Principios bsicos y simples de la tecnologatransgnica y knock-out

ANA MILENA HERRERA TORRES1

E

RESUMEN

Forma de citar: Herrera AM. Principios bsicos y simples de la tecnologa transgnica y knock-out . Rev CES Med 2005; 19(1): 43-51

Raton Knock-outRatn transgnicoRatn quimrico

PALABRAS CLAVE

l desarrollo de los animales knock-out ha permitido grandes avances en la investigacinmdica moderna y en la creacin de nuevas alternativas teraputicas para diferentes enfermedades. Hasta la fecha, la habilidad humana para manipular el genoma murino ha transformado dramticamente la investigacin cientfica a nivel mundial. Durante la ltima dcada, lastecnologas transgnica convencional y de knock-out gentico se han convertido en herramientas deincalculable valor para la modelacin de desordenes genticos, para la asignacin de diferentes funciones a diferentes genes, para la evaluacin de drogas y toxinas, y para la resolucin de importantespreguntas en la investigacin bsica y aplicada. Actualmente, el uso de ambos, animales transgnicosy knock-out, se ha convertido en una prctica estndar global en la investigacin biomdica. Debido alos grandes y acelerados avances en la tecnologa molecular, es necesario poseer un conocimientobsico simple y actualizado acerca de las tcnicas usadas para la manipulacin gentica murina, quepuedan servir como instrumento para la generacin de nuevas ideas en la investigacin cientfica. Estarevisin tiene como objetivo repasar los conceptos elementales de la tecnologa knock-out para un fcilentendimiento de la misma.

PhD Patologa. Docente Facultad de Medicina CES. Grupo Ciencias Basicas y Epidemiolgicas. E-mail: aherrera@ces.edu.co

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Recibido: 2 junio/ 2005, Revisado: 16 junio/2005, Aceptado: 8 julio/ 2005

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EL CONCEPTOPara poder entender como se disean y desarrollan los ratones transgnicos y knock-out es necesario repasar los conceptos bsicos que definen losmismos:

caciones realizadas a nivel geonmico a travs demutagnesis de un gen blanco son ampliamenteaplicadas en la investigacin cientfica y las tcnicas utilizadas para este propsito valen la pena serentendidas hasta por el cientfico o medico msnovato.(2) Para explicarlo de una manera simple, estas tcnicas (transgnica y knock-out), hacen posible el diseo de ratones carentes de productos derivados de un gen seleccionado o que exhiben diferentes propiedades regulatorias del mismo. Es poresto que, la tecnologa del knock-out genticocuenta en la actualidad con un enorme impacto enmuchas, sino en todas las disciplinas mdicas.

Durante los ltimos 20 aos, la exploracin bsicade la funcin de los genes ha sido proporcionadaeficientemente por experimentos transgnicos y deknock-out. Aunque el gran beneficio de esta tecnologa para el avance en investigacin biomdicaha sido comprobado y en muchos aspectos sus tcnicas se encuentran estandarizadas y bien documentadas, estos experimentos han mostrado a suvez serias limitaciones intrnsecas a la manipulacingentica convencional.(1) Sin embargo, las modifi-

INTRODUCCIN

Knock-out mouseTransgenic mouseChimeric mouse

KEY WORDS

The development of knockout animals has allowed for majoradvances in modern medical research and at the same timehas provided numerous advances in drug therapy. To datethe human ability to engineer the mouse genome hasprofoundly transformed biomedical research in numerousways and worldwide. During the last decade alone,conventional transgenic and gene knock-out technologieshave become invaluable experimental tools for modelinggenetic disorders, assigning functions to genes, evaluatingdrugs and toxins, and by and large helping to answer fundamental questions in basic and applied research. Usingboth transgenic and knock-out animals has become a global standard practice in biomedical research in this dayin-age. Due to the big and fast advances in moleculartechnologies, a good state-of-principle knowledge about thetechniques used to manipulate and engineer the murinegenome could help as a tool to generate new ideas inscientific research. Therefore, this review is intended to revisitthe basic concepts in the knock-out technology for an easyunderstanding of it.

