, rethinking in drug discovery is in discussion. One tendency is to intensify the High‐Content‐Screening‐approach. Through application of living cells target‐identification is subordinated and it is additionally possible to address more than one target with one drug candidate. Completely automated cell culture systems are available; however they are expensive und very complex therefore being uneconomical for some laboratories. Newly engineered systems try to cover the demand. One approach is to use the existing infrastructure of a lab and to develop small‐scale microscopes to run inside an incubator. The project “COSIR”, which was founded by the Bavarian Research Foundation, follows this idea. It aims to build an incubator‐suitable multichannel microscope, which is additionally equipped with oxygen and pH‐sensors.

Two possible application fields for such a COSIR‐module were selected as a main focus for this thesis. First, suitability of the designed system for the media optimization was examined. Next, its application for drug screening was tested. Moreover, these works were integrated in daily lab routine by expending the analytical and instrumental methods.

The work presented here was based on current discussion of Warburg’s effect. According to this hypothesis different metabolic cell phenotypes could be deflected. Hence oxidative and proliferative phenotypes are considered. Referred to Warburg’s effect immortalized cancer cell lines are of a proliferative type. This is expressed by the strong correlation of observed growth, glucose consumption and resulting lactate production. Proof can be provided that these observations are linked to oxygen demand of cells and their acidification rate, which can be shown here. There is a strong relationship between the oxidative phosphorylation and oxygen partial pressure. One exception is delivered by cells, which provide a large extracellular oxygen usage by PMET (Plasma Membrane Electron Transport). Furthermore lactate exclusion tends to result in the majority of the acidification because of the proton‐symport. This leads to the conclusion that cells of the proliferative type indeed show high growth rates together with high nutrition demand. Accordingly they have the prerequisite for fast NADH‐recycling via lactate. Oxidative phenotypes tend to appear with slow growth or no growth at all, at which oxygen consumption per metabolized substrate is maximized. This leads to the conclusion that the respiratory chain is highly utilized.

The variable values of the optimization experiments described above are glutamine and FCS in different media. An increasing concentration of glutamine leads initially to an increase in growth rate. Further increase causes a drop due to the toxic byproduct ammonium. Glutamine is often discharged in form of lactate or used as a building block molecule. Thus a raise in concentration ends in higher cell densities or lower observed pHmin, which is consistent with literature.

When specifically targeting metabolism, it was possible to provoke a certain response of one individual COSIR‐sensor. Hence, a higher acidification results from the application of cobalt on a cell culture, which mimics hypoxia to a large degree. Experiments with ionomycin showed increased metabolism via raised intracellular calcium concentrations as a possible explanation. Excessive increase in calcium levels conducts cell death, which was also demonstrated.

Inhibition of individual complexes of the respiratory chain has an impact on monitored oxygen uptake rate (OUR). Cytometric methods indicate further initiation of apoptosis‐related signal cascades. With this knowledge, oligomycin can be utilized to study its impact and use it to induce certain metabolic pathways. Due to inhibited respiratory chain cells are now forced to use glycolysis for energy generation. This affects ATP‐levels of the cells in an early phase of drug application. The data obtained by an ad‐hoc method for analysis of hypoxia marker molecules suggests, that oligomycin inhibits the cell but does not mimic hypoxia, as i.e. hypoxanthine was still converted to uric acid.

ZUSAMMENFASSUNG

‐Seite XII‐

A consequence of the planed hardware is a challenge for Live‐Cell‐Imaging. Solely transmitted light techniques with simple optics were applied. This means that only bright field images are available. So a further intention of this work is to offer ideas, which data can be generated from such a source. Evaluation of the cell’s morphology and distance to its neighbours (single cell‐, monolayer and agglomeration‐feature) parameters were extracted. These parameters can be allocated to data from media analysis or sensors like pH. The outcome was an interesting correlation between important changes in growth phases and course of the graph.

Concluding, this work gives a summary of applications expressing the advantages of this sensor‐combination. It motivates for further investigations in the field of process automation. Feature extraction from microscopy images showed to be an issue, so data processing and drug testing experiments should be intensified in future work.

EINLEITUNG

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1. EINLEITUNG

In den letzten zwei Jahrzehnten zeigt die Zulassung neuer Medikamente gegensätzliche Effekte. Zum einen sinken die Zulassungszahlen und zum anderen steigen die Entwicklungskosten [Laufer et al. 2013]. Das führt dazu, dass die aktuellen Methoden der Wirkstoff‐Forschung in der Diskussion stehen. Weit verbreitet sind heutzutage Verfahren, welche molekulare Targets in High‐Throughput‐Screenings (HTS) auf Wechselwirkungen mit Substanzen großer Datenbanken testen. Das erfordert zunächst die Identifizierung eines Targets und die Ableitung eines HTS‐tauglichen Assays. Ein Assay ist erfolgreich, wenn ein Wirkstoffkandidat gefunden wird. Diese sogenannte Leitstruktur kann in der Folge chemisch modifiziert und somit in der eigentlichen Wirkung optimiert werden. Erst danach beginnt die präklinische Phase am Tier, um eine Abschätzung für den Einsatz am Menschen zu erhalten. Verläuft diese positiv, können klinische Studien mit dem Ziel der Zulassung durchgeführt werden.

Davon unterscheidet sich das Phänotypen‐Screening. Die Besonderheit liegt darin, dass keine vorherige Target‐Identifizierung notwendig ist, sondern, sofern eine Plattform besteht, die Substanzen direkt getestet werden können. Möglich wird dies durch den Einsatz lebender Zellen. Somit werden auch kombinierte Wirkungen einer Substanz an verschiedenen Wirkorten innerhalb der Zelle erfasst. Eine Target‐Identifizierung kann somit nach Zulassung erfolgen. Betrachtet man das retrospektiv, hat es nahezu 100 Jahre gedauert das Target von Aspirin® aufzuklären, während es jedoch bereits als Medikament zur Anwendung gekommen war. Innerhalb des Phänotypen‐Screenings werden Parameter wie die Morphologie‐Änderung, die Apoptose‐Induktion, das Abtöten von Krebszellen, die metabolische Aktivität oder die Zell‐Motilität herangezogen [Zheng et al. 2013]. Nicht selten werden hierzu automatisierte Plattformen mit Durchflusszytometern oder Fluoreszenzmikroskopen eingesetzt, was zur Abgrenzung als High‐Content‐Screening (HCS) bezeichnet wird.

Ein Großteil der getätigten Investitionen in Wirkstoffkandidaten aus HTS‐Verfahren gingen bis zur klinischen Phase verloren, da sie die Erwartungen nicht erfüllen konnten. Laufer et al. merken an, dass etwa die Hälfte der neuen Medikamente aus den USA stammt. Von diesen entspringen wiederrum 60 % von Universitäten oder damit assoziierten, kleinen Unternehmen. Daraus leiten sie ab, dass auch in Deutschland zukünftig Spin‐offs für die neuen und innovativen Wirkstoffe verantwortlich sein werden [Laufer et al. 2013]. Um diesen Trend zu unterstützen, besteht ein reges Entwicklungsaufkommen für Inkubator‐taugliche Mikroskope. Diese belegen die Nische zwischen kostenintensiven Robotik‐Plattformen und manueller (Fluoreszenz‐)Mikroskopie. Durch den steigenden Automatisierungsgrad werden der Arbeitsaufwand und die Kosten gesenkt. Somit sind diese HCS‐Systeme aussichtsreiche Kandidaten für die zukünftige Wirkstoffforschung.

Das von der Bayerischen Forschungsstiftung finanzierte Vorhaben „COSIR“ ist als ein modulares HCS‐System konzipiert. Dabei greift es auf Sensoren zur Sauerstoff‐ und pH‐Messung zurück (Fa. PreSens; Regensburg) und soll diese mit einem Miniatur‐Mikroskop hinsichtlich ihrer Aussage kombinieren.

Ausgehend von den durch „COSIR“ messbaren Daten, werden in der vorliegenden Arbeit daraus abgeleitete Parameter dargestellt. Es werden Modell‐Versuche mit Substanzen durchgeführt und vor dem Hintergrund der bekannten biochemischen Zusammenhänge diskutiert. Die Auswertung erfolgt darüber hinaus mit zusätzlichen Referenzsystemen, um das „COSIR“‐Konzept in ein reales Labor‐Umfeld zu integrieren. Das soll Möglichkeiten der Auswertung und Automatisierung aufzeigen. Der heutige Stand der Technik erlaubt es in kurzer Zeit sehr große Datenmengen zu generieren. Eine objektive Datenverarbeitung aus diesen Parametern ist noch nicht in allen Bereichen zufriedenstellend gelöst, so dass hier ein hohes Innovationspotential gerade im Bereich der Bildverarbeitung zu erwarten ist.

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2. STAND DES WISSENS

Jede aktive Zelle eines Organismus hat generell betrachtet drei Wahlmöglichkeiten: sie kann sich teilen, spezialisieren oder sterben. Die Regulation darüber ist zur Ausbildung eines komplexen Organismus entscheidend. Alleine gesehen ist keine von diesen drei Möglichkeiten zielführend. Im korrekten Zusammenspiel ermöglichen sie das Leben und Überlegen aller höheren Spezies.

2.1. Metabolismus der eukaryotischen Zelle

Um das Fortbestehen der Zelle(n) zu sichern, werden Nährstoffe zur Energiegewinnung und für Biosynthesen benötigt. Hierzu durchlaufen energiereiche Edukte wie bspw. Glucose ein komplexes System an Reaktionskaskaden, aus welchen Energieäquivalente oder Vorläufermoleküle hervorgehen. In einzelne Reaktionswege aufgegliedert, handelt es sich hierbei um:

die Glykolyse,

den Citratzyklus,

und die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS).

Diese drei großen Pathways sind untereinander eng verknüpft und in ein hoch reguliertes Netzwerk integriert. Abhängig von den Anforderungen an die Zelle, kann die Ausbeute der Produkte gesteuert werden. Abbildung 2‐2 setzt diese Hauptwege mit dem für diese Arbeit relevanten Netzwerk in Bezug. Der allgemeine Ablauf lässt sich demnach wie folgt beschreiben.

Ein Molekül Glucose wird zunächst über Glucose‐Transporter (GLUT) in die Zelle eingebracht und dort durch die Glykolyse prozessiert. Wird dieser Prozess komplett durchlaufen und nichts durch Nebenreaktionen, wie bspw. für den Aufbau von Phospholipiden, hieraus abgezogen, so stehen am Ende zwei Moleküle Pyruvat. Diese werden in der Folge auf unterschiedlichen Wegen weiter verwertet. Eine bedeutende Möglichkeit ist der mitochondriale Umsatz innerhalb des Citratzyklus zu NADH und CO2. Durch eine enge Verknüpfung mit der oxidativen Phosphorylierung, wird das mitochondriale NADH unter Sauerstoffverbrauch weiter zu ATP umgesetzt und regeneriert [Löffler und Schölmerich 2008].

Innerhalb der Glykolyse entsteht zytosolisches NADH, welches zur Aufrechterhaltung ebenfalls regeneriert werden muss. Hierbei bieten sich mehrere Möglichkeiten, die sich anhand des Sauerstoffbedarfs klassifizieren lassen. Zum einen kann Pyruvat zu Laktat umgesetzt werden, was die Regeneration von der OXPHOS und Sauerstoff entkoppelt. Zu anderen ergeben sich weitere Möglichkeiten über zwei Shuttle‐Systeme: das Aspartat‐Malat‐Shuttle und Glycerin‐3‐Phosphat‐Shuttle (Glyc‐3P‐Shuttle). Letzteres überträgt die freiwerdenden Elektronen direkt über Ubiquinon auf Komplex III der OXPHOS. Der Aspartat‐Malat‐Shuttle ist teilweise in den Citratzyklus integriert und nutzt die Transaminierungs‐Reaktionen von Glutamat bzw. Glutamin. Hierdurch wird das zytosolische NADH in den Citratzyklus transportiert und ebenfalls in der OXPHOS zur ATP‐Gewinnung genutzt. Zu Letzt bietet sich eine weitere Möglichkeit durch Nutzung des Plasmamembran‐Elektronentransport (PMET). Hierbei findet ein Transport der Ladungsträger vom zytosolischen NADH über die Plasmamembran an geeignete Elektronen‐Akzeptoren statt [Löffler und Schölmerich 2008].

Neben den Transaminierungs‐Reaktionen ist Glutamat bzw. Glutamin für weitere Reaktionen bedeutend. Im Zusammenhang mit der Sauerstoffabhängigen Energiegewinnung ist Glutathion zu nennen. Hierbei handelt es sich um ein wichtiges Antioxidans der Zelle, welches radikale Sauerstoffspezies (ROS) aus Glykolyse und OXPHOS neutralisieren kann [Wu et al. 2004].

Die Bildung von Laktat ermöglicht der Zelle, den durch die freiwerdenden Protonen sinkenden, intrazellulären pH‐Wert (pHi) zu regulieren. Hierzu kann Laktat als Symport mit Protonen über Monocarbonsäure‐Transporter (MCT) aus der Zelle ausgeschleust werden. Eine alternative bieten die Carboanhydrasen (CA), welche in verschiedenen Isoformen sowohl im Zytosol, wie auch

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membrangebunden vorkommen. Im Allgemeinen katalysieren CA die Hydratisierung von CO2, welches bspw. aus dem Citratzyklus hervorgeht zu H2CO3 und zurück. CA IX ist eine membran‐assoziierten Isoform [Parks et al. 2011]. Es trägt sowohl zur extra (pHe) wie intrazellulären (pHi) pH‐Kontrolle bei [Parks et al. 2011]. Die selektive Hydrogencarbonat‐Aufnahme ermöglicht so die intrazelluläre Reaktion mit einem Proton, welches durch die CA‐Tätigkeit nun aus der Zelle transportiert werden kann [Löffler und Schölmerich 2008].

2.1.1. Glykolyse

Die Glykolyse ist der erste Schritt innerhalb der Energiegewinnung und wichtiges Drehkreuz für viele Vorläufermoleküle diverser Biosynthesen. Auf Grund der bedeutenden Abzweigungen ist diese Reaktionsfolge stark reguliert und ein essentieller Weg jeder Zelle.

Abbildung 2-1: Allgemeiner Verlauf der Glykolyse mit wichtigen Abzweigungen. Des Weiteren sind wichtige intensivierende Stimuli grün und hemmende Stimuli rot eingezeichnet (Eigene Darstellung; Quellen siehe Text).

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Abbildung 2-2: Übersicht aller in der Arbeit behandelten Reaktionskaskaden. Eigene Darstellung auf Grundlage folgender Unterkapitel (Quellen siehe Text)

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Glucose‐Transport Um Glucose in die Zelle zu transportieren bedarf es bestimmter transmembranärer Transportproteine. Diese nutzen die im Konzentrationsgradienten enthaltene Energie, um Glucose in Form eines Uniports in die Zelle zu transportieren. Im Falle der Glucosetransporter (GLUT) handelt es sich um eine größere Gruppe verschiedener Typen. Hierbei unterscheidet man Typ 1 – 3, von welchen manche insulinabhängig, andere insulinunabhängig agieren können. Inwiefern ein Transporter also Glucose in die Zelle einschleust, ist nicht ausschließlich von Insulin abhängig, sondern ebenfalls von der Affinität des jeweiligen GLUT. So wird beispielsweise GLUT4 in Fettzellen exprimiert und ist abhängig vom Insulinspiegel. Steigt mit der Glucose‐Konzentration auch der Insulinspiegel, so wird vermehrt Glucose aufgenommen, um den Glucose‐Wert im Blut zurück in einen physiologisch normalen Bereich zu bewegen. Im Falle des GLUT2, welches z.B. in Hepatozyten vorkommt, ist der Transport insulinunabhängig und besitzt gleichzeitig eine nur geringe Glucose‐Affinität (KM 17‐66 mM) [Guillam et al. 1997; Oosterveer und Schoonjans 2014]. Daher ist die Glucose‐Aufnahme über die Konzentration reguliert und wird nur bei hoher Konzentration in die Zelle aufgenommen. Dieser dient als Glucose‐Sensor und hemmt so bspw. die Speicherung von Glucose in der Leber. In fast allen Säugerzellen werden dahingegen GLUT1 und GLUT3 exprimiert [Löffler und Schölmerich 2008]. Diese haben geringe KM‐Werte (1 mM), weswegen diese eine stetige Aufnahme von Glucose in die Zelle gewährleisten (gewöhnliche Serumkonzentration 4 – 8 mM) [Rassow 2008; Lunt und Vander Heiden 2011]. Allgemein wird die Expression von Glucose‐Transportern und Enzymen der Glykolyse durch Akt‐Aktivierung erhöht [Feron 2009]. Auch über den Phosphoinositid‐3‐Kinasen‐Pathway (PI3K) wird die Glucose‐Aufnahme reguliert und ist somit von Wachstumssignalen abhängig [Lunt und Vander Heiden 2011].

Verlauf der Glykolyse In Abbildung 2‐1 ist der generelle Verlauf der Glykolyse dargestellt. Nach dem aktiven Transport der Glucose in das Zytosol der Zelle, wir die Hexose unter ATP Verbrauch durch das Enzym Hexokinase irreversibel zu Glucose‐6‐phosphat (G6P) phosphoryliert und somit zurückgehalten (trapping) [Lunt und Vander Heiden 2011]. Im darauffolgenden Schritt isomerisiert die Hexosephosphat‐Isomerase G6P zu Fructose‐6‐Phosphat (F6P). In einem zweiten ATP‐verbrauchenden Schritt wird dieses durch die Phosphofructokinase‐I (PFK‐1) zu Fructose‐1,6‐Bisphosphat (F1,6BP) umgesetzt. Die Aktivität dieses Enzyms ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt und kann allosterisch reguliert werden. Im nächsten Schritt wird F1,6BP via Adolase A einer Aldolspaltung unterzogen, so dass die Triosen Glycerinaldehyd‐3‐Phosphat (G3P) und Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) hervorgehen. Diese beiden Triose‐Formen können durch die Triosephosphat‐Isomerase ineinander umgewandelt werden. Ausgehend von G3P findet durch die von Glycerinaldehyd‐3‐Phosphat‐Dehydrogenase vermittelte Oxidation und damit verbundene Phosphatbindung ein erster Schritt der Energiekonservierung statt. Hierbei wird ein Molekül NAD+ zu NADH unter Bindung eines weiteren Phosphatrests umgesetzt. Das so gebildete 1,3‐Bisphosphoglycerat (1,3BPG) überträgt, katalysiert von der Phosphoglycerinkinase, eine Phosphatgruppe auf ein ATP‐Molekül und geht somit in 3‐Phosphoglycerat (3PG) über. Das Enzym Phosphoglyceratmutase verschiebt die verbliebene Phosphatgruppe auf C2 und bildet 2‐Phosphoglycerat (2PG). Eine Enolase katalysiert den Umsatz zu Phosphoenolpyruvat (PEP) durch Wasserabspaltung. Durch die Pyruvatkinase findet ein weiterer Schritt der Energie‐Konservierung statt, indem durch Phosphatabspaltung ein weiteres Molekül ATP gebildet wird. Das PEP geht somit in Pyruvat über [Michal 1999; Löffler und Schölmerich 2008; Rassow 2008; Phillips und Orme 2013].

Regulation der Glykolyse

Wie bereits angedeutet, handelt es sich bei der Glykolyse um einen hochregulierten Prozess. So können Intermediate oder Nebenprodukte hemmend oder begünstigend wirken. Bereits der Umsatz zu G6P wirkt sich selbst kontrollierend, indem hohe Konzentrationen G6P die Reaktion selbst hemmen. Das ist ebenso für Acetyl‐CoA der Fall. Der Metabolisierungsschritt der PFK ist sensitiv gegenüber dem ATP/AMP‐Verhältnis, worüber der Eintritt der Glucose‐Metabolite im weiteren Verlauf der Glykolyse reguliert wird [Lunt und Vander Heiden 2011]. Hohe Konzentrationen an ATP oder PEP führen dazu, dass G6P jedoch nicht weiter zu F6P reagiert. Als Alternative besteht die

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Anknüpfung an den Pentose‐Phosphat‐Weg. F6P kann entweder in F1,6BP oder F2,6BP umgesetzt werden. Wird Letzteres angehäuft, so begünstigt es seinerseits die Reaktion zu F1,6BP. Allerdings wird dieser Weg an sich durch ATP und Citrat beeinträchtigt. Hohe ATP‐Levels führen zu einer allosterischen Hemmung der PFK‐1 [Lunt und Vander Heiden 2011]. Diese Hemmung kann über Fructose‐2,6‐bisphosphat (F2,6BP) verringert werden [Michal 1999].

F2,6BP ist ein Produkt der PFK‐2, welche ebenfalls F6P umsetzt, und wird als ein Mechanismus beschrieben, wie Wachstumssignale mit der Regulation des Glucose‐Metabolismus in proliferierenden Zellen gekoppelt werden [Lunt und Vander Heiden 2011]. Phosphofructokinase‐1 (PFK‐1) wird darüber hinaus durch einen niedrigen pH‐Wert inhibiert. Das Folgeprodukt 3PG begünstigt die Reaktion von 1,3BPG zu 2,3BPG. Der abschließende Umsatz von PEP zu Pyruvat durch PK wird ebenfalls durch ATP und auch durch das Transaminierungs‐Produkt Alanin negativ reguliert [Lunt und Vander Heiden 2011]. Ein Aktivator dieser Reaktion ist das schon genannte F1,6BP [Michal 1999; Löffler und Schölmerich 2008].

Wachstumsfaktoren stellen einen Stimulus dar, welcher ebenso die Aktivität der Pyruvatkinase reguliert und somit einen Einfluss auf den Kohlenstofffluss durch die Glykolyse haben [Vander Heiden et al. 2009]. Allerdings kann die Pyruvatkinase (PK) alternativ in mehrere Isoformen gespleißt werden: L, R, M1 oder M2. Die L und R‐Isomere sind bspw. in der Leber aktiv. Die M1‐Form findet sich in vielen adulten Geweben, wohingegen die M2‐Form vor allem in sich schnell teilenden oder stark metabolisierenden Geweben lokalisiert ist. Während die PKM2 stark über obige Wege – wie ATP ‐ reguliert wird, ist es bemerkenswert, dass PKM1 im Kontrast dazu nahezu nicht reguliert arbeitet [Lunt und Vander Heiden 2011].

Abzweigungen aus der Glykolyse

Die Glykolyse beinhaltet Knotenpunkte, aus denen weitere wichtige Pathways gespeist werden. Für die Betrachtungen dieser Arbeit ist der Pentose‐Phosphatweg (PPP) zu erwähnen. Hierrüber ist die Glykolyse an der Synthese von Aminosäuren, Nukleotiden, Coenzymen und weiteren Ribose‐Intermediaten beteiligt. Beispielsweise haben insgesamt 5‐9 C‐Atome eines Purin‐Moleküls ihren Ursprung in Glucose [Lunt und Vander Heiden 2011]. Dabei stammen zwei C‐Atome der Purine von Glycin, welches aus 3PG über Serin synthetisiert werden kann und somit den Aminosäure‐Pool der Zelle beliefert [Locasale 2013]. Aus der Katalyse der Glucose‐6‐Phosphat‐Dehydrogenase (G6PD) geht unter anderem NADPH hervor. Dieses Reduktionsäquivalent ist für reduktive Biosynthesen, wie der Regeneration von GSH aus GSSG, nötig [Löffler und Schölmerich 2008]. G3P/DHAP bildet einen Teil des Glyc‐3P‐Shuttles und ist gleichzeitig ein Vorläufer zur Synthese von Phospholipiden und Triglyceriden [Metallo und Vander Heiden 2013].

Energiegewinnung aus Pyruvat

Da es sich bei Pyruvat um eine toxische aber energiereiche Verbindung handelt, ist ein Organismus bestrebt dieses entsprechend zu verwerten [Feron 2009; Hirschhaeuser et al. 2011]. Pyruvat kann zu organischen Säuren oder Alkoholen reduziert werden [Lunt und Vander Heiden 2011]. In eukaryotischen Zellen gibt es gemäß Abbildung 2‐3 mehrere Möglichkeiten. Die Zelle kann durch die Lactatdehydrogenase (LDH) Pyruvat zu Laktat umsetzen und so gleichzeitig NAD+ regenerieren. Zu welchem Anteil der Weg der Glucose über Laktat oder die OXPHOS läuft, ist von der aktiven Isoform der PK abhängig [Hirschhaeuser et al. 2011]. Zellen, welche PKM2 exprimieren, produzieren mehr Laktat und benötigen weniger Sauerstoff als jene Zellen mit der M1 Isoform [Vander Heiden et al. 2010]. Der Unterschied im Regulationsweg von PKM2 zu PKM1 liegt darin, dass PKM2 negativ über die Bindung an tyrosinphosphorylierte Proteine reguliert werden kann (z.B. als Antwort auf Signale durch Wachstumsfaktoren) [Vander Heiden et al. 2010].

Das gebildete Laktat wird aus der Zelle ausgeschleust [Lunt und Vander Heiden 2011] um den intrazellulären pH‐Wert (pHi) aufrecht zu erhalten und somit einer Hemmung durch Azidose zu entgehen [Parks et al. 2013]. Die Effektivität der Laktat‐Ausschleusung ist vom extrazellulären pH‐

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Wert (pHe) abhängig und beeinflusst somit indirekt den pHi [Parks et al. 2013]. MCT ermöglichen darüber hinaus den Laktat‐Transport zwischen individuellen Zellen [Hussien und Brooks 2011]. Damit ist Laktat kein reines Abfallprodukt, sondern kann unter bestimmten Umständen als Energielieferant dienen oder Hormon‐ähnliche Eigenschaften aufweisen [Hussien und Brooks 2011]. Laktat kann in Pyruvat unter NADH Bildung konvertiert und im Citratzyklus eingesetzt werden. Das hier entstehende NADH wird in der oxidativen Phosphorylierung zur ATP‐Produktion genutzt [Hussien und Brooks 2011]. Dies kann über die PDH verlaufen und so die hohe ATP‐Ausbeute der oxidativen Phosphorylierung nutzen (G1 und C1 in Abbildung 2‐3). Alternative Wege Pyruvat in den Citratzyklus einzubringen, laufen über NADPH und CO2 unter Bildung von Malat (C3 in Abbildung 2‐3). Eine weitere Alternative verbraucht ATP, um Pyruvat durch die Pyruvat‐Carboxylase in der mitochondrialen Matrix zu Oxalacetat zu konvertieren (C2 in Abbildung 2‐3). Schlussendlich führt die Energiekonservierung in Form von GTP zu einer Verminderung von Pyruvat, in dem bereits dessen Vorstufe PEP zu Oxalacetat umgesetzt wird (C4 in Abbildung 2‐3). Pyruvat kann jedoch auch innerhalb des Aminosäure‐Stoffwechsels über die Alanin‐Aminotransferase in Alanin umgesetzt werden (TA2 in Abbildung 2‐3), wobei Glutamat zu α‐Ketoglutarat katalysiert wird. Dies ist im Citratzyklus von Bedeutung [Michal 1999][Lunt und Vander Heiden 2011].

Abbildung 2-3: Reaktionswege des Pyruvats (Eigene Darstellung; Quellen siehe Text)

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2.1.2. Citratzyklus

Nach Einschleusung in den Citratzyklus werden aus Pyruvat in einem Turnus zwei Moleküle CO2 und 8 Wasserstoffatome gewonnen. Letztere treten in der Form von 3 NADH einem FADH2 und einem GTP auf. Über diese Redoxäquivalente wird über die OXPHOS weiteres ATP erzeugt.

Abbildung 2-4: Der Citratzyklus und ausgewählte kata- und anaplerotische Nebenreaktionen (Eigene Darstellung; Quellen siehe Text)

Der Zyklus Der Citratzyklus beginnt gemäß Abbildung 2‐4 mit der Bildung von Acetyl‐CoA. Dies kann entweder aus dem Protein‐ oder Fettabbau entspringen oder durch oxidative Decarboxylierung aus dem Pyruvat der Glykolyse erzeugt werden. Dies geschieht über den Multi‐Enzymkomplex Pyruvatdehydrogenase (PDH), der die Bindung an das Coenzym A (CoA) vermittelt. Neben der Bildung von einem Molekül CO2 verbraucht diese komplexe Reaktion ein NAD+. Ist das Pyruvat über CoA eingeschleust und aktiviert worden, so reagiert es mit Oxalacetat unter Bildung von Citrat. Diese Reaktion wird über das Enzym Citratsynthase vermittelt. Über Aconitase wird eine Umlagerung zu

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Isocitrat katalysiert, was über das enzymgebundene Intermediat cis‐Aconitat verläuft. Die Isocitratdehydrogenase vermittelt die NAD+‐abhängige Reaktion zu Oxalsuccinat, welches instabil ist und unter CO2‐Abspaltung zu α‐Ketoglutarat zerfällt. Dieses oxidiert nun die α‐Ketoglutaratdehydrogenase zu Succinyl‐CoA (der Mechanismus gleicht dem der PDH). Im nächsten Schritt wird hieraus Succinat gebildet. Über die Freisetzung von Coenzym A wird Energie frei, welche durch die Bildung von GTP konserviert wird (Succinyl‐CoA‐Synthase). Der Kreis wird durch die Oxidation von Succinat zu dem eingangs verwendeten Oxalacetat geschlossen. Hierzu setzt die Succinatdehydrogenase Succinat zu Fumarat um, wobei FADH2 gebildet wird. Die Fumerase katalysiert die Wasseranlagerung an Fumarat und Malat entsteht. Dieses Malat wird in einer NAD‐abhängigen Oxidation durch die Malatdehydrogenase zu Oxalacetat umgesetzt [Löffler und Schölmerich 2008].

Die Regulation des Zyklus Bereits die Einschleusungsreaktion des Pyruvats wird durch NADH, sowie das zugehörige Enzym PDH, durch Acetyl‐CoA inhibiert. Die nächstfolgende Reaktion zu Citrat wird über seine Produkt und das Zyklus‐Intermediat Succinyl‐CoA gemindert. Dieses Citrat kann aus den Mitochondrien ins Zytosol transferiert werden, um die Hemmung aufzuheben und Lipide aufzubauen. Aconitase ist empfindlich gegenüber ROS und wird hierdurch in seiner Aktivität reduziert. Die Reaktionsrate von Isocitrat ist abhängig von der Konzentration der Energieäquivalente ATP und NADH. So hemmt eine hohe ATP‐Konzentration diesen Schritt, eine hohe ADP‐Konzentration ist dahingegen neben Calcium in der Lage diesen zu aktivieren. Das Calcium beeinflusst auch den nächsten Schritt zu Succinyl‐CoA positiv. Wohingegen die Produkte der Reaktion (NADH, Succinyl‐CoA) einen hemmenden Einfluss zeigen. Somit wird der Aspartat‐Malat‐Shuttle indirekt beeinflusst, da die TA1‐Reaktion in Abbildung 2‐4 durch α‐Ketoglutarat negativ reguliert wird. Einen ähnlichen Einfluss auf dieses Shuttle‐System hat die Hemmung des Komplexes II der OXPHOS durch Malonat. Das hierdurch auflaufende Succinat setzt die Umsatzrate zu Aspartat (TA1 in Abbildung 2‐4) herab [Michal 1999].

Kata‐ und anaplerotische Reaktionswege Eine wichtige Aufgabe des Citratzyklus ist die indirekte ATP‐Produktion über die Oxidation des Substrats zu CO2 und die damit einhergehende NADH Bildung. Allerdings dient dieser Zyklus in proliferierenden Zellen als eine wichtige Quelle von zellulären Vorläufer‐Molekülen [Lunt und Vander Heiden 2011]. Der Prozess der Entnahme von Intermediaten wird unter den kataplerotischen Reaktionen zusammengefasst. Im Zytosol wird Citrat zu Acetyl‐CoA und Oxalacetat umgesetzt [Feron 2009]. Dadurch wird ein Großteil der Fettsäureproduktion über Glucose gewährleistet [Vander Heiden et al. 2009]. Ein hoher Prozentsatz des Membran‐Kohlenstoffs sowie des Mevalonats – einem Cholesterin‐Vorgänger ‐ leitet sich aus Acetyl‐CoA ab. Darüber hinaus können Oxalacetat und α‐Ketoglutarat in vier nicht‐essentielle Aminosäuren (Aspartat, Asparagin, Glutamat und Prolin) umgesetzt werden [Lunt und Vander Heiden 2011]. Die zytosolische Isocitrat‐Dehydrogenase (IDH1) ist neben dem Pentose‐Phosphat‐Weg eine Quelle von NADPH, wobei sie Isocitrat in α‐Ketoglutarat überführt [Lunt und Vander Heiden 2011].

Werden beispielsweise Aminosäuren in den Zyklus eingeschleust, so wird dies als anaplerotische Reaktion bezeichnet [Lunt und Vander Heiden 2011]. Einen wichtigen Beitrag hierzu leistet Glutamin, wie in Abbildung 2‐5 zu sehen ist. Dies wird zu Glutamat über das Enzym Glutaminase (GLS1) desaminiert, was den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Glutamin‐Verwertung darstellt [Cantley und Shaw 2012]. In einem folgenden Schritt wird über Transaminase‐Aktivität Glutamat zu α‐Ketoglutarat umgesetzt. Die Aminogruppe geht hierbei unter Bildung von Alanin auf Pyruvat über (TA1/2 in Abbildung 2‐5). Dabei ist es eine wichtige Anforderung toxische Ammonium‐Levels zu vermeiden [Feron 2009]. Glutamin stellt dennoch eine wichtige Stickstoffquelle dar und kann in Laktat umgesetzt werden, wobei NADPH gebildet wird. Dieser Weg führt über Oxidationsreaktionen zu Malat, welches zu Pyruvat umgesetzt wird [Lunt und Vander Heiden 2011]. Gleichzeitig stellt die Glutaminolyse die Synthese von Purinen und Pyrimidinen aus Ribose sicher [Feron 2009] und ist neben Glucose eine wichtige Quelle für den Kohlenstoff der Fettsäuren [Lunt und Vander Heiden

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2011]. Im Allgemeinen können Aminosäuren über Pyruvat, Acetyl‐CoA, Acetoacetyl‐CoA, α‐Ketoglutarat, Succinyl‐CoA, Fumarat und Oxalacetat in den Citratzyklus eintreten und verwertet werden [Lunt und Vander Heiden 2011].

Somit kann auch der Citratzyklus neben dem Pentose‐Phosphat‐Weg einen hohen Precursor‐Pool zur Verfügung stellen und durch alternative Quellen gespeist werden [Hirschhaeuser et al. 2011]. Das gilt insbesondere für die Aminosäure Glutamin, welcher in dieser Arbeit eine wichtige Rolle zukommt. Abbildung 2‐5 fasst die wichtigsten Senken zusammen.

Abbildung 2-5: Reaktionswege des Glutamins (eigene Darstellung, Quellen siehe Text)

2.1.3. Atmungskette

Die Atmungskette ist der dritte große Bereich des Energiestoffwechsels. Hierbei impliziert die Bezeichnung ihrerseits bereits den eigentlichen Verlauf. Es handelt sich um eine Kette aufeinanderfolgender Redox‐Reaktionen, die Sauerstoff verbrauchen und Energie liefern.

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Die Kettenreaktion der oxidativen Phosphorylierung Unter normoxischen Bedingungen kann Pyruvat durch Aktivierung mit Acetyl‐CoA im Citratzyklus zu CO2 oxidiert werden. Die freiwerdende Energie wird (zum Teil) über die Bildung von Reduktionsäquivalenten wie NADH konserviert. Diese Reduktionsäquivalente können in der Atmungskette genutzt werden, um schließlich ATP zu synthetisieren. Lokalisiert sind diese Prozesse, wie auch bereits der Citratzyklus, in den Mitochondrien der Zelle. Die Energiegewinnung in Form von ATP geschieht durch chemiosmotische Kopplung und wird oxidative Phosphorylierung genannt. Dieser Prozess stellt bis zu 95 % der zellulären ATP‐Produktion unter aeroben Bedingungen dar (bezogen auf ein Molekül Glucose zu CO2) [Löffler und Schölmerich 2008]. Dabei werden Elektronen von Donatoren wie dem NADH über eine Reihe von Redox‐Carriern unter der Bildung von H2O auf Sauerstoff übertragen. Die bei dieser Elektronentransportkette frei werdende Energie wird genutzt, um einen Protonengradienten aufzubauen, der letztlich der Synthese von ATP aus ADP und Phosphat dient [Hatefi 1985; Petzke 1992]. Der Aufbau der Mitochondrien spielt für diesen Prozess eine große Rolle. Diese bestehen aus einer Matrix, die von einer doppelten Membran umgeben ist. Die äußere Mitochondrienmembran ist cholesterolreich und mit Porinproteinen besetzt, die sie für Moleküle kleiner 4 kDa durchlässig macht [Löffler und Schölmerich 2008]. Die innere Mitochondrienmembran ist weitgehend undurchlässig und cholesterolfrei. Die Impermeabelität dieser Membran ist Voraussetzung für die oxidative Phosphorylierung, da über diese Membran der Protonengradient aufgebaut wird [Schellhaas 2012]. Der Elektronentransport erfolgt über mehrere große Multiproteinkomplexe, die nach aktuellen Erkenntnissen auch zu sog. Superkomplexen zusammengelagert sein können. Die Transportkette, schematisch dargestellt in Abbildung 2‐6, ist in fünf Komplexe eingeteilt [Löffler und Schölmerich 2008]. In nachfolgendem Abschnitt wird die Funktionsweise der Atmungskette durch detaillierte Betrachtung der einzelnen Komplexe näher erläutert.

Abbildung 2-6: Der Verlauf der Atmungskette (Eigene Darstellung, Quellen siehe Text)

Komplex I

Dieser Proteinkomplex wird auch als NADH‐Ubichinon‐Oxidoreduktase bezeichnet. In Säugetier‐Mitochondrien besteht dieser L‐förmige Komplex aus 46 verschiedenen Proteinen mit einer Masse von insgesamt fast 1.000 kDa [Brandt 2006]. Dieser Komplex stellt die Eintrittspforte der Elektronen in die Atmungskette dar und begünstigt die Übertragung von Elektronen über Flavinmononucleotid (FMN) und Eisen‐Schwefel‐Clustern auf Ubichinon. Dabei werden für jedes Elektronenpaar vier Protonen aus der Mitochondrienmatrix in den Intermembranraum (IMT) gepumpt [Löffler und Schölmerich 2008].

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4 → 4

Komplex II

Die Succinat‐Ubichinon‐Oxidoreduktase bildet Komplex II. Dieser besteht bei Säugern aus vier Untereinheiten und ist wesentlich kleiner als Komplex I. Die beiden hydrophilen Untereinheiten dieses Enzymkomplexes entsprechen dem Enzym Succinat‐Dehydrogenase (SDH) aus dem Citratzyklus. Dies bedeutet, dass Elektronen von Succinat aus dem Citratzyklus über das gebildete FADH2 auf Ubichinon übertragen werden. Dabei findet kein Protonentransport über die innere Mitochondrienmembran statt. Für den Elektronentransport sind wieder Eisen‐Schwefel‐Cluster sowie ein Hämb560‐Zentrum verantwortlich [Sun et al. 2005; Löffler und Schölmerich 2008].

→

Komplex III

Die Ubihydrochinon‐Cytochrom c‐Oxidoreduktase, auch als bc1‐Komplex bezeichnet, besteht aus elf Untereinheiten und bildet den Komplex III. Drei dieser Untereinheiten, Cytochrom b, Cytochrom c1 sowie das Rieske‐Eisen‐Schwefel‐Protein, bilden den katalytischen Kern. Der Enzymkomplex katalysiert die Elektronenübertragung von Ubihydrochinon auf Cytochrom c, wobei wieder Protonen über die innere Mitochondrienmembran gepumpt werden [Löffler und Schölmerich 2008].

2 2 → 2 4

Obwohl hier formal vier Protonen im Intermembranraum freigesetzt werden, bedingt die Ladungsbilanz lediglich die Freisetzung von zwei Protonen pro oxidierten Ubihydrochinon. Die beiden Protonen werden durch Aufnahme von zwei Elektronen durch das auf der gleichen Membranseite befindliche Cytochrom c kompensiert [Löffler und Schölmerich 2008].

Komplex IV

Die Cytochrom c‐Oxidase (Komplex IV) besteht in Säugermitochondrien aus 13 Untereinheiten. Davon bilden drei den katalytischen Kern. Die Elektronenübertragung erfolgt über zwei Häm‐Zentren vom reduzierten Cytochrom c auf Sauerstoff. Dabei werden pro Sauerstoffatom zwei Protonen über die Membran transportiert. Die Protonenbilanz wird formal durch die beiden in Komplex III aufgenommen Protonen ausgeglichen [Löffler und Schölmerich 2008].

2 1 2 4 → 2 2

Insgesamt werden durch die Komplexe I bis IV pro Mol oxidiertem NADH zehn Protonen über die innere Mitochondrienmembran gepumpt. Wird Komplex I umgangen oder inhibiert, verringert sich diese Zahl auf sechs [Löffler und Schölmerich 2008].

Komplex V

Die F1F0‐ATP‐Synthase ist ein aus 16 Untereinheiten bestehender Proteinkomplex und bildet den Komplex V. Dieser synthetisiert aus dem durch die Komplexe I, III und IV erzeugten Protonengradienten ATP. Die Untereinheiten bilden den membranständigen F0‐Teil, durch den die Protonen fließen, sowie den in die Matrix hineinragenden F1‐Teil, der die Nucleotid‐Bindungsstellen enthält. Pro gebildetem ATP fließen rechnerisch 3 ⅓ Protonen zurück [Löffler und Schölmerich 2008].

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3 1 3 → 1 3

Die Protonen fließen durch den in die innere Mitochondrienmembran eingebetteten F0‐Teil und bewirken dadurch eine Drehbewegung. Diese Drehbewegung induziert eine Konformationsänderung des in die Matrix hineinragenden F1‐Teils. In dieser neuen Konformation ist der F1‐Teil in der Lage ATP aus ADP und Pi zu synthetisieren [Löffler und Schölmerich 2008].

Durch den sog. P/O‐Quotienten kann erfasst werden, wie viel Mol ATP (P) pro Sauerstoffatom (O) gebildet werden. Dabei muss berücksichtigt werden, dass der Pi‐Transport in die Mitochondrien über einen Symport mit einem Proton erfolgt. Pro Mol gebildetem ATP gelangen also netto 4 ⅓ Protonen in die Matrix zurück. Für die Oxidation von NADH durch Komplex I liegt der P/O‐Quotient bei 2,3. Für die Oxidation von Succinat bei 1,4, da hier weniger Protonen über die Membran gepumpt werden. Durch einen gewissen Anteil an unproduktivem Protonenrückstrom („leak“) sind diese Werte als Maximalwerte zu betrachten, die in vivo nicht erreicht werden [Löffler und Schölmerich 2008].

2.1.4. Regeneration von zytosolischem NADH

In der eukaryotischen Zellkultur kommen für die benannte Wertschöpfungskette zwei Substanzen besonders in Frage: Glucose und Glutamin [Vander Heiden et al. 2009]. Bezogen auf die ATP‐Ausbeute pro Molekül Glucose ist die Glykolyse mit 2 ATP der oxidativen Phosphorylierung mit etwa 34 ATP unterlegen. Bezogen auf die zeitliche Umsatzrate verhält es sich genau entgegengesetzt [Lunt und Vander Heiden 2011]. Aus der bisherigen Betrachtung ergibt sich die „Energiewährung“ der Zelle, die über verschiedene Wege bedarfsorientiert bereitgestellt werden kann zu ATP/GTP, Acetyl‐CoA, NADH oder NADPH [Metallo und Vander Heiden 2013].

Auf die Notwendigkeit der Regeneration von NADH ist bereits kurz eingegangen worden. Auf Grund des Einflusses des zytosolischen NADH auf gewichtige Assays dieser Arbeit, ist eine genauere Betrachtung notwendig.

Die Regeneration des zytosolischen NAD+ ist für die Aufrechterhaltung der Glykolyse unentbehrlich. Ohne NAD+ kann G3P nicht zu BPG umgesetzt werden. Die oxidierte Form hat Einfluss auf das CtBP1 (C‐terminal‐binding protein 1), welches in das Zellwachstum oder die Zelldifferenzierung involviert ist [Lunt und Vander Heiden 2011]. Durch den Umsatz von Pyruvat zu Laktat wird es zügig regeneriert, was einen hohen Fluss durch die Glykolyse ermöglicht [Lunt und Vander Heiden 2011]. Aus Abbildung 2‐7 gehen weitere, komplex regulierte Alternativen hervor. Über Shuttle‐Systeme können die Protonen des NADH über den Citratzyklus oder auf direktem Wege der OXPHOS zugeführt werden. Das Malat‐Aspartat‐Shuttle, welches unter Glutamat‐Verbrauch über die TA1‐Reaktion aus dem Citratzyklus hervorgeht (siehe Abbildung 2‐7), kann über entsprechende Antiporter (Aspartat/Glutamat‐Antiporter; AGC) aus der Matrix in den IMR transportiert werden. Dort wird durch die Rückreaktion aus Aspartat erneut Oxalacetat, welches durch die zytosolische Malat‐Dehydrogenase (cMDH) zu Malat umgesetzt wird. Diese kann nun erneut über einen Antiport (Malat/α‐Ketoglutarat‐Antiporter; OGC) zurück in die Mitochondrien‐Matrix transportiert werden. Hier findet innerhalb des Citratzyklus der Umsatz von Malat zu Oxalacetat statt und NADH wird in den Mitochondrien frei, wo es für die OXPHOS verfügbar ist [Barron 1998; Eto 1999; Michal 1999].

Das DHAP der Glykolyse kann zu Glyc‐3P umgesetzt werden, was NADH verbraucht. Wird Glyc‐3P nicht durch Folgereaktionen innerhalb der Phospholipid‐Synthese verbraucht, so kann es durch die mitochondriale Glycerin‐3‐phosphat‐Dehydrogenase (mGPD) zu DHAP regeneriert werden. Dadurch wird FAD zu FADH2 reduziert. Letzteres reduziert in der Folge Ubiquinon, welches seinerseits die Elektronen an den Komplex III der OXPHOS weitergibt [Michal 1999].

Abschließend ist die Reduktion der Äquivalente innerhalb des Transmembranen Elektronentransports (PMET) zu nennen. Hierbei werden die Elektronen über die Plasmamembran an extrazelluläre Akzeptoren übertragen und NAD+ regeneriert. Einige Quellen sprechen dem PMET

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einen deutlichen extrazellulären Sauerstoffverbrauch und damit verbundener ROS‐Bildung zu [Herst und Berridge 2007; Gray et al. 2011; Löw et al. 2012].

Abbildung 2-7: Varianten der zytosolischen NADH-Regeneration (eigene Darstellung, Quellen siehe Text)

2.1.5. Antioxidantien

Die mitochondriale OXPHOS ist eine der bedeutendsten Quellen zellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (engl.: reactive oxygen species; ROS) [Vander Heiden et al. 2009]. Entsprechend neuerer Erkenntnisse wirken sich akute Änderungen im Sauerstoffpartialdruck richtungsunabhängig in einer erhöhten ROS‐Bildung aus. Dem folgt die Theorie, dass die zelluläre Atmung für (konstant‐)physiologische Bedingungen geschaffen ist [Semenza 2010]. Um der Radikalbildung durch ROS entgegenzuwirken und Zellschäden zu vermeiden, besitzt die Zelle ein Netzwerk antioxidativer Substanzen. Das gebildete Produkt ist stabiler und unterbricht somit die Kettenreaktion, die zu einer Schädigung führt.

Glutathion Ein sehr dominierender Vertreter ist das Glutathion [Cairns et al. 2011]. Hierbei handelt es sich um ein Tripeptid (siehe Abbildung 2‐5 ), welches aus Cystein, Glycin und Glutamat besteht und innerhalb der Zelle in Konzentrationen von bis zu 5 mM vorliegt [Locasale 2013]. Der durch die γ‐Glutamylcystein‐Synthase (GCS) katalysierte erste Schritt verknüpft die γ‐Carboxylgruppe des Glutamats mit der Aminogruppe des Cysteins [Cairns et al. 2011; Lunt und Vander Heiden 2011]. Diese besondere Verbindung schützt das GSH später vor intrazellulären Peptidasen. Die zweite und abschließende Synthesereaktion, katalysiert durch die GSH‐Synthase, erzeugt eine Peptidbindung zwischen dem Glycin und dem terminalen C‐Atom [Wu et al. 2004]. Die freistehende Thiol‐Gruppe an dem Cystein ist für die biologische Aktivität des GSH verantwortlich und kann ein Elektron abgeben. Folglich ist es in der Lage mit ROS, wie z.B. H2O2, zu reagieren und diese unschädlich zu machen

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[Locasale 2013]. Die das Dimer Glutathion‐Disulfid (GSSG) aus zwei GSH‐Molekülen bildende Reaktion findet entweder katalysiert durch vier verschiedene Glutathionperoxidasen (GPx1‐4) oder nicht‐enzymatisch statt (vgl. dazu Abbildung 2‐8). Unter Verbrauch von NADPH katalysiert die GSH‐Reduktase die Rückbildungsreaktion von GSSG zu zwei GSH‐Molekülen [Vander Heiden et al. 2009; Yin et al. 2012]. Somit stellt diese Reaktion ebenfalls ein entsprechendes NADP+/NADPH‐Verhältnis für anabole Prozesse bereit [Locasale 2013]. Neben seiner Rolle als Antioxidans kontrolliert GSH den Redox‐Status sämtlicher subzellulärer Kompartimente [Cairns et al. 2011]. In den Mitochondrien ist das Verhältnis von GSH zu GSSG meist größer als 100. Der Redox‐Status kann über die Nernst‐Gleichung wie folgt berechnet werden [Yin et al. 2012]:

30 log

Das Redox‐Potential des mitochondrialen GSH/GSSG Paares ist etwa ‐300 mV [Yin et al. 2012].

Abbildung 2-8: molekulare Struktur von red. und oxd. Glutathion

Ascorbinsäure Die Ascorbinsäure (Asc) gehört der Stoffklasse der Vitamine an und weist eine planare Laktonstruktur und ‐ benachbart zu der Carbnoylgruppe ‐ zwei enolische Hydroxygruppen auf. Dieser chemische Aufbau heißt Redukton und trägt maßgeblich zu den antioxidativen Eigenschaften der Asc bei. Asc liegt unter physiologischen Bedingungen aufgrund seines pKs‐Wertes von 4,25 als Ascorbat‐Anion (AscH‐) vor [Bendich et al. 1986]. Bedingt durch seine Struktur (siehe Abbildung 2‐9) kann Asc bei Kontakt mit OH‐. oder anderen Radikalen als Radikalfänger dienen. Das nach der Redox‐Reaktion vorliegende Ascorbyl‐Radikal wird durch seine Redukton‐Struktur stabilisiert und hat eine geringere Reaktivität als die Sauerstoffradikale [Rose und Bode 1993]. Nach einer Disproportionierungsreaktion von zwei Ascorbyl‐Radikalen liegt das Asc innerhalb der Zelle wieder in seiner biologisch aktiven und in seiner vollständig oxidierten Form, der Dehydroascorbinsäure (DHA), vor. Die Regenerierung der

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DHA zurück zur Asc erfolgt enzymatisch über die NADPH‐abhängige Thioredoxin‐Reduktase oder über die Glutathion‐abhängige DHA‐Reduktase. Beide enzymatischen Prozesse benötigen final Sauerstoff für die Regenerierung der Redoxäquivalente [Wilson 2002].

Abbildung 2-9: molekulare Struktur von Vitamin C

2.1.6. Hypoxie

Das Auftreten mangelnder Sauerstoffversorgung wird als Hypoxie bezeichnet. Die Unterversorgung dient als prägnantes Signal und hat eine Vielzahl an Reaktionen zur Folge. Die Schlüsselrolle spielt dabei der Hypoxia Inducible Factor‐1 (HIF‐1). Dieser Faktor ist ein Heterodimer bestehend aus einer α‐ und einer β‐Untereinheit. Während die β‐Untereinheit unabhängig von der Sauerstoffversorgung in gleichbleibender Konzentration vorliegt, wird die α‐Untereinheit unter normoxischen Bedingungen stetig abgebaut, so dass deren Konzentration zu vernachlässigen ist [Huang et al. 1998; Semenza 2003]. Der Abbau findet statt, da die α‐Untereinheit unter normoxischen Bedingungen am Prolin‐Rest 402 (Pro‐402) und/oder Pro‐564 der oxygen‐dependent degradation domain (ODD) durch die Prolyl‐Hydroxylase „domain protein“ 1‐3 (PHD 1‐3) hydroxiliert wird. Diese Reaktion benötigt allerdings Sauerstoff, α‐Ketoglutarat als Co‐Substrat [Semenza 2010], zweiwertige Eisen‐Kationen und Ascorbat. Somit wird die Hydroxylierung von Proteinen unter Sauerstoffmangel limitierend [Wouters und Koritzinsky 2008; Lunt und Vander Heiden 2011; Weibo Luo und Gregg L. Semenza 2011; Metallo und Vander Heiden 2013]. Die Untereinheit enthält weiterhin einen Asparaginrest als Bindungsstelle für transkriptionelle Koaktivatoren, den sogenannten factor inhibiting HIF (FIH). Die Hydroxylierung der Prolin‐Reste der α‐Untereinheit ermöglicht eine Interaktion mit dem von‐Hippel‐Lindau‐Tumorsuppressor‐Protein (pVHL) [Hirschhaeuser et al. 2011].

Fehlender Sauerstoff hemmt den Abbau von HIF‐1α und führt zu dessen Akkumulation in der Zelle. Laut Carroll und Ashcroft, Hagen et al. und Berra et al. agieren Prolylhydroxylasen als Sauerstoffsensor [Berra 2003; Hagen 2003; Carroll und Ashcroft 2005]. Durch die Limitierung des Kosubstrats O2 kommt es so zu einer verminderten Hydroxylierung der α‐Untereinheit. Nach Guzy et al. wirken die PHD’s lediglich unter anoxischen (komplettes Fehlen von Sauerstoff) Bedingungen als Sensor und Signalmolekül [Guzy et al. 2005]. Es wird postuliert, dass die Ursache für die Bildung von aktivem HIF‐1 in der vermehrten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) am Komplex III der Atmungskette liegt. Voraussetzung hierfür sind intakte und vollständig funktionsfähige Mitochondrien. Die ROS dienen als Signalmoleküle und führen letztendlich zu einer Inhibierung der Prolylhydroxylasen. Dadurch wird die Anpassung der Zelle an den Sauerstoffmangel eingeleitet [Goldberg et al. 1988; Gage und Stanton 1996]. Die α‐Untereinheit wird während der Hypoxie über Translokation mit der β‐Untereinheit dimerisiert und bindet an Hypoxie‐sensitive Promotorregionen verschiedener Gene, welche die Adaption der Zelle an die Sauerstoffunterversorgung gewährleisten

HIF‐1α kann auch unter normoxischen Bedingungen durch unterschiedliche Wege stabilisiert werden. Diese sind beispielsweise Endprodukte der Glykolyse, Laktat und Pyruvat, aber auch mTOR‐Aktivierung, NAD+‐Level, ROS, Stickstoffmonooxid und viele Metabolite des Citratzyklus tragen dazu bei [Hirschhaeuser et al. 2011]. Onkogene oder inaktivierte Tumor‐Supressor‐Gene haben ebenfalls einen Einfluss hierauf [Lunt und Vander Heiden 2011]. ROS oder NO greifen in den Redox‐Zyklus des Eisens in der prosthetischen Gruppe des PHD2 ein oder konkurrieren mit den α‐Ketoglutarat um die PHD2 Reaktion; bspw. Pyruvat [Saedeleer et al. 2012].

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Folgen der Hypoxie Mit Eintritt der Hypoxie werden Gene transkribiert, die der Regulation des pH‐Wertes und der Umstellung der Stoffwechselwege dienen. Durch mangelnden Sauerstoff fehlt der finale Elektronenakzeptor bei der ATP‐Gewinnung durch OXPHOS in den Mitochondrien.

Proteinexpression

Um den Energiehaushalt aufrecht zu erhalten, wechselt die Zelle auf einen anaeroben Metabolismus. Dies geschieht durch vermehrt gebildete Pyruvatdehydrogenasen‐Kinasen (PDK) und Laktatdehydrogenase (LDH). Die PDK hemmen den Transport von Pyruvat in die Mitochondrien und verhindern so den Abbau von Pyruvat zu Acetyl‐CoA und damit dessen Einschleusen in den Zitronensäurezyklus [Kim et al. 2006; Hirschhaeuser et al. 2011; Cantley und Shaw 2012; Metallo und Vander Heiden 2013].

HIF‐1 (oder auch DNA‐Schäden) können die Aktivierung bzw. Akkumulation des Proteins p53 in Gang setzen. p53 ist ein Schlüsselprotein bei zellulärem Stress und in der Lage eine Vielzahl von „stress response pathways“ zu induzieren. So kann p53 unter anderem den Zellzyklus arretieren, um durch ROS entstandene DNA‐Schäden zu reparieren. Ferner ist es in der Lage einen programmierten Zelltod zu induzieren. Weiterhin kann Sauerstoffmangel die Öffnung der mitochondrial permeability transition pore (MTP) zur Folge haben. MTP stellt ein Kontaktelement zwischen äußerer und innerer Mitochondrienmembran dar. Unter normoxischen Bedingungen ist die Permeabilität der Pore(n) extrem niedrig, während hypoxische Konditionen die Öffnung von MTP hervorrufen. Stoffe bis zu einer Größe von 1500 Da können dann über die MTP die Membran passieren und führen so zu einem Zusammenbruch des Membranpotentials und folglich zur Inhibierung der ATP‐Synthese [Hüser et al. 1998]. Zudem wird postuliert, dass MTP durch die Freisetzung von Cytochrom c und apoptosis inducing factor (AIF) eine wichtige Rolle beim Einleiten des programmierten Zelltodes einnimmt [Chernyak 1997].

Eines der durch Hypoxie exprimierten Proteine ist Carboanhydrase IX (CA IX). Die Kapazität zur pHi‐Regulation schützt alle Zellen während der Hypoxie vor einer säureinduzierten Inhibierung der Glykolyse [Parks et al. 2013]. Schwere Hypoxie führt schnell zu ER‐Stress und aktiviert die UPR (unfolded protein response), welche Effektor‐Pathways beeinflusst. Dies gewährleistet eine gewisse Hypoxie‐Toleranz [Wouters und Koritzinsky 2008]. Auf diesem Weg kann Hypoxie als eine Art Überlebens‐Mechanismus in saurer Umgebung angesehen werden [Parks et al. 2013].

Akkumulation von Laktat

Fällt innerhalb der Zelle die Konzentration von O2 unter einen Schwellenwert steigt die Expressionsrate des HIF‐1α exponentiell. Zum einen erhöht sich die Menge an GLUT1 und GLUT3, um die Glucoseaufnahmerate in das Zytosol zu steigern. Des Weiteren produziert die Zelle vermehrt Laktatdehydrogenase (LDH), welches Pyruvat in Laktat metabolisiert (vgl. Abbildung 2‐10) und Pyruvatdehydrogenase(PDH)kinase 1, welches die PDH phosphoryliert. Beide Prozesse führen somit zu einer Anreicherung von Laktat im Zytosol. Der Anstieg der Laktatkonzentration wiederum führt zu einem Absinken des pH‐Wertes innerhalb der Zelle. Kann das nicht kompensiert werden, so hemmt der niedrige pH‐Wert die Phosphofructokinase und der Abbau der Glukose kommt zum erliegen [Seagroves et al. 2001; Semenza 2001; Philp 2005; Papandreou et al. 2006].

Abbildung 2-10: molekulare Struktur von Pyruvat und Laktat

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Abbau von Creatinphosphat zu Creatin unter Bildung von ATP

Nachdem die Glykolyse in der Zelle zum Stillstand kommt, kann sie das anfallende ADP bzw. AMP nicht mehr regenerieren [Balaban 1990; Schlattner et al. 2006]. Um den Verlust für kurze Zeit zu überbrücken, verwendet die Zelle das Creatin/Creatinphosphat‐System (siehe Abbildung 2‐11) und das Enzym Creatinkinase (CK). Dieses Enzym tritt in Form von mehreren Isoenzymen auf. So finden sich entsprechend dem zellulären Kompartiment zytosolische (cCK) und mitochondriale Creatinkinasen (MtCK) [Wallimann et al. 1992; Schlattner et al. 2006]. Die durch die CK katalysierte Reaktion von Creatin (Cr) mit ATP ist reversibel und kann in beide Richtungen ablaufen. Um das Cr/PCr‐Verhältnis im Mitochondrium und im Zytosol zu regulieren, besitzen die cCK und die MtCK unterschiedlich hohe Affinitäten zu den unterschiedlichen Reaktionspartnern. Während die MtCK eine hohe Affinität zu ATP und Cr besitzt, verwendet die cCK bevorzugt ADP und Phosphocreatin (PCr) als Substrat [Wallimann et al. 1992].

Abbildung 2-11: molekulare Strukturen von Creatin und Creatinphosphat

Akkumulation von Hypoxanthin

Mit dem Anstieg der Konzentration von AMP in der Zelle, beginnt auch der Abbau dessen zu Ionosinmonophosphat (IMP) durch die AMP‐Desaminase unter der Abspaltung von Ammoniak. IMP wird weiter über Inosin zu Hypoxanthin (HX) metabolisiert. Der weitere Abbau von HX über Xanthin (X) zu Harnsäure (vom engl. uric acid = UA) findet jedoch nicht statt, da die Xanthindehydrogenase für die Umwandlung von HX in X und von X in UA neben Wasser auch Sauerstoff benötigt (siehe Abbildung 2‐12). Im Fall der Hypoxie steht dieser nicht zu Verfügung und es akkumuliert HX in der Zelle [Altschuld et al. 1987; Khatchikian 1996; Carlucci et al. 2002].

Konversion des Enzyms Xanthindehydrogenase zu Xanthinoxygenase

Als Quelle für die vermehrte Bildung von ROS gilt die O2‐abhängige Xanthinoxidase (XO) [Granger 1988]. Von diesem im Zytoplasma vorliegenden Enzym existieren 2 Isoformen. Die NAD+‐abhängige Xanthinoxidase (XOH) verwendet zur Umsetzung von Xanthin zu UA als Co‐Substrat NAD+ und H2O während die XO H2O und O2 als Co‐Substrat benutzt. Im Fall der XO tritt als Nebenprodukt das Hyperoxidanion O2

‐ auf.

Für die Umwandlung der Enzyme in ihre Isoform existieren reversible Mechanismen, wie z.B. die chemische oder die enzymatische Oxidation von Sulfhydryl‐Gruppen und auch irreversible Mechanismen, wie z.B. proteolytische Modifikationen [Linas et al. 1990; Nishino et al. 2008]. Da es unter hypoxischen Bedingungen zu einer Akkumulation von Hypoxanthin kommt, liegt mit dem Wiedereinsetzen der Sauerstoffversorgung das Substrat für die XO im Überschuss vor [Granger 1988]. Der nun vermehrt stattfindende Abbau der Purine zur Harnsäure, welche das finale Abbauprodukt von Purinen in Säugetierzellen bildet, führt zu einem starken Anstieg an ROS innerhalb der Zelle. Des Weiteren steigt auch die Konzentration von X und UA [Thompson‐Gorman und Zweier 1990].

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Abbildung 2-12: molekulare Strukturen von Hypoxanthin, Xanthin und Harnsäure

Bildung von Reactive Oxygen Species (ROS)

ROS treten in der Zelle unter anderem als Nebenprodukt bei der Zellatmung im Mitochondrium auf. Circa 0,1 ‐ 2 % des Sauerstoffes wird innerhalb der Atmungskette in den Komplexen I und III in O2

.‐ und durch die Superoxiddismutase (SOD) zusammen mit H2O in H2O2 umgewandelt [Irani 1997; Han et al. 2001]. Während unter Normbedingungen und unter hypoxischen Bedingungen die in der Zelle auftretende Menge an reaktiven Sauerstoffradikalen gering ist, steigt mit der wiedereinsetzenden Sauerstoffversorgung die Menge an ROS stark an [Kehrer 2000].

Bildung von Malondialdehyd durch Lipidperoxidation

Das durch das Enzym Xanthinoxidase gebildeten O2‐ reagiert im Anschluss, katalysiert durch die SOD, teilweise weiter zu H2O2. Sind in der Zelle Spuren von Übergangsmetallen, wie z.B. Fe3+ vorhanden, wirken diese als Katalysator für die sog. Fenton‐Reaktion, welche die Reaktion von O2

‐ und H2O2 zu dem hochreaktiven Hydroxylradikal beschreibt [Kehrer 2000].

Die Doppelbindungen an den mehrfach ungesättigten Phospholipiden, welche das funktionelle und strukturelle Grundgerüst der Zellmembran darstellen, bieten einen Angriffspunkt für ROS und führen zu einer Lipidperoxidation. Durch die Reaktion von OH‐ mit einer Fettsäure und der anschließenden Addition von O2 bildet sich ein Fettsäure‐Peroxylradikal. Dieses Radikal reagiert nun mit einer Fettsäure und es entsteht ein stabiles Fettsäure‐Hydroperoxid sowie ein weiteres Fettsäureradikal. Alternativ kommt es zu einer Addition des freistehenden Sauerstoffs an eine benachbarte Doppelbindung und damit zu einem zyklischen Peroxid. Die Hydrolyse dieses zyklischen Peroxides führt final zu Bildung von Malondialdehyd (MDA) [Powers und Jackson 2008]. Da die Bildung von MDA nur im Fall der Lipidperoxidation auftritt, kann die Menge an gebildeten MDA (Struktur siehe Abbildung 2‐13) als Indikator für die Bildung von ROS genutzt werden [Esterbauer et al. 1991].

Abbildung 2-13: molekulare Struktur von Malondialdehyd

2.1.7. Zellteilung

Sollen sich Zellen teilen, ist es eine notwenige Voraussetzung, dass über eine ausreichende Nährstoffversorgung alle benötigten Edukte für die de‐novo‐Synthese der Zellbestandteile vorhanden sind und in der Folge mitoseauslösende Signale erfolgen [Vander Heiden et al. 2009; Gstraunthaler und Lindl 2013; Locasale 2013]. Weiterhin benötigen Zellen die Möglichkeit zur schnellen ATP Bildung, um den Energiehaushalt aufrecht zu erhalten, eine erhöhte Biosyntheserate für Makromoleküle und die Aufrechterhaltung eines angemessenen Redox‐Status [Cairns et al. 2011]. Für den Prozess der Zellteilung ist eine hohe Glykolyserate von Vorteil [Lunt und Vander Heiden 2011].

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Zellzyklus und Kontrolle Die Zellteilung von einer Zelle zu zwei gleichen (hinsichtlich DNA) Tochterzellen durchläuft die drei Phasen des Intermitosezyklus. In diesem Zyklus werden alle notwendigen Bestandteile für die eigentliche Teilung (Mitose) bereitgestellt [Vander Heiden et al. 2009] und als Zellzyklus bezeichnet.

Die erste Phase wird als G1‐Phase bezeichnet. Hierbei handelt es sich um die Wachstumsphase. Es wird die Proteinsynthese intensiviert, um alle notwendigen Enzyme und Proteine (z.B. Histone) zu bilden. Wie Lunt et al. zeigen, hält die Zelle gerade in der G1‐Phase hohe Levels an glykolytischen Intermediaten vor [Lunt und Vander Heiden 2011]. Außerdem werden in dieser Phase bereits die Zentriole neu gebildet. Die Dauer der G1‐Phase ist variabel und nicht festgelegt.

Im nächsten Schritt, welcher als S‐Phase bezeichnet wird, findet die Replikation der DNA statt. Dieser Prozess ist relativ stark konserviert und dauert in tierischen Zellen in etwa 7‐8 h. Nach erfolgreicher S‐Phase liegt die DNA nun korrekt verdoppelt vor. Durch den eigentlichen Prozess der Mitose werden die Chromatiden durch den Spindelappart der Zelle auf die entstehenden Tochterzellen aufgeteilt. Auf diese Phase folgt die kurze G2‐Phase von circa 3 Stunden bis die Zelle in die eigentliche Mitose eintritt. In einer Zelle der G2‐Phase sind alle Bedingungen für eine Zellteilung erfüllt [Buselmaier 2007].

Die meisten differenzierten Zellen eines Organismus können sich aus diesem Kreislauf vorrübergehend oder dauerhaft entziehen und verweilen dann in der G1‐Phase, welche jedoch in einem solchen Fall als G0‐Phase bezeichnet wird [Buselmaier 2007].

Das verdeutlicht das Vorhandensein und die Notwendigkeit einer strikten Regulation, um Fehler in diesem Prozess zu vermeiden. Hierzu besitzt die Zelle sogenannte Kontrollpunkte. Diese werden über die Interaktion von zyklisch aktivierten Proteinkinasen und zyklinabhängigen Proteinkinasen (CdK: cyclin dependent protein kinases) abgebildet. Zykline werden in ihrer Aktivität durch Phosphorylierung und Bindung an zyklinabhängige Proteinkinasen reguliert. Der Name impliziert die oszillierende Änderung ihrer Konzentration während des Zellzyklus. CdKs bleiben in ihrer Konzentration demgegenüber konstant [Buselmaier 2007].

Liegt ein Fehler vor, wird der Zyklus angehalten und es wird die DNA damage respone (DDR) ausgelöst [Foster et al. 2012]. Für diesen Prozess ist das Protein p53 von Bedeutung. Interessanter Weise kann dieses durch Mutation ausfallen und so zur Krebsentstehung führen, da hierdurch eine ungehemmte Proliferation ausgelöst werden kann [Buselmaier 2007].

Mitose Mit Abschluss der Intermitosephasen geht die Zelle zur Kernteilung über. Dieser als Mitose bezeichnete Prozess beschreibt die exakte Aufteilung der vorher duplizierten DNA auf zwei Tochterzellen. So ist sichergestellt, dass beide Zellen die exakt gleichen genetischen Informationen enthalten [Buselmaier 2007].

Die Mitose beginnt mit der Prophase, in welcher sich die Chromosomen verdichten, so dass diese gegen Ende dieser Phase physiologisch inaktiv vorliegen. Durch die Längenzunahme der Spindelfasern wandern die beiden Zentriole zu den Zellpolen. An diesem Prozess sind Motorproteine wie z.B. der Kinesonfamilie beteiligt, welche ihre Energie aus ATP beziehen. Dieser Teilprozess benötigt in etwa 0,5 bis 4,5 h. Im Anschluss hieran löst sich in der Prometaphase die Kernmembran auf. Nun kann der Spindelapparat an den Chromosomen ansetzen. Hierbei bilden sich die sogenannten Kinetochor‐Spindelfasern zwischen den Zentromeren der Chromosomen und den Zentriolen aus. Im nächsten Schritt der Metaphase liegen die Chromosomen mittig im Zytoplasma. Alle Zellorganellen werden aus dem Bereich des Spindelapparates verdrängt. Die Chromatiden der Chromosomen hängen ausschließlich in der Zentromerregion zusammen. In der Anaphase geht der Zusammenhalt der Chromatiden verloren, da sich die Zentromeren teilen. Die Spindelfasern können diese nun trennen und zu den entgegengesetzt liegenden Zellpolen transportieren. In der

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abschließenden Telophase wird eine neue Kernhülle gebildet. In diesem neuen Arbeitskern werden die Chromatiden entwunden und stehen so der Transkription zur Verfügung [Buselmaier 2007]. Durch die Bildung eines kontraktilen Ringes aus Aktin und Myosin wird das Zytoplasma in zwei Hälften geteilt. In dieser sogenannten Zytokinese wird die Interphasenanordnung hergestellt. Es sind nun zwei Zellen vorhanden [Buselmaier 2007].

2.1.8. Zytoskelett

Das Zytoskelett von eukaryotischen Zellen besteht aus spezifischen Proteinen. Unterschieden werden können Mikrotubuli, Actinfilamente und intermediäre Filamente.

Mikrotubuli Hierbei handelt es sich um röhrenförmige Gebilde, welche in allen eukaryotischen Zellen vorkommen. Aufgebaut werden diese aus dem α‐ und β‐Tubulin, wobei der Aufbau GTP abhängig ist. Das Wachstum findet durch die Dimerisierung der α‐ und β‐Form nach Bindung von GTP statt. Dies setzt sich weiter fort bis Protofilamente vorliegen. Da das β‐Tubulin über eine GTPase‐Aktivität verfügt wird durch Pi Abspaltung GDP gebildet. Hierdurch werden diese Strukturen instabil, was auch als dynamische Instabilität bezeichnet wird. Somit kann diese Struktur nur verlängert werden, wenn neue Dimere schneller angelagert werden, als GTP zu GDP katalysiert wird. Dies ist maßgeblich von der Menge freien Tubulin abhängig. In der Zelle haben sie wichtige Aufgaben innerhalb des Vesikeltransports. Kinesine oder Dyneine können an diese binden und so Vesikel in entgegengesetzter Richtung transportieren [Löffler und Schölmerich 2008].

Actinfilamente Actinfilamente kommen in allen Zellen vor und sind als Bündel oder Netzwerke organisiert. Hauptsächlich finden diese sich direkt unterhalb der Plasmamembran. Man unterscheidet filamentöses Actin (F‐Actin) und globuläres Actin (G‐Actin). Wobei Erstes durch Polymerisation des G‐Actins, von welchem drei Isoformen im Menschen vorkommen, entsteht. Für die Polymerisierung benötigt G‐Actin die Bindung von ATP. Ähnlich wie bei den Mikrotubuli führt eine geringe ATPase‐Aktivität zum Umsatz von ADP und auch hier führt dies zu einer gewissen Destabilisierung. Ein Zerfall führt zu einer erneuten Beladung mit ATP. Die Aufgaben des Actins sind vielfältig. So bildet es z.B. den Zellkortex, was der Zelle zusammen mit der Zelloberfläche ihre mechanische Widerstandskraft verleiht und darüber hinaus an der Wanderung der Zelle beteiligt ist [Löffler und Schölmerich 2008].

Intermediäre Filamente Auch hierbei handelt es sich um Polymere, die aus monomeren Untereinheiten aufgebaut werden. Von ihrem Durchmesser her befinden diese sich zwischen Actinfilamenten und Mirkotubuli. Die faserförmigen Moleküle dimerisieren leicht und lassen sich zu Filamenten zusammenfügen. So vermitteln diese die mechanische Stabilität der Zelle [Löffler und Schölmerich 2008].

2.1.9. Zelltod

Unabdingbar für die Funktion eines komplexen Organismus ist die Kontrolle über zelluläre Strukturen und deren Organisation. Eine Möglichkeit zur Regulation dieser ist die Zellzahl. Zur Aufrechterhaltung der korrekten Funktion von Strukturen ist es notwendig, dass bestimmte Zellen den programmierten Zelltod unterlaufen. Dafür kann es mehrere Ursachen geben: Mutationen, virale Infektionen oder Beschädigung durch Toxine [Melino 2001].

Bei genauerer Betrachtung zeigt sich aber, dass der Begriff Zelltod naturwissenschaftlich relativ schwer zu erfassen und zu definieren ist. Hierbei gibt es verschiedene Varianten, deren genaue Einteilung (siehe Tabelle 2‐1) momentan kontrovers diskutiert wird [Galluzzi et al. 2011]. Tote Zellen können z.B. durch morphologische Merkmale wie dem endgültigen Verlust der Membranintegrität oder der Zellfragmentierung erkannt werden. Von besonderem Interesse ist hier vor allem der programmierte Zelltod. Auf dem Weg zu diesem Zustand unterlaufen sterbende Zellen einen Prozess aus reversiblen Schritten, solange bis ein erster irreversibler Schritt („point of no return“) erreicht wird. Mögliche Gründe für diesen Schritt könnten eine starke Aktivierung von Caspasen, der Verlust

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des mitochondrialen Potentials ΔΨ, komplette Permeabilität der äußeren Mitochondrienmembran oder die Präsentation von Phosphatidylserin (PS) auf der äußeren Zytoplasmamembran sein [Galluzzi et al. 2011].

Tabelle 2-1: Übersicht der Todesmechanismen gemäß der Unterteilung nach dem NCCD 2012 [Galluzzi et al. 2011]

Mechanismus Eigenschaft Caspasen-Abhängigkeit

Anoikis Verlust von Zell-Matrix-Wechselwirkung Caspase-3 Aktivierung

Ja

Autophagischer Zelltod Selbstverdau Zytoplasmatische Vakuolisierung

Nein

Caspasenabhängige, intrinsische Apoptose

Caspasen-Aktivierung, Cytochrom c Freisetzung, Bildung eines Apoptosoms

Ja

Caspasenunabhängige, intrinsische Apoptose

Keine Caspasen-Aktivierung, jedoch AIF & ENDOG

Nein

Verhornung Bildung des stratum corneum Vermutlich Entose Zell-Kannibalismus und Verdau in Lysosomen -- Extrinsische Apoptose durch Todesrezeptoren

Bindung von Liganden an FAS und Aktivierung von DISC Caspase-8 Aktivierung

Ja

Extrinsische Apoptose durch Abhängigkeitsrezeptoren

Abwesenheit von Ligand löst Kaskade aus Caspase-9 Aktivierung

Ja

Mitotische Katastrophe Zelltod während fehlerhafter Mitose Nein Nekroptose Programmierte Nekrose Nein Netose Spezifischer Zelltod von Granulozyten Nein Parthanatos Übermäßige PARP1 Aktivierung, NAD+/ATP

Verarmung, AIF-vermittelte Chromatin-Lyse Nein

Pyroptose Frühe Caspase-1 Aktivierung Freisetzung pyrogener Mediatoren bspw. IL-18

Ja

In Zytotoxizitäts‐Studien werden Parameter wie die mittlere letale Konzentration (LC50) angegeben. Dabei wird nach definierter Einwirkdauer die Lebendzellzahl, oder die metabolische Aktivität der Kultur bestimmt. Der zu Grunde liegende Todesmechanismus wird nicht selten außer Acht gelassen. Entsprechende Untersuchungen zeigen, dass gleiche letale Konzentrationen durchaus unterschiedliche Todesmechanismen hervorrufen können. Ursachen sind z.B. der Regulationsgrad bestimmter Apoptose‐relevanter Proteine und die daraus resultierende Apoptose‐Toleranz einer Zelllinie. Aber auch der metabolische Zustand einer Kultur oder ein Medienparameter wie die Glukosekonzentration kann einen Einfluss haben [Orrenius und Zhivotovsky 2006; Palorini et al. 2013]. Eine genaue Analyse des Zelltodes kann Aufschluss über zelluläre Signalkaskaden geben und hilft damit die Auswirkungen eines Toxins besser zu charakterisieren [Vaux 2002; Orrenius und Zhivotovsky 2006].

Seit der ersten Erwähnung des programmierten Zelltodes Mitte der 60er Jahre sind verschiedene Varianten entdeckt worden. Dieser kann verschiedene Formen annehmen und zum einen durch morphologische Änderung der Zelle, aber auch durch verschiedene biochemische Reaktionen innerhalb der Zelle in verschiedene Kategorien unterteilt werden [Galluzzi et al. 2011].

Apoptose Während apoptotischer Vorgänge durchläuft eine Zelle oft eine Reihe an morphologischen Veränderungen (siehe Abbildung 2‐14), die jedoch nicht zwingend auftreten müssen. Dabei löst sich die apoptotische Zelle aus dem Gewebeverband und schrumpft, die Chromatine kondensieren und die DNA wird fragmentiert, der Nucleus sowie die Zisternen des endoplasmatischen Reticulums (ER) und des Golgi‐Apparates werden zerlegt. Das Phosphatidylserin (PS) wird von innen auf die

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STAND DES WISSENS

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Das NCCD schlägt zur Unterteilung der Apoptose zwei Definitionen vor. Die extrinsische Apoptose wird durch extrazelluläre Liganden wie FAS/CD95 oder Tumornekrosefaktor α (TNF α) eingeleitet. Durch die Bindung an Transmembranproteine, den sogenannten Todesrezeptoren, wird die Initiator‐Caspase‐8 aktiviert, die die Caspase‐Kaskade in Gang setzt [Galluzzi et al. 2011]. Bei der intrinsischen Apoptose kann in einen Caspase‐abhängigen und einen Caspase‐unabhängigen Mechanismus unterteilt werden. Beide werden durch intrazellulären Stress und meist durch Schädigung der äußeren Mitochondrienmembran ausgelöst. Durch die freigesetzten mitochondrialen Proteine im Zytosol werden weitere Reaktionen hervorgerufen. Cytochrom c bildet zusammen mit Apaf‐1 eine heptagonale Struktur, das sogenannte Apoptosom. Apaf‐1 liegt als inaktive Vorstufe im Zytosol vor und wird durch Smac aus den Mitochondrien aktiviert. Das Apoptosom aktiviert die Caspase‐9 →Caspase‐3 Kaskade [Galluzzi et al. 2011]. Durch Freisetzung von Endonuclease G sowie AIF kann aber auch ein Caspase‐unabhängiger Weg beschrieben werden. Diese Proteine bewirken eine Kondensation und Fragmentation des Zellkerns. AIF bewirkt darüber hinaus die Präsentation von Phosphatidylserin auf der äußeren Zytoplasmamembran [Höffeler 2004; Galluzzi et al. 2011].

Nekrose Für lange Zeit wurde die Nekrose, als Gegenpart zur Apoptose, wie ein verunfallter, unregulierter Zelltod betrachtet. Durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) oder einem osmotischen Schock können Zellen einen Prozess durchlaufen, bei dem keine Caspasen aktiviert werden. Morphologisch zeigt sich die Nekrose durch eine Zunahme im Zellvolumen in Folge des Anschwellens der Organellen. Damit einhergehend ist eine Schädigung der Plasmamembran und der Verlust des intrazellulären Inhaltes [Proskuryakov et al. 2003; Kroemer et al. 2008].

Allerdings lassen Assunção Guimarães und Linden den Mitochondrien auch beim nekrotischen Zelltod eine wichtige Funktion zukommen. Ausgelöst durch einen Nährstoffmangel können diese spontan depolarisieren. Die zelluläre Antwort ist abhängig davon, wie viele Mitochondrien depolarisiert werden. Bei einer geringen Anzahl wird der Prozess der Autophagie aktiviert. Bei einer größeren Anzahl depolarisierter Mitochondrien für die dadurch bedingte Freisetzung von z.B. Cytochrom c zur Auslösung einer Apoptose‐Kaskade. Bei einer sofortigen Depolarisation von nahezu allen Mitochondrien käme es demnach zu einem Stillstand der oxidativen Phosphorylierung und dem nekrotischen Zelltod [Assuncao Guimaraes und Linden 2004]. Obwohl die Nekrose als unregulierter Mechanismus gilt, spielen auch hier Zellorganellen und zelluläre Prozesse eine wichtige Rolle [Kroemer et al. 2008]. So können antiapoptotische Faktoren wie Bcl‐2, Bcl‐xL und Caspase‐Inhibitoren zum nekrotischen Zelltod führen, wenn ein entsprechendes Signal vorliegt. Aufgrund dieser Kontrollmechanismen und bestimmten Gemeinsamkeiten mit der apoptotischen Signalkaskade wird von Nekroptose gesprochen [Assuncao Guimaraes und Linden 2004; Metzig et al. 2012].

In der aktuellen Forschung ist der programmierte Ablauf der Nekrose ein Diskussionsthema. Goldstein und Kroemer zeigen, dass der Ablauf sowie das Auftreten des nekrotischen Zelltodes auf einer gewissen Ereignissequenz beruht und sie damit keinesfalls unreguliert sind. Als ein möglicher Entscheidungspunkt im Zelltod gilt die ATP‐Konzentration. Leist et al. konnten zeigen, dass humane T‐Zellen nur bei einem hinreichend großen ATP‐Level den apoptotischen Weg durchlaufen. Bei geringeren ATP Konzentrationen sterben die Zellen den nekrotischen Tod [Leist et al. 1997; Golstein und Kroemer 2007].

Dieser Themenkreis ist jedoch deutlich komplexer und in stetiger Diskussion. Daher sei für vertiefende Informationen an folgende Literatur verwiesen [Bruin und Medema 2008; Eisenberg‐Lerner et al. 2009; Harr und Distelhorst 2010; Orrenius et al. 2010; Dickens et al. 2012; Dixon et al.

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‐Seite 25‐

2012; Konstantinidis et al. 2012; Li et al. 2012; Oka et al. 2012; Shen und Codogno 2012; Wickman et al. 2012; Caruso et al. 2013].

2.1.10. Der Warburg‐Effekt

Der Freiburger Arzt Otto Warburg machte 1924 die Beobachtung, dass Krebszellen häufig hohe Laktatwerte zeigen [Vander Heiden et al. 2009]. Er hat daraus gefolgert, dass Krebszellen nicht zwingend Sauerstoff zur Proliferation benötigen. Die Intensivierung der oxidativen Phosphorylierung hat die Wachstumsrate von Krebszellen vielmehr gehemmt. Eine Steigerung der anaeroben Vergärung von Glucose hat dahingegen das Tumorwachstum gesteigert, weshalb dieses Phänomen aktuell ein Ansatzpunkt der Tumorforschung ist. Der Warburg‐Effekt beschreibt aus heutiger Sicht somit die Tatsache, dass Krebszellen nicht selten eine hohe Glykolyse‐Rate zeigen und ein hohes Maß der umgesetzten Glucose als Laktat ausschleusen, obwohl Sauerstoff in ausreichendem Maße zur Verfügung steht [Feron 2009; Vander Heiden et al. 2009; Cairns et al. 2011; Metallo und Vander Heiden 2013]. Dieser Stoffwechselweg wird daher meist als aerobe Glykolyse bezeichnet [Vander Heiden et al. 2009].

Sind dagegen essentielle Nährstoffe limitierend, ist es sinnvoll das Maximum an Energie aus diesem limitierenden Substrat zu generieren und die Teilungsrate zu reduzieren [Vander Heiden et al. 2009]. Da in den meisten höheren Organismen Zellen einen konstanten Nährstofffluss ausgesetzt sind, ist eine Limitierung meist zu vernachlässigen und es benötigt entsprechende Kontrollsysteme, um eine übersteigerte Zellteilung zu unterbinden [Vander Heiden et al. 2009]. Normal proliferierende bzw. ausdifferenzierte Zellen werden im Zellzyklus arretiert (G0‐Phase) und aktivieren einen katabolen Metabolismus, wenn die ATP Bildung aus Glucose gefährdet ist [Vander Heiden et al. 2009]. Der Umstand, warum Zellen diese aerobe Glykolyse betreiben, liegt gemäß neueren Forschungsergebnissen in dem stark erhöhten Bedarf an Vorläufer‐Molekülen. Somit sei dieser metabolische Phänotyp kein alleiniges Kennzeichen maligner Krebszellen, sondern trifft vielmehr auf sämtliche schnell proliferierende Zellen zu [Vander Heiden et al. 2009].

2.1.11. Metabolischer Phänotyp von Krebszellen

Die Kontrolle über die Zellteilung ist für eine Aufrechterhaltung lebenswichtiger Funktionen von essentieller Bedeutung. Es kann jedoch passieren, dass diese Kontrolle verloren geht. Je nach Schwere dieser Deregulierung, kann ungebremstes Zellwachstum auftreten. In der Zellkultur werden diese Zellen allerdings den ausdifferenzierten Gewebezellen (primären Zellen) wegen ihrer quasi endlosen Teilungskapazität bzw. ‐bereitschaft nicht selten vorgezogen. Allerdings ist nicht definiert, was in einer immortalisierten Zelllinie der Funktionalität der ursprünglichen Zelle entspricht und was durch sukzessive Mutation verändert worden ist. Diese Veränderungen sind allerdings gleichzeitig ein mögliches Target, den Tumor zu bekämpfen, was deren Erforschung rechtfertigt.

Krebszellen zeigen häufig eine quasi ungehemmte Proliferation. Dadurch besteht ein ständiges Bedürfnis nach Nährstoffen, wie Glucose und Glutamin, um diese zu Precursor und Energieäquivalenten umzusetzen. Dieses Bedürfnis ist in der Zellkultur in Form der logarithmischen Wachstumsphase deutlich ausgeprägt [Lunt und Vander Heiden 2011] und stellt ein Kerngebiet dieser Arbeit dar. Die Glutamin‐Aufnahme und dessen Metabolismus werden von dem Onkogen MYC reguliert. MYC‐transformierte Zellen zeigen eine erhöhte Expressionsrate von Glutamin‐Transportern und Glutamin‐abbauenden Enzymen. Glioblastom‐Zellen nutzen mehr als die Hälfte des Glutamins, um es als Laktat aus der Zelle zu schleusen und somit daraus NADPH zu produzieren. Dies kann so weit gehen, dass MYC‐Transformanten an toxischen Konzentrationen von Ammonium zu Grunde gehen. Demgegenüber gibt es Krebszellen, die von Glutamin nicht strikt abhängig sind und daher die Vermutung nach einem alternativen Pathway geäußert wird [Lunt und Vander Heiden 2011]. Für viele dieser immortalisierten Zellen ist Glutamin jedoch essentiell. Sie sterben sobald dieses verbraucht ist [Feron 2009; Cairns et al. 2011]. Die erhöhte Aufnahme von Glucose kann durch das PI3K‐Signal über die Proteinkinase AKT gewährleistet werden. Dies führt zu einer erhöhten Expression von GLUT1 [Lunt und Vander Heiden 2011]. Die Glukose wird oft gemäß dem Warburg‐

STAND DES WISSENS

‐Seite 26‐

Effekt umgesetzt. Auch der Verlust der p53 Funktionalität führt zu einer vermehrten Glykolyse [Lunt und Vander Heiden 2011].

In Tumoren trägt dieser Stoffwechselweg zum Überlegen der Zellen bei. Hypoxische Zellen bilden Laktat, welches wiederrum von normoxisch versorgten Zellen im Außenbereich des Tumors veratmet wird [Saedeleer et al. 2012]. Hirschhäuser et al. zeigen, dass dieser typische Laktat‐Metabolismus stark mit der Schwere der Erkrankung bzw. Aggressivität des Tumors einhergeht [Hirschhaeuser et al. 2011]. Um den pHi aufrechterhalten zu können, schleusen diese Zellen das überschüssige Laktat aus der Zelle. Da dieser Transport mit Protonen gekoppelt ist, deren Verhältnis (L‐/H+) größer/gleich 1 ist, führt dies zu einer Ansäuerung des Interzellularraumes. Diese pHe‐Änderung bewahrt die Tumorzelle auf der einen Seit vor der Azidose, auf der anderen Seite führt es zur Metastasen‐Bildung, Abtöten gesunder Zellen des umliegenden Gewebes und zur Auflösung der extrazellulären Matrix [Parks et al. 2011]. Es kommt hierbei nicht zur Bewegung weniger einzelner Zellen, sondern einer umfassenden Migration der Tumormasse [Hirschhaeuser et al. 2011]. Somit ist Laktat sowohl für das Wachstums als auch die Metastasierung von Tumoren verantwortlich [Bonuccelli et al. 2010]. Allerdings wird auch dem CO2 ein Einfluss auf den pH‐Wert zugerechnet, wie Parks et al. in ihrem Review bemerken. Es ist ebenfalls eine Ansäuerung messbar, wenn die Glykolyse und Laktat‐Produktion ausgeschaltet werden. Somit könnte die Erforschung von CA IX‐Inhibitoren in Zukunft von Bedeutung sein [Parks et al. 2011]. Für die entartete Zelle bedeutet dies jedoch auch, dass sie die Wachstum‐inhibierenden Signale, welche von solch einem Umfeld ausgehen, umgehen muss [Cairns et al. 2011].

Da die Sauerstoffkonzentrationen in vielen Tumoren stark gegenüber dem umliegenden Gewebe reduziert sind (10 mmHg in Brusttumoren, gegenüber 65 mmHg im umliegenden Gewebe), wird es in diesen Zellen zu einer gewissen Induktion des HIF‐1 kommen und den entsprechenden Regelkreis in Gang setzen. Dieser führt schlussendlich dazu, dass ein noch höheres Maß Glucose aufgenommen und zu Laktat umgesetzt werden kann, indem mehr Pyruvat‐Dehydrogenase‐Kinase 1 gebildet wird [Semenza 2010]. Dieser weiter gesteigerte Fluss durch die Glykolyse ist somit relativ unabhängig vom Sauerstoff [Hirschhaeuser et al. 2011].

Durch den Mechanismus der Hypoxie erhalten Zellen, die zur OXPHOS nicht befähigt sind, einen Vorteil, welchen sie unter aeroben Bedingungen aufrecht zu erhalten versuchen [Feron 2009]. Dem pflichtet die Beobachtung bei, dass Tumorzellen diesen glykolytischen Metabolismus nutzen, bevor es überhaupt zum Auftreten hypoxischer Bedingungen kommt. Somit ist es denkbar, dass eine Mutation zur Aktivierung dieser HIF1‐α‐vermittelten Glucose‐Nutzung führt [Vander Heiden et al. 2009; Weibo Luo und Gregg L. Semenza 2011].

Ein niedriges NAD+/NADH Verhältnis ist eine weitere Beobachtung in manchen Krebszellen. Es wird gefolgert, dass eine verminderte PK‐Aktivität in Zusammenhang mit der PKM2 den Fluss durch die Glykolyse von der ATP‐Bildung entkoppeln kann. PKM2 ist ferner für den Warburg‐Effekt in Krebszellen verantwortlich, indem es die Expression von HIF‐1 Zielgenen verstärkt [Weibo Luo und Gregg L. Semenza 2011]. Allerdings findet sich die M2‐Isoform auch in selbsterneuernden Zellen, wie embryonalen oder adulten Stammzellen [Cairns et al. 2011].

2.2. Analytik

Zur Analyse der metabolischen Vorgänge stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Diese lassen sich grundsätzlich in invasive und nicht‐invasive Techniken unterscheiden. Viele instrumentelle, nicht‐invasive Techniken können für Online‐Messungen herangezogen werden (bspw. PreSens SDR). Molekulare Sonden benötigen nicht selten einen starken Eingriff in den laufenden Versuch. Allerdings liefern diese meist ein individuelles Signal pro Zelle, so dass sie zur Populationsanalyse herangezogen werden.

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Hoechst 33342 ist ein lipophiler Farbstoff, weshalb er die intakte Membran vitaler Zellen passiert und in den Nukleus gelangen kann (Struktur siehe Abbildung 2‐18). Dort lagern sich die Fluoreszenz Moleküle in der kleinen Grube des DNA‐Doppelstrangs (bevorzugt an AT‐reichen Bereichen) an, wodurch das Chromatin im Fluoreszenzmikroskop blau erscheint. Die Anregungswellenlänge liegt bei 340‐380 nm und die Emissionswellenlänge bei 435‐485 nm. Hoechst 33342 eignet sich für eine Bestimmung der Gesamtzellzahl, da sowohl die DNA lebender als auch toter Zellen markiert wird [lifetechnologies].

Abbildung 2-18: Strukturformel des Hoechst 33342 [lifetechnologies]

Apoptose‐assoziierte Fluorochrome Einige Phänomene, welche während apoptotischer Vorgänge beobachtet werden können (vgl. Kapitel 2.1.9), sind über fluoreszenzbasierte Methoden quantifizierbar.

Annexin V

Änderungen in der Struktur der Zellmembran während der Apoptose können mit Hilfe von Annexinen näher untersucht werden. Diese Proteine können in der Gegenwart von Ca2+‐Ionen spezifisch an Phospholipide wie Phosphatidylserin binden. Die erste Erwähnung ist durch Inaba et al. erfolgt, die das Protein aus einer humanen Plazenta isolierten und es placental protein 4 (PP4) nannten [Inaba et al. 1984]. Die Benennung in Annexin V erfolgte, nachdem durch Klonierung und Sequenzierung der cDNA bekannt war, dass eine Homologie zur Familie der Annexine vorliegt. Durch die rekombinante Produktion in Bakterien und die Möglichkeit Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluorescein (FITC) oder Allophycocyanin (APC) an das Protein zu koppeln, ist ein wichtiger Apoptosemarker entstanden [van Engeland et al. 1998].

An die Membran vitaler Zellen ist keine Annexin V Bindung möglich, da die Präsentation von PS fehlt und das Protein die Phospholipidmembran nicht durchdringen kann. Bei toten Zellen, die bereits eine perforierte Membran besitzen, kann Annexin V auch an der inneren Membranseite binden (siehe Abbildung 2‐19). Um diese beiden Fälle zu unterscheiden, ist eine zusätzliche Färbung mit einem Vitalitätsmarker wie PJ nötig. Zellen mit perforierter Membran sind bei dieser Vorgehensweise mit beiden Farbstoffen positiv gefärbt [van Engeland et al. 1998].

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WISSENS

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‐Seite 32‐

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WISSENS

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STAND DES WISSENS

‐Seite 33‐

Der erste Schritt bei der Bestimmung der Masse eines Moleküls ist die Ionisierung des Analyten, um die Auftrennung nach dem m/z‐Verhältnis zu ermöglichen. Die Ionisierung kann unter Vakuum mit verschiedenen Techniken erfolgen. Eine davon ist ESI (Electrospray‐Ionisation). Da hierbei meist ein einfach oder mehrfach geladenes, intaktes Mutterion entsteht, ist die ESI die Methode der Wahl bei der Detektion von Biomolekülen [Engels und Lottspeich 2012].

Über eine Edelstahlkapillare wird der sich im Eluentenstrom befindliche Analyt in die ESI geleitet. Die Erzeugung einer Spannung zwischen dem Ende der Kapillare und einer Gegenelektrode führt zu einer Potentialdifferenz und wandelt den konstanten Eluentenfluss in ein Aerosol. Stellt die Spitze der Edelstahlkapillare den positiven Pol dar, spricht man von dem positiven „ESI+“‐Modus, im umgekehrten Fall von dem negativen „ESI‐“‐Modus. Durch das Verdampfen des Lösungsmittels verringert sich die Tröpfchengröße während gleichzeitig die Dichte des elektrischen Feldes auf der Tröpfchenoberfläche zunimmt. Bei dem Erreichen des Rayleigh‐Limits findet aufgrund der Abstoßung gleichartiger Ladungen die Columb‐Explosion statt und die Töpfchen zerfallen in ein Spray. Nach dem Ionisierungsprozess findet die Auftrennung der Ionen nach ihrem m/z‐Verhältnis statt. Hierfür stehen die Quadrupoltechnik und die Flugzeit‐Massenspektrometrie (TOF, Time Of Flight) zur Verfügung. Durch Hintereinanderschalten von zwei Quadrupolfiltern gewinnt die Methode an Sensitivität und Spezifität. Ein MS/MS wird als Tandemmassenspektrometrie bezeichnet. In dieser Arbeit wird ein Quadrupol‐Iontrap‐MS verwendet [Engels und Lottspeich 2012].

SDR Auf Lumineszenz basierende optisch‐chemische Sensoren stellen eine elegante Methode der Messwertaufnahme dar und sind seit über 20 Jahren bekannt. Durch ihren Aufbau lassen sie sich einfach miniaturisieren und sterilisieren. Diese Eigenschaften ermöglichen ein großes Einsatzgebiet, unter anderem auch in Multiwell Platten. Hier ist der analytsensitive Farbstoff in einer analytpermeablen Matrix eingebettet, die sich in der Mitte des Wells befindet [Beckers et al. 2010]. Die Matrix besteht meist aus einem Polymer, das eine hohe Durchlässigkeit für Sauerstoff besitzen muss, um kurze Ansprechzeiten zu realisieren. Am häufigsten werden dabei Polysiloxane, organische Polymere wie PS, PMMA, PVC oder Zellulosederivate eingesetzt [Arain 2006].

Grundlage der Messtechnik ist die Auslöschung des Anregungszustandes eines Fluoreszenzfarbstoffes durch z.B. die Anwesenheit von Sauerstoff. Das Maß dieser Auslöschung ist dann eine Funktion der Sauerstoffkonzentration [Bacon und Demas 1987; Ries et al. 2010]. Die Auslöschung kann dabei über die Bestimmung der Intensität oder die Lebensdauer errechnet werden. Letztere bietet Vorteile, da sie durch Inhomogenitäten in der Lichtquelle sowie der Sensorschicht nicht beeinflusst wird [Arain 2006].

Die Beziehung zwischen der Fluoreszenzintensität bzw. Lebensdauer und der Sauerstoffkonzentration ist nicht linear und wird durch die Stern‐Volmer Gleichung ( 1 ) beschrieben.

1

1 ∙ ( 1 )

Dabei ist I die Fluoreszenzintensität und die Lebensdauer bei der Sauerstoffkonzentration cO2 und KSV beschreibt den Stern‐Volmer Parameter. Der Index 0 beschreibt dabei I und in Abwesenheit von Sauerstoff [Arain 2006].

Um die Lebensdauer der Fluoreszenz zu bestimmen, benutzt das SDR System die Phasenmodulationstechnik. Dabei wird der Sensor mit Licht einer sinusförmigen Intensität angeregt. Die Lebensdauer verursacht dadurch eine Verschiebung im Emissions‐ bzw. Messsignal. Diese Verschiebung wird Phasenwinkel φ genannt. Dynamisches Quenching durch Molekülzusammenstöße im Sensorfarbstoff bewirkt eine Nicht‐Linearität im Stern‐Volmer Plot. Hier ist eine Modifikation der Gleichung gemäß ( 2 ) notwendig [Beckers et al. 2010].

, un

Modell b

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1

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2+ dPolysiloxan M

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‐Seite 34‐

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1

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1

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AND DES W

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WISSENS

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Das SDROxoDishausgelesEmissionSoftware

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‐Seite 35‐

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AND DES W

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WISSENS

Hydrogel.

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( 4 )

( 5 )

( 6 )

asiert auf ( 7 ) wird 81].

STAND DES WISSENS

‐Seite 36‐

1 2 ( 7 )

Für die Berechnung der OTR ist das Verhältnis von Reaktionsrate zu Massentransferrate von Bedeutung. Dies kann gemäß ( 8 ) durch das Hatta Modul (Ha) beschrieben werden.

21 ∙ ∙ ∗ ∙

( 8 )

Dabei ist n die Reaktionsordnung für Sauerstoff, kn die Reaktionskonstante für eine Reaktion n‐ter Ordnung, c*O2 die Sauerstoffkonzentration an der Phasengrenzfläche, DO2 der Diffusionskoeffizient für Sauerstoff in der Lösung und kL der Massentransferkoeffizient [Hermann et al. 2001].

Die Annahme, dass die Sauerstoffkonzentration im bulk vernachlässigt werden kann, vereinfacht die Berechnung. Diese Annahme ist gültig, wenn die Reaktionsrate wesentlich größer als die Massentransferrate ist. Dies kann auch durch die Reaktionszahl R in ( 9 ) beschrieben werden [Hermann et al. 2001].

∙ ∗

10 ( 9 )

Die Reaktionszeit der kompletten Sulfitoxidation tR wird dann zur Berechnung der übertragenen

Sauerstoffmenge in ( 10 ) verwendet. Dabei ist die eingesetzte Konzentration an

Natriumsulfit , sowie der stöchiometrische Koeffizient der Reaktion bzgl. des Sauerstoffs zu

berücksichtigen. Die Reaktion gilt als beendet wenn die Sauerstoffsättigung erneut 80 % beträgt (Glazyrina et al. 2010).

∙

( 10 )

Diese Sauerstoffmenge ist einer maximalen OTR gleichzusetzen. Hieraus kann letztlich der volumenbezogene Stoffübergangskoeffizient kla nach ( 11 ) ermittelt werden [Linek und Vacek 1981].

∗ ( 11 )

2.3. Modelltoxine

Für die Applikationsentwicklung werden gut charakterisierte Wirkstoffe gängiger Forschungsbereiche angewendet, um Modell‐Versuche aufzubauen und die individuellen Signale interpretieren zu können.

STAND DES WISSENS

‐Seite 37‐

2.3.1. Ionomycin

Das vom Bakterium Streptomyces conglobatus gebildete Toxin Ionomycin (Struktur siehe Abbildung 2‐26) gehört zu der Gruppe sogenannter Ionophore. Durch dieses Molekül ist es möglich Calcium durch biologische Membranen zu transportieren. Durch diesen Calcium‐Transport stört es die Homöostase der Zelle und kann somit Apoptose und/oder Autophagie bzw. Nekrose auslösen [Gwag et al. 1999; Nakajima et al. 2011].

Abbildung 2-26: Struktur des Ionomycins

2.3.2. Kupfer

Freies Kupfer ist in der Lage einzelne Elektronen auf‐ und abzugeben und kann daher reaktive Ionen wie beispielsweise Hydroxyl‐Radiakle bilden. Somit ist ein Großteil seiner Toxizität auf der Erzeugung von ROS und entsprechender Folgeprodukte zurückzuführen [Gaetke 2003].

2.3.3. Kobalt

In der medizinischen Forschung findet die Nachahmung einer Hypoxie unter atmosphärischen Sauerstoffbedingungen durch den Einsatz von Kobaltchlorid Anwendung [Hervouet et al. 2006]. Ursächlich für den Einsatz des Wirkstoffes ist die Stabilisierung von HIF‐1α. Welche biochemischen Reaktionen und Interaktion zu dieser Stabilisierung führen, ist zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht ausreichend erforscht. Die existierenden Theorien korrelieren mit der jeweiligen Hypothese zur Beschreibung des Signalwegs bei Sauerstoffmangel. Eine Hypothese ist, dass Co2+ direkt an die ODD bindet und dadurch eine Hydroxylierung durch die PHD verhindert. Sollte die Reaktion dennoch zu einem gewissen Anteil stattfinden, kann Co2+ auch an die hydroxylierte α‐Untereinheit binden und dadurch die Interaktion zwischen der markierten Untereinheit und dem pVHL blockieren [Yuan 2003; Hirsila 2005]. Geringe Co2+‐Konzentrationen bewirken hingegen lediglich eine Inhibierung der FIH, nicht aber der PHD. Die unter normoxischen Bedingungen in sehr geringen Mengen vorliegenden HIF‐1α können aufgrund der gehemmten FIH mit den Koaktivatoren interagieren und transkriptionell aktiv werden. Somit kommt es bereits bei geringen Wirkstoffkonzentrationen zu einer Aktivierung von HIF‐1, ohne dabei die Hydroxylierung der Prolin‐Reste zu hemmen [Hirsila 2005]. Laut Guzy et al. und Chandel et al. wirken die Mitochondrien als Sauerstoffsensor, die mit einer intensivierten Bildung von ROS als Signalstoffe auf Hypoxie reagieren [Chandel et al. 1998; Guzy et al. 2005]. Co2+ führt, nach Chandel et al. über einen mitochondrienunabhängigen, bislang unbekannten Weg zur Bildung von ROS, welche letztendlich für die Stabilisierung der α‐Untereinheit von HIF‐1 verantwortlich sind [Chandel et al. 1998]. Unabhängig vom Signalmechanismus konnte in all diesen Studien übereinstimmend gezeigt werden, dass Co2+ die Zellen in einer Weise stimuliert, dass sie trotz normoxischer Bedingungen Gene, die der Adaption an eine Hypoxie dienen, exprimieren.

2.3.4. Inhibition der Atmungskette

Durch geeignete Substanzen ist es möglich einzelne Komplexe der Atmungskette gezielt zu inhibieren (Übersicht siehe Abbildung 2‐27). Die Toxine bewirken dabei entweder eine Konformationsänderung der beteiligten Proteine oder sie konkurrieren als kompetitiver Inhibitor mit dem Substrat um eine Bindestelle.

Rotenon Durch die Inhibierung von Komplex I mit Rotenon kann NADH nicht mehr als Elektronendonator der Atmungskette zugeführt werden. Hieraus ergeben sich verschiedene Folgen für die Zelle. Li et al. berichten bei HL‐60 Zellen von einer fast vollständigen Abnahme der Zellatmung sowie von einem

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Abbildung

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‐Seite 38‐

ung des KomDamit verbune Merkmale auf Rotenovon reaktivroße Rolle. l. zeigen, dasestimmt. Nurllulären ATPmmung der ngham et al.

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ss bei Krebszr bei einem g‐KonzentratiZellprolifera 1995; Srivas

e auch Teil dnonpool deeres kann dur und Schömplex II einhend ist eeren Verlauft al. 2005; Qu

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AND DES W

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WISSENS

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Abbildung

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‐Seite 39‐

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AND DES W

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WISSENS

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ZIELSETZUNG

‐Seite 40‐

3. ZIELSETZUNG

Für viele kleine und mittlere Unternehmen sind automatisierte Plattformen für Hochdurchsatz‐Versuche finanziell nicht realisierbar oder unzweckmäßig. Diesen Umstand greift das Projekt COSIR – „Combination of chemical‐Optical Sensors and Image Recognition“ auf. Durch die Verknüpfung chemisch‐optischer Sensorik mit skalierbaren, mikroskopischen Techniken, soll ein Inkubator taugliches System konstruiert werden, welches das Live‐Cell‐Imaging ermöglicht. Aus der Konstruktion der Hardware ergibt sich als Standard‐Kulturgefäß das 24‐Multiwell Platten‐Format. Dabei basiert die Entwicklung auf einem Vorgängergerät, dem Sensor Dish Reader (SDR; Fa. PreSens; Regensburg). Mit diesem ist es aktuell möglich im selben Kulturformat entweder den pO2 oder den pH‐Wert online zu messen.

Aus den genannten biochemischen und analytischen Fragestellungen leiten sich konkrete Experimente ab. Zur Applikationsentwicklung werden zwei Kategorien von Versuchen festgelegt. Im ersten Teil wird die Medienoptimierung durch Serum‐ und Glutamin‐Variation nachgebildet und die Reaktionen von verschiedenen Zelllinien hierauf gemessen. Dabei ist die Auswirkung auf klassische Wachstumsparameter zu untersuchen. Über den SDR werden weitere Daten erhoben und metabolische Phänotypen diskutiert. Als Arbeitshypothese dient der Warburg‐Effekt, aus welchem sich zwei generelle Varianten ableiten: der oxidative und proliferative Phänotyp. Die aus diesem Versuchssatz hervorgehenden Bilddaten werden ausgewertet und den metabolischen Daten gegenübergestellt. Ziel ist es, einen generellen Nutzen der Bilddaten für die genannte Anwendungsform zu zeigen. Der zweite Teil bildet das Wirkstoffscreening ab. Hierzu werden in ihrer Wirkung bereits charakterisierte Substanzen zu den Zellen geben und die resultierenden Effekte dargestellt. Es ist insbesondere von Interesse Wirkstoffe einzusetzen, welche möglichst prägnant auf einen Sensor wirken. Dabei kommen hauptsächliche Inhibitoren der Atmungskette und des Citrat‐Zyklus zum Einsatz.

Um die Möglichkeiten von COSIR innerhalb eines zellanalytischen Labors zu testen, werden die hieraus gewonnen Daten mit weiterführenden Ergebnissen von gängigen Referenzsystemen in Bezug gesetzt. Somit lassen sich die beobachtete Wirkung und Messwerte detaillierter diskutieren und zu einer Aussage ableiten. Dabei werden vor allem Methoden herangezogen, welche nach Zeng et al. bereits im HCS eingesetzt werden [Zheng et al. 2013]. Dies sind die Fluoreszenzmikroskopie, der WST‐Assay, enzymatische Nachweisreaktionen sowie mehrere durchflusszytometrische Anwendungen. Zudem wird eine eigenes entwickelte HPLC/MS‐Methode zur Diskussion gestellt.

MATERIAL UND METHODEN

‐Seite 41‐

4. MATERIAL UND METHODEN

4.1. Allgemeine Methoden Zellkultivierung

Innerhalb der Arbeit werden verschiedene Zelllinien in Voll‐ und Mangelmedien mit statischer Zellkultur kultiviert. Zum Einsatz kommen neben T‐Flaschen ebenfalls Multiwell Platten.

4.1.1. Verwendete Medienvarianten

Für sämtliche Versuche sind ausschließlich die unten aufgeführten Medienzusammensetzungen eingesetzt worden. Es wird ein Ansatz in Form von 40 ml Aliquots in 50 ml Gefäßen zu Grunde gelegt.

Vollmedien Die eingesetzten Vollmedien sind vorkonditioniert, wobei diesen gemäß Tabelle 4‐1 Glutamin und FKS zu zusetzen sind.

Tabelle 4-1: Varianten der Vollmedien in Bezug auf Gln und FKS

Medium Gln [mM] % FKS Medium [ml] FKS [ml] Gln-Stock (200 mM) [ml]

DMEM/Ham’s F-12 (1:1)

2 10 35,6 4 0,4

4 10 35,2 4 0,8

6 10 34,8 4 1,2

4 0 39,2 0 0,8

Advanced DMEM

2 1 39,2 0,4 0,4

4 1 38,8 0,4 0,8

6 1 38,4 0,4 1,2

OptiCHO

2 0 39,6 0 0,4

4 0 39,2 0 0,8

6 0 38,8 0 1,2

Ex-Cell 325 PF 4 0 39,2 0 0,8

RPMI

2 10 35,6 4 0,4

4 10 35,2 4 0,8

6 10 34,8 4 1,2

Advanced RPMI

2 1 39,2 0,4 0,4

4 1 38,8 0,4 0,8

6 1 38,4 0,4 1,2

Mangelmedien Eingesetzt worden ist DMEM als Mangelmedium ohne C‐Quelle. Diese wird dem Versuch entsprechend Tabelle 4‐2 individuell zugegeben.

Tabelle 4-2: Mangelmedien mit zugehöriger C-Quellen Konzentration

Medium Gln [mM] Lac [mM] Pyr [mM] Glc [mM]

DMEM/Ham’s F-12 (1:1) 4 0 0,5 17,5

DMEM + Lac + Gln 4 10 0 0

DMEM + Pyr + Gln 4 0 0,5 0

DMEM + Lac 0 10 0 0

DMEM Mangelmedium 0 0 0 0


‐Seite 42‐

4.1.2. Stammhaltung

Untenstehende Tabelle 4‐3 gibt Aufschluss über die Methodik der Stammhaltung in Abhängig der Zelllinie.

Tabelle 4-3: Übersicht der Materialien zur Stammhaltung

Bezeichnung Hersteller / Bezug T-Flasche 25 cm² (grün)* T-Flasche 25 cm² (rot)**

Sarstedt Sarstedt

CHO-K1 (**) L929 (**) MHEC5-T (**) Jurkat (*) HepZ (**) PAC (**)

LS Biotechnik LS Biotechnik Kryokultur BVT Kryokultur BVT Kryokultur BVT Primärzellen BVT

Die Zellen werden zur Stammhaltung und Vorkultur in T‐Flaschen mit einer Grundfläche von 25 cm² kultiviert. Hierbei ist von vornherein eine Unterscheidung zwischen adhärenten Zellen (**) und Suspensionszellen (*) getroffen worden. Ein Kultursplit bzw. Passagierung zur Stammhaltung findet alle 2 – 4 Tage statt, um die Zellen in der exponentiellen Phase zu halten.

Die Zellen werden in den T‐Flaschen bis zum Entnahmezeitpunkt bei 37°C, 7 % CO2 und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit inkubiert. Das Medium‐Volumen beträgt 8 ml pro T‐Flasche (25 cm²).

Subkultivierung adhärenter Zellen

Zur Passagierung der Zellen werden adhärente Zellen durch den Einsatz von Accutase® abgelöst. Hierzu wird das Medium komplett aus dem Kulturgefäß entnommen und in einem sterilen 50 ml Zentrifugenröhrchen aufbewahrt. Einer T‐25 Flasche werden 2 ml Accutase® zugesetzt und das Ablösen der Zellen abgewartet. Die Einwirkdauer wird mit dem Ablösen und Vereinzeln der Zelle durch Zurückführen des aufbewahrten, alten Mediums beendet. Die Zellen werden in der Folge durch Zentrifugation für 8 min bei 180 g und Raumtemperatur pelletiert. Der Überstand wird verworfen und die Zellen werden zunächst in 2 ml Medium resuspendiert. Die für die Stammhaltung oder den Versuch benötigte Menge (ggfs. Trypanblau‐Zählung) wird entnommen, überführt und auf das geforderte Volumen aufgefüllt.

4.2. Spezielle Methoden Zellkultivierung

4.2.1. Trypanblauzählung

Zur Trypanblauzählung werden Zellen in Suspension gebracht. Hiervon werden 100 µl Probe mit 20 µl respektive 100 µl Trypanblau‐Lösung in einem Reaktionsgefäß (Eppendorf) gemischt. Nach Aufbringen auf die Zählkammer werden die Zellen in den vier Großquadraten unter Berücksichtigung der Färbung ausgezählt. Es ist das Ziel in etwa 50 – 80 Zellen pro Großquadrat zu zählen. Sollte die Zellkonzentration zu hoch sein, kann die Probe entsprechend mit physiologischer NaCl‐Lösung verdünnt werden. Die Zellkonzentrationen werden wie folgt berechnet.

LZZml MittelwertLZZaus4Großquadraten ∙ Verdünnungsfaktor ∙ 10 ( 12 )


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GZZml MittelwertGZZaus4Großquadraten∙Verdünnungsfaktor∙104 ( 13 )

Vitalität LebendzellzahlpromlGesamtzellzahlproml

∙100% ( 14 )

4.2.2. SDR‐Messungen

Für das SDR‐System werden 24‐Multiwell Platte des Herstellers PreSens genutzt. Es wird in den 24‐Multiwell Platte einem Medienvolumen von 600 µl gearbeitet. Zu Versuchsbeginn werden die jeweiligen Zellen aus der Vorkultur ggfs. über die Einwirkung von Accutase® entnommen und – wenn

nicht gesondert genannt – auf eine Dichte von 1·105 LZZ ml eingestellt und unter den gleichen

Bedingungen wie die Vorkultur inkubiert. Das Verfahren unterscheidet nicht zwischen den originalen Greiner CELLSTAR™‐Platten und den modifizierten SDR‐Platten, sondern ist alleinig vom Format abhängig.

Bestimmung des kla‐Werts via SDR Zur Bestimmung der Sauerstoffaufnahmerate ist die Kenntnis über den kla‐Wert unerlässlich. Dieser wird nach einer Sulfit‐Methode wie folgt bestimmt:

1. Herstellen der Sörensen Stammlösung A durch Lösen von 9,078 g KH2PO4 in 1.000 ml deionisiertem Wasser

2. Herstellen der Sörensen Stammlösung B durch Lösen von 11,876 g Na2HPO4∙2H2O in 1.000 ml deionisiertem Wasser

3. Für den Pufferbereich von pH=8 werden 96,9 ml der Stammlösung A verwendet und mit Stammlösung B auf 1.000 ml aufgefüllt

4. Befüllen mit je 600 µl Puffer pro Well und Inkubation für 4 h bei 37 °C 5. Herstellen einer 10‐4 molaren CoSO4 Lösung 6. Begasen von 40 ml Sörensen Puffer (pH=8) für 45 Minuten mit Stickstoff und anschließend

Lösen von 2,518 g Natriumsulfit in selbigem 7. Entfernen des Puffers aus den SDR‐Platten und Zugabe der gepufferten Natriumsulfitlösung 8. Zugabe von 6 µl CoSO4 pro Well (finale Konzentration 10‐7 M) und Start der Messung 9. Die Messung ist beendet wenn das Sauerstoffsignal erneut auf 80 % atm steigt

4.2.3. WST‐8 Proliferationsassay

Wenn nicht gesondert erwähnt werden WST‐Tests stets in 96‐Multiwell Platten der Firma Greiner Typ CELLSTAR™ durchgeführt. Unabhängig von der Art des Versuchs (Wachstumskurve oder Toxizitäts‐Test) befinden sich je auszuwertendem Well je 100 µl Zellsuspension. Zu dieser werden 10 µl des CCK‐8 Kits gegeben und, sofern nicht gesondert erwähnt, bei Kultivierungsbedingen (37°C, 7 % CO2, 95 % rh) für exakt 2 h inkubiert. Im Anschluss daran wird die gesamte Platte im Vertikalphotometer (Plate‐Reader) bei 450 nm gemessen.

4.2.4. Zytotoxizitäts‐Tests

Zytotoxizitäts‐Tests werden sowohl via CCK‐8 als auch SDR ausgewertet. Daher basiert dieses Vorgehen auf den bereits genannten Methoden zur Ausbringung der Zellen in den jeweiligen Multiwell Platten:


‐Seite 44‐

1. Entnahme von Zellen aus einer exponentiell wachsenden Vorkultur 2. Zellzahlbestimmung mittels Trypanblau

3. Durch eine geeignete Verdünnung wird eine Zellzahl von 1·105 LZZ ml eingestellt

4. Überführen in Multiwell Platten: im 24‐Well Format 600 µl, im 96‐Well Format 100 µl pro Well

5. Inkubation für 4 Stunden bei 37 °C und 7 % CO2 6. Teilweise Entnahme von Mediumüberstand und Toxinzugabe auf ein finales Volumen von

600 bzw. 100 µl pro Well, wobei die Toxine in möglichst geringem Volumen zugegeben werden

4.2.5. Durchflusszytometrie

Der Versuchsansatz erfolgte nach der beschriebenen Methode im 24‐Well Format. Nach entsprechender Einwirkdauer wurde das überstehende Medium entfernt und die Zellen durch 200 µl Accutase® in Suspension gebracht. Die weitere Vorgehensweise ist im Folgenden beschrieben, wobei zwischen den eingesetzten Durchflusszytometern BD LSR und Muse™ Cell Analyzer unterschieden wird.

BD LSR

PJ/YO-PRO®-1

Auf 200 µl Accutase –Zellsuspension wurde je 1 µl PJ und YO‐PRO®‐1 pipettiert. Die Messung im BD LSR Durchflusszytometer erfolgte bei folgenden Parametern:

Laser 1: 488 nm

FL‐1: 530‐BP‐28

FL‐3: 670‐AGLP

Metabolic Activity/Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit

1. Positiv Kontrolle durch Inkubation für 4 h bei 37 °C mit 2 mM H2O2 2. Waschen der Zellen in 1X Annexin‐Bindepuffer 3. Zentrifugieren für 5 Minuten bei 380 g, anschließend Überstand verwerfen und

resuspendieren in 100 µl 1X Annexin‐Bindepuffer 4. Zugabe von 5 µl APC Annexin V, 1 µl 50 µM C12‐Resazurin working solution und 1 µl SYTOX®

Green working solution zu je 100 µl Zellsuspension 5. Inkubation für 15 Minuten bei 37 °C und 7 % CO2 6. Anschließend Zugabe von je 400 µl 1X Annexin‐Bindepuffer, vorsichtig resuspendieren und

auf Eis lagern 7. Analyse am BD LSR Durchflusszytometer mit folgenden Parametern:

Laser 1: 488 nm

FL‐1: 530‐BP‐28

FL‐2: 575‐BP‐26

SSC‐W: 660‐DF‐30

MitoProbeTM DiOC2(3) Assay Kit

1. Zugabe von 0,5 µl 50 mM CCCP zur Positivkontrolle und Inkubation für 5 Minuten bei 37 °C 2. Zugabe von 2,5 µl 10 µM DiOC2(3) zu jeder Probe und Inkubation für 15 bis 30 Minuten bei

37 °C 3. Analyse im BD LSR Durchflusszytometer mit folgenden Parametern:

Laser 1: 488 nm

FL‐1: 530‐BP‐28

FL‐3: 670‐AGLP


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MUSETM Cell Analyzer

Muse Annexin V and Dead Cell Assay Kit

1. Zugabe von 100 µl Muse™ Annexin V & Dead Cell Reagenzlösung zu 100 µl Zellsuspension 2. Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur 3. Resuspendieren und Messung am Muse™ Cell Analyzer

Muse Caspase 3/7 Assay Kit

1. Zellsuspension für 5 Minuten bei 380 g zentrifugieren 2. Resuspendieren in 1X Assay Buffer 3. Zugabe von 5 µl Muse™ Caspase‐3/7 working solution zu 50 µl Zellsuspension 4. Inkubation für 30 Minuten bei 37 °C 5. Zugabe von 150 µl 7‐AAD working solution 6. Resuspendieren und Messung am Muse™ Cell Analyzer

Muse MultiCaspase Assay Kit

1. Zellsuspension für 5 Minuten bei 380 g zentrifugieren 2. Resuspendieren in 1X Caspase Buffer 3. Zugabe von 5 µl Muse™ MultiCaspase working solution zu 50 µl Zellsuspension 4. Inkubation für 30 Minuten bei 37 °C 5. Zugabe von 150 µl 7‐AAD working solution 6. Resuspendieren und Messung am Muse™ Cell Analyzer

Muse MitoPotential Assay Kit

1. Zugabe von 95 µl Muse™ MitoPotential working solution zu 100 µl Zellsuspension 2. Inkubation für 20 Minuten bei 37 °C 3. Zugabe von 5 µl Muse™ MitoPotential 7‐AAD 4. Resuspendieren und Messung am Muse™ Cell Analyzer

4.2.6. Fluoreszenzmikroskopie

1. Zugabe von je 1 µl PJ sowie YO‐PRO®‐1 pro Well 2. Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur 3. Bildaufnahme von Fluoreszenzbild bei Belichtungszeit t=2,0 s und Steigerung von 2,0 x in

Nikon NIS Software 4. Bestimmung an positiv gefärbten Zellen mittels ImageJ

4.2.7. Wachstumskurven

Innerhalb dieser Versuchsgruppe wird auf bereits weiter oben genannte Protokolle zurückgegriffen. Das grundlegende Vorgehen ist in Abbildung 4‐1 dargestellt. Die jeweilige Zelllinie wird im entsprechenden Medium sowohl in 24‐Multiwell‐ wie auch 96‐Multiwell Platten ausgebracht und inkubiert. Zu jedem Messzeitpunkt werden je nach Kulturplatte die jeweiligen Parameter bestimmt, sofern dies nicht bereits durch Online‐Technik geschieht (SDR). Im Falle der 96‐Multiwell Platte wird wie bereits genannt der WST‐Test mittels CCK‐8 bzw. WST‐8 durchgeführt. Im Fall der originalen Greiner CELLSTAR™‐Platten erfolgt zunächst eine mikroskopische Aufnahme der Zellen, um eine Datengrundlage zu erhalten. Zellen und Medium werden getrennt und den jeweiligen Analysen gemäß der Abbildung zugeführt. Diese werden nachfolgend beschrieben und weitere Parameter berechnet (siehe 4.5).

Glucose‐Bestimmung Zur Glucose‐Bestimmung wird das Monoreagenz (Liqui UV‐Mono‐Reagenz) der Firma Human Diagnostics verwendet. Der Assay wird in 96‐Multiwell Platten angesetzt und im Plate Reader bei 337 nm vermessen. Das Vorgehen ist wie folgt:


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1. Zugabe von 10 µl Probe innerhalb einer Dreifachbestimmung 2. Hinzugeben von 200 µl Reagenz 3. Inkubation auf Plattenschüttler für 45 min, RT 4. Messung im Plate‐Reader bei 337 nm

Glutamin‐Bestimmung Zur Bestimmung der Glutamin‐Konzentration ist das Glutamin‐Kit der Firma Megazyme (K‐GLNAM) verwendet worden. Mit diesem Produkt ist es ebenfalls möglich die Ammonium‐Konzentration zu bestimmen. Das Prinzip geht über den Umsatz von Glutamin zu Glutamat und damit verbundener Ammonium‐Freisetzung. Dieses Ammonium wird mit dem bereits frei vorliegenden Ammonium über GIDH unter NADPH‐Verbrauch zu Glutamat umgesetzt. Da die Stöchiometrie bekannt ist, kann über die Abnahme an NADPH auf das vorhandene Ammonium geschlossen werden. Gemäß dem Hersteller‐Protokoll wird zur Bestimmung im Medium‐Überstand wie folgt vorgegangen:

Ammonium-Bestimmung

1. Zugabe von 10 µl Probe 2. Hinzufügen von 172 µl dest. Wasser und 30 µl Puffer (Solution 2) 3. Addition von 20 µl NADPH (Solution 3) 4. Für etwa 4 min auf dem Plattenschüttler mischen und im Anschluss bei 340 nm im Plate‐

Reader messen (= A1) 5. Zugabe von 2 µl GIDH (Suspension 5) 6. Inkubation bei RT für etwa 5 min auf dem Plattenschüttler 7. Bei 340 nm messen (= A2). Wichtig ist, dass das Ende der Reaktion erreicht ist. Dazu ein

weiteres Mal messen und auf Konstanz der Werte achten. Solange wiederholen bis kein Anstieg mehr zu bemerken ist (für weiteres siehe Anleitung des Herstellers)

Glutamin-Bestimmung

1. Vorlegen von 20 µl Puffer (Solution 1) 2. Zugabe von 10 µl Probe 3. Zugabe von 2 µl Glutaminase (Suspension 4) 4. Hinzufügen von 150 µl dest. Wasser und 30 µl Puffer (Solution 2) 5. Addition von 20 µl NADPH (Solution 3) 6. Für etwa 4 min auf dem Plattenschüttler mischen und im Anschluss bei 340 nm im Plate‐

Reader messen (= A1) 7. Zugabe von 2 µl GIDH (Suspension 5) 8. Inkubation bei RT für etwa 5 min auf dem Plattenschüttler 9. Bei 340 nm messen (=A2). Wichtig ist, dass das Ende der Reaktion erreicht ist. Dazu ein

weiteres Mal messen und auf Konstanz der Werte achten. Solange wiederholen bis kein Anstieg mehr zu bemerken ist (für weiteres siehe Anleitung des Herstellers)


‐Seite 47‐

Abbildung 4-1: Versuchsübersicht im Themenbereich „Medienoptimierung“


‐Seite 48‐

Für die Berechnung wird die Differenz zu einer Blank‐Probe benötigt. Für den Blank bleibt das Vorgehen identisch. Einziger Unterschied ist die Zugabe von 10 µl Wasser statt Probe.

Berechnung von Ammonium

∆ _ _ ( 15 )

Bestimmung von Glutamin

∆ _ _ ( 16 )

∆ ∆ ∆ ( 17 )

Die Konzentration kann nun über den Bezug ∗

∗ ∗∗ ∆ berechnet werden. Hierbei ist V das

finale Volumen, M die molare Masse von Lactat, ε der molare Extinktionskoeffizient von NADPH bei 340 nm (=6300 l/(mol*cm)), d die durchstrahlte Schichtdicke und v das Probenvolumen.

Laktat‐Bestimmung Zur Bestimmung der Laktat‐Konzentration ist das Laktat‐Kit der Firma Megazyme (K‐LATE) verwendet worden. Hierbei wird Laktat über LDH zu Pyruvat umgesetzt. Diese Reaktion ist mit der Bildung von NADH verknüpft. Da das Gleichgewicht allerdings auf Edukt‐Seite liegt, ist eine Folgereaktion in Form von Alanin‐Bildung von Nöten. Dabei wird Pyruvat mit zugegebenem Glutamat über die GPT transaminiert. Gemäß dem Hersteller‐Protokoll wird zur Laktat‐Bestimmung im Medium‐Überstand wie folgt vorgegangen:

1. Vorlage von 150 µl destilliertem Wasser 2. Zugabe von 10 µl Probe 3. Hinzufügen von 50 µl Puffer (Solution 1) 4. Supplementieren mit 10 µl Co‐Enzym NAD+ (Solution 2) 5. Zugabe von 2 µl GTP (Solution 3) 6. Inkubation bei RT für etwa 3 min 7. Messung am Plate‐Reader bei 340 nm (=A1) 8. Starten der Reaktion durch Zugabe von L‐LDH (Solution 4) 9. Mischen und nach etwa 10 min ein zweites Mal bei 340 nm messen (=A2). Wichtig ist, dass

das Ende der Reaktion erreicht ist. Dazu ein weiteres Mal messen und auf geringen, konstanten Anstieg achten (für Weiteres siehe Anleitung des Herstellers)

Die Konzentration kann nun über den Bezug ∗

∗ ∗∗ ∆ berechnet werden, wobei

∆ ist. Hierbei ist V das finale Volumen, MLac die molare Masse von Lactat, ε der molare Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm (=6300 l/mol·cm , d die durchstrahlte Schichtdicke und v das Probenvolumen.

Wird ein Standard in jedem Versuch mitgeführt, so vereinfacht sich die Berechnung im linearen Bereich über einen Dreisatz der jeweils gemessenen∆ .


‐Seite 49‐

4.2.8. ATP‐Bestimmung

Zur Bestimmung des ATP‐Gehalt der Zellen wird auf gängige Luciferase‐Assays zurückgegriffen. Das Prinzip beruht auf der Quantifizierung der Biolumineszenz, verursacht durch das Enzym Luciferase. Diese verwendet u.a. ATP und Luziferin als Substrat und setzt dieses unter Lichterscheinung um. In diesem Fall wird der ATP Determination Kit (A22066) der Firma Invitrogen/Molecular Probes verwendet. Die benötigten Puffer und Reaktionslösungen werden gemäß Herstellervorgaben angesetzt. Zu Beginn wird der Background der Standard‐Reaktionslösung bestimmt. Zu 90 µl der Reaktionslösung wird 10 µl Probenvolumen gegeben und die entstehende Lumineszenz umgehend im Plate‐Reader gemessen. Anzumerken ist, dass entweder der Überstand und somit freies ATP oder Zell‐Lysat verwendet werden kann. In diesem Fall sind die Zellen mittels eines Lysepuffers lysiert worden. Als Reaktionsgefäße dienten schwarze 96‐Multiwell Platten, um Störeinflüsse benachbarter Wells zu vermeiden.

4.3. Parametrisierung von Bilddaten

Das Bildmaterial, welches aus den Wachstumskurven hervorgeht, ist wie folgt aufgenommen und prozessiert worden.

4.3.1. Bildergenerierung

Um eine Datengrundlage für die Modellierung zu schaffen, werden die Versuche, welche für die Wachstumskurven durchgeführt werden, täglich bebildert. Das Vorgehen ist:

1. 24‐Multiwell Platte positionieren, um einen mittigen Bildausschnitt zu erhalten 2. Aufnahme mit 10‐facher Vergrößerung und Phasenkontrast 3. Das Bild als TIFF (ohne Kompression) speichern

Daraus resultiert ein Bild mit 2560 x 1920 Pixeln und einem Größenstandard von 2 px/µm.

4.3.2. Bildauswertung

Da die Segmentierung der Zellen manuell durchgeführt werden muss, wird das erzeugte Bild entsprechend beschnitten. Hierzu wird ein repräsentativer Bildausschnitt mit 700 px x 700 px in Adobe® Photoshop® erzeugt.

Segmentierung Der nun verkleinerte Ausschnitt wird in ImageJ [Schindelin et al. 2012] geöffnet und manuell segmentiert.

Dazu werden die Zellen mit dem „polygon selection“‐Werkzeug einzeln entlang des Zellumfangs markiert und so ein geschlossener Kurvenzug erzeugt. Jede erzeugte Fläche wird in den „ROI Manager“ geladen (Analyze > Tools > ROI Manager und dort Add [t]).

Es werden alle Zellen segmentiert sofern diese komplett im Bildausschnitt liegen. Abgeschnittene Zellen an den Bildrändern werden ignoriert. Ist dies erfolgt werden die Zellen nachfolgenden Parametern vermessen:

1. Flächenschwerpunkt als (x,y)‐Koordinaten: S(x,y) 2. Flächeninhalt: A 3. Feret‐Durchmesser: F

4. Circularity: C=4πA/U2 (U: Umfang)

5. Roundness: R=4A/πF2

Dazu wird zunächst der Größenstandard in ImageJ festgelegt. Unter dem Menüpunkt „Analyze > Set Scale“ werden folgende Werte eingetragen:

„Distance in pixels“: 2


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„Known distance“: 1

„Pixel aspect ratio“: 1

„Unit of length“: µm

„Global“: Haken setzen

Nun werden obige Parameter festgelegt. Dazu wird erneut unter dem Menüpunkt „Analyze > Set Measurements“ ein Haken vor jeweils folgende Optionen gesetzt:

„Area“

„Center of mass“

„Shape descriptors“

„Feret’s diameter“

„Display label“

„Add to overlay“

Durch Markierung aller Einträge im ROI‐Manager und einem Klick auf „Measure“ in Selbigen, werden alle segmentierten Zellen vermessen und die Ergebnisse in einer Tabelle ausgegeben. Diese Tabelle wird als CSV‐Datei gespeichert.

Auswertung der Zellform Zur Ableitung der Zellform werden die Deskriptoren „Roundness“ und „Circularity“ in Populationen eingeteilt. Die Intervallbereiche gestalten sich nach Tabelle 4‐4 wie folgt:

Tabelle 4-4: Auflistung der Populationen und zugehöriger Intervalle

Population Intervalle Circularity Intervalle Roundness

AZI ; ∈ |0 0,6 ∈ |0,3 0,5

∈ |0 0,3 ∈ |0,3 0,4

AZII ; ∈ |0 0,5 ∈ |0 0,3

∈ |0,4 0,6 ∈ |0,3 0,4

AZIII ; ∈ |0,6 0,7 ∈ |0,5 0,6

∈ |0,2 0,4 ∈ |0,3 0,5

SZIII ; ∈ |0,6 0,8 ∈ |0,4 0,7

SZII ; ∈ |0,8 1 ∈ |0,4 0,8

SZI ; ∈ |0,9 1 ∈ |0,8 1

DZ ; ∈ |0,5 0,9 ∈ |0,5 0,8 ∈ |0,5 0,6

∈ |0,8 1 ∈ |0,7 0,8 ∈ |0,5 0,7

TZ ; ∈ |0 0,5 ∈ |0,6 1

Die Anzahl der in diesen Intervallen liegenden Ereignisse werden summiert und deren Anteil, wie nachfolgend für AZ I exemplarisch gezeigt, berechnet:


‐Seite 51‐

∑ ;→

⋮ ( 18 )

Für jedes Bild ergibt sich somit eine Bilanz über die einzelnen Populationen, welches sich als Vektor

darstellen lassen. Multipliziert man diesen Anteil‐Vektor mit einem Gewichtungs‐Vektor

⋮ ( 19 )

und normiert den resultierenden Skalar auf den maximal zu erwartenden Wert, ergibt sich der Suspension Indication‐Index (SI‐Index).

⋮ ∙ ⋮

( 20 )

Für die weiteren Berechnungen ist folgende Gewichtung (Tabelle 4‐5) verwendet worden:

Tabelle 4-5: Verwendete Gewichtungsfaktoren der Formmessung

Gewichtungsfaktor Wert 0 4 7 9,5 16 20 15 0

Auswertung der Zellabstände Zur Beurteilung der Abstände zwischen zwei Zellen wird der jeweilige Flaschenschwerpunkt S(x,y) herangezogen und an MATLAB® übergeben.

Dazu werden die Koordinaten in zwei Spalten‐Vektoren aufgeteilt, die bei gleicher Zeilennummer den x‐ bzw. y‐Wert enthalten. Der Index k gibt an dieser Stelle die Anzahl an ausgewerteten Ereignissen wieder.

⋮ ⋮ ⟹

⋮

⋮

( 21 )

Über den delaunay‐Befehl innerhalb von MATLAB® kann die Triangulation durchgeführt werden:


‐Seite 52‐

tri=delaunay(datenx, dateny) ( 22 )

Das Ergebnis ist eine mx3‐Matrix „tri“. Somit finden sich in jeder Zeile drei Punkte Pm1 bis Pm3, welche ein Dreieck aus einer Menge von m Dreiecken bilden.

⋮ ⋮ ⋮ ( 23 )

Das Ergebnis der Triangulation kann über den Befehl triplot(tri, datenx, dateny)grafisch dargestellt werden. Um aus obiger Matrix die Koordinaten der Punkte zu erhalten, wird eine mx6 Matrix erzeugt.

⋮ ⋮ ⋮ ⋮ ⋮ ⋮ ( 24 )

Mit Hilfe dieser können die Längen zwischen zwei Punkten über den Satz von Pythagoras berechnet werden. In diesem Fall folgt die Ausgabe unter Angabe der zugehörigen Punkte Pmi in der 3mx3 Matrix .

⋮ ⋮ ⋮

; 3 ( 25 )

Diese Matrix wird zur weiteren Auswertung an Microsoft® Excel® übergeben. Neben diesen Werten werden der Feret‐Durchmesser F, der Flächeninhalt A und der Formdeskriptor R aus der ImageJ Auswertung benötigt.

In Excel werden zunächst die Werte von R von Duplikaten bereinigt. Dies erfolgt durch einen logischen Bezug. Die Punkte Pmi werden in der Zeile sortiert, da es für eine skalare Länge unerheblich ist, ob diese Größe von Pmi nach Pmj erfolgt oder entgegengesetzt. Die Bedingung lautet

,,, ; ß,

,, ;

, 1,2,3

1, … ,3

( 26 )

In einem weiteren Schritt werden nun die geordneten Punkte Pmi zusammen mit der berechneten Länge L über eine Stringverkettung zusammengefügt.


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, ; ß, ; ⇒ " , "" ß, "" " ( 27 )

Im nächsten Schritt folgt die Identifizierung von Duplikaten in der Menge von n Zeilen anhand der soeben ausgeführten Stringverkettung in jeder Zeile i.

⇒"Pklein,i""Pgroß,i""Li" " , "" ß, "" "1 →1 → ( 28 )

Im weiteren Verlauf werden ausschließlich „p“ eindeutige Werte betrachtet. Um die Form der Zellen in die Auswertung einfließen zu lassen werden mehrere Radien definiert.

Halber Feret‐Durchmesser: r 0,5

Radius des flächengleichen Kreises: r 0,5 ∙∙

Radius abgeleitet aus dem Formdeskriptor Roundness R: r 0,5 ∙ √ ∙

Radius entsprechend der kleinen Achse einer Ellipse: r∙

( 29 )

Zwischen zwei Zellen Zt (Radius , ) und Zt+1 (Radius , ) kann der Abstand Dr,i in Abhängigkeit

obiger Radien und der zugehörigen Länge Li berechnet werden. (Hierbei steht der Index „r“ als Platzhalter für die verschiedenen Radien‐Indizes „F“, „K“, „R“ und „a“).

, , , ( 30 )

Zu Zwecken der Normierung wird diese Netto‐Distanz auf die Summe berechneten Zellradien bezogen.

,,

, , ( 31 )

Die Häufigkeit dieser Quotienten , wird gemäß untenstehenden Intervallen gezählt (Tabelle

4‐6) und als , ausgegeben:

Tabelle 4-6: Übersicht der Intervalle und deren Grenzen als Grundlage der Summenbildung

Intervall (1…7) Bereich

1 , ∈ | 1 , 0,5 2 , ∈ | 0,5 , 0 3 , ∈ | 0 , 0,5 4 , ∈ | 0,5 , 1 5 , ∈ | 1 , 2 6 , ∈ | 2 , 5 7 , ∈ |5 ,


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Die Anzahl der Ereignisse , in einem Intervall werden auf die Gesamtzahl aller gezählten

Ereignisse normiert.

,,

∑ , ∙ 100 % ( 32 )

Für eine sich selbstanpassende Gewichtung wird auf das arithmetische Mittel sowie die Standardabweichung der Koeffizienten , von p Ereignissen zurückgegriffen:

∑ , ( 33 )

∑ ,

( 34 )

Hieraus lässt sich wiederrum der Variationskoeffizient der Verteilung berechnen:

∑ , ∙

∑ ,

( 35 )

Die berechneten Mittelwerte und Variationskoeffizienten werden nun auf bzw

normiert, so dass folgt:

1

;

1

( 36 )

Hieraus ergibt sich der Form‐Vektor

,

1∙ ,

1 ∙ ,

1 ∙ ,

1 ,

( 37 )


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der als dyadisches Produkt mit dem transponierten Gewichtungs‐Vektor zur Gewichtungs‐Matrix

führt.

⋮

⋮ ( 38 )

, ⊗

, ⋯ ,

, ⋯ ,

, ⋯ ,

⋯

( 39 )

Die einzelnen Elemente der Matrix werden in der Folge mit der relativen Häufigkeit ,

multipliziert, so dass sie als 4x7‐Matrix dargestellt werden kann.

, , ⋯ , ,

, , ⋯ , ,

, , ⋯ , ,

, ⋯ ,

, ⋯ ,⋮ , ⋮, ⋯ ,

( 40 )

Das abschließende Ergebnis wird über die Division der Summe aller Elemente , von durch

Summe jenes Spaltenvektors der Matrix für den gilt max erhalten. Ist also

beispielsweise das Element das Größte im Vektor so wird in der Folge die Spalte =7 hinsichtlich ihrer Elemente summiert.

∑ ∑ ,

∑ , ,∙ 100 % ( 41 )

4.4. Spezielle Methoden der Bioanalytik

Um weitere Charakteristika der jeweiligen Stoffwechsellage bestimmen zu können, ist eine Methode entwickelt worden, den hypoxischen Zustand einer Zelle zu messen. Auf Grund der Möglichkeit mehrere Analyten gleichzeitig in einer Probe quantifizieren zu können, ist eine mit der Massenspektrometrie (ESI‐MS) gekoppelte HPLC‐Anlage zum Einsatz gekommen. Diese besteht dabei aus Komponenten der Firma Shimadzu gemäß Tabelle 4‐7.

Tabelle 4-7: Komponentenliste der eingesetzten HPLC

Komponente Typenbezeichnung

Injektor SIL-10AD Pumpen LC-10AD Säulenofen CTO-10AC Steuereinheit SCL-10A UV-Spektrometer SPD-10AV


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4.4.1. Standards

Zur Methodenentwicklung und Bestimmung der Nachweisgrenze werden zunächst Standards eingesetzt. Hierbei sind Lac, Pyr, Asc, Cr, CrP, GSH und GSSG gut in Wasser lösbar und werden mit einer Konzentration von 10 mM angesetzt (Details siehe Tabelle 4‐8). HX, X und UA sind schwerer lösbar. Dazu wird das die jeweilige Substanz gemäß einer Endkonzentration von 1 mM in ca. 2/3 des Endvolumens vorgelegt. Es wird zur vollständigen Dissoziation intervallweise tropfenweise 6 %ige Ammoniaklösung zu getropft und ins Ultraschallbad eingebracht, bis die jeweilige Substanz final gelöst vorliegt.

Tabelle 4-8: Liste der verwendeten Standards

Substanz Ascorbinsäure ≥99 % Creatin ≥98 % Creatinphosphat ≥98 % Harnsäure ≥99 % Hypoxanthin ≥99, 5 % Laktat ≥99 % Pyruvat ≥99 % ox. Glutathion ≥98 % red. Glutathion ≥98 % Tetraethoxypropan ≥96 %Xanthin ≥98 %

MDA ist als Standard nicht erhältlich und wird deswegen aus Tetraethoxypropan (TEP) umgesetzt (für Details siehe [Rupprecht 2012]). Dazu werden 73,2 mg bzw. 79,65 μl (Dichte 0,919 g/cm3) in 10 ml 0,1 N HCl gelöst, in einem kochenden Wasserbad für 5 min erhitzt und sofort auf RT abgekühlt. Es wird mit Wasser (dest.) auf 50 ml aufgefüllt. Die resultierende Lösung hat (im Falle einer vollständigen Umsetzung) eine Konzentration von 538 μg/ml. Die Standards werden 10 min im Ultraschallbad entgast, aliquotiert und bei ‐20 °C eingefroren. Für die Messungen wurden alle elf Standards (siehe Tabelle 4‐9) gemischt und mit Acetonitril (AcN) verdünnt.

Tabelle 4-9: Ansetzen der Standards

Substanz c [mM] M [g/mol] V [ml] Einwaage [mg] Lac 10 112,06 50 56,6 Pyr 10 110,04 50 55,58 Asc 10 198,11 50 100,1 Cr 10 131,13 50 66,9 CrP 10 327,14 50 166,91 GSH 10 397,32 50 156,8 GSSG 10 612,63 50 312,56 HX 1 136,11 100 13,74 X 1 152,11 100 15,29 UA 1 168,11 100 16,98

4.4.2. Probenvorbereitung

Zur Messung werden jeweils getrennt das Zellpellet wie auch der zugehörige Medienüberstand herangezogen. Die Probenvorbereitung beider ist in der Folge erläutert.


‐Seite 57‐

Aus Zellkulturen Die Zellen werden entnommen (ggf. abgelöst) und zentrifugiert (180 g, 8 min, 4°C), der Überstand wird verworfen bzw. für die Überstandsmessung separiert. Das Pellet wird zweimal mit PBS gewaschen (Zentrifugation bei gleichen Parametern). Das nun mediumfreie Pellet wird in 50 μl Reinstwasser aufgenommen und bei ‐20°C für mindestens 30 min eingefroren. Nach dem Auftauen wird das Pellet mit Stickstoff überschichtet und 15 min mit Eiswasser im Ultraschallbad lysiert. Währenddessen werden die Ultrazentrifugationseinheiten (Roti‐Spin MINI‐3) zur Vorbereitung zweimal mit 500 μl Reinstwasser zentrifugiert (3000 g, ca. 8 min, 4°C). Nach dem Ultraschall wird die Probe durch einen Millex‐HV (Millipore, PVDF, 0,45 μm) Filter in die Ultrazentrifugationseinheit gegeben, mit Stickstoff überschichtet und abzentrifugiert (3000 g, ca. 15 min, 4°C). Das Permeat wird mit AcN verdünnt und zur Messung in einem HPLC‐Vial verschlossen.

Aus Mediumüberständen Da in diesem Fall keine Zellen lysiert werden müssen, beginnt das ansonsten identische Vorgehen mit der Ultrafiltration.

4.4.3. HPLC Methode

Die generelle Methode der HPLC‐Läufe ist Tabelle 4‐10 zu entnehmen. Auf Grund beobachteter Druckanstiege wird in jeden Lauf ein zehnminütiger Spülvorgang mit 90 % Puffer integriert.

Tabelle 4-10: Parameter für die Flüssigkeitschromatographie

Parameter Wert HPLC-Anlage Shimadzu Prominence Säule SeQuant ZIC-cHILIC Länge 150 mm Durchmesser 2,1 mm Partikelgröße 3 μm Porengröße 100 A Mobile Phase A 10 mM Ammoniumacetat pH 6,7 Mobile Phase B Acetonitril (LC-MS grade) Flow 0,2 ml/min Säulentemperatur 30 °C Injektionsvolumen 5 μl Autosampler 4 °C UV-Detektor Kanal 1 206 nm UV Detektor Kanal 2 260 nm Gradient 0-5 min hold 80 % B 5-20 min 80-40 % B 20-25 min 40-10 % B 25-35 min hold 10 % B 35-40 min 10-80 % B 40-50 min hold 80 % B

4.4.4. MS Methode

Die Parameter gehen auf Vorarbeiten zurück (siehe [Rupprecht 2012]) und sind für diese Arbeit teilweise angepasst worden. Die allgemeinen Parameter sind in Tabelle 4‐11 angegeben. Die stoffspezifischen Parameter finden sich in Tabelle 4‐12. Hierbei ist zu beachten, dass GSH sowohl positiv als auch negativ gemessen werden kann.

Tabelle 4-

Tabelle 4-

4.5. B

4.5.1. P

Zur BestAbbildun

AbbildungParameter

Hieraus Zelldicht

-11: Allgemein

12: Stoffspezifi

SLPACC

G

GHXUM

Berechnung

Parameter a

timmung deng 4‐2 exemp

g 4-2: Halbloga

werden diete (PCD) und

ne Parameter für

fische Paramete

Substanz QLac 89Pyr 86Asc 17Cr 13CrP 21

GSH 3030

GSSG 61HX 13X 15UA 16MDA 70

g abgeleitet

us Rohdaten

r wachstumplarisch darg

arithmische Auf

e Verdoppe flächenbezo

r das Massensp

ParameterCurtain GaIonspray VTemperaturIon Source Ion Source Interface H

r für die massen

1 Q3 9 42,9 6,9 58,8 74,9 86,4 32 89,6 10 78 08,1 179 06 142,311 305,534,9 92,1 51 107,366,9 124 0,7 70,7

ter Größen

n

scharakterisgestellt, ausg

ftragung der Leb

lungszeit (tdogene Zelldic

‐Seite 58‐

pektrometer

as (CUR) Voltage (IS)

r (TEM) Gas 1 (GS1Gas 2 (GS2

Heater (ihe)

nspektrometrisc

Ladung D- - - + - + - - - - - -

sierenden Pagewertet.

bendzellkonzen

d) bzw. spechte (ACDexp

Wert 25 +/- 4500400

) 25 ) 60

on

che Detektion

DP EP -40 -5,8-16 -3 -42 -6 95 4 -10 -6 35 5,5 -20 -6 -65 -4 -60 -7 -52 -2 -55,8 -3,8-21 -2

arameter we

ntration gegen d

ezifische Waund ACDstat)

MATERIAL

CE CX-18,5 -4,5-10 -52-30 -1015 1 -30 -4 32 3 -30 -1 -52 -12-25 -58-26 -25-25 0 -20 -51

erden die Ve

die Prozesszeit

achstumsrateberechnet.

L UND MET

XP 5

2 0

2 8 5

1

ersuchsdate

und daraus resu

e (µ), die m

THODEN

n, wie in

ultierende

maximale


‐Seite 59‐

∙ → μln

( 42 )

ln2μ ( 43 )

Da die Verdopplungszeit einprägsamer ist, wird diese zum Vergleich der Medien bevorzugt eingesetzt. Die PCD ist als maximale Zelldichte definiert und kennzeichnet oft die stationäre Phase.

max ( 44 )

Aus dem Verlauf der Lebendzellzahl bzw. deren Konzentration ergibt sich als Fläche unter dieser Kurve die ACD. In dieser Arbeit wird zwischen der Fläche innerhalb der Wachstumsphase und der stationären Phase unterschieden. Die oberen Integrationsgrenzen kennzeichnen sich durch den Eintritt in die stationäre Phase (konstante LZZ) sowie durch den Übergang in die Sterbephase (Vitalität kleiner 85 %).

( 45 )

Die Rohdaten sowie ausgewerteten Wachstumsverläufe finden sich im Anhang.

4.5.2. Berechnung der Sauerstoffaufnahmerate

Mit Kenntnis des kla‐Werts für 24‐Multiwell Platten, ist es möglich von einem Sauerstoffpartialdruck, welcher in einer laufenden Kultur gemessen wird, eine Sauerstoffaufnahmerate (oxygen uptake rate = OUR) zu berechnen. Mit Kenntnis der Zellkonzentration und des Arbeitsvolumens kann hierbei die Sauerstoffaufnahme pro vitaler Zelle und Zeit angegeben werden. Dabei wird vom bereits genannten Zusammenhang zwischen OTR und OUR unter quasi‐stationären Bedingungen ausgegangen.

∙ ( 46 )

Somit ergibt sich OTR = OUR und letztere kann über die Differenz der Sauerstoffkonzentration (Sättigungskonzentration zu aktuellem Messwert) und dem bestimmten kla‐Wert berechnet werden. Ist die Zellzahl bekannt, kann dieser Wert in die spezifische Sauerstoffverbrauchsrate umgerechnet werden.

4.5.3. Berechnung von CORE‐Parametern

Der Begriff CORE‐Parameter (Consumption and Release) greift alle Größen zusammen, die im Medium verbraucht oder akkumuliert werden. Diese Größen werden bis auf den pH‐Wert zu distinkten Zeitpunkten zusammen mit der Zellzahl bestimmt. Da die zugehörigen Zeitintervalle


‐Seite 60‐

entsprechend groß sind, gilt der quasi‐stationäre Ansatz nicht. Aus diesem Grund werden diese Werte als Konzentration auf die ACD zweier Zeitpunkte bezogen.