SUMMARY

Ratn transgnico: Se refiere a un ratn en elcual material gentico clonado ha sido transferido. Simplificando, es aquel que posee un genextrao que ha sido insertado deliberadamentedentro de su genoma.(2) Ratn knock-out: Este es bsicamente un ratnproducto de un ratn transgnico o quimeraen el cual el gen insertado no se expresa o es ungen nulo.(2) Ratn quimera: Este es un ratn que consisteen dos o mas tipos celulares genticamente diferentes y derivados de diferentes cigotos. Esun ratn que posee clulas y tejidos con diferente informacin gentica.(2) Gen blanco: Es el gen de inters, el gen que sequiere mutar o anular. Transgen: Gen mutado que reemplaza al genblanco.(2) Vector: Es un agente que lleva un fragmento deADN al interior de una clula husped. Es untransportador similar a un virus, pero que noposee cubierta proteica y no se puede moverde clula a clula como lo hace un virus.(2)

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VARIABLES

En otro proceso para la creacin de ratonestransgnicos, se realiza la inyeccin del gen elegidoen el pro-ncleo masculino de un vulo fertilizadopero que no ha iniciado su proceso de divisin.(10)Este embrin (vulo fecundado despus de su primera divisin mittica) que ya lleva el transgen ensu interior, es implantado en el tero de una ratonapreviamente preparada para poder anidar el huevofecundado. De esta manera se obtienen cras delas cuales el 5- 40% sern portadoras del gen inyectado y que sern identificadas a travs del anlisis de su DNA.(7, 9, 10)

Para llevar a cabo alguno de estos procedimientoscomplejos, se deben tener en cuenta numerosasvariables como se explica a continuacin:

Seleccin de lneas celulares (clulasmadre embrionarias)

Para poder crear un ratn knock-out y para poderapuntar a un gen de inters particular (blanco) sepueden realizar dos procesos diferentes: En uno delos procesos de creacin de ratones knock-out otransgnicos, es necesaria la construccin de unvector (transportador) que lleve en s un marcadorcon secuencias flanqueadoras homlogas al ADNgenmico del gen blanco.(1) Posteriormente, estevector se introduce a una lnea celular embrionariamediante el mtodo de transfeccin.(3) La secuencia homloga que lleva el vector facilita su insercin dirigida al genoma del husped y es as comoel gen introducido reemplaza al gen con la secuencia original, en un proceso denominado recombinacinhomologa. (9, 11, 12) Las clulas embrionarias que hayan sido exitosamente mutadas en el gen blancosern luego inyectadas a embriones en etapablastocstica (tres y medio das de madurez) o sern co-cultivadas con embriones en etapa de mrula(dos y medio das de madurez) para luego ser implantados en el animal. As, estas clulas contribuirn a la formacin de tejidos del animal en desarrollo, as como tambin entrarn a hacer parte de lasclulas de la lnea germinal.(3) Este proceso darcomo resultado ratones quimricos que, a travsde cruces selectivos con ratones sanos, darn comoresultado ratones heterocigticos para el gen deseado y el cruce de stos a su vez, producirn finalmente ratones knock-out homocigticos.(2, 4, 6)

Secuencia flanqueadora: Regin de un gen queprecede o sigue a la regin de transcripcin. Esel ADN a cada lado de un gen blanco.(2) Transfeccin: Introduccin de material genticoo ADN a una lnea celular especfica a travs dediferentes mtodos como electroporacin y precipitacin con fosfato de calcio entre otros.(2) Recombinacin homloga: Intercambio o reemplazo de una regin de ADN por una secuenciade ADN homloga perteneciente a uncromosoma homlogo.(2) Heterocigotos: Que posee dos formas diferentes de un gen particular, cada uno heredado decada progenitor.(2) Homocigotos: Que posee dos copias idnticasde un mismo gen, cada uno heredado de cadaprogenitor.(2)

Las clulas madre embrionarias, son derivadas declulas totipotenciales de la masa celular internade blastocistos en etapa de pre-implantacin. Estas clulas madre son capaces de realizar proliferacin ilimitada e indiferenciada in vitro y de mantener su capacidad para diferenciarse en todos losdiversos tipos de clulas tisulares. Para poder conservar la pluripotencialidad y viabilidad de estasclulas ex vivo es necesario mantenerlas en un medio de cultivo apto y en presencia de factoresinhibidores de diferenciacin.(3) El medio de cultivoapto se basa en la presencia de fibroblastos primarios mitticamente inactivados y extrados de tejido embrionario de ratones entre los das 13-14 degestacin, que sirven principalmente como matrizpara favorecer la adherencia celular y para alimentar a las clulas madre. En cuanto a los factoresinhibidores de diferenciacin, el ms utilizado es elfactor inhibidor de leucemia (LIF) que es unaglicoprotena multifuncional de la familiainterleuquina 6 de las citoquinas y que tiene mltiples efectos en diferentes rganos y sistemas. El

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el marcador de resistencia a la neomicina no diferencia las clulas cuyo gen mutado es el gen blanco u otro gen