∆

∆ ( 47 )

Ein Spezialfall ist die Ansäuerungsrate ACR. Der pH‐Wert wird zunächst in die Protonen‐Konzentration umgerechnet. Die jeweilige Protonen‐Differenz wird dann nach obiger Formel kalkuliert. Für spezielle Versuche ist das Intervall auf etwa 5 h angepasst worden, um es einem einzelnen Zählzeitpunkt zu ordnen zu können. Dabei wird erneut von einem quasi‐stationären Zustand ausgegangen.

4.5.4. Berechnung der zellbezogenen WST‐Bildung

Das Rohsignal des WST‐8 Assays ist die gemessene Absorption entsprechend dem gebildeten Formazans. Dieses kann entweder durch die LZZ zu jedem Zeitpunkt dividiert werden (siehe 10.5), um den mittleren Beitrag pro Zelle zu erhalten oder als Stoffumsatzrate angegeben werden. Dabei ist zu beachten, dass die genaue Inkubationszeit des Tests bekannt ist. Über das Lambert‐Beersche Gesetz wird die Absorption (A) in eine Konzentration umgerechnet. Diese kann in eine Bildungsrate pro Zelle überführt werden, wenn der Wert durch die Inkubationszeit t und Lebendzellzahl X dividiert wird.

Der Parameter d ergibt sich aus der Füllhöhe des Wells mit Beachtung des Meniskus zu etwa 0,28 cm. Der molare Extinktionskoeffizient ergibt sich zu 30700 Lmol‐1cm‐1 [Ishiyama 1997].

∙ ∙ →∙ ∙

( 48 )

ERGEBNISSE

‐Seite 61‐

5. ERGEBNISSE In Tabelle 5‐1 sind die verwendeten Messmethoden nach Analyten aufgelistet. Hierbei ist eine Unterscheidung nach der Möglichkeit zur Online‐Messung, der Beeinflussung der laufenden Kultur und der Detailtiefe getroffen worden. Es ergibt sich die notwendige Reihenfolge der Versuche bzw. die Notwendigkeit von Parallelversuchen.

Tabelle 5-1: Übersicht der Messsysteme und Methoden

Methode Messgröße Analyt Online Invasiv Signal Trypanblau-Zählung Anzahl & Färbung Zelle Nein ++ Population SDR-Messungen Fluoreszenz Medium Ja 0/+ Summe Enzym-Tests Absorption/Enzymaktivität Medium Nein + Summe Durchflusszytometrie Apoptose/Todes-Marker Zelle Nein ++ Population LC-MS Diverse (siehe Methode) Beide Nein ++ Summe Fluoreszenzmikroskopie Fluoreszenz Zelle Nein + Population Live-Cell-Imaging Bilddaten (ungefärbt) Zelle Ja 0 Population

5.1. Der Sensor Dish Reader (SDR)

Ein Beispiel für eine non‐invasive Online‐Messung spiegelt der Sensor Dish Reader der Firma PreSens wider. Als Fundament dieser Arbeit wird er zunächst charakterisiert und auf Vergleichbarkeit mit anderen Multiwell‐Systemen geprüft. Modifizierte SDR Platten werden je nach Messgröße als OxoDish (Sauerstoffmessung) oder HydroDish (pH‐Wert‐Messung) bezeichnet.

5.1.1. Kultivierung im SDR

Es hat sich herausgestellt, dass auf dem Hydrogel des Sensorspots kein Wachstum adhärenter Zellen stattfindet (siehe Abbildung 5‐1). Um den Einfluss dieser geänderten Umgebung auf das Zellwachstum zu untersuchen, sind Wachstumskurven erstellt worden.

Eine graphische Gegenüberstellung ist in Abbildung 5‐2 dargestellt. Hierbei ist zu beachten, dass in beiden Systemen ähnliche PCDs erreicht werden. Die zur Verfügung stehende Besiedelungsfläche im SDR System ist durch den aufgebrachten Sensorspot geringer. Dadurch ist die auf die Fläche in cm2 bezogene PCD im SDR System größer als in den Greiner CELLSTAR™ Platten. Bei der Kultivierung von L929 Zellen zeigen sich ab einer Inkubationszeit von 100 Stunden Unterschiede zwischen den Systemen, wobei sowohl die Lebendzellzahl als auch die Vitalität in den Greiner CELLSTAR™ Platten geringer als im SDR System ist. In Tabelle 5‐2 ist dargestellt, dass die maximale Wachstumsrate in OxoDishes für beide Zelllinien geringer ist.

Abbildung 5-1: Kultivierung adhärenter Zellen im SDR System bei 100-facher Vergrößerung Bild A CHO Zellen, Bild BL929 Zellen. Am linken Bildrand ist jeweils der Sensorspot zu sehen.

ERGEBNISSE

‐Seite 62‐

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180105

106

107

Prozesszeit [h]

LZZ [1/m

l]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Vitalität [%]

A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180105

106

107

LZZ [1/m

l]

Prozesszeit [h]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Vitalität [%]

B

Abbildung 5-2: Vergleich der Kultivierungsumgebung zwischen Greiner CELLSTAR und SDR-Well Platten. Bild A: CHO Bild B: L929; LZZ: Greiner CELLSTAR; OD24-1308-01; Vitalität: Greiner CELLSTAR OD24-1308-01

Tabelle 5-2: Vergleich der Wachstumsparameter zwischen Greiner CELLSTAR und OxoDish OD24-1308-01

Kultivierungs-system

Zelllinie Wachstumsrate µmax [1/h]

Verdopplungszeit td [h]

maximale Zelldichte [LZZ/ml]

maximale Zelldichte [LZZ/cm2]

Greiner CELLSTAR®

CHO 0,039 18 1,9·106 9,5·105

L929 0,032 22 1,9·106 9,5·105

OD24- 1308-01

CHO 0,033 21 2,0·106 1,0·106

L929 0,029 24 1,9·106 9,9·105

Chargeneinfluss In Abbildung 5‐3 ist der zeitliche Verlauf des pO2‐Signals in zwei verschiedenen Produktionschargen

dargestellt. Dabei sind CHO Zellen mit einer Startzellzahl von 5,0·104 LZZ ml (A) bzw. 1,0·105 LZZ

ml

(B) kultiviert worden. Nach 70 h Kultivierungsdauer ist die Lebendzellzahl sowie die Vitalität der Kultur (B) in den drei Systemen bestimmt worden. Die Ergebnisse sind in Abbildung 5‐4 dargestellt.

Hierbei weisen beide OxoDish Platten eine wesentlich geringere Lebendzellzahlkonzentration auf als die CELLSTAR™ Platte. Die Vitalität der Kulturen ist in allen drei System in einem ähnlichen Bereich, wobei sie in der Charge 1245‐01 rein rechnerisch mit 97,7 % am geringsten ausfällt. Der in Abbildung 5‐3 dargestellte Verlauf des Sauerstoffpartialdruckes zeigt, dass die Zellen im System 1245‐01 ein unterschiedliches Wachstumsverhalten zeigen. Wie in Abbildung 5‐5 B zu erkennen ist, erfolgt die Oberflächenbesiedelung der Zellen ungleichmäßig. Der Bereich um den Sensorspot wird von den Zellen ausgespart.

ERGEBNISSE

‐Seite 63‐

0 10 20 30 40 50 60 700

20

40

60

80

100

pO

2

[% atm

]

Prozesszeit [h]

A

0 10 20 30 40 50 60 700

20

40

60

80

100

pO

2

[% atm

]

Prozesszeit [h]

B

Abbildung 5-3: Zeitlicher pO2-Verlauf für verschiedene OxoDish Chargen bei Kultivierung von CHO Zellen: rot Charge „OD1319-01“; schwarz „OD1319-01“; Startzellzahl: Bild A: 5,0 ∙ 10 , Bild B: 1,0 ∙ 10 . Verlaufslinien stellen jeweils den Mittelwert aus drei einzelnen Messungen dar. Die Hüllkurve gibt die Standardabweichung wieder

OD1245‐01 OD1319‐01 Greiner CELLSTAR0,0

5,0x105

1,0x106

1,5x106

2,0x106

LZZ [1/m

l]

Charge

90

92

94

96

98

100

Vitalität [%]

Abbildung 5-4: Vergleich von OD1245-01, OD1319-01 und Greiner CELLSTAR® nach 70 h Kultivierung bezüglich Lebendzellzahl und Vitalität. Startzellzahl: 1,0 ∙ 10

Abbildung 5-5: Mikroskop-Aufnahmen der Charge OD1245-01. Besiedelungsfläche am Sensorspot bei 100-facher Vergrößerung

ERGEBNISSE

‐Seite 64‐

Um eine homogene Verteilung der Zellen über die gesamte Fläche der OxoDish Platten zu erreichen, werden verschiedene Vorgehensweisen getestet. Durch die Beschichtung der Welloberfläche mit extrazellulärer Matrix (ECM) sollte eine Besiedlung des Sensorspots ermöglicht werden. Die Verwendung von ThinCert® Zellkultureinsätzen sollte zusätzliche Besiedelungsfläche über dem Hydrogel schaffen. Durch diese Methode kann oberhalb des Sensorspots auf einer gesonderten Membran eine zusätzliche Zellkultivierung erfolgen. Die Ergebnisse dieser Messung sind in Abbildung 5‐6 dargestellt.

Es ist zu erkennen, dass sich durch die Beschichtung mit ECM keine Unterschiede zur Referenzkultur ergeben. Nach 42 h ist die Platte aus dem Inkubator entnommen worden, um sie unter dem Lichtmikroskop zu beobachten. Zu diesem Zeitpunkt ist ein Anstieg des pO2 zu messen gewesen. Dieser fällt mit 25 % für die Referenz bzw. die ECM Beschichtung deutlich größer aus als für den ThinCert® Einsatz (5 %). Weiterhin zeigt sich durch den Zellkultureinsatz eine deutlich geringere Sauerstoffsättigung in der stationären Phase (10 %) im Vergleich zur Referenz (40 %). Nach 120 h ist der Zellkultureinsatz entfernt worden. Die Sauerstoffsättigung steigt dadurch von 60 % auf 90 %.

0 20 40 60 80 100 1200

20

40

60

80

100

pO

2

[% atm

]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-6: Modifikation der OxoDish Platten. Rot: ECM-Beschichtung Blau: Referenzplatte Schwarz: SDR mit ThinCert Einsatz

Einflussfaktoren der Online‐Messung Die Messung der Sauerstoffsättigung ist temperaturabhängig, da nicht zu Letzt die maximale Sättigungskonzentration eine Funktion dieser ist. Arain beschreibt, dass die Sensoreigenschaften ebenfalls temperaturabhängig sind [Arain 2006]. In jedem Sensor Dish Reader ist ein Temperaturfühler verbaut, der die Aufzeichnung des Temperaturverlaufs ermöglicht.

0 20 40 60 80 100 120 140

65

70

75

pO

2

[% atm

]

Prozesszeit [min]

38,0

38,2

38,4

38,6

Temperatur [°C]

Abbildung 5-7: Temperaturabhängigkeit der pO2-Messung. Temperatur rot, Sauerstoffpartialdruck schwarz.

ERGEBNISSE

‐Seite 65‐

Alle Messungen sind in einem Inkubator durchgeführt worden, der die Temperatur auf 37°C regelt. Durch Öffnen des Inkubators ändert sich das pO2‐Signal merklich, wie Abbildung 5‐7 zu entnehmen ist. Es ist hierbei ein Anstieg um 8 % zu beobachten. Die Rückkehr auf die ursprüngliche Temperatur beträgt etwa zwei Stunden. In Tabelle 5‐3 ist, ausgehend von einer Kalibration bei 37°C, die resultierende Temperaturänderung als Funktion der pO2 dargestellt.

Tabelle 5-3: Temperaturabhängigkeit der Sauerstoffmessung ohne den Einfluss von CO2

ΔpO2 [% atm] ΔT [°C]

0 0

7,5 2

14,5 4

21,5 6

28 8

36,5 10

44 12

5.1.2. Bestimmung kla‐Wert für 24‐Multiwell Platten

Der volumenbezogene Stoffübergangskoeffizient ist für die Berechnung der korrekten Sauerstoffaufnahmerate von Bedeutung. Die Ermittlung erfolgte chemisch durch die Sulfitmethode. Für den Versuch ist eine OxoDish Platte zur Sauerstoffmessung und eine HydroDish Platte zur pH‐Messung verwendet worden.

Zur Berechnung ist es zunächst notwendig die Reaktionszeit tR zu bestimmen. Diese kann graphisch ermittelt werden. Die Reaktion gilt als beendet, wenn die Sauerstoffsättigung 80 % atm beträgt. Aus Abbildung 5‐8 kann tR mit 25,3 h abgelesen werden. In Abbildung 5‐8 (oben) ist zu erkennen, dass die Sauerstoffsättigung erst bei Erreichen eines konstanten pH‐Wertes ansteigt.

Nach diesem Verfahren konnte der kla‐Wert aus Abbildung 5‐8 zu 47,06 1/h bestimmt werden. Dieser Wert ist aus dem Mittelwert von 24 Einzelmessungen errechnet worden. Tabelle 5‐4 gibt Aufschluss über die Statistik der Messung.

Tabelle 5-4: Statistische Größen der kla-Bestimmung

Mittelwert Standardabweichung Maximum Minimum CV kla 47,1 5,5 51,2 22,6 0,12

ERGEBNISSE

‐Seite 66‐

0 10 20 30 40 50 60 70

0

50

100

pO

2

[% atm

]

Prozesszeit [h]

7

8

9

pH [‐]

20 21 22 23 24 25 26

0

25

50

75

100

pO

2

[% atm

]

Prozesszeit [h]

7

8

9

pH [‐]

Abbildung 5-8: kla-Bestimmung über die Sulfitmethode. Gezeigt sind pO2 (rot) und pH-Verlauf (blau) für die Reaktion einer 0,5 molaren Natriumsulfitlösung mit Sauerstoff. Dargestellt als Mittelwert aus 24 Einzelmessungen. Die Abbildung unten zeigt einen Ausschnitt.

5.2. Untersuchung des Metabolismus

Zur Bearbeitung des Themenkomplexes der Medienoptimierung sind Wachstumskurven aufgenommen worden. Aus den jeweiligen Versuchen werden charakterisierende Parameter abgeleitet.

5.2.1. Wachstumskurven‐bezogene Parameter

Aus der Zellzählung an sich lassen sich über den Verlauf der Lebendzellzahl (LZZ) beispielsweise Wachstumsphasen, Verdoppelungszeiten oder maximale Zelldichten berechnen. Aus Gründen der Übersicht finden sich die Rohdaten sowie abgeleiteten Rohdaten im Anhang unter Kapitel 10.2 bis 10.7.

Einteilung in Wachstumsphasen Für die spätere Zuordnung von Wachstums‐ und Verbrauchsparametern, sind die Wachstumskurven in die jeweiligen Wachstumsphasen (Wachstum, Stationarität, Rückgang) eingeteilt worden. Das Entscheidungskriterium für die Wachstumsphase ist eine zunehmende Zellzahl. Die stationäre Phase gilt ab dem Zeitpunkt, zu dem kein Netto‐Wachstum mehr festzustellen ist. Die Retardationsphase wird ab einer Vitalität von 85 % angesetzt. Die Einteilungen in Tabelle 5‐5 erfolgen gerundet, da die Bewertung auf Grund der Zählung nur zu diskreten Zeitpunkten erfolgen kann.

ERGEBNISSE

‐Seite 67‐

Tabelle 5-5: Gerundete Zeitintervalle der Wachstumsphasen. Die Phasen Wachstum, Stationarität und Rückgang sind von oben nach unten angeordnet

DMEM/

F-12 Advanced DMEM

OptiCHOEx-Cell 325

PF RPMI 1640

Advanced RPMI

CHO 0 – 80 h

80- 140 h Ab 140 h

0 – 80 h 80- 140 h Ab 140 h

0 – 100 h Ab 100 h

n/a

n/a 0-180 h

n/a

L929 0 – 75 h 75 – 95 h Ab 95 h

0 – 75 h 75 – 95 h Ab 95 h

n/a n/a n/a

MHEC5-T 0 – 70 h

70 – 100 h Ab 100 h

0 – 50 h 50 – 75 h Ab 75 h

n/a n/a n/a

Jurkat 0 – 100 h

n/a Ab 100 h

0 – 100 h n/a

Ab 100 h

HepZ 0 – 100 h

n/a Ab 100 h

0 – 100 h n/a

Ab 100 h

PAC 0 – 100 h

n/a Ab 100 h

0 – 80 h Ab 80 h

n/a h

Bestimmung der Verdoppelungszeit bzw. µmax

Für die Auswertung der maximalen Wachstumsrate bzw. der maximalen Verdoppelungszeit wird jeweils die erste Wachstumskurve herangezogen und die Steigung in der exponentiellen Wachstumsphase bestimmt. In Tabelle 5‐6 sind die Verdoppelungszeiten in Stunden für alle eingesetzten Varianten nach Zellen und Medienvariante getrennt dargestellt.

CHO Zellen zeigen für das DMEM/F‐12 Medium mit 2 mM Glutamin die kürzeste Verdoppelungszeit. Die Erhöhung der Glutamin‐Konzentration auf 4 mM oder 6 mM führt zu einer Erniedrigung dieses Wertes. Der Unterschied zu 4 mM ist allerdings gering. Im Vergleich der 4 mM Gln‐Konzentrationen mit 10 % und ohne (0 %) FKS, zeigt sich für die Serumsupplementierung eine höhere Teilungsrate. Beide liegen circa 10 h auseinander. Für Advanced DMEM zeigt sich im Falle von CHO Zellen eine minimale Verdopplungszeit von 22 h bei einer Supplementierung mit 4 mM Gln. Hier wirkt sich die Serumreduzierung auf 1 % [v/v] in einer Erhöhung der Verdoppelungszeit aus. Die Spannweite ist in diesem Fall deutlich geringer als bei Verwendung von DMEM/F‐12. Wird das speziell für die Serumfreie CHO‐Kultur entwickelte Medium OptiCHO verwendet, so ergibt sich erneut die geringste Verdoppelungszeit bei einer Zugabe von 4 mM Gln. Die Erhöhung oder Erniedrigung führt zu einer Zunahme der Verdoppelungszeit, welche von ihrer Spannweite größer ist als im Falle von Advanced DMEM. Der Einsatz eines alternativen Serumfreien Mediums (Ex‐Cell 325 PF) zeigt nahezu kein Wachstum, so dass die theoretische Verdoppelungszeit etwa 365 h beträgt.

Die murine Fibroblasten‐Zelllinie L929 zeigt ein ähnliches Verhalten zu CHO‐Zellen. Im Falle von DMEM/F‐12 findet sich die minimale Verdoppelungszeit bei einer Glutamin‐Gabe von 2 mM. Eine Steigerung dieser führt zu einer Steigerung, um etwa eine Stunde. Wird der Medium‐Variante mit 4 mM das Serum entzogen, bleibt die Wachstumsrate bei 18 h. Bei Verwendung des Advanced DMEM mit 1 % FKS werden mit 22 h bis 24 h erhöhte Teilungszeiten erreicht. Das Minimum findet sich bei 4 mM Gln. Die Verdoppelungszeit sinkt bei der Verwendung von OptiCHO mit 4 mM Gln auf 21 h und liegt damit zwischen DMEM/F‐12 und Advanced DMEM.

ERGEBNISSE

‐Seite 68‐

Tabelle 5-6: Übersicht über die Verdoppelungszeit in Stunden aller eingesetzter Zelllinien/primärer Zellen und zugehörige Medienvarianten

Medium FKS [v/v]

Glutamin [mM]

CHO L929 MHEC5-

T Jurkat HepZ PAC

DMEM/F-12

0 % 4 25 18 27 n/a 330

10 %

2 15 17 21 27 34 4 16 18 33 32 38 6 20 18 23 30 39

Advanced DMEM

1 %

2 25 24 23 n/a 38 4 22 22 20 42 51 6 22 24 22 41

OptiCHO 0 %

2 27 4 17 21 80 6 28

Ex-Cell 325 PF 0 % 4 365

RPMI 10 %

2 25 4 24 6 25

Advanced RPMI

1 %

2 23 4 25 6 25

Heterogener zeigen sich Endothelzellen aus dem Mausherzen (MHEC5‐T). Bei Verwendung des DMEM/F‐12 Standard Mediums liegt das Minimum mit 21 h erneut bei 2 mM Gln. Eine Steigerung auf 4 mM erhöht diese um über 50 % auf etwa 33 h. Werden 6 mM Gln zugegeben erniedrigt sich die Teilungszeit auf 23 h. Ein Serumentzug der 4 mM Variante führt ebenfalls zu einer Abnahme der Teilungszeit auf 27 h. Der Einsatz von OptiCHO führt zu einer Abnahme der Wachstumsrate, so dass eine Verdoppelung alle 80 h stattfindet.

Einheitlich stellt sich die Glutamin‐Variation bei Jurkat‐Zellen dar. Diese verdoppeln sich unabhängig von der Glutamin‐Gabe in RPMI 1640 mit 10 % FKS (2‐6 mM) etwa alle 25 h. Die Verwendung des serumreduzierten Advanced RPMI zeigt im Mittel ebenfalls einen Wert von 25 h. Einzig für die Variante mit 2 mM Gln ist die Verdoppelungszeit mit 23 h etwas kürzer.

Die Leber‐Zelllinie HepZ zeigt für DMEM/F‐12 mit 10 % FKS bei 2 mM die höchste Teilungsrate. Mit Erhöhung der Glutamin‐Konzentration steigt diese bei 4 mM Gln auf ein Maximum von 32 h, um im weiteren Verlauf bei 6 mM Gln auf 30 h zu sinken. Der Serumentzug führt zu keinem nennenswerten Wachstum. Die Umstellung auf Advanced DMEM führt im Falle von 4 mM und 6 mM zu vermindertem Wachstum und einer Verdoppelungszeit von über 40 h. Der Versuch mit 2 mM konnte im ersten Durchlauf der Versuchsreihe nicht ausgewertet werden. Im zweiten Lauf ergibt sich Verdoppelungszeiten von 49 h (zum Vergleich zweiter Lauf 4 mM: 57 h; 6 mM: 59 mM).

Die primären Zellen aus der Aorta des Hausschweins reagieren auf steigende Glutamin‐Konzentration mit einer erhöhten Verdoppelungszeit. Diese steigt ausgehend von 2 mM Gln von 34 h auf 39 h bei 6 mM Gln. Ein Serumentzug erhöht die Verdoppelungszeit deutlich auf circa 330 h. Die Serumreduzierung durch den Einsatz von Advanced DMEM verringert die Teilungsrate ebenfalls. Hier liegen die Zeiten bei 38 h für 2 mM Gln und 51 h für 4 mM Gln.

ERGEBNISSE

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Bestimmung der maximalen Lebendzellkonzentration PCD Als Grundlage dienen die beiden Durchgänge einer jeden Wachstumskurve. Es wird jeweils der höchste erhaltene Wert in Tabelle 5‐7 wiedergegeben.

Beginnt man diese Betrachtung erneut mit CHO‐Zellen, so ergibt sich ein positiver Zusammenhang

mit der Glutamin‐Konzentration. Ausgehend von 2 mM steigt die PCD von 1,3·106 1/ml auf 1,6·106 (6 mM Gln). Die PCD der serumfreien Variante erreicht einen ähnlichen Wert zu der Kultivierung mit 2 mM Gln und 10 % FKS. Der Einsatz von Advanced DMEM bringt eine maximale PCD in der

Versuchsreihe von 1,1·106 1/ml hervor. Eine leichte Zunahme der PCD mit steigender Gln‐Konzentration ist feststellbar. Die gleiche Tendenz bildet sich im serumfreien System mit OptiCHO ab.

Hier steigt die PCD über die Glutamin‐Variation von 1,1·106 1/ml auf 1,3·106 1/ml.

Ein gegenläufiges Ergebnis offenbart der Vergleich der L929 Kulturen in DMEM/F‐12. Hier wird eine

PCD von etwa 1,6·106 1/ml erreicht. Mit zunehmender Glutamin‐Konzentration sinkt die PCD auf

1,5·106 1/ml. Bei Serumentzug zeigt sich mit 1,9·106 1/ml eine höhere PCD bei gleicher Glutamin‐Gabe von 4 mM. Bei Anwendung des serumreduzierten Advanced DMEM ergibt sich ebenfalls eine abnehmende Tendenz der PCD mit steigender Gln‐Konzentration. So liegt diese bei 2 mM Gln bei

maximal 1,1·106 1/ml. In OptiCHO erreicht diese Zelllinie eine maximale Dichte von 0,6·106 1/ml.

MHEC5‐T Zellen zeigen eine positive Korrelation der PCD mit steigender Glutamin‐Konzentration. So

steigt die PCD beginnend bei 2 mM Gln von 0,6·106 1/ml auf 0,9·106 1/ml bei 6 mM Gln. Der Serum‐

Entzug in DMEM/F‐12 führt zu einer PCD von0,6·106 1/ml. Die serumreduzierten Kulturläufe in

Advanced DMEM besitzen eine ähnliche PCD von0,5·106 1/ml mit leicht steigender Tendenz bei

Erhöhung der Glutamin‐Konzentration. Diese Größenordnung von0,6·106 1/ml erreicht ebenfalls die Kultur im serumreichen System OptiCHO.

Tabelle 5-7: PCD-Werte in 1/ml der eingesetzten Zellen und Medien

Medium FKS [v/v]

Glutamin [mM]

CHO L929 MHEC5-T Jurkat HepZ PAC

DMEM/F-12

0 % 4 1,3 ∙ 10 1,9 ∙ 10 0,6 ∙ 10 0,3 ∙ 10 0,2 ∙ 10

10 %

2 1,3 ∙ 10 1,6 ∙ 10 0,6 ∙ 10 0,9 ∙ 10 0,3 ∙ 104 1,5 ∙ 10 1,6 ∙ 10 0,7 ∙ 10 0,9 ∙ 10 0,5 ∙ 106 1,9 ∙ 10 1,5 ∙ 10 0,9 ∙ 10 1,0 ∙ 10 0,4 ∙ 10

Advanced DMEM

1 %

2 0,9 ∙ 10 1,1 ∙ 10 0,5 ∙ 10 0,6 ∙ 10 0,2 ∙ 104 1,1 ∙ 10 1,0 ∙ 10 0,6 ∙ 10 0,5 ∙ 10 0,2 ∙ 106 1,1 ∙ 10 0,9 ∙ 10 0,6 ∙ 10 0,4 ∙ 10

OptiCHO 0 %

2 1,1 ∙ 10

4 1,6 ∙ 10 0,6 ∙ 10 0,6 ∙ 10

6 1,6 ∙ 10

Ex-Cell 325 PF 0 % 4 0,3 ∙ 10

RPMI 10 %

2 1,5 ∙ 10

4 1,8 ∙ 10

6 1,8 ∙ 10

Advanced RPMI

1 %

2 1,5 ∙ 10

4 1,7 ∙ 10

6 1,5 ∙ 10

ERGEBNISSE

‐Seite 70‐

Das Suspensionssystem mit Jurkat‐Zellen resultiert ebenfalls in einem positiven Zusammenhang

zwischen steigender Gln‐Konzentration und PCD. So wachsen diese von 1,5·106 1/ml mit 2 mM Gln

bis auf 1,8·106 1/ml mit 6 mM Gln. Im serumreduzierten System mit Advanced RPMI findet sich das

Maximum der PCD mit 1,7·106 1/ml bereits bei einer Supplementierung mit 4 mM Glutamin.

Die Leberzelllinie HepZ deutet eine schwache Korrelation zwischen Zunahme der PCD und Steigerung

der Gln‐Konzentration bei Verwendung von DMEM/F‐12 an. Die höchste PCD mit 1,0·106 1/ml findet

sich somit bei 6 mM Gln. Bei Serumentzug in diesem Medium sinkt die PCD auf 0,3·106 1/ml. Im serumreduzierten Advanced DMEM zeigt sich eine negative Korrelation mit der Glutamin‐

Konzentration. So liegt die PCD für 2 mM Gln bei 0,6·106 1/ml, wohingegen bei 6 mM Gln

0,4·106 1/ml erreicht werden.

Die primären Schweinezellen (PAC) zeigen im Allgemeinen eine geringere PCD als die verwendeten

Zelllinien. In DMEM/F‐12 liegt das Maximum bei 0,5·106 1/ml und einer Konzentration von 4 mM Gln.

Eine Verringerung auf 2 mM führt zu einer PCD von 0,3·106 1/ml, eine Erhöhung auf 6 mM Gln eine

PCD von 0,4·106 1/ml. Im serumreduzierten Advanced DMEM liegt die PCD unabhängig von den

eingesetzten Glutamin‐Konzentrationen bei 0,2·106 1/ml.

Berechnung der flächenbezogenen Zellkonzentration Um zeitliche wie auch Zellkonzentration bezogene Betrachtungen zu ermöglichen, wird die Lebendzellzahl LZZ [1/ml] über die Zeit t [h] integriert. Als Integrationsgrenzen gelten der Prozessbeginn mit t = 0 sowie der Zeitpunkt, zu welchem die Kultur in die stationäre Phase übergeht. bzw. PCD erreicht wird. Die ACDexp ist in Tabelle 5‐8 zusammengefasst. Die ACDstat beschreibt die Zeitgrenzen zwischen der PCD und der Zeit, ab welcher die Vitalität unter 85 % sinkt. Dieser findet sich in Tabelle 5‐9.

Tabelle 5-8: Übersicht aller errechneten ACDexp in h/ml

Medium FKS [v/v]

Glutamin [mM]


DMEM/F-12

0 % 4 4,5 ∙ 10 4,1 ∙ 10 1,3 ∙ 10 / /

10 %

2 1,7 ∙ 10 4,3 ∙ 10 1,3 ∙ 10 2,2 ∙ 10 1,7 ∙ 104 1,5 ∙ 10 4,5 ∙ 10 3,1 ∙ 10 3,0 ∙ 10 1,9 ∙ 106 5,4 ∙ 10 4,2 ∙ 10 3,7 ∙ 10 3,6 ∙ 10 2,0 ∙ 10

Advanced DMEM

1 %

2 2,8 ∙ 10 3,7 ∙ 10 1,1 ∙ 10 3,0 ∙ 10 /4 3,7 ∙ 10 3,5 ∙ 10 1,3 ∙ 10 4,0 ∙ 10 /6 3,9 ∙ 10 3,0 ∙ 10 2,5 ∙ 10 3,0 ∙ 10

OptiCHO 0 %

2 3,4 ∙ 10

4 4,3 ∙ 10 / 2,1 ∙ 10

6 3,9 ∙ 10

Ex-Cell 325 PF 0 % 4 /

RPMI 10 %

2 5,3 ∙ 10

4 5,4 ∙ 10

6 5,6 ∙ 10

Advanced RPMI

1 %

2 5,8 ∙ 10

4 5,5 ∙ 10

6 5,2 ∙ 10

ERGEBNISSE

‐Seite 71‐

Die Summe dieser beiden Werte ergibt die Gesamtfläche ACDges. Für zusätzliche Parameter wird ferner Bezug auf die Fläche einzelner Intervalle genommen. Diese sind nicht mit einem der hier genannten Parameter zu verwechseln. Für die Berechnung sind beide Wachstumskurven pro Variante mit einbezogen worden. Im Falle der CHO‐Zellen zeigen sich Höchstwerte der ACDexp bei hohen Glutamin‐Konzentrationen. Von diesem Trend weichen allerdings die 4 mM Glutamin Kulturen in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS, DMEM/F‐12 ohne FKS und OptiCHO ab. Das globale Maximum für CHO

Zellen findet sich bei DMEM/F‐12 mit 6 mM Glutamin. L929‐Zellen zeigen mit 4,5·107 h·Zelle/ml eine niedrigere Maximalfläche in der exponentiellen Wachstumsphase. Für DMEM/F‐12 ist keine klare Tendenz zu erkennen. Im Falle des Advanced DMEM zeigt sich das Verhalten umgekehrt proportional. Die ACDexp nimmt mit steigender Glutamin‐Konzentration ab und besitzt bei 6 mM Gln ein Minimum. Die Kultur in OptiCHO zeigt keine auswertbare exponentielle Phase. MHEC5‐T‐Zellen zeigen eine positive Korrelation zwischen der Glutamin‐Konzentration und der ACDexp. Das Maximum

für diese Zelllinie liegt mit 3,7·107 h·Zelle/ml bei DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 6 mM Glutamin. Das

Minimum dahingegen liegt mit 1,1·107 h·Zelle/ml bei Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin. Die Suspensionszelllinie Jurkat zeigt für RPMI 1640 eine steigende Tendenz mit steigender Glutamin‐Konzentration. Allerdings kehrt sich dieser Zusammenhang bei Einsatz des Advanced RMPI

um. So liegen das Maximum mit 5,8·107 h·Zelle/ml bei Verwendung von 2 mM Gln und das Minimum

mit 5,2·107 h·Zelle/ml bei dreimal höherer Glutamin‐Konzentration. Die Leberzelllinie HepZ zeigt für das klassische DMEM/F‐12 einen ebenfalls positiven Zusammenhang mit der Glutamin‐

Konzentration, der zu einer maximalen ACDexp von 3,6·107 h·Zelle/ml bei 6 mM Gln führt. Wird

Advanced DMEM eingesetzt, so wird liegt die maximale ACDexp bei 4 mM Gln und übertrifft mit

4,0·107 h·Zelle/ml das DMEM/F‐12‐Maximum.

Tabelle 5-9: Übersicht aller errechneten ACDstat in h/ml

Medium FKS [v/v]

Glutamin [mM]


DMEM/F-12

0 % 4 7,7 ∙ 10 8,4 ∙ 10 4,0 ∙ 10 / 8,8 ∙ 10

10 %

2 5,0 ∙ 10 1,2 ∙ 10 1,9 ∙ 10 3,0 ∙ 10 3,6 ∙ 104 8,8 ∙ 10 1,0 ∙ 10 1,7 ∙ 10 0,9 ∙ 10 6,5 ∙ 106 1,5 ∙ 10 8,4 ∙ 10 5,8 ∙ 10 1,2 ∙ 10 4,8 ∙ 10

Advanced DMEM

1 %

2 1,7 ∙ 10 5,3 ∙ 10 1,6 ∙ 10 1,2 ∙ 10 6,5 ∙ 10

4 4,1 ∙ 10 2,7 ∙ 10 2,7 ∙ 10 0,7 ∙ 10 5,9 ∙ 106 4,2 ∙ 10 3,1 ∙ 10 2,5 ∙ 10 2,2 ∙ 10

OptiCHO 0 %

2 7,3 ∙ 10

4 1,1 ∙ 10 1,2 ∙ 10 1,0 ∙ 10

6 1,0 ∙ 10

Ex-Cell 325 PF 0 % 4 1,9 ∙ 10

RPMI 10 %

2 4,8 ∙ 10

4 6,0 ∙ 10

6 6,0 ∙ 10

Advanced RPMI

1 %

2 2,2 ∙ 10

4 1,8 ∙ 10

6 1,5 ∙ 10

Die primären Zellen des Schweins sind nur für das serumhaltige DMEM/F‐12 auswertbar. Hier zeigt sich erneut eine positive Korrelation der ACDexp mit der Steigerung der Glutaminkonzentration. Das

ERGEBNISSE

‐Seite 72‐

Maximum liegt bei 2,0 ∙ 10 h·Zelle/ml (6 mM Glutamin). Eine Auswertung der serumreduzierten und serumfreien Medien ist nicht möglich gewesen.

Wird die ACDstat von CHO‐Zellen betrachtet, so zeigt sich eine positive Korrelation mit der Glutamin‐Supplementierung. So steigt dieser Wert bei Verwendung des DMEM/F‐12 mit Serum und 2 mM Gln

von 5,0·107 h·Zelle/ml auf 1,5·108 h·Zelle/ml bei 6 mM. Ohne Serum befindet sich diese Fläche in einer ähnlichen Größenordnung wie sein serumsupplementierter Pedant. Ein ähnliches Verhalten wird durch die Verwendung Advanced DMEM abgebildet, auch wenn dieses nicht die absolute Höhe

betrifft. So steigt der Wert auf ein Maximum von 4,2·107 h·Zelle/ml. In serumfreiem OptiCHO werden ähnliche ACDstat erhalten, wie im Serumhaltigen DMEM/F‐12. Allerdings findet sich das

Maximum mit 1,1·108 h·Zelle/ml bei der 4 mM Variante. Die höhere Konzentration erreicht leicht verringerte Werte. Im ebenfalls serumfreien Ex‐Cell Medium werden die geringsten Werte im Vergleich zu allen anderen Varianten mit 4 mM erreicht. Die Korrelation der ACDstat mit der Glutamin‐Konzentration ist negativ. Der höchste Flächenwert wird bei einer Konzentration von 2 mM Glutamin

in DMEM/F‐12 mit Serum erreicht und liegt bei 1,2·108 h·Zelle/ml. Eine Zunahme des Glutamins führt zu einer Abnahme der ACDstat. Ähnliches wird durch den Serumentzug erreicht. In Advanced DMEM lässt sich eine ähnliche Tendenz bemerken. Das Maximum findet sich bei 2 mM Gln und

beträgt 5,3·107 h·Zelle/ml. Danach wird das Minimum bei 4 mM Gln erreicht, was in der Folge einer weiteren Glutamin‐Erhöhung zu einem erneuten Anstieg führt. Das absolute Minimum wird mit

1,2·107 h·Zelle/ml durch Kultivierung im serumfreien OptiCHO erreicht. Keine wirkliche Korrelation kann bei der Kultivierung von MHEC5‐T in den verschiedenen Medien festgestellt werden. So findet sich das globale Maximum von ACDstat bei einer Kultivierung in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 6 mM

Glutamin. Das absolute Minimum wird dahingegen mit 1,0·107 h·Zelle/ml durch eine Kultivierung im serumfreien OptiCHO mit 4 mM Glutamin erreicht. Jurkat‐Zellen reagieren auf Glutamin‐Steigerung mit einer tendenziell zunehmenden ACDstat, sofern diese in RPMI 1640 kultiviert werden. Dieses Verhalten kehrt sich bei Einsatz des serumreduzierten Advanced RPMI um. So findet sich das

absolute Maximum von 6,0·107 h·Zelle/ml bei Verwendung von RPMI 1640 mit 4 mM bzw. 6 mM

und Minimum von 1,5·107 h·Zelle/ml bei der Variante Advanced RPMI mit 1 % FKS und 6 mM Glutamin. Die Leberzelllinie erlaubt keine tendenzielle Zuordnung. Es findet sich in diesem Fall das

Maximum von 3,0·107 h·Zelle/ml bei DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin. Die geringste Fläche wird bei dem Einsatz von Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin erreicht. Die Betrachtung der Primärzellen zeigt keine Korrelation mit der Glutamin‐Konzentration oder Serumgabe. Die höchste ACDstat findet sich hier für DMEM/F‐12 ohne Serum und einer Glutamin‐Konzentration von 4 mM. Das Minimum wird durch Verwendung von DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 2 mM gemessen.

5.2.2. Online‐Parameter des Metabolismus

Aus den Sauerstoff‐ und pH‐Wert‐Verläufen des SDR lassen sich weitere charakterisierende Größen berechnen.

Minimale Sauerstoffkonzentration pO2,min In Tabelle 5‐10 sind der in der jeweiligen Medienvariante erreichte geringste Sauerstoffpartialdruck (po2,min in %atm) dargestellt. Die Zeitangabe spiegelt die Prozesszeit wieder, zu welcher dieser Wert gemessen worden ist. Im Falle adhärenter Zellen ist eine Korrelation mit der Glutamin‐Konzentration zu bemerken. Die absoluten Minima der Sauerstoffpartialdrücke der einzelnen Zelllinien finden sich oft bei 6 mM Glutamin. Eine Ausnahme bildet die Medienvariante DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin. In dieser Variante wird für MHEC5‐T Zellen das Minimum erreicht. Eine weitere Erhöhung führt zu einem Anstieg des Sauerstoffsignals. Im Falle der Suspensionszelllinie Jurkat ist die Tendenz entgegengesetzt. Hier führt eine höhere Glutamin‐Konzentration zu erhöhten pO2,min‐Werten. Weiterhin ist anzumerken, dass die Unterschiede – erneut mit Ausnahme der Jurkat‐Zellen – zwischen 2 mM und 4 mM mit bis zu 36 % größer sind als die Differenzen zwischen 4 mM und 6 mM Glutamin. Ein Serumentzug im DMEM/F‐12 Medium hat einen Anstieg des po2,min zur Folge. Dieser unterscheidet sich bis zu 33 % von der serumfreien Kultivierung in der OptiCHO‐Variante.

ERGEBNISSE

‐Seite 73‐

Tabelle 5-10: Darstellung der minimal erreichte, relativen Sauerstoffpartialdrücke mit zugehöriger Prozesszeit

Medium FKS [v/v]

Glutamin [mM]


DMEM/F-12

0 % 4 56%/105h 52%/100h 65%/68h 95%/10h 82%/9h

10 %

2 34%/60h 35%/75h 30%/45h 73%/94h 83%/15h

4 26%/60h 24%/70h 22%/68h 63%/92h 82%/7h

6 26%/60h 18%/70h 25%/70h 63%/96h 81%/11h

Advanced DMEM

1 %

2 42%/50h 50%/90h 41%/48h 82%/90h 84%/10h

4 25%/68h 14%/60h 29%/58h 75%/90h 83%/10h

6 25%/65h 14%/62h 25%/70h 74%/92h

OptiCHO 0 %

2 50%/100h

4 32%/120h 85%/10h 54%/92h

6 30%/120h

Ex-Cell 325 PF 0 % 4 80%/36h

RPMI 10 %

2 10%/105h

4 10%/108h

6 14%/110h

Advanced RPMI

1 %

2 42%/105h

4 42%/105h

6 50%/96h

Sauerstoffaufnahmerate (OUR) Die OUR wird innerhalb der Wachstumskurven als zellbezogener Wert angegeben. Dabei erfolgt die Angabe in Intervallen gemäß den unter Kapitel 5.2.1 eingeteilten Wachstumsphasen.

CHO

CHO‐Zellen zeigen in DMEM/F‐12 gemäß Tabelle 5‐11 eine über die Prozesszeit abnehmende Sauerstoffaufnahmerate. Beginnend bei etwa 15‐18 pmol Zelle·h⁄ sinkt dieser Wert auf etwa 5 pmol Zelle·h⁄ innerhalb der Wachstumsphase relativ unabhängig von der Glutamin‐Konzentration und Serumgabe. In der stationären Phase nimmt die OUR der einzelnen Kulturen unterschiedlich stark zu und liegt bei Prozessende bei 5‐10 pmol Zelle·h⁄ . Auffällig ist der starke Anstieg der Kultur mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin bei 20 h. Die CHO‐Zellen in Advanced DMEM starten mit einer Sauerstoffaufnahmerate von etwa 13‐17 pmol Zelle·h⁄ . Innerhalb der exponentiellen Phase ist eine Zunahme auf 21 pmol Zelle·h⁄ festzustellen. Dieser Wert sinkt bis zum Eintreten der stationären Phase auf bis zu 4 pmol Zelle·h⁄ ab. In der Folge zeigt sich ein erneuter Anstieg, wobei der Einfluss von Glutamin zunimmt. Dabei ist kein linearer Zusammenhang zwischen der Differenz und der zunehmenden Glutamin‐Konzentration zu erkennen. Den größten Anstieg verzeichnet die Kultur mit 4 mM Glutamin, den Geringsten die Kultur mit 6 mM Glutamin. Der Einfluss des Glutamins sinkt mit Eintritt in die Sterbephase etwas, wobei die absoluten Werte in etwa die Größenordnung behalten. In OptiCHO kultivierte Zellen besitzen in der exponentiellen Wachstumsphase einen Sauerstoffbedarf von 4‐15 pmol Zelle·h⁄ . Bis zu 100 h Prozesszeit sinken diese geschlossen auf etwa 5 pmol Zelle·h⁄ und verbleiben dort bis zum Ende der Kultivierung. Der Kultivierung in Ex‐Cell 325 PF kann keine Wachstums‐ oder Sterbephase zugeordnet werden. Daher wird von einer gewissen Stationarität ausgegangen. Hierbei liegt die berechnete OUR in einem Bereich von 5‐14 pmol Zelle·h⁄ und zeigt eine entsprechend abnehmende Tendenz.

ERGEBNISSE

‐Seite 74‐

Tabelle 5-11: Die Sauerstoffaufnahme von CHO Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.

Medium Wachstumsphase Wachstum Stagnation Retardation DMEM/F-12 Bereich OUR

[pmol Zelle·h⁄ ] 4-18 4-8 7-9

Differenz Gln + +++ ++ Differenz FKS 0 ++ (++) Advanced DMEM Bereich OUR

[pmol Zelle·h⁄ ] 7-21 7-15 9-12

Differenz Gln + +++ (++) OptiCHO Bereich OUR

[pmol Zelle·h⁄ ] 4-15 3-5 n/a

Differenz Gln +/++ ++ n/a Ex-Cell 325 PF Bereich OUR

[pmol Zelle·h⁄ ] n/a 5-14 n/a

L929

Mausfibroblasten erreichen in DMEM/F‐12 eine anfängliche OUR von 15‐18 pmol Zelle·h⁄ , welche innerhalb der ersten 20 h auf 4‐10 pmol Zelle·h⁄ sinken (vgl. Tabelle 5‐12). In der stationären Phase verweilen die Kulturen auf diesem Niveau von 4‐8 pmol Zelle·h⁄ , wobei der Einfluss von Glutamin deutlich und der von FKS mäßig steigt. Zum Ende der Kultivierung ist eine leicht zunehmende Tendenz der OUR zu beobachten. Die Einflüsse der Supplemente sinken leicht bzw. bleiben konstant. In Advanced DMEM zeigen sie in der Wachstumsphase einen Bedarf von 5‐31 pmol Zelle·h⁄ , wobei die Tendenz abnimmt, je weiter der Prozess fortschreitet. Hierbei ist ein gewisser Einfluss des Glutamins mit zunehmender Tendenz festzustellen. In der stationären Phase liegt die OUR bei etwa 5‐11 pmol Zelle·h⁄ und zeigt deutliche Unterschiede zwischen den Glutamin‐Konzentrationen. Zum Ende der Kultivierung nimmt die OUR erneut leicht zu und liegt im Bereich von 3‐18 pmol Zelle·h⁄ . Der Einfluss des Glutamins wird in dieser Phase maximal. Die serumfreie Kultivierung von L929 in OptiCHO ist nach den genannten Kriterien nicht auswertbar.

Tabelle 5-12: Die Sauerstoffaufnahme von L929 Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.

Medium Wachstumsphase Exponentiell Stationär Retardation DMEM/F-12 Bereich OUR

[pmol Zelle·h⁄ ] 4-19 5-8 5-15

Differenz Gln ++ ++ (+++) Differenz FKS ++ + (+) Advanced DMEM Bereich OUR

[pmol Zelle·h⁄ ] 5-31 5-11 3-18

Differenz Gln ++ +++ (++++) OptiCHO Bereich OUR

[pmol Zelle·h⁄ ] n/a n/a n/a

ERGEBNISSE

‐Seite 75‐

MHEC5-T

Die in DMEM/F‐12 kultivierten MHEC5‐T‐Zellen zeigen ein über die Kulturdauer inhomogenes Bild. Innerhalb der Wachstumsphase erreichen sie gemäß Tabelle 5‐13 sehr hohe Werte der OUR im Bereich von 30 pmol Zelle·h⁄ . Bis zum Ende dieser Phase werden Werte mit 7 pmol Zelle·h⁄ im Minimum erreicht. Die Tendenz ist im Allgemeinen abnehmend. Der Einfluss von Glutamin ist merklich und zeitweise gestaffelt, jener von FKS ist deutlich. Mit Übergang zur stationären Phase werden bereits minimale Werte der OUR im Intervall von 7‐13 pmol Zelle·h⁄ erreicht. Hierbei zeigt sich ein höherer Einfluss des Glutamins. FKS wirkt sich etwas weniger deutlich aus. Beginnt das mehrheitliche Sterben der Zellen, so zeigt sich zum Teil ein erneutes Ansteigen des Messwerts in der Größenordnung von 6‐24 pmol Zelle·h⁄ . Zwischen den einzelnen Versuchsansätzen stellt sich eine sehr große Streuung ein, die als Einfluss von Glutamin und FKS gewertet werden kann. Ähnlich ist das Verhalten in Advanced DMEM zu Beginn des Versuchs. Während die Kultur in 6 mM Glutamin eine OUR von 47 pmol Zelle·h⁄ zeigt, beginnen die die restlichen Ansätze bei etwa 27‐32 pmol Zelle·h⁄ . Diese sinken in der stationären Phase auf Werte im Bereich von 11‐14 pmol Zelle·h⁄ . Der Einfluss von Glutamin scheint leicht erhöht und steigt mit Eintritt in die Retardations‐Phase weiter an. Die resultierende OUR steigt ebenfalls in einen Bereich von 9‐30 pmol Zelle·h⁄ .

Tabelle 5-13: Die Sauerstoffaufnahme von MHEC5-T Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


[pmol Zelle·h⁄ ] 7-30 7-13 6-24

Differenz Gln ++ +++ (++++) Differenz FKS +++ ++ (++++) Advanced DMEM Bereich OUR

[pmol Zelle·h⁄ ] 10-47 11-14 9-30

Differenz Gln +/++ ++ +++ OptiCHO Bereich OUR

[pmol Zelle·h⁄ ] 7-31 n/a n/a

Die in OptiCHO serumfrei gehaltene Kultur besitzt zu Beginn eine OUR von 31 pmol Zelle·h⁄ . Dieser Wert sinkt über die Kulturdauer auf etwa 7 pmol Zelle·h⁄ . Eine genaue Aufteilung in Wachstumsphasen erfolgt nicht.

Jurkat

Die Kultivierung von Jurkats ist gerade zu Beginn der Wachstumsphase von einem merklichen Glutamin‐Einfluss geprägt (vgl. Tabelle 5‐14). In dieser Phase liegt der Sauerstoffbedarf bei 6‐22 pmol Zelle·h⁄ . Der Übergang erfolgt direkt in die Sterbephase und ist mit einem Sinken der OUR auf 3 pmol Zelle·h⁄ verbunden. Hierbei besteht kein merklicher Unterschied zwischen den Glutamin‐Konzentrationen. Das Verhalten in Advanced DMEM ist dem obigen sehr ähnlich. Jedoch werden insgesamt geringere Sauerstoffverbrauchsraten erreicht. Diese liegen maximal bei 13 pmol Zelle·h⁄ . Ebenso ist der anfängliche Einfluss von Glutamin geringer.

ERGEBNISSE

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Tabelle 5-14: Die Sauerstoffaufnahme von Jurkat Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.

Medium Wachstumsphase Exponentiell Stationär Retardation RPMI 1640 Bereich OUR

[pmol Zelle·h⁄ ] 6-22 n/a 3

Differenz Gln ++ n/a (0) Advanced RPMI Bereich OUR


Differenz Gln +/++ n/a (0)

HepZ

Die Kultivierung von Leberzellen im DMEM/F‐12 zeigt nach Tabelle 5‐15 eine sehr deutliche Abhängigkeit von FKS. Neben der Tatsache, dass im serumfreien System ausschließlich eine Retardationsphase zu bemerkten ist, weicht der serumfreie Verlauf deutlich von den Restlichen ab. Diese bewegen sich zu Beginn in einem Intervall von 4‐16 pmol Zelle·h⁄ , wobei der Einfluss von Glutamin gering ist. Erst mit Eintritt in die Sterbephase nimmt die Abweichung zwischen den einzelnen Kulturen zu, so dass dieser Einfluss zumindest rechnerisch mehr Gewicht bekommt. Die OUR sinkt deutlich auf Werte zwischen 5‐9 pmol Zelle·h⁄ . In Advanced DMEM ist der anfängliche Sauerstoffbedarf und Glutamin‐Einfluss zu vorheriger Betrachtung sehr ähnlich, wobei die absoluten OUR‐Werte sowie der Gln‐Einfluss etwas geringer ausfallen.

Tabelle 5-15: Die Sauerstoffaufnahme von HepZ Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


[pmol Zelle·h⁄ ] 4-16 n/a 5-9

Differenz Gln + n/a (++) Differenz FKS n/a n/a +++ Advanced DMEM Bereich OUR


Differenz Gln + n/a (+)

PAC

Die Primärzellen des Schweins zeigen in der Wachstumsphase eine OUR von 3‐16 pmol Zelle·h⁄ mit abnehmender Tendenz. Ein Einfluss von Glutamin ist über diese gesamte Kulturdauer kaum wahrnehmbar. Dahingegen ist der Einfluss von FKS merklich und nimmt zum Ende hin deutlich zu, während der Sauerstoffbedarf im Mittel sinkt. Wird das serumreduzierte Advanced DMEM appliziert so zeigt sich ein ähnlicher Verlauf. Der Einfluss von Glutamin scheint dahingegen gemäß Tabelle 5‐16 leicht erhöht zu sein. Im letzten Messpunkt steigt die OUR mit Werten um 45 pmol Zelle·h⁄ sehr deutlich.

ERGEBNISSE

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Tabelle 5-16: Die Sauerstoffaufnahme von PAC Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.



Differenz Gln 0 n/a 0 Differenz FKS ++ n/a ++++ Advanced DMEM Bereich OUR


Differenz Gln + n/a (0)

Ansäuerungsrate (ACR) Die Darstellung der Ansäuerungsrate erfolgt an dieser Stelle analog zur OUR zellbezogen und nach Wachstumsphasen unterteilt.

CHO

Für CHO‐Zellen zeigen sich gemäß Tabelle 5‐17 zu Anfang maximale Ansäuerungsraten im Bereich von 2‐6 amol Zelle·h⁄ . Deutlich bzw. sehr deutlich fallen die Unterschiede in dieser Phase zwischen den einzelnen Glutamin‐ bzw. FKS‐Varianten aus. Mit Eintritt in die stationäre Phase gleichen sich diese Differenzen an, was mit einem Sinken der ACRZelle einhergeht. Innerhalb der Sterbephase ist zu beobachten, dass die ACRZelle zum Teil geringe, negative Werte annimmt. Hierbei nimmt die Staffelung der Gln‐Varianten erneut leicht zu. Die gemessenen pH‐Werte liegen im Bereich von anfangs 7,4 und sinken um Kulturverlauf auf Werte von 6,7‐6,5. Ein Einfluss von Glutamin und FKS ist zu erkennen.

Tabelle 5-17: Die Ansäuerungsrate von CHO Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.

Medium Wachstumsphase Exponentiell Stationär Retardation

DMEM/F-12

Bereich ACR [amol Zelle·h⁄ ]

2-6 2 -1 bis 1

Differenz Gln +++ + ++ Differenz FKS ++++ ++ (++)

Advanced DMEM Bereich ACR

[amol Zelle·h⁄ ] 2-5 1-2 -2 bis -1

Differenz Gln +++ ++ (++)

OptiCHO Bereich ACR

[amol Zelle·h⁄ ] -1 bis 1 1-2 n/a

Differenz Gln + + n/a

Ex-Cell 325 PF Bereich ACR

[amol Zelle·h⁄ ] n/a -2 bis 0 n/a

Ein ähnliches Verhalten ist für die Kultivierung in Advanced DMEM zu beobachten. Der Unterschied liegt im Einfluss des Glutamins. Dieser ist zu Beginn in der Wachstumsphase schwächer ausgeprägt und nimmt im weiteren Verlauf zu. Ähnlich zur DMEM/F‐12 Kultivierung nehmen die Werte in der stationären Phase ab und werden innerhalb der Retardations‐Phase negativ. Dabei liegen die erreichten pH‐Werte abhängig von Glutamin im Bereich von 7,4 bis 6,6. In der serumfreien OptiCHO‐

ERGEBNISSE

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Kultur setzt sich der Trend, dass die maximale Ansäuerung innerhalb des Versuchs zu späteren Zeitpunkten gemessen wird, fort. So ist teilweise zu beobachten, dass die Kulturen zu Beginn leicht negative ACR‐Werte aufweisen. Der folgende Anstieg ist mäßig, so dass die Werte in der Höhe den anderen Versuchen unterlegen sind. Die pH‐Werte bewegen sich in einem Bereich von 7,4 bis 6,8 und unterscheiden sich zwischen den Glutamin‐Versuchen. Unterboten wird dies nur durch die Kultivierung in Ex‐Cell 325 PF, welche keine positive ACR zeigt und somit auf einem pH‐Niveau von 7,5 verbleibt.

L929

Auch L929 in DMEM/F‐12 zeigen, wie in Tabelle 5‐18 zusehen, eine zunächst auf das Maximum von bis zu 5 amol Zelle·h⁄ steigende ACRZelle. Hierbei ist erneut ein Einfluss des Glutamins zu bemerken, welcher positiv mit steigender ACRZelle korreliert (pH‐Werte 7,4‐6,4). Weitaus prägnanter ist der Einfluss von FKS. Ohne Zugabe von FKS verweilt die ACRZelle nahe Null. Mit Eintritt in die stationäre und spätere Sterbephase nehmen die Werte deutlich ab; teilweise ins Negative. Das bedingt eine Abnahme des FKS‐Einflusses. Die Distanz der Glutamin‐Varianten zeigt ebenfalls eine leicht abnehmende Tendenz. Deutlich stärker prägt sich der Unterschied der ACRZelle in den serumreduzierten Glutamin‐Versuchen aus. Dieser wird innerhalb der Wachstumsphase maximal, so dass sich eine Spannweite von 0‐7 amol Zelle·h⁄ ergibt. Der Zusammenhang zwischen ACRZelle und Glutamin lässt ein Optimum vermuten, da der 4 mM‐Versuch den maximalen ACR‐Wert zeigt. Dieses Ergebnis zeigen auch die absoluten pH‐Werte, welche sich im Bereich von 7,4 bis 6,7 bewegen. Der niedrigste Wert wird innerhalb der 4 mM Kultivierung gemessen. Im Bereich der stationären Phase geht der Einfluss des Glutamins zunächst zurück, wobei die ACRZelle ebenfalls sehr geringe Werte annimmt. Die ursprünglichen Differenzen werden in der Sterbephase erneut deutlich; diesmal allerdings in negativer Richtung. Auch hier ist die 4 mM‐Variante am deutlichsten. Einen gänzlich anderen Verlauf zeigt die serumfreie Kultur in OptiCHO. Dieser Verlauf ist stetig im Negativen und erreicht erst gegen Ende der Kultivierung die Nulllinie. Daraus folgt ein Anstieg des pH‐Werts von 7,5 auf etwa 7,7.

Tabelle 5-18: Die Ansäuerungsrate von L929 Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12


1-5 2-3 -1 bis 0

Differenz Gln ++ ++ ++ Differenz FKS ++++ +++ (+)


[amol Zelle·h⁄ ] 0-7 0-2 -3 bis -0

Differenz Gln ++++ ++ ++++

OptiCHO Bereich ACR

[amol Zelle·h⁄ ] n/a n/a n/a

MHEC5-T

Die Endothelzellen zeigen über die gesamte Kulturdauer auffällige Verläufe (vgl. Tabelle 5‐19). Zu Erkennen sind sehr große Unterschiede zwischen den Glutamin‐ und den FKS‐ Varianten. Die 2 mM und 4 mM Gln‐Varianten nehmen hohe Werte der ACRZelle an. Dem gegenüber ist zu erkennen, dass der ACR‐Verlauf der 6 mM Gln‐Variante bereits innerhalb der Wachstumsphase unter den Wert der serumfreien Kultur sinkt. In der stationären Phase nehmen die Unterschiede noch etwas zu. Mit Übergang die Sterbephase werden alle Werte negativ, wobei die Differenzen kleiner werden. In pH‐Werten ausgedrückt bedeutet dies ein Intervall von 7,5 bis 6,2 als Minimum. Dieses wird in der 2 mM

ERGEBNISSE

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Gln‐Kultivierung gemessen. Ein ähnliches Verhalten ergibt sich für die serumreduzierte bzw. serumfreie Kultivierung. Der Unterschied liegt in den absolut erreichten Raten. Diese sind in der Wachstumsphase in einem Bereich von 5‐16 amol Zelle·h⁄ zu finden. In der stationären Phase steigt die 2 mM Gln‐Kultur bis auf 80 amol Zelle·h⁄ , wobei es sich um einen Messfehler handeln sollte. Die restlichen Kulturen liegen in einem engen Bereich von 8‐11 amol Zelle·h⁄ . Die Retardations‐Phase wird erneut von einem Absinken der Werte, z.T. in den negativen Bereich, charakterisiert. Für die serumfreie Kultur kann zusammengefasst werden, dass diese stetig geringe Werte über die Versuchsdauer zeigt. Dadurch werden ähnliche pH‐Werte erreicht, wie in Advanced DMEM: 7,5 bis 6,3. Letzter Wert zeigt sich erneut in der 2 mM Gln‐Kultur.

Tabelle 5-19: Die Ansäuerungsrate von MHEC5-T Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12


2-30 0-33 -10 bis -2

Differenz Gln ++++ ++++ ++++ Differenz FKS ++++ ++++ (++++)


[amol Zelle·h⁄ ] 5-16 8-11(80) -22 bis 1

Differenz Gln ++++ ++++ ++++

OptiCHO Bereich ACR

[amol Zelle·h⁄ ] 0-7 n/a n/a

Jurkat

Die verwendete Suspensionszelllinie zeigt gemäß Tabelle 5‐20 ein recht gleichförmiges Ergebnis. Es ist zu beobachten, dass die ACR der einzelnen Ansätze zunächst einvernehmlich steigt und sich in einem Intervall von 2‐6 amol Zelle·h⁄ bewegt. Gegen Ende der Wachstumsphase nimmt die ACR deutlich ab und sinkt ins Negative. Dort verbleiben die Werte bis zum Ende der Kultivierung. Die Variation des Glutamins erzeugt kaum Differenzen. Einzig innerhalb der Wachstumsphase ist ein niedrigeres Niveau der 2 mM Gln‐Variante zu erkennen. Die Läufe der serumreduzierten Advanced DMEM Versuche zeigen ein vergleichbares Verhalten. Allerdings sind die erreichten Absolut‐Werte geringer. Darüber hinaus ist die Abhängigkeit von der Glutamin‐Konzentration etwas deutlicher, da die jeweilige ACRZelle mit Glutamin‐Konzentration positiv korreliert. In pH‐Werten bedeutet das eine prozessbegleitende Abnahme von 7,2 auf 6,8 (RPMI) bzw. 7,0 (Advanced RPMI).

Tabelle 5-20: Die Ansäuerungsrate von Jurkat Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


RPMI 1640 Bereich ACR

[amol Zelle·h⁄ ] 2-6 n/a -1 bis 0

Differenz Gln ++ n/a 0

Advanced RPMI Bereich ACR

[amol Zelle·h⁄ ] 2-5 n/a 0


ERGEBNISSE

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HepZ

Die verwendeten Leberzellen zeigen bezüglich der ACRZelle zu den meisten Zeitpunkten in den unterschiedlichen Varianten das gleiche Bild. In DMEM/F‐12 mit FKS sind, außer zum ersten Zeitpunkt, alle Werte nahe der Nulllinie orientiert (vgl. Tabelle 5‐21 bzw. 10.4). Der Beginn liegt im Bereich von 11‐7 amol Zelle·h⁄ . Wird der Kultur das FKS entzogen liegt dieser Wert etwas höher und sinkt im nächsten Moment ins Negative. Im serumreduzierten Advanced DMEM stellt sich das gleiche Verhalten ein. Allerdings sind die anfänglichen ACR‐Werte der verschiedenen Gln‐Varianten klar differenzierbar. In pH‐Werten ausgedrückt, zeigt sich einer tendenzieller Anstieg von 7,5 auf bis zu 7,8 (FKS freie Kultur).

Tabelle 5-21: Die Ansäuerungsrate von HepZ Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12


0-8 n/a 0

Differenz Gln + n/a 0 Differenz FKS +++ n/a ++


[amol Zelle·h⁄ ] 10 bis -1 n/a 0


PAC

Einen ebenso interessanten Verlauf zeigen die Primärzellen gemäß Tabelle 5‐22. Diese liegen zu Beginn in DMEM/F‐12 auf dem gleichen Niveau (im Mittel 2 amol Zelle·h⁄ ), wovon sich im weiteren Verlauf zwei Gruppen erkennbar absetzen. Die Kultur mit 4 mM und 6 mM Glutamin steigen um etwa 50 % des Ausgangswertes. Auf diesem Niveau verbleibt die Ansäuerungsrate bis zum Ende des Versuchs. Die serumfreie und 2 mM Glutamin haltige Kultur mit 10 % FKS folgen diesem ansteigenden Trend nicht und bewegen sich um den Startwert. Das Verhalten der 2 mM und 4 mM Kultur in Advanced DMEM ist identisch. Beide beginnen im Bereich von etwa 1 amol Zelle·h⁄ und sinken in der Folge stetig in den negativen Bereich. Auf diesem negativen Niveau verbleiben die Werte bis zum Ende der Kultivierung. Die pH‐Werte lassen sich ebenfalls in zwei Gruppen unterteilen. In DMEM/F‐12 sinkt der pH‐Wert von 7,5 auf bis zu 6,8. Im serumfreien oder –reduzierten Advanced DMEM ist die Abnahme auf etwa 7,3 geringer bzw. steigt der Wert auf bis zu 7,7.

Tabelle 5-22: Die Ansäuerungsrate von PAC Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.

Medium Wachstumsphase: Exponentiell Stationär Retardation

DMEM/F-12


0-3 n/a 2-3

Differenz Gln ++ n/a ++ Differenz FKS ++ n/a ++


[amol Zelle·h⁄ ] 1 bis -1 -1 n/a

Differenz Gln 0 0 n/a

ERGEBNISSE

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5.2.3. Offline‐Parameter des Metabolismus

Die folgenden Messwerte sind innerhalb dieser Arbeit ausschließlich durch invasive, manuelle Verfahren durchgeführt worden. Dadurch ist eine Weiterführung der Kultur nicht möglich und jeder Zeitpunkt stellt einen individuellen Ansatz dar. Es wird hierfür vorausgesetzt, dass sich alle Ansätze zu jedem Zeitpunkt vergleichbar sind.

Zellbezogener WST‐Wert Die gemessene Absorption wird gemäß dem Lambert‐Beerschen Gesetz in die Stoffmenge umgerechnet. Diese kann durch Kenntnis der Inkubationszeit und Zellzahl als spezifische Bildungsrate dargestellt werden.

CHO

Für CHO‐Zellen in DMEM/F‐12 zeigt sich der höchste WST‐Umsatz innerhalb der Wachstumsphase (vgl. Tabelle 5‐23). Hierbei erreichen die Werte zu Beginn das Maximum in einem Bereich von 0,11 bis 0,44 pmol Zelle·h⁄ (1,3 pmol Zelle·h⁄ ; möglicher Messfehler). Sowohl die Glutamin‐ wie auch FKS Variation erzeugt eine merkliche Schwankungsbreite der Messwerte. Mit Eintreten der stationären Phase nimmt das Signal mit steigender Gln‐Konzentration ab. Innerhalb der Retardationsphase werden die Minima erreicht. Die Einflüsse der Supplemente nehmen ebenso ab. In serumreduziertem Advanced DMEM stellt sich ein ähnliches Verhalten ein. Auffällig ist, dass die maximalen Werte erneut bei etwa 20 h erreicht werden. Die gemessenen Absorptionen sind vergleichbar und erreichen zellbezogene Werte von 0,6‐0,16 pmol Zelle·h⁄ . Die Unterschiede zwischen den Glutamin‐Versuchen sind deutlich, wobei sich der 2 mM Versuch abhebt. Bis zum Ende des Versuchs hin ist im Mittel eine Abnahme der Werte zu erkennen. Die Kultivierung in den serumfreien Medien zeigt die niedrigsten Umsatzraten. Diese sind zu Beginn des Versuchs leicht erhöht. Nach 40 h erreichen sie ein Plateau von etwa 0,16 pmol Zelle·h⁄ . Die Werte sinken in der Folge nur noch leicht.

Tabelle 5-23: Die Formazan-Bildungsrate von CHO Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12

Bereich nFormazan [pmol Zelle·h⁄ ]

0,44-0,11(1,3) 0,22-0,11 0,05-0,11

Differenz Gln ++ + + Differenz FKS ++ 0 (+)

Advanced DMEM Bereich nFormazan [pmol Zelle·h⁄ ]

0,6-0,16 0,38-0,16 0,22-0,11

Differenz Gln ++ +++ (++)

OptiCHO Bereich nFormazan [pmol Zelle·h⁄ ]

0,33-0,16 0,16-0,11 n/a

Differenz Gln + + n/a

Ex-Cell 325 PF Bereich nFormazan [pmol Zelle·h⁄ ]

n/a 0,07-0,03 n/a

L929

Auch die Mausfibroblasten zeigen in Tabelle 5‐24 zu Beginn dieser Versuchsreihe die höchsten Werte mit gleichzeitig größten Abweichungen. Die Werte liegen in einem Bereich von 0,54 bis 0,16 pmol Zelle·h⁄ , wobei deutliche Unterschiede zwischen den Glutamin‐ und FKS‐Gaben zu erkennen sind. Die beschriebene Deutlichkeit nimmt im weiteren Verlauf ab. Generell sinken die Werte über die Wachstumsphasen stetig. Die Versuchswiederholung der FKS‐freien DMEM/F‐12

ERGEBNISSE

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Variante zeigt einen abweichenden Verlauf, dessen erreichtes Niveau höher liegt. Dieses Verhalten findet sich erneut innerhalb der serumreduzierten Kultivierungen in Advanced DMEM. Allerdings sind die Unterschiede zwischen einzelnen Kulturen mit abnehmender Tendenz geringer. Mit Eintritt in die Sterbephase nehmen diese Differenzen erneut zu. Die Versuchswiederholung zeigt gerade im Bereich der exponentiellen Wachstumsphase gewisse Unterschiede. So fällt das Maximum zu 20 h deutlicher aus und auch die Differenzen der einzelnen Kulturen zueinander sind größer. Die serumfreie Kultivierung in OptiCHO kann nicht in Phasen unterteilt werden, liegt aber stellenweise deckungsgleich mit den serumreduzierten Ansätzen.

Tabelle 5-24: Die Formazan-Bildungsrate von L929 Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12


0,54-0,16 0,16-0,11 0,06-0,11

Differenz Gln ++ + 0 Differenz FKS ++ + (+)


0,16-0,44 0,16-0,22 0,16-0,27

Differenz Gln + + (++)


n/a n/a n/a

MHEC5-T

Die Endothelzellen der Maus zeigen einen großen Schwankungsbereich der Einzelversuche, die das Kriterium der Gln‐ und FKS‐Einflüsse erhöhen. Für die serumhaltige und –freie Kultur zeigen sich zu 50 h deutliche Maxima. In den Zeitpunkten davor und danach liegen diese in etwa mit dem Niveau der anderen Kulturen im Bereich von 0,22‐0,44 pmol Zelle·h⁄ gleich auf (siehe Tabelle 5‐25). Auch die Versuchswiederholung zeigt über die 100 h hinaus stark schwankende Werte mit entsprechenden Differenzen zwischen den Glutamin‐Varianten. Ab 120 h ist hier eine deutlich abnehmende Tendenz zu erkennen. In ähnlicher Weise verhalten sich die Werte in der Versuchsreihe mit Advanced DMEM. Diese liegen in Etwa dem gleichen Bereich, jedoch zeigen sich keine überdeutlichen Maxima. Die Werte schwanken über die Kulturdauer zwischen 0,38 pmol Zelle·h⁄ und 0,65 pmol Zelle·h⁄ . Die verschiedenen Glutamin‐Gaben resultieren in einem zu Anfangs recht ähnlichen Verlauf. Gegen Ende der Wachstumsphase nimmt zunächst die Kultur mit 4 mM Gln ab. Dieser folgt die 6 mM Gln‐Variante. Die Versuchswiederholung zeigt ebenfalls deutliche Differenzen zwischen Messreihen, jedoch werden die Abhängigkeiten von Glutamin hier nicht in gleicher Weise abgebildet. Die serumfreie Kultur in OptiCHO gliedert sich in diese Kurvenschar zum Großteil unauffällig ein. Zum Ende der Kultivierung ab etwa 160 h sinken die Verläufe gegen Null.

ERGEBNISSE

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Tabelle 5-25: Die Formazan-Bildungsrate von MHEC5-T Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12


0,33-0,44 0,22-0,44 0,22-0,44

Differenz Gln + ++ + Differenz FKS ++ 0 (++)


0,38-0,49 0,38-0,44 0,33-0,66

Differenz Gln ++ ++ (+)


0,27-0,49 n/a n/a

Jurkat

Die Versuchsreihen der Jurkat‐Zellen zeigen ein einheitliches Verhalten mit vernachlässigbaren Unterschieden zwischen den Gln‐Varianten, wie es Tabelle 5‐26 verdeutlicht. In RPMI 1640 bewegen sich die Werte zu Beginn des Versuchs um 0,27 pmol Zelle·h⁄ . Von da ab sinken sie geschlossen auf 0,05 pmol Zelle·h⁄ zum Ende der Kultivierung. Diesem sehr ähnlich sind die Verläufe in Advanced RPMI. Die Versuchsreihen starten allerdings etwas niedriger im Bereich von 0,16 pmol Zelle·h⁄ . Hierbei ist im weiteren Verlauf ein geringer Unterschied zwischen den verschiedenen Glutamin‐Versuchen zu erkennen. Dieser wird bis zum Ende der Kultivierung vernachlässigbar. Die Versuchswiederholung zeigt eine deutliche Abkehr des bereits dargelegten ab 80 h Versuchszeit.

Tabelle 5-26: Die Formazan-Bildungsrate von Jurkat Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


RPMI 1640


0,05-0,27 n/a 0,05

Differenz Gln 0 n/a 0 Differenz FKS n/a n/a

Advanced RPMI Bereich nFormazan [pmol Zelle·h⁄ ]

0,05-0,16 0

Differenz Gln + n/a

HepZ

Der erste Versuchsansatz mit Leberzellen führt von Beginn an zu merklichen Differenzen zwischen den Messwerten der einzelnen Ansätze. Diese bewegen sich in der Wachstumsphase zwischen 0,16‐0,44 pmol Zelle·h⁄ . Die Tendenz und die absoluten Messwerte sind sowohl für die FKS, als auch für die Glutamin‐Variation gemäß Tabelle 5‐27 unterschiedlich. Während die 6 mM Gln‐Variante bis auf den letzten Wert nahezu konstant bleibt, steigen und sinken die 2 mM und 4 mM Varianten zeitverzögert. Die serumfreie Kultur zeigt merkliche Differenzen zur FKS‐haltigen Variante. Allerdings ist in keinem der Versuche eine klare Tendenz zu erkennen. Zum Ende hin wird der Unterschied zwischen allen Ansätzen maximal. Hinsichtlich der Messwertunterschiede kann für die Versuchsreihe in Advanced DMEM festgestellt werden, dass die Differenzen innerhalb der Wachstumsphase geringer ausfallen. Die Ausnahme bildet ein starker Anstieg der 2 mM Gln‐Kultur. Wird dieser

ERGEBNISSE

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vernachlässigt, so bewegen sich die Werte in einer ähnlichen Größenordnung zum DMEM/F‐12. Denn auch zum Ende des Versuchs hin werden die Differenzen erneut maximal.

Tabelle 5-27: Die Formazan-Bildungsrate von HepZ Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12


0,16-0,44 n/a 0,44-0,75

Einfluss Gln ++ n/a +++ Einfluss FKS ++ n/a +++


0,22-0,6 (1,6) 0,33-0,45

Einfluss Gln + n/a

PAC

Die Werte der primären Schweinezellen in DMEM/F‐12 lassen sich grob in zwei Gruppen untergliedern, deren Trend sich entgegengesetzt verhält: serumhaltig und serumfrei (vgl. Tabelle 5‐28). Während beide im selben Punkt beginnen, steigt der Verlauf der FKS‐freien Kultur über die Prozesszeit im Mittel an. Die serumhaltige Versuchsreihe sinkt mit geringer Steigung, wobei die Unterschiede zwischen den jeweiligen Glutamin‐Varianten gering sind. Sehr ähnlich verhält es sich im serumreduzierten Advanced DMEM. Hier liegen die Werte ebenfalls in einem Bereich von 0,44‐0,49 pmol Zelle·h⁄ . Dieses Niveau bleibt bis zum Ende relativ konstant. Der letzte Messpunkt zeigt einen erneuten Anstieg, welcher bereits bei der FKS‐freien DMEM/F‐12 Kultur beobachtet werden kann.

Tabelle 5-28: Die Formazan-Bildungsrate von PAC Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12


0,16-0,54 n/a 0,22

Einfluss Gln + n/a n/a Einfluss FKS ++ n/a +++ (extrapol.)


0,44-0,49 0,33-1,36 n/a

Einfluss Gln 0 + n/a

Glucose im Überstand Die Glucose wird enzymatisch in den bis zur Messung bei ‐20°C zwischengelagerten Medienüberständen bestimmt. Über den Bezug zur molaren Masse kann die Stoffmenge angeben werden. Die zellspezifische Verbrauchsrate ergibt sich durch den Bezug auf die jeweilige ACD zwischen zwei Zählzeitpunkten, zu welchen sowohl die Zellzahl bestimmt als auch das korrespondierende Medium für die Analyse eingelagert worden ist.

CHO

Der Glucose‐Verlauf von CHO Zellen in serumhaltigen DMEM/F‐12 zeigt in den ersten 70 h eine merkliche Abnahme mit konstanter Steigung. Mit Eintritt in die stationäre Phase ist zu erkennen,

ERGEBNISSE

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dass diese Steigung deutlich abnimmt. Zu diesem Zeitpunkt sind etwa 80 % der Glucose verbraucht. Hierbei ist eine geringe Distanz zwischen den Glutamin‐Versuchen zu erkennen. Diese bleiben in ihrer Deutlichkeit weit hinter denen des FKS‐Entzugs zurück. Die Glucose‐Abnahme ist wesentlich geringer. So sind nach 70 h etwa 25 % verbraucht. Wird die zellbezogene Verbrauchsrate berechnet, zeigt sich das Maximum zu Beginn des Versuchs (siehe Tabelle 5‐29). Dieses nimmt in der Folge stark ab. Mit Übergang zur stationären Phase nähert sich dieser Wert asymptotisch der Nulllinie. Die Unterschiede zwischen den Glutamin‐Versuchen sind meist vernachlässigbar. Eine Ausnahme ist der erste Messpunkt, in welchem sich Einflüsse zeigen. Die Verbrauchswerte der serumfreien Kultur zeigen Einigkeit mit der Glucose‐Abnahme und liegen unterhalb der Werte der FKS‐haltigen Versuche. Allerdings kann innerhalb der stationären Phase ein erhöhter Verbrauch festgestellt werden. Innerhalb der Sterbephase sind erneut alle DMEM/F‐12 Versuche gleich auf und die Verbrauchsrate geht mit 60‐20 fmol Zelle·h⁄ gegen Null.

Tabelle 5-29: Glucose-Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von CHO Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12

Glucose [g/l] 3,2 – 0,6 0,7 – 0,4 0,1 - 0 Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 2500 - 150 40 - 20 60 - 20

Einfluss Gln 0 / + + / + - / ++ Einfluss FKS ++ / ++ ++ / +++ (++++) / 0

Advanced DMEM

Glucose [g/l] 3,2 – 0,4 0,8 - 0,2 0,8 - 0,1 Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 1000 - 380 95 - 25 110 - 0

Einfluss Gln + / 0 ++ / ++ (++) / (++)

OptiCHO

Glucose [g/l] 5 – 3,7 3,3 – 2,5 n/a Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 440 – 110 75 - 40 n/a

Einfluss Gln 0 / +++ + / + n/a Ex-Cell 325 PF Glucose [g/l] n/a 3,3 – 3,7 n/a

Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] -240 bis -360

Die Abnahme der Glucose in Advanced DMEM zeigt ähnliche Resultate. Auch in diesem Fall ist die Glucose bis zum Eintritt in die stationäre Phase nahezu verbraucht. Allerdings nimmt sie in der 2 mM Glutamin Kultur geringer ab, so dass mit Übertritt in die stationäre Phase etwa 1 g/l Glc verfügbar sind. Mit Blick auf die zellbezogene Verbrauchsrate ist zu erkennen, dass die Verläufe in der mittleren Phase der Kultivierung sehr ähnliche Werte zeigen und gegen Null tendieren. Hierbei fällt auf, dass die erwähnte 2 mM Gln‐Kultur zu Beginn den geringsten, die 4 mM Gln‐Variante den höchsten Verbrauch aufweisen. Gegen Ende des Versuchs zeigt der 2 mM Gln‐Ansatz als einziger einen geringen Glucose‐Verbrauch. Von der bisherigen Betrachtung weichen die Kulturen in OptiCHO deutlich ab. In den ersten 50 h ist relativ unabhängig von der Gln‐Konzentration kein merklicher Verbrauch zu erkennen. Zum Ende der Wachstumsphase liegen noch 3,7 g/l Glucose im Medium vor. Innerhalb der stationären Phase ist eine Abnahme auf 2,5 g/l messbar, wobei diese niedrigen Werte nicht von dem 2 mM Gln‐Ansatz erreicht werden. Zellbezogen zeigt sich zunächst ein Schwanken der Werte bis zu 50 h. Danach steigt der Verbrauch tendenziell auf ein lokales Maximum von etwa 200‐300 fmol Zelle·h⁄ . Die Kultur in Ex‐Cell 325 PF zeigt einen linearen Anstieg der Glucose, welcher sich in negativen Verbrauchsraten äußert.

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L929

Die Kultivierung von L929 Zellen in DMEM/F‐12 mit Serum führt unabhängig von der Glutamin‐Konzentration, wie aus Tabelle 5‐30 ersichtlich, zu einer stetigen Abnahme der Glucose‐Konzentration. Diese sinkt von anfänglich etwa 3,2 g/l auf 0,5 g/l nach 80 h, was einem absoluten Verbrauch von 85 % entspricht. In der Folge sinkt die Konzentration gegen Null. Die serumfreie Kultur zeigt ebenfalls eine deutliche Abnahme der Glucose‐Kurve. Allerdings ist die Steigung in diesem Fall flacher. So ist gegen Ende des Versuchs bei 170 h Prozesszeit noch 85 % vom ursprünglichen Signal messbar. Die Verbrauchsrate nimmt für die serumhaltigen Varianten bis zur Nulllinie linear ab. Die serumfreie Kultur zeigt niedrigere Verbrauchswerte als die serumhaltigen Versuche. So wird die zellbezogene Glucose‐Verbrauchsrate nicht null. Im Falle der serumreduzierten Kulturen in Advanced DMEM zeigt sich ebenfalls eine starke Abnahme in der ersten Hälfe der Kultivierung. So ist nach 75 h über 90 % der Glucose in den 4 mM und 6 mM Kulturen verbraucht. In der 2 mM Variante sind noch 70 % der ursprünglichen Glucose‐Konzentration messbar. Somit entwickelt sich zeitverzögert eine deutliche Differenz der Glutamin‐Varianten. Die zellbezogene Verbrauchsrate zeigt die höchsten Werte erneut zu Beginn des Versuchs. In der Folge nehmen jedoch alle Werte ab und erreichen bei 140 h die Nulllinie.

Tabelle 5-30: Glucose-Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von L929 Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12

Glucose [g/l] 3,2 – 0,7 0,5 – 0,4 0 Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 1360 - 190 60 - 45 40 - 30

Einfluss Gln 0 / 0 + / 0 - / 0 Einfluss FKS ++ / ++ ++ / + (+++) / (+)

Advanced DMEM

Glucose [g/l] 3,2 – 0,1 0,5 - 0 0 Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 850 - 340 140 - 60 40 – 0

Einfluss Gln ++ / ++ +++ / ++ (+++) / (+) OptiCHO Glucose [g/l] n/a n/a n/a

Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] n/a n/a n/a

MHEC5-T

Die Glucose‐Verläufe von MHEC5‐T‐Zellen zeigen eine lineare Abnahme. Die Glucose wird in den ersten 100 h nahezu vollständig verbraucht. Dabei ist kein Unterschied zwischen den Glutamin‐ oder FKS‐Gaben auszumachen (vgl. Tabelle 5‐31). Die Kulturen erreichen zu Beginn eine maximale Glucose‐Aufnahme pro Zelle. Davon hebt sich der serumfreie Versuch nicht merklich ab. Eine Ausnahme bildet der Zeitpunkt zu 110 h, in welchem eine erneute Zunahme der 4 mM und 6 mM Gln‐Kulturen zu erkennen ist. In der Folge streben alle Werte gegen Null und werden teilweise leicht negativ, was der Messauflösung geschuldet sein sollte. Die Kultivierung in Advanced DMEM zeigt einen sehr ähnlichen Lauf, sowohl innerhalb der Gln‐Varianten wie auch im Vergleich mit der DMEM/F‐12 Kultivierung. Dies spiegelt auch die Verbrauchsrate wider, welche ihre Maximalwerte zu Beginn erreichen und in der Folge auf null oder ins Negative absinken. Dabei fällt die Kultur mit 2 mM Gln auf, welche zeitweise einen erkennbar niedrigeren Glucose‐Verbrauch hat.

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Tabelle 5-31: Glucose-Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von MHEC5-T Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12

Glucose [g/l] 3,2 – 0,7 0,5 – 0,4 0 Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 600 - 20 0 20 - 0

Einfluss Gln + / ++ + / ++ + / ++ Einfluss FKS + / + + / 0 (+) / (0)

Advanced DMEM

Glucose [g/l] 3,2 – 0,8 0,5 - 0 0 Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 650- 140 280 – 0 70 – 0

Einfluss Gln 0 / ++ + / +++ (++) / (+) OptiCHO Glucose [g/l] n/a n/a n/a

Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] n/a n/a n/a

Jurkat

Große Übereinstimmung der Verläufe zeigen die Jurkat‐Zellen, welche in RPMI 1640 oder Advanced RPMI kultiviert worden sind. Diese zeigen eine einheitliche, lineare Abnahme der Glucose‐Konzentration (siehe Tabelle 5‐32).

Tabelle 5-32: Glucose-Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von Jurkat Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


RPMI 1640

Glucose [g/l] 2 – 0 n/a 0 Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 870 - 75 n/a >5

Einfluss Gln 0 / 0 n/a 0 / 0 Einfluss FKS n/a

Advanced RPMI

Glucose [g/l] 2 – 0 n/a 0 Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 590 - 80 n/a >6

Einfluss Gln 0 / + n/a (0) / (0)

So ist diese nach 100 h nicht mehr (verlässlich) messbar. Zwischen den Glutamin‐Varianten gibt es keine merklichen Unterschiede. Allerdings zeigen die zellzahlbezogenen Verbrauchsraten leichte Abweichungen. Im Falle von RPMI 1640 liegt die maximale Verbrauchsrate bereits zu Beginn des Versuchs vor und sinkt danach auf etwa ein Drittel des Ausgangswertes ab. Von diesem Punkt an nimmt die Verbrauchsrate weiter linear, allerdings mit geringerer Steigung, gegen den Nullpunkt ab. Für Advanced RPMI zeigt sich ein niedrigerer Glucose‐Verbrauch zu Beginn der Kultivierung. Dieser startet bei etwa 600 fmol Zelle·h⁄ und sinkt nach 80 h auf ein Sechstel. In der Folge geht die Verbrauchsrate gegen Null. Hier herrscht unabhängig von der Glutamin‐Konzentration große Übereinstimmung der Daten. Einzig zum Zeitpunkt 40 h sind Abweichungen zu erkennen. Hierbei ist die zellbezogene Glucose‐Verbrauchsrate proportional zum ursprünglichen Glutamin‐Gehalt.

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HepZ

Die Glucose‐Konzentrationen in HepZ‐Kulturen in DMEM/F‐12 fallen gemäß Tabelle 5‐33 unbeeinflusst von der Glutamin‐Supplementierung. So ist eine lineare Abnahme der Werte bis zu 170 h zu erkennen. Zu diesem Zeitpunkt sind etwa 85 % der Glucose verbraucht. Dies gilt nicht für die serumfreie DMEM/F‐12 Kultivierung. Hier sinkt die Glucose‐Konzentration nicht, sondern steigt linear an. Hinsichtlich der zellbezogenen Verbrauchswerte ist anzumerken, dass die 2 mM Variante zu Beginn keinen merklichen Verbrauch zeigt. Bereits zum nächsten Messpunkt steigt dieser auf das globale Maximum von etwa 480 fmol Zelle·h⁄ . Die Kultur in 4 mM und 6 mM Glutamin zeigen von Beginn an einen gewissen Glucose‐Verbrauch, welcher sich im Verlauf bei etwa 250 fmol Zelle·h⁄ einpendelt. Bis zum Prozessende wird der Glucose‐Verbrauch nicht null oder negativ. Der Glucose‐Verbrauch der serumfreien DMEM/F‐12 Kultur liegt dauerhaft im negativen Bereich.

Tabelle 5-33: Glucose-Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von HepZ Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12

Glucose [g/l] 3,2 – 1,8 n/a 0,6 – 0,5 Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 480 - 100 n/a 200 - 150

Einfluss Gln 0 / ++ n/a (0) / (+) Einfluss FKS +++ / +++ n/a (++++) / (++++)

Advanced DMEM


[fmol Zelle·h⁄ ] 620- 210 n/a 180 – 60

Einfluss Gln + / +++ n/a (++) / (+)

Die Glucose‐Konzentrationen der Kulturen in Advanced DMEM zeigen über die Prozesszeit allesamt eine abnehmende Tendenz, welche jedoch deutlich geringer ausfällt als in bisherigen Betrachtungen. Bis zum Prozessende liegt die gesamte Glucose‐Abnahme im Fall der 2 mM Gln Kultur bei 20 % und 50 % im Fall der 4 mM Gln Variante. Somit sind die Differenzen zwischen den Glutamin‐Versuchen größer als in DMEM/F‐12. Bei Betrachtung der Glucose‐Aufnahmerate ist zunächst keine eindeutige Tendenz zu erkennen. Die Werte zeigen eine starke Streuung und damit verbundene, höhere Differenzen zwischen den Varianten. Hierbei ist keine klare Tendenz zu erkennen. Erst über 70 h hinaus nähern sich alle drei Ansätze bis zum Prozessende an.

PAC

Die Glucose‐Konzentrationen der primären Zellen deuten nach Tabelle 5‐34 eine abnehmende Tendenz an. Die serumhaltigen Kulturen verdeutlichen eine Abnahme der Glucose‐Konzentration bis circa 50 h. Hierbei sind keine wesentlichen Unterschiede zu erkennen. In der Folge fächert sich das Signal auf. Dies bedingt eine Zunahme der Differenzen, wobei es teilweise zu einem Anstieg der gemessenen Glucose kommt. Dies prägt sich in der Verbrauchsrate aus. Während die serumhaltigen Kulturen einem nahezu einheitlichen Verlauf folgen, welcher nach und nach mäßige Unterschiede zwischen den Glutamin‐Varianten zeigt, weicht die serumfreie Kulturführung deutlicher davon ab. Letztere sinkt beginnend von einem Wert bei 1500 fmol Zelle·h⁄ ins Negative und oszilliert in der Folge um die Nulllinie. In serumreduzierten Advanced DMEM zeigt sich zunächst ein Rückgang der Glucose‐Konzentration. Während die 2 mM Gln Kultur weiter eine abnehmende Glucose‐Konzentration aufzeigt, bleibt das Signal der 4 mM Kultur nach 30 h konstant. Durch einen erneuten Anstieg treffen sich beide Kurven im gleichen Punkt. In der folge bleibt die Glucose‐Konzentration

ERGEBNISSE

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beider Varianten konstant. In der zellbezogenen Verbrauchsrate verdeutlicht sich dies in einem Oszillieren um die Nulllinie. Rechnerisch zeigen PAC im Vergleich hohe Glucose‐Verbrauchsraten.

Tabelle 5-34: Glucose-Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von PAC Zellen eingeteilt nach Medium und Wachstumsphase. Die Tendenz der Werteverläufe wird über Pfeile angegeben. Die Differenz der Mediumsupplemente wird aus der Mittelwert-bezogenen Mittelabweichung abgeleitet: 0: keine Differenz (<10 %), +: geringe Differenz innerhalb des Messfehlers (10-35 %), ++: merkliche Differenz (35-70 %), +++: markante Differenz (70-100 %), ++++: sehr markante Differenz (>100 %). Beurteilungen in Klammern erfolgen, wenn innerhalb der abschließenden Phasen ausschließlich ein Punkt liegt.


DMEM/F-12


[fmol Zelle·h⁄ ] 2100 - 0 n/a 15 - 0

Einfluss Gln + / + n/a (++) / (+++) Einfluss FKS ++ / +++ n/a (+) / (+++)

Advanced DMEM

Glucose [g/l] 3,2 – 1,5 2,6 – 2,2 n/a Verbrauch

[fmol Zelle·h⁄ ] 1800 - 0 320 – 0 n/a

Einfluss Gln ++ / +++ + / +++ n/a

Laktat im Überstand Im weiteren Verlauf der Arbeit sind bestimmte Kultivierungen ausgewählt und deren Laktat‐Gehalt gemessen worden. Diese Ergebnisse werden in der Folge auch als zellbezogene Laktatbildungsraten in Tabelle 5‐35 dargestellt. Die Berechnung erfolgt dabei in Analogie zur Glucose‐Verbrauchsrate, mit dem Unterschied des Vorzeichenwechsels. Innerhalb des Kulturverlaufs von CHO Zellen mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin wird deutlich, dass bereits zu Beginn Laktat gebildet wird. Ausgehend von ca. 2,5 mM zu Prozessbeginn, liegen nach 100 h etwa 10 mM vor. Dieser Wert sinkt in der Folge auf 8 mM, was durch die Bildungsrate verdeutlicht wird. Zunächst ist diese maximal und sinkt mit Übergang in den negativen Bereich.

Tabelle 5-35: Darstellung der Laktat-Konzentration und Bildungsraten in den gemessenen Versuchsreihen unterteilt nach Wachstumsphasen

Zellen in Medium Wachstumsphase Exponentiell Stationär Retardation CHO in DMEM/F-12 + 10 % FKS + 2 mM Gln

Laktat [mM] 2-9 10 8 Bildung [fmol Zelle·h⁄ ] 330-60 40 -40

CHO in Advanced DMEM + 1 % FKS + 4 mM Gln

Laktat [mM] 3,5-8,5 7 4 Bildung h [fmol Zelle·h⁄ ] 360-10 -80 -230

CHO in Ex-Cell 325 PF + 4 mM Gln

Laktat [mM] n/a 2 n/a Bildung [fmol Zelle·h⁄ ] n/a -50 bis 50 n/a

L929 in DMEM/F-12 + 10 % FKS + 4 mM Gln

Laktat [mM] 2-8 9 7 Bildung [fmol Zelle·h⁄ ] 240-90 20 -40

L929 in Advanced DMEM + 1 % FKS + 4 mM Gln

Laktat [mM] 1,5-7 6 4,5 Bildung [fmol Zelle·h⁄ ] 430-80 -50 -120

Jurkat in RPMI 1640 + 10 % FKS + 4 mM Gln

Laktat [mM] 2-7,5 n/a 7 Bildung [fmol Zelle·h⁄ ] 340-30 n/a -10

Jurkat in Advanced RPMI + 1 % FKS + 4 mM Gln

Laktat [mM] 1-8 n/a 7,5 Bildung [fmol Zelle·h⁄ ] 330-30 n/a 0

Die Kultur von CHO in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin zeigt nach etwa 30 h einen Wert von 3,5 mM Laktat. Dieser steigt stetig an, wobei das gemessene Maximum von 8,5 mM bei 120 h liegt. In der Folge nimmt die Konzentration bis zu 170 h auf 4 mM ab. Somit ist die Bildungsrate

ERGEBNISSE

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zu Beginn maximal, nimmt im Intervall von 90 h auf nahe null ab und geht dann mit späterer Zunahme ins Negative über. CHO Zellen in Ex‐Cell 325 PF mit 4 mM Glutamin zeigen einen über die Prozesszeit nahezu konstanten Laktat‐Verlauf. Deutlicher wird an dieser Stelle die zellzahlbezogene Bildungsrate. Hier ist zu erkennen, dass der Kurvenverlauf zunächst im negativen Bereich beginnt, für die Zeit von etwa 20 h positiv wird und zum Ende des Versuchs erneut deutlich ins Negative sinkt.

L929‐Zellen in DMEM mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin zeigen einen ähnlichen Verlauf der Laktat‐Kurve, wie CHO Zellen. Hierbei beginnt diese bei 2 mM und steigt auf etwa 9 mM nach 90 h. Dem Maximum folgt eine Abnahme des Signals auf 7 mM nach 170 h. Dargestellt als zellbezogene Bildungsrate zeigt sich, dass diese zu Beginn maximal ist und über die Zeit mit abnehmender Steigung der Nulllinie nähert. Gemäß dem Kurvenverlauf liegt diese für etwa 40 h bis zum Ende der Kultivierung im Negativen. Dem recht ähnlich verläuft die Kultivierung in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin. Diese beginnt bei etwa 1,8 mM und steigt auf maximal 7 mM nach 120 h. Über diese Zeit hinaus kommt es zu einer Abnahme der Konzentration. In zellbezogene Bildungsraten ausgedrückt, bedeutet das ein Maximum zu Beginn und einen Rückgang bis zur Nulllinie nach circa 100 h. Ab diesem Zeitpunkt geht der Wert in eine Verbrauchsrate über.

Die Kulturführung von Jurkat Zellen in RPMI 1640 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin zeigt erneut einen Anstieg des Laktats in den ersten 100 h des Versuchs. Dieser Anstieg beginnt bei etwa 2 mM und erreicht ein Maximum von etwa 7,5 mM. Betrachtet man dies als Bildungsrate mit Fokus auf die LZZ, so zeigt sich eine maximale Bildungsrate zu Beginn der Kulturführung, welche linear sinkt und bei 90 h ein positives Minimum erreicht. Mit geringerer Steigung verringert sich die Bildungsrate in der Folge bis diese bei circa 130 h gegen Null geht. Ein sehr ähnliches Bild zeigt auch die Kultivierung der Jurkat in Advanced RPMI. Hier steigt die Laktat‐Konzentration von etwa 1 mM auf etwa 8 mM und sinkt über diesen Punkt hinaus leicht. Somit zeigt sich in diesem Fallen erneut die maximale Bildungsrate zu Prozessbeginn und sinkt innerhalb der ersten Hälfe auf ein Niveau nahe Null, welches endgültig nach 140 h erreicht wird.

Glutamin im Überstand In den Kulturüberständen sollte neben den bereits genannten Analyten auch die Konzentration an Glutamin bestimmt werden. Hierzu kann jedoch ausschließlich Abbildung 5‐9 herangezogen werden. Bezogen auf CHO‐Zellen in 4 mM bleibt festzuhalten, dass Glutamin ab etwa 100 h nahezu verbraucht ist. Dem Gegenüber wird innerhalb der Sterbephase die maximale Ammonium‐Konzentration von 4 mM erreicht.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 18010

5

106

Leb

endzellzahl [1/m

l]

Prozesszeit [h]

50

60

70

80

90

100

Vitalität [%]

0

1

2

3

4

Glutamin/Ammonium Konz. [mmol/l]

Abbildung 5-9: Verlaufe der Gln-Überstandmessung in einer Kultur von CHO -Zellen in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 4 mM Gln. Gezeigt sind der Gln-() sowie Ammonium()-Verlauf vor dem Hintergrund der zugehörigen Wachstumskurve mit LZZ ()und Vitalität()

ERGEBNISSE

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5.3. Beeinflussung des Metabolismus

Innerhalb dieses Kapitels werden die Ergebnisse ausgewählter Toxizitätstest vorgestellt. Für jedes Toxin ist zunächst ein WST‐Test durchgeführt worden, um die wirksamen Konzentrationen zu identifizieren. In der Folge sind ausgewählte Konzentrationen im SDR zur Anwendung gekommen, deren prozessierten Ergebnisse dargestellt werden. Es werden die Sauerstoffaufnahmerate (= OURges) und die Ansäuerungsrate (= ACRges) berechnet. Im Fall der OUR findet eine zeitpunktbezogene Auftragung Anwendung, im Fall der Ansäuerungsrate handelt es sich auf eine intervallbezogene Angabe zwischen zwei Zeitpunkten. Anzumerken ist, dass in diesem Fall die Raten weder auf eine Zellzahl noch auf ein Volumen bezogen sind.

5.3.1. Hemmung der Atmungskette

Innerhalb dieser Versuchsreihe ist WST‐8 sowohl als Screening‐Werkzeug, zur schnellen Eingrenzungen relevanter Konzentrationen, wie auch zum Vergleich der Messmethoden herangezogen worden.

Rotenon In Abbildung 5‐10 ist die Dosis‐Wirkungskurve für das Komplex I inhibierende Rotenon dargestellt. Hier zeigt die Kultur mit der größten Rotenon‐Konzentration (0,1 mM) einen ca. 50 % geringeren Umsatz als die Kontrollkultur.

10‐7 10‐6 10‐5 10‐40,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

norm

. Absorption=

450 nm [‐]

Konzentration Rotenon [mol/l]

A

10‐7 10‐6 10‐5 10‐40,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

norm

. Absorption=

450 nm [‐]

Konzentration Rotenon [mol/l]

B

Abbildung 5-10: Normierte Dosis-Wirkungskurve für Rotenon nach 24-stündiger Einwirkdauer auf CHO (Bild A links) und L929 (Bild B rechts) Zellen; Startzellzahl: 1,0·105 LZZ

ml

Durch die Zugabe von Rotenon zeigt die Kultur im Konzentrationsbereich von 100 bis 0,1 µM über die Kultivierungsdauer von 70 h eine konstante Sauerstoffsättigung (vgl. Abbildung 5‐11). Dabei liegt der Sättigungswert für 100 µM bei ca. 90 %, während geringere Konzentrationen eine geringere Sättigung besitzen. Die Kulturen mit 10 bzw. 1 µM weisen fast identische Verläufe auf, der pO2 ist hier bei ca. 87 % konstant. Bei 0,1 µM zeigt sich dieser Wert mit 85 % nur minimal geringer. Die Kontrollkultur geht im Bereich von 70 h in einen stationären Bereich von 50 % über.

ERGEBNISSE

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0 20 40 60 80

50

60

70

80

90

pO

2

[% atm

]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-11: Zeitlicher pO2-Verlauf für die Einwirkung von Rotenon auf CHO Zellen. Startzellzahl: 1,0·105 LZZml,

Batch: OD-1319-01. Die pO2-Verlaufslinien stellen den Mittelwert aus drei einzelnen Messungen dar. Von Rot nach Schwarz nimmt die Konzentration zu. Diese sind Kontrolle 100 µM, 10 µM, 1 µM, 100 nM

Die Einwirkung von Rotenon zeigt im Konzentrationsbereich von 0,1 bis 100 µmol/l mit fortschreitender Inkubationszeit eine sinkende Atmungsaktivität (Abbildung 5‐12 A). Die Abnahme der Sauerstoffaufnahme beträgt über einen Konzentrationsbereich von drei Zehnerpotenzen lediglich 20 %. Dabei sind die Konzentrationen 0,1 und 1 µmol/l mit einer größeren Standardabweichung behaftet (Abbildung 5‐12 B).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

102030

4050

6070

0,1

1

10100

OUR norm

iert [‐]

Inkubationszeit [h] Konzen

tration

Roteno

n

[µmol/l

]

A B

Konzentration Rotenon [µmol/l]

0,1 1 10 100

OUR norm

iert [‐]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Abbildung 5-12: Sauerstoffaufnahmerate bei CHO Zellen unter Einwirkung von Rotenon. Bestimmung nach dem quasistationären Prinzip. Bild A: normierte OUR in Abhängigkeit von Inkubationszeit sowie Konzentration. Normiert auf OUR der Kontrollkultur zum entsprechenden Zeitpunkt Bild B: normierte OUR nach 24-stündiger Einwirkdauer

Malonat Malonat zeigt für Konzentrationen kleiner 0,01 M keine deutlichen Unterschiede zur Kontrollkultur (siehe Abbildung 5‐13). Im Konzentrationsbereich von 0,01 M bis 0,1 M ist eine Abnahme im metabolischen Umsatz zu sehen. Bei Konzentrationen größer 0,1 M ist ein Umsatz von ca. 10 % bezogen auf die Kontrollkultur zu beobachten.

ERGEBNISSE

‐Seite 93‐

10‐3 10‐2 10‐1 1000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2norm

. Absorption=

450 nm [‐]

Konzentration Malonat [mol/l]

10‐3 10‐2 10‐1 1000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

norm

. Absorption=

450 nm [‐]


Abbildung 5-13: Normierte Dosis-Wirkungskurve für Malonat nach 24-stündiger Einwirkdauer auf CHO (Bild A links) und L929 (Bild B rechts) Zellen; Startzellzahl: 1,0·105 LZZ

ml

Der in Abbildung 5‐14 dargestellte zeitliche pO2‐Verlauf zeigt, dass die Kontrolle zu jedem Zeitpunkt die geringste Sauerstoffsättigung besitzt. Die Einwirkung von 0,1 M Malonat weist bereits nach wenigen Stunden ein Minimum bei ca. 90 % auf. Die restlichen Kurven besitzen, einen von der eingesetzten Konzentration, abhängigen Sättigungswert für die stationäre Phase. Dabei weisen die Kulturen mit einer höheren Konzentration an Malonat eine höhere Sauerstoffsättigung in der stationären Phase auf. Die Kontrolle selbst ist bei einer Sauerstoffsättigung von ca. 45 % stationär.

0 20 40 60 80 10040

50

60

70

80

90

100

pO

2

[% atm

]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-14: Zeitlicher pO2-Verlauf für die Einwirkung von Malonat auf CHO Zellen. Startzellzahl: 1,0·105 LZZml,

Batch: OD-1319-01. Die pO2-Verlaufslinien stellen den Mittelwert aus drei einzelnen Messungen dar. Von Rot nach Schwarz nimmt die Konzentration zu. Diese sind Kontrolle 0,1 M, 0,05 M, 0,02 M, 0,01 M, 5 mM

Bei Zugabe von Malonat zeigt sich in der dreidimensionalen Darstellung (Abbildung 5‐15 A) eine Abnahme der Atmungsaktivität, sowohl mit steigender Konzentration als auch mit steigender Inkubationszeit. Bereits nach zehn Stunden ist die normierte OUR für 0,1 mol/l auf 60 % gesunken. Diese nimmt in der weiteren Inkubationszeit auf 15 % ab. Die Konzentrationen 0,005 mol/l und 0,01 mol/l zeigen über den gesamten Inkubationszeitraum nahezu eine konstante Sauerstoffaufnahmerate bezogen auf die Kontrollkultur. Bei Einwirkung von 0,01 mol/l Malonat ergibt sich in der Inkubationszeit bis 48 h mit nahezu 100 % die größte OUR. Die Betrachtung nach 24 h (Abbildung 5‐15 B) zeigt, dass die Konzentrationen 0,005, 0,02 und 0,05 mol/l eine vergleichbare OUR zur Folge haben. Lediglich eine Konzentration von 0,1 mol/l bewirkt mit 40 % eine deutliche Reduktion der Sauerstoffaufnahme.

ERGEBNISSE

‐Seite 94‐

0,0

0,2

0,4

0,6

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Abbildung 5-15: Sauerstoffaufnahmerate bei CHO Zellen unter Einwirkung von Malonat. Bestimmung nach dem quasistationären Prinzip. Bild A: normierte OUR in Abhängigkeit von Inkubationszeit sowie Konzentration. Normiert auf OUR der Kontrollkultur zum entsprechenden Zeitpunkt. Bild B: normierte OUR nach 24-stündiger Einwirkdauer.

Azid Azid (Abbildung 5‐16) zeigt bei einer Konzentration von ca. 100 µM einen um 70 % größeren Formazan Umsatz. Dieser erreicht ab einer Konzentration von 1 µM wieder den Level der Kontrollkultur. Für höhere Konzentrationen (> 100 µM) ist eine starke Abnahme im Umsatz zu sehen. Eine Konzentration von 0,1 M NaN3 zeigt einen Umsatz von ca. 40 % bezogen auf die Kontrollkultur.

10‐9 10‐8 10‐7 10‐6 10‐5 10‐4 10‐3 10‐2 10‐10,0

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Konzentration Azid [mol/l]

A

10‐9 10‐8 10‐7 10‐6 10‐5 10‐4 10‐3 10‐2 10‐10,0

0,2

0,4

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1,2

1,4

1,6

norm

. Absorption=

450 nm [‐]

Konzentration Azid [mol/l]

B

Abbildung 5-16: Normierte Dosis-Wirkungskurve für Azid nach 24-stündiger Einwirkdauer auf CHO (Bild A links) und L929 (Bild B rechts) Zellen; Startzellzahl: 1,0·105 LZZ

ml

Bei der Betrachtung von Azid (Abbildung 5‐17) zeigt sich, dass keine Kultur eine Wachstumsphase bzw. eine eindeutige Abnahme in der Sauerstoffsättigung zeigt. Selbst die Kontrollkultur bleibt über einen Zeitraum von 90 h bei einer fast konstanten Sauerstoffsättigung. Die Wiederholung des Versuches, auch mit unterschiedlichen Produktionschargen, hat stets ein ähnliches Ergebnis geliefert.

ERGEBNISSE

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0 20 40 60 80 10060

70

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90

100

pO

2

[% atm

]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-17: Zeitlicher pO2-Verlauf für die Einwirkung von Natriumazid auf CHO Zellen. Startzellzahl: 1,0·105 LZZ ml, Batch: OD-1319-01. Die pO2-Verlaufslinien stellen den Mittelwert aus drei einzelnen Messungen dar. Von Rot nach Schwarz nimmt die Konzentration zu. Diese sind Kontrolle 0,1 M, 0,01 M, 5 mM, 100 µM, 10 µM, 1 µM

Oligomycin Durch Oligomycin (Abbildung 5‐18) wird die ATP‐Synthase gehemmt. Dabei zeigen beide Zelllinien ab einer Konzentration von 20 µM einen konstanten Umsatz von circa 10 %. Die Umsatzrate steigt dabei von 20 µM bis 5 µM an. Bei geringeren Konzentrationen bleibt der Umsatz für CHO Zellen bei etwa 92 % konstant. L929 Zellen zeigen eine Schwankungsbreite von ca. 10 %. Allerdings sind diese Messwerte mit einer größeren Standardabweichung behaftet.

10‐7 10‐6 10‐5 10‐40,0

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1,2

norm

. Absorption=

450 nm [‐]

Konzentration Oligomycin [mol/l]

B

Abbildung 5-18: Normierte Dosis-Wirkungskurve für Oligomycin A nach 24-stündiger Einwirkdauer auf CHO (Bild A links) und L929 (Bild B rechts) Zellen; Startzellzahl: 1,0·105 LZZ

ml

In Abbildung 5‐19 wird deutlich, dass die zeitliche Änderung in der Sauerstoffsättigung unter Einwirkung von Oligomycin A für alle drei eingesetzten Konzentrationen (1, 5 und 10 µM) nahezu identisch ist. Diese zeigt über einen Zeitraum von 70 h einen fast nahezu konstanten Wert von 85 %. Lediglich für 1 µM ist für den Zeitpunkt um 20 h eine geringfügig geringere Sättigung um 82 % festzustellen. Die Kontrollkultur erreicht ab 70 h einen konstanten pO2 von ca. 50 % atm.

ERGEBNISSE

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0 20 40 60 8040

50

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70

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90

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pO

2

[% atm

]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-19: Zeitlicher pO2-Verlauf für die Einwirkung von Oligomycin A auf CHO Zellen. Startzellzahl: 1,0·105 LZZ

ml, Batch: OD-1319-01. Die pO2-Verlaufslinien stellen den Mittelwert aus drei einzelnen Messungen dar. Von Rot nach Schwarz nimmt die Konzentration zu. Diese sind Kontrolle 10 µM, 5 µM, 1 µM

Die normierte OUR unter der Einwirkung von Oligomycin A zeigt über den gesamten Inkubationszeitraum eine Abnahme von 80 % auf etwa 30 % (Abbildung 5‐20 A). Dies gilt über den gesamten Konzentrationsbereich von 1 bis 10 µmol/l. Größere Konzentrationen haben eine um nur wenige Prozent geringere Sauerstoffaufnahme zur Folge. Die Betrachtung nach 24 h (Abbildung 5‐20 B) zeigt über den Konzentrationsbereich von 1 bis 10 µmol/l eine Abnahme der normierten OUR um etwa 10 %.

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Abbildung 5-20: Sauerstoffaufnahmerate bei CHO Zellen unter Einwirkung von Oligomycin A. Bestimmung nach dem quasistationären Prinzip. Bild A: normierte OUR in Abhängigkeit von Inkubationszeit sowie Konzentration. Normiert auf OUR der Kontrollkultur zum entsprechenden Zeitpunkt. Bild B: normierte OUR nach 24-stündiger Einwirkdauer.

Antimycin A Antimycin A (Abbildung 5‐21) bewirkt bei höchster Konzentration (550 µM) eine auf 30 % gesunkenen metabolischen Umsatz. Alle weiteren Verdünnungen zeigen eine deutlich geringere Auswirkung auf den WST‐Umsatz.

ERGEBNISSE

‐Seite 97‐

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450 nm [‐]

Konzentration Antimycin A [mol/l]

B

Abbildung 5-21: Normierte Dosis-Wirkungskurve für Antimycin A nach 24-stündiger Einwirkdauer auf CHO (Bild A links) und L929 (Bild B rechts) Zellen; Startzellzahl: 1,0·105 LZZ

ml

Abbildung 5‐22 zeigt den zeitlichen Verlauf der Sauerstoffsättigung für Antimycin A. Dabei ist in der ersten Stunde zu beobachten, dass der Sauerstoffpartialdruck bei der Kontrollkultur abnimmt, während er bei den mit Antimycin A versetzten Kulturen ansteigt. Für die gesamte Inkubationszeit weisen die Kurven für 270 und 55 µM nahezu identische Verläufe auf. Die Kontrollkultur geht bei 70 h in einen konstanten pO2 von ca. 50 % atm über.

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Abbildung 5-22: Zeitlicher pO2-Verlauf für die Einwirkung von Antimycin A auf CHO Zellen. Startzellzahl: 1,0·105 LZZ

ml, Batch: OD-1319-01. Die pO2-Verlaufslinien stellen den Mittelwert aus drei einzelnen Messungen dar. Von Rot nach Schwarz nimmt die Konzentration zu. Diese sind Kontrolle 550 µM, 270 µM, 55 µM

Unter Einwirkung von Antimycin A zeigt sich bereits zu Beginn der Inkubationszeit im gesamten Konzentrationsbereich von 50 bis 550 µmol/l eine Sauerstoffaufnahmerate, die lediglich 70 % der Kontrollkultur beträgt (Abbildung 5‐23 A). Diese nimmt über die gesamte Inkubationsdauer stetig ab und erreicht nach 70 h einen Wert von 20 %. Dabei zeigt sich über den gesamten Zeitraum die höchste Konzentration (550 µmol/l) stets mit der geringsten O2‐Aufnahme. Dies spiegelt sich auch in der Betrachtung nach 24 h wieder(siehe Abbildung 5‐23 B).

ERGEBNISSE

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Abbildung 5-23: Sauerstoffaufnahmerate bei CHO Zellen unter Einwirkung von Antimycin A. Bestimmung nach dem quasistationären Prinzip. Bild A: normierte OUR in Abhängigkeit von Inkubationszeit sowie Konzentration. Normiert auf OUR der Kontrollkultur zum entsprechenden Zeitpunkt. Bild B: normierte OUR nach 24-stündiger Einwirkdauer.

DNP Der Einsatz des Entkopplers 2,4‐Dinitrophenol (Abbildung 5‐24) zeigt im Konzentrationsbereich von 0,4 mM bis 3 mM eine Abnahme in der metabolischen Aktivität. Der Umsatz bei höchster Dosierung (6,5 mM) beträgt ca. 45 %. Für Konzentrationen kleiner 0,4 mM besitzen beide Zelllinien einen Umsatz von ca. 85 %.

Da 2,4‐Dinitrophenol aufgrund seiner molekularen Struktur eine Absorption bei 450 nm besitzt, stört es die photometrische Bestimmung des WST‐Umsatzes. Deswegen ist hier vor der WST‐Zugabe ein Medienwechsel erfolgt.

10‐5 10‐4 10‐30,0

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B

Abbildung 5-24: Auf die Kontrolle normierte Dosis-Wirkungskurve für 2,4-Dinitrophenol nach 24-stündiger Einwirkdauer auf CHO (Bild A links) und L929 (Bild B rechts) Zellen. Startzellzahl: 1,0·105 LZZ

ml; Vor WST-8 Zugabe erfolgte ein Medienwechsel.

Der Einfluss des Entkopplers 2,4‐Dinitrophenol auf den pO2‐Verlauf ist in Abbildung 5‐25 dargestellt. Hier zeigen Konzentrationen im Bereich von 1,3 mM bis 0,13 mM eine geringere Sauerstoffsättigung für die stationäre Phase als die Kontrollkultur. Dabei besitzt die Kultur mit 0,65 mM DNP mit ca. 30 %

ERGEBNISSE

‐Seite 99‐

die geringste Sättigung. Die Kurve für 3,26 mM zeigt nach 45 h ein Minimum bei 52 % atm. Bei der doppelten Konzentration ist der Verlauf der Sauerstoffsättigung bereits nach wenigen Stunden konstant.

0 20 40 60 80 10020

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]

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Abbildung 5-25: Zeitlicher pO2-Verlauf für die Einwirkung von 2,4-Dinitrophenol auf CHO Zellen. Startzellzahl: 1,0·105 LZZ

ml, Batch: OD-1319-01. Die pO2-Verlaufslinien stellen den Mittelwert aus drei einzelnen Messungen dar. Von Rot nach Schwarz nimmt die Konzentration zu. Diese sind Kontrolle, 0,13 mM, 0,26 mM, 0,65 mM, 1,3 mM, 3,26 mM, 6,52 mM.

In der dreidimensionalen Darstellung der normierten OUR gegen die Inkubationszeit und die Konzentration an 2,4‐Dinitrophenol ergeben sich mehrere lokale Maxima (Abbildung 5‐26 A). Das globale Maximum liegt bei einer Konzentration von 0,65 mmol/l und einer Inkubationszeit von 12 h. Die Sauerstoffaufnahmerate ist dabei um etwa 45 % größer als die der Kontrollkultur. Für diese Konzentration ist die OUR über die gesamte Inkubationszeit größer als die der Kontrollkultur. Bei den Konzentrationen 0,13 mmol/l und 0,26 mmol/l sind über die Inkubationsdauer von 70 h ein Anstieg der bezogenen OUR von anfänglich 90 % auf etwa 100 % zu verzeichnen. 6,5 mM DNP zeigt ebenso wie 3,26 mM mit fortlaufender Inkubationszeit eine Abnahme in der Sauerstoffaufnahme.

Die Betrachtung nach 24 h (Abbildung 5‐26 B) liefert zwei Maxima in der normierten OUR. Für 3,26 mM liegt diese bei 130 % und für 0,65 mM bei 135 %. Allerdings ist bei letzterer Konzentration die Standardabweichung mit 28 % relativ groß.

ERGEBNISSE

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0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Abbildung 5-26: Sauerstoffaufnahmerate bei CHO Zellen unter Einwirkung von 2,4-Dinitrophenol. Bestimmung nach dem quasistationären Prinzip. Bild A: normierte OUR in Abhängigkeit von Inkubationszeit sowie Konzentration. Normiert auf OUR der Kontrollkultur zum entsprechenden Zeitpunkt. Bild B: normierte OUR nach 24-stündiger Einwirkdauer.

Untersuchung des Todesmechanismus via Durchflusszytometrie Im folgenden Kapitel sind durchflusszytometrische Daten dargestellt. Diese sind mit zwei unterschiedlichen Systemen erfasst worden. Für Färbungen mit PJ und YO‐PRO®‐1, sowie für verschiedene Kitsysteme von invitrogen Molecular Probes ist das LSR I von BD verwendet worden. Dieses arbeitet nach dem Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung mit Hilfe eines Hüllstromes. Hier ist eine manuelle Anpassung der Einstellungsparameter (Filter, Gain, Kompensation) notwendig.

Im Weiteren ist ein Muse® Cell Analyzer von Merck Millipore im Einsatz gewesen. Die Fokussierung erfolgt in einer Kapillare durch ein laminares Strömungsprofil ohne ein zusätzliches Hüllfluid. Für dieses Gerät werden speziell abgestimmte Testsysteme angeboten. Parametereinstellungen wie beim LSR I sind nicht nötig.

PJ/YO-PRO®-1 Färbungen

Die kombinierte Färbung aus PJ und YO‐PRO®‐1 ermöglicht es nicht nur zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden, sondern sie gibt auch Informationen über apoptotische Vorgänge. (Früh‐) Apoptotische Zellen erscheinen dabei lediglich in der YP‐Färbung positiv.

Abbildung 5‐27 zeigt die 2D Dot/Contour Plots nach 4‐stündiger Einwirkung aller sechs verwendeten Toxine. Zur besseren Vergleichbarkeit ist die Kontrollkultur jeweils in grün dargestellt. Bei Oligomycin (10 µM) ist ein Anstieg in der YP Intensität um den Faktor 10 festzustellen. Antimycin (55µM) zeigt eine deutliche erhöhte PJ Intensität. Die restlichen Toxine besitzen zu diesem Zeitpunkt eine größere Streuweite in beiden Parametern im Vergleich zur Kontrollkultur.

ERGEBNISSE

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Abbildung 5-27: Dot-Plots für PJ und YP gefärbte CHO Zellen nach 4-stündiger Einwirkdauer A: Rotenon 5 µM B: Malonat 20 mM C: Antimycin A 55 µM D: Azid 100 mM E: Oligomycin A 10 µM F: 2,4‐Dinitrophenol 6,5 mM

Metabolic Activity/Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit

Das hier verwendete Kitsystem nutzt drei Farbstoffe um Zellen zu unterscheiden. Sytox Green ermöglicht die Unterscheidung zwischen lebend und tot. C12‐Resazurin dient zur Differenzierung der metabolischen Aktivität. APC Annexin V dient der Markierung apoptotischer Zellen. Zur Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist neben einer Negativkontrolle ohne Toxineinwirkung eine Positivkontrolle geführt worden, welche dazu 2 mM Wasserstoffperoxid für 4 h ausgesetzt gewesen ist. Bei der Betrachtung von CHO Zellen (Abbildung 5‐28) fällt auf, dass die Negativkontrolle bereits in zwei Populationen unterteilt werden kann. Eine Teilpopulation besitzt eine deutliche gesteigerte Intensität im Annexin V Signal. Die Einwirkung von Azid (10 mM) zeigt in der Annexin V Intensität einen starken Anstieg. Aus der Sytox Green Intensität lassen sich zwei Populationen ableiten. Die größte zeigt einen leichten Intensitätsanstieg gegenüber der Negativkontrolle, während die kleinere das Intensitätsniveau der Positivkontrolle erreicht. Die C12 Intensität ist gegenüber der Positivkontrolle größer, zeigt aber eine deutlich geringere Streuweite als die Negativkontrolle (vgl. Abbildung 5‐28).

ERGEBNISSE

‐Seite 102‐

Abbildung 5-28: Metabolic Activity/Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit für CHO Zellen nach 24-stündiger Einwirkdauer von Azid

Abbildung 5‐29 zeigt die Auswirkungen von Malonat nach 24 h auf CHO Zellen. Hier ist eine starke Streuweite in der Annexin V Intensität zu erkennen. Bei der Betrachtung von Sytox Green ist ein Anstieg um den Faktor 4 der Intensität gegenüber der Negativkontrolle zu erkennen. Bei einer kleinen Population ist eine 20‐fach gesteigerte Intensität zu beobachten. Die Intensität für C12 liegt im Bereich der Negativkontrolle.

ERGEBNISSE

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Abbildung 5-29: Metabolic Activity/Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit für CHO Zellen nach 24-stündiger Einwirkdauer von Malonat

Muse Annexin V & Dead Cell

Bei diesem Testsystem erfolgt die Unterscheidung durch den Vitalitätsmarker 7‐AAD und den Apoptosemarker Annexin V. Die Auswertung ist sowohl nach 4‐ als auch nach 24‐stündiger Einwirkdauer der Toxine erfolgt. Dabei sind pro Toxin drei verschiedene Konzentrationen getestet worden. Dieses Muster findet bei allen Muse‐Versuchen Anwendung mit der einzigen Ausnahme der MultiCaspase Versuche, die nach 24 h ausgewertet worden sind.

Anhand der Signalintensität können vier Populationen abgegrenzt werden: Lebend, Apoptotisch, Spätapoptotisch und Tot. Die Festlegung dieser Gates ist an den Kontrollkulturen zum entsprechenden Zeitpunkt geschehen (vgl. Abbildung 5‐30). Die Kontrollkultur nach 4‐stündiger Inkubation zeigt mit 99,9 % nur lebende Zellen. Die Kontrolle nach 24 h weißt mit etwa 5 % einen gestiegenen Anteil an toten Zellen auf. Der Anteil an lebenden Zellen liegt bei knapp 92 %. Die apoptotische bzw. spätapoptotischen Zellen belaufen sich in beiden Fällen auf wenige Prozent.

Abbildung

Die zugKonzentMalonatrestlicheKontrollkIntensitägegenüb5‐30 fest

Tabelle 5-

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‐Seite 104‐

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EBNISSE

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ERGEBNISSE

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In Tabelle 5‐36 ist zu sehen, dass nach 4‐stündiger Einwirkdauer der Anteil an nicht gefärbten Zellen mit über 94 % sehr groß ist. Eine positive Markierung bezüglich Annexin V ist nur bei wenigen Prozent zu beobachten. Dabei beläuft sich der Anteil an toten Zellen auf ebenfalls wenige Prozent.

Nach 24‐stündiger Einwirkdauer ist bei Antimycin (550 µM) eine stark apoptotische Fraktion zu erkennen. Ein Absenken der Konzentration auf 270 µM bzw. 137 µM reduziert diesen Anteil auf unter 2 %. Auch Rotenon besitzt bei einer Konzentration von 25 µM mit 13 % einen erhöhten apoptotischen Anteil. Der Anteil an lebenden Zellen ist im Vergleich zur 4‐stündigen Einwirkdauer erheblich gesunken. Lediglich Malonat und Oligomycin weisen hier einen Anteil von über 90 % auf.

Tabelle 5-37: Übersicht Muse Annexin V Assay nach 24-stündiger Einwirkdauer. Werte aus Einzelmessungen, Angabe in [%]

Toxin Annexin V [-] 7-AAD [-]

Annexin V [+] 7-AAD [-]

Annexin V [+] 7-AAD [+]

Annexin V [-] 7-AAD [+]

Rotenon

25 µM 68,4 13 17,8 0,8

12 µM 84,6 2,7 11,3 1,4

2 µM 81,5 2 15,3 1,2

Malonat

20 mM 96,2 1,7 1,7 0,4

10 mM 95 0,7 3,5 0,9

1 mM 96,1 1,6 2,1 0,2

Antimycin

550 µM 25,7 42,8 30,5 1

275 µM 87 1,5 10,6 0,9

137 µM 85,3 1,9 12,3 0,5

Azid

10 mM 77,4 1,5 19,2 2

100 µM 93,5 1,7 4,3 0,4

1µM 93,3 2,6 3,4 0,7

Oligomycin

8 µM 94,4 1,6 3,8 0,3

2 µM 90,8 2,4 6,4 0,4

0,8 µM 94,4 1,8 3,6 0,3

DNP

6,5 mM 63,4 1,6 28,7 6,2

1,3 mM 96,5 0,9 2,2 0,4

0,3 mM 95,4 1,4 3 0,2

Muse MitoPotential

Die Entwicklung des Mitochondrienpotentials ΔΨ ist unter Einwirkung von Inhibitoren der Atmungskette von besonderem Interesse. Oft ist ein Verlust des transmembranen Potentials mit einem programmierten Zelltod verbunden. Die Bestimmung erfolgt über einen lipophilen kationischen Farbstoff und dem Vitalitätsmarker 7‐AAD im Muse Cell Analyzer.

Die Zellen können anhand ihrer Signalintensität in vier verschiedene Bereiche unterteilt werden: Lebend, Depolarisiert, Depolarisiert‐Tot und Tot. Ein hohes Fluoreszenzsignal steht für einen großen Protonengradienten über der inneren Mitochondrienmembran und zeigt damit intakte Mitochondrien an. In Folge von Toxineinwirkung oder apoptotischen Kaskaden können die Mitochondrien ihre Depolarisation verlieren.

Die Festlegung der Gates geschieht anhand von Kontrollkulturen (vgl. Abbildung 5‐31). Beide zeigen einen Anteil an lebenden Zellen von knapp 99 %.

Abbildung

Eine tabDie ersteZellen uÄnderun1 µM) usticht AnMitochobei den Malonat

Tabelle 5-[%]

A

g 5-31: Muse M

ellarische Übe Übersicht unter Einflusng im Mitochnd 2,4‐Dinitntimycin (55ondrienpoten restlichen t (10 mM) un

38: Übersicht M

Roteno

Malona

Antimy

Azid

Oligom

DNP

A

MitoPotential Do

bersicht der stellt Ergebss von Olighondrienpottrophenol zu50 µM) allerdntial vorhandToxinen. Dend Antimycin

Muse MitoPoten

Toxin

on

25 µ

12 µ

2 µM

at

20 m

10 m

1 m

ycin

550 µ

270 µ

137 µ10 m

100 µ

1µM

mycin

8 µM

2 µM

0,8 µ6,5 m

1,3 m

0,3 m

ot Plot der CHO

Populationsnisse nach 4omycin keinential ist beu beobachtedings deutlicden. Der Einer Anteil ann (550 µM) a

ntial Assay nac

Depol7-AAD

µM 79,

µM 85,3

M 95,2mM 25,4

mM 23,3

M 9,6µM 4,7

µM 20,2

µM 78,5mM 87,4

µM 27,5

M 28,5M 93,5

M 93,9

µM 92,7mM 36,

mM 14,

mM 16,7

‐Seite 106‐

O Kontrollkultu

sanalysen sin4‐stündiger ne Verändei Einwirkungn. Mit einemch hervor. Hfluss von Ron nicht‐vitaluf wenige Pr

ch 4-stündiger E

. [-] D [-]

Depo7-AA

1 14

3 10

2 3,4 73

3 63

6 867 80

2 79

5 194 11

5 71

5 705 4,

9 5,

7 6,1 62

1 84

7 78

uren. Bild A: na

nd in TabelleEinwirkdauerungen in dg von Malonm Anteil vonier sind 4,7 %otenon auf den Zellen brozent.

Einwirkdauer. W

l. [+] AD [-]

Depo7-AA

,9

0 3

2 1,1 1

,9 12

,5 3,5 14

,1 0

,9 1,9 0

,5 0

,7 09 1

8 0

4 0,6 1

,7 0

8 5

B

ch 4 h; Bild B:

e 5‐38 und Ter dar. Hier der Depolarat, Antimycin 95 % an d% an vitalendie Depolarisbeläuft sich

Werte aus Einze

ol. [+] AD [+]

De7-A

5

3,8

1,3 1,3

2,7

3,6 4,7

0,6

1,6 0,5

0,9

0,6 1,3

0,3

0,7 1,3

0,8

5,1

ERGE

nach 24 h

Tabelle 5‐39 zeigen ledigrisation. Einin, Azid (100depolarisierten Zellen mit sation ist germit Ausnah

elmessungen, A

epol. [-] AAD [+]

1

1

0,3 0,2

0,1

0,3 0,2

0,1

0 0,3

0,3

0,3 0,3

0

0,2 0

0,4

0,2

EBNISSE

gegeben. glich CHO ne starke 0 µM und en Zellen intaktem ringer als hme von

Angabe in

ERGEBNISSE

‐Seite 107‐

Eine Verlängerung der Einwirkdauer auf 24 h erbringt ein ähnliches Ergebnis. Besonders Malonat, Antimycin, Azid (100 µM und 1 µM) und 2,4‐Dinitrophenol bewirken einen starken Abfall im mitochondrialen Protonengradienten. Im Gegensatz dazu kann unter Einwirkung von Oligomycin der Gradient größtenteils aufrechterhalten werden. Hier ist der Anteil an 7‐AAD positiven Zellen lediglich wenige Prozent groß. Dieser wird unter Einwirkung von Rotenon größer, allerdings bleibt auch hier das Mitochondrienpotential mehrheitlich erhalten.

Ähnlich den Ergebnissen bei 4‐stündiger Einwirkdauer bewirkt 550 µM Antimycin auch nach 24 h einen deutlichen Verlust im Mitochondrienpotential. Der Anteil an lebenden Zellen hat sich mit 4 % nur geringfügig verändert. Dahingegen hat sich der Anteil an 7‐AAD positiven Zellen erhöht.

Tabelle 5-39: Übersicht Muse MitoPotential Assay nach 24-stündiger Einwirkdauer. Werte aus Einzelmessungen, Angabe in [%]

Toxin Depol. [-] 7-AAD [-]

Depol. [+] 7-AAD [-]

Depol. [+] 7-AAD [+]

Depol. [-] 7-AAD [+]

Rotenon

25 µM 84,6 6,8 5,4 3,3

12 µM 86,5 5,7 4,2 3,7

2 µM 92 4,3 2,3 1,4

Malonat

20 mM 17,9 79,6 1,4 1,2

10 mM 17,7 68 9,9 4,4

1 mM 5,8 87,8 5,6 1

Antimycin

550 µM 4 65 30,3 0,7

270 µM 17,4 81,4 1,1 0,1

137 µM 75,8 21,7 2,5 0,1

Azid

10 mM 85,1 13,3 0,5 1,1

100 µM 22 73,9 2,6 1,5

1µM 21,2 76,7 0,9 1,2

Oligomycin

8 µM 92,4 4,4 2 1,3

2 µM 92 7,1 0,4 0,6

0,8 µM 89,4 8,9 1 0,8

DNP

6,5 mM 35,5 62,8 1,8 0,1

1,3 mM 12,7 85,4 0,7 1,3

0,3 mM 10,9 81,7 5,6 1,8

Bei Betrachtung der Populationen nach 4 h Einwirkdauer (siehe Anhang: Abbildung 10‐79) wird deutlich, dass Rotenon (25 µM) sowie Oligomycin (2 µM) nahezu identisch mit der Kontroll‐Kultur sind. Unter Einwirkung von Malonat (20 mM), Azid (10 mM) bzw. 2,4‐Dinitrophenol (6,52 mM) ist eine starke Abnahme in der Depolarisation zu beobachten. Gleichzeitig nimmt die Intensität von 7‐AAD ab. Die Einwirkung von Antimycin (550 µM) bewirkt die Ausbildung von zwei Populationen. Während die erste als schwach depolarisiert eine große Vitalität besitzt, zeigt die zweite einen deutlichen Anstieg im 7‐AAD Signal. Dieses Bild ändert sich nach 24 h Einwirkdauer (siehe Anhang: Abbildung 10‐80) nur geringfügig.

Muse Caspase 3/7

Bei der Apoptose sind maßgeblich Effektorcaspasen wie Caspase 3 und 7 an der Fragmentierung des Zellinventars beteiligt. Die Festlegung der Schwellenwertparameter ist in Abbildung 5‐32 dargestellt. Dabei lassen sich je nach Signalintensität vier Bereiche unterteilen: Lebend, Apoptotisch, Spätapoptotisch und Tot. Beide Kontrollkulturen zeigen mit 98 % einen großen Anteil an lebenden Zellen. Die Streuung in andere Bereiche ist mit unter 1 % sehr gering.

Abbildung

Eine ÜbeTabelle gestiege

Tabelle 5-[%]

WeiterhCaspase Membra

A

g 5-32: Muse C

ersicht über5‐41 gegeb

ener Anteil an

40: Übersicht M

To

Rotenon

Malonat

Antimycin

Azid

Oligomycin

DNP

in ist unter3/7 Aktivitanintegrität

A

aspase 3/7 Pseu

r die prozenben. Bei einn apoptotisc

Muse Caspase 3

oxin

25 µM

12 µM

2 µM 20 mM

10 mM

1 mM 550 µM

270 µM

137 µM 10 mM

100 µM

1µM

n

8 µM

2 µM

0,8 µM 6,5 mM

1,3 mM

0,3 mM

r Einwirkungät zu verzeverloren ha

udocolour Plot d

tualen Verteer Einwirkdhen Zellen z

3/7 Assay nach

Casp. 3/7 [7-AAD [-

84,5

76,5

78,9 78,4

89

86 83,9

76,9

84,9 70,4

78,1

79,8 88,7

53,3

95,6 89,3

94,3

95,5

g von Roteeichnen, weben. 2,4‐Din

‐Seite 108‐

der CHO Kontr

eilungen derauer von 4u beobachte

4-stündiger Ein

[-] -]

Casp. 3/7-AAD

6,8

3,9

2,419

7,9

7,92

1,8

1,427,

20,

17,2,1

2,7

0,83,9

2,9

1,4

enon, Antimenngleich dnitrophenol

B

rollkulturen Bil

r einzelnen h ist bei en.

nwirkdauer. We

/7 [+] D [-]

Casp7-A

8

9

4 9

9

9

8

4 1

6

9 1

7

8 9

9

4

ycin und Odiese bei Zebewirkt nac

ld A: nach 4 h; B

Kulturen ist Malonat (20

erte aus Einzelm

p. 3/7 [+] AAD [+]

C7

8,5

18,8

18,2 2,4

2,5

5,9 13,1

20,3

12,9 2,5

1,2

2,4 8,6

40,5

3,3 6,5

2,5

2,8

Oligomycin (ellen auftritch 4‐stündig

ERGE

Bild B: nach 24

in Tabelle 50 mM) und

messungen, An

Casp. 3/7 [-] 7-AAD [+]

0,2

0,8

0,5 0,2

0,5

0,2 1

1

0,8 0

0,1

0 0,6

3,5

0,4 0,4

0,3

0,3

2 µM) eine tt, die berger Einwirkd

EBNISSE

4 h

5‐40 und Azid ein

gabe in

erhöhte eits ihre auer nur

ERGEBNISSE

‐Seite 109‐

einen geringen Anteil an apoptotischen/spätapoptotischen Zellen. Der Anteil an toten Zellen ist mit unter 1 % sehr niedrig.

Bei Verlängerung der Einwirkdauer zeigt sich besonders bei Azid, dass sich die apoptotischen Zellen zu spätapoptotischen Zellen verschoben haben. Unter Einwirkung von 2,4‐Dinitrophenol ist der Anteil an spätapoptotischen Zellen leicht gestiegen.

Tabelle 5-41: Übersicht Muse Caspase 3/7 Assay nach 24-stündiger Einwirkdauer. Werte aus Einzelmessungen, Angabe in %

Toxin Casp. 3/7 [-] 7-AAD [-]

Casp. 3/7 [+] 7-AAD [-]

Casp. 3/7 [+] 7-AAD [+]

Casp. 3/7 [-] 7-AAD [+]

Rotenon

25 µM 80,5 1,9 15,6 1,9

12 µM 94,1 0,8 4,3 0,8

2 µM 81,3 0,9 13,4 4,4

Malonat

20 mM 92,8 0,8 5,7 0,7

10 mM 90,5 3,5 5,4 0,6

1 mM 93,6 1,2 4,6 0,6

Antimycin

550 µM 69,5 1,9 23,6 5

270 µM 79,7 3,6 15,3 1,4

137 µM 84,8 1 11,9 2,3

Azid

10 mM 65 3,4 30,3 1,4

100 µM 84,9 1,7 12,3 1,1

1µM 87,9 2,4 9,2 0,4

Oligomycin

8 µM 89 1,9 8,3 0,8

2 µM 92,2 2,4 4,9 0,4

0,8 µM 90 2,7 6,4 0,9

DNP

6,5 mM 78,6 7,3 13 1,1

1,3 mM 93 1,2 5,5 0,3

0,3 mM 87,3 1,7 10,5 0,5

Bei 4‐stündiger Einwirkdauer lassen sich bei Antimycin und Oligomycin zwei Populationen ausmachen. Diese liegen im spätapoptotischen Bereich. Nach 24 h haben sich unter Einwirkung von Rotenon, Antimycin, Azid und 2,4‐Dinitrophenol spätapoptotische Populationen gebildet.

Muse MultiCaspase

Neben Effektorcaspasen spielen in der Apoptosekaskade auch Initiatorcaspasen eine wichtige Rolle. Durch Kombination des MultiCaspase und des Caspase 3/7 Assays können somit sehr frühe Stadien im programmierten Zelltod untersucht werden. Neben einem Caspase‐spezifischen Substrat wird 7‐AAD zur Differenzierung der Membranintegrität verwendet. Die Auswertung erfolgte nach 24 h im Muse Cell Analyzer. Als Referenz diente eine unbehandelte CHO Kultur (siehe Abbildung 5‐33).

Abbildung

In TabelCaspase In der behandezu sehen

Tabelle 5-[%]

Ro

M

An

Az

Ol

DN

5.3.2. I

Aus AbbZellen in

g 5-33: Muse M

le 5‐42 ist zAktivität hegraphischenelten Kulturen.

42: Übersicht M

Toxin

otenon

Malonat

ntimycin

zid

ligomycin

NP

nduktion de

bildung 5‐34 n DMEM/F‐1

Multicaspase Pse

zu erkennen,ervorrufen. Dn Darstellunen in Richtun

Muse Multicasp

M

25 µM 12 µM 2 µM

20 mM 10 mM 1 mM

550 µM 270 µM 137 µM 10 mM 100 µM

1µM 8 µM 2 µM

0,8 µM 6,5 mM 1,3 mM 0,3 mM

er ROS‐Bildu

ist der akut12 mit 10 %

eudocolour Plot

, dass ledigliDie Anzahl ang in Abbildng gesteiger

pase Assay nach

MultiCasp. [-]7-AAD [-]

78,7 92,3 87,2 93,4 92,7 94,2 86,6 91,4 94

80,7 91,9 91,4 89,9 93

92,7 85,7 88,9 91,4

ng durch Ku

e ToxizitätsvFKS und 4 m

‐Seite 110‐

t der CHO Kon

ich Rotenonn toten Zelledung 10‐83rte Caspase A

h 24-stündiger E

] MultiCas7-AAD

1,30,96,42,11,61,64,22,72,33,52,73

4,62,52,32,75,92,2

pfer

verlauf von KmM Glutam

ntrollkultur nach

(25 µM) unen ohne Akt(siehe AnhAktivität und

Einwirkdauer. W

p. [+] D [-]

Mul7-A

Kupferchloriin zu erkenn

h 24-stündiger E

nd Azid (10 mivität ist verhang) sind d erhöhte M

Werte aus Einz

tiCasp. [+] AAD [+]

19,7 6,6 6,2 4,4 5,7 4,1 9

5,8 3,5

15,5 5,5 5,6 5,5 4,4 5

11 5

5,8

d (als Dihydnen. Es wird

ERGE

Einwirkdauer

mM) eine gernachlässigbaVerschiebun

Membranperf

zelmessungen, A

MultiCasp. 7-AAD [+

0,3 0,2 0,2 0,1 0

0,1 0,2 0,1 0,2 0,2 0 0 0

0,1 0

0,5 0,2 0,6

rat) gegenübd ersichtlich,

EBNISSE

esteigerte ar gering. ngen der forierung

Angabe in

[-] +]

ber CHO‐, dass ab

ERGEBNISSE

‐Seite 111‐

einer Konzentration von 0,5 mM die gemessenen Absorptions‐Werte auf dem Level des ursprünglich eingesetzten Mediums ohne Zellen liegen. Die Absorption der 0,2 mM‐Kultur zeigt eine Absorption in der Größe des ZK I‐Kontrollwertes. Dieser indiziert den WST‐Umsatz der Zellen zum Zeitpunkt null. Mit weiter sinkender Toxin‐Konzentration steigt die Absorption der Proben bis zum Kontrollwert ZK II.

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Absorption=

450 nm [‐]

Konzentration CuCl2x2H

2O [mM]

TK Cu

M

ZK I

ZK II

Abbildung 5-34: Auftragung der gemessenen WST-Werte gegen die eingesetzten Konzentrationen von Kupferchlorid nach 24 h. Zusätzlich gekennzeichnet sind die mitgeführten Kontrollen: TK zeigt den Blindumsatz durch das Toxin, Cu die Absorption der höchsten Kupferkonzentration ohne WST, M den Blindumsatz durch Medium an. Die Zellkontrollen ZK indizieren den zellulären Umsatz nach 0 h (= ZK I) bzw. 24 h (=ZK II) Prozesszeit

In Abbildung 5‐35 A ist zu erkennen, dass die Kontrollkultur eine stetig zunehmende Ansäuerungsrate zeigt. So liegt der Anstieg im Bereich des 9‐fachen des Ursprungswertes. Die niedrigste Kupfergabe zeigt eine zu Beginn höhere Ansäuerungsrate, welche zunächst abnimmt und im nächsten Zeitabschnitt auf den ursprünglichen Wert ansteigt. Dennoch liegt hier bereits ein Faktor von Vier zwischen der Kontrolle und diesem Versuch. Dieser Trend setzt sich zunächst fort. Ab 2 mM Kupferchlorid ist zu erkennen, dass die Ansäuerungsrate ins Negative zeigt und dort mit über die Zeit abnehmender Tendenz verbleibt. Dem gegenüber ist in Abbildung 5‐35 B die OURges dieses Versuchs zu sehen. Die Kontrolle zeigt nach Versuchsansatz die höchste Zunahme der OURges. So wird nach 40 h das etwa 4‐fache des Ausgangswertes erreicht. Die mit unterschiedlichen Kupferkonzentrationen versetzten Kulturen zeigen zu Beginn eine vergleichbare OURges. Im Fall der Versuche mit 0,35 mM und 0,7 mM Kupferchlorid ist eine leichte Zunahme bzw. Konstanz der OURges zu beobachten. Über diese Konzentration hinaus fallen die Werte stetig ab und erreichen ein Minimum zum Ende des Versuchs.

Kontrolle 0,35 0,7 2 2,7 4,1 ‐1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

c H

+/t [pmol/l*h]


2O [mM]

A

Kontrolle 0,35 0,7 2 2,7 4,1 0

1

2

3

4

5

OUR [mmol/l*h]


2O [mM]

B

Abbildung 5-35: Darstellung der aus den SDR-Messungen abgeleiteten Größen: Bild links A: Ansäuerungsrate über die Konzentrationen und Zeitintervalle zwischen 5-12 h, 12-23 h, 23-40 h Bild rechts B: Sauerstoffaufnahmerate über die Konzentrationen und Zeitpunkte 5 h, 12 h, 23 h, 40 h

ERGEBNISSE

‐Seite 112‐

5.3.3. Induktion von Hypoxie

In diesem Kapitel sind die Ergebnisse zum Phänomen der Hypoxie dargestellt. Dabei sind zwei grundsätzliche Herangehensweisen getestet worden. Zum einen die chemische Induktion der Hypoxie durch Kobalt und zum anderen die Provokation einer Hypoxie bzw. Anoxie durch künstliches Übersteigern der PCD.

Kobaltchlorid Die Versuche mit Kobaltchlorid (als Hexahydrat) sind dem gleichen Vorgehen unterzogen worden. Daher findet sich in Abbildung 5‐36 erneut die Auftragung der umgesetzten WST‐Menge. Zu erkennen ist, dass die niedrigsten Konzentrationen noch im Bereich der Kontrolle ZK II liegen. Ab etwa 0,2 mM sinkt der Verlauf merklich. So wird bei 0,35 mM Kobaltchlorid das Niveau der Kontrolle ZK I unterschritten. Allerdings wird auch mit der höchsten eingesetzten Konzentration nicht der Blindwert des reinen Mediums erreicht.

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,80,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Absorption=

450 nm [‐]

Konzentration CoCl2x6H

2O [mM]

TK Co

M

ZK I

ZK II

Abbildung 5-36: Auftragung der gemessenen WST-Werte (CHO-Zellen) gegen die eingesetzten Konzentrationen von Kobaltchlorid nach 24 h. Zusätzlich gekennzeichnet sind die mitgeführten Kontrollen: TK zeigt den Blindumsatz durch das Toxin, Co die Absorption der höchsten Kobaltkonzentration ohne WST, M den Blindumsatz durch Medium an. Die Zellkontrollen ZK indizieren den zellulären Umsatz nach 0 h (= ZK I) bzw. 24 h (=ZK II) Prozesszeit

Interessant ist die Ansäuerungsrate, wie sie in Abbildung 5‐37 A zu sehen ist. Es zeigt sich eine Zunahme der Ansäuerung über die Prozesszeit. So nimmt diese im Falle der Kontrolle auf maximal 0,7 pmol/h zu. Bereits die niedrigsten Kobaltchlorid‐Konzentrationen übertreffen diese ACR um den Faktor 2. Ab einer Konzentration von 0,37 mM Kobaltchlorid sinkt diese Ansäuerungsrate erneut. So liegt der Wert im letzten Intervall bereits wieder unter der Kontrolle. Dies trifft jedoch nicht für die ersten beiden Intervalle zu. Hier ist die Ansäuerungsrate größer als das Pendant der Kontrolle. Für die beiden höchsten Konzentrationen ist zu bemerken, dass die ACRges zu Beginn negativ ist und im weiteren Verlauf schwach ins Positive steigt. Betrachtet man nun die OURges dieser Zellen wie in Abbildung 5‐37 B dargestellt, so zeigt sich zu Beginn innerhalb der ersten 5 h kaum ein Unterschied. Die OURges liegt bei allen Kulturen in einem Bereich von etwa 1,5‐2 mmol/l·h. Über diese Zeit hinaus ist zu beobachten, dass die OURges bzw. die Zunahme der OURges mit der Kobalt‐Konzentration korreliert. Keine der Kulturen erreicht in der Folge den Verbrauchswert der Kontrolle nach 23 h bzw. 40 h. Kann für die Versuche mit 0,04 mM bzw. 0,14 mM noch eine Zunahme der OURges nach 24 h beobachtet werden, so sinkt diese für Kulturen ab 0,37 mM Kobaltchlorid stetig.

ERGEBNISSE

‐Seite 113‐

Kontrolle 0,04 0,14 0,37 0,7 0,9

‐0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6c

H+/t [pmol/l*h]

Konzentration CoCl2 [mM]

A

Kontrolle 0,04 0,14 0,37 0,7 0,90,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

OUR [mmol/l*h]

Konzentration CoCl2x6H

2O [mM]

B

Abbildung 5-37: Darstellung der aus den SDR-Messungen abgeleiteten Größen: Bild links A: Ansäuerungsrate über die Konzentrationen und Zeitintervalle zwischen 5-10 h, 10-24 h, 24-46 h Bild rechts B: Sauerstoffaufnahmerate über die Konzentrationen und Zeitpunkte 5 h, 10 h , 24 h, 46 h

Zelldichte Zur Gegenüberstellung des vermeintlich unterschiedlichen Verhaltens von Zelllinien zu primären Zellen unter Hypoxie, sind CHO und PAC jeweils in verschiedenen Zelldichten über drei Zehnerpotenzen in SDR‐Platten ausgesät und inkubiert worden. Die resultierenden Daten in ACRges (Intervall zur Berechnung 1 h) und OURges umgerechnet worden und als Funktion der Prozesszeit in Abbildung 5‐38 A und B bzw. Abbildung 5‐39 A und B dargestellt.

Abbildung 5-38: Darstellung des Zelldichteversuchs mit CHO-Zellen. Zu sehen sind in Bild A und Bild B die ACR und OUR über die Prozesszeit sowie in C die Auftragung der zellbezogenen Werte gegeneinander mit der Prozesszeit als Datenbeschriftung. Hierbei bedeuten die Symbole eine Zelldichte von: : 3,8 ∙ 10 Zellen/ml; 3,8 ∙ 10 Zellen/ml; 3,8 ∙ 10 Zellen/ml

0 10 20 30 40 50

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

cH

+/t [µmol/l x h]

Prozesszeit [h]

A

0 10 20 30 40 500

5

10

OURges [mmol/l x h]

Prozesszeit [h]

B

ERGEBNISSE

‐Seite 114‐

Betrachtet man zunächst die CHO‐Zellen so fällt auf, dass ein starker Zusammenhang zwischen Zelldichte und Ansäuerungverhalten bzw. OURges besteht. Je mehr Zellen vorhanden sind, desto höher fallen diese aus. Für die höchste Zelldichte zeigt die ACRges ein Maximum nach 10 h, welches bis zum Ende des Versuchs gegen Null geht. Die OURges dieser Kultur ist meist maximal und sinkt erst nach 45 h leicht. Die ACRges der nächsten niedriger konzentrierten Kultur ist vergleichsweise gering. Dafür ist eine Zunahme der Sauerstoffaufnahmerate über die Zeit zu bemerken. Dieses Verhalten setzt sich für die niedrigste Zelldichte fort.

PAC‐Zellen – dargestellt in Abbildung 5‐39 ‐ sind im Vergleich dazu unauffällig. Die ACRges zeigt für alle drei Konzentrationen die gleiche Größenordnung und den gleichen Verlauf. Die unterschiede der OURges sind ebenfalls relativ gering. Die zeitliche Tendenz zeigt eher einen Rückgang Selbiger.

Abbildung 5-39: Darstellung des Zelldichteversuchs mit PAC-Zellen. Zu sehen sind in Bild A und Bild B die ACR und OUR über die Prozesszeit sowie in C die Auftragung der zellbezogenen Werte gegeneinander mit der Prozesszeit als Datenbeschriftung. Hierbei bedeuten die Symbole eine Zelldichte von: :5,6 ∙ 10 Zellen/ml; 5,6 ∙ 10 Zellen/ml; 5,6 ∙ 10 Zellen/ml

5.3.4. Störung der Calcium‐Homöostase durch Ionomycin

Die Versuche mit Ionomycin sind sowohl mit CHO als auch L929 Zellen durchgeführt worden. Neben der bisherigen Messung via WST‐8 und SDR werden in diesem Versuch erneut durchflusszytometrische Methoden angewandt.

0 10 20 30 40 50

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

c H

+/t [µmol/l x h]

Prozesszeit [h]

A

0 10 20 30 40 500

5

10

OURges [mmol/l x h]

Prozesszeit [h]

B

ERGEBNISSE

‐Seite 115‐

L929 Diese Versuchsauswertung bezieht sich auf den Versuch mit der Zelllinie L929 und ist daher nicht direkt mit den zwei vorhergehenden Versuchen zu vergleichen. Die WST‐Auswertung zeigt den bereits bekannten Verlauf. Allerdings ist in diesem Fall auffällig, dass geringe Konzentrationen einen höheren Absorptionswert zeigen, wie die Kontrolle ZK II. Weiterhin fällt auf, dass die geringste Konzentration einen Signalunterschied gegenüber ZKI von ca. 13 % erzeugt. Mit fortschreitender Konzentrationszunahme wird nach und nach der Wert der ZK II und ZK I sowie auch der Medienkontrollen erreicht.

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

Absorption=

450 nm [‐]

Konzentration Ionomycin [µM]

TK Ionomycin

M

ZK I

ZK II

Abbildung 5-40: Auftragung der für L929 gemessenen WST-Werte gegen die eingesetzten Konzentrationen von Ionomycin nach 24 h. Zusätzlich gekennzeichnet sind die mitgeführten Kontrollen: TK zeigt den Blindumsatz durch das Toxin, Ionomycin die Absorption der höchsten Toxinkonzentration ohne WST und M den Blindumsatz durch Medium an. Die Zellkontrollen ZK indizieren den zellulären Umsatz nach 0 h (= ZK I) bzw. 24 h (=ZK II) Prozesszeit

Betrachtet man mit dieser Kenntnis das ACR‐Diagramm in Abbildung 5‐41 A, so fällt auf, dass sich das Ansäuerungsverhalten der Kontrolle und der niedrigsten Ionomycin‐Konzentration annähernd gleich ist. Mit Zunahme der Konzentration ändert sich dieses Bild, sodass dieser Wert bereits bei einer Konzentration von 0,2 mM um etwa 55 % niedriger liegt. Mit weiterer Steigerung der Konzentration nimmt die ACR weiter ab und wird im mittleren Intervall negativ. Die in Abbildung 5‐41 B dargestellte OUR verhält sich im Vergleich zu den vorherigen CHO Versuchen abweichend. So ist in diesem Fall eine deutliche Steigerung der OUR über die Zeit zu erkennen. Der Maximalwert wird hier stets gegen Ende des Versuchs gemessen. Eine weitere Auffälligkeit ist, dass die Konzentrationen mit 0,1 µM und 0,2 µM Ionomycin sich im Grunde sehr ähnlich sehen. Der Unterschied besteht hier in den ersten zwei Messzeitpunkten der geringsten Ionomycin‐Konzentration, wo eine erhöhte OUR erkennbar ist. Wird die Konzentration des Ionomycin um eine Zehnerpotenz erhöht, so zeigt sich eine deutliche Abnahme der maximalen OUR, welche jedoch immer noch zum Ende des Versuchs erreicht wird.

ERGEBNISSE

‐Seite 116‐

Kontrolle 0,1 0,2 2 5 10 ‐1,0

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0c

H+/t [pmol/l*h]


A

Kontrolle 0,1 0,2 2 5 100,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

OUR [mmol/l*h]


B

Abbildung 5-41: Darstellung der aus den SDR-Messungen abgeleitete Größen für L929: Bild links A: Ansäuerungsrate über die Konzentrationen und Zeitintervalle zwischen 5-12 h, 12-23 h, 23-44 h Bild rechts B: Sauerstoffaufnahmerate über die Konzentrationen und Zeitpunkte 5 h, 12 h , 23 h, 44 h

CHO Der identische Versuch ist neben L929‐Zellen ebenfalls mit CHO‐Zellen durchgeführt worden. In Abbildung 5‐42 ist der WST‐Verlauf dargestellt. Prinzipiell verhält sich dieser ähnlich zu jenem der L929 Zellen. Es fällt jedoch auf, dass das Übersteigen der Kontrolle ZK II mit etwa 25 % deutlich ausfällt. Innerhalb dieses Versuches zeigt die Sauerstoffaufnahmerate der Konzentrationen 0,1 µM und 0,2 µM eine ähnliche Zunahme wie jene der Kontrolle. Wird die Konzentration um eine Zehnerpotenz erhöht, zeigt sich eine deutlich verminderte OUR, welche jedoch immer noch eine leicht steigende Tendenz aufweist. Die Messung der ACR liegt für diesen Versuch nicht auswertbar vor.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 110,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

Absorption=

450 nm [‐]


TK Ionomycin

M

ZK I

ZK II

Abbildung 5-42: Auftragung der für CHO gemessenen WST-Werte gegen die eingesetzten Konzentrationen von Ionomycin nach 24 h. Zusätzlich gekennzeichnet sind die mitgeführten Kontrollen: TK zeigt den Blindumsatz durch das Toxin, Ionomycin die Absorption der höchsten Toxinkonzentration ohne WST und M den Blindumsatz durch Medium an. Die Zellkontrollen ZK indizieren den zellulären Umsatz nach 0 h (= ZK I) bzw. 24 h (=ZK II) Prozesszeit

ERGEBNISSE

‐Seite 117‐

Abbildung 5-43: Darstellung der aus den SDR-Messungen abgeleitete Größen für CHO: Sauerstoffaufnahmerate über die Konzentrationen und Zeitpunkte 5 h, 12 h , 23 h, 44 h

Durchflusszytometrische Analyse Zur weiteren Aufklärung des Phänomens sind diese Kulturen mit PJ und YO‐PRO®‐1 gefärbt und durchflusszytometrisch vermessen worden. Die Populationen sind ausgehend von der vitalen Kultur eingeteilt worden (Population „vital“). Dabei entspricht eine alleinige Zunahme der grünen Fluoreszenz der Population „früh‐apoptotisch“, eine gleichzeitig rot‐grüne Zunahme der Population „spät‐apoptotisch“ und die alleinige Zunahme im roten Kanal der Population „nekrotisch“. Die resultierenden Daten sind Tabelle 5‐43 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass mit steigender Ionomycin‐Konzentration zunächst der Anteil der apoptotischen Zellen zunimmt ohne, dass die nekrotische Population einen Zuwachs erfährt. Mit maximaler Ionomycin Konzentration verschiebt sich der maximale Anteil der Zellen in die nekrotische Fraktion. Weiterhin ist zu erkennen, dass es gerade innerhalb der Kontrolle große Unterschiede zwischen CHO und L929 gibt. Denn auch die Kontrolle der CHO‐Zellen zeigt eine deutliche früh‐ und auch spät‐apoptotische Fraktion. Diese ist bei L929 nicht zu erkennen.

Tabelle 5-43: Ergebnis der Populationsanalyse von CHO- und L929-Zellen

CHO Konzentration

Population in % Kontrolle 0,5 µM 5 µM „vital“ 57,2 38,7 21,6 „früh-apoptotisch“ 19,9 29,7 13,7 „spät-apoptotisch“ 10,0 18,4 5,1 „nekrotisch“ 6,6 6,0 53,4

L929 Konzentration

Population in % Kontrolle 0,5 µM 5 µM „vital“ 89,7 62,5 10,4 „früh-apoptotisch“ 0,9 1,5 0,3 „spät-apoptotisch“ 0,8 5,7 4,3 „nekrotisch“ 3,6 3,9 75,9

5.3.5. Induktion von Stoffwechselwegen

Durch die Kombination von Medienvarianten mit Wirkstoffgaben soll der Einfluss auf die jeweiligen Stoffwechselwege dargestellt werden. Hierfür ist vor allem der SDR als Basis‐System herangezogen

Kontrolle 0,1 0,2 2 5 100,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

OUR [mmol/l*h]


ERGEBNISSE

‐Seite 118‐

worden. Als Wirkstoff wird Oligomycin in Konzentrationen im Bereich der LC50 aus vorherigen Versuchen eingesetzt. Die Wirkung dessen wird im weiteren Kontext mit der ATP‐Messung und LC/MS‐Methode untersucht.

Sauerstoffverbrauch in Mangelmedien Zur detaillierteren Darstellung der Stoffwechsellagen unter nährstofflimitierten Bedingungen, wie sie innerhalb der Medienvariation oder Toxizitäts‐Versuche auftreten können, sind einzelne Experimente in speziell dafür angesetzten Medien durchgeführt worden. In Abbildung 5‐44 A und B ist jeweils die Sauerstoffaufnahmerate der gesamten Kultur in einer Medienvariante einmal mit und einmal ohne Oligomycin‐Gabe dargestellt. Es ist zu erkennen, dass in Abbildung 5‐44 A, welche das Mangelmedium ohne C‐Quelle darstellt, quasi kein Unterschied auszumachen ist. Beide Linien verlaufen konstant über die Versuchszeit. In Abbildung 5‐44 B ist ein Unterschied wahrnehmbar. Beginnend von geringen Ausgangswerten steigen die beiden Verläufe unterschiedlich stark an. Der Kurvenverlauf nimmt in der Folge über die gesamte Dauer linear zu, wohingegen die mit Oligomycin versetzte Kultur auf ein deutlich niedrigeres Niveau zurückfällt und dort verweilt.

Abbildung 5-44: Verläufe der absoluten Sauerstoffaufnahmerate von CHO über 24 h in verschiedenen Medienvarianten Bild A links: DMEM-Mangelmedium ohne C-Quelle ohne Oligomycin: und mit Oligomycin: Bild B rechts: DMEM/F-12-Vollmedium mit Pyruvat, Glucose sowie Glutamin ohne Oligomycin: und mit Oligomycin:

In Abbildung 5‐45 A ist das Mangelmedium mit Laktat und Glutamin versehen worden. Es zeigt sich ein geringer Unterschied zwischen den gehemmten und ungehemmten Kulturen. Beiden gleich ist, dass kein nennenswerter Anstieg über die Zeit zu erkennen ist. Wird dem Mangel‐Medium statt Laktat Pyruvat und Glutamin zugesetzt, so spricht das Sauerstoffsignal, wie in Abbildung 5‐45 B zu sehen, deutlicher an. Es resultiert ein Anstieg der Oligomycin‐freien Variante, der in der Folge auf einem konstanten Niveau verbleibt. Die gehemmte Kultur sinkt rasch auf ein minimales Niveau und verbleibt dort.

0 5 10 15 20 250,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

OUR [mmol/l x h]

Prozesszeit [h]

A

0 5 10 15 20 250,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5OUR [mmol/l x h]

Prozesszeit [h]

B

ERGEBNISSE

‐Seite 119‐

Abbildung 5-45: Verläufe der absoluten Sauerstoffaufnahmerate von CHO über 24 h in verschiedenen Medienvarianten Bild A links: DMEM-Mangelmedium mit zusätzlichem Lactat sowie Glutamin ohne Oligomycin: und mit Oligomycin: Bild B rechts: DMEM-Mangelmedium mit zusätzlichem Pyruvat sowie Glutamin ohne Oligomycin: und mit Oligomycin:

Wird das Mangel‐Medium ausschließlich mit Laktat supplementiert, so zeigt sich der Verlauf wie in Abbildung 5‐46 A dargestellt. Es ist zwischen gehemmter und ungehemmter Kultur eine deutliche Differenz erkennbar. Beiden gemein ist, dass diese über die Kulturdauer nicht steigt, sondern eine abnehmende Tendenz aufweist. Entzieht man dem Vollmedium Glutamin so erhält man die in Abbildung 5‐46 B gezeigten Daten. Die Hemmung ist erneut erfolgreich und führt zu dem bereits erläuterten konstanten Verlauf. Die nicht gehemmte Kultur liegt davon deutlich abgesetzt und zeigt über die Zeit eine Zunahme.

Abbildung 5-46: Verläufe der absoluten Sauerstoffaufnahmerate von CHO über 24 h in verschiedenen Medienvarianten Bild A links: DMEM- Mangelmedium mit Laktat, ohne Glutamin, ohne Oligomycin: und mit Oligomycin: Bild B rechts: DMEM/F-12-Vollmedium mit Pyruvat, Glucose, ohne Glutamin sowie ohne Oligomycin: und mit Oligomycin:

Wird die Glucose‐Konzentration in den entsprechenden Medien nach Ablauf des Versuchs bestimmt,

so zeigt sich, dass der Verbrauch im Vollmedium mit Glutamin um den Faktor 2 größer ist als in allen

anderen Varianten (Werte siehe Tabelle 5‐44).

0 5 10 15 20 250,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5OUR [mmol/l x h]

Prozesszeit [h]

A

0 5 10 15 20 250,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

OUR [mmol/l x h]

Prozesszeit [h]

B

0 5 10 15 20 250,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

OUR [mmol/l x h]

Prozesszeit [h]

A

0 5 10 15 20 250,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

OUR [mmol/l x h]

Prozesszeit [h]

B

ERGEBNISSE

‐Seite 120‐

Tabelle 5-44: Vergleich des absoluten Glucose-Verbrauchs innerhalb stoffwechselinhibierter CHO-Zellen

Varianten DMEM/F-12 Glutamin +Oligomycin +

Glutamin + Oligomycin -

Glutamin - Oligomycin +

Glutamin - Oligomycin -

Glucose-Verbrauch [g/l] 0,52 1,10 0,47 0,50

Untersuchung eines Oligomycin‐Toxizitäts‐Test auf Hypoxie‐Marker Bisherige Versuche zeigen die Reaktion auf Toxine über größere Zeiträume. Innerhalb dieser Versuchsreihe ist ein Toxizitäts‐Test mit Oligomycin zeitnah ausgewertet worden. Da Proben für die LC/ESI‐MS Methode generiert worden sind und dazu eine entsprechende Zellzahl erforderlich ist,

wird der Versuch mit 8·105 Zellen/ml (statt 1·105 Zellen/ml) angesetzt. In Abbildung 5‐47 sind prozessierten SDR‐Daten aufgetragen. Hierbei gilt für die Berechnung der Ansäuerungsrate erneut ein Intervall von 1 h. Die Sauerstoffaufnahmerate sinkt innerhalb der ersten Stunde um 30 %, verweilt auf diesem Niveau über etwa 15 h und steigt danach erneut an, bis ein lokales Maximum bei 20 h erreicht wird. Die ACRZelle beginnt zunächst negativ, steigt in der Folge rasch ins Positive und verweilt auf einem niedrigen Niveau bis etwa 15 h. Danach ist eine Zunahme um den Faktor 2‐3 zu erkennen, bevor die Kurve erneut abfällt.

Abbildung 5-47: Darstellung der OURZelle (Bild A links) und ACRZelle (Bild B rechts) über die Prozesszeit

In Tabelle 5‐45 ist die Glucose‐Konzentration zu ausgewählten Zeitpunkten gezeigt. Es wird deutlich, dass nach 24 h etwa ein Drittel verbraucht ist. Ferner ist anzumerken, dass kein merklicher Unterschied zwischen der Oligomycin versetzten und Kontroll‐Kultur zu bemerken ist.

Tabelle 5-45: Gemessene Glucose-Konzentration

Zeit 0h 6h 20h 24h 24 h Kontrolle Glucose-Konzentration [g/l] 2,9 2,8 2,0 1,9 2,0

Wie bereits erwähnt, ist dieser Versuch ebenfalls über das LC/ESI‐MS ausgewertet worden. Gemäß der Methodenentwicklung ergeben sich für die eingesetzten Analyten die in Tabelle 5‐46 aufgezeigten Nachweisgrenzen (LOD). Die höchste Sensitivität besteht demnach für HX, Asc, UA und Cr. Sehr spät zeigen sich Pyr und Lac.

0 20 400,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

qO

2

[pmol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A

0 20 40

-2,0

-1,0

0,0

1,0

2,0

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B

ERGEBNISSE

‐Seite 121‐

Tabelle 5-46: Nachweisgrenzen der Analyten im MS

Nachweisgrenzen

Pyr 2,5mM

MDA 0,478 µg/ml

HX 0,05mM

Lac 2,5mM

X 0,1mM

Asc 0,05mM

UA 0,05mM

Cr 0,05mM

GSH 0,1mM

CrP 2,5mM

GSSG 0,666mM

Sowohl Zellpellet als auch der zugehörige Medienüberstand sind nach diesen Parametern vermessen worden. Die Rohdaten‐Auftragung ist in Abbildung 5‐48 A und Abbildung 5‐49 A dargestellt. Für die Messung des Zellpellets zeigt sich, dass ausschließlich die Analyten HX, Lac, UA, Cr, X nachweisbar sind. In Abbildung 5‐48 B sind die Werte auf die Kontrolle nach 24 h bezogen dargestellt. Es fällt auf, dass HX zunächst fällt, jedoch noch 24 h mit der Kontrolle gleich auf liegt. Lac ist erst nach 3 h messbar und steigt in der Folge nur langsam. Nach 20 h ist eine Vervielfachung festzustellen, welche die Kontrolle um den Faktor 2,5 übertrifft. Nach weiteren 4 h geht dieser Wert auf das Niveau der Kontrolle zurück. In ähnlicher Weise verhält sich die Harnsäure (UA). Zunächst ein moderater Anstieg, dann rasant mit einem absoluten Maximum zu 20 h. Auch dieser Wert fällt in den folgenden 24 h ab. Dennoch übertrifft er die Kontrolle um den Faktor 2. Creatin zeigt bezogen auf die Kontrolle ein absolutes Maximum zu Beginn. In der Folge sinkt der Messwert leicht, sodass zu 20 h ist kein Creatin nachweisbar ist. Dies ändert sich nach weiteren 4 h. Hier ist ein geringer Cr‐Peak zu erkennen. Xanthin (X) ist über die gesamte Zeit nicht nachweisbar. Die einzige Ausnahme bildet hierbei die Probe zu 20 h.

ERGEBNISSE

‐Seite 122‐

Abbildung 5-48: Bild A Auftragung der gemittelten, gemessenen Peak Flächen über die Zeit einer mit Oligomycin versetzten Kultur und einer Kontrolle. Gezeigt ist das Messergebnis der Zellpellets. Bild B Auf die Kontrolle normierte Darstellung. Die gemessenen Analyten sind: HX, ,Lac UA Cr, X

Wird der Überstand mit der gleichen Methode vermessen, so finden sich gemäß Abbildung 5‐49 weitere Analyten. Neben den bisher Genannten ist nun ebenfalls Asc nachweisbar. Für Lac deutet sich ein zweiter, kleinerer Peak an, der der Vollständigkeit halber mit aufgeführt wird. Die Messung von HX zeigt eine rasche Zunahme und das Verweilen auf gegenüber der Kontrolle erhöhtem Niveau. Lac 1 zeigt zu Beginn ein Maximum. In der Folge jedoch steigt nach anfänglichem Absacken dieser Wert zusammen mit Lac 2 auf ein Maximum nach 24 h. Die Kontrolle wird von beiden Fraktionen übertroffen, wobei es sich im Falle von Lac 1 mit ca. 50 % deutlicher ausprägt. Die Harnsäure (UA) durchläuft bereits nach 3 h das Maximum. Im weiteren Verlauf sinkt der Wert und liegt am Ende unterhalb der Kontrolle. Cr ist über den Verlauf relativ konstant und liegt schlussendlich mit der Kontrolle gleich auf. Auffallend ist, dass es im ersten Lauf nicht zu detektieren gewesen ist. Asc durchläuft ebenfalls früh ein Maximum und zeigt in der Folge eine leicht abnehmende Tendenz. Schlussendlich liegt es innerhalb des Oligomycin‐Versuchs nach 24 h bei etwa 25 % der Kontrolle.

0 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 20 h 24 h Kontrolle

24 h

0,0

2,5

5,0

x103 Skalenteile [‐]

Prozesszeit [h]

A

0 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 20 h 24 h Kontrolle

24 h

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

Relative Anteile

Prozesszeit [h]

B

ERGEBNISSE

‐Seite 123‐

Abbildung 5-49: Bild A Auftragung der gemittelten, gemessenen Peak Flächen über die Zeit einer mit Oligomycin versetzten Kultur und einer Kontrolle. Gezeigt ist das Messergebnis des Kulturüberstands. Bild B Auf die Kontrolle normierte Darstellung. Die gemessenen Analyten sind: HX, ,Lac 1 Lac 2 ,UA Cr, X, Asc

Bestimmung des ATP‐Levels in Mangelsituationen Zur Untersuchung, welche eine kurzfristige Auswirkung Oligomycin auf die ATP‐Bildung der Zelle hat, sind Versuche über die Zeit mit dem Luciferase‐Assay durchgeführt worden. Die Kulturen sind mit der gleichen Startzellzahl zum gleichen Zeitpunkt ausgesät worden. Daher erfolgt die Auftragung als Gesamt‐ATP. In Abbildung 5‐50 ist zu erkennen, dass der ATP‐Wert des Versuchs in DMEM mit Laktat und Oligomycin minimale Werte annimmt. Das Vollmedium DMEM/F‐12 (Glucose) erreicht die höchsten Messwerte und Standardabweichungen. Die Variante in DMEM und Laktat zeigt eine im Mittel um etwa 20 % geringere Lumineszenz. Dem folgt das mit Oligomycin versetze DMEM/F‐12, welches einen um etwa 70 % geringeren Wert gegenüber dem ungehemmten Vollmedium erreicht.

0 h 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 20 h 24 h Kontrolle

24 h

0102030405060708090

100110120130140

x103 Skalenteile [‐]

Prozesszeit [h]

A

0 h 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h 20 h 24 h Kontrolle

24 h

0,0

1,0

2,0

Relative Anteile

Prozesszeit [h]

B

ERGEBNISSE

‐Seite 124‐

DMEM/F‐12 DMEM +

Laktat

DMEM/F‐12 +

Oligomycin

DMEM +

Laktat +

Oligomycin

0

500

1000

1500

2000

2500

ATP‐Gehalt [nM]

Abbildung 5-50: ATP-Gehalte aufgeschlossener CHO-Zellen nach Inkubation in verschiedenen Medien. Werte über mehrere Messungen (3 h) gemittelt

5.4. Datenerhebung aus Mikroskop‐Bildern

Viele HCS‐Verfahren setzen auf mikroskopische Techniken. Diese lassen sich für diese Arbeit in fluoreszenz‐mikroskopische und durchlichtmikroskopische Techniken unterschieden. Je nach eingesetztem Farbstoff ist das Live‐Cell‐Imaging realisierbar. Eine Herausforderung ist die objektive Interpretation von ungefärbten Bildern.

5.4.1. Fluoreszenzmarkiertes Imaging

Durch eine Auswahl verschiedener Fluorochrome kann eine sehr hohe Zahl an Parametern über das Farb‐Feedback erhoben werden. Allerdings erlauben nicht alle Farbstoffe die Inkubation über lange Zeit, da sie entweder instabil oder invasiv sind.

Live Cell Imaging Im Zuge dieser Arbeit hat die Möglichkeit bestanden, eine automatisierte Langzeitaufnahme an einem Fluoreszenzmikroskop mit angeschlossener Klimakammer durchzuführen. Dabei können über die Inkubationszeit mehrere Informationen gewonnen werden. In Abbildung 5‐51 ist eine Suspensionszelle (in diesem Fall Sf21 – für spätere Versuche mit anderen Zelllinien ergab sich keine Möglichkeit) zu sehen, welche über die Zeit im Live‐Cell‐Mikroskop beobachtet worden ist. Innerhalb des entstanden Bildmaterials, ist eine gewisse Motilität der Zelle zu erkennen. Diese nimmt über die Zeit deutlich ab. Mit dieser Abnahme ist eine Auswölbung der Membran zuerkennen, wie sie in Abbildung 5‐51 durch Pfeile gekennzeichnet wird. Dieser Prozess setzt sich fort, bis schlussendlich ein rotes Fluoreszenzsignal des PJ erkennbar ist.

Abbildung 5-51: Entnahme von Einzelbildern aus einem Kulturlauf mit Suspensionszellen, die mit PJ supplementiert worden sind. Zu erkennen ist die Änderung der Morphologie mit verzögertem Eintritt von PJ.

ERGEBNISSE

‐Seite 125‐

Manuelle Fluoreszenzmikroskopie Als Alternative zum Live‐Cell‐Imaging ist ein Versuchsaufbau gewählt worden, bei dem Aufnahmen gefärbter Kulturen nach 4 h und 24 h auf einem Nikon TE2000‐U Fluoreszenzmikroskop ohne Klimakammer erfolgt sind. Die Kulturen sind im Inkubator bebrütet und lediglich zur Mikroskopie entnommen worden. Abbildung 5‐52 zeigt exemplarische Färbeergebnisse der verwendeten DNA‐Fluorochrome Hoechst 33342, YO‐PRO®‐1 und PJ. Diese Bilder können mit dem Phasenkonstrastbild überlagert werden. Die gesamte intakte DNA wird durch Hoechst 33342 gefärbt, was es somit ungeeignet für die Dauermikroskopie macht. Unterschiede zeigen sich in der grünen und roten Fluoreszenz. Es gibt Zellen, deren DNA zwar durch YO‐PRO®‐1, aber nicht durch PJ gefärbt worden ist. Der entgegengesetzte Fall tritt ebenso in Erscheinung. Auch ist eine diffuse grüne Färbung zu erkennen, die nicht rot und schwach blau angefärbt wird. Im blauen Kanal ist ein Fragmentierungsmuster der DNA zu erkennen, welches sich deutlich im grünen Kanal wiederfindet, jedoch kaum im Roten. Die Überlagerung mit dem Phasenkontrastbild zeigt die Lokalisierung der Färbung im Zellkern. Teilweise ist ebenso eine grüne Fluoreszenz im Zytosol bzw. extrazellulären Raum zu erkennen.

Abbildung 5-52: Exemplarische Darstellung von Fluoreszenzfärbungen, die mit Phasenkontrastbildern überlagert werden. Reihen: A Hoechst 33342, B YO-PRO®-1, C PJ, D RGB, E Phasenkontrast, F: Merge

Die Bildaufnahme zur Auswertung ist an drei verschiedenen Positionen erfolgt, um die unregelmäßige Verteilung der Zellen durch einen Mittelwert mit Standardabweichung zu erfassen. Eine Bildaufnahme besteht aus einem Phasenkontrastbild, sowie aus zwei Fluoreszenzaufnahmen bei 200‐facher Vergrößerung. Die Färbung der Kulturen ist mit dem Vitalitätsmarker PJ und YO‐PRO®‐1 erfolgt. Um die Vergleichbarkeit der Farbintensitäten zu gewährleisten ist für jeden Farbstoff eine feste Belichtungszeit gewählt worden. Die Bildfläche kann über das Pixel‐zu‐Mikrometer Verhältnis berechnet werden. Dieses liegt in diesem Fall bei 0,24. Damit entspricht eine Aufnahme bei 200‐facher Vergrößerung einer Fläche von 0,012 cm2.

In Abbildung 5‐53 sind Ergebnisse dieser Aufnahmen dargestellt. Die Bestimmung der Zellzahlen ist per Hand über die Software ImageJ erfolgt [Schindelin et al. 2012]. Für die Bestimmung der GZZ sind die Phasenkontrastaufnahmen verwendet worden. Die Fluoreszenzaufnahmen sind über ein Macro in die jeweiligen Farbkanäle getrennt worden.

ERGEBNISSE

‐Seite 126‐

Abbildung 5-53: Mikroskopische Färbungen von CHO Zellen mit PJ und YO-PRO®-1 nach 4- und 24-stündiger Einwirkdauer

Durch Zugabe von Antimycin A zeigt sich mit über 50 % der größte Anteil von sowohl PJ als auch YP positiv gefärbten Zellen. Die restlichen Toxine liegen im Bereich von 1 %. Lediglich Rotenon besitzt nach 4‐stündiger Einwirkdauer mit 2,6 % (YP) bzw. 1,5 % (PJ) einen leicht erhöhten Anteil. Grundsätzlich sinkt bei allen Toxinen die Gesamtzellzahl in der Zeitspanne von 4 bis 24 h. Lediglich die Kontrollkultur wächst von 22.000 GZZ/cm2 auf 28.000 GZZ/cm2. Bei Betrachtung der Morphologie ist unter Einwirkung von Antimycin A zu erkennen, das YP positive Zellen eine deutliche Vesikelbildung zeigen. Hier ist bei etwa 50 % der Zellen eine Morphologieänderung zu beobachten. Dieser Anteil ist unter Einwirkung von Rotenon wesentlich geringer. Hier weisen die meisten Zellen noch die typische Struktur bei adhärentem Wachstum auf. Dabei ist zu beobachten, dass lediglich sphärische Zellen eine positive Färbung auf YP zeigen.

4 h

Azid 0,1 M

Malonat 0,02 M

DNP 6,52 mM

Antimycin 55 µM

Oligomycin 1 µM

Rotenon 5 µM

Kontrolle

positiv gefärbt [%

]

0

1

2

3

4

540

50

60

24 h

Azid 0,1 M

Malonat 0,02 M

DNP 6,52 mM

Antimycin 55 µM

Oligomycin 1 µM

Rotenon 5 µM

Kontrolle

0

1

2

3

4

540

50

60

PJ

YP

4 h

Azid 0,1 M

Malonat 0,02 M

DNP 6,52 mM

Antimycin 55 µM

Oligomycin 1 µM

Rotenon 5 µM

Kontrolle

GZZ/cm2

5,0x103

104

1,5x104

2,0x104

2,5x104

3,0x104

3,5x104

24 h

Azid 0,1 M

Malonat 0,02 M

DNP 6,52 mM

Antimycin 55 µM

Oligomycin 1 µM

Rotenon 5 µM

Kontrolle

5,0x103

104

1,5x104

2,0x104

2,5x104

3,0x104

3,5x104

GZZ

ERGEBNISSE

‐Seite 127‐

5.4.2. Parametrisierung ungefärbter Einzelbildaufnahmen

Innerhalb eines Wachstumsverlaufs können auch ohne Live‐Cell‐Imaging hohe Datenmengen anfallen. Deren Auswertung oder Darstellung erfolgt meist direkt als Bild mit subjektiver Beschreibung. Die Darstellung langer Bild‐Sequenzen ist gerade für die Darstellung in gedruckten Medien unvorteilhaft. Hieraus geht die Idee hervor, diese Bilddaten in reproduzierbare Parameter zu übersetzen und final als einfachen Zahlenwert darzustellen.

Parameterauswahl Um aus den gespeicherten Phasenkontrastbildern Informationen entnehmen zu können, müssen diese mangels Automatisierung manuell segmentiert werden. Dadurch wird ein geschlossener Kurvenzug erhalten, welcher durch die verwendete Software „ImageJ“ ausgewertet werden kann. Dies führt zu dem Ergebnis der Zellfläche, dem Feret‐Durchmesser, den Formdeskriptoren sowie den Flächenschwerpunkt‐Koordinaten. Diese können dann entweder direkt für die Morphologie‐Bestimmung und die Längen‐Charakteristik verwendet werden.

Morphologische Beurteilung

Abbildung 5-54: Formen zur Beurteilung der Deskriptoren

In Abbildung 5‐54 sind verschiedene Formen dargestellt, wie sie durch die beiden Formdeskriptoren zum Ausdruck gebracht werden. Durch dieses Herangehen ist erkennbar, dass sich runde Zell‐Formen im oberen rechten Quadranten befinden. Dies ist gleichbedeutend mit Werten von Roundness (R) und Circularity (C) nahe 1. Phänotypen von Objekten mit einer länglichen Erscheinung finden sich dahingegen im unteren Skalenbereich von R und C. Sternförmige Objekte zeigen eine hohe Rundheit, sind allerdings nach dieser Auftragung nicht kreisförmig. Ausgehenden von diesen Objekten finden sich zerklüftete Formen, welche eine geringere Rundheit besitzen und schlussendlich in längliche Objekte übergehen. Diese Formen können in Intervalle eingeteilt werden. Für die vorliegende Arbeit ist die in Einteilung gemäß Tabelle 5‐47 verwendet worden.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Roundness

Circularity

ERGEBNISSE

‐Seite 128‐

Tabelle 5-47: Festgelegte Populationen mit zugehörigen Intervallen

AZI – III: Bereich adhärenter Zellen

SZI – III: Bereich Suspensionszellen

DZ: Deformierte Zellen

TZ: Tote Zellen

Population Intervalle Circularity Intervalle Roundness

AZI ; ∈ |0 0,6 ∈ |0,3 0,5

∈ |0 0,3 ∈ |0,3 0,4

AZII ; ∈ |0 0,5 ∈ |0 0,3

∈ |0,4 0,6 ∈ |0,3 0,4

AZIII ; ∈ |0,6 0,7 ∈ |0,5 0,6

∈ |0,2 0,4 ∈ |0,3 0,5

SZIII ; ∈ |0,6 0,8 ∈ |0,4 0,7

SZII ; ∈ |0,8 1 ∈ |0,4 0,8

SZI ; ∈ |0,9 1 ∈ |0,8 1

DZ ; ∈ |0,5 0,9 ∈ |0,5 0,8 ∈ |0,5 0,6

∈ |0,8 1 ∈ |0,7 0,8 ∈ |0,5 0,7

TZ ; ∈ |0 0,5 ∈ |0,6 1

Ausgehend von dieser Unterteilung kann nun eine Gewichtung (Tabelle 5‐48) der einzelnen Populationen nach einem Zielwert erfolgen. In diesem Fall erfolgte eine starke Gewichtung je runder und gleichmäßiger ein Objekt ist. Somit wird der eindimensionale, linear skalierte Gewichtungsindex „SI“ (Suspension Indication) erhalten.

Tabelle 5-48: Übersicht der gewählten Gewichtungsfaktoren

Gewichtungsfaktor Wert

0

4

7

9,5

16

20 15 0

Messung der Zellabstände

Zur Messung der Zellabstände wird auf die Flächenschwerpunkte aus der vorhergehenden

Berechnung zurückgegriffen. Über den in MatLab® integrierten delaunay‐Algorithmus können die vorhandenen Punkte direkt trianguliert werden. Über Kenntnis der Eckpunkte und der Koordinaten

ERGEBNISSE

‐Seite 129‐

ist es dann möglich über den Satz von Pythagoras die Länge zu berechnen und an Microsoft Excel zu übergeben. Um den Abstand zwischen zwei Zellen endgültig zu berechnen, wird der Objektradius benötigt (siehe exemplarisch Abbildung 5‐55 und Abbildung 5‐56).

Abbildung 5-55: Exemplarische Darstellung der Triangulation. Das Bild der Zellen (Bild links) wird zunächst manuell segmentiert (Bild Mitte). Die daraus erhaltenen Flächenschwerpunkte werden an MatLab® zur Delaunay-Triangulation übergeben (Bild rechts – überlagerte Darstellung).

Um den Abstand zweier Objekte ausdrücken zu können, die von der idealen Kreisform abweichen, werden weitere Größen mit einbezogen, um eine genauere Abschätzung zu ermöglichen. Diese sind:

Der gemessene Feret‐Durchmesser F

Die Rundheit R

Die kleine Achse a einer flächengleichen Ellipse mit der großen Achse F Aus diesen Parametern werden äquivalente Radien berechnet und als Gewichtungszonen definiert (vgl. Abbildung 5‐56). Nach mehreren Berechnungsschritten (siehe Formeln unten) folgt erneut eine Einbeziehung der subjektiven Erfahrung des Benutzers in Form einer Gewichtungsmatrix.

Abbildung 5-56: Beispielhafte Darstellung der Äquivalentdurchmesser und Annäherungszonen für eine Zelle (gelb) und die davon erfassten Nachbarzellen (grün)

Am Ende stehen drei unterscheidbare Charakteristika, die ein Maß für das Verhalten der gemessenen Zellen zu ihren direkten Nachbarzellen beschreiben sollen: „Einzelzellen“ als Maß für Zellen die ein Vielfaches ihres Äquivalent‐Radius voneinander entfernt sind. „Monolayer“ als Indikator für eine Annäherung, aber noch keine Überlappung der Zellen und schließlich „Agglomerate“ zur Anzeige von überschichteten Zellen.

5; 4; 2; 1; 0; 0; 0

ERGEBNISSE

‐Seite 130‐

5; 5; 5; 5; 1; 0; 0

0; 0; 0; 0,5; 2; 5; 6

Annäherung von Kreisen Im Folgenden wird obiges Vorgehen verwendet, um dargestellte Modellfälle zu beschreiben. Ein erster Fall wird durch gleichverteilte Kreise abgebildet. Es ist Abbildung 5‐57 zu entnehmen, dass in diesem Fall ausschließlich die Charakteristik für Einzelzellen mit etwa 85 % ein deutliches Signal ergibt.

0,00 3,14E‐04

0,85

Agglomerat Monolayer Einzelzellen0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Charak

teristik x100 [%]

Abbildung 5-57: Auswertung von nahezu gleichverteilten, entfernten Kreisen

Wird die gleiche Anzahl Kreise so stark angenähert, dass sich diese gerade nicht berühren ergibt sich die Auswertung zu Abbildung 5‐58. Der Wert für die Charakteristik „Monolayer“ zeigt hierbei 96 %. Die Charakteristik „Agglomerat“ schlägt ebenfalls an und gibt 38 % aus. Das Signal des Parameters der Einzelzellen kann mit 3 % nahezu vernachlässigt werden.

0,38

0,96

0,03


0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Charak

teristik x10

0 [%]

Abbildung 5-58: Auswertung nach Annäherung, sodass gerade kein Kontakt besteht

Wird der Abstand zwischen den Kreisen nun weiter verringert, sodass sich diese deutlich und unterschiedlich stark überlappen, gibt das Berechnungsschema folgende Daten aus (siehe Abbildung 5‐59):

ERGEBNISSE

‐Seite 131‐

0,770,99

0,01


0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Charak

teristik x10

0 [%]

Abbildung 5-59: Auswertung nach weiterer Abstandverringerung und Überschneidung der Objekte

Der Monolayer‐Wert steigt weiter auf 99 % und folgt damit dem Trend des Agglomerat‐Maßes, welches sich im Vergleich zur vorherigen Auswertung verdoppelt. Der Wert für die Einzelzellen ist mit 1 % nach wie vor sehr klein und vernachlässigbar.

Annäherung von nicht-rotationssymetrischen Formen Nimmt der Abstand zwischen Objekt‐Paarungen beginnend von etwa 3‐fachem Abstand der längsten Achse bis hin zur Überschneidung der Umfangslinien ab, so ergibt sich das Ergebnis gemäß der Darstellung in Abbildung 5‐60 bis Abbildung 5‐62. Während der Annäherung sinkt das Einzelzell‐Verhalten auf 61 %, während zunächst der Parameter für Monolayer steigt. Bei Überlagerung steigt schlussendlich ebenfalls der Indikator für Agglomerate.

0,00 0,00

0,79


0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Charak

teristik x10

0 [%]

Abbildung 5-60: Ausgangssituation mit etwa dreifachem Abstand und 90° Ausrichtung beider Objekte bezogen auf die längste Achse

ERGEBNISSE

‐Seite 132‐

0,00 0,04

0,61


0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Charak

teristik x10

0 [%]

Abbildung 5-61: Annäherung auf einen Abstand etwas kleiner als die längste Achse des annähernden Objektes

0,250,35

0,61


0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Charak

teristik x10

0 [%]

Abbildung 5-62: Überschneidung der Objekte mit einem Abstand der Mittelpunkte etwa im Bereich des kleinsten Radius

Vergleich von kombinierten Abstands-Gruppen Fügt man dem in Abbildung 5‐58 bereits vorgestellten Modellfall weitere Kreise mit größerem Abstand hinzu, so steigt das Einzelzellen‐Verhalten von etwa 2 % auf 39 % an, wohin gegen die beiden anderen Parameter von 96 % bzw. 38 % auf 58 % bzw. 23 % fallen (vgl. Abbildung 5‐63).

0,23

0,58

0,39


0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Charak

teristik x10

0 [%]

Abbildung 5-63: „Monolayer“-Gruppe mit zusätzlichen, einzelnen Kreisen

ERGEBNISSE

‐Seite 133‐

Analog verhält es sich mit dem in Abbildung 5‐64 dargestellten Fall, in welchem einem Agglomerat zusätzliche einzelne Objekte hinzugefügt werden.

0,47

0,60

0,38


0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Charak

teristik x10

0 [%]

Abbildung 5-64: "Agglomerat"-Gruppe mit zusätzlichen, einzelnen Kreisen

Hierbei steigt analog der Wert für Einzelzellen von 2 % auf 38 %, wohingegen Agglomerate von 77 % auf 47 % und Monolayer von etwa 99 % auf 60 % sinken.

Wird die Agglomerat‐Zahl in obigen Fall von einem auf drei erhöht, so führt dies zu einem Absinken der Einzelzell‐Charakteristik von 38 % auf etwa 19 % (Abbildung 5‐65). Die anderen beiden Parameter steigen dagegen von je 47 % auf 60 % respektive 60 % auf 78 %

0,60

0,78

0,19


0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Charak

teristik x10

0 [%]

Abbildung 5-65: Erhöhung der Agglomerat-Anzahl auf drei

ERGEBNISSE

‐Seite 134‐

Ergebnisse der Anwendung auf adhärente Zellen

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Param

eter [‐]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-66: Darstellung der Wachstumskurve von CHO-Zellen in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen Prozesszeit die aufgetragen werden: : Einzelzellen, : Monolayer, : Agglomerate, : SI-Index

Wird das Bildmaterial von CHO Zellen in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin nach obigem Modell ausgewertet, so ergibt sich Abbildung 5‐66. Zu erkennen ist im Falle des Kriteriums „Einzelzellen“, dass das Wachstum mit einem Wert von 0,1 beginnt. Der Formfaktor gibt entsprechend 0,2 aus. Zwischen diesem und dem nächsten Zeitpunkt zeigt der SI‐Index die größte Änderung und steigt hierbei auf 0,55 an. Die Charakteristik „Einzelzelle“ sinkt in der gleichen Zeit auf etwa 0,05. Sowohl der SI‐Index als auch die Größe „Einzelzellen“ ändern sich im weiteren Verlauf nicht merklich. In den letzten 70 h des Versuchs kann eine Änderung des SI‐Index auf einen Wert um 0,65 festgestellt werden. Der Charakteristikum „Agglomerate“ beginnt bei etwa 0,28. Mit zunehmender Prozesszeit steigt dieser Wert auf etwa 0,33. Im nächsten etwa gleichgroßen Zeitintervall steigt die Größe „Agglomerate“ auf 0,4. Obwohl der SI‐Index in der Folge konstant bleibt, steigt dieses Kriterium weiter leicht auf 0,45. Zum Ende der Kultivierung zeigt sich mit erneuter Zunahme des SI‐Index eine Abnahme der „Agglomerate“ auf 0,42. Den höchsten Startwert zeigt das Kriterium „Monolayer“. Dies beginnt bei 0,63 und steigt innerhalb der ersten knapp 50 h Prozesszeit auf 0,79. Nach einem weiteren Anstieg auf circa 0,9 verweilt die Kultur auf diesem Wert. Auch mit Zunahme des SI‐Index ändert sich dies mit einem Wert von 0,88 kaum.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Param

eter [‐]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-67: Darstellung der Wachstumskurve von CHO-Zellen in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen die Prozesszeit aufgetragen werden: : Einzelzellen,: Monolayer,: Agglomerate,: SI-Index

Die Kultivierung von CHO‐Zellen in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin zeigt gemäß Abbildung 5‐67 einen anfänglichen SI‐Index von 0,36, welcher innerhalb von 50 h auf 0,62 steigt. Im

ERGEBNISSE

‐Seite 135‐

Gegensatz zu dem Versuch in DMEM/F‐12 ist in den darauffolgenden 25 h eine Abnahme auf einen Wert von etwa 0,59 zu beobachten. Innerhalb der nächsten 70 h nimmt dieser allerdings erneut zu und liegt am Ende bei 0,72. Betrachtet man nun vor diesem Hintergrund erneut das Charakteristikum „Einzelzelle“, so zeigt sich in den ersten 75 h des Versuchs keine merkliche Änderung und der Wert verbleibt auf dem Ausgangsniveau von 0,08. Jedoch steigt dieser Wert zu späteren Zeitpunkten zunächst gering, später sprunghaft auf 0,35. Der Startwert der „Agglomerate“ befindet sich etwa bei 0,34. Er steigt mit Zunahme des SI‐Index auf das Maximum von 0,48 und sinkt in der Folge auf einen Wert von 0,32. Mit einer größeren Änderung des SI‐Index ist auch eine Abnahme des „Agglomerat“‐Charakters zu beobachten. Dieser liegt zum Ende der Kultivierung bei 0,2. Das Kriterium „Monolayer“ bildet in diesem Fall den Verlauf des „Agglomerat“‐Wertes ab. Hierbei steigt der Wert zunächst von 0,72 auf 0,85. In einem ersten Schritt sink dieser auf etwa 0,7 und zum Ende der Kultivierung auf 0,47.

0 20 40 60 80 100 1200,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Param

eter [‐]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-68: Darstellung der Wachstumskurve von CHO-Zellen in Ex-Cell 325 PF mit 2 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen die Prozesszeit aufgetragen werden: : Einzelzellen,: Monolayer,: Agglomerate,: SI-Index

Während der serumfreien Kulturführung von CHO‐Zellen in Ex‐Cell 325 PF mit 4 mM Glutamin ist in Abbildung 5‐68 deutlich zu erkennen, dass der SI‐Index ausschließlich Werte über 0,8 ausgibt. Dieser Wert steigt im Verlauf auf ein Maximum von 0,95. Zu erkennen ist, dass das Maß für „Einzelzellen“ bei Werten von 0,18 beginnt. Über die Prozesszeit verhält es sich jedoch schwankend. Zunächst steigt dieser auf etwa 0,33, um im nächsten Zeitabschnitt auf 0,25 zu sinken. Es folgt ein erneuter Anstieg auf einen Wert von 0,42. In der gleichen Größenordnung ist das Charakteristikum „Agglomerate“ zu finden. Dieses startet bei 0,28 und ist in der ersten Phase nahezu konstant. In der Folge nimmt es auf 0,39 zu, um in der nächsten Auswertung einen Wert von 0,25 zu liefern. Dem „Einzelzelle“‐Charakter entgegen verhält sich das „Monolayer“‐Verhalten. Dieser Wert sinkt zunächst von 0,69 auf 0,58. Im Anschluss daran zeigt sich ein erneuter Anstieg auf etwa 0,67 und in der Folge auf 0,47.

ERGEBNISSE

‐Seite 136‐

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Param

eter [‐]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-69: Darstellung der Wachstumskurve von L929-Zellen in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen die Prozesszeit aufgetragen werden: : Einzelzellen,: Monolayer,: Agglomerate,: SI-Index

Die Kultivierung von L929‐Zellen in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin äußert sich in einen anfänglichen SI‐Index von 0,47 (vgl. Abbildung 5‐69). Dieser steigt im ersten Zeitraum auf einen Wert von 0,68. Nach weiteren 25 h ist dieser Wert wieder auf 0,6 gesunken. Nach insgesamt 96 h wird das Maximum von 0,76 erreicht. Danach sinkt der Wert erneut auf 0,67. Das Einzelzell‐Verhalten beginnt in diesem Fall bei 0,13 und sinkt zunächst auf 0,05. In diesem Bereich bleibt der Wert bis zum letzten Messzeitpunkt, an welchem ein leichter Anstieg auf 0,08 zu erkennen ist. Die Eigenschaft „Agglomerate“ startet bei einem Skalenwert von 0,33 und steigt in den ersten 25 h auf 0,42. In den darauf folgenden Stunden ist ein leichter Anstieg auf 0,46 zu erkennen. Bis zum Ende des Versuchs geht der Wert über eine Zwischenstation bei 0,5 auf einen Endwert von 0,35 zurück. Das Monolayer‐Verhalten zeigt einen Anfangswert von 0,7 und steigt innerhalb eines Tages auf 0,87, wobei der SI‐Index deutlich zunimmt. Für die nächsten ca. 50 h schwankt diese Eigenschaft in einem kleinen Intervall um 0,87. Erst gegen Ende des Versuchs ist ein deutlicher Rückgang auf 0,8 zu erkennen, welcher mit Abnahme des SI‐Index einhergeht.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Param

eter [‐]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-70: Darstellung der Wachstumskurve von L929-Zellen in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen die Prozesszeit aufgetragen werden: : Einzelzellen,: Monolayer,: Agglomerate,: SI-Index

Die Kultivierung von L929‐Zellen in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin zeigt einen SI‐Index, welcher zu Beginn der Kultivierung bei 0,61 liegt und in der Folge nach Abbildung 5‐70 ansteigt. So erreicht er über mehrere Tage einen Wert vom 0,85. Innerhalb des letzten Messzeitraums fällt der Wert leicht ab und liegt dann bei 0,82. Der Wert für die „Einzelzellen“

ERGEBNISSE

‐Seite 137‐

beginnt niedrig bei 0,11. Über die Kulturdauer schwankt dieser um den Wert von 0,1 und erreicht zum Ende ein Minimum von 0,08. Das Maß für „Agglomerate“ zeigt einen Anstieg von seinem Startwert bei 0,28 auf 0,4. In den folgenden 70 h ändert sich dieser Wert nicht signifikant, obwohl der SI‐Index deutlich zunimmt. In den darauffolgenden zwei Tagen nimmt der Wert zunächst leicht zu, um dann auf 0,35 zurückzufallen. Die „Monolayer“‐Charakteristik zeigt einen anfänglichen Wert von 0,65 und steigt innerhalb eines Tages auf 0,85. Innerhalb der nächsten 70 h geht dieser Wert auf 0,78 zurück. In dieser Zeit steigt auch das „Monolayer“‐Kriterium wieder auf 0,86.

Ergebnisse der Anwendung auf Suspensionszellen

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Param

eter [‐]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-71: Darstellung der Wachstumskurve von Jurkat-Zellen in RPMI 1640 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen die Prozesszeit aufgetragen werden: : Einzelzellen,: Monolayer,: Agglomerate,: SI-Index

Im Falle von Jurkat‐Suspensionszellen in RPMI 1640 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin fällt ein konstanter SI‐Index ins Auge (siehe Abbildung 5‐71). Eine zeitliche Zuordnung der Charakteristika erscheint an dieser Stelle nicht sinnvoll. So schwanken die Werte der „Einzelzellen“ Bereich von 0,09 bis 0,17. Der Messwert „Agglomerate“ besitzt eine Schwankungsbreite von 0,36 bis 0,5. Die Eigenschaft „Monolayer“ oszilliert zwischen 0,74 und 0,95.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Param

eter [‐]

Prozesszeit [h]

Abbildung 5-72: Darstellung der Wachstumskurve von Jurkat-Zellen in Advanced RPMI mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen die Prozesszeit aufgetragen werden: : Einzelzellen,: Monolayer,: Agglomerate,: SI-Index

Werden die selben Zellen in dem serumreduzierten Advanced RPMI mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin kultiviert, so fällt bei Abbildung 5‐72 auf, dass in diesem Fall der SI‐Index mit der Zeit tendenziell abnimmt. Zu Beginn liegt dieser bei 0,91 und sinkt bis zum Ende auf 0,82. Allerdings ist auch hier zu erkennen, dass die Modell‐Werte, welche den Zusammenhang zwischen den Zellen beschreiben, in

ERGEBNISSE

‐Seite 138‐

Intervallen oszillieren. So zeigt der Wert für Agglomerate ein Intervall von 0,25 bis 0,41. Der Deskriptor für Monolayer schwankt zwischen 0,54 und 0,86. Und schließlich befinden sich die „Einzelzellen“ in einem Bereich von 0,08 bis 0,34.

FEHLERBETRACHTUNG

‐Seite 139‐

6. FEHLERBETRACHTUNG

Arbeiten im Labor sind aufgrund gerätespezifischer Messungenauigkeiten, Ungenauigkeiten beim Ablesen der Messwerte und in der Vorbereitung mit Messfehlern belegt.

6.1. Allgemeine Laborgeräte

Bei den Verwendeten Laborgeräten ergeben sich folgende Messungenauigkeiten

Eppendorf‐Pipetten ± 1,0 %

Feinwaage ± 0,01 g

Glaspipetten ± 1,0 %

Hamiltonspritzen ± 1,0 %

Laborwaage ± 0,01 g

pH‐Meter ± 0,05 pH‐Einheiten

6.2. Zellkultur

Beim Umgang mit Zellkulturen sind die größten Fehlerquellen in der korrekten Bestimmung der Zellzahl bzw. der Vitalität zu finden. Entscheidend ist die Entnahme einer repräsentativen Probe der Kultur. Adhärenten Zellkulturen müssen dazu vollständig von der Kultivierungsoberfläche abgelöst sein und sich in Suspension befinden. Inhomogenität der Zellverteilung in Folge von Sedimentation oder Agglomerat‐Bildung sollten durch Resuspendieren beseitigt werden. Dies bedeutet für die Zellen durch die Scherkräfte eine zusätzliche Belastung, die sich negativ auf die Membranintegrität bzw. Vitalität der Zellen auswirken kann. Außerdem kann bei Zellagglomeraten in der Zählkammer die genaue Zellzahl oft nur geschätzt werden. Durch den Kammerfaktor ergibt sich eine theoretisch minimal zählbare Gesamt‐Zellkonzentration von 1 ∙ 10 1/ml. Da dies allerdings einer Zelle pro Großquadrant entspräche ist hiervon entsprechend kein Gebrauch zu machen. Die verwendete

minimale Zellkonzentration von 1 ∙ 10 1/ml gilt in dieser Arbeit als unterstes Limit zur Zählung. Sind Zellkonzentrationen unterhalb dieses Limits nötig, so muss hierfür verdünnt werden. Für die Auswertung der Versuche – insbesondere der Wachstumskurven – bedeutet dies eine zunehmende Genauigkeit mit steigender Zellzahl.

Weiterhin ist zu berücksichtigen, dass bei fortschreitender Kultivierung ein gewisser Anteil an Wasser evaporiert. Das ist mit einer Erhöhung der LZZ pro ml gleichzusetzen. Da die Zellzahl allerdings auf das ursprüngliche Kulturvolumen bezogen wird, bedeutet dies eine Ungenauigkeit in der Bestimmung der Zellkonzentration. Es ist versucht worden dies verdampfende Volumen im verwendeten Inkubator zu quantifizieren. Im Mittel war eine Verdunstung von 10 %‐40 % in 15 Tagen zu verzeichnen. Die scheinbare Linearität des Zusammenhangs ist jedoch nur bedingt gültig, da es viel mehr davon abhängig ist, wie oft der Inkubator geöffnet wird.

Zur Beurteilung der Zellzahl wird ebenfalls ein unteres Limit bei 1 ∙ 10 1/ml als kleinste, unterscheidbare Einheit festgelegt. Bei dieser Konzentration bedeutet eine Differenz von einer Zelle bereits eine Abweichung von 4 % (CV). Werden wie gefordert bis zu 80 Zellen pro Großquadrat ausgezählt ergibt sich eine Abweichung von 1 % (CV). Im Mittel liegt die Abweichung allerdings bei

5 % ‐ 8 % (CV). Im Fall von 1 ∙ 10 1/ml bedeutet eine tote Zelle eine Vitalität von 97,6 %, was somit die untere Grenze der Auflösung ergibt. Bei einer Zählung von 60 bis 80 Zellen pro Großquadrat ergibt sich eine Abstufung von etwa 0,5 %. Gemäß der Gaußschen Fehlerabschätzung ergibt sich für die Verdoppelungszeit eine rechnerische, untere Grenze der Unterscheidbarkeit von 1 h. Die Bewertung als merklicher Unterschied gilt ab einer Differenz von etwa 5 h.

FEHLERBETRACHTUNG

‐Seite 140‐

Die Genauigkeit der Überstandmessungen ist abhängig von der eingesetzten Serummenge. Serumfreie Medien zeigen eine Abweichung von etwa 1 %, Serumhaltige eine mittlere Abweichung von 6 % (CV).

6.3. Wirkstoff‐Tests

In der Herstellung der konzentrierten Toxin‐Lösungen entstehen durch Ungenauigkeiten in der Einwaage Fehler. Auch die Volumenbestimmung des Lösungsmittels ist mit Fehlern behaftet. Die Messunsicherheit der verwendeten Glaspipetten durch den Hersteller liegt bei unter 1 %. Die verwendete Analysenwaage ermöglicht eine Ablesbarkeit von 0,1 mg. Die Fehler in der Herstellung der Toxin‐Lösungen können deshalb als untergeordnet betrachtet werden.

6.4. Durchflusszytometrie

Die Probenvorbereitung für die durchflusszytometrischen Analysen erfordert, dass die Zellen von der Kultivierungsoberfläche abgelöst und in Suspension gebracht werden. Durch die Pipettiervorgänge entstehen Scherkräfte, die für die bereits geschwächten Zellen zusätzlichen Stress bedeuten.

Der größte Fehler ist in der Probenvorbereitung zu suchen. Bei dieser wird das alte überstehende Medium entfernt. Mit diesem Schritt werden Zellen, die sich vorher von der Kultivierungsfläche gelöst haben, aspiriert. Dies trifft bei adhärenten Kulturen auf bereits tote oder sich teilende Zellen zu. Da für die weiteren Analysen oft wiederkehrende längere Inkubationszeiten mit Reagenzien notwendig sind, wird dieses Medium verworfen. Die Inkubation erfolgt dann in Pufferlösung evtl. sogar unter Zusatz von Accutase um ein Anheften der Zellen an die Wand der Reaktionsgefäße zu verhindern. Durch dieses Vorgehen werden also in Suspension befindliche Zellen von der Populationsanalyse ausgeschlossen. Die Möglichkeit der Zentrifugation besteht, beeinflusst dann allerdings nur einen Teil der Population, weswegen hiervon kein Gebrauch gemacht worden ist.

6.5. Sensor Dish Reader

Bei der Messwertaufnahme im SDR System ergeben sich maßgeblich Fehler in der Bestimmung der Sauerstoffkonzentration durch Temperaturunterschiede. Neben der physikalisch bedingten Temperaturabhängigkeit der Gaslöslichkeit ergibt sich ein Fehler in der Berechnung des Messwertes. Dieser wird immer auf die Kalibrierungstemperatur von 37 °C bezogen. Der Temperaturabfall beim Öffnen des Inkubators und die daraus resultierende Regulierung der Temperatur lassen sich allerdings erkennen und zurückverfolgen. Ein Nebeneffekt des Öffnens ist, dass sich das Gasgemisch zu Ungunsten des CO2 ändert. Ein Einfluss auf das pO2‐Signal ist evident. Dazu kommt, dass diese Änderungen in der Summe ortsabhängig und vom Füllstand sowie Inhalt abhängen. Eine Fehler‐ bzw. Ausgleichsrechnung ist mit einem Temperatur‐Sensor nicht möglich.

Weitere Fehler bei der Zellkultivierung im SDR System ergeben sich zum einen durch die technische Komponente der Messwerterfassung und zum anderen durch die biologische Komponente der Zellkulturen. Die Firma PreSens gibt für die OxoDishes eine Auflösung von ±0,4 %, sowie eine Präzision von ±1 % an.

6.6. Probenaufbereitung für LC‐MS

Die Probenaufbereitung bestand aus einem Zellaufschluss und einer anschließenden Proteinentfernung über eine Ultrafiltration mittels einer 3‐kDa‐cut‐off‐Membran. Durch eine Unterbrechung der Kühlung der Probe kann die Aktivität von Enzymen wie bspw. der CK erhöht sein. Dies würde zu einem Abbau des CrP zu Cr führen und hätte somit einen Einfluss auf das Ergebnis.

FEHLERBETRACHTUNG

‐Seite 141‐

6.7. Detektion der Analyten mit der LC‐MS

Die Detektion der Analyten erfolgt über das MS. Hierbei liegt der Gehalt der Analyten meist im Spurenbereich, woraus eine erhöhte Messunsicherheit resultiert. Durch die Anwendung der MRM‐Methode kann das Rauschen des Signals minimiert werden, da keine Störsignale im MS2 auftreten. Die Möglichkeit einer Fehldetektion, bzw. die fehlgeleitete Interpretation der Signale, wird durch die Anwendung der MRM‐Methode und durch die Kopplung mir der HPLC ausgeschlossen. Die Detektion der Analyten ist somit eindeutig.

DISKUSSION

‐Seite 142‐

7. DISKUSSION

7.1. Vergleichbarkeit der Basis‐Systeme

Für die Kultivierung von Zellkulturen steht eine breite Palette an Kulturgefäßen zur Verfügung. Diese reichen von einfachen Petrischalen bis hin zu komplexen Hohlfaser‐Modulen oder größeren Rührkesselreaktoren. Da die vorliegende Arbeit die Idee des High Content Screenings aufgreift, ist es von Bedeutung gleichzeitig mehr Versuche in geringem Volumen ansetzen zu können, als das reine Arbeitsvolumen zu betonen. Auch durch die verwendete Messtechnik fällt die Wahl schnell auf Multiwell Platten, welche bereits häufig für bspw. Roboter‐Plattformen Verwendung finden.

7.1.1. Verhalten von Zellen in SDR und originalen Greiner Platten

Wie das Prozessflussbild der Wachstumskurven verdeutlicht, sind Greiner CELLSTAR™ Platten als Standard verwendet worden. Somit wird versuchsunabhängig auf die gleichen Kulturgefäße (im 24 bzw. 96‐Multiwell Format) zurückgegriffen. Erste Kultivierungsansätze (siehe Abbildung 5‐2) haben bei mikroskopischer Betrachtung gezeigt, dass der Bereich um den Spot einer SDR‐Platte für einen Bewuchs mit Zellen nicht zugänglich gewesen ist. Adhärente Zellen bleiben in diesem Bereich abgerundet und nehmen nicht den typischen Phänotyp an, welchen sie direkt auf dem Polystyrol‐Boden zeigen. Bei Letzteren ist viel mehr zu erkennen, dass sie sich zu dem Spot hin abgrenzen. Entweder handelt es sich um ein topologisches Problem und die Zellen rutschen vor Anheftung ab, oder die Oberflächeneigenschaften des Spots verhindern die Anheftung. Die maximal zur Verfügung stehende Besiedelungsfläche des Wells wird folglich um die Spotfläche reduziert. Daher ist es fraglich, ob die absolut zu erreichende Zellzahl gegenüber einer sensorfreien Multiwell Platte geringer ist. Versuche mit CHO‐Zellen konnten dies nicht belegen. Die Zelldichten sind innerhalb des Messfehlers vergleichbar.

Da es sich bei CHO Zellen zum einen um eine (immortalisierte) Zelllinie handelt, ist es denkbar, dass sie nicht mehr ausreichend über Kontakthemmung im Wachstum reguliert ist. Diese Einschätzung wird durch weitere Versuche gestützt. Des Weiteren handelt es sich um einen Spot mit circa 2‐3 mm Durchmesser. Bezieht man die resultierende Fläche auf die gesamte Wellfläche, so ist der Anteil des Spots weniger als 10 % und ist somit im Bereich der Genauigkeit der Trypanblau‐Zählung.

Werden zur alternativen Zellzahlbestimmung Zellen im Well mit MTT versetzt, so zeigt sich eine Interaktion mit dem Spot.

Abbildung 7-1: Oxo-Spot in einem Well, welches mit MTT versehen worden ist. Durch unspezifischen Umsatz ist ein Teil des MTT in Formazan umgesetzt worden. MTT selbst kristallisierte an der Phasengrenzfläche Spot/Medium aus.

In Abbildung 7‐1 ist das Resultat eines unspezifischen MTT‐Umsatzes zu erkennen. Dem Anschein nach befindet sich das gebildete Formazan, welches in Wasser normaler Weise unlöslich ist, hier in

DISKUSSION

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der Spotmatrix. Somit kann ein amphiphiler Charakter der Spotmatrix vermutet werden. Eine merkliche Adsorption von Medienbestandteilen wird auf Grund der absoluten Verhältnisse allerdings als vernachlässigbar angesehen.

Bei Betrachtung der minimal gemessenen Sauerstoffpartialdrücke innerhalb der Wachstumskurven stellt sich heraus, dass sich in keinem der vorgestellten Fälle ein Sauerstoffwert von nahe Null einstellt. Bei ungehemmtem Wachstum wäre dies zu erwarten, da Sauerstoff bei einer ausreichend großen Anzahl an Verbrauchern limitierend wird. Da die Besiedelungsfläche durch den Spot geringer ausfällt, stellt sich im Vergleich mit einer spotfreien Multiwell‐Platte die Frage, inwiefern dieses geänderte Verhältnis zwischen gasaustauschender Oberfläche und verbrauchender Bewuchs‐Fläche inklusive Sensor einen Einfluss haben könnte.

Eine exemplarische COMSOL‐Simulation zeigt nach Abbildung 7‐2, dass der Sauerstoffgradient durch den Sensorspot beeinflusst werden könnte. Da es sich um eine konvektionsfreie Betrachtung handelt, deren Verbraucher flächig und nicht volumetrisch vorliegen, stellt sich im Bereich der Spotmatrix eine lokal höhere Sauerstoffkonzentration ein. Allerdings ist der genaue Diffusionskoeffizient für die Spotmatrix nicht bekannt und ist daher gemäß der Vorgabe eines sauerstoffdurchlässigen Feststoffs abgeschätzt worden. Deshalb ist diese Simulation ausschließlich zur Veranschaulichung der Überlegung gedacht.

Abbildung 7-2: COMSOL-Simulation einer SDR Messung. Die Farben indizieren die Sauerstoffkonzentration von grün für eine maximale Sättigung bis dunkelrot als Nullwert.

Die generelle Messbarkeit einer absoluten Sauerstoffverarmung steht allerdings außer Frage, da sie durch die Sulfit‐Methode sowohl durch den Hersteller, als auch durch eigene Experimente (kla‐Bestimmung, PCD‐Experimente) belegt ist. Da allerdings der Zeitpunkt respektive die Exaktheit ab dem eine Zellkultur in diese hypoxischen oder anoxischen Bereich übergeht von Interesse ist, sind die Messwerte entsprechend reflektiert worden. Für weitere Überlegungen wird dieser Einfluss jedoch als gering angenommen.

Die Berechnung der Sauerstoffaufnahmerate hängt von der Bestimmung des volumetrischen Stoffübergangskoeffizienten kla ab. Dieser wird über die Sulfitmethode bestimmt. Während bei der chemischen Bestimmung der Sauerstoffverbraucher im kompletten Wellvolumen homogen vorliegt, besitzt das biologische System eine flächige, konzentrische Sauerstoffsenke am Wellboden. Weiterhin müssen die ermittelten Koeffizienten auf das Kultivierungsmedium übertragen werden, das sich in pH‐Wert sowie der Ionenstärke von der gepufferten Natriumsulfitlösung unterscheidet. Hermann et al. geben für eine 96‐Multiwell Platte mit 200 µl Füllvolumen einen kla‐Wert von 50 1/h an [Hermann et al. 2003] und liegen damit in der gleichen Größenordnung.

In einigen Wells haben sich unbewachsene Stellen mit dem immer gleichen Muster in SDR‐Platten gezeigt. Die erwartete Sauerstoffabnahme über die Kultivierungsdauer ist nicht erreich worden. In

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nachfolgenden Begutachtungen mittels des Mikroskops ist zu erkennen, dass vornehmlich CHO‐Zellen den immer gleichen Well‐Bereich meiden bzw. nicht wachsen. Es ist bekannt, dass das Wachstum von Zellen über physikalische Parameter wie der Oberflächenenergie beeinflusst werden kann. Bacakova et al. zeigen beispielsweise in ihren Arbeiten, dass es von der Oberflächenenergie abhängig ist, wie stark Fibronectin an die Oberfläche adsorbiert [Bacakova et al. 2011]. Nun ist gerade für CHO‐Zellen die Fibronectin‐Adsorption bedeutend. Fehlt dieser Stimulus, kann dies ein Todessignal sein [McGill 1997; Iwamoto et al. 1999; Sordel et al. 2007]. Gängige Prozesse, welche einen Einfluss auf die Modifikation der Oberfläche haben, sind beispielsweise Lösungsmittel [Murakami et al. 1998]. Sterilisationsmethoden für Polystyrol‐Platten kommen ebenso in Betracht. So ist von β‐Strahlung beispielsweise bekannt, dass sie eine ähnliche Wirkung wie ein Sauerstoffplasma erzielen kann [Lock et al. 2010]. Doch auch die Lagerung von PS‐Platten kann den entscheidenden Ausschlag geben. Wird die Polystyrol‐Oberfläche beispielsweise über ein Sauerstoffplasma hydrophilisiert, so betrifft dies meist nur wenige Molekülschichten an der Oberfläche. Dieser Zustand ist thermodynamisch ungünstig. So kann es abhängig von der Temperatur und der Befüllung der Platten dazu kommen, dass diese Schicht entweder in den Material‐Bulk wandert und die Oberfläche somit hydrophober wird, oder genau das Gegenteil eintritt (bspw. bei der Befüllung mit Wasser und Temperaturen von 75°C) und hydrophilere Eigenschaften auftreten [Murakami et al. 1998]. Da dieses Phänomen innerhalb dieser Arbeit ausschließlich post priori festzustellen gewesen ist, sind diese Versuche nur teilweise ausgewertet worden. Die Versuchsreihe ist als nicht aussagekräftig verworfen worden, wenn die Sauerstoffsättigung der Kontrollkultur auch nach 70 h Inkubation nicht unter 60 % gefallen ist. Beim Vergleich der Kontrollkulturen in Abbildung 5‐11 bis Abbildung 5‐25 liegt der pO2 nach 70 h stets im Sättigungsbereich von 42 % bis 50 %. Gesamt bedeutet das einen Mittelwert von 47 % und eine Standardabweichung von 3,7 %.

Es sind alternative Methoden der Kultivierung im SDR angewandt worden. Zum einen ist die gesamte Oberfläche mit extrazellulärer Matrix beschichtet und zum anderen Zellkultureinsätzen eingebracht worden. Letztere besitzen eine Membran mit einer Porenweite von 8,0 µm, die die Kultivierung von Zellen über dem Sensorspot erlauben. Die Beschichtung mit extrazellulärer Matrix hat im direkten Vergleich mit dem Referenz‐Well keinen Einfluss auf das Signal. Der Sprung in der Sauerstoffsättigung nach entfernen des ThinCert®‐Einsatzes entspricht mit 30 % genau dem Differenzbetrag in der stationären Phase. Beckers et al. beschreiben bei der Kultivierung von primären Ratten Hepatozyten eine Beschichtung mit 10 µg/cm2 Typ I Kollagen. Eine ähnliche Vorgehensweise zur Versuchsdurchführung ist verworfen worden. Um einen Vergleich der Ergebnisse mit andern Methoden zu ermöglichen, hätten alle Kultivierungen unter identischen Bedingungen erfolgen müssen [Beckers et al. 2010], was in der Konsequenz nicht durchzuführen gewesen ist. In der Literatur werden bei Verwendung dieser Technik oft Suspensionskulturen wie Sf‐21 [Ries et al. 2010] oder Bakterienkulturen wie Corynebacterium glutamicum [John et al. 2003] genannt. Letztere stellen an die Oberflächenbeschaffenheit weniger Ansprüche. Weiterhin wird durch Kultivierung im Schüttler das System ständig durchmischt, was einen dauerhaften Kontakt zur Oberfläche unterbindet und die Organismen bzw. Zellen in Suspension hält.

7.1.2. Sensitivität der SDR‐Messung

Wie viele Messmethoden weist auch das Messprinzip des SDR eine Temperaturabhängigkeit auf. Daraus leitet sich eine methodische Schwierigkeit ab, da der Inkubator für jede Manipulation geöffnet werden muss. Innerhalb eines Toxizitäts‐Tests kann es – wie im Falle von Oligomycin – vorkommen, dass eine frühe Wirkung innerhalb von 2 h bis 4 h auftritt. Daher kann das Toxin nicht mit der Zellsuspension zugeben werden. Das Absetzen und Anwachsen der Zellen ist ein Faktor, der andere ist, dass die Spots erst einige Zeit benötigen um zu quellen und so zu äquilibrieren. Eine erneute Herausnahme der Multiwell Platte und Zugabe unter der Werkbank scheidet aus Temperatur‐Gründen aus. Daher ist im Falle der früher Toxin‐Wirkungen die Dosis in eine Hamilton‐Spritze aufgenommen und diese über einen modifizierten Deckel möglichst steril in das Well eingespritzt worden. Um die Temperaturabweichung so gering wie möglich zu halten, ist diese Spritze bereits über die Quellzeit im Inkubator gelagert worden.

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Dennoch prägt sich das Öffnen merklich im Signalverlauf aus. Neben der Temperatur ist die CO2‐haltige Atmosphäre ein weiterer Grund. Wird der Inkubator einen kurzen Moment geöffnet, so sinkt das Volumenverhältnis zu Ungunsten des Kohlenstoffdioxids. Welche der beiden Einflussgrößen in diesem Fall den absolut größeren Teil ausmacht, ist von Fall zu Fall unterschiedlich. Somit kann der Temperatur‐Einfluss nicht eindeutig herausgerechnet werden. SDR‐bezogene Parameter wie OUR oder ACR können daher nicht direkt auf den Zeitpunkt der Zählung bezogen werden, da hierzu der Inkubator geöffnet wird. Um das zu umgehen werden Sauerstoff und pH‐Wert‐Daten herangezogen, bevor der Inkubator geöffnet wird. In dieser Zeit (bis zu 5 h) wird von einer quasi‐stationären Biomasse ausgegangen.

7.1.3. Abgleich mit Literaturdaten

Die erhaltenen Messwerte der OURZelle liegen auf die Zellzahl gerechnet im Bereich von 1‐50 pmol Zelle·h⁄ und damit sehr nahe an Literaturwerten. Deshpande und Heinzle messen für CHO‐Zellen in einem 96‐Multiwell Platten‐System eine zellbezogene OUR von 18 bis 32 pmol Zelle·h⁄ und zeigen ebenfalls eine Abnahme über die Kulturdauer [Deshpande und Heinzle 2004]. Wagner et al. bieten darüber hinaus einen guten Überblick gemessener Sauerstoffverbrauchsraten. Dabei ist eine große Breite der Daten über mehrere Zehnerpotenzen abhängig von Zelllinie und Methode zu erkennen. Bezogen auf diese Arbeit, sind die gemessenen SDR‐Daten im oberen Bereich wiederzufinden [Wagner et al. 2011]. Die pH‐Messung zeigt zu Beginn meist Werte im Bereich von 7,2‐7,4 und liegt damit im zu erwartenden Bereich des Mediums. Der Glucose‐Verbrauch wird für CHO‐Zellen im Bereich von 138 bis 36 fmol Zelle·h⁄ angeben und liegt damit in der Größenordnung dieser Arbeit, wenn auch die Werte zu Beginn bis zu einem Faktor 20 größer sind. Ähnliches gilt für die Laktat‐Bildungsrate, die hier im Bereich von 330 bis ‐230 fmol Zelle·h⁄ vorliegt. Die Literatur zeigt beispielsweise Raten von 216 bis ‐18 fmol Zelle·h⁄ [Altamirano et al. 2004]. Verdopplungszeiten für Krebszellen werden im Bereich von 14 h bis 76 h angeben [Shimada et al. 1992; Plendl et al. 1995; Ong 2002]. Damit entsprechen die gemessenen Wachstumsraten den Erwartungswerten.

7.2. Ableitung metabolische Phänotypen

Glutamin als wichtige C‐ bzw. N‐Quelle [Butler und Spier 1984] und FKS als Supplement mit einer Vielzahl an Wachstumsfaktoren (siehe Kapitel 2) haben einen merklichen Einfluss auf das Wachstum und Verhalten von Zellen. Diese stellen eine gut zugängliche Möglichkeit dar, Beispielfälle einer Medienoptimierung anhand diverser Zellkulturen abzubilden. Die Auswahl an Zellen umfasst klassische Produktionszelllinien (CHO), Zellen für toxikologische Studien (L929), Lymphozyten als typische Suspensionszellen (Jurkat), primäre und immortalisierte Endothelzellen (PAC & MHEC5‐T) sowie (polarisierte) Leberzellen (HepZ). Diese Zellen werden in klassischen serumhaltigen Medien (bis 10 % FKS), wie auch neueren, serumreduzierten Medien (1 % FKS) kultiviert. Eine Auswahl der Zellen wird zudem in serumfreien Produktionsmedien ausgebracht.

Durch die klassische Trypanblau‐Zählung werden wichtige Parameter wie Vitalität und Zelldichte bestimmt. Aus dieser können die spezifische Wachstumsrate µ, die maximale Zelldichte PCD sowie die flächenbezogene Zelldichte ACD berechnet werden, wodurch eine Medienkomposition bewertet werden kann. Als Alternative zur Zellzählung haben sich verschiedene Proliferations‐Assays etabliert. In dieser Arbeit wird der sogenannte WST‐8‐Assay (abgekürzt: WST) verwendet. Allerdings dient er nicht ausschließlich als Maß für die Zellzahl, sondern vielmehr als metabolisches Aktivitäts‐Maß einer Zellpopulation. Des Weiteren werden aus den SDR‐Messungen neben absoluten Größen (bspw. pO2,min) zellbezogene Parameter wie die Sauerstoffaufnahme‐ oder Ansäuerungsrate abgeleitet. Diese Werte können zur Bewertung einer Medium‐Variante herangezogen werden.

7.2.1. Allgemeine Phänomene

Jeder der erwähnten Wachstumskurven ist inklusive der WST‐Läufe zweimal unabhängig von einander zu unterschiedlichen Zeitpunkten gestartet worden, um das Vorgehen auf Reproduzierbarkeit zu testen. Denn es ist nicht für alle Messgrößen die Dreifachbestimmung zu

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realisieren gewesen. Für viele der durchgeführten Wachstumskurven zeigt sich eine gute Übereinstimmung der Versuchswiederholung. Zwei Gruppen stechen allerdings negativ heraus. Zum einen die zweite Kultivierung von Jurkat und PAC und zum anderen die CHO‐Ansätze in OptiCHO.

Während des zweiten Kulturlaufs von Jurkat und PAC ist ein COSIR‐Prototyp in den Inkubator einbracht worden. In der Folge war über mehrere Tage ein deutlicher Geruch bei Öffnung des Klimaschrankes wahrzunehmen. Mit dieser Beobachtung geht der Vitalitätsabfall der Zellen einher. Dieser betraf neben den gezeigten Versuchen auch andere Vorkulturen. Somit wird davon ausgegangen, dass die Ursache in flüchtigen Verbindungen aus den Kunststoffteilen des Prototyps in Betracht zu ziehen ist.

Als Startzellzahl ist für alle Versuche ein Wert von 1·105 1/ml zur Anwendung gekommen. Dieser Wert ist für alle eingesetzten Zellen praktikabel und der Trypanblau‐Zählung gerade noch zugänglich. Somit wäre eine niedrigere Startzellzahl ohne Konzentrierungsschritte nicht direkt zu quantifizieren. Die einzige Ausnahme hiervon stellen CHO Zellen im serumfreien OptiCHO dar. Für eine Kultivierung ist der Startwert verdoppelt worden, da diese sonst nicht zu kultivieren gewesen wären. Die Problematik an sich ist allerdings ein starkes Argument für automatisierte Systeme wie COSIR.

7.2.2. Variation von Glutamin

Auf Grund der wichtigen Funktion von Glutamin im fundamentalen Metabolismus gemäß Kapitel 2.1 ist davon auszugehen, dass sich dessen Variation in der Wachstumsrate bzw. PCD zeigt. Gemäß der Zellzykluskontrolle kann sich eine Zelle teilen, wenn alle dafür notwendigen Enzyme, Makromoleküle bzw. Membranbausteine bereitstehen (siehe Kapitel 2.1.7.). Die Zeit, welche für die Mitose benötigt wird, ist relativ stark konserviert. So lässt sich die Hypothese aufstellen, dass die Bereitstellung all dieser Bausteine der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist. Je schneller diese bereitgestellt werden, desto größer ist die messbare Wachstumsrate. Bei optimaler Enzymauslastung sollte die höchste Teilungsrate erreicht werden. Glutamin ist dazu in drei Konzentrationen appliziert worden: 2 mM, 4 mM und 6 mM.

Einfluss auf die Wachstumsrate Die Erwartungshaltung bei einer Glutamin‐Steigerung geht von einer Zunahme der Wachstumsrate aus, bis toxische Effekte des entstehenden Ammoniums die Vorteile einer höheren Konzentration überwiegen. Kann es nicht ausreichend detoxifiziert werden, so wird es sich ab einer gewissen Konzentration negativ auf das Wachstum der Zellkultur auswirken [Butler und Spier 1984].

Vergleicht man die maximale Wachstumsrate bzw. minimale Verdoppelungszeit, so erkennt man eine Tendenz zu einer niedrigeren Glutamin‐Konzentration, was zunächst stimmig mit der Ammonium‐Argumentation ist [Butler und Spier 1984]. So ist die Verdoppelungszeit für CHO‐Zellen in DMEM/F‐12 bei 2 mM Gln minimal. Dem folgen L929‐ und MHEC5‐T‐Zellen. Auch Leberzellen und primäre PAC präsentieren dieses Verhalten. In serumreduziertem Advanced DMEM zeigt sich dahingegen ein Optimum bei 4 mM Gln für CHO‐, L929‐ und MHEC5‐T‐Zellen. Hier folgen HepZ und PAC nicht. Sie zeigen allerdings eine größere Abhängigkeit vom Serum, was vermutlich der größere Einflussfaktor für dieses Verhalten ist.

Im serumfreien System (OptiCHO bzw. Ex‐Cell 325 PF) zeigen CHO‐Zellen deutliche Abweichungen. Zu erwähnen ist, dass die sonst strikt eingehaltene Aussaatzelldichte für CHO‐Zellen in OptiCHO

verdoppelt worden war. Werden diese mit 1·105 1/ml ausgebracht, so zeigt sich lange Zeit keine Wachstumsphase, sondern zunächst ein Rückgang der LZZ. Generell ist in der Arbeit eine starke Schwankung im Wachstumsverhalten innerhalb der serumfreien Medien aufgetreten. Möglicherweise sind wichtige Inhaltsstoffe trotz Kühlung sehr empfindlich gegenüber Oxidationsreaktionen bzw. allgemein instabil. Setzt man diesem bereits als „schlechter“ zu bewertenden Medium erneut 10 % FKS zu, so verbessert dies die Kulturführung erheblich (Daten nicht gezeigt), sodass eher von einem Mangel als einer Inhibition ausgegangen wird. In frischem OptiCHO zeigen CHO‐Zellen hingegen ein Optimum der Glutamin‐Konzentration bei 4 mM.

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Jurkat‐Zellen in RPMI 1640 und Advanced RPMI zeigen über die Glutamin‐Erhöhung keine merklichen Differenzen in der Verdoppelungszeit. Chang et al. haben für Jurkat Zellen einen protektiven Einfluss des Glutamins nachweisen können. Sie bringen dabei Glutamin mit erhöhter IL‐2 Produktion in Verbindung und erwähnen, dass Glutamin die T‐Zell‐Aktivierung moduliert. Allerdings untersuchen die Autoren mit PMA bzw. Ionomycin aktivierte Jurkat‐Zellen bis zu einer Glutamin‐Konzentration von 2 mM [Chang et al. 2002]. Klucinski und Targowski haben in ihren Arbeiten dahingegen zeigen können, dass der toxische Effekt von Ammonium im Blut stark speziesabhängig ist. Das kann teilweise über den pH‐Wert des Mediums bzw. Blutes erklärt werden. Im basischen Bereich wird Ammonium leichter deprotoniert und kann so als Ammoniak die Zellmembran – im Gegensatz zum ionischen Ammonium ‐ nahezu ungehindert überwinden [Klucinski und Targowski 1984]. Hieraus ergibt sich ein wichtiger Zusammenhang zwischen der extrazellulären Ansäuerungsrate und der Ammoniumbildungsrate, welche somit für verschiedene Zellen unterschiedliche Folgen impliziert.

Ryll et al. bieten für die indirekten Folgen des Ammoniums ein interessantes Modell an. Ihrer Interpretation folgend, reagiert Ammonium mit F6P aus der Glykolyse (siehe Kapitel 2.1.1) und bildet über mehrere Stufen UDP‐N‐Acetylglucosamin. Da dies strikt von der Konzentration des Ammoniums abhängig ist, könnte eine erhöhte Konzentration zu einer veränderten posttranslationalen Modifikation entscheidender Proteine führen [Ryll et al. 1994]. Die Modifikation ihrerseits hat einen Einfluss auf die Aktivität der Enzyme und somit den Stoffwechsel. Andere Autoren beschreiben den Einfluss des Ammoniums auf die Wege des Glutamats (siehe Übersicht Abbildung 2‐5). Demnach wird die Umsetzung durch die GDH bereits früh inhibiert. Dieser folgt in einem Konzentrationsbereich von 2‐4 mM Ammonium die Inhibierung der Transaminierung zu Aspartat (TA1). Ab Konzentrationen größer 6 mM werde auch die zweite Transaminierungsreaktion zu Alanin inhibiert (TA2) [Lao und Toth 1997]. Nach Butler und Spier ist die initiale Glutamin‐Gabe direkt mit der Ammonium‐Bildung verlinkt. Schätzt man die maximale erreichbare Ammonium‐Konzentration ab und berücksichtig dabei nur die initiale Glutaminolyse, so können in der Arbeit bei bspw. 4 mM Gln auch theoretisch 4 mM Ammonium durch diesen Prozess entstehen. Die Messung des Kulturüberstandes deutet dieses 1:1 Verhältnis an, was jedoch der Quelle widerspräche, da diese ein Verhältnis von 1:2 (Ammonium zu Gln) zeigen. Allerdings wird das Wachstums‐Optimum von 4 mM Gln durch diese bestätigt [Butler und Spier 1984; Lao und Toth 1997]. Durch die Inhibierungs‐Hypothese wird auch der teilweise zu beobachtende Einfluss auf OUR, ACR oder das WST‐Signal durch die Implikation der Shuttlesysteme nachvollziehbar.

Einfluss auf die PCD Glutamin leistet einen nicht unerheblichen Beitrag zur Bereitstellung sog. „Building Blocks“ [Hirschhaeuser et al. 2011]. Ein großer Teil (tlw. 60 % des Gesamt‐Glutamins) davon wird allerdings zur Energiegewinnung in Laktat umgesetzt [Vander Heiden et al. 2009]. Daraus kann gefolgert werden, dass eine Erhöhung dieser Ressource die Ausbeute an Biomasse erhöht bzw. sich dies im Ansäuerungsverhalten niederschlägt. Dies kann allerdings nur geschehen, wenn die eben genannte Inhibierung durch Ammonium nur die Wachstumsrate vermindert, aber die Zelle bspw. nicht gänzlich im Zyklus arretiert bzw. toxische Effekte zu einer Abnahme führen. Durch das enge Zusammenspiel zwischen Glucose und Glutamin kann ein Einfluss des Glutamins erwartet werden, da die Glucose‐Konzentration (DMEM/F‐12 = 3,2 g/l) in den Medien nicht variiert worden ist.

Betrachtet man die maximal erreichte Zelldichte (PCD), so zeigt sich, dass mit steigender Glutamin‐Konzentration tendenziell eine Zunahme der PCD zu erkennen ist. Allerdings ist dies nicht für jede Zelllinie und jede Medienvariante zu beobachten. So zeigen beispielsweise L929‐Zellen einen gegenteiligen Trend, wenn auch die absolute Differenz mit 10 %‐15 % eher gering und leicht außerhalb der Fehlertoleranz der Zählung liegt. Dieser Zusammenhang ist bereits in der Literatur bekannt. So führt übermäßig erhöhtes Glutamin zu einer verminderten Biomassen‐ bzw. Produktausbeute [Butler und Spier 1984; Newland et al. 1990; Kurokawa et al. 1994; Ryll et al. 1994; Yang und Butler 2000; Genzel et al. 2005].

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Es ist auffällig, dass gerade in Advanced DMEM der Bezug zu Glutamin und PCD seltener stimmig ist. Der Unterschied zwischen diesem Medium und DMEM/F‐12 ist zum einen das reduzierte FKS und damit eine geringere Konzentration an Wachstumsfaktoren. Dieser Einfluss dürfte aber untergeordneter Natur sein, da beispielsweise das serumfreie DMEM/F‐12 zum serumhaltigen Pedanten entweder ähnliche oder sogar höhere PCDs erreicht. Zum anderen wird dem Advanced DMEM rekombinantes Insulin, Transferrin und Albumin beigesetzt. Möglicherweise wirken diese Proteine als Signale hin zu einer stärkeren Auslastung der OXPHOS zu Ungunsten der gebildeten Biomasse. Für den Wachstumsfaktor ILGF ist der Einfluss beispielsweise beschrieben worden [Unterluggauer et al. 2008]. Betrachtet man den Wachstumsversuch von L929 in diesen beiden Medien und beurteilt die Sauerstoffaufnahme und die Ansäuerungsrate, so ist festzustellen, dass die Ansäuerung in DMEM/F‐12 gegenüber Advanced DMEM erhöht, die OURZelle merklich erniedrigt ist. Abbildung 7‐3 verdeutlicht diese Beobachtung durch eine kombinierte Auftragung mit entsprechenden Verhältnislinien.

Abbildung 7-3: Vergleich des Sauerstoffverbrauchs und der Ansäuerung von L929-Zellen in Bild A: DMEM/F-12 + 10 % FKS + Gln Bild B: Advanced DMEM mit 1 % FKS + Gln: : 2 mM Gln, : 4 mM Gln, : 6 mM Gln

7.2.3. Serumentzug und Suspensions‐Zwang

Der Serum‐Entzug in DMEM/F‐12 wird von CHO, L929 und MHEC5‐T Zellen gut kompensiert. Die Teilungsrate geht zwar in allen Fällen zurück, dennoch zeigt sich meist eine typische Wachstumskurve, die eine ähnliche PCD hervorbringt. Daher folgt die Annahme, dass das Serum in diesen Fällen nachrangig ist. Für HepZ und PAC gilt dies nicht. Diese reagieren sehr empfindlich auf den Entzug, welchen sie entweder mit vermeintlicher Apoptose oder stationärer Phase beantworten.

Für die meisten gesunden Zellen bedeutet der Serumentzug, ähnlich wie der Kontakt zu einer Vielzahl von Nachbarzellen, den Austritt aus dem aktiven Zellzyklus hin zur Ruhephase G0. Für Krebszellen muss dies nicht gelten. Eine Erklärung liefern Pause et al. Ihrer Arbeit zur Folge benötigen die Zellen ein aktives VHL Tumor Suppressor Gen, um diesen Austritt zu gewährleisten. Vielen Krebszellen ist diese Fähigkeit abhanden gekommen [Pause et al. 1998]. Eine andere Erklärung wird durch Lum et al. genannt. Diese zeigen, dass durch den Serum‐ und damit auch IL‐3‐Entzug, die Zelle nicht mehr in der Lage ist effektiv Nährstoffe aus dem Medium aufzunehmen und zur Autophagie übergeht, um den Erhaltungsstoffwechsel in Gang zu halten. So würde bspw. die Expression des GLUT1 als Antwort auf den Serumentzug deutlich zurückgehen [Lum et al. 2005]. In der Tat kann ein Rückgang des Glc‐Verbrauchs mit dem Serumgehalt in dieser Arbeit in Verbindung gebracht werden.

Die Kultivierung von CHO in Ex‐Cell 325 PF hebt sich von allen bisherigen Ansätzen ab. Hier sind die Zellen über die gesamte Kulturdauer völlig stationär. Es ist keine wirkliche Wachstumsphase bzw. kein entsprechender Erhaltungsstoffwechsel zu erkennen. In OptiCHO sind sie stark von der anfänglichen Zelldichte abhängig. Endpunktverdünnungsversuche mit CHO in serumhaltigen

‐25 ‐20 ‐15 ‐10 ‐5 0 5 10 15 200

5

10

15

20

25

30

35

qO

2,Zelle [pmol/Zelle x h]

cH+ / (h x Zelle) [amol/Zelle x h]

‐2000:1

‐1000:1

2000:1

1000:1

A

‐25 ‐20 ‐15 ‐10 ‐5 0 5 10 15 200

5

10

15

20

25

30

35

1000:1qO



‐2000:1

‐1000:1

2000:1B

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DMEM/F‐12 (Daten in dieser Arbeit nicht gezeigt) belegen, dass die Zellzahl in diesen Fällen ohne Einfluss auf das Überleben gewesen ist. Zudem ist dies in OptiCHO allem Anschein nach ein transientes Problem, da die Zellen – wenn auch sehr spät – ein gewisses Wachstum zeigen. Da CHO‐Zellen innerhalb der Apoptose‐Versuche ebenfalls in der Negativ‐Kontrolle ein erhöhtes Signal gegenüber anderen Zelllinien zeigten, geht die Vermutung hin zu einer stärkeren Anfälligkeit der Zellen gegenüber dem Verlust zu Bestandteilen der extrazellulären Matrix. Dieser Todesmechanismus ist als Anoikis bekannt und gehört zu einer Untergruppe der Caspasen‐abhängigen Mechanismen [Zhang et al. 1995; Zhan et al. 2004]. Zhang und Kollegen haben nachweisen können, dass CHO Zellen zum Teil sehr abhängig von der Signal‐Kaskade sind. Geht man davon aus, dass es sich um dieses Problem handelt, so stellt sich die Frage, warum CHO‐Zellen dann in serumfreien DMEM/F‐12 wachsen. Der Grund liegt möglicherweise in Resten des Fibronectins oder anderer EZM‐Bestandteilen, die über das Zellpelett mit in den Versuch gelangen, da hier der plötzliche Serumentzug getestet wird. Somit kann dies aus der Vorkultur eingeschleppt worden sein. Eine andere Erklärung wäre, dass OptiCHO für die Produktion gedacht ist. Diese Prozesse sind meist auf Suspensions‐Zellen ausgelegt, weshalb die Zell‐Adhäsion möglichst zu unterbinden ist. Also könnte die Annahme getroffen werden, dass es Zusätze im Medium gibt, die Anheftung an Oberflächen zu minimieren und so die fehlende Rezeptor‐Stimulation (5 beta 1 Integrin) zum Zelltod führt [Zhang et al. 1995]. Zellen, die davon nicht betroffen sind, wachsen an. Um diese These zu stützen, müssten allerdings gezielte Versuche mit diesem Medium unter Kenntnis der Zusammensetzung durchgeführt werden.

7.2.4. ACD und pO2,min als Indikator der Nährstofflimitierung

Der Parameter ACD entspricht der Fläche unter der Wachstumskurve. Diesen kann man dazu heranziehen, um den Verbrauch von Nährstoffen unter gleichen Bedingungen zu überschlagen.

Tabelle 7-1: Anteil der ACDexp an der ACDges

Medium FKS [v/v]

Glutamin [mM]

CHO L929 MHEC5-

T Jurkat HepZ PAC

DMEM/F-12

0 % 4 37 % 33 % 25 % n/a 0 %

10 %

2 25 % 26 % 41 % 42 % 83 %

4 15 % 31 % 65 % 77 % 75 %

6 78 % 33 % 39 % 75 % 81 %

Advanced DMEM

1 %

2 62 % 41 % 41 % 71 % 0 %

4 47 % 56 % 33 % 98 % 0 %

6 48 % 49 % 50 % 93 %

OptiCHO 0 %

2 32 %

4 28 % 0 % 68 %

6 28 %

Ex-Cell 325 PF 0 % 4 0 %

RPMI 10 %

2 52 %

4 47 %

6 48 %

Advanced RPMI

1 %

2 73 %

4 75 %

6 78 %

Der Wert eignet sich ferner zu Abschätzung von Scale‐Up Fragestellungen und gehört damit zur Kategorie der Medienoptimierung. So eignet er sich zu Berechnung der Kulturdauer von repeated‐

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batch‐Prozessen oder immobilisierten Kulturen. Durch Einbeziehung der Vitalität gibt dieser Wert Auskunft, ab wann eine essentielle Limitierung oder toxische Anreicherung im Medium auftritt, ohne die Ursache genau zu benennen. Für diese Arbeit ist die ACDexp der Gesamtfläche gemäß Tabelle 7‐1 gegenüberstellt worden. Die Hypothese dahinter ist, dass die Aussage über die Schwere der Limitierung bzw. Inhibierung deutlicher wird und die Wahl einer Medium‐Mischung vereinfacht darzustellen ist. Wenn eine Kultur in die stationäre Phase übergeht, so tut sie das aus einer Hemmung oder einem Mangel heraus. Ein letales Ereignis (z.B. Mangel essentieller Nährstoff) sollte schnell zu einem Übergang der exponentiellen Phase in die Sterbephase führen. Je kleiner das Verhältnis, desto länger können die Zellen ohne Netto‐Wachstum verweilen, da sie bspw. die Autophagie oder eine alternative Quelle nutzen können. Oftmals wird der Übergang in die besagte stationäre Phase durch eine Sauerstofflimitierung bedingt, was zu einer ausgeprägten stationären Phase führt [Casciari et al. 1992]. In den meisten hier gezeigten Relationen besitzt die exponentielle Phase jedoch einen unerwartet hohen Anteil. Gerade die serumreduzierten Medien schneiden in dieser Betrachtung mäßig ab.

Ein Blick in die Tabelle der minimalen Sauerstoffpartialdrücke zeigt, dass ein sauerstofflimitierender Zustand unwahrscheinlich ist. Die Minima liegen im Bereich von 10 %‐30 % atm, was selbst unter der Annahme, dass die Werte durch das SDR als zu hoch angezeigt werden, deutlich von einer Anoxie entfernt ist. Deutlicher ist dafür der Glucose‐Verbrauch, welcher in der stationären Phase stark absinkt. Der häufigste Grund ist, dass das Edukt verbraucht worden ist. Leitet man aus den ACD‐Verhältnissen die Eignung der Mischung für die jeweilige Zelllinie ab, so zeigt sich die Analogie zur obigen Diskussion der Glutamin‐Konzentration und Serumgabe. Durch die Kombination von PCD und Wachstumsrate ist die Klassifizierung anhand eines Parameters möglich.

7.2.5. ACR als Maß der Laktat‐Anreicherung

Setzt die Zelle möglichst viel Glucose für ausgeprägtes Wachstum zu Pyruvat um, so sind die Folgereaktionen für die weiteren Messwerte entscheidend. Wird Pyruvat zu Laktat und/oder CO2 umgesetzt, so wird das den intrazellulären pH (pHi) beeinflussen (siehe Kapitel 2.1). Die Zelle ist bestrebt einen bestimmten pHi aufrecht zu erhalten und ist ebenso von einem physiologischen extrazellulären pH‐Wert abhängig (pHe) [Parks et al. 2011]. Eine Möglichkeit ist das entstehende Laktat zusammen mit Protonen auszuschleusen. Da laut Literatur teilweise bis zu 40 mM Laktat in soliden Tumoren zu erwarten sind und das Verhältnis der ausgeschleusten Protonen 1:1 oder größer ist, kann die pH‐Wert Änderung mit dem Laktat in Verbindung gebracht werden [Hirschhaeuser et al. 2011]. Hierfür ist entscheidend, in welchem System gemessen wird. Für kurzweilige Experimente können die Zellen aus ihrem Umfeld entnommen und in ein schwächeres Puffersystem überführt werden, so dass die Ansäuerung direkt messbar ist [Owicki und Wallace Parce 1992]. In dieser Arbeit ist jedoch eine Online‐Methode angewandt worden, welche die Messung in situ im Kulturmedium bedingt. Aus diesem Grund und dem Grund der verfügbaren Messwertauflösung ergeben sich längere Messzeiträume, als in ungepufferten Systemen. Je nach Zusammensetzung des Mediums sind verschiedene Puffersysteme präsent. In Tabelle 7‐2 sind die Wichtigsten samt Pufferkapazität dargestellt [Owicki und Wallace Parce 1992].

Tabelle 7-2: Abschätzung der Puffersysteme und -kapazitäten nach [Owicki und Wallace Parce 1992]

Puffersystem Pufferkapazität Bikarbonat 10 mM Phosphat

Zusammen circa 1 mM Aminosäuren (v.a. Glutamin) Fötales Kälberserum (FKS) 1 %-10 % [v/v] <1 mM

Die Pufferkapazität von Bikarbonat ist demnach um den Faktor 5‐10 größer als die restlichen puffernden Bestandteile und sollte auf alle Medien, die für den Einsatz unter den selben CO2‐Partialdrücken konzipiert sind, übertragbar sein.

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Gemäß der Henderson‐Hasselbalch‐Gleichung ist die Funktion der Pufferkapazität für eine einzelne Puffersubstanz symmetrisch und besitzt ein Maximum wenn pH = pKs gilt. Somit kann die Pufferkapazität im Bereich um dieses Maximum als relativ konstant angenommen werden, wenn | |<0,28 [Owicki und Wallace Parce 1992]. Da der pH‐Wert in manchen Kulturen im Bereich von 7,4 – 6,4 liegt, ist davon auszugehen, dass sich die Pufferkapazität ändert und die Korrelation zwischen pH‐Änderung und freigesetzter Protonen nicht über die gesamte Kulturdauer linear verläuft.

Durch den Citratzyklus wird CO2 produziert (siehe Kapitel 2.1.2), was in Reaktion mit Wasser Kohlensäure bildet und somit anteilig an der extrazellulären und intrazellulären Ansäuerung beteiligt ist. Die Carboanydrasen (CA) sind in diesen Prozess zur pH‐Regulierung involviert. Sie werden in der Literatur als Marker für das Auftreten von Hypoxie gesehen und sind in Krebs‐Zellen stark überexprimiert [Parks et al. 2011; Nordfors et al. 2013]. Eine Auswahl von Stoffwechselwegen mit zugehöriger Protonen‐Produktion ist in Tabelle 7‐3 gezeigt. Da hierbei der Sauerstoffbedarf variiert ist ebenso das Verhältnis von verbrauchtem Sauerstoff – direkt als OUR ‐ zu gebildeten Protonen – indirekt als ACR – interessant.

Tabelle 7-3: Übersicht grundlegender, energiebereitstellender Reaktionen und deren Protonenausbeute pro ATP (entnommen und ergänzt nach Owicki und Wallace Parce 1992)

C-Quelle Pathway Reaktion ATP

Ausbeute H+ pro ATP

OUR/ACR

Glucose Glykolyse →

2 2 2 1,0 0

Glucose Glykolyse + OXPHOS

6 → 6 6

36 0,17 1

Glucose HMP Shunt + Glykolyse + OXPHOS

3112

→

5 3 5 827 0,30 0,7

Glutamin OXPHOS 392

3 →

5 2 3 27 0,11 1,5

Pyruvat OXPHOS 52

→

3 2 15 0,13 1,25

Fettsäuren β-Oxidation 6 1 →

2 2 1 17 n- 6

0,13 (n=9)

2,8 (n=9)

Hier ist zu erkennen, dass bezogen auf einen reinen Energie‐Stoffwechsel zur ATP‐Gewinnung, die Glykolyse die höchste Protonenausbeute pro Molekül ATP besitzt [Owicki und Wallace Parce 1992]. Dem Gegenüber verschiebt sich das Verhältnis von OUR zu ACR im Falle der β‐Oxidation zu Gunsten des Sauerstoffs.

Geht man davon aus, dass während der Wachstumsphase ein beträchtlicher Teil der Glucose über Glykolyse samt dem HMP‐Shunt läuft und Pyruvat nur zu einem geringen Teil in den Citratzyklus gespeist wird, um diesen zusammen mit Glutamin für das Malat‐Aspartat‐Shuttle bzw. die Protein‐Synthese zu nutzen, so sollte der Großteil der pH‐Änderung dem Laktat zuzuschreiben sein.

DISKUSSION

‐Seite 152‐

Tabelle 7-4: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung von CHO-Zellen über den Kulturlauf in Stunden: A: DMEM/F-12 +10 % FKS +2 mM Gln B: Advanced DMEM + 1 % FKS + 4 mM Gln

A

Zeit 21 47 72 96

100 % 22 % 9 % -11 %

100 % 65 % 5 % 17 %

100 % 151 % 51 % -20 %

BZeit 21 47 72 96

100 % 6 % -22 % -64 %

100 % 4 % 58 % 0 %

100 % 51 % 49 % -78 %

Betrachtet man dazu Tabelle 7‐4 bis Tabelle 7‐6, ist ein Zusammenhang zwischen Glucose‐Verbrauch, Laktat‐Bildung und Ansäuerungverhalten zu erkennen. Diese sind in Form von normierten Stoffströmen aufgezeigt. Bei Glucose handelt es sich um eine Verbrauchsgröße und wird daher gemäß Definition nicht negativ dargestellt, da die Gluconeogenese unter diesen Umständen sehr unwahrscheinlich ist (näheres weiter unten). Der Verbrauch geht in allen Kulturen mit der Zeit zurück. In den meisten Fällen da die Glucose verbraucht ist.

Tabelle 7-5: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung von L929-Zellen über den Kulturlauf in Stunden: A: DMEM/F-12 +10 % FKS +4 mM Gln B: Advanced DMEM + 1 % FKS + 4 mM Gln

A Zeit 21 47 72 96

100 % 38 % 11 % -14 %

100 % 86 % 21 % 13 %

100 % 202 % 122 % 6 %

B Zeit 21 47 72 96

100 % 19 % -14 % -27 %

n/a n/a n/a n/a

100 % 31 % 22 % -32 %

Während maximaler Glucose‐Zehrung zeigt auch die Laktat‐Bildung ein Maximum. Die Ansäuerungsrate folgt dem tendenziell, scheint jedoch zeitverzögert zu sein. Das könnte zum einen in Zusammenhang mit dem Puffer stehen, oder zum anderen an einem variablen Verhältnis des Lac/H+‐Symport liegen. Des Weiteren ist eine weitere Protonenquelle denkbar.

Tabelle 7-6: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung von Jurkat-Zellen über den Kulturlauf in Stunden: A: RPMI 1640 +10 % FKS +4 mM Gln B: Advanced RPMI + 1 % FKS + 4 mM Gln

A Zeit 28 56 77 100 172

100 % 48 % 12 % -2 % -38 %

100 % 76 % 29 % 1 % 71 %

100 % 140 % -28 % -10 % 20 %

B Zeit 28 56 77 100

100 % 67 % 12 % -2 %

100 % 51 % 25 % 1 %

100 % 135 % -10 % -10 %

CHO‐Zellen in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin erreichen eine maximale Laktatkonzentration von 10 mM, was stimmig mit der Literaturlage ist. Allerdings geben die Autoren an, dass jener in ihrer Arbeit verwendete CHO‐Klon nicht zur Laktat‐Verwertung ohne Galactose im Stande gewesen sei [Wilkens et al. 2011]. Dies trifft hier nicht zu. Allerdings verwenden die Autoren zwar CHO‐Zellen, jedoch nicht den Klon K1, sondern einen speziellen Produktionsstamm, welcher unter Umständen defizitäre Eigenschaften aufweist. Noch deutlicher als im DMEM/F‐12 zeigt sich dies bei Verwendung von Advanced DMEM/F‐12. Dieses Maß der Laktatverwertung spiegelt sich ebenfalls im Protonen‐Flux wieder, was auf Grund des protonengekoppelten Symports der MCT stimmig ist [Ullah 2005; Hirschhaeuser et al. 2011].

DISKUSSION

‐Seite 153‐

7.2.6. OUR als Maß für die OXPHOS

Wie im Stand des Wissens in Kapitel 2.1 dargelegt, sind Zellen zumindest kurzzeitig und vom Zelltyp abhängig nicht strikt sauerstoffabhängig. Über die Umsetzung von Pyruvat zu Laktat ist die Zelle in der Lage ihrerseits Redoxäquivalente zu regenerieren und so erneut für die glykolytische ATP‐Bildung zu nutzen. Geht man davon aus, dass proliferierende Zellen einer hohen Glykolyse‐Leistung bedürfen, um ausreichend Precursor zu produzieren, so stellt sich die Frage, welchen Einfluss der Weg des Pyruvats hat (gemäß Kapitel 2.1.1). Dies wird entweder in den Citratzyklus gespeist, in Laktat umgesetzt oder über die Transaminierung zur Aminosäuresynthese genutzt. Interessant ist es deshalb ein Maß für die Auslastung der jeweiligen Wege zu besitzen. Da die OXPHOS der Ort großen Sauerstoffverbrauchs in der Zelle ist, liegt es nahe die OUR mit der Aktivität der OXPHOS zu korrelieren.

Betrachtet man dazu als Beispiel die Sauerstoffaufnahmeraten pro Zelle in Abbildung 7‐4 A‐C, so stellt man fest, dass die OUR ist zu Beginn des Prozesses maximal ist und bis zur stationären Phase abnimmt. Erst gegen Ende der Kultivierung ist eine leichte Zunahme zu erkennen. Das erzeugt zunächst den Eindruck, als stünde dies mit der Hypothese durch Warburg im Widerspruch. Hierbei wurde postuliert, dass sich schnell teilende Zellen auf Grund des hohen Bedarfs an Vorläufermolekülen eben nicht im hohen Maße auf die OXPHOS zurückgreifen (siehe Kapitel 2.1.10). In diesem Fall ist die alleinige Betrachtung des Sauerstoffverbrauchs pro Zelle nicht aussagekräftig genug. Zieht man zur weiteren Bewertung die Ansäuerungsraten mit in Betracht, zeigen sich Unterschiede zwischen den Medien, wie durch Abbildung 7‐4 A‐C dargestellt wird. Abbildung 7‐4 D zeigt den normierten Quotienten aus Sauerstoff‐ und Glucose‐Verbrauch. Hierbei zeigt sich, dass der Sauerstoffbedarf pro verbrauchte Glucose zu Beginn minimal ist. Mit Übergang zur stationären Phase und Glucose‐Verknappung steigt dieses Verhältnis deutlich an und ist somit in Einklang mit der genannten Hypothese. Somit ist die hohe OUR in den untenstehenden Diagrammen mit einer hohen Auslastung des Metabolismus im Allgemeinen zu erklären. Dieses Verhalten kann anhand der Verhältnisse von ACR und OUR in dem Diagramm abgeschätzt werden. An den roten Umrahmungen in Abbildung 7‐4 A‐C ist zu erkennen, dass das Verhältnis über die Medien von 2000:1 bis auf Werte von etwa 10000:1 steigt. Je größer dieses Verhältnis desto stärker kann der Anteil der OXPHOS angenommen werden. Betrachtet man dazu die Wachstumsraten so sind diese im Mittel für CHO in DMEM/F‐12 am höchsten und in OptiCHO am Niedrigsten.

DISKUSSION

‐Seite 154‐

Abbildung 7-4: Darstellung der Ansäuerungsrate gegen die Sauerstoffaufnahmerate von CHO Zellen in Bild A: DMEM/F-12 + 10 % FKS + Gln; Bild B: Advanced DMEM + 1 % FKS + Gln; Bild C: Serumfreie Medien + Gln: 2 mM Gln, 4 mM Gln, 6 mM Gln. DMEM/F-12 ohne Serum und Ex-Cell 325 PF. Der schwarze Pfeil kennzeichnet die Laufrichtung über die Prozesszeit. Der rote Rahmen zeigt die Lage der exponentiellen Phase, Bild D: normierter (Kultur in DMEM/F-12 +10 % FKS + 4 mM Gln) Quotient aus OUR und Glucose-Verbrauch: : DMEM/F-12,: Advanced DMEM,: OptiCHO

PMET versus OXPHOS Ist bisher der Hauptverbrauch des Sauerstoffs innerhalb der Mitochondrien angenommen worden, so muss diese Sichtweise bei Einbeziehung des PMET überdacht werden. Denn dies trägt Elektronen vom zytosolischen NADH in den extrazellulären Raum, wo diese ebenfalls unter Sauerstoffverbrauch zu Wasser (je nach Quelle auch zu H2O2) reagieren [Gray et al. 2011]. Entscheidend für die bisherige Betrachtung ist, welchen Anteil dieser Sauerstoffverbrauch am Gesamtverbrauch hat. Nach Herst und Berridge ist das deutlich von der Zelllinie abhängig [Herst und Berridge 2007]. In ihren Arbeiten haben sie 19 Zelllinien untersucht und kamen zu dem Schluss, dass der Sauerstoffverbrauch durch das PMET 1 %‐90 % des Gesamtverbrauchs betragen könne, was die Bewertung der OXPHOS durch die OUR deutlich erschwert. Wie auch in der vorliegenden Arbeit haben die Autoren unter anderem auf Jurkat‐Zellen zurückgegriffen.

‐20 ‐15 ‐10 ‐5 0 5 10 15 200

5

10

15

20

25

30

‐2000:1

‐1000:1

qO



2000:1

1000:1

exponentielle Phase

A

‐20 ‐15 ‐10 ‐5 0 5 10 15 200

5

10

15

20

25

30

exponentielle

Phase

‐5000:1

‐2000:1

qO



2000:15000:1

B

‐20 ‐15 ‐10 ‐5 0 5 10 15 200

5

10

15

20

25

30

exponentielle

Phase

5000:1

‐2000:1

qO



2000:1‐5000:1

C

0 20 40 60 80 100 120 140

0

10

20

30

40

[OUR*A

CD/nGlc] n

orm

iert [‐]

Prozesszeit [h]

wachsend stationär bzw.

sterbend

D

DISKUSSION

‐Seite 155‐

0 5 10 15 20 250,0

0,4c F

orm

azan/LZZ x t [pmol/Zelle x h]

qO

2,Zelle

[pmol/Zelle x h]

1:25

1:50

1:125Prozesszeit

A

0 5 10 15 200,0

0,4

c Form


qO

2,Zelle

[pmol/Zelle x h]

1:25

1:50

1:125

Prozesszeit

B

Abbildung 7-5: Darstellung Formazan-Bildung gegen OUR Bild A: Jurkat-Zellen in RPMI + 10 % FKS Bild B: L929-Zellen in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und Gln: 2 mM Gln, 4 mM Gln, 6 mM Gln

Diese verbrauchen bis zu 21 % des Sauerstoffs an der Zelloberfläche und nicht in den Mitochondrien [Herst und Berridge 2007]. In den Messungen dieser Arbeit fallen sie vor allem durch einen sehr gleichförmigen Verlauf auf. Dabei fällt in Abbildung 7‐5 A eine deutliche Korrelation zwischen OUR und der gebildeten Formazan‐Menge auf. Auch wenn dieses um den Faktor 2‐3 geringer ist als bei den in nebenstehender Abbildung gezeigten L929, so fällt ein Unterschied auf. Demnach stärkt es den Eindruck, dass das Zustandekommen des OUR‐Wertes nicht alleinig auf eine Aktivität der Mitochondrien zu beziehen ist. Vielmehr verhält es sich additiv. Das mPMS konkurriert mit dem Sauerstoff um die Elektronen, welche durch PMET bereitgestellt werden [Gray et al. 2011]. Da die Effizienz hiervon nicht bekannt ist, gestaltet sich der Literaturvergleich hierzu abschätzend. Da sich nahezu konstant ein Verhältnis von etwa 1:125 einstellt, würde demnach der durch PMET umgesetzte Sauerstoff weniger als 1 % der Gesamtmenge betragen. Das wiederspräche der Literaturlage.

In der Arbeit von Herst und Berridge werden zum Großteil Tumorzellen des hämatopoetischen Systems untersucht, sodass weitere Zelllinien dieser Arbeit nicht direkt verglichen werden können. Eine der wenigen Ausnahmen bildet die Epithelzelllinie HeLa. Diese zeigt einen sehr geringen extrazellulären O2‐Verbrauch von 1 % [Herst und Berridge 2007]. Wenn es sich bestätigen sollte, dass vornehmlich Zellen des Immunsystems auf diesem Weg des Sauerstoffverbrauchs ROS generieren, könnte es als eine Art unspezifischer Abwehrmechanismus zu verstehen sein [del Castillo‐Olivares et al. 2000]. L929 teilen die Eigenschaft von HeLa‐Zellen, nicht zum Immunsystem zu gehören und zeigen zudem keine Korrelation des WST‐Signals zur OUR. Es bleibt abschließend festzuhalten, dass auch das Sauerstoffsignal in Form der OUR nicht auf einen singulären Vorgang bzw. Ort in der Zelle zu beziehen ist.

7.2.7. Implikationen der NADH‐Regeneration

Proliferations‐Assays, wie der eingesetzte WST‐Test, werden meist dazu verwendet eine Alternative zur Zellzahlbestimmung zu haben. Das setzt voraus, dass der WST‐Umsatz pro Zelle im Idealfall über die Wachstumsphasen konstant ist. Für diese Arbeit ist WST‐8 herangezogen worden, welches ein wasserlösliches Produkt bildet. Somit ist der Test ohne weitere Aufarbeitungs‐Schritte, im Kontrast zu einem MTT‐Test, nach einer konstanten Inkubationszeit auszuwerten. Das macht ihn leichter innerhalb automatisierter Systeme einsetzbar. Durch die Ladung funktioneller Gruppen dringt WST‐8 nicht in die Zelle ein, sondern kann nur indirekt extrazellulär umgesetzt werden [Berridge et al. 2005]. mPMS dient als Bindeglied zwischen der Zelle und der Reaktion. Die dazu benötigten Elektronen stammen vom Plasmamembran‐Elektronen‐Transport (PMET). Hierbei wird NADH an der Plasmamembran zu NAD+ umgesetzt [Herst und Berridge 2007].

DISKUSSION

‐Seite 156‐

Nicht alle Elektronen stammen dabei von NADH oder werden auf Sauerstoff übertragen. So findet teilweise ein Übertrag auf Disulfid‐Bindungen von Proteinen oder andere Elektronen‐Akzeptoren statt. Im Allgemeinen wird diesem Prozess ein positiver Einfluss auf das Wachstumsverhalten von Zellen zugesprochen, da durch die Gewährleistung eines günstigen NAD+/NADH Verhältnisses Sirtuin aktiviert wird. In vielen Fällen kann Transferrin das Serum (FKS) im Zellkulturmedium ersetzen und über diesen Kanal zum Wachstum anregen [Crane et al. 2013a; Crane et al. 2013b]. Hierbei stellt sich vor allem die Frage der Stabilität des Transferrins in Lösung. Denn die Ergebnisse mit den serumfreien Medien OptiCHO und Ex‐Cell 325 PF zeigen relativ unbefriedigende Ergebnisse. Abdallah erwähnt in seinen Arbeiten, dass Eisen die Bindung an Transferrin innerhalb von Redox‐Reaktionen verlieren kann und so sein oxidatives Potential in Form der Fenton Reaktion zu entfalten vermag [Abdallah 2012]. Zusammenfassend ist der Umsatz des WST nicht immer über den Wachstumsverlauf konstant, so dass dieser in der vorliegenden Arbeit als Maß einer mittleren Aktivität und nicht als relatives Maß der Zellzahl genutzt wird.

Malat‐Aspartat‐Shuttle Auch wenn der Umsatz an der Zelloberfläche stattfindet, so wird in der Literatur angegeben, dass das NADH, welches aus dem Citratzyklus stammt, ein Reduktionsmittel des PMET darstellt. Nach Berridge kann der WST‐Assay mit der Bildungsrate von NADH innerhalb des Citratzyklus korreliert werden [Berridge et al. 2005]. Allerdings transferiert der Malat‐Aspartat‐Shuttle in der Regel das NADH der Glykolyse in die Mitochondrien. Über diesen Weg ist er in der Lage die Laktat‐Bildung zu beeinflussen und für bis zu 21 % des Sauerstoffverbrauchs der OXPHOS verantwortlich [Barron 1998].

Wenn Berridge et al. den WST‐Umsatz dem NADH aus dem Citratzyklus zuordnen, ist zunächst unklar wie der Mechanismus dahinter aussieht. Denn zytosolisches NADH ist bei aktiver Glykolyse stetig vorhanden, auch wenn es ebenfalls an anderer Stelle regeneriert werden kann [Gray et al. 2011]. Eine Störung der OXPHOS würde bedeuten, dass mitochondriales NADH dort nicht mehr regeneriert werden kann. Nun sind zwei Mechanismen denkbar. Entweder wird mitochondriales NADH ins Zytosol transportiert oder das zytosolische NADH nicht gegen den Gradienten in die Mitochondrien eingebracht. In erstem Fall entginge die Zelle einer Hemmung des Citratzyklus (siehe Kapitel 2.1.2). Im zweiten Fall wäre dieser durch niedrigere NAD+/NADH‐Verhältnisse vermutlich gehemmt. Gray et al. zeigen, dass sowohl bei einer Hemmung der Atmungskette als auch bei einer Inhibierung des Malat‐Aspartat‐Shuttles der Elektronentransport über die Plasmamembran zunimmt, was die Stau‐Hypothese stützt [Gray et al. 2011].

7.2.8. Glykolyse und Zellteilung

Um die neuere Interpretation der Warburg‐Hypothese zu verdeutlichen, sind in einigen Kulturen neben der Glucose und spezifischen Wachstumsrate der extrazelluläre Laktat‐Wert bestimmt worden. Nach den Erläuterungen in Kapitel 2.1.10 und 2.1.11 sollte ein Zusammenhang zwischen dem Maximum der spezifischen Wachstumsrate, dem Glucose‐Verbrauch sowie der Laktat‐Anreicherung bestehen. Die relevanten Daten sind in Tabelle 7‐7 bis Tabelle 7‐9 dargestellt.

Tabelle 7-7: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung, des Wachstum und des Ausbeutekoeffizienten von CHO-Zellen über den Kulturlauf in Stunden. A: DMEM/F-12 +10 % FKS +2 mM Gln B: Advanced DMEM + 1 % FKS + 4 mM Gln

A Zeit 21 47 72 96

100 % 22 % 9 % -11 %

100 % 65 % 5 % 17 %

µt 100 % 145 % 38 % -50 %

/ 0,5 0,2 0,9 -0,3

B Zeit 29 52 123 146

100 % 6 % -22 % -64 %

100 % 4 % (5 %) 0 %

µt 100 % 115 % -120 % 11 %

/ 0,8 1,5 -0,7 -

Der Glucose‐Verbrauch von CHO‐Zellen ist in der frühen Versuchsphase maximal und geht mit weiterem Fortschritt zügig gegen Null. Die Laktat‐Bildungsrate nimmt zunächst ab bis sich der

DISKUSSION

‐Seite 157‐

Prozess umkehrt und durch Laktat‐Aufnahme negative Werte erreicht. Die berechnete Wachstumsrate zu diesen Zeitpunkten folgt der obigen Hypothese, wenn auch zeitverzögert. Da es sich um Intervall‐gemittelte Werte handelt, sind Abweichungen nachvollziehbar. Eine alternative Erklärung ist die intensivierte Nutzung von Glutamin. Bezieht man die verbrauchte Menge Glucose auf die gebildete Menge Laktat unter Beachtung der theoretisch zu erreichenden Stöchiometrie, so kann ein Ausbeutekoeffizient eingeführt werden. Dieser zeigt bisweilen sehr hohe Werte, die sogar das theoretische Maximum von 1 übersteigen. Eine Erklärung hierfür ist bereits genannt: der Umsatz von Glutamin zu Laktat [Vander Heiden et al. 2009]. Interessanterweise fällt dieses Verhalten für die serumreduzierte Kultur deutlicher aus.

Tabelle 7-8: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung, des Wachstum und der Ausbeutekoeffizienten von L929-Zellen über den Kulturlauf. A: DMEM/F-12 +10 % FKS +4 mM Gln B: Advanced DMEM + 1 % FKS + 4 mM Gln

A

Zeit 21 47 72 96

100 % 38 % 11 % -14 %

100 % 86 % 21 % 13 %

µt 100 % 84 % 65 % -17 %

/ 0,9 1,5 -0,7 -

B Zeit 21 47 72 96

100 % 19 % -14 % -27 %

- - - -

µt 100 % 175 % 55 % -24 %

/ - - - -

Für L929 zeigt sich prinzipiell der gleiche Zusammenhang. Jedoch ist die gemessene Glucose in diesem Anlauf der Wachstumskurve nicht nutzbar gewesen, weswegen sich die Werte im Ergebnisteil und die hier gezeigten Laktat‐Werte auf andere Zeiträume beziehen und nicht direkt vergleichbar sind. Auch hier ist die Korrelation zwischen maximaler Laktat‐Bildung und höchstem Wachstum zu erkennen. Es fällt ferner auf, dass die Laktat‐Nutzung mit negativer Wachstumsrate, also der Sterberate, einhergeht.

Tabelle 7-9: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung, des Wachstum und der Ausbeutekoeffizienten von Jurkat-Zellen über den Kulturlauf. A: RPMI 1640 +10 % FKS +4 mM Gln B: Advanced RPMI + 1 % FKS + 4 mM Gln

A Zeit 28 56 77 100 172

100 % 48 % 12 % -2 % -38 %

100 % 76 % 29 % 1 % (71 %)

µt 100 % 137 % 154 % 121 % 7 %

/ 0,6 0,4 0,3 -1,3

B Zeit 28 56 77 100

100 % 67 % 12 % -2 %

100 % 51 % 25 % 1 %

µt 100 % 120 % 78 % 135 %

/ 0,4 0,6 0,2 -0,6

Jurkats komplettieren diese Sicht. Auffällig sind die Ausbeutekoeffizienten, welche stets unter 0,6 bleiben. Somit sind die Daten mit der Literaturlage stimmig. Denn ein relativ großer Teil des aufgenommenen und prozessierten Kohlenstoffs geht über Laktat durch Ausschleusung (zunächst) verloren. Die Nutzungsrate der glykolytischen Intermediate, welche für die Biosynthese der Makromoleküle genutzt wird, läge laut verschiedenerer Autoren bei etwa 10 % der Glykolyserate. Humane Glioma Zellen setzten demnach circa 93 % der Glucose‐Aufnahme wieder als Laktat und Alanin frei. Obwohl damit ungenutzte Energie und Kohlenstoffe für die Zelle verloren gegangen sind, hatte dieser Stoffwechselweg einen deutlichen Nutzen für die Zelle [Vander Heiden et al. 2009; Lunt und Vander Heiden 2011]. Es ist der pHi so geregelt und NADH regeneriert worden [Metallo und Vander Heiden 2013]. Zum Ende der Kulturführung kann die Zelle diesen „Laktat‐Speicher“ nutzen und zur aeroben Energiegewinnung einsetzen. Über die Wachstumsverläufe ist häufig zu erkennen, dass der pH‐Wert zum Ende hin ansteigt. Die Laktat‐Messung nährt schlussendlich die Vermutung, dass Laktat über MCTs als Symport mit Protonen erneut in die Zelle aufgenommen und metabolisiert wird. Da Laktat nur noch dem Citratzyklus und somit der OXPHOS zugänglich ist, wird zur effektiven Energiegewinnung Sauerstoff benötigt [Hirschhaeuser et al. 2011]. In Kapitel 2.1.11 ist bereits die

DISKUSSION

‐Seite 158‐

Literaturlage aufgezeigt worden, dass Glutamin essentiell für das Überleben vieler Tumorzellen ist. Es ist anzunehmen, dass durch einen Glutamin‐Mangel die Zelle nicht mehr in der Lage ist über diesen Weg ausreichend ATP bereitzustellen, wie es für L929 den Anschein hat.

7.2.9. Der Stoffwechsel von Leberzellen

Abbildung 7-6: Vergleich von L929 (Bild A und B) mit HepZ (Bild C und D) in DMEM/F-12 mit 10 % FKS + Gln: 2 mM Gln, 4 mM Gln, 6 mM Gln

Diskussionswürdig ist das Verhalten von HepZ in DMEM/F‐12 Abbildung 7‐6. Diese zeigen über die gesamte Kultivierungsdauer keine signifikante Änderung des pH‐Werts außer innerhalb der ersten und letzten Stunden, was vermutlich ein Artefakt der Auswertung (SDR, Zählung) ist. Betrachtet man die Auftragung der Sauerstoffaufnahmeraten gegen den zellbezogenen WST‐Wert, so fällt auf, dass die zeitliche Abfolge gegenüber L929‐Zellen (trifft analog für CHO zu) genau umgekehrt ist. Während L929‐Zellen zunächst mit einem Verhältnis von circa 1:25 (WST/OUR) beginnen und auf das Niveau von 1:125 übergehen, beginnen HepZ mit einem Verhältnis von 1:50 bis 1:100 und enden bei einem Verhältnis von 1:12,5 bis 1:25. Die Verdoppelungszeiten sind mit etwa 30 h um den Faktor 2 größer als jene der CHO‐Zellen. Die erreichte PCD ist relativ unabhängig vom zugesetzten Glutamin. Es fällt auf, dass die Glucose bis zum Ende der HepZ‐Kultivierung keine limitierende Größe darstellt. Neben dem bisher betrachteten Glucosetransporter 1 (GLUT‐1) findet sich in Hepatozyten, zu welchen HepZ ‐ wenn auch in maligner Form gehören‐, der Glucosetransporter 2 (GLUT2). Dieser ist ebenfalls insulinunabhängig und als Glucose‐Sensor in Diskussion [Yang et al. 2009]. Des Weiteren sind Leberzellen in den Cori‐Zyklus integriert und somit befähigt aus Metaboliten wie bspw. Laktat Glucose aufzubauen. Dies wäre eine Hypothese für die sehr geringe Ansäuerung. Es könnte auf Ebene des Pyruvats in die Gluconeogenese eingebracht werden. Des Weiteren sind Leberzellen in der Lage Glukogensynthese zu betreiben und somit als Glucose‐Speicher zu dienen [Löffler und Schölmerich 2008]. So müssen weitere Senken für Laktat und Glucose in Betracht gezogen werden,

0 5 10 15 200,0

0,4

nForm


qO

2,Zelle

[pmol/Zelle x h]

1:25

1:50

1:125

Prozesszeit

A

‐25 ‐20 ‐15 ‐10 ‐5 0 5 10 15 200,0

0,4

nForm



20:1

80:140:1

Prozesszeit

Glc Abnahme

B

0 5 10 15 200,0

0,4

1:12,5

nForm


qO

2,Zelle

[pmol/Zelle x h]

1:25

1:50

1:125

Prozesszeit

C

‐20 ‐15 ‐10 ‐5 0 5 600,0

0,4

‐40:1

nForm



80:1

Prozesszeit

D

DISKUSSION

‐Seite 159‐

die sich der Überstand‐ bzw. Onlinemessung zum Teil entziehen. GLUT2 sorgt für eine effiziente und gleichmäßige Aufnahme von Glucose in die Zelle, wo es zu G6P phosphoryliert wird. In Leberzellen aktiviert es die Glykogen‐Synthese, sofern der Glucose‐Spiegel ausreichend hoch ist. Ein Teil des G6P geht den bekannten Weg der Glykolyse und den Citratzyklus, aus welchem Überschüsse als Citrat entnommen und zu Lipiden aufgebaut werden können (siehe Kapitel 2.1.1 und 2.1.2) [Oosterveer und Schoonjans 2014]. Allerdings liegen die gewonnen Daten nicht ausschließlich im Einklang mit der Literatur. Denn der gemessene Sauerstoffbedarf ist in der hiesigen Arbeit etwa um den Faktor 100 größer als bei Werner et al [Werner et al. 2000]. Bei einem solch hohen Faktor ist ein Zählfehler unwahrscheinlich. Auffällig ist weiterhin, dass die Autoren eine deutliche Laktat‐Bildung beschreiben. Zudem liegt die Wachstumsrate um 70 % bis 200 % höher, je nachdem, ob man deren Medium‐Variante (DMEM/F‐12 mit 5 % FKS) mit den DMEM/F‐12 oder Advanced DMEM vergleicht. So lässt sich folgern, dass deren Zellen eher einem proliferativen Phänotyp entsprechen, als die Wachstumskurven es in dieser Arbeit zeigen. Das wiederrum könnte eine Erklärung für den Sauerstoffverbrauch sein: eine gesteigerte OXPHOS zu Ungunsten der Proliferation. Betrachtet man die gewählten Kultursysteme, so verwenden Werner et al. Spinner‐Flaschen und „CultiSpher G gelatin“ Mikrocarrier [Werner et al. 2000]. Dieses Kultursystem unterscheidet sich maßgeblich von der statischen Kulturführung in dieser Arbeit. Ausschlaggebend mögen in diesem Fall die Oberflächeneigenschaften der verwendeten Materialien sein.

Abbildung 7-7: Vergleich der Kultivierung von HepZ in DMEM/F-12 mit 4 mM Gln: 10 % FKS ohne FKS Bild A: Vergleich des Sauerstoffverbrauchs mit dem zellbezogenen WST-Umsatz. Die Pfeile deuten die Laufrichtung über die Prozesszeit an Bild B: Glucose-Verlauf

Wird der DMEM/F‐12‐Kultur das Serum entzogen, so wirkt sich das deutlich negativ auf das Wachstum aus, sodass es als stark „oxidativer Phänotyp“ interpretiert werden könnte. Interessant ist die Zunahme der Glucose‐Konzentration über die Zeit (vgl. Abbildung 7‐7). Diese Zunahme kann ein Artefakt durch Verdunstung oder einem realen Stoffwechselphänomen von Hepatozyten entsprechen. Durch den Serumentzug fehlen wichtige Hormone und Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise Insulin oder ILGF. Girard und Weitere zeigen in ihren Veröffentlichungen den inhibierenden Effekt von Insulin auf die hepatische Glucose‐Produktion [Fisher und Kahn 2003; Girard 2006]. Dies heißt jedoch im Umkehrschluss, dass in dieser Kultur Glucose produziert worden sein könnte. Die Netto‐Zunahme liegt bei etwa 5,6 mM (1 g/l) nach 170 h, was im Mittel etwa 33 µM pro Stunde bedeutet. Da dieser Prozess bis auf wenige Ausnahmen der Glykolyse ähnelt, kann er entweder über Intermediate dieser oder aber auch indirekt über Amino‐ und Fettsäuren gespeist werden. Bei der gemessenen Zunahme wären zur Deckung des Bedarfs alleine 11,2 mM Glutamin notwendig (stöchiometrische Betrachtung). Da im Medium jedoch nur 4 mM vorgelegt worden sind, müssen verschiedene Quellen verwertet werden. Dabei ist noch nicht in Betracht gezogen worden, dass dieser Prozess an sich einen hohen Energiebedarf hat, welcher neben dem eigentlichen Erhaltungsstoffwechsel gedeckt werden muss. Somit müsste ein markanter Anteil an

0 5 10 15 20 25

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

nForm


qO

2,Zelle

[pmol/Zelle x h]

1:125

1:50

A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6

nGlc [g/l]

Prozesszeit [h]

B

DISKUSSION

‐Seite 160‐

Vorläufermolekülen in den Gluconeogenese geflossen sein und nicht zur Zellteilung beigetragen haben.

Diese Erklärung bedeutet für alle Insulin‐haltigen Kulturen, dass die Gluconeogenese nicht für ausbleibende Ansäuerung über Laktat herangezogen werden kann. Somit bleibt der darin involvierte Cori‐Zyklus, welcher Hepatozyten dazu veranlasst Laktat oxidativ zu verwerten. Somit könnte sich eine stetige Netto‐Aufnahme ergeben. Je nach physiologischem Zustand ist dies durchaus denkbar, wie durch Morand et al. gezeigt worden ist [Morand et al. 1993].

Die Vermutung der Gluconeogenese stellt sich dahingegen als Artefakt heraus. Die gesamte Glc‐Zunahme beträgt etwa 30 % der ursprünglichen Glucose. Messungen der Verdunstung [Lesko 2013] zeigen, dass das Phänomen hierdurch geschuldet sein kann, auch wenn der Wert somit hoch angesiedelt wäre. CHO‐Zellen in Ex‐Cell 325 PF sind ebenfalls über die Dauer der Kultivierung nahezu stationär. In diesem Fall ist die Steigung der Glucose‐Zunahme sehr ähnlich, was eine identische Ursache vermuten lässt.

7.2.10. Oxidativer Phänotyp ‐ „primäre Zellen“

In der bisherigen Betrachtung sind ausschließlich Zelllinien diskutiert worden. Diese besitzen auf Grund ihrer genetischen Disposition meist ein sehr hohes proliferatives Potential mit entsprechend starker Nutzung der vorliegenden Nährstoffe [Lunt und Vander Heiden 2011]. Darüber hinaus sind wichtige Regulatoren, welche z.B. eine Kontakthemmung darstellen, meist inaktiv.

Hieraus ergibt sich die Erwartungshaltung metabolische Abweichungen zwischen den primären PAC und immortalisierten MHEC5‐T zu beobachten. Bei PAC handelt es sich um Zellen aus der Aorta des Hausschweins, welche mit proteolytischen Enzymen heraus gelöst worden waren. Demnach handelt es sich aller Wahrscheinlichkeit nach um ein Gemisch aus Endothelzellen und Fibroblasten.

Betrachtet man die Wachstumseigenschaften von PAC so zeigen diese Zellen eine deutlich geringere Wachstumsrate als beispielsweise L929 oder CHO und die niedrigste aller erreichten PCDs. Diese ist primär von der FKS Gabe abhängig. Eine serumreduzierte oder serumfreie Kultivierung erzielt sehr geringe Zelldichten. Das stärkt die Vermutung, dass diese Zellen dem oxidativen als proliferativen Phänotyp zuzuordnen sind. Ein Blick in Abbildung 7‐8 offenbart deutliche Unterschiede der beiden Zellen sowohl in der absoluten Höhe der Werte, wie auch in den zeitlichen Verläufen. Das Ansäuerungverhalten und die Sauerstoffaufnahme der MHEC5‐T sind sehr hoch. Die Maximalwerte von MHEC5‐T und PAC liegen im Fall der ACR um einen Faktor 4 und im Fall der OUR um einen Faktor 2 auseinander. Die PAC zeigen zusammenfassend einen geringeren Stoffwechsel oxidativer Ausprägung. So geht die Kultur zu Grunde bevor die zu Verfügung stehende Glucose aufgebraucht worden ist, was bspw. auf einen Mangel an Wachstumsfaktoren zurückgeführt werden könnte.

DISKUSSION

‐Seite 161‐

Abbildung 7-8: Gegenüberstellung metabolischer Verläufe von MHEC5-T (Bild A und B) und PAC-Zellen (Bild C und D) in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und Glutamin: 2 mM Gln, 4 mM Gln, 6 mM Gln

7.3. Optische Ausprägung metabolischer Phänotypen

Im zurückliegenden Kapitel sind ausgehend von verschiedenen Messmethoden Bildungs‐ und Verbrauchsraten zu metabolischen Phänotypen abgeleitet worden. In diesem Kapitel ist von Interesse, wie sich metabolische Vorgänge optisch ausprägen. Der Kosten‐ und Arbeitsaufwand ungefärbte Live‐Cell‐Aufnahmen zu generieren ist gering und gut zu automatisieren, sofern es gelingt entsprechende Algorithmen zu etablieren.

7.3.1. Auswertung der Standbilder

Für die hier vorliegende Arbeit war es interessant vor allem mit möglichst einfachen Formdeskriptoren und Längenmaßen ungefärbte Zellen zu klassifizieren, was eine Grundidee des COSIR‐Projekts gewesen ist. Dazu sind Phasenkontrastbilder manuell segmentiert worden. Zelllinien bzw. Zellen im Allgemeinen unterscheiden sich oftmals untereinander und ändern dieses Erscheinungsbild über den Kulturverlauf mit unter deutlich. Es baut sich ein subjektives Empfinden dafür auf, was einer vitalen Zellkultur ähnelt und was nicht. Abbildung 7‐9 bietet hierzu drei Beispiele. Hierbei handelt es sich um die gleiche Zelllinie (CHO). Die Bilder entstammen jedoch unterschiedlichen Medien im zeitlichen Verlauf.

0 5 10 15 20 25 30 45 500,0

0,4

1,01,2

nForm


qO

2,Zelle

[pmol/Zelle x h]

1:25 1:50

1:125

Prozesszeit

Abnahme Glucose

Glucose verbraucht

A

‐300 ‐50 ‐40 ‐30 ‐20 ‐10 0 10 20 30 40 500

10

20

30

40

501000:1

qO



‐2000:1‐1000:1 2000:1

300:1

Prozesszeit

Abnahme Glucose

( )

Glucose erschöpft

B

0 5 10 15 20 25 30 350,0

0,4

c Form


qO

2,Zelle

[pmol/Zelle x h]

1:25 1:50

1:500

Prozesszeit

Glucose‐Verbrauch sinkt

Glc > 0

Kein Verbrauch

C

‐60 ‐50 ‐40 ‐30 ‐20 ‐10 0 10 20 30 40 500

10

20

30

40

50

qO



‐2000:1

‐1000:1

2000:1

1000:1

Prozesszeit

sinkender Glc‐Verbrauch

D

DISKUSSION

‐Seite 162‐

Abbildung 7-9: Bilddaten der CHO-Zellen in den drei eingesetzten Medienvarianten. Obere Zeile: DMEM/F-12 +10 % FKS +2 mM Gln; Mittlere Zeile: Advanced DMEM + 1 % FKS +4 mM Gln; Untere Zeile: Ex-Cell 325 PF + 4 mM Gln

Diese subjektive Erfahrung soll in eine objektive Datenlage überführt werden. Hierzu sind die einzelnen segmentierten Zellen hinsichtlich der genannten Parameter wie Fläche, Durchmesser oder Umfang ausgewertet worden. Interessant sind die Formdeskriptoren Circularity und Roundness. Beide Werte sind bezogene Größen und erreichen daher einen maximalen Wert von 1, womit sie unisono einen Kreis beschreiben. Allerdings setzt der Parameter Roundness die gemessene Fläche mit der Kreisfläche der längsten Achse des gemessenen Objekts in Bezug. Im Kontrast dazu liefert die Circularity ein Maß für das Verhältnis der gemessenen Fläche zum Umfang. Damit wird ersichtlich, dass die Roundness ebenfalls eine Aussage trifft, wie länglich ein Objekt ist und die Circularity eher ein Maß für den Umfang und im abgeleiteten Sinn für die Zerklüftung der Zelle ist. Aus zellbiologischer Sicht ist das insofern interessant, da dieses morphologische Unterscheidungsmerkmal innerhalb der Zellkultur genutzt wird. Den einfachsten Fall stellen runde Suspensionszellen dar. Das phänotypische Gegenteil bilden adhärente Zellen, welche pflastersteinartige, ellipsoide, spindelförmige oder längliche Formen annehmen können (siehe Abbildung 7‐9). Zwischen diesen Zuständen liegen teilweise pathologische Formen, wie übermäßig zerklüftete Strukturen oder kleine abgeschnürte Vesikel wie z.B. „apoptotic bodies“ nach einer durchlaufenen Apoptose (siehe dazu Kapitel 2.1.9). Da gerade diese beide Formdeskriptoren im Bereich von adhärenten Zellen unterschiedlich ansprechen, sind beide herangezogen worden, um eine möglichst detaillierte Aussage zu erzeugen. Der Wertebereich beider Parameter ist in Intervalle unterteilt worden, welchen über eine Gewichtung Eigenschaften zugeteilt werden. Im hier vorliegen Fall hat das Interesse darin gelegen, Suspensionszellen von adhärenten Formen zu unterscheiden. Wenn sich eine Zelle in Kultur abrundet, so kann dies verschiedene Gründe haben. Zum einen kann es sich um echte Suspensionszellen des hämatopoetischen Systems handeln, wie bspw. Jurkat‐Zellen, und zum anderen können sich adhärente Zellen während der Teilung oder des Sterbeprozesses von der Oberfläche des Kulturgefäßes lösen und folglich abrunden. Um ein Maß für das Zusammenwirken

DISKUSSION

‐Seite 163‐

der Zellen über die Zeit zu finden, ist eine individuelle Betrachtung nicht ausreichend. Durch die Distanz zwischen zwei Zellen sollten Unterschiede im Wachstumsverhalten oder der Zellmigration zu erkennen sein.

Die Populationsanalyse wird in Form der Durchflusszytometrie in vielen Fragestellungen eingesetzt und besitzt einen großen Marktanteil. In dieser Weise bedingt sie jedoch Zellen in Suspension und somit das Detachement adhärenter Zellen. Der Informationsverlust z.B. über die Zellform ist hierbei leicht nachzuvollziehen. Somit versteht sich die grundlegende Idee hinter diesem Vorgehen als eine Methode zur Populationsanalyse adhärenter Zellen im möglichst non‐invasiven Kulturumfeld. Es können die immer gleichen Zellen und deren Abkömmlinge verfolgt werden.

Abbildung 7-10: Obige Bilder in gleicher Reihenfolge nach erfolgter Delaunay-Triangulation. Obere Zeile: DMEM/F-12 +10 % FKS +2 mM Gln; Mittlere Zeile: Advanced DMEM + 1 % FKS +4 mM Gln; Untere Zeile: Ex-Cell 325 PF + 4 mM Gln

Die Distanz ist definiert als Länge zwischen zwei Punkten. Da Zellen als Flächen vorliegen ist es zunächst wichtig diesen Flächenbezug sinnvoll in einen Punkt zu übersetzen. Am zugänglichsten erscheint hierbei der Flächenschwerpunkt. Allerdings ist es bei einer hohen Anzahl an Punkten fraglich inwiefern eine vollständige Permutation der Verbindungsmöglichkeiten anzustreben ist. Da

0 50 100 150 200 250 300 3500

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200 250 300 3500

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200 250 300 3500

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200 250 300 3500

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200 250 300 3500

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200 250 300 3500

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200 250 300 3500

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200 250 300 3500

50

100

150

200

250

300

350

0 50 100 150 200 250 300 3500

50

100

150

200

250

300

350

DISKUSSION

‐Seite 164‐

das eigentliche Interesse darin besteht, wie sich Zellen zu ihren direkten Nachbarn verhalten, war es zunächst das Ziel die Anzahl der Kombinationen zu reduzieren. Als einfache Möglichkeit hat sich die Delaunay‐Triangulation geboten. Das Prinzip dieser Triangulation besagt, dass Punkte (in diesem Fall) einer (Projektions‐)Ebene so zu Dreiecken vernetzt werden, dass innerhalb des resultierenden Umfangkreises keine Punkte benachbarter Dreiecke liegen [Lee und Schachter 1980; Paul Chew 1989]. Hierdurch wird die Anzahl der Längen, wie in Abbildung 7‐10 gezeigt, reduziert.

Im einfachsten Fall kann bei ideal runden Suspensionszellen über die Fläche auf den Radius des zugehörigen Kreises geschlossen werden. Da bekannt ist durch welche Länge zwei Zellen verbunden werden, erhält man die Distanz durch die Differenz aus dieser Länge und den beiden individuellen Radien. Komplexer stellt sich dieses Problem für adhärente Zellen heraus, deren Morphologie oft weit ab des idealen Kreises liegt. Da die Ausrichtung der Zellen bisher nicht berücksichtigt wird und die Länge ebenfalls eine skalare Größe ist, sind Äquivalent‐Kreise als Annäherungszonen definiert worden. Beginnend mit dem Durchmesser der kleinen Achsen einer zur Zelle flächengleichen Ellipse ergeben sich der Zellgröße und –form folgende Radien. Die große Achse dieser Ellipse ist der maximale Feret‐Durchmesser. Der Unterschied zwischen diesen Größen nimmt mit steigender Abweichung von der idealen Kreisform immer weiter zu und wird maximal für die Annäherung an einen Strich. Somit wird die Ausrichtung sehr langer Zellen zueinander einen gewissen Einfluss auf das Ergebnis haben, was durch die Versuchsauswertungen bekräftigt wird.

Zusammenfassend kann nun eine Distanz zwischen zwei Objekten in Abhängigkeit ihrer Form und Größe berechnet werden. Bezieht man diese Distanz auf den eigentlichen Zellradius, so findet sich über das Verhältnis ein Maß, ob die beiden Nachbarn tendenziell Einzelzellen, Monolayer oder Agglomerat‐Charakter zeigen. Für diese Beurteilung ist ebenfalls eine Gewichtung der verschiedenen Distanzen erfolgt, um subjektives Wissen zu konservieren. Um die daraus abgeleiteten Parameter zu testen, sind Beispielfälle generiert worden. Diese zeigen die generelle Unterscheidbarkeit der Grenzfälle. Zu bemerken ist jedoch auch, dass die Parameter „Agglomerat“ und „Monolayer“ oft gemeinsam, aber unterschiedlich stark ansprechen. Das ist insofern nachvollziehbar, da eine lineare Gewichtung vorgenommen worden ist. Für den Abstand „Einzelzellen“ gilt das Kriterium, dass diese Größe ein Vielfaches der Vergleichsradien ist. Für den Parameter „Monolayer“ ist festgelegt worden, dass es sich hierbei um den einfachen Abstand handeln müsse bzw. die Distanz gegen Null geht. Somit ist der verfügbare Skalenbereich für das Maß „Agglomerat“ der einfache Zellradius. Je nach Zellform gibt es durch die Gewichtung Überschneidungen. Für eine erhöhte Sensitivität des Vorgehens wäre es eine Option, der Gewichtung eine logarithmische statt einer linearen Skalierung zu Grunde zu legen. Generell kann mit dieser Variante gearbeitet werden, wie es die Modellfälle belegen.

Um das Verfahren an Bildern zu testen sind insgesamt sieben Wachstumsverläufe aus dem Datensatz der Medienvariation herangezogen und mit den metabolischen Datensätzen verglichen worden. Hierzu werden die drei Längen‐Parameter gegen den SI‐Index aufgetragen.

DISKUSSION

‐Seite 165‐

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

21,2

47,372,0

95,5

168,8

Populations‐Charakteristik [‐]

SI‐Index [‐]

exponentielle Phase

max. Glc‐Flux

stationäre Phase Vitalität geht zurück

Glc/Gln verbraucht

Lac erreicht Max

Lac nimmt ab

Abbildung 7-11: Darstellung der Wachstumskurve von CHO-Zellen in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen den SI-Index aufgetragen werden: : Einzelzellen, : Monolayer, : Agglomerate, : normierte Zellfläche. Der zeitliche Verlauf wird in Richtung der Pfeile durch die zusammenhängenden Punkte dargestellt. Die Beschriftung der -Symbole entspricht der Prozesszeit in Stunden

Der verfügbare Platz in einer Kulturschale sinkt mit steigender Zellzahl, was sich in der Distanz und somit den Längen‐Parametern bemerkbar macht. Im ersten Beispiel mit CHO‐Zellen in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 2 mM Gln (gezeigt in Abbildung 7‐11) nimmt der Einzelzellcharakter über die Zeit ab, was als Zunahme der Zellzahl gewertet werden kann. Vergleicht man das Kriterium „Monolayer“ über die Zeit mit der Wachstumskurve, so fällt auf, dass die größten Änderungen sowohl vom SI‐Index, als auch vom genannten Monolayer‐Parameter in der exponentiellen Wachstumsphase liegen. Mit Beginn der stationären Phase nimmt die Formänderung ab und wird zeitweise konstant. Dem folgt zeitverzögert der Parameter „Monolayer“. Zum letzten Messzeitpunkt, welcher sich in der Sterbephase der Kultivierung befindet, zeigt der SI‐Index eine erneute leichte Zunahme, wobei der Monolayer‐Charakter tendenziell abnimmt. Das Agglomerat‐Kriterium ähnelt dem Verlauf des Monolayers. Der Unterschied besteht darin, dass die Differenz zwischen dem dritten und vierten Messzeitpunkt deutlicher ausfällt. Das kann als weiteres Annähern der Zelle verstanden werden.

Ein klarer Vorteil dieser Betrachtungsweise wäre, wenn durch die Formänderung und das Verhalten der Zellen zu ihren Nachbarn direkte oder indirekte Rückschlüsse auf die Vitalität bzw. den Energiehaushalt getroffen werden könnten. Wie in Kapitel 2.1.8 dargestellt ist für die korrekte Funktion des Zytoskeletts sind sowohl ATP als auch GTP von Nöten [Löffler und Schölmerich 2008], was somit energiebereitstellende Stoffwechselvorgänge mit der Morphologie verknüpft. Die Energieäquivalente sind in einer Vielzahl weitere Reaktionen beteiligt und deren Neusynthese ist vom Pentosephosphatweg‐Weg abhängig.

DISKUSSION

‐Seite 166‐

Abbildung 7-12: Alternative Auftragung der Vitalität und des Agglomerat-Charakteristikums gegen die Prozesszeit und den SI-Index der CHO-Kultur in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin. Schwarz: Agglomerations-Charakteristikum, Blau: Vitalität, Rot: SI-Index

Eine Verknappung dieser Energieäquivalente sollte sich also folglich optisch bemerkbar machen. Dieser erste Versuch zeigt das Minimum der Änderungen für den SI‐Index und weitere Charakteristika gerade zu der Zeit, zu welcher die Glucose und vermutlich das Glutamin limitierend werden. In Abbildung 7‐11 ist ebenfalls die auf den Anfangswert normierte Zellfläche gegen den SI‐Index aufgetragen. Es ist zu erkennen, dass diese Fläche zu Beginn stark abnimmt. Da sich in dieser Zeit jedoch ebenfalls der SI‐Index merklich ändert, ist die Interpretation nicht eindeutig. Die Abnahme des Zellvolumens kann für eine Nährstofflimitierung und einsetzende Autophagie sprechen. Die Zelle versucht diese Limitierung durch Recycling nicht essentieller Organellen zu umgehen. Allerdings wird in diesem Fall die Projektionsfläche der Zelle gemessen. Somit ist die Fläche auch von dem Anhaftungsgrad, der den SI‐Index beeinflusst, abhängig und das gleiche Volumen kann zu einer unterschiedlich großen Projektionsfläche führen. Innerhalb der stationären Phase ab etwa 50 h sinkt die Korrelation von SI‐Index und normierter Größe. Die Zellgröße sinkt, wobei sich die Zellen zunächst nicht weiter abrunden. Möglich, dass diese These nun greift, da Glucose gemäß den Messwerten verbraucht ist. Für Glutamin kann die Vermutung geäußert werden, da die Messung nur für 4 mM vorliegt, welches zu diesem Zeitpunkt bereits erschöpft ist. Abbildung 7‐12 zeigt eine alternative Darstellung des Charakteristikums „Agglomerat“ im Vergleich mit der gemessenen Vitalität. Auch wenn beide Parameter nicht denselben Verlauf zeigen, so ist die zeitliche Abhängigkeit interessant. Als Funktion des SI‐Index verhalten sich beide gegensätzlich. Wenn die Vitalität sinkt, so steigt das Agglomerationsverhalten.

Betrachtet man den nächsten ausgewerteten Versuch von CHO‐Zellen in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin in Abbildung 7‐13, so stellt man bei der gleichen Zelllinie ein abgewandeltes Verhalten fest. Zwar steigt über die Kulturdauer erneut der SI‐Index, was mit einer schrittweisen Abrundung der Zellen gleichzusetzen ist, jedoch vermisst man die kurzzeitige Konstanz der Werte. Das ist unter Umständen der zeitlichen Auflösung geschuldet. Nach circa 75 h nimmt das Einzelzellverhalten mit steigender Tendenz zu. Dahingegen zeigen die anderen Längen‐Charakteristika eine gegenteilige Änderung, was auf Grund des mathematischen Zusammenhangs zu erwarten ist. Der Richtungswechsel fällt erneut mit dem Eintritt in die stationäre Phase bzw. mit einer Limitierung zusammen. Viel mehr ist durch weitere Referenzmessungen belegt, dass es in diesem Zeitfenster zu einer Verknappung der Glucose kommt, während die Sauerstoffaufnahmerate ebenfalls zurückgeht und das gebildete Laktat den Maximalwert erreicht. Gerade Laktat und die damit verbundene Ansäuerung wird als eine der Ursachen der Metastasierung gesehen [Bonuccelli et al. 2010]. Somit wäre es nachvollziehbar, wenn sich in dieser Phase Zellverbände lockern, was durch die Abnahme dieser Charakteristika beschrieben werden würde. Im weiteren Verlauf der Kultivierung

DISKUSSION

‐Seite 167‐

wird ein Teil des Laktats verbraucht. Die Kultur geht dennoch in die Sterbephase über, was durch eine sinkende Vitalität zu erkennen ist. In den dargelegten Modell‐Parametern stellt sich dies als weitere Zunahme des Einzelzell‐Charakteristikums dar.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

25,9

75,3

99,8

173,2


SI‐Index [‐]

exponentielle Phase

stationäre Phase

Vitalität sinkt

Lac maximal ACR maximal

OUR abnehmend

Lac sinkt

Glc = 0

OUR steigt

Abbildung 7-13: : Darstellung der Wachstumskurve von CHO-Zellen in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen den SI-Index aufgetragen werden: : Einzelzellen, : Monolayer, : Agglomerate, : normierte Zellfläche. Der zeitliche Verlauf wird in Richtung der Pfeile durch die zusammenhängenden Punkte dargestellt. Die Beschriftung der -Symbole entspricht der Prozesszeit in Stunden

Interessant ist auch der Blick auf die normierte Zellfläche. Zur Interpretation gilt das bereits genannte, aber gerade zwischen 75 h und 100 h ändert sich der SI‐Index wenig bzw. wird marginal kleiner. Genau in dieser Zeitspanne nimmt die ausgezählte LZZ sowie Vitalität ab. Der Zusammenhang mit der Vitalität lässt sich für dieses Beispiel erneut über eine dreidimensionale Auftragung gemäß Abbildung 7‐14 anschaulich darstellen. Unter Berücksichtigung der geringen Anzahl ausgewerteter Zeitpunkte fällt dennoch die Ähnlichkeit der Verläufe von Vitalität und Agglomerations‐Charakteristik auf. Diesmal sowohl im zeitlichen wie auch SI‐Index bezogenen Kontext. Im direkten Vergleich der beiden bisher betrachteten Kulturen ist zusammenfassend festzustellen, dass der Übergang in andere Wachstumsphasen durch Richtungswechsel bzw. verminderte Steigungen verdeutlicht wird. Diese optischen Auffälligkeiten stehen mit Ereignissen der weiteren Messtechnik in Bezug. Da CHO‐Zellen in beiden Medien optisch eine unterschiedliche Ausprägung zeigen, kann kein identischer Verlauf für jede Wachstumsphase erwartet werden.

Als Negativ‐Beispiel einer CHO‐Kultur dient das Medium Ex‐Cell 325 PF mit 4 mM Gln. Hierbei handelt es sich um serumfreies Medium, um CHO‐Zellen in Suspension zu kultivieren. Der in Abbildung 7‐15 dargestellte Wachstumsverlauf offenbart, dass es zu keinem messbaren Netto‐Wachstum gekommen ist. Auch die Verbrauchsraten deuten einen minimalen Stoffwechsel der ausgebrachten Zellen an. Die Auswertung der Bilddaten ergibt von Beginn an einen sehr hohen SI‐Index. Die weiteren Charakteristika der Längenauswertung sind schwer zuzuordnen.

DISKUSSION

‐Seite 168‐

Abbildung 7-14: Alternative Auftragung der Vitalität und des Agglomerat-Charakteristikums gegen die Prozesszeit und den SI-Index der L929- in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin. Schwarz: Agglomerations-Charakteristikum, Blau: Vitalität, Rot: SI-Index

Der Messwert zeigt lose Zellen, was für ein Suspensionsmedium zu erwarten ist. Da ein SI‐Index über 0,8 bedeutet, dass Zellen mit hoher Wahrscheinlichkeit frei schwimmen, ist eine weitere Interpretation aus methodischen Gründen nicht möglich.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

21,2

47,3

72,095,5


SI‐Index [‐]

Abbildung 7-15: : Darstellung der Wachstumskurve von CHO-Zellen in Ex-Cell 325 PF mit 2 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen den SI-Index aufgetragen werden: : Einzelzellen, : Monolayer, : Agglomerate, : normierte Zellfläche. Der zeitliche Verlauf wird in Richtung der Pfeile durch die zusammenhängenden Punkte dargestellt. Die Beschriftung der -Symbole entspricht der Prozesszeit in Stunden

DISKUSSION

‐Seite 169‐

Die Bilder sind mit dem Labor‐Mikroskop aufgenommen worden, da zu dieser Zeit kein Inkubator‐Mikroskop zur Verfügung gestanden war. Somit ist der Transport vom Inkubator zum Mikroskop notwendig gewesen. Hierbei kann nicht gewährleistet werden, dass freischwimmende Zellen nicht verfrachtet werden. Somit gibt es eine exogene Einflussgröße auf die Parameter „Einzelzelle“ und „Monolayer“. Das Kriterium „Agglomerat“ ist davon teilweise auszunehmen, da hier die Zellen untereinander zusammenhaften und durch den äußeren Einfluss das gesamte Agglomerat verlagert wird. Allerdings kann nicht ausgeschlossen werden, dass durch lose, zufällige Zusammenlagerung der Agglomerat‐Charakter überbetont wird. Dennoch ist zu beobachten gewesen, dass CHO‐Zellen in serumfreien Medien zu starker Agglomeration neigen. An dieser Stelle sollte vielmehr die divergierende Morphologie von CHO in den drei aufgeführten Medien mit abnehmendem FKS‐Gehalt dargestellt werden.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

21,2

47,3

72,0

95,5

168,8


SI‐Index [‐]

hoher Glc‐Flux

Vitalität sinktstationäre Phase

Lac maximal

Glc = 0 Zunahme OUR

exponentielle

Phase

Abbildung 7-16: Darstellung der Wachstumskurve von L929-Zellen in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen den SI-Index aufgetragen werden: : Einzelzellen, : Monolayer, : Agglomerate, : normierte Zellfläche. Der zeitliche Verlauf wird in Richtung der Pfeile durch die zusammenhängenden Punkte dargestellt. Die Beschriftung der -Symbole entspricht der Prozesszeit in Stunden

Betrachtet man als weitere adhärente Zelllinie die Auswertung von L929‐Zellen in Abbildung 7‐16, so stellt man erneut die Abnahme des SI‐Index über die Prozesszeit fest. Die Längen‐Parameter beschreiben einen individuellen Verlauf. Das Wachstum ist durch eine Zunahme des Monolayer‐ bzw. Agglomerat‐Charakteristikums zu erkennen, was entsprechend der Zählung bestätigt wird. Innerhalb dieser Zunahme liegt die größte Glucose‐Aufnahme sowie Laktatbildung. Ab etwa 75 h erreicht die Kultur die stationäre Phase. Während das Monolayer‐Verhalten leicht abnimmt, steigt das Agglomerations‐Kriterium um etwa 10 %. Es zeigt sich erneut eine Unstetigkeit. Im Kontrast zu den bisher gezeigten CHO‐Zellen zeigt sich eine Abnahme des SI‐Index in der Wachstumsphase. Ist der SI‐Index bisher als eine Art Vitalitätskriterium verstanden worden, scheint es somit widersprüchlich, dass bei zurückgehendem Stoffwechsel und so vermutlich Nährstoffversorgung, die Zellen einen

DISKUSSION

‐Seite 170‐

„aktiveren“ Phänotyp zeigen. Allerdings bilden diese gewichteten Parameter Verhältnisse ab und keine Absolut‐Werte. Somit ist der Rückgang des SI‐Index ebenfalls mit der Tatsache erklärbar, dass durch den Eintritt in die stationäre Phase der Anteil der sich teilenden, runden Zellen gegenüber dem Anteil adhärenten, nicht proliferierenden Zellen abnimmt. Somit kann der Zeitpunkt zum Eintritt in die stationäre Phase als Wendepunkt gesehen werden. Das zeichnet sich auch in der normierten mittleren Zellfläche ab. Diese ist quasi konstant, obwohl der SI‐Index abnimmt (47 h – 72 h). In der Zeit von 72 h bis etwa 95 h ist zu erkennen, dass sich die Zellen erneut leicht abrunden, der Agglomerations‐Charakter im Gegensatz zum Monolayer‐Charakter jedoch sinkt. Es ist erwähnenswert, dass innerhalb dieser Zeit die Glucose komplett verbraucht wird, die Laktat‐Konzentration das Maximum durchläuft und die ACRZelle ins Negative übergeht. Im letzten gemessenen Zeitpunkt ist die Zelle gänzlich auf Laktat oder Speicherstoffe zur Energiegewinnung angewiesen. Dies führt zu einer Abnahme der Vitalität. Aus Modellsicht nimmt der Einzelzellcharakter nun zu, was durch die Abnahme von Monolayer‐ und Agglomerat‐Verhalten gestützt wird. Der SI‐Index ist im vorliegenden Fall erneut nicht auf eine Zunahme der Adhärenz zurückzuführen, sondern auf das vermehrte Auftreten „pathologischer“ Phänotypen (gemäß Einteilung).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

28,8

51,8

122,6145,8

167,2


SI‐Index [‐]

exponentielle Phase

stationäre Phase

Vitalität sinkt

maximaler Glc‐Flux

Glc = 0

Lac maximal Lac sinkt

Abbildung 7-17: Darstellung der Wachstumskurve von L929-Zellen in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen den SI-Index aufgetragen werden: : Einzelzellen, : Monolayer, : Agglomerate, : normierte Zellfläche. Der zeitliche Verlauf wird in Richtung der Pfeile durch die zusammenhängenden Punkte dargestellt. Die Beschriftung der -Symbole entspricht der Prozesszeit in Stunden

Werden L929‐Zellen serumreduzierten Bedingungen ausgesetzt, zeigen sie von Beginn an eine rundlichere Form und somit höheren SI‐Index, wie Abbildung 7‐17 zu entnehmen ist. Innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase ist das erneut mit dem erhöhten Anteil sich gerade teilender Zellen zu erklären. Innerhalb dieser Wachstumsphase zeigt der Monolayer‐Charakter die größte Zunahme, was die proliferierende Kultur unterstreicht. Die sinkende Glucose‐Konzentration bewirkt einen

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Rückgang dieses Charakteristikums, während die Zellen sich weiter abrunden. Gleichzeitig steigt das Einzelzellsignal, der Agglomerat‐Charakter dahingegen bleibt nahezu konstant. Diese Tendenz lässt auf einen gewissen Agglomerationsgrad der Kultur schließen, was mit der Verknappung wichtiger Nährstoffe zu erklären ist. Die Sterbephase deutet sich etwas unterbetont im letzten Messpunkt an. Die Agglomerate und Monolayer zerfallen.

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

27,8

53,6

77,599,8

172,1


SI‐Index [‐]

Abbildung 7-18: Darstellung der Wachstumskurve von Jurkat-Zellen in RPMI 1640 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen den SI-Index aufgetragen werden: : Einzelzellen, : Monolayer, : Agglomerate, : normierte Zellfläche. Der zeitliche Verlauf wird in Richtung der Pfeile durch die zusammenhängenden Punkte dargestellt. Die Beschriftung der -Symbole entspricht der Prozesszeit in Stunden

Die Anwendung des Modells auf Jurkat‐Zellen ist mit Einschränkungen wie bereits bei in Suspension gezwungenen CHO‐Zellen zu sehen. Eine Verfrachtung der Zellen durch den Transport zum Mikroskop ist sehr wahrscheinlich. Allerdings ist die Auswertung dieser Bilder insofern von Interesse gewesen, da es sich hierbei um typische Suspensionszellen handelt. Es sollte damit zum einen die Konstanz der Form von Suspensionszellen über die Zeit gezeigt werden, was im ersten Fall in Abbildung 7‐18 deutlich wird. Des Weiteren ist erneut zu bemerken, dass die normierte Fläche (nach einer Zunahme) ebenfalls sinkt und somit nicht zu jeder Zeit eine Funktion des SI‐Index darstellt.

Oftmals ist eine Abnahme der OURZelle im Kulturverlauf zu erkennen gewesen. Dieses Modell zeigt eine zeitliche Korrelation dieser Abnahme mit der Projektionsfläche der Zelle. Wagner et al. verknüpfen das Zellvolumen mit dem Proteingehalt der Zelle und setzen dies in Abhängigkeit des Sauerstoffverbrauchs. Sie zeigen dadurch, dass ein größeres Volumen eine größere Sauerstoffaufnahme bedingt. Somit ergibt sich für die Bildauswertung ein weiterer Parameter, durch welchen die Sauerstoffaufnahme pro Zelle beurteilt werden kann [Wagner et al. 2011].

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0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

27,8

53,677,5

99,8

172,1


SI‐Index [‐]

Abbildung 7-19: Darstellung der Wachstumskurve von Jurkat-Zellen in Advanced RPMI mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin nach Auswertung der Längen und Zellformen. Die unterschiedlichen Kurven beschreiben die jeweiligen Charakteristika, welche gegen den SI-Index aufgetragen werden: : Einzelzellen, : Monolayer, : Agglomerate, : normierte Zellfläche. Der zeitliche Verlauf wird in Richtung der Pfeile durch die zusammenhängenden Punkte dargestellt. Die Beschriftung der -Symbole entspricht der Prozesszeit in Stunden

Werden Jurkat‐Zellen in serumreduzierter Kultur gehalten, so ist ein gewisses Agglomerations‐verhalten gemäß Abbildung 7‐19 festzustellen. Das ist für Blutzellen erstmal nicht zu erwarten. Allerdings sind auch diese zu einer Anhaftung in der Lage, wenn T‐Lymphozyten z.B. aus der Blutbahn in das periphere Gewebe übertreten [Cepek et al. 1994]. Hierbei müssen sie zunächst mit dem Endothelzellen in Kontakt treten und sich folglich anhaften [Ginés et al. 2002]. Nun fällt auf, dass während dieser Agglomeration die Form gewisse Abweichungen von der RPMI 1640 Variante zeigt. Möglicherweise weicht durch die Anlagerung der Zellen die Form in der Tat von der reinen Suspensionsform ab und kann detektiert werden. Die Aufklärung der Ursache dürfte nicht trivial sein und entspricht nicht der Zielsetzung dieser Arbeit, weswegen nicht weiter darauf eingegangen werden kann.

Ebenso möglich ist allerdings ein generelles Problem der manuellen Segmentierung aus einem einzelnen, ungefärbten Standbild. Die Zellabgrenzungen sind nur bis zu einer gewissen Agglomerat‐Größe gut zu erkennen. Je größer die betrachtete Geometrie ist, desto eher liegen Teile davon außerhalb der Fokusebene und sind folglich schwerer von einander zu trennen. Darüber hinaus sind Zellen im Phasenkontrast eben nicht ideal transparent – was ja der eigentliche Sinn hinter dieser Technik ist – sondern überdecken dahinterliegende Strukturen. Somit könnte diese Form‐Schwankung ein Artefakt sein. Dennoch zeigt dieser "proof‐of‐concept" gerade mit Fokus auf die aktuelle Literatur‐ und Forschungslage interessante Ansätze. Durch den Einsatz anderer Techniken wie beispielsweise der Multiphotonen‐Mikroskopie sollte es möglich sein, Zellgrenzen bzw. die gesamte Zelle auch über mehrere Fokus‐Ebenen so darzustellen, dass eine automatisierte Segmentierung einfacher und schneller zu bewerkstelligen ist. Denn zum einen benötigt diese

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Modellierung eine wesentlich höhere Versuchszahl, um die Phänomene besser zu verstehen sowie eine höhere zeitliche Auflösung zu gewährleisten und zum anderen wird durch einen solchen Algorithmus die Datenauswertung von vollautomatisierten Systemen intensiviert. Denn die einzelnen Wachstumsphasen sind durch die Trypanblauzählung und vermutlich durch eine allgemeine Zellzahlbestimmung ebenso gut abzubilden. Allerdings besteht die Auffassung, dass in dem erzeugten Bildmaterial wesentlich mehr Informationen zu finden sind. Durch die obige Auswahl ist dies bekräftigt worden. Gelingt es in Zukunft mehr Informationen markerfrei aus Mikroskop‐Aufnahmen automatisiert zu extrahieren, würde es vermutlich das HCS‐Verfahren erleichtern und vergünstigen. Diese wissenschaftliche Relevanz wird von mehreren Forschungsarbeiten in den letzten 5 Jahren unterstrichen. Ein Beispiel ist Morphobase von Futamura et al. Diese arbeiten ebenfalls mit Phasenkontrastbildern, erweitern die Parameter allerdings um Ergebnisse von Fluoreszenz‐Färbungen. So fließen hier Parameter des Zellkerns oder zellulärer Granula mit ein [Futamura et al. 2012]. Mosaliganti et al. stellten kürzlich eine automatisierte Methode vor, wie sie Zellen aus dichtem Gewebe segmentieren und so bspw. die Zellteilung in Embryos verfolgen können [Mosaliganti et al. 2012]. Yashunsky et al. zeigen mit einer auf IR basierenden (IR waveguide spectroscopy) Methode, dass sie in der Lage sind die Zellhöhe zu bestimmen [Yashunsky et al. 2012]. Natürliche Aktin‐Stabilisatoren konnten von Sumiya et al. durch Morphologie‐Profile einer HCS‐Plattform identifiziert werden [Sumiya et al. 2011]. Über die Anwendung der Fraktal‐Analyse von Zellen ist es möglich auf die Bösartigkeit mancher Tumore Rückschlüsse zu ziehen [Klein et al. 2013]. All diese Verfahren betonen das hohe Interesse an morphologischen Auswerteverfahren.

7.3.2. Beurteilung der mikroskopischen Färbungen

Die Motivation des fluoreszenzbasierten Live Cell Imaging ist die Möglichkeit morphologische Änderungen zeitlich hoch aufgelöst zu erfassen und diese mit der Information von Fluoreszenzfärbungen zu kombinieren. Hierfür sind insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe von Interesse, die möglichst geringe Wechselwirkungen mit der vitalen Zelle zeigen. Daher stehen die Vitalitätsmarker PJ und der Apoptosemarker YO‐PRO®‐1 im Fokus dieser Arbeit. Beeinflussen diese die Zelle nicht, so kann der Farbstoff bereits mit dem Medium auf die Zellkultur gegeben werden und es ist keine weitere Manipulation mehr während des Versuchs notwendig. Dieses Vorgehen ist für PJ in Abbildung 5‐51 dargestellt. Zu sehen sind zunächst Ausstülpungen aus der Zellmembran, dem mit fortschreitender Zeit das rote PJ‐Signal folgt und so die Perforation der Membran zeigt. Nach diesem Versuch hat das Gerät jedoch auf Grund von Hardwareproblemen nicht weiter zur Verfügung gestanden, so dass dieses Thema mit einem Standard‐Fluoreszenzmikroskop ohne Klimakammer weiterverfolgt werden musste. Hierzu sind einzelne Phasenkonstrast‐ und Fluoreszenzbilder manuell quantitativ bzw. qualitativ ausgewertet worden. Die Bestimmung der Zellzahl ist folglich mit einer großen Abweichung behaftet. Dies liegt an der Tatsache, dass ein Anfahren definierter Punkte im Well von Hand zu ungenau ist. Beim Vergleich von Abbildung 5‐27 und Abbildung 5‐53 zeigt sich für die Einwirkung von Antimycin A eine gewisse Korrelation zwischen den Mikroskop‐Bildern und der Durchflusszytometrie. Für alle weiteren Aufnahmen scheint die Optik im Mikroskop der des Zytometers hinsichtlich Sensitivität unterlegen zu sein.

Der Vergleich der Annexin V‐ und YP‐Färbung zeigt widersprüchliche Ergebnisse. Zwar ist unter Antimycin‐Einwirkung nach 4 h eine stark positive Färbung mit YO‐PRO®‐1 zu beobachten. Allerdings spiegelt sich das nicht in der Annexin Färbung wieder. Lediglich nach 24 h ist eine starke Annexin Färbung festzustellen. Möglicherweise ist die Membranpermeabilität von YO‐PRO®‐1 nicht an die Präsentation von PS gekoppelt, sondern an einen weiteren Mechanismus, der jedoch die gleiche Ursache haben kann. Es ist auffällig, dass die mikroskopische Auswertung von Rotenon nach 4 h ein deutliches YP‐Signal zeigt, welches nach 24 h vermutlich auf Grund einer stark sinkenden Zellzahl nahezu verschwunden ist. Die Durchlusszytometrie spricht dahingegen erst nach 24 h auf eine wesentlich höhere Konzentration leicht an. Abbildung 5‐52 zeigt exemplarische Bildausschnitte dieser Färbungen. Um auch die DNA vitaler Zellen visualisieren zu können, ist zusätzlich eine Färbung mit Hoechst 33342 vorgenommen worden. Hierbei ist gut zu erkennen, dass sich gemäß der Zellmembran‐Hypothese mehrere Fälle unterscheiden lassen, welche Auffälligkeiten hinsichtlich des

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Zellkerns zeigen. In der ersten Zeile ist bspw. eine deutlich grün gefärbte Zelle zu erkennen, deren Zellmembran auf Grund der vernachlässigbaren PJ‐Färbung intakt ist. Die grüne Färbung an sich lässt auf apoptotische Vorgänge schließen. Bestärkt wird dies durch das Chromatinmuster des Zellkerns. Dies wirkt entsprechend fragmentiert, was oftmals während der Apoptose zu beobachten ist. Das Gegenteil ist in der zweiten Zeile zu erkennen. Eine Zelle zeigt zwar eine deutliche PJ‐Färbung, jedoch spricht YP nicht an. Das Chromatinmuster wirkt wesentlich homogener. Somit bleibt festzuhalten, dass YP innerhalb apoptotischer Vorgänge in die Zelle gelangt. Welcher konkrete Mechanismus dem zu Grunde liegt ist nicht zu klären. Durch die mangelnde Verfügbarkeit des Langzeit‐Mikroskops, konnte die Frage, ob das grüne YP‐Signal transient auftreten kann, nicht abschließend geklärt werden. Denn es wäre gerade für die Bewertung von Standbildern wichtig zu wissen, ob einer positiven PJ‐Färbung eine YP‐Färbung vorausgegangen ist.

7.4. Beeinflussung des Metabolismus

Um wie Sumiya et al. Wirkstoffe identifizieren und charakterisieren zu können, ist der Dosis‐Wirkungs‐Zusammenhang wichtig. Zur Beurteilung kann hierzu beispielsweise die Zellzahl oder Aktivität der gesamten Kultur gemessen werden.

Das Sauerstoffsignal ist über den SDR mit hoher zeitlicher Auflösung messbar. Als Wirkstoffklasse bieten sich hierfür Inhibitoren der Atmungskette, als Ort hohen Sauerstoffverbrauchs, an. Um entscheidende Konzentrationsbereiche eingrenzen zu können, werden stets WST‐8 Tests mitgeführt, die somit auch eine Abschätzung für zytosolische Vorgänge bieten (siehe vorherige Kapitel). Damit ist ein Vergleich wie bereits in Kapitel 7.1 möglich und es können beide Verfahren zur Beurteilung des Dosis‐Wirkungs‐Zusammenhangs herangezogen werden. Die prozessierten Rohdaten sind aus Gründen der Übersicht im Anhang unter 10.8 zu finden.

7.4.1. Inhibierung der individuellen Komplexe der OXPHOS

Für die Inhibierung des Komplex I durch Rotenon zeigen die Dosis‐Wirkungskurven beider Verfahren einen ähnlichen Verlauf (Abbildung 7‐20). Im Bereich 0,1 bis 1 µmol/l ist der Sauerstoffverbrauch geringer als der WST‐8 Umsatz. Der Unterschied liegt allerdings im Bereich der Standardabweichung beider Analyseverfahren. Im Bereich 10 bis 100 µmol/l liegt der Sauerstoffverbrauch über dem WST‐8 Umsatz, die Standardabweichung nimmt wesentlich ab.

Die Tatsache, dass auch bei hohen Konzentrationen (100 µmol/l) beide normierten Werte über 50 % liegen, ist vermutlich auf den Ort der Inhibierung zurückzuführen. Obwohl Komplex I durch Rotenon inhibiert ist, können über Komplex II durch Succinat und über das Glyc‐3P via Komplex III weiterhin Elektronen der Transportkette zugeführt und in Komplex IV auf Sauerstoff übertragen werden. Dadurch wird der Protonengradient durch die Komplexe III und IV zu einem bestimmten Grad aufrechterhalten und die ATP Versorgung der Zelle gewährleistet. Für die Bestimmung mit WST‐8 bedeutet das einen Überschuss an NADH in der Zelle. Dieser muss durch die Zelle kompensiert werden. Dies kann z.B. durch erhöhte Bildung von Laktat geschehen. Da durch WST‐8 bzw. mPMS ein geeigneter Elektronen/Protonen Akzeptor bereitsteht, ist von einer überverhältnismäßigen Reduktion auszugehen, sofern das PMET selbst nicht durch Rotenon beeinfluss wird. Hierbei ist dann entscheidend, welches NAD+/NADH Verhältnis sich einstellt, da die Proliferation über Sirtuin beeinflusst wird. Santidrian et al. bringen die Aktivität des Komplex I und das resultierende Verhältnis der Redoxäquivalente mit dem Teilungsverhalten von Brustkrebs in Verbindung [Santidrian et al. 2013]. Der Signalverlauf in Abbildung 7‐20 deutet auf einen verminderten Proliferationsgrad bei steigender Rotenon‐Konzentration hin. Srivastava und Panda zeigen ebenfalls eine Inhibierung der Proliferation durch Rotenon bei HeLa und MCF‐7 Zellen [Srivastava und Panda 2007]. Die IC50 ist mit 0,2 bzw. 0,4 µM angegeben. Bei höheren Konzentrationen von 1 und 2 µM beschreiben sie eine Depolarisierung des Mikrotubuli Netzwerkes. Der zeitliche pO2‐Verlauf in Abbildung 5‐11 zeigt einen stationären Verlauf für alle Rotenon‐Konzentrationen. Dies spricht für die Annahme einer Arretierung des Zellzyklus und ist ein weiteres Indiz für die Sirtuin‐These.

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Ergebnisse von Li et al. zeigen, dass Rotenon bei einer Konzentration von 1 µM die Zellatmung von HL‐60 Zellen zu fast 100 % inhibiert [Li et al. 2003]. Dabei sinkt auch der ATP‐Level um 30 %. Untersuchungen von Palorini et al. weisen nach, dass vor allem bei Krebszelllinien die Glucose‐Konzentration einen Einfluss auf die zellulären Auswirkungen von Rotenon haben kann [Palorini et al. 2013]. Durch eine Konzentration von 17,5 mM an Glucose im Kultivierungsmedium kann eine Limitierung in den ersten 24 h ausgeschlossen werden. Es kann also angenommen werden, dass durch eine gesteigerte Glykolyserate eine Kompensierung des verminderten ATP‐Gehalts erfolgt. Der Quotient beider Größen zeigt, dass bei geringeren Konzentrationen der WST‐Umsatz circa 15 % höher liegt als die OUR. Somit reagiert Letztere wie vermutet zuerst auf Rotenon.

0,1 1 10 1000,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

1,2

norm

ierte Absorption bzw

. OUR [‐]


A

0,1 1 10 1000,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

norm

. WST/norm

. OUR


B

Abbildung 7-20: Vergleich von normiertem WST-8 Umsatz () mit normierte OUR ()nach 24 h unter Einwirkung von Rotenon auf CHO Zellen. Bild A: Normierte Werte mit Hüllkurve zur Fehlerdarstellung Bild B: Quotient der Kurvenzüge WST/OUR

Ein Vergleich der Auswerteverfahren für Malonat im Konzentrationsbereich von 5 bis 20 mM zeigt eine Übereinstimmung im Bereich der Standardabweichung (Abbildung 7‐21). Bei 50 mM ist die OUR mit 40 % merklich größer als der WST‐8 Umsatz.

Durch Blockierung des Komplex II ergibt sich eine umgekehrte Situation im Vergleich zur Inhibierung von Komplex I. NADH kann weiterhin über die NADH‐Ubichinon‐Oxidoreduktase der Atmungskette zugeführt werden. Die Elektroneneinspeisung über die Succinat‐Ubichinon‐Oxidoreduktase ist nicht mehr möglich. Gleichzeitig bleibt der Protonen‐Wirkungsgrad der Atmungskette unverändert, da durch Komplex II auch im ungehemmten Zustand kein Protonentransport stattfindet (siehe dazu Kapitel 2.1.3). Dadurch sinkt der Sauerstoffverbrauch nicht im gleichen Maße wie die Formazan‐Bildung bei Erhöhung der Malonat‐Konzentration.

Neben der Beeinflussung der Elektronentransportkette durch Malonat ist der Einfluss auf die Inhibierung des Citratzyklus zu berücksichtigen. Hier wird die Umwandlung von Succinat zu Fumarat unterbunden. Allerdings handelt es sich bei Malonat um einen kompetitiven Inhibitor, was den Grad der Hemmung in zusätzliche Abhängigkeit von Succinat und dem Komplex II selbst setzt [Wojtovich und Brookes 2008]. Damit kann dieser Prozess durch Substraterhöhung oder anaplerotische Reaktionen, wie der Einschleusung von Aspartat/Malat kompensiert werden. Damit rückt allerdings die Konzentration an Aminosäuren im Kultivierungsmedium vermehrt in den Fokus. Eine Inhibierung des Citratzyklus würde die Produktion an Reduktionsäquivalenten wie NADH stark vermindern (siehe dazu Kapitel 2.1.2). Das könnte sich sowohl in der OXPHOS als auch dem WST‐Signal auswirken. Die Sauerstoffaufnahmerate sollte unter diesen Bedingungen zurückgehen, da weder durch Komplex II noch durch NADH über Komplex I Elektronen in die Atmungskette eingespeist werden können. Zumindest theoretisch sollte sich für beide Messtechniken ein ähnliches Ergebnis zeigen. Das ist für niedrige Konzentrationen zu erkennen. Die Einigkeit endet jedoch ab Konzentrationen von 20 mM Malonat. Der WST‐Umsatz nimmt in der Folge stärker ab. Eine Hypothese dahinter könnte ein

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intensivierter Transport von NADH in die Mitochondrien sein. Allerdings zeigt Malonat weitere Auswirkungen au die Mitochondrien, wie das Kalium‐induzierte Anschwellen, die einen komplexeren Wirkmechanismus vermuten lassen [Wojtovich und Brookes 2008].

1 10 1000,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,2

norm


. OUR [‐]

Konzentration Malonat [mmol/l]

A

1 10 1000,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

norm

. WST/norm

. OUR

Konzentration Malonat [mmol/l]

B

Abbildung 7-21: Vergleich von normiertem WST-8 Umsatz () mit normierte OUR ()nach 24 h unter Einwirkung von Malonat auf CHO Zellen. Bild A: Normierte Werte mit Hüllkurve zur Fehlerdarstellung Bild B: Quotient der Kurvenzüge

Abbildung 7‐22 verdeutlicht für beide Verfahren eine prinzipiell ähnliche Dosis‐Wirkungskurve für Antimycin A. Allerdings zeigt sich im WST‐Signal eine Abnahme um fast 50 % bei Verdopplung der Konzentration von 270 auf 550 µM. Die Abnahme im Sauerstoffbedarf erreicht 15 %. Tzung et al. beschreiben unter Einwirkung von 18 µM Antimycin A eine Abnahme im Sauerstoffverbrauch um 90 % bzw. 50 % bei Maus‐Hepatozyten. Allerdings wird die Expressionsrate des antiapoptotischen Faktors Bcl‐xL als wichtiger Faktor für die zelluläre Antwort auf Antimycin A genannt [Tzung et al. 2001]. Diese Unterbrechung scheint die Zelle über einen weiten Konzentrationsbereich ausreichend kompensieren zu können. Das sichtbare Plateau der WST‐Messungen verdeutlicht diese Annahme. Die OUR stützt diese These mit Ausnahme des letzten Messpunkts.

Die WST‐Messung von Azid unterscheidet sich von allen anderen Toxinen der Atmungskette. In Abbildung 5‐16 ist im Konzentrationsbereich von 1 µM bis 10 mM ein starker Anstieg des WST‐Umsatzes zu erkennen, welcher auf eine Akkumulation von zytosolischem NADH schließen lässt. Diese können durch die Inhibierung nicht mehr der Atmungskette zugeführt werden und stehen der Zelle im Überschuss zur Verfügung. Als eine Alternative steht die Regeneration durch PMET zur Verfügung, wodurch das Messsignal zu erklären wäre. Für die Untersuchung der zytotoxischen Wirkung von Azid nennt Ishikawa die Messung des Gelöst‐Sauerstoffs als Analysewerkzeug der Wahl [Ishikawa et al. 2006]. Die Verläufe im pO2‐Signal unter Einwirkung von Azid unterscheiden sich dennoch stark von den Verläufen unter Einwirkung von Antimycin A. Dabei ist anzumerken, dass die Kontrollkultur in Abbildung 5‐17 kein exponentielles Wachstum zeigt. Ein Vergleich dieser Daten mit anderen Auswerteverfahren bzw. anderen pO2‐Verläufen ist damit zu vermeiden. Versuchswiederholungen haben kein reproduzierbares Ergebnis hervorbringen können. Die Kontrollkultur zeigte in allen Fällen kein Wachstum. Ein Einfluss der verwendeten Sensorplatte ist nicht auszuschließen und muss daher als Möglichkeit in Betracht gezogen werden, zumal die Literatur von einer Eignung der Sauerstoffmessung berichtet. Möglicherweise ist der Sensorspot ein Katalysator für die Reaktion von Azid zu einen flüchtigen, toxischen Produkt wie z.B. Stickstoffwasserstoffsäure und kann auf diesem Wege in die Kontrollkultur gelangen.

Aufgrund der erwarteten ähnlichen Auswirkungen der Komplex III bzw. IV Inhibierung auf das WST‐Signal ist ein Vergleich dieser Ergebnisse sinnvoll. Es bleibt allerdings anzumerken, dass der „WST‐peak“ lediglich unter Einwirkung von Azid zu beobachten war. Auch bei mehrmaliger Versuchswiederholung wurde im Proliferationsassay mit Antimycin A ein ähnliches Ergebnis wie in Abbildung 5‐21 erzielt. Eventuell hat hier die ROS Produktion eine größere Rolle. Veröffentlichungen

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zeigen, dass bei Inhibierung von Komplex III bzw. IV eine gesteigerte Radikalbildung festzustellen ist [Park et al. 2007]. Diese sind in der Lage eine chemische Formazanreduktion hervorzurufen und können damit das Messergebnis beeinflussen. In diesem Zusammenhang wird von einer Stimulation der WST‐1 Reduktion durch Azid gesprochen [Berridge et al. 2005]. Eine weitere Erklärung für das WST‐Signal liefern Kiss et al. Wird Komplex I gehemmt, so kann NADH in der OXPHOS nicht mehr regeneriert werden und es sollte sich ebenfalls ein solcher Verlauf durch den stillstehenden Citratzyklus bzw. das Malat‐Aspartat‐Shuttle zeigen. In diesem Fall konnten die Autoren nachweisen, dass in den Mitochondrien ein weiteres Enzym (DT‐Diaphorase) vorhanden ist, welches die Regeneration alternativ zu Komplex I übernehmen kann. Dabei greift es jedoch auf Cytochrom c und Quinole zurück [Kiss et al. 2014]. Wirkt ein Toxin folglich an beiden Stellen, der OXPHOS und dem Bypass, so dürfte sich ein niedriges NAD+/NADH‐Verhältnis einstellen. Azid kommt gemäß dem WST‐Signalverlauf als Kandidat in Frage.

0 100 200 300 400 500 6000,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,2

norm


. OUR [‐]

Konzentration Antimycin A [µmol/l]

A

0 100 200 300 400 500 6000,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

norm

. WST/norm

. OUR

Konzentration Malonat [µmol/l]

B

Abbildung 7-22: Vergleich von normiertem WST-8 Umsatz () mit normierte OUR () nach 24 h unter Einwirkung von Antimycin A auf CHO Zellen. Bild A: Normierte Werte mit Hüllkurve zur Fehlerdarstellung Bild B: Quotient der Kurvenzüge

Der Vergleich von der OUR und dem WST‐Signal zeigt bei Oligomycin A in Abbildung 7‐23 zwei relativ ähnliche Verläufe. Beide weisen eine Abnahme um 10 % bei Erhöhung der Konzentration von 1 auf 10 µM auf. Dabei ist die normierte OUR stets um einige Prozent geringer als die normierte WST‐Bildung.

Die durch Oligomycin inhibierte ATP‐Synthese wirkt sich im Konzentrationsbereich 1 bis 10 µM geringfügig auf den Sauerstoffverbrauch sowie den WST‐Umsatz aus. Dabei zeigt sich der Einfluss auf die OUR etwas deutlicher, was für folgende Versuche wichtig ist. Diese sollen klären in wie weit die ATP‐Bildung und der Glucose‐Verbrauch beeinträchtigt werden und ob Merkmale der Hypoxie nachzuweisen sind.

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0,0 2,5 5,0 7,5 10,00,00,10,20,30,40,50,60,70,80,91,01,11,2

norm


. OUR [‐]


A

0 2 4 6 8 100,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

norm

. WST/norm

. OUR


B

Abbildung 7-23: Vergleich von normiertem WST-8 Umsatz () mit normierte OUR () nach 24 h unter Einwirkung von Oligomycin A auf CHO Zellen. Bild A: Normierte Werte mit Hüllkurve zur Fehlerdarstellung Bild B: Quotient der Kurvenzüge

Die Entkopplung der Atmungskette von der protonengetriebenen ATP‐Produktion durch 2,4‐Dinitrophenol zeigt im Methodenvergleich (Abbildung 7‐24) die größten Unterschiede. Die Sauerstoffaufnahmerate liegt zum Teil ca. 40 % über der Kontrollkultur. Beide Kurven zeigen grundsätzlich unterschiedliches Verhalten. Während der WST‐8 Umsatz mit steigender Konzentration abnimmt, steigt die OUR zunächst an. Erst bei einer Konzentration von 6,5 mM sinkt sie wieder auf knapp 90 % ab. Die Formazan‐Bildung beträgt in diesem Punkt über 40 %.

Beide Verläufe können sich vermutlich durch die gesteigerte Stoffwechselleistung im Zusammenhang mit 2,4‐Dinitrophenol erklären. Nadanaciva et al. konnten eine Steigerung um 300 % im Sauerstoffbedarf bei HepG2 unter Einwirkung des Entkopplers FCCP im Konzentrationsbereich von 1 nM bis 1000 nM feststellen [Nadanaciva et al. 2012]. Der Abbau des Protonengradienten bedeutet für die Zelle eine geringere Versorgung mit ATP. Dies resultiert in einem Anstieg der ADP Konzentration, die den Sauerstoffbedarf der Zelle nach oben reguliert. Dass dabei scheinbar große Teile des Energiestoffwechsels genutzt werden, ist in dem WST‐8 Umsatz im Konzentrationsbereich von 6 nM bis 3 mM zu sehen. Dieser liegt bei über 40 % und damit deutlich höher als in Versuchen mit Malonat oder Oligomycin A (vgl. Abbildung 5‐13 und Abbildung 5‐18).

Unter Berücksichtigung der dreidimensionalen Auswertung aus Abbildung 5‐26 ist zu erkennen, dass die erhöhte Stoffwechselleistung nur in einem relativ kurzem Zeitraum möglich ist. Bei höheren Konzentrationen zeigt sich mit steigender Inkubationszeit eine deutliche Abnahme der Sauerstoffaufnahmerate, was auf vermehrt eintretenden Zelltod zurückzuführen ist. Es ist auch zu erkennen, dass Konzentrationen kleiner 0,3 mmol/l über eine längere Inkubationszeit keinen durch das SDR‐System messbaren Einfluss auf die Zellen besitzen. Nach 24 h liegt die normierte OUR bei fast 100 % und nimmt über die gesamte Inkubationsdauer nicht ab.

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0,1 1 100,0

0,5

1,0

1,5norm


. OUR [‐]


A

0,1 1 100,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

norm

. WST/norm

. OUR


B

Abbildung 7-24: Vergleich von normiertem WST-8 Umsatz () mit normierte OUR () nach 24 h unter Einwirkung von 2,4-Dinitrophenol auf CHO Zellen. Bild A: Normierte Werte mit Hüllkurve zur Fehlerdarstellung Bild B: Quotient der Kurvenzüge

7.4.2. Bestimmung des Todesmechanismus

Zum besseren Verständnis der zeitlichen Verläufe sind umfangreiche Untersuchungen zur Wirkung der Toxine durchgeführt worden. Dabei hat der Todesmechanismus im besonderen Fokus gestanden, um eine nicht letale Beeinflussung der Zellen in den Online‐Messdaten zu belegen. In Tabelle 7‐10 ist eine Übersicht der Testreihen im Muse Cell Analyzer dargestellt. Dabei sind mehrere Aspekte zu beachten. Eine Einteilung in positive und negative Färbung erfolgte nach im Ergebnisteil festgelegten Gates. Die Einordnung einer Kultur richtet sich nach deren Anteil an positiv gefärbten Zellen. Dabei wurde eine Abstufung in 50 %, 30 % und 10 % gewählt.

Für die Bewertung der Annexin V Färbung erfolgt eine kombinierte Auswertung mit einem Vital‐Farbstoff. Eine positive Färbung bei beiden Farbstoffen lässt nicht automatisch auf einen apoptotischen Zelltod schließen, da Annexin V bei perforierter Membran an der Innenseite an Phosphatidylserin binden kann. Die Betrachtung einer positiven Annexin Färbung bezieht sich daher nur auf Zellen, die gleichzeitig eine niedrige, unter dem festgelegten Schwellenwert liegende 7‐AAD Intensität zeigen. Ähnlich verhält es sich bei Bewertung des Mitochondrienpotentials. Hier ist lediglich der Zustand der Mitochondrien von vitalen Zellen von Interesse, weshalb ausschließlich Zellen mit intakter Zellmembran berücksichtigt werden. Bei Bestimmung der Caspase‐Aktivität sind auch Zellen von Interesse die bereits eine beschädigte Zellmembran aufweisen. Hier ist lediglich von Interesse, ob der Zelltod unter dem Einfluss von Caspasen steht. Die Betrachtung der Vitalität erlaubt allerdings Rückschlüsse auf das Apoptose Stadium zu ziehen. In sehr frühen Stadien ist eine intakte Zellmembran gegeben, die erst im weiteren Verlauf der Apoptose zunehmend an Integrität verliert. Aber auch durch Kombination der beiden Caspase Assays lassen sich Rückschlüsse auf verschiedene Stadien der Apoptose ziehen. Dabei wird ausgenutzt, dass in der frühen Phase der Apoptose lediglich Initiator‐ und Vermittlercaspasen aktiviert sind. Diese werden ausschließlich durch den Multicaspase Assay erfasst. Dahingegen wird im Caspase 3/7 Assay die Aktivität der Effektorcaspasen bestimmt, die in frühen Stadien noch inaktiviert sind. Eine gänzliche Perforation der Membran kann dennoch eine Signalabnahme bedeuten, wenn signalgebende Bestandteile ins Medium gelangen, und muss dementsprechend kritisch betrachtet werden (vgl. dazu 2.1.9).

Die Analysen, die am Durchflusszytometer vom Typ LSR I durchgeführt worden sind, können mit den Ergebnissen der Muse Kits verglichen werden. Von besonderem Interesse ist hierbei der Apoptosemarker YO‐PRO®‐1. Dieser ist aufgrund seiner Fluoreszenz‐Eigenschaften besonders für das Live Cell Imaging von Interesse. In der Literatur wird diesem Farbstoff eine Membrangängigkeit während der Apoptose zugeschrieben [Idziorek et al. 1995b]. In diesem Zusammenhang ist ein Vergleich der Annexin V Färbung und der Membrangängigkeit von YO‐PRO®‐1 von Bedeutung. Mit

DISKUSSION

‐Seite 180‐

Hilfe der in Tabelle 7‐10 dargestellten Ergebnisse soll versucht werden den zugrunde liegenden Todesmechanismus bei Einwirkung der jeweiligen Toxine zu ermitteln.

Tabelle 7-10: Übersicht der durchflusszytometrischen Assays Anteil positiv gefärbter Zellen: + > 10 %, ++ >30 %, +++ >50 % 1: Nur Betrachtung von Annexin V [+] und 7‐AAD [‐] 2: Kompletter Anteil an Casp. 3/7 [+] bzw. Multicaspase [+] 3:Nur Betrachtung von Depol. [+] und 7‐AAD [‐]

Toxin PS-Präsentation1 Effektor-Caspasen2

Initiator-Caspasen2

Mitochondrien Potential3

4 h 24 h 4 h 24 h 24 h 4 h 24 h

Rotenon 25 µM - + + + + + -

12 µM - - + - - + -

2 µM - - + + + - - Malonat 20 mM - - + - - +++ +++

10 mM - - + - - +++ +++

1 mM - - + - - +++ +++ Antimycin 550 µM - ++ + + + +++ +++

270 µM - - + + - +++ +++

137 µM - - + + - + + Azid 10 mM - - + ++ + + ++

100 µM - - + + - +++ +++

1µM - - + + - +++ +++ Oligomycin 8 µM - - + + + - -

2 µM - - ++ - - - -

0,8 µM - - - - - - - DNP 6,5 mM - - + + + +++ +++

1,3 mM - - - - - +++ +++

0,3 mM - - - + - +++ +++

Die Einwirkung von Rotenon zeigt mit Ausnahme von 25 µM zu 24 h keine Präsentation von Phosphatidylserin. Allerdings ist eine gesteigerte Aktivität der Caspasen zu verzeichnen. Das Mitochondrienpotential bleibt unter Einwirkung von Rotenon zu allen Zeitpunkten nahezu vollständig erhalten, was für intakte Mitochondrien spricht. Ergebnisse von Li et al. wie die gesteigerte Caspase‐3 Aktivität konnten ebenfalls nachgewiesen werden. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass die fast vollständige Abnahme der Zellatmung im SDR‐System nicht gezeigt werden konnte [Li et al. 2003]. Das kann, wie Betrachtungen in anderen Kapiteln gezeigt haben, abhängig von der Zelllinie durch weitere Orte des Sauerstoffverbrauchs (PMET) zu erklären sein. Die Aktivierung der Caspasen lässt auf einen apoptotischen Zelltod schließen, ohne dass eine Präsentation von PS erfolgt und eine Beteiligung der Mitochondrien zu messen ist.

Die Einwirkung von Malonat zeigt zu keinem Zeitpunkt eine positive Annexin V Färbung. Darüber hinaus ist nach 24 h keine Caspase‐Aktivität zu verzeichnen. Lediglich nach 4 h Einwirkdauer ist ein Anstieg der Effektorcaspasen zu beobachten. Deutlich zu erkennen ist, dass für alle Messungen der mitochondriale Protonengradient stark erniedrigt ist. Diese Beobachtung steht im Einklang mit Ergebnissen von Fernandez‐Gomez [Fernandez‐Gomez et al. 2005] und lassen eine weiter Implikation der Kalium‐Schwellung vermuten [Wojtovich und Brookes 2008]. Die Ergebnisse des Apoptosis Kit

DISKUSSION

‐Seite 181‐

gemessen mit dem LSR I stimmen dabei mit den Ergebnissen des Muse Cell Analyzer grundsätzlich überein.

Aufgrund der von Quinlan et al. beschriebenen erhöhten Produktion von Superoxid und Wasserstoffperoxid unter Malonateinfluss ist auch unter Berücksichtigung der hier dargestellten Ergebnisse von einem nekrotischen Zelltod auszugehen [Quinlan et al. 2012]. Dafür sprechen die fehlende Präsentation von PS sowie der, zumindest nach 24 h, Caspase‐unabhängige Zelltod. Auch der Verlust des Mitochondrienpotentials bei einem Großteil der Zellen spricht nach Assunção Guimarães und Linden für einen nekrotischen Tod [Assuncao Guimaraes und Linden 2004]. Die geringe Effektorcaspase‐Aktivität zu 4 h ist eventuell durch eine Kombination verschiedener Varianten wie der Nekroptose zu erklären. Möglich wäre ein anfänglich apoptotischer Zustand, der in einen nekrotischen Zelltod übergeht. Zu erklären ist das möglicherweise durch den ATP‐Gehalt der Zelle. Dieser kann anfangs noch ausreichend für eine Caspase‐Aktivierung sein. Im weiteren Verlauf bricht der ATP‐Gehalt aber ein und der Zelltod folgt dem nekrotischen Muster. Solche Vorgänge sind bspw. für Ionomycin, welches im weiteren Verlauf erläutert wird, beschrieben worden [Gwag et al. 1999].

Antimycin A bewirkt in einer Konzentration von 550 µM bei 24‐stündiger Inkubationszeit eine sehr starke Präsentation von Phosphatidylserin. Eine Verringerung der Konzentration ist einer drastischen Reduktion der Annexin V Färbung gleichgesetzt. Zu jedem Zeitpunkt ist eine Beteiligung von Effektorcaspasen zu beobachten. Allerdings stehen dem die Ergebnisse der MultiCaspase Messung gegenüber. Zum Zeitpunkt 24 h ist eine positive Färbung für Caspase 3/7 zu sehen, während die Färbung auf alle Caspasen negativ bleibt. Da dieser Assay die Aktivität aller Caspasen anzeigen sollte, könnte man annehmen, dass durch das zu erwartende deutlich höhere Signal, die Auflösung im niedrigen Bereich schlechter ist. Denn der Nachweis von Capsase‐3 deckt sich mit der Literatur. So haben Park et al. eine Beteiligung von Caspase‐3 am Antimycin A induzierten Zelltod gezeigt [Park et al. 2007]. Der von Löffler et al. beschriebene verminderte Protonengradient kann zu beiden Zeitpunkten nachgewiesen werden [Löffler und Schölmerich 2008]. Dabei ist zu beobachten, dass die Anzahl an Zellen mit intaktem Mitochondrienpotential bei Reduktion der Antimycin A Konzentration zunimmt. Zusammenfassend kann vor allem für die Konzentration 550 µM von einem apoptotischen Zelltod ausgegangen werden. Aber auch bei geringerer Konzentration lässt sich aufgrund der gesteigerten Effektorcaspasen Aktivität auf diesen Todesmechanismus schließen.

Die Inhibierung des Komplex IV durch Azid äußert sich in einer erhöhten bis starken Beteiligung der Apoptose Proteasen. Dabei bleibt allerdings die Präsentation von Phosphatidylserin aus. Ebenso zeigen sich teilweise starke Auswirkungen auf das Mitochondrienpotential. Sato et al. können unter Azid Einwirkung sowohl einen nekrotischen als auch einen apoptotischen Zelltod feststellen [Sato et al. 2008]. Die hier vorliegenden Messergebnisse sprechen allerdings für letztere Variante. Die Ergebnisse der am LSR Zytometer durchgeführten Apoptose‐Messungen stimmen mit jenen des Muse Cell Analyzers überein. In Abbildung 5‐28 ist ebenfalls eine verstärkte Annexin‐Färbung sowie eine erhöhte Permeabilität des Vitalitätsmarkers Sytox Green zu erkennen.

Die Unterbindung der ATP‐Synthese durch Oligomycin äußert sich vor allem durch das Aufrechterhalten des mitochondrialen Protonengradienten. Die Färbung mit Annexin V bleibt aus. Allerdings ist zum Zeitpunkt 4 h bei 2 µM eine starke Färbung auf Effektorcaspasen zu verzeichnen. Unter Berücksichtigung der Beobachtungen von Leist et al. kann angenommen werden, dass CHO Zellen durch eine gesteigerte Glykolyse‐Leistung den intrazellulären Mangel an ATP ausgleichen können [Leist 1997]. Die dadurch hervorgerufene intrazelluläre Ansäuerung kann zur Azidose führen und nach Höffeler ein Auslöser für Apoptose sein [Höffeler 2004]. Leist et al. führen dahingegen einen nekrotischen Zelltod durch Oligomycin an und setzen diesen in Zusammenhang mit einem niedrigen ATP‐Gehalt [Leist 1997].

Die entkoppelnde Wirkung von 2,4‐Dinitrophenol zeigt sich wie zu erwarten besonders im Mitochondrienpotential. Dieses ist in jeder Messung stark erniedrigt und indiziert eine erfolgreiche

DISKUSSION

‐Seite 182‐

Entkopplung. Es findet zudem keine positive Färbung mit Annexin V statt und auch Caspasen werden nur in geringem Maße aktiviert. Dies widerspricht den Ergebnissen von Han et al., die unter Einfluss von 2,4‐Dinitrophenol von einer Phosphatidylserin‐Präsentation und Caspase‐9 Aktivierung sprechen [Han et al. 2008]. Denkbar ist ein Zelllinien‐abhängiges Verhalten.

7.4.3. Induktion von ROS durch Kupfer

Bei Kupfer handelt es sich um ein Spurenelement, welches bei erhöhter Dosierung letale Folgen auf Zellen hat. Dabei scheint die toxische Wirkung durch viele Eingriffe in den Metabolismus erzeugt zu werden. Es wird insbesondere häufig angeführt, dass eine erhöhte ROS‐Bildung zu beobachten ist, da Redox‐Vorgänge gestört werden oder Signalkaskaden nicht korrekt ablaufen können [Gaetke 2003]. Der gemessene WST‐Verlauf zeigt, dass bereits Konzentrationen um die 0,1 mM Kufperchlorid‐Dihydrat (entspricht ca. 0,037 mM Cu2+) einen merklichen Einfluss, der im Bereich der LC50 liegt, haben. Bei einer Konzentration von 0,5 mM Kupferchlorid ist keine Stoffwechselleistung mehr nachweisbar. Aus den SDR‐Messungen kann zu diesen Toxin‐Konzentrationen entsprechend eine ACRges und OURges berechnet werden. Diese Werte werden auf Grund der geringen Zelldichte nicht wie in Kapitel 7.2 auf die Zellzahl bezogen. Die OURges der Kontrolle zeigt eine Zunahme über die Zeit, was in der Zellteilung und zunehmenden Zahl an Verbrauchern begründet ist. Mit steigender Kupfer‐Konzentration nimmt die OURges tendenziell stärker ab, wodurch die Erwartung erfüllt wird.

Abbildung 7-25: Kombinierte Auftragung der abgeleiteten Daten für den Kupferchlorid-Toxizitätstest nach 24 h. Die jeweiligen Punkte entsprechen den Konzentrationen gemäß ihrer Beschriftung. Die gestrichelte Linie verbindet den Nullpunkt mit dem Kontrollwert. Bild oben links A: WST-Umsatz gegen die Ansäuerungsrate Bild oben rechts B: OUR gegen ACR Bild unten links C: WST-Umsatz gegen OUR

Die Interpretation der Daten ist anschaulicher, wenn diese zu einem festen Zeitpunkt gegeneinander aufgetragen und die Koordinaten der Kontrolle mit dem Nullpunkt verbunden werden. Gemäß der Arbeitshypothese müsste eine reine Reduktion der Zellzahl ohne Einfluss auf den Metabolismus zu

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6‐9,0

‐6,0

‐3,0

0,0

3,0

6,0

9,0Kontrolle

0,35mM

0,7 mM

2 mM

4,1 mM

cH

+/t [pmol/l*h]

Absorption=450 nm [‐]

AA

0 1000 2000 3000‐9,0

‐6,0

‐3,0

0,0

3,0

6,0

9,0 Kontrolle

0,35mM

0,7 mM

2 mM

4,1 mM

c H

+/t [pmol/l*h]

OURt=24 h

[mmol/l*h]

B

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,60

1000

2000

3000

Kontrolle

0,35mM0,7 mM

2 mM4,1 mMO

URt=24 h [mmol/l*h]


C

DISKUSSION

‐Seite 183‐

einer Verringerung der Werte mit konstantem Verhältnis ‐ also entlang dieser Linie ‐ erfolgen. Für die Ansäuerungsrate ist dies allerdings nur in linearer Abhängigkeit der Pufferkapazität zulässig.

In Abbildung 7‐25 A und B fällt auf, dass mit zunehmender Kupfer‐Konzentration eine überproportionale Abnahme der ACRges gegenüber der OURges und dem WST‐Umsatz auftritt. Demgegenüber sinkt die OURges im Vergleich zum WST‐Assay unterproportional (Abbildung 7‐25 C). In Kapitel 7.2 ist eine negative ACR mit Glucose‐Verknappung bzw. Laktat‐Verbrauch in Beziehung gesetzt worden. In der Literatur wird die Hauptwirkung von Kupfer über die Fenton‐Reaktion diskutiert [Gaetke 2003]. Durch das sich ändernde Redox‐Potential wird die ROS‐Bildung begünstigt. Neuere Quellen berichten von der Inhibierung von Tyrosin‐Phosphatasen, welche wichtige regulatorische Aufgaben im Metabolismus besitzen [Wang et al. 2010]. Es ist zu lesen, dass diese Tyrosin‐Phosphorylierung für Tumor‐Zellen entscheidend ist, die NAD+/NADH‐Homöostase aufrecht zu erhalten [Fan et al. 2011]. Sehr interessant sind dazu die Arbeiten von Bryson und White, die zeigen, dass die Tyrosin‐Phosphorylierung in die Signal‐Kaskade der Glucose‐Verarmung involviert ist. Durch das Signal der Glucose‐Verarmung im Medium folge demnach eine verstärkte ROS‐Bildung, welche wiederrum die Tyrosin‐Phosphatase inhibiere. Durch die dazu in Gang gesetzt Kaskade käme es zum Zelltod [Bryson und White 2012]. Dieser Interpretation zur Folge imitiert Kupfer ab einer gewissen Konzentration eine essentielle Nährstoffverarmung, da es durch übermäßige ROS‐Bildung die gleichen Sensoren der Zelle anspricht.

7.4.4. Kobalt‐abhängige Hypoxie

Im weiteren Verlauf sind Arbeiten mit Kobaltchlorid durchgeführt worden. Von diesem ist bekannt, dass es zur Auslösung einer Chemo‐Hypoxie verwendet wird (siehe Kapitel 2.1.6 und 2.3.3). Hierin involviert ist eine (weitere) Trunkierung des Citratzyklus sowie Stabilisierung von HIF1‐α [Gong et al. 2001]. Betrachtet man dazu den WST‐Verlauf, so stellt sich erneut der Dosis‐Wirkungszusammenhang her. In diesem Fall ist der Dosis‐Wirkungsverlauf deutlicher als bei Kupfer. Allerdings ist die LC100 in diesem Diagramm nicht vertreten. Der Sauerstoffverbrauch der Kontrolle steigt stetig und verdoppelt sich gemäß Wachstumsrate etwa alle 24 h. Mit Zugabe von Kobalt ist ein genereller Rückgang der OURges im Vergleich zur Kontrolle festzustellen. Allerdings lässt sich dies über die Konzentrationen in zwei Gruppen unterteilen. Während bei den zwei niedrigsten Konzentrationen eine Zunahme über die Zeit zu verzeichnen ist, nimmt die OURges bei den nächsthöheren Konzentrationen kontinuierlich ab. Noch auffälliger stellt sich die ACRges dar. Die Kontrolle zeigt über die Zeit eine zunehmende Ansäuerung. Diese wird von den Kobalt‐Kulturen übertroffen; im Falle der 0,14 mM Kultur bis zu einem Faktor von 2,5.

Stellt man die Änderungen der einzelnen Messgrößen gemäß Abbildung 7‐26 A‐C gegenüber, so wird dieses Phänomen verdeutlicht. Während sich das WST‐Signal zunächst vernachlässigbar ändert, zeigt die Ansäuerungsrate einen Sprung in positive Richtung. In der Folge sinkt zwar das WST‐Signal, die ACRges verbleibt jedoch auf diesem überproportionalen Niveau. Erst mit den höchsten Konzentrationen kehrt der Verlauf auf die Proportionalitätslinie zurück. Die Zunahme der ACRges bedingt eine leichte Abnahme der OURges, die ebenfalls zunächst eher moderat verläuft und hin zu den höheren Konzentrationen ebenfalls auf die Proportionalitätslinie zurückkehrt. Während also bei der geringsten Kobalt‐Konzentration eine merkliche Abnahme der OURges zu beobachten ist, sinkt der WST‐Umsatz marginal. Mit weiterer Erhöhung der Konzentration wird die Proportionalitätslinie geschnitten und das WST Signal sinkt überdurchschnittlich im Vergleich zum Sauerstoffverbrauch. Prinzipiell könnte man die starke Zunahme vor dem Hintergrund der bereits diskutierten Wachstumskurven als Indiz für eine intensivierte Laktat‐Produktion interpretieren. Die verringerte Einschleusung in den Citratzyklus reduziert in der Folge den Sauerstoffverbrauch. Postuliert man die Zunahme der Hypoxie mit steigender Kobalt‐Konzentration, tritt eine dadurch verursachte Azidose als letale Folge in den Fokus. Dennoch sind sekundäre Effekte nicht auszuschließen. Battaglia et al berichten bspw. von Kobalt‐induzierter ROS‐Bildung [Battaglia et al. 2009]. Vengellur bemerken

DISKUSSION

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darüber hinaus die Aktivierung von Caspase‐3, was sie mit einer starken HIF1‐α Aktivierung in Verbindung bringen [Vengellur 2004]. Je nach Zelle wird auch der nekrotische Zelltod durch ATP‐Verarmung beobachtet. Es wird ferner angeführt, dass die Toxizität von Kobalt verzögert auftritt, da sich die Zelle für eine gewisse Zeit durch Chaperon‐Expression anpassen kann [Karovic et al. 2007].

Abbildung 7-26: Kombinierte Auftragung der abgeleiteten Daten des Kobaltchlorid-Toxizitätstests. Die jeweiligen Punkte entsprechen den Konzentrationen gemäß ihrer Beschriftung in mM. Die gestrichelte Linie verbindet den Nullpunkt mit dem Kontrollwert. Bild oben links A: WST-Umsatz gegen die Ansäuerungsrate Bild oben rechts B: OUR gegen ACR Bild unten links C: WST-Umsatz gegen OUR

7.4.5. PCD‐abhängige Hypoxie

Der Warburg‐Effekt wird von einigen Autoren als Überlebensstrategie solider Tumore gesehen (siehe Kapitel 2.1.10). Den größten Nutzen dürften sie in einer frühen Phase ihrer Entstehung haben, solange noch keine Angiogenese eingesetzt hat und somit die Sauerstoffversorgung im Kern des soliden Tumors limitierend ist [Feron 2009; Cairns et al. 2011]. Es wird angenommen, dass diese hypoxischen Zellen vornehmlich Glucose zu Laktat verstoffwechseln und dieses über MCT4 aus der Zelle ausschleusen. Das überschüssige Laktat kann von den äußeren Zellen, welche besser mit Sauerstoff versorgt sind, über MCT1 in die Zelle aufgenommen und über die OXPHOS zur Energiegewinnung genutzt werden [Feron 2009; Hussien und Brooks 2011]. Für den Tumor scheint dies überlebenswichtig. Eine Inhibierung der MCT’s führt zu einer Abnahme des Tumorvolumens oder gar zum Absterben dieses [Parks et al. 2011]. So hat die MCT1‐Inhibierung den Zelltod im Kern des Tumors zu Folge [Hussien und Brooks 2011].

Um dieses Verhalten als Modell nachzustellen, sind CHO‐ und PAC‐Zellen in Konzentrationen über drei Zehnerpotenzen in Multiwell Platten ausgesät worden. Die Zelldichte ist auf Grundlage der erstellten Wachstumskurven so ausgelegt worden, dass eine Kultur von Beginn an stark sauerstofflimitiert (LZZ >> PCD) ist, eine weitere innerhalb der Kulturdauer rechnerisch in diese

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,60

2

4

6

Kontrolle

0,040,14

0,37

0,7 c H

+/t [pmol/l*h]


A

0 1000 2000 30000

2

4

6

Kontrolle

0,04

0,14

0,37

0,7

c H

+/t [pmol/l*h]

OURt=24 h

[mmol/l*h]

B

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,60

1000

2000

3000

Kontrolle

0,04 0,14 0,37

0,7

OURt=24 h [mmol/l*h]


C

DISKUSSION

‐Seite 185‐

Limitierung (Dichte im Bereich PCD) laufen sollte und die Dritte deutlich von diesem Bereich fern bleibt (Dichte << PCD). Aus den erhaltenen Daten ist die OURges bzw. ACRges berechnet worden, welche durch Bezug auf die Startzellzahl als gemittelte OURZelle bzw. ACRZelle vorliegen.

Im Falle von CHO veranschaulicht das Ergebnis, dass die Kultur mit der höchsten Zelldichte sich in der Sauerstofflimitierung befindet (vgl. Abbildung 7‐27 A). Das zeigt sich zum einen darin, dass kein Sauerstoff mehr messbar ist und somit die mittlere Sauerstoffaufnahme OURZelle sehr geringe Werte annimmt. Zum anderen steigt die ACRZelle deutlich und erreicht nach 10 h ein Maximum. Bis zum Ende der Kultivierung erreicht die ACRZelle das Niveau der anderen Kulturen. Die massive Ansäuerung lässt den Schluss zu, dass ein hohes Maß an Energie über die Glykolyse bereitgestellt wird. Ein Einsatz der OXPHOS ist aber ebenso zu beobachten, sonst wäre die Kultur nicht in der Sauerstofflimitierung. Der Sauerstoffverbrauch kann durch alle Zellen im Mittel verbraucht worden sein. Oder auf Grund der hohen Zelldichte ist es zu Sauerstoff‐diffusionslimitierten Multilayern gekommen. Letzteres scheint wahrscheinlich, da CHO bereits im Bereich der PCD teilweise übereinander wachsen.

Mit abnehmender Zelldichte ist zu erkennen, dass die Ansäuerung über etwa 20 h konstant bleibt während die OURZelle um den Faktor 2 zunimmt. Dann jedoch zeigt sich ein Wendepunkt. In weiteren ca. 25 h nimmt der gemittelte Sauerstoffverbrauch nur noch unwesentlich zu, wobei sich die Ansäuerungsrate in etwa Verfünffacht. Setzt man voraus, dass die CHO Zellen unter Sauerstofflimitierung nahe µmax wachsen, so hätten im Schnitt über diese Kulturdauer 3‐Teilungszyklen pro Zelle erfolgen können. Bei einer anfänglichen Zellzahl von etwa 400.000 1/ml ergäben das 3.200.000 1/ml. Also etwa doppelt so hoch wie die PCD der zugehörigen Wachstumskurve, die jedoch mit einer wesentlich geringeren Zelldichte gestartet war. Diese hypothetisch erreichte Zelldichte misst in etwa 80 % der Anfangszelldichte des maximal konzentrierten Versuchs. Vergleicht man die OURges so ist zu erkennen, dass sich diese asymptotisch einem Wert von etwa 7 mmol/l·h zu nähern scheint und somit unterhalb der extremen Sauerstofflimitierung bleibt. Möglicher Weise existieren zelluläre Sensoren, die ab einer gewissen Sauerstoffsättigung eine Änderung des Metabolismus bewirken. Alternativ kann ein essentieller Nährstoff verbraucht sein und in die Limitierung führen. Postuliert man ausgehend von der

Startzellzahl drei Teilungen je Zelle, so ergibt sich in 45 h eine ACD von 8·107 h·Zelle/ml. Vergleicht man diese hypothetische ACD mit der Wachstumskurve und nimmt als obere Grenze zur Berechnung der Vergleichs‐ACD, den Zeitpunkt des Übergangs in die Glucose‐Limitierung, so ergibt sich eine um den Faktor 4 geringere ACD (2 ∙ 10 h·Zelle/ml). Somit ist die postulierte Zellkonzentration zu hoch angesetzt und eine Beeinflussung des Metabolismus mit sinkender Wachstumsgeschwindigkeit wahrscheinlich. Ähnliches konnte durch Lin und Miller gezeigt werden [Lin und Miller 1992]. Wird die Zellkonzentration um eine weitere Zehnerpotenz reduziert, so zeigt sich die höchste Sauerstoffaufnahmerate pro Zelle. Auffällig dahingegen ist, dass die ACRZelle deutlich erhöht ist. Betrachtet man die absolute ACR, so zeigt sich allerdings kaum eine Änderung über die Zeit, sodass die berechneten Änderungen pro Zelle durch stochastische Schwankungen auf Grund der Messungenauigkeit zu erklären ist.

Wird derselbe Versuch mit PAC durchgeführt so zeigt sich, dass die Sauerstoffaufnahmerate der höchsten Konzentration deutlich hinter denen der CHO‐Zellen zurückbleibt (vgl. Abbildung 7‐27 A). Dem nicht genug ist die höchste gewählte Konzentration bereits ein Problem, wie an der über die Zeit sinkenden OURges zu erkennen ist. Mit einer Reduzierung der Zellzahl geht auch eine Verringerung der OUR einher. Die absoluten Ansäuerungsraten sind für alle drei Kulturen gering, so dass sich die berechneten Schwankungen erneut über die Messungenauigkeit zu erklären sind.

DISKUSSION

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Abbildung 7-27: Auftragung der auf die Startzellzahl normierten OUR und ACR für Bild A: CHO Zellen und Bild B: PAC. Die Datenbeschriftung zeigt die Prozesszeit.

Zusammenfassend zeigt dieser Versuch die Auswirkung der Zelldichte auf den Metabolismus und die Kapazität der jeweiligen Zelle damit umzugehen. CHO‐Zellen verhalten sich demnach wie in den Kapiteln 2.1.10 und 2.1.11 beschrieben. Der Sauerstoffverbrauch geht erst nach 30 h zusammen mit der ACR messbar zurück. Die Hochzelldichte‐Kultivierung von CHO‐Zellen wird seit Jahren genutzt und ist dementsprechend bekannt. Allerdings werden hierbei meist Perfusionsverfahren angewandt [Gray et al. 1996; Clincke et al. 2013]. PAC Zellen stellen gemäß der Erwartung das Gegenteil dar. Zu hohe wie zu niedrige Zelldichten führen zu einer schnellen Abnahme der OUR, was in diesem Fall als Rückgang der vitalen Zellen aufzufassen ist.

7.4.6. Störung der Calcium‐Homöostase

Ionomycin gehört zur Gruppe der Ionophore und ist in der Lage Calcium über die Zellmembran bzw. allgemein über biologische Membranen zu transportieren. Somit beeinflusst es die Calcium‐Homöostase der Zellen [Gwag et al. 1999]. Die Zelle ist bestrebt einen gewissen Calcium‐Spiegel aufrecht zu erhalten, was in Form der Calcium‐ATPase ein ATP‐verbrauchender Prozess ist. So wird ein nicht unerheblicher Teil der produzierten Energie in die Ausschleusung dieses Ions investiert. Währen im Zytosol ungebundenes Calcium im Bereich von 100 nM vorliegt, finden sich im extrazellulären Raum Konzentrationen im mM‐Maßstab. Darüber hinaus ist Calcium in der Lage Phosphat zu binden, was deren Verfügbarkeit für die ATP‐Bildung mindert. Daher wird schnell ersichtlich, dass Ca2+ der Zelle als Sensor dienen kann [Clapham 2007]. Die Anwendung einer Substanz, die konzentrationsabhängig diesen Sensor anspricht, sollte sich so auch im Stoffwechsel

0 1 2 3 4 5‐1,5

‐1,0

‐0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

47

101420

30

454

7

10 14 2030

45

4

7

1014

20

3045

cH

+/t*Xges,t=0 [fmol/Zelle x h]

qO

2, X

t=0

[pmol/Zelle x h]

A

0 2 4 6 8‐1,5

‐1,0

‐0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

47

4 7 4

7

10

14

20

3045

c H

+/t*Xges,t=0 [fm

ol/Zelle x h]

qO

2, X

t=0

[pmol/Zelle x h]

B

DISKUSSION

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bemerkbar machen. Betrachtet man zunächst den WST‐Verlauf so fällt auf, dass im Kontrast zu den bisherigen Ergebnissen eine Erhöhung des WST‐Signals mit den niedrigsten Ionomycin‐Konzentrationen über die Kontrolle zu beobachten ist. Mit weiterer Erhöhung der Konzentration sinkt das WST‐Signal gemäß den bisherigen Dosis‐Wirkungs‐Zusammenhängen. Ähnlich verhält sich die ACRges, wobei die Kontrolle nicht wesentlich übertroffen wird. Deutlicher ist die OURges. Über die Zeit ist eine Zunahme in allen Konzentrationen zu bemerken, die sich in der absoluten Höhe unterscheiden. Bezogen auf den Kontrolllauf ist nach 5 h eine Abnahme der OURges zu bemerken. Dies gilt allerdings nur für Kulturen mit Konzentrationen größer als 0,2 µM Ionomycin. Die Verläufe der Kultur mit 0,1 µM Ionomycin zeigen eine nahezu stetig erhöhte OURges. Nimmt man die Werte zu etwa 24 h und trägt diese gemäß Abbildung 7‐28 auf, so ist erneut eine Abkehr von den Proportionalitätslinien zu erkennen. Vergleicht man das WST‐Signal mit der Ansäuerungsrate zeigt sich, dass die Proportionalität zunächst eingehalten wird. Mit steigender Konzentration sinkt die Ansäuerung im Intervall um 24 h zunehmend. Die WST‐Absorption steigt, um dann ebenfalls entsprechend stark zu sinken, was in einer Parallelverschiebung zur Proportionalitätslinie resultiert. Dem recht ähnlich verhält sich die OURges gegenüber der Ansäuerungsrate. Während Letztere fällt, steigt der Sauerstoffverbrauch an, um dann ebenfalls stark zu sinken, was ebenfalls in der bereits genannten Parallelverschiebung zu erkennen ist. Die Auftragung von OURges gegen die WST‐Absorption, folgt am ehesten dieser Proportionalitätsbedingung. Eine Ausnahme hiervon bildet der Versuch mit 0,1 µM Ionomycin, der eine Abnahme des WST bei Zunahme des Sauerstoffverbrauchs zeigt. Hin zu den höchsten Konzentrationen nimmt das WST‐Signal überproportional ab.

Durch die Zunahme des Ionomycins kann postuliert werden, dass es zu einem dazu proportionalen Influx von Calcium in die Zelle kommt. Dieses Calcium kann über das Zytoplasma in die Mitochondrien gelangen und die dortigen Ca2+‐abhängigen Dehydrogenasen beeinflussen (siehe ebenfalls Kapitel 2.1.2 und Abbildung 2‐4), sodass es zu einem erhöhten Fluss durch den Citratzyklus kommt und die ATP‐Bildung steigert [Clapham 2007]. Dabei begründet sich die Intensivierung nicht ausschließlich über Pyruvat, sondern steht ebenfalls in Zusammenhang mit einer Calcium‐Aktivierung von Enzymen, die in das Malat‐Aspartat‐Shuttle involviert sind [Contreras et al. 2006]. Das lässt den Schluss zu, dass ein höheres Maß der NADH‐Regenerierung erforderlich ist und in der Folge mehr Sauerstoff verbraucht werden müsste, was den Messdaten entnommen werden kann. Setzt man den Fluss durch die Glykolyse als konstant an, so sollte weniger Pyruvat zur Bildung von Laktat zur Verfügung stehen und auf Grund des gesteigerten Regenerationspotentials der OXPHOS auch nicht benötigt werden. Ein höherer Fluss durch den Citratzyklus stellt das Gegenteil des Kobalt‐Versuchs dar, was sich beispielsweise in den Ansäuerungsraten verdeutlicht. Durch den erhöhten Stoffumsatz und ATP‐Produktion könnten Sensoren der Zelle aktiviert werden, welche eine Apoptose‐Kaskade auslösen [Lasorsa 2003; Zamaraeva et al. 2005; Glancy und Balaban 2012]. Bei weiterer Erhöhung wäre es denkbar, dass die anorganische Chemie greift und Calcium direkt mit freien Phosphatresten reagiert und so die ATP‐Regeneration ineffizient wird.

DISKUSSION

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Abbildung 7-28: Kombinierte Auftragung der abgeleiteten Daten des Ionomycin-Toxizitätstests für L929. Die jeweiligen Punkte entsprechen den Konzentrationen gemäß ihrer Beschriftung in µM. Die gestrichelte Linie verbindet den Nullpunkt mit dem Kontrollwert. Bild oben links A: WST-Umsatz gegen die Ansäuerungsrate Bild oben rechts: OUR gegen ACR Bild unten links C: WST-Umsatz gegen OUR

CHO Zellen zeigen einen ähnlichen Verlauf wie L929, allerdings ist das anfängliche Übersteigen der Kontrolle (ZKII) wesentlich stärker ausgeprägt (vgl. Abbildung 7‐29). Durch die Konzentrationsabhängigkeit des Ionomycins gegenüber der ATP‐Verfügbarkeit folgt die Hypothese, dass hierdurch indirekt ein Unterschied im Zelltodesmechanismus provoziert werden kann. Dazu sind Messungen am Durchflusszytometer mit Propidiumjodid und YO‐PRO®‐1 durchgeführt worden. Diese Versuche fanden sowohl mit L929 als auch CHO‐Zellen statt. Das durchflusszytometrische Ergebnis ist gemäß der Fluoreszenzintensitäten in vier Populationen unterteilt worden, die der Tabelle 5‐43 entnommen werden können. Sowohl für CHO wie auch L929 Zellen ist eine Korrelationen von niedriger Ionomycin‐Dosis mit erhöhten Apoptose‐Anteilen zu erkennen. Dagegen führt eine hohe Ionomycin‐Konzentration zu einem isolierten Ansprechen von PJ als Attribut der Nekrose. Dieses differenzierte, von der Konzentration abhängige Verhalten ist in der Literatur bereits für Ionomycin beschrieben worden [Gwag et al. 1999].

Es fällt ferner auf, dass die apoptotischen Anteile bei CHO größer sind und bereits die Kontrolle eine merkliche „apoptotische“ Fraktion zeigt. Dieses Verhalten für CHO‐Zellen ist bereits in früheren Kapiteln mit Anoikis in Verbindung gebracht worden. Gemäß Kapitel 2.1.9 handelt es sich um einen Caspase‐abhängigen Mechanismus, der seine Ursache im vorrübergehenden Kontaktverlust zu einer Matrix hat. Somit ergeben sich zwei unterschiedliche Auslöser, welche eine ähnliche Kaskade in Gang setzen. Daher liegt es nahe, dass die resultierenden Veränderungen mit YO‐PRO®‐1 zu detektieren aber nicht zu differenzieren sind.

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8‐9

‐6

‐3

0

3

6

9Kontrolle

0,1

0,22

510

c H

+/t [pmol/l*h]


A

0 1000 2000 3000‐9

‐6

‐3

0

3

6

9 Kontrolle

0,1

0,22

510

c H

+/t [pmol/l*h]

OURt=24 h

[mmol/l*h]

B

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,80

1000

2000

3000

Kontrolle

0,10,2

25

10



C

DISKUSSION

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0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,20

1000

2000

3000

Kontrolle

0,10,2

2

5

10



Abbildung 7-29: Kombinierte Auftragung des WST-Umsatzes gegen die OUR-Daten des Ionomycin-Toxizitätstests für CHO. Die jeweiligen Punkte entsprechen den Konzentrationen gemäß ihrer Beschriftung in µM. Die gestrichelte Linie verbindet den Nullpunkt mit dem Kontrollwert.

7.4.7. C‐Quellen Variation und gehemmte OXPHOS

Das Atmungsketten‐Toxin Oligomycin eignet sich gemäß den gezeigten Daten zur Aufklärung von Stoffwechselwegen. Dazu sind Kulturen sowohl in einem vollwertigen DMEM/F‐12, als auch einem Mangel‐DMEM angesetzt worden. Diesem Mangelmedium kann eine alternative C‐Quelle wie Pyruvat oder Laktat zugesetzt werden, um die Glykolyse zu umgehen. Wie bereits gezeigt, kann Oligomycin dazu genutzt werden, die oxidative Phosphorylierung zu inhibieren ohne automatisch den Zelltod herbeizuführen. Tabelle 7‐11 stellt die verwendeten Medien und resultierenden Stoffwechselwege dar.

Nimmt man dies zusammen, so kann man über das Sauerstoffsignal und die pH‐Wertmessung die Stoffwechsellage bewerten. Letztere sind trotz Versuchswiederholung aus messtechnischen Gründen nicht verfügbar. Somit steht ausschließlich das Sauerstoffsignal zur Bewertung zur Verfügung. Dabei wird eine konstante Zunahme der OUR über 24 h (Faktor 1,5‐2,5) als Zellproliferation, eine Abnahme als Zelltod und Konstanz als stationäre Zellzahl gewertet. Aus der dosierten C‐Quelle lässt sich gemäß Kapitel 2.1.1 und 2.1.2 die Möglichkeit zur Glykolyse ableiten. Die Bewertung für das Maß der OXPHOS folgt aus der Differenz der Hemmung mit Oligomycin und der Kontrollkultur.

Tabelle 7-11: Auswertung der Stoffwechselwege nach C-Quellensupplementierung. Hierbei ist die Glykolyse ausschließlich nach der theoretischen Möglichkeit bewertet worden

C-Quelle Glykolyse OXPHOS WachstumGlc + Pyr + Gln Ja +++ ++ Glc + Pyr Ja ++ + Lac + Gln Nein + 0 Pyr + Gln Nein +++ 0 Lac Nein ++ 0 Keine Nein 0 -

Im Vollmedium sind sämtliche Stoffwechselwege verfügbar und führen wie gezeigt zur Zellproliferation. Wird dem Vollmedium das Glutamin entzogen, so wirkt sich das negativ in der OUR und im Wachstumspotential aus. Für den Glutamin‐Entzug wäre gemäß mehrerer Quellen zu erwarten, dass ein solcher nach einigen Stunden zum Zelltod führt, da die Trunkierung des Citratzyklus ohne Glutamin nicht umgangen werden kann [Newsholme et al. 1999; Newsholme 2001; Chang et al. 2002; Reynolds et al. 2013]. Allerdings gibt es hiervon Ausnahmen, wie auch durch die

DISKUSSION

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Arbeiten von Dyring et al. bestärkt wird [Dyring et al. 1994]. Es hat nicht den Anschein als würde die Kultur sterben, da sich der Sauerstoffverbrauch nach 24 h noch deutlich von der mit Oligomycin gehemmten Kultur unterscheidet. Eine Beeinflussung durch Serum kann ausgeschlossen werden, da es innerhalb dieses Versuchs keine Anwendung gefunden hat.

Werden CHO‐Zellen ohne jegliche C‐Quelle kultiviert so zeigt sich deutlich, dass die Atmungskette zum Erliegen kommt. Es ist kein Unterschied zwischen den Versuchen mit und ohne Oligomycin auszumachen. Interessant ist der Unterschied zwischen den Endprodukten der Glykolyse. Wie in Kapitel 2.1 dargelegt, ist die Glykolyse für die Bereitstellung wichtiger Intermediate für die Zell‐Proliferation bedeutend. Insofern entspricht es der Erwartung bei inaktiver Glykolyse kein Wachstum zu beobachten. Der Sauerstoffverbrauch der Kultur mit Pyruvat und Glutamin ist den Anfangswerten des Vollmediums sehr ähnlich. Aus reaktionskinetischer Sicht ist das nachvollziehbar, wenn in beiden Fällen die Bereitstellung gleich schnell bzw. so schnell abläuft, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt die Einschleusung in den Citratzyklus ist und nicht die Bereitstellung des Pyruvats. Insbesondere auf Grundlage dieser Betrachtung ist der Unterschied der beiden Laktat Versuche diskussionswürdig. Damit Laktat aus dem extrazellulären Raum ins Zytosol gelangen und als Pyruvat in den Citratzyklus eingespeist werden kann, sind zwei enzymatische Reaktionen notwendig. Zum einen muss Laktat über MCT‐4 als Symport mit Protonen in die Zelle transportiert und dort durch die Laktat‐Dehydrogenase mit NAD+ in Pyruvat und NADH umgesetzt werden. Pyruvat wird ebenfalls über MCT‐Enzyme transportiert, jedoch kann dieses direkt in den Citratzyklus einfließen. Ist die Reaktion der Laktatdehydrogenase aus Gründen der NAD+‐Verfügbarkeit limitiert, könnte dies eine mögliche Erklärung sein. Die Literatur berichtet darüber in recht ähnlicher Weise mit der Ausnahme, dass Pyruvat in manchen Brustkrebszellen zur Proliferation führt, wohin gegen Laktat dazu nicht im Stande sei [Diers et al. 2012]. Dies ist ein Widerspruch zu der These, dass die Glykolyse von Bedeutung für die Zellproliferation ist [Lunt und Vander Heiden 2011]. Ein Argument, welches beide Sichtweisen verknüpft, ist die extrazelluläre Reduktion des Pyruvat zu Laktat, was über das PMET zur Sirtuin‐Stimulation führt [Crane et al. 2013a]. Das wiederrum ist ein Wachstumssignal, welches somit Einfluss auf den Membrantransport haben könnte.

Wird der Glucose‐Verbrauch bestimmt, so zeigt sich ein Zusammenhang zwischen OXPHOS, Citratzyklus und der Glutamin‐Versorgung. Die Hemmung der OXPHOS mit Oligomycin hat den gleichen Effekt auf den Glucose‐Verbrauch, wie die Glutamin‐freie Kultivierung oder die Kombination aus beiden. Hierdurch wird der Verbrauch um den Faktor 2 vermindert. Scheinbar führt dies beides zu einer indirekten Inhibierung des Citratzyklus. In einem Fall ist es die toxische Wirkung, im anderen Fall fehlt bspw. ein Bestandteil des Malat‐Aspartat‐Shuttles oder der Glutathion‐Synthese, was zum vermehrten Auftreten von ROS führt [DeBerardinis und Cheng 2009]. Das bestärkt damit die Sichtweise der Glutamin‐Variation innerhalb der Wachstumskurven.

Wird der ATP‐Gehalt in den ersten drei Stunden der Oligomycin‐Anwendung gemessen, so zeigt sich die Abhängigkeit der ATP‐Produktion von Glykolyse und OXPHOS. Bedingung ist, dass die Adaption an diese induzierte Stoffwechsellage längere Zeit beansprucht als die Auswertung der ersten ATP‐Messungen.

Wird die OXPHOS durch Oligomycin inhibiert und ausschließlich Laktat als C‐Quelle geboten, so sinkt der ATP‐Gehalt der Zelle auf ein Minimum. Das Maximum erreicht der Versuch im Vollmedium. Die Zellen sind hier in der Lage ATP sowohl über die Glykolyse als auch OXPHOS zu synthetisieren. Wird Laktat als alleinige C‐Quelle dem Mangelmedium zugesetzt, so kann über die OXPHOS ein ATP‐Level von etwa 70 % des Maximalwertes erreicht werden. Dementsprechend leistet die Glykolyse (Vollmedium mit Oligomycin) 30 % des gesamten ATP‐Umsatzes.

Der gesamte ATP‐Pool der Zelle wird innerhalb von einer Minute bis zu sechs mal umgesetzt [Metallo und Vander Heiden 2013]. Daher führt bei konstantem Bedarf eine 10 %ige Abnahme der Produktionsleistung dazu, dass sich die gesamte, verfügbare ATP‐Menge in einer Minute um 50 % abnimmt [Bacon und Demas 1987; Metallo und Vander Heiden 2013]. In diesem Fall liegt die

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Abnahme über zwei Stunden bei konstanten 30 % bzw. 70 % des Kontrollwertes. Das liegt somit im Bereich der postulierten Abnahme der Produktionsleistung; allerdings über eine viel größere Zeitspanne. Das bedingt die Vermutung, dass die Zelle den jeweilig nicht‐gehemmten Produktionsweg hochreguliert hat und die ATP Konzentration – außer in der voll gehemmten Kultur – nicht limitierend bzw. letal ist. Für die Oligomycin‐induzierte OXPHOS Hemmung ist dies bereits gezeigt worden [Hao et al. 2010].

7.4.8. Hypoxie‐Indikatoren durch Hemmung mit Oligomycin

Um zu ergründen, ob Oligomycin durch die Blockierung der OXPHOS Eigenschaften einer chemisch‐induzierten Hypoxie zeigt, ist die hierfür entwickelten LC/MS‐Methode angewendet worden. Betrachtet man das Ergebnis und folgt dem zeitlichen Verlauf, so sticht die Messung zu 20 h mit den Höchsten gemessenen Werten von Laktat und Harnsäure heraus. Dazu ist das der einzige Zeitpunkt an welchem Xanthin nachweisbar ist. Die Zunahme des Laktat‐Wertes, welcher auch unter hypoxischen Zuständen zu beobachten ist, kann bereits aus anderen Versuchen entnommen werden. Diese finden nun auch bei intrazellulärer Messung Bestätigung. Ein weiteres Indiz was demnach für Hypoxie spricht, ist das nicht vorhandene CrP. Die CrP‐Verarmung ist gemäß Kapitel 2.1.6 eine Folge der Hypoxie. Je höher der Creatin‐Anteil ist, desto eher scheint ein ATP‐Mangel bestanden zu haben. Allerdings ist zur Bewertung der Quotient aus Cr und CrP nötig. CrP ist in diesen Messungen nicht nachzuweisen gewesen, so dass gemäß LOD von einem Wert deutlich unter 2,5 mM ausgegangen werden muss.

Die Abnahme von Hypoxanthin spricht gegen eine echte Hypoxie, da der Umsatz durch die Xanthinoxidase Sauerstoffabhängig ist. Dazu passt der Aufwärtstrend der Harnsäure, welches das Endprodukt darstellt. Xanthin ist in diesem Fall das Zwischenprodukt und läuft auf, wenn nicht ausreichend Sauerstoff vorhanden ist. Xanthin ist allerdings gerade dann nachweisbar, wenn die Sauerstoffaufnahmerate der Zellen steigt. Die SDR‐Daten zeigen eine Zunahme der OUR im Bereich von 20 h. Diese könnte auf Zellteilung oder eine Änderung im Metabolismus zurückzuführen sein. Von Gemin et al. wird nachgewiesen, dass Oligomycin in der Lage ist den Zellzyklus in der G1‐Phase zu arretieren. Dieses Toxin wirke sich auf die Zyklin‐D1‐Konzentration aus [Gemin et al. 2005]. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Zunahme der OUR auf Zellteilung zurückzuführen ist. Zudem ist sie im Vergleich zu den ungehemmten Wachstumskurven deutlich niedriger, so dass hierdurch die erfolgreiche Hemmung belegt wird. Die beobachtete Änderung hingegen ist absolut gesehen gering, so dass ein Mess‐Artefakt nicht ausgeschlossen werden kann. Eine Hypothese wäre die transiente Hemmung durch Oligomycin. Durch erneutes Anlaufen der OXPHOS könnte kurzzeitig eine Konkurrenzsituation in der Zelle entstehen, die für dieses Zeitfenster zu einer Xanthin‐Zunahme führt, da der Sauerstoff verknappt wird. Es ist zusammenfassend nicht davon auszugehen, dass Oligomycin eine Hypoxie auszulösen vermag. Auch Hao et al. äußern sich hierzu kritisch [Hao et al. 2010]. Gong und Agani zeigen insbesondere, dass die HIF‐1α Expression durch Oligomycin unter bestimmten Umständen inhibiert wird [Gong 2005].

Es ist ein Anreiz zur Fortführung um zu klären wieso kein Glutathion nachweisebar ist. In Frage kommen ein methodisches Problem, weil es durch Matrixeffekte verloren geht, oder eine Konzentration unterhalb der LOD. Diese ist hierbei allerdings 0,1 mM. Laut Literatur sollte dieses sehr wichtige Antioxidans in Konzentrationen bis 5 mM vorliegen [Locasale 2013]. Dies gilt für viele weitere Analyten, die so nicht in Kulturüberständen oder dem Zellpellet nachweisbar gewesen sind.

DISKUSSION

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7.5. Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit ist es begleitend zur eigentlichen COSIR‐Entwicklung möglich gewesen, gerätetypische Applikationen durchzuführen und diese in ein labortypisches Netzwerk zu integrieren. Anhand einer Medienoptimierung unter Variation von Glutamin und FKS ist die gängige Diskussion bezüglich des Warburg‐Effekts demonstriert worden. Rasch proliferierende Zellen haben einen hohen Nährstoffverbrauch mit gleichzeitig hoher Laktat‐Anreicherung gezeigt, die indirekt über das pH‐Signal zu messen gewesen ist. Dabei ist die Sauerstoffaufnahmerate absolut betrachtet ebenso erhöht gewesen. Dies hat das erhöhte Stoffwechselaufkommen indiziert. Bezogen auf den Glucose‐Verbrauch ist der Sauerstoffverbrauch jedoch gemäß der Hypothese innerhalb der stationären Phase angestiegen. Dieses Phänomen ist indirekt aus dem Verhältnis von OUR und ACR abzuschätzen gewesen. Der endgültige Beleg hat demnach jedoch erst durch die Glucose‐Messung erfolgen können. Daraus ergibt sich als COSIR‐Minimalvoraussetzung die Kenntnis über die Gesamtzellzahl; besser jedoch Lebendzellzahl. Des Weiteren muss gegebenenfalls der Sauerstoffverbrauch durch den PMET durch spezifische Hemmung bestimmt werden, um die korrekte Aktivität der OXPHOS abzuleiten. Bezüglich der Medienvariation ist der erwartete Einfluss des Glutamins auf die Wachstumsrate und maximale Zelldichte gezeigt worden. Hierbei hat insbesondere das schlechte Wachstumsverhalten in serumfreien Produktionsmedien überrascht, wohingegen der FKS‐Entzug im günstigen Standardmedium zum Teil gute Erfolge erbracht hat.

Durch Verknüpfung der metabolischen Daten mit dem zugehörigen Bildmaterial ist ein einfaches Vorgehen gezeigt worden, um objektive Daten aus ungefärbten, segmentierten Bildern zu extrahieren. Interessant ist die Korrelation zwischen der Morphologie der Zellen, deren Verbrauchsraten und dem Nährstoffkonzentrationen im Medium, welche zu weiteren Arbeiten motiviert.

Der Einsatz von spezifischen Toxinen hat zeigen können, dass hierdurch spezifische Sensoren angesprochen werden. Wird die Atmungskette gehemmt, so wirkt sich dies oft im Sauerstoffsignal aus. Eine artifizielle Induktion der Hypoxie hatte ein stärkeres Ansprechen des pH‐Sensors zur Folge. Mit einer Kombination aus Wirkstofftest und Medienoptimierung ist exemplarisch die Beeinflussung von Stoffwechselwegen gezeigt worden. Diese Daten lassen alleine gesehen eine Eingrenzung der zeitlichen Abläufe und Konzentrationen zu. Durch weitere Analytik wie dem WST‐8 Assay und/oder der Durchflusszytometrie können diese detaillierter aufgeklärt werden. Die LC‐MS‐Methode hat an Hand des Beispiels Oligomycin gezeigt, wie mit einer Überstands bzw. Zellaufschlussmessung eine größere Menge an Analyten zur Bewertung herangezogen werden kann und zeigt Übereinstimmung mit der Literatur, dass keine echte Hypoxie ausgelöst worden ist.

Der Vorteil eines COSIR‐Moduls oder vergleichbarer Technik begründet sich mehrheitlich durch die Online‐Messung. Diese erlaubt mit mittlerer Skalierbarkeit im 24‐Multiwell Format, den Zeitraum und die Konzentration eines Wirkstoffs einzugrenzen, um es in der Folge weiterer Analytik zugänglich zu machen. Somit lassen die absoluten Versuchszahlen reduzieren, wodurch Zeit und Kosten eingespart werden.

AUSBLICK

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8. AUSBLICK

Ziel dieser Arbeit ist die Applikationsentwicklung für das Projekt „COSIR“ und somit für vereinfachte modulare HCS‐Systeme mit geringer Baugröße. Sie eignen sich für den Betrieb innerhalb eines Inkubators und nutzen so die bestehende Infrastruktur des Labors. Durch das Live‐Cell‐Imaging und die non‐invasive Messtechnik ist es möglich Zellen über die gesamte Kulturdauer zu analysieren und Daten zu generieren, ohne dass für jeden Messpunkt ein Versuchsansatz verbraucht wird.

Die erzeugten Daten motivieren zur Intensivierung und zur Optimierung dargestellter Vorgehensweisen. Zur Evaluierung der Bilddaten wäre es wichtig die Versuchszahl zu erhöhen und die Auswertung, insbesondere Segmentierung, zu automatisieren. Möglicher Weise ist hierzu eine Verfahrensänderung sinnvoll. Während das bisherige Herangehen als „bottom‐up“ verstanden werden kann, wäre es für die Methodenentwicklung wohlmöglich zielführender zu „top‐down“ zu wechseln. Konkret bedeutet das anhand bereits automatisierter und komplexer Systeme wie bspw. Multiphotonen‐Mikroskopen konkrete Anwendungen und Methoden abzuleiten, die in der Folge in weniger kostenintensive, darauf spezialisierte Baumformen übernommen werden können. Somit ließen sich modulare Systeme für verschiedene Anwendungsarten und Zielgruppen ableiten.

Im Hinblick auf automatisierte Plattformen könnte die Integration der Referenzmethoden vorgenommen werden. Für einige der bearbeiteten Methoden ist grundsätzlich eine Automatisierung verfügbar. Beispielsweise hat sich die LC‐MS‐Methode als generell praktikabel herausgestellt und es ist denkbar diese weiter zu integrieren. Allerdings sollte hierzu auf neuere Geräte zurückgegriffen werden, deren Sensitivität mittlerweile etwa 2‐3 Zehnerpotenzen höher ist, als die eingesetzte Geräteversion. Dadurch könnten weitere Einsatzgebiete aufdeckt werden. Denn in der vorliegenden Arbeit sind statische Monolayer‐Kulturen eingesetzt worden. Wenn diese auf Grund des Mediums zur Agglomeration neigen, zeigen sich die Grenzen der einfachen Durchlichtmikroskopie. Oft gelangt man über die dynamische Kulturführung von Aggregaten über das Tissue Engineering zu anspruchsvollen Organtransplantaten (siehe [Präbst 2011]). Lichtmikroskopische Techniken scheiden hier ebenso aus, wie die invasive Analytik. Allerdings ist es möglich Perfusat‐Proben aus dem Kreislauf zu entnehmen und diese mit Systemen wie der gezeigten LC‐MS‐Methode zu analysieren [Präbst 2011; Rupprecht 2012].

Zusammenfassend könnte mit der diskutierten Herangehensweise ein Beitrag dazu geleistet werden, kleinere Forschungsgruppen stärker in die gegenwärtige Entwicklung der (Pharma‐)Forschung mit spezialisierten HCS‐Systemen einzubinden oder gar über Datenbanken zu vernetzen. Auf diesem Weg wären eine Intensivierung und eine Flexibilisierung der HCS‐Verfahren, die in ihrem Durchsatz aktuell noch hinter den (zellfreien) HTS‐Systemen zurückbleiben, zu erreichen. Der von Prof. Laufer angeführte Trend, dass in Zukunft kleine Firmen und Spin‐offs hierbei größeres Gewicht erhalten könnten [Laufer et al. 2013], liefert darüber hinaus eine starke wirtschaftliche Motivation diesem Trend nachzugehen.

VERZEICHNISSE

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9. VERZEICHNISSE

9.1. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 2‐1: Allgemeiner Verlauf der Glykolyse mit wichtigen Abzweigungen. ................................. 3 Abbildung 2‐2: Übersicht aller in der Arbeit behandelten Reaktionskaskaden. ..................................... 4 Abbildung 2‐3: Reaktionswege des Pyruvats .......................................................................................... 7 Abbildung 2‐4: Der Citratzyklus und ausgewählte kata‐ und anaplerotische Nebenreaktionen ............ 8 Abbildung 2‐5: Reaktionswege des Glutamins ...................................................................................... 10 Abbildung 2‐6: Der Verlauf der Atmungskette (Eigene Darstellung, Quellen siehe Text) ................... 11 Abbildung 2‐7: Varianten der zytosolischen NADH‐Regeneration ........................................................ 14 Abbildung 2‐8 molekulare Struktur von red. und oxd. Glutathion ....................................................... 15 Abbildung 2‐9 molekulare Struktur von Vitamin C ............................................................................... 16 Abbildung 2‐10 molekulare Struktur von Pyruvat und Laktat ............................................................... 17 Abbildung 2‐11 molekulare Strukturen von Creatin und Creatinphosphat .......................................... 18 Abbildung 2‐12 molekulare Strukturen von Hypoxanthin, Xanthin und Harnsäure ............................. 19 Abbildung 2‐13 molekulare Struktur von Malondialdehyd ................................................................... 19 Abbildung 2‐14: Schematische Darstellung der morphologischen Änderungen .................................. 23 Abbildung 2‐15: Strukturformel (links) sowie Anregungs‐ und Emissionsspektrum von PJ ................. 27 Abbildung 2‐16: Strukturformel (links), sowie Anregungs‐ und Emissionsspektrum von 7‐AAD ......... 28 Abbildung 2‐17: Strukturformel (links), sowie Anregungs‐ und Emissionsspektrum von YO‐PRO®‐1 .. 28 Abbildung 2‐18: Strukturformel des Hoechst 33342 [lifetechnologies] ............................................... 29 Abbildung 2‐19: Schematische Darstellung der Phosphatidylserin ...................................................... 30 Abbildung 2‐20: Schematische Darstellung der fluoreszenten Bestimmung der Caspase Aktivität. .... 30 Abbildung 2‐21: Strukturformeln von MTT, WST und mPMS ............................................................... 31 Abbildung 2‐22: Reduktion von WST‐8 durch den Elektronenmediator mPMS. .................................. 31 Abbildung 2‐23: Schematische Darstellung der Zellreduktion von WST. .............................................. 32 Abbildung 2‐24: Strukturformeln der Sauerstoffindikatoren ............................................................... 34 Abbildung 2‐25: Schematische Darstellung der Indikatorimmobilisierung .......................................... 35 Abbildung 2‐26: Struktur des Ionomycins ............................................................................................. 37 Abbildung 2‐27: Atmungskettentoxine ................................................................................................. 38 Abbildung 2‐28: Schematische Darstellung der Entkopplung durch DNP. ............................................ 39 Abbildung 4‐1: Versuchsübersicht im Themenbereich „Medienoptimierung“ .................................... 47 Abbildung 4‐2: Halblogarithmische Auftragung der Lebendzellkonzentration .................................... 58 Abbildung 5‐1: Kultivierung adhärenter Zellen im SDR System ............................................................ 61 Abbildung 5‐2: Vergleich der Kultivierungsumgebung.......................................................................... 62 Abbildung 5‐3: Zeitlicher pO2‐Verlauf für verschiedene OxoDish Chargen ........................................... 63 Abbildung 5‐4: Vergleich von OD1245‐01, OD1319‐01 und Greiner CELLSTAR® .................................. 63 Abbildung 5‐5: Mikroskop‐Aufnahmen der Charge OD1245‐01. .......................................................... 63 Abbildung 5‐6: Modifikation der OxoDish Platten. ............................................................................... 64 Abbildung 5‐7: Temperaturabhängigkeit der pO2‐Messung. ................................................................. 64 Abbildung 5‐8: kla‐Bestimmung über die Sulfitmethode. ..................................................................... 66 Abbildung 5‐9: Verlaufe der Gln‐Überstandmessung in einer Kultur von CHO ‐Zellen ........................ 90 Abbildung 5‐10: Normierte Dosis‐Wirkungskurve für Rotenon ............................................................ 91 Abbildung 5‐11: Zeitlicher pO2‐Verlauf für die Einwirkung von Rotenon .............................................. 92 Abbildung 5‐12: Sauerstoffaufnahmerate bei CHO Zellen unter Einwirkung von Rotenon. ................ 92 Abbildung 5‐13: Normierte Dosis‐Wirkungskurve für Malonat ............................................................ 93 Abbildung 5‐14: Zeitlicher pO2‐Verlauf für die Einwirkung von Malonat .............................................. 93 Abbildung 5‐15: Sauerstoffaufnahmerate bei CHO Zellen unter Einwirkung von Malonat. ................. 94 Abbildung 5‐16: Normierte Dosis‐Wirkungskurve für Azid ................................................................... 94 Abbildung 5‐17: Zeitlicher pO2‐Verlauf für die Einwirkung von Natriumazid ........................................ 95 Abbildung 5‐18: Normierte Dosis‐Wirkungskurve für Oligomycin A .................................................... 95

VERZEICHNISSE

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Abbildung 5‐19: Zeitlicher pO2‐Verlauf für die Einwirkung von Oligomycin A ....................................... 96 Abbildung 5‐20: Sauerstoffaufnahmerate bei CHO Zellen unter Einwirkung von Oligomycin A. ......... 96 Abbildung 5‐21: Normierte Dosis‐Wirkungskurve für Antimycin A ...................................................... 97 Abbildung 5‐22: Zeitlicher pO2‐Verlauf für die Einwirkung von Antimycin A ........................................ 97 Abbildung 5‐23: Sauerstoffaufnahmerate bei CHO Zellen unter Einwirkung von Antimycin A. ........... 98 Abbildung 5‐24: Auf die Kontrolle normierte Dosis‐Wirkungskurve für 2,4‐Dinitrophenol ................. 98 Abbildung 5‐25: Zeitlicher pO2‐Verlauf für die Einwirkung von 2,4‐Dinitrophenol ............................... 99 Abbildung 5‐26: Sauerstoffaufnahmerate bei CHO Zellen unter Einwirkung von 2,4‐Dinitrophenol. 100 Abbildung 5‐27: Dot‐Plots für PJ und YP gefärbte CHO Zellen nach 4‐stündiger Einwirkdauer ......... 101 Abbildung 5‐28: Metabolic Activity/Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit für CHO Zellen .................... 102 Abbildung 5‐29: Metabolic Activity/Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit für CHO Zellen .................... 103 Abbildung 5‐30: Annexin V Dot Plot der CHO Kontrollkulturen .......................................................... 104 Abbildung 5‐31: Muse MitoPotential Dot Plot der CHO Kontrollkulturen. ......................................... 106 Abbildung 5‐32: Muse Caspase 3/7 Pseudocolour Plot der CHO Kontrollkulturen ............................ 108 Abbildung 5‐33: Muse Multicaspase Pseudocolour Plot..................................................................... 110 Abbildung 5‐34: Auftragung der gemessenen WST‐Werte ................................................................. 111 Abbildung 5‐35: Darstellung der aus den SDR‐Messungen abgeleiteten Größen: ............................. 111 Abbildung 5‐36: Auftragung der gemessenen WST‐Werte (CHO‐Zellen) ........................................... 112 Abbildung 5‐37: Darstellung der aus den SDR‐Messungen abgeleiteten Größen: ............................. 113 Abbildung 5‐38: Darstellung des Zelldichteversuchs mit CHO‐Zellen. ................................................ 113 Abbildung 5‐39: Darstellung des Zelldichteversuchs mit PAC‐Zellen. ................................................. 114 Abbildung 5‐40: Auftragung der für L929 gemessenen WST‐Werte ................................................... 115 Abbildung 5‐41: Darstellung der aus den SDR‐Messungen abgeleitete Größen für L929 .................. 116 Abbildung 5‐42: Auftragung der für CHO gemessenen WST‐Werte ................................................... 116 Abbildung 5‐43: Darstellung der aus den SDR‐Messungen ................................................................. 117 Abbildung 5‐44: Verläufe der absoluten Sauerstoffaufnahmerate von CHO ..................................... 118 Abbildung 5‐45: Verläufe der absoluten Sauerstoffaufnahmerate von CHO ..................................... 119 Abbildung 5‐46: Verläufe der absoluten Sauerstoffaufnahmerate von CHO ..................................... 119 Abbildung 5‐47: Darstellung der OURZelle (Bild A links) und ACRZelle (Bild B rechts) ............................ 120 Abbildung 5‐48: Bild A Auftragung der gemittelten, gemessenen Peak Flächen ............................... 122 Abbildung 5‐49: Bild A Auftragung der gemittelten, gemessenen Peak Flächen ............................... 123 Abbildung 5‐50: ATP‐Gehalte aufgeschlossener CHO‐Zellen .............................................................. 124 Abbildung 5‐51: Entnahme von Einzelbildern aus einem Kulturlauf mit Suspensionszellen .............. 124 Abbildung 5‐52: Exemplarische Darstellung von Fluoreszenzfärbungen ............................................ 125 Abbildung 5‐53: Mikroskopische Färbungen von CHO Zellen mit PJ und YO‐PRO®‐1 ........................ 126 Abbildung 5‐54: Formen zur Beurteilung der Deskriptoren ................................................................ 127 Abbildung 5‐55: Exemplarische Darstellung der Triangulation. .......................................................... 129 Abbildung 5‐56: Beispielhafte Darstellung der Äquivalentdurchmesser und Annäherungszonen ..... 129 Abbildung 5‐57: Auswertung von nahezu gleichverteilten, entfernten Kreisen ................................. 130 Abbildung 5‐58: Auswertung nach Annäherung, sodass gerade kein Kontakt besteht ...................... 130 Abbildung 5‐59: Auswertung nach weiterer Abstandverringerung .................................................... 131 Abbildung 5‐60: Ausgangssituation mit etwa dreifachem Abstand .................................................... 131 Abbildung 5‐61: Annäherung auf einen Abstand etwas kleiner als die längste Achse ....................... 132 Abbildung 5‐62: Überschneidung der Objekte .................................................................................... 132 Abbildung 5‐63: „Monolayer“‐Gruppe mit zusätzlichen, einzelnen Kreisen ...................................... 132 Abbildung 5‐64: "Agglomerat"‐Gruppe mit zusätzlichen, einzelnen Kreisen ..................................... 133 Abbildung 5‐65: Erhöhung der Agglomerat‐Anzahl auf drei ............................................................... 133 Abbildung 5‐66: Darstellung der Wachstumskurve von CHO‐Zellen in DMEM/F‐12 .......................... 134 Abbildung 5‐67: Darstellung der Wachstumskurve von CHO‐Zellen in Advanced DMEM ................. 134 Abbildung 5‐68: Darstellung der Wachstumskurve von CHO‐Zellen in Ex‐Cell 325 PF ....................... 135 Abbildung 5‐69: Darstellung der Wachstumskurve von L929‐Zellen in DMEM/F‐12 ......................... 136 Abbildung 5‐70: Darstellung der Wachstumskurve von L929‐Zellen in Advanced DMEM ................. 136 Abbildung 5‐71: Darstellung der Wachstumskurve von Jurkat‐Zellen in RPMI 1640 ......................... 137

VERZEICHNISSE

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Abbildung 5‐72: Darstellung der Wachstumskurve von Jurkat‐Zellen in Advanced RPMI ................. 137 Abbildung 7‐1: Oxo‐Spot in einem Well, welches mit MTT versehen worden ist. .............................. 142 Abbildung 7‐2: COMSOL‐Simulation einer SDR Messung. .................................................................. 143 Abbildung 7‐3: Vergleich des Sauerstoffverbrauchs und der Ansäuerung von L929‐Zellen ............... 148 Abbildung 7‐4: Darstellung der Ansäuerungsrate gegen die Sauerstoffaufnahmerate ...................... 154 Abbildung 7‐5: Darstellung Formazan‐Bildung gegen OUR ................................................................ 155 Abbildung 7‐6: Vergleich von L929 (Bild A und B) mit HepZ (Bild C und D) ........................................ 158 Abbildung 7‐7: Vergleich der Kultivierung von HepZ .......................................................................... 159 Abbildung 7‐8: Gegenüberstellung metabolischer Verläufe ............................................................... 161 Abbildung 7‐9: Bilddaten der CHO‐Zellen ........................................................................................... 162 Abbildung 7‐10: Obige Bilder in gleicher Reihenfolge nach erfolgter Delaunay‐Triangulation. ......... 163 Abbildung 7‐11: Darstellung der Wachstumskurve von CHO‐Zellen in DMEM/F‐12 .......................... 165 Abbildung 7‐12: Alternative Auftragung ............................................................................................. 166 Abbildung 7‐13: : Darstellung der Wachstumskurve von CHO‐Zellen in Advanced DMEM ............... 167 Abbildung 7‐14: Alternative Auftragung ............................................................................................. 168 Abbildung 7‐15: : Darstellung der Wachstumskurve von CHO‐Zellen in Ex‐Cell 325 PF ..................... 168 Abbildung 7‐16: Darstellung der Wachstumskurve von L929‐Zellen in DMEM/F‐12 ......................... 169 Abbildung 7‐17: Darstellung der Wachstumskurve von L929‐Zellen in Advanced DMEM ................. 170 Abbildung 7‐18: Darstellung der Wachstumskurve von Jurkat‐Zellen in RPMI 1640 ......................... 171 Abbildung 7‐19: Darstellung der Wachstumskurve von Jurkat‐Zellen in Advanced RPMI ................. 172 Abbildung 7‐20: Vergleich von normiertem WST‐8 Umsatz () mit normierte OUR () .................. 175 Abbildung 7‐21: Vergleich von normiertem WST‐8 Umsatz () mit normierte OUR () .................. 176 Abbildung 7‐22: Vergleich von normiertem WST‐8 Umsatz () mit normierte OUR () .................. 177 Abbildung 7‐23: Vergleich von normiertem WST‐8 Umsatz () mit normierte OUR () .................. 178 Abbildung 7‐24: Vergleich von normiertem WST‐8 Umsatz () mit normierte OUR () n ............... 179 Abbildung 7‐25: Kombinierte Auftragung der abgeleiteten Daten ..................................................... 182 Abbildung 7‐26: Kombinierte Auftragung der abgeleiteten Daten ..................................................... 184 Abbildung 7‐27: Auftragung der auf die Startzellzahl normierten OUR und ACR ............................... 186 Abbildung 7‐28: Kombinierte Auftragung der abgeleiteten Daten ..................................................... 188 Abbildung 7‐29: Kombinierte Auftragung des WST‐Umsatzes gegen die OUR‐Daten ........................ 189 Abbildung 10‐1: CHO in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin ........................................... 217 Abbildung 10‐2: CHO in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin ........................................... 218 Abbildung 10‐3: CHO in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin ........................................... 219 Abbildung 10‐4: CHO in DMEM/F‐12 mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin ............................................. 220 Abbildung 10‐5: CHO in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin ..................................... 221 Abbildung 10‐6: CHO in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin ..................................... 222 Abbildung 10‐7: CHO in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 6 mM Glutamin ..................................... 223 Abbildung 10‐8: CHO in OptiCHO mit 0 % FKS und 2 mM Glutamin ................................................... 224 Abbildung 10‐9: CHO in OptiCHO mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin ................................................... 225 Abbildung 10‐10: CHO in OptiCHO mit 0 % FKS und 6 mM Glutamin ................................................. 226 Abbildung 10‐11: CHO in Ex‐Cell 325 PF mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin ........................................ 227 Abbildung 10‐12: L929 in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin ......................................... 228 Abbildung 10‐13: L929 in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin ......................................... 229 Abbildung 10‐14: L929 in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 6 mM Glutamin ......................................... 230 Abbildung 10‐15: L929 in DMEM/F‐12 mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin ........................................... 231 Abbildung 10‐16: L929 in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin .................................. 232 Abbildung 10‐17: L929 in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin .................................. 233 Abbildung 10‐18: L929 in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 6 mM Glutamin .................................. 234 Abbildung 10‐19: L929 in OptiCHO mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin ................................................ 235 Abbildung 10‐20: MHEC5‐T in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin ................................. 236 Abbildung 10‐21: MHEC5‐T in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin ................................. 237 Abbildung 10‐22: MHEC5‐T in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 6 mM Glutamin ................................. 238 Abbildung 10‐23: MHEC5‐T in DMEM/F‐12 mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin ................................... 239

VERZEICHNISSE

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Abbildung 10‐24: MHEC5‐T in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin ........................... 240 Abbildung 10‐25: MHEC5‐T in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin ........................... 241 Abbildung 10‐26: MHEC5‐T in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 6 mM Glutamin ........................... 242 Abbildung 10‐27: MHEC5‐T in OptiCHO mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin ......................................... 243 Abbildung 10‐28: Jurkat in RPMI1640 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin .......................................... 244 Abbildung 10‐29: Jurkat in RPMI1640 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin .......................................... 245 Abbildung 10‐30: Jurkat in RPMI1640 mit 10 % FKS und 6 mM Glutamin .......................................... 246 Abbildung 10‐31: Jurkat in Advanced RPMI mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin ................................... 247 Abbildung 10‐32: Jurkat in Advanced RPMI mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin ................................... 248 Abbildung 10‐33: Jurkat in Advanced RPMI mit 1 % FKS und 6 mM Glutamin ................................... 249 Abbildung 10‐34: HepZ in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin ........................................ 250 Abbildung 10‐35: HepZ in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin ........................................ 251 Abbildung 10‐36: HepZ in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 6 mM Glutamin ........................................ 252 Abbildung 10‐37: HepZ in DMEM/F‐12 mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin .......................................... 253 Abbildung 10‐38: HepZ in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin .................................. 254 Abbildung 10‐39: HepZ in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin .................................. 255 Abbildung 10‐40: HepZ in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 6 mM Glutamin .................................. 256 Abbildung 10‐41: PAC in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin .......................................... 257 Abbildung 10‐42: PAC in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 4 mM Glutamin .......................................... 258 Abbildung 10‐43: PAC in DMEM/F‐12 mit 10 % FKS und 6 mM Glutamin .......................................... 259 Abbildung 10‐44: PAC in DMEM/F‐12 mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin ............................................ 260 Abbildung 10‐45: PAC in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin .................................... 261 Abbildung 10‐46: PAC in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin .................................... 262 Abbildung 10‐47: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol ......................................................................... 263 Abbildung 10‐48: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol ......................................................................... 264 Abbildung 10‐49: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol ......................................................................... 264 Abbildung 10‐50: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol ......................................................................... 265 Abbildung 10‐51: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol ......................................................................... 265 Abbildung 10‐52: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol ......................................................................... 266 Abbildung 10‐53: Ansäuerungsraten in amol ...................................................................................... 266 Abbildung 10‐54: Ansäuerungsrate in amol ........................................................................................ 267 Abbildung 10‐55: Ansäuerungsrate in amol ........................................................................................ 267 Abbildung 10‐56: Ansäuerungsraten in amol ...................................................................................... 268 Abbildung 10‐57: Ansäuerungsrate in amol ........................................................................................ 268 Abbildung 10‐58: Ansäuerungsrate in amol ........................................................................................ 269 Abbildung 10‐59: Gemessener WST‐Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der CHO‐Zellen .......... 270 Abbildung 10‐60: Gemessener WST‐Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der L929 .................... 271 Abbildung 10‐61: Gemessener WST‐Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der MHEC5‐T‐Zellen .. 272 Abbildung 10‐62: Gemessener WST‐Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der Jurkat‐Zellen ....... 273 Abbildung 10‐63: Gemessener WST‐Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der HepZ‐Zellen ........ 274 Abbildung 10‐64: Gemessener WST‐Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der PAC‐Zellen .......... 275 Abbildung 10‐65: Glucose‐Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium .................................... 276 Abbildung 10‐66: Glucose‐Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium .................................... 277 Abbildung 10‐67: Glucose‐Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium .................................... 278 Abbildung 10‐68: Glucose‐Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium .................................... 279 Abbildung 10‐69: Glucose‐Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium .................................... 280 Abbildung 10‐70 Glucose‐Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium ..................................... 281 Abbildung 10‐71: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von CHO‐Zellen in DMEM/F‐12 ....................... 282 Abbildung 10‐72: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von CHO‐Zellen in Advanced DMEM ................ 282 Abbildung 10‐73: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von CHO‐Zellen in Ex‐Cell 325 PF ..................... 283 Abbildung 10‐74: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von L929‐Zellen in DMEM/F‐12 ........................ 283 Abbildung 10‐75: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von L929‐Zellen in Advanced DMEM ............... 283 Abbildung 10‐76: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von Jurkat‐Zellen in RPMI 1640 ........................ 284

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Abbildung 10‐77: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von Jurkat‐Zellen in Advanced RPMI ................ 284 Abbildung 10‐78: Muse Annexin V Dot‐Plots für CHO Zellen ............................................................. 285 Abbildung 10‐79: MUSE MitoPotential bei CHO Zellen ...................................................................... 286 Abbildung 10‐80: MUSE MitoPotential bei CHO Zellen ...................................................................... 287 Abbildung 10‐81: Caspase 3/7 Aktivität von CHO Zellen .................................................................... 288 Abbildung 10‐82: Caspase 3/7 Aktivität von CHO Zellen .................................................................... 289 Abbildung 10‐83: MultiCaspase Aktivität von CHO Zellen .................................................................. 290

VERZEICHNISSE

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9.2. Tabellenverzeichnis

Tabelle 2‐1: Übersicht der Todesmechanismen .................................................................................... 22 Tabelle 4‐1: Varianten der Vollmedien in Bezug auf Gln und FKS......................................................... 41 Tabelle 4‐2: Mangelmedien mit zugehöriger C‐Quellen Konzentration ............................................... 41 Tabelle 4‐3: Übersicht der Materialien zur Stammhaltung ................................................................... 42 Tabelle 4‐4: Auflistung der Populationen und zugehöriger Intervalle .................................................. 50 Tabelle 4‐5: Verwendete Gewichtungsfaktoren der Formmessung ..................................................... 51 Tabelle 4‐6: Übersicht der Intervalle und deren Grenzen als Grundlage der Summenbildung ............ 53 Tabelle 4‐7: Komponentenliste der eingesetzten HPLC ........................................................................ 55 Tabelle 4‐8: Liste der verwendeten Standards ...................................................................................... 56 Tabelle 4‐9: Ansetzen der Standards ..................................................................................................... 56 Tabelle 4‐10: Parameter für die Flüssigkeitschromatographie ............................................................. 57 Tabelle 4‐11: Allgemeine Parameter für das Massenspektrometer ..................................................... 58 Tabelle 4‐12: Stoffspezifische Parameter für die massenspektrometrische Detektion ........................ 58 Tabelle 5‐1: Übersicht Messsysteme und Methoden ........................................................................... 61 Tabelle 5‐2: Vergleich der Wachstumsparameter ................................................................................ 62 Tabelle 5‐3: Temperaturabhängigkeit der Sauerstoffmessung ............................................................. 65 Tabelle 5‐4: Statistische Größen der kla‐Bestimmung .......................................................................... 65 Tabelle 5‐5: Gerundete Zeitintervalle der Wachstumsphasen. ............................................................ 67 Tabelle 5‐6: Übersicht über die Verdoppelungszeit .............................................................................. 68 Tabelle 5‐7: PCD‐Werte in 1/ml der eingesetzten Zellen und Medien ................................................. 69 Tabelle 5‐8: Übersicht aller errechneten ACDexp ................................................................................... 70 Tabelle 5‐9: Übersicht aller errechneten ACDstat ................................................................................... 71 Tabelle 5‐10: Darstellung der minimal erreichte, relativen Sauerstoffpartialdrücke ........................... 73 Tabelle 5‐11: Die Sauerstoffaufnahme von CHO Zellen ........................................................................ 74 Tabelle 5‐12: Die Sauerstoffaufnahme von L929 Zellen ....................................................................... 74 Tabelle 5‐13: Die Sauerstoffaufnahme von MHEC5‐T Zellen ................................................................ 75 Tabelle 5‐14: Die Sauerstoffaufnahme von Jurkat Zellen ..................................................................... 76 Tabelle 5‐15: Die Sauerstoffaufnahme von HepZ Zellen ....................................................................... 76 Tabelle 5‐16: Die Sauerstoffaufnahme von PAC Zellen ......................................................................... 77 Tabelle 5‐17: Die Ansäuerungsrate von CHO Zellen ............................................................................. 77 Tabelle 5‐18: Die Ansäuerungsrate von L929 Zellen ............................................................................. 78 Tabelle 5‐19: Die Ansäuerungsrate von MHEC5‐T Zellen ...................................................................... 79 Tabelle 5‐20: Die Ansäuerungsrate von Jurkat Zellen ........................................................................... 79 Tabelle 5‐21: Die Ansäuerungsrate von HepZ Zellen ............................................................................ 80 Tabelle 5‐22: Die Ansäuerungsrate von PAC Zellen .............................................................................. 80 Tabelle 5‐23: Die Formazan‐Bildungsrate von CHO Zellen ................................................................... 81 Tabelle 5‐24: Die Formazan‐Bildungsrate von L929 Zellen ................................................................... 82 Tabelle 5‐25: Die Formazan‐Bildungsrate von MHEC5‐T Zellen ............................................................ 83 Tabelle 5‐26: Die Formazan‐Bildungsrate von Jurkat Zellen ................................................................. 83 Tabelle 5‐27: Die Formazan‐Bildungsrate von HepZ Zellen .................................................................. 84 Tabelle 5‐28: Die Formazan‐Bildungsrate von PAC Zellen .................................................................... 84 Tabelle 5‐29: Glucose‐Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von CHO Zellen ......................... 85 Tabelle 5‐30: Glucose‐Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von L929 Zellen ......................... 86 Tabelle 5‐31: Glucose‐Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von MHEC5‐T Zellen ................. 87 Tabelle 5‐32: Glucose‐Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von Jurkat Zellen ....................... 87 Tabelle 5‐33: Glucose‐Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von HepZ Zellen ........................ 88 Tabelle 5‐34: Glucose‐Gehalt und Verbrauchsraten in den Kulturen von PAC Zellen .......................... 89 Tabelle 5‐35: Darstellung der Laktat‐Konzentration und Bildungsraten .............................................. 89 Tabelle 5‐36: Übersicht Muse Annexin V Assay nach 4‐stündiger Einwirkdauer. ............................... 104 Tabelle 5‐37: Übersicht Muse Annexin V Assay nach 24‐stündiger Einwirkdauer. ............................. 105 Tabelle 5‐38: Übersicht Muse MitoPotential Assay nach 4‐stündiger Einwirkdauer. ......................... 106

VERZEICHNISSE

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Tabelle 5‐39: Übersicht Muse MitoPotential Assay nach 24‐stündiger Einwirkdauer. ....................... 107 Tabelle 5‐40: Übersicht Muse Caspase 3/7 Assay nach 4‐stündiger Einwirkdauer. ........................... 108 Tabelle 5‐41: Übersicht Muse Caspase 3/7 Assay nach 24‐stündiger Einwirkdauer. ......................... 109 Tabelle 5‐42: Übersicht Muse Multicaspase Assay nach 24‐stündiger Einwirkdauer. ........................ 110 Tabelle 5‐43: Ergebnis der Populationsanalyse von CHO‐ und L929‐Zellen ....................................... 117 Tabelle 5‐44: Vergleich des absoluten Glucose‐Verbrauchs ............................................................... 120 Tabelle 5‐45: Gemessene Glucose‐Konzentration .............................................................................. 120 Tabelle 5‐46: Nachweisgrenzen der Analyten im MS .......................................................................... 121 Tabelle 5‐47: Festgelegte Populationen mit zugehörigen Intervallen ................................................ 128 Tabelle 5‐48: Übersicht der gewählten Gewichtungsfaktoren ........................................................... 128 Tabelle 7‐1: Anteil der ACDexp an der ACDges ....................................................................................... 149 Tabelle 7‐2: Abschätzung der Puffersysteme ...................................................................................... 150 Tabelle 7‐3: Übersicht grundlegender, energiebereitstellender Reaktionen ..................................... 151 Tabelle 7‐4: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung von CHO‐Zellen ........................................ 152 Tabelle 7‐5: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung von L929‐Zellen ........................................ 152 Tabelle 7‐6: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung von Jurkat‐Zellen ...................................... 152 Tabelle 7‐7: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung .................................................................. 156 Tabelle 7‐8: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung .................................................................. 157 Tabelle 7‐9: Normierte Parameter der Nährstoffnutzung .................................................................. 157 Tabelle 7‐10: Übersicht der durchflusszytometrischen Assays ........................................................... 180 Tabelle 7‐11: Auswertung der Stoffwechselwege nach C‐Quellensupplementierung. ...................... 189 Tabelle 10‐1: Liste der Chemikalien und Reagenzien .......................................................................... 212 Tabelle 10‐2: Liste der verwendeten Zellen ........................................................................................ 213 Tabelle 10‐3: Liste der Kulturmedien und Supplemente .................................................................... 214 Tabelle 10‐4: Liste der Geräte ............................................................................................................. 215 Tabelle 10‐5: Liste sonstiger Verbrauchsmittel ................................................................................... 216

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9.3. Literaturverzeichnis

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ZIERINGER, J. 2013. Etablierung intrazellulärer ATP‐Messung via ATP‐sensitiver Nanopartikel. Bachelorarbeit, FAU.

ZWACK, M. 2013. Vergleich des chromatografisch bestimmten Energy Charge mit dem Signal ATP‐sensitiver Nanopartikel. Bachelorarbeit, FAU.

ANHANG

‐Seite 212‐

9.4. Betreute wissenschaftliche Arbeiten und Ergebnisse

BINDL, S. 2013. Charakterisierung der Wirkung von Kobaltchlorid auf Endothelzellen. Untersuchung anhand verschiedener Analysemethoden im Hinblick auf die Etablierung eines Hypoxiemodells in der Zellkultur. Bachelorarbeit, FAU

ENGELHARDT, H. 2013. Non‐invasive Auswerteverfahren von Zytotoxizitäts‐Tests. Gegenüberstellung mit invasiven Verfahren zur extra‐ und intrazellulären Signalgenerierung. Masterarbeit, FAU

LESKO, C. 2013. Der Einfluss von Serumalbumin in Toxizitäts‐Studien. Bachelorarbeit, FAU

PRÄBST, K. 2011. Perfusion des Musculus rectus abdominis im MOPS System. Diplomarbeit, FAU

RUPPRECHT, F. 2012. Niedermolekulare Markersubstanzen für die Hypoxie und Reoxygenierung. Identifizierung und Etablierung via ESI‐MS/MS gekoppelter Ionenpaarchromatographie. Diplomarbeit, FAU

ZIERINGER, J. 2013. Etablierung intrazellulärer ATP‐Messung via ATP‐sensitiver Nanopartikel. Bachelorarbeit, FAU

ZWACK, M. 2013. Vergleich des chromatografisch bestimmten Energy Charge mit dem Signal ATP‐sensitiver Nanopartikel. Bachelorarbeit, FAU

10. ANHANG

10.1. Geräte und Chemikalien

Allgemeine Chemikalien und Reagenzien Tabelle 10-1: Liste der Chemikalien und Reagenzien

Bezeichnung Hersteller / Bezug Bestellnummer

2,4‐Dinitrophenol Sigma‐Aldrich, Steinheim D198501

Acetonitril, Bio‐analyzed J.T. Baker 8144

Ammoniaklösung 25% Aplichem 8M000663

Antimycin A Sigma‐Aldrich, Steinheim A8674

Ascorbatsäure ≥99 % Sigma‐Aldrich, Steinheim 11140

Cell Counting Kit‐8 (CCK‐8) Sigma‐Aldrich, Steinheim 96992

Creatin ≥98 % Sigma‐Aldrich, Steinheim C0780

Creatinphosphat ≥98 % Sigma‐Aldrich, Steinheim 27920

Dimethylsulfoxid, ROTIPURAN® Carl Roth GmbH, Karlsruhe 4720.3

Dinatriumhydrogenphosphat Carl Roth GmbH & C. KG, Karlsruhe T877.2

Ethanol Abs. Mallinckrodt Baker, Center Valley, PA (USA) JT9401‐22

FACSClean BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ (USA) 340345

FACSFLOW sheath fluid BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ (USA) 342003

FACSRinse BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ (USA) 340345

Glutamin/Ammonium‐Kit Megazyme, Bray (IRL) K‐GLNAM

Harnsäure ≥99 % Sigma‐Aldrich, Steinheim U2625

Hoechst 33342 Sigma‐Aldrich, Steinheim 14533

Hypoxanthin ≥99, 5 % Sigma‐Aldrich, Steinheim H9377

Ionomycin Sigma‐Aldrich, Steinheim I3909

ANHANG

‐Seite 213‐

Kaliumchlorid Carl Roth GmbH & C. KG, Karlsruhe HN02.1

Kaliumdihydrogenphosphat Carl Roth GmbH & C. KG, Karlsruhe P018.2

Kobaltchlorid‐Hexahydrat Sigma‐Aldrich, Steinheim C8661

Kobaltsulfat Sigma‐Aldrich, Steinheim C6768

Kupfer(II)‐chlorid‐Dihydrat Sigma‐Aldrich, Steinheim C3279

Laktat ≥99 % Sigma‐Aldrich, Steinheim 71718

Laktat‐Kit Megazyme, Bray (IRL) K‐LATE

Liqui UV‐Mono‐Reagenz (Glc) Human Diagnostics 10786

Metabolic Activity/Annexin V/Dead Cell Apoptosis

Invitrogen AG, Carlsbad, CA (USA) V35114

Methanol, MS‐Grade J.T. Baker HN4.1

Muse Annexin V & Dead Cell Kit Merck Millipore, Billerica, MA (USA) MCH100105

Muse Caspase 3/7 Merck Millipore, Billerica, MA (USA) MCH100108

Muse MitoPotential Merck Millipore, Billerica, MA (USA) MHC100110

Muse MultiCaspase Merck Millipore, Billerica, MA (USA) MHC100109

Natriumazid BioXtra Sigma‐Aldrich, Steinheim S8032

Natriumchlorid Sigma‐Aldrich, Steinheim S5886

Natriummalonat (dibasic monohydrate) Sigma‐Aldrich, Steinheim M4795

Natriumsulfit Sigma‐Aldrich, Steinheim S0505

Oligomycin A Sigma‐Aldrich, Steinheim 75351

ox. Glutathion ≥98 % Sigma‐Aldrich, Steinheim G4376

Propidiumiodid (2 mg/ml in VE) Sigma‐Aldrich, Steinheim P4170

Pyruvat ≥99 % Sigma‐Aldrich, Steinheim P2256

red. Glutathion ≥98 % Sigma‐Aldrich, Steinheim G4251

Rotenon Sigma‐Aldrich, Steinheim 45656

Tetraethoxypropan ≥96 % Sigma‐Aldrich, Steinheim T9889

Trypanblau Sigma‐Aldrich, Steinheim T6146

Wasserstoffperoxid 30 % Merck KGaA, Darmstadt 1072090250

Xanthin ≥98 % Sigma‐Aldrich, Steinheim X0626

YO‐PRO®‐1 ‐Iodid Invitrogen AG, Carlsbad, CA (USA) Y3603

Zelllinien Tabelle 10-2: Liste der verwendeten Zellen

Bezeichnung Hersteller / Bezug

CHO‐K1 (**) LS Biotechnik

L929 (**) LS Biotechnik

MHEC5‐T (**) Kryokultur BVT

Jurkat (*) Kryokultur BVT

HepZ (**) Kryokultur BVT

PAC (**) Primärzellen BVT

ANHANG

‐Seite 214‐

Zellkulturmedien und Zusätze Tabelle 10-3: Liste der Kulturmedien und Supplemente

Bezeichnung Hersteller / Bezug Bestellnummer / Charge

DMEM/F‐12 (1:1) (**) Life Technologies Kat.#: 21331046

RPMI 1640 (*) Life Technologies Kat.#: 31870025

Advanced DMEM (**) Life Technologies Kat. #: 12491015

Advanced RPMI (*) Life Technologies Kat.#: 12633012

OptiCHO (**) Life Technologies Kat. #: 12681011

Ex‐Cell 325 PF (**) Sigma‐Aldrich Kat.#: 14340C

DMEM w/o Glc, Gln, Pyr Life Technologies Kat.#: A14430‐01

FKS PAA Kat.#: A15‐101

Glutamin 200 mM Sigma‐Aldrich Kat.#: 59202C

Accutase® Sigma‐Aldrich Kat.#: A6964

ANHANG

‐Seite 215‐

Laborequipment und Geräte Tabelle 10-4: Liste der Geräte

Gerät Hersteller

Analysenwaage ABS Kern & Sohn GmbH, Balingen

Autoklav Systec V‐95 Systec GmbH, Wettenberg

CO2‐Inkubator Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach

Durchflusszytometer LSR BD, Franklin Lakes, NJ (USA)

Durchflusszytometer MuseTM Cell Analyzer Merck Millipore, Billerica, MA (USA)

Fluoreszenzmikroskop Nikon TE2000‐U Nikon GmbH, Düsseldorf

Gefrierschrank ‐20 °C Liebherr, Bulle (Schweiz)

Gefrierschrank –80 °C New Brunswick GmbH, Nürtingen

Glaspipetten 10 ml Brand GmbH, Wertheim




Hitzesterilisator Function line Heraeus GmbH, Hanau

HPLC‐Anlage (siehe Methode für Details) Shimadzu, Kyoto (JAP)

Kolbenhubpipette Transferpette 10 – 100 µl Brand GmbH, Wertheim

Kolbenhubpipette Transferpette 0,5 – 10 µl Brand GmbH, Wertheim

Kolbenhubpipette Transferpette 100 – 1000 µl Brand GmbH, Wertheim

Kühlschrank Profiline Liebherr, Bulle (Schweiz)

Laborwaage Extend Sartorius AG, Göttingen

ESI‐Massenspektrometer AB Sciex, Q‐Trap 2000

Multikanalpipette PipetLiteTM Mettler Toledo, Greifensee (CH)

Neubauer improved Zählkammer LO‐Laboroptik, Lancing (UK)

Pipettierhilfe accu jet Brand GmbH, Wertheim

SensorDish Reader (SDR) PreSens GmbH, Regensburg

Sicherheitswerkbank Klasse 2 HERAsafe Heraeus GmbH, Hanau

Tischzentrifuge Biofuge pico Heraeus GmbH, Hanau

Vertikalphotometer EnSpire 2300 Perkin Elmer, Waltham, MA (USA)

Vortexer Vortex‐Genie 2 Scientific Industries, New York (USA)

Zentrifuge Eppendorf 5810R Eppendorf, Wesseling‐Berzdorf

ANHANG

‐Seite 216‐

Verbrauchsmaterialien Tabelle 10-5: Liste sonstiger Verbrauchsmittel

Bezeichnung Hersteller / Bezug Bestellnummer

24 Well Platten CELLSTAR® greiner bio‐one, Kremsmünster (Österreich) 662160

96 Well Platten CELLSTAR® greiner bio‐one, Kremsmünster (Österreich) 655180

Eppendorf Reaktionsgefäße (1,5 ml) Sarstedt AG & Co, Nürnbrecht 72.690.001

Pipettenspitzen blau Sarstedt AG & Co, Nürnbrecht 70.762

Pipettenspitzen gelb Sarstedt AG & Co, Nürnbrecht 70.760.002

Pipettenspitzen kristall Sarstedt AG & Co, Nürnbrecht 70.1130

T‐Flasche, 25 cm2 & 75 cm² Sarstedt GmbH, Nürnbrecht 83.1810.00283.1811.002

Zentrifugenröhrchen (Falcon tubes) greiner bio‐one, Kremsmünster (Österreich) 22729

ThinCert® greiner bio‐one, Kremsmünster (Österreich) 662610

Millex‐HV Filter (Millipore, PVDF, 0,45 μm) Merck Millipore, Billerica, MA (USA) SLHVX13TL

Ultrazentrifugationseinheiten (Roti‐Spin MINI‐3)

Carl Roth GmbH & C. KG, Karlsruhe CL12.1

24‐Multiwell Platte OxoDish PreSens, Regensburg OxoDish®

24‐Multiwell Platte HydroDish PreSens, Regensburg HydroDish®

ANHANG

‐Seite 217‐

10.2. Wachstumskurven

CHO

Abbildung 10-1: CHO in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 218‐


ANHANG

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ANHANG

‐Seite 220‐


ANHANG

‐Seite 221‐

Abbildung 10-5: CHO in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 222‐


ANHANG

‐Seite 223‐


ANHANG

‐Seite 224‐

Abbildung 10-8: CHO in OptiCHO mit 0 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 225‐


ANHANG

‐Seite 226‐


ANHANG

‐Seite 227‐

Abbildung 10-11: CHO in Ex-Cell 325 PF mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 228‐

L929

Abbildung 10-12: L929 in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 229‐


ANHANG

‐Seite 230‐


ANHANG

‐Seite 231‐


ANHANG

‐Seite 232‐

Abbildung 10-16: L929 in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 233‐


ANHANG

‐Seite 234‐


ANHANG

‐Seite 235‐

Abbildung 10-19: L929 in OptiCHO mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 236‐

MHEC5-T

Abbildung 10-20: MHEC5-T in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

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ANHANG

‐Seite 238‐


ANHANG

‐Seite 239‐


ANHANG

‐Seite 240‐

Abbildung 10-24: MHEC5-T in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 241‐


ANHANG

‐Seite 242‐


ANHANG

‐Seite 243‐

Abbildung 10-27: MHEC5-T in OptiCHO mit 0 % FKS und 4 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 244‐

Jurkat

Abbildung 10-28: Jurkat in RPMI1640 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 245‐


ANHANG

‐Seite 246‐


ANHANG

‐Seite 247‐

Abbildung 10-31: Jurkat in Advanced RPMI mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 248‐


ANHANG

‐Seite 249‐


ANHANG

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HepZ

Abbildung 10-34: HepZ in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 251‐


ANHANG

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ANHANG

‐Seite 253‐


ANHANG

‐Seite 254‐

Abbildung 10-38: HepZ in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 255‐


ANHANG

‐Seite 256‐


ANHANG

‐Seite 257‐

PAC

Abbildung 10-41: PAC in DMEM/F-12 mit 10 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 258‐


ANHANG

‐Seite 259‐


ANHANG

‐Seite 260‐


ANHANG

‐Seite 261‐

Abbildung 10-45: PAC in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 2 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 262‐

Abbildung 10-46: PAC in Advanced DMEM mit 1 % FKS und 4 mM Glutamin

ANHANG

‐Seite 263‐

10.3. OUR Graphen

CHO

Abbildung 10-47: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl der CHO-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A oben links : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B oben rechts : +1 % FKS + 2 mM Gln, :+1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln; Bild C unten links : OptiCHO + 2 mM Gln; : OptiCHO + 4 mM Gln; : OptiCHO + 6 mM Gln; : Ex-Cell 325 + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

5

10

15

20

25

30

qO


Prozesszeit [h]

A DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

5

10

15

20

25

30

qO


Prozesszeit [h]

B Advanced DMEM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

5

10

15

20

25

30

qO


Prozesszeit [h]

C OptiCHO / Ex‐Cell 325 PF

ANHANG

‐Seite 264‐

L929

Abbildung 10-48: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl der L929-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A links : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : Advanced DMEM +1 % FKS + 2 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 4 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 6 mM Gln, OptiCHO + 4 mM Gln

MHEC5-T

Abbildung 10-49: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl der MHEC5-T-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A links : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : Advanced DMEM +1 % FKS + 2 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 4 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 6 mM Gln, OptiCHO + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

5

10

15

20

25

30qO


Prozesszeit

A DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

10

20

30

40

50

60

70

80

qO


Prozesszeit

B Advanced DMEM / OptiCHO

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

10

20

30

40

50

qO


Prozesszeit

A DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

10

20

30

40

50

qO


Prozesszeit


ANHANG

‐Seite 265‐

Jurkat

Abbildung 10-50: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl Jurkat-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A links :+ 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln

HepZ

Abbildung 10-51: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl HepZ-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A links : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

5

10

15

20

25

30qO


Prozesszeit

ARPMI 1640

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

5

10

15

20

25

30

qO


Prozesszeit

B Advanced RPMI

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

10

20

30

40

50

qO


Prozesszeit

ADMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

10

20

30

40

50

qO


Prozesszeit

B Advanced DMEM

ANHANG

‐Seite 266‐

PAC

Abbildung 10-52: Sauerstoffaufnahmeraten in pmol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl Jurkat-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A links : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln

10.4. ACR Graphen

CHO

Abbildung 10-53: Ansäuerungsraten in amol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl der CHO-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A oben links : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B oben rechts : +1 % FKS + 2 mM Gln, :+1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln; Bild C unten links : OptiCHO + 2 mM Gln; : OptiCHO + 4 mM Gln; : OptiCHO + 6 mM Gln; : Ex-Cell 325 + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

5

10

15

20

25

30

35

40

150160

qO


Prozesszeit

A DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

qO


Prozesszeit

B Advanced DMEM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B Advanced DMEM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

C OptiCHO / Ex‐Cell 325 PF

ANHANG

‐Seite 267‐

L929

Abbildung 10-54: Ansäuerungsrate in amol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl der L929-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A links : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : Advanced DMEM +1 % FKS + 2 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 4 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 6 mM Gln, OptiCHO + 4 mM Gln

MHEC5-T

Abbildung 10-55: Ansäuerungsrate in amol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl der MHEC5-T-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A links : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : Advanced DMEM +1 % FKS + 2 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 4 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 6 mM Gln, OptiCHO + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

-10

0

10

20

30

40

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-30

-20

-10

0

10

20

80

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]


ANHANG

‐Seite 268‐

Jurkat

Abbildung 10-56: Ansäuerungsraten in amol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl Jurkat-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A links :+ 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln

HepZ

Abbildung 10-57: Ansäuerungsrate in amol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl HepZ-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A links : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A RPMI 1640

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B Advanced RPMI

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10-8-6-4-202468

1012

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10-8-6-4-202468

1012

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B Advanced DMEM

ANHANG

‐Seite 269‐

PAC

Abbildung 10-58: Ansäuerungsrate in amol bezogen auf die Prozesszeit in Stunden und Lebendzellzahl PAC-Zellen in einem Wellvolumen von 600 µl. Bild A links : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

c H

+/ACD [am

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B Advanced DMEM

ANHANG

‐Seite 270‐

10.5. WST Graphen

CHO

Abbildung 10-59: Gemessener WST-Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der CHO-Zellen Bild A-1 und A-2 : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 und B-2s : +1 % FKS + 2 mM Gln, :+1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln; Bild C-1 und C-2: OptiCHO + 2 mM Gln; : OptiCHO + 4 mM Gln; : OptiCHO + 6 mM Gln; : Ex-Cell 325 + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5

Abs (450nm),t/LZZ t [10‐5ml/Zelle]

Prozesszeit [h]

A‐1DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5

Abs (450nm),t/LZZ g

es,t [10‐5ml/Zelle]

Prozesszeit [h]

DMEM/F‐12A‐2

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

Advanced DMEMB‐1

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

B‐2Advanced DMEM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

OptiCHO / Ex‐Cell 325 PFC‐1

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

C‐2OptiCHO / Ex‐Cell 325 PF

ANHANG

‐Seite 271‐

L929

Abbildung 10-60: Gemessener WST-Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der L929 Bild A-1 und A-2 : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 und B-2 : Advanced DMEM +1 % FKS + 2 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 4 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 6 mM Gln, OptiCHO + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

A‐1DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

A‐2DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

Advanced DMEMB‐1

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5Abs (450nm),t/LZZ t [10‐5ml/Zelle]

Prozesszeit [h]

Advanced DMEM / OptiCHOB‐2

ANHANG

‐Seite 272‐

MHEC5-T

Abbildung 10-61: Gemessener WST-Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der MHEC5-T-Zellen Bild A-1 und A-2 : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 und B-2 : Advanced DMEM +1 % FKS + 2 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 4 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 6 mM Gln, OptiCHO + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5

2,0


Prozesszeit [h]

A‐1DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5

Abs (450nm),t/LZZ g

es,t [10‐5/Zelle]

Prozesszeit [h]

A‐2DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

Advanced DMEM / OptiCHOB‐1

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0


Prozesszeit [h]

B‐2Advanced DMEM / OptiCHO

ANHANG

‐Seite 273‐

Jurkat

Abbildung 10-62: Gemessener WST-Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der Jurkat-ZellenBild A-1 und A-2 :+ 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 und B-2 : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

A‐1RPMI 1640

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

A‐2RPMI 1640

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

B‐1Advanced RPMI

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5

2,0


Prozesszeit [h]

B‐2Advanced RPMI

ANHANG

‐Seite 274‐

HepZ

Abbildung 10-63: Gemessener WST-Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der HepZ-Zellen Bild A-1 und A-2 : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 und B-2 : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

A‐1DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5


Prozesszeit [h]

A‐2DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5

2,0


Prozesszeit [h]

B‐1Advanced DMEM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0


Prozesszeit [h]

B‐2Advanced DMEM

ANHANG

‐Seite 275‐

PAC

Abbildung 10-64: Gemessener WST-Umsatz bezogen auf die Lebendzellzahl der PAC-Zellen Bild A-1 und A-2 : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 und A-2 : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5

4,5


Prozesszeit [h]

A‐1DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5


Prozesszeit [h]

A‐2DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

1,5

2,0


Prozesszeit [h]

B‐1Advanced DMEM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800,0

0,5

1,0

14


Prozesszeit [h]

B‐2Advanced DMEM

ANHANG

‐Seite 276‐

10.6. Glucose

CHO

Abbildung 10-65: Glucose-Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium (links) und zugehörige Verbrauchsrate (rechts) der CHO-Zellen. Bild A-1 & A-2 oben DMEM/F-12: ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 & B-1 mittig Advanced DMEM : +1 % FKS + 2 mM Gln, :+1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln; Bild C-1 & C-2 unten : OptiCHO + 2 mM Gln; : OptiCHO + 4 mM Gln; : OptiCHO + 6 mM Gln; : Ex-Cell 325 + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6

c Glc [g/l]

Prozesszeit [h]

A‐1DMEM/F‐12

WK‐A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐400

‐200

0

200

400

600

800

10002500

2600

c G

lc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A‐2DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6

c Glc [g/l]

Prozesszeit [h]

B‐1Advanced DMEM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐200

0

200

400

600

800

1000

cGlc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B‐2Advanced DMEM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6

7

c Glc [g/l]

Prozesszeit [h]


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

‐400

0

400

c G

lc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]


ANHANG

‐Seite 277‐

L929

Abbildung 10-66: Glucose-Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium (links) und zugehörige Verbrauchsrate (rechts) der L929-Zellen. Bild A-1 & A-2 : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 & B-2 : Advanced DMEM +1 % FKS + 2 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 4 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 6 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6

c Glc [g/l]

Prozesszeit [h]

A‐1DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

200

400

600

800

1000

1200

1400

c G

lc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A‐2DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6

c Glc [g/l]

Prozesszeit [h]

B‐1Advanced DMEM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐200

0

200

400

600

800

cGlc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B‐2Advanced DMEM

WK‐A

ANHANG

‐Seite 278‐

MHEC5-T

Abbildung 10-67: Glucose-Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium (links) und zugehörige Verbrauchsrate (rechts) der MHEC5-T-Zellen. Bild A-1 & A-2 : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 & B-2 : Advanced DMEM +1 % FKS + 2 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 4 mM Gln, : Advanced DMEM +1 % FKS + 6 mM Gln, OptiCHO + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6c G

lc [g/l]

Prozesszeit [h]

A‐1DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐200

0

200

400

600

800

1000

c G

lc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A‐2 DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6

c Glc [g/l]

Prozesszeit [h]

B‐1Advanced DMEM

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐600

‐300

0

300

600

900

1200

1500

cGlc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B‐2Advanced DMEM

ANHANG

‐Seite 279‐

Jurkat

Abbildung 10-68: Glucose-Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium (links) und zugehörige Verbrauchsrate (rechts) der Jurkat-Zellen. Bild A links :+ 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B rechts : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐1

0

1

2

3

4

5

6RPMI 1640

c Glc [g/l]

Prozesszeit [h]

A‐1

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐400

‐200

0

200

400

600

800

1000

cGlc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A‐2RPMI 1640

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐1

0

1

2

3

4

5

6

c Glc [g/l]

Prozesszeit [h]

B‐1Advanced RPMI

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐400

‐200

0

200

400

600

800

1000

nGlc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B‐2Advanced RPMI

ANHANG

‐Seite 280‐

HepZ

Abbildung 10-69: Glucose-Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium (links) und zugehörige Verbrauchsrate (rechts) der HepZ-Zellen.Bild A-1 & A-2 : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 & B-2 : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln, : +1 % FKS + 6 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6c G

lc [g/l]

Prozesszeit [h]

A‐1DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐1000

‐500

0

500

1000

cGlc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A‐2 DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6

c Glc [g/l]

Prozesszeit [h]

B‐1Advanced DMEM

WK‐A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐1000

‐500

0

500

1000

cGlc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B‐2Advanced DMEM

ANHANG

‐Seite 281‐

PAC

Abbildung 10-70 Glucose-Konzentration in g/l gemessen im Kulturmedium (links) und zugehörige Verbrauchsrate (rechts) der MHEC5-T-Zellen. Bild A-1 & A-2 : ohne FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 2 mM Gln, : + 10 % FKS + 4 mM Gln, : + 10 % FKS + 6 mM Gln; Bild B-1 & B-2 : +1 % FKS + 2 mM Gln, : +1 % FKS + 4 mM Gln

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6c G

lc [g/l]

Prozesszeit [h]

A‐1 DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐2000

‐1000

0

1000

2000

cGlc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

A‐2DMEM/F‐12

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

1

2

3

4

5

6

c Glc [g/l]

Prozesszeit [h]

B‐1Advanced DMEM

WK‐A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐2000

‐1000

0

1000

2000c

Glc/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

Advanced DMEMB‐2

ANHANG

‐Seite 282‐

10.7. Laktat

Abbildung 10-71: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von CHO-Zellen in DMEM/F-12 mit 10 % FKS + 2 mM Gln Bild B rechts Zugehörige Laktatbildungsrate

Abbildung 10-72: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von CHO-Zellen in Advanced DMEM mit 1 % FKS + 4 mM Gln Bild B rechts Zugehörige Laktatbildungsrate

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

2

4

6

8

10

12

c Lac [mM]

Prozesszeit [h]

A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐100

0

100

200

300

400

c L

ac/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

2

4

6

8

10

12

c Lac [mM]

Prozesszeit [h]

A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

‐200

‐100

0

100

200

300

400

c L

ac/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B

ANHANG

‐Seite 283‐

Abbildung 10-73: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von CHO-Zellen in Ex-Cell 325 PF mit 4 mM Gln Bild B rechts Zugehörige Laktatbildungsrate

Abbildung 10-74: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von L929-Zellen in DMEM/F-12 mit 10 % FKS + 4 mM Gln Bild B rechts Zugehörige Laktatbildungsrate

Abbildung 10-75: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von L929-Zellen in Advanced DMEM mit 1 % FKS + 4 mM Gln Bild B rechts Zugehörige Laktatbildungsrate

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

2

4

6

8

10

12c L

ac [g/l]

Prozesszeit [h]

A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐100

‐50

0

50

100

c L

ac/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

2

4

6

8

10

12

c Lac [mM]

Prozesszeit [h]

A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180‐100

0

100

200

300

c L

ac/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

2

4

6

8

10

12

c Lac [mM]

Prozesszeit [h]

A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

‐100

0

100

200

300

400

500

c L

ac/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B

ANHANG

‐Seite 284‐

Abbildung 10-76: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von Jurkat-Zellen in RPMI 1640 mit 10 % FKS + 4 mM Gln Bild B rechts Zugehörige Laktatbildungsrate

Abbildung 10-77: Bild A links Laktatverlauf in [mM] von Jurkat-Zellen in Advanced RPMI mit 1 % FKS + 4 mM Gln Bild B rechts Zugehörige Laktatbildungsrate

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

2

4

6

8

10

12

c Lac [mM]

Prozesszeit [h]

A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

0

100

200

300

400

c L

ac/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B

0 20 40 60 80 100 120 140 160 1800

2

4

6

8

10

12

c Lac [mM]

Prozesszeit [h]

A

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

0

100

200

300

400

cLac/ACD [fm

ol/Zelle x h]

Prozesszeit [h]

B

ANHANG

‐Seite 285‐

10.8. FACS Daten

Muse Annexin V

Abbildung 10-78: Muse Annexin V Dot-Plots für CHO Zellen nach 24-stündiger Einwirkdauer. Grün Kontrolle, Rot Versuch A: Rotenon 25 µM B: Malonat 20 mM C: Antimycin A 550 µM D: Azid 10 mM

E: Oligomycin A 2 µM F: 2,4‐Dinitrophenol 6,5 mM

ANHANG

‐Seite 286‐

MUSE MitoPotential

Abbildung 10-79: MUSE MitoPotential bei CHO Zellen nach 4-stündiger Einwirkdauer A: Rotenon 25 µM B: Malonat 20 mM C: Antimycin A 550 µM D: Azid 10 mM


ANHANG

‐Seite 287‐

Abbildung 10-80: MUSE MitoPotential bei CHO Zellen nach 24-stündiger Einwirkdauer A: Rotenon 25 µM B: Malonat 20 mM C: Antimycin A 550 µM D: Azid 10 mM


ANHANG

‐Seite 288‐

Caspase 3/7

Abbildung 10-81: Caspase 3/7 Aktivität von CHO Zellen nach 4-stündiger Einwirkdauer A: Rotenon 25 µM B: Malonat 20 mM C: Antimycin A 550 µM D: Azid 10 mM


ANHANG

‐Seite 289‐

Abbildung 10-82: Caspase 3/7 Aktivität von CHO Zellen nach 24-stündiger Einwirkdauer A: Rotenon 25 µM B: Malonat 20 mM C: Antimycin A: 550 µM D: Azid 10 mM

E: Oligomycin A: 2 µM F: 2,4‐Dinitrophenol 6,5 mM

ANHANG

‐Seite 290‐

MultiCaspase

Abbildung 10-83: MultiCaspase Aktivität von CHO Zellen nach 24-stündiger Einwirkdauer A: Rotenon 25 µM B: Malonat 20 mM C: Antimycin A 550 µM D: Azid 10 mM


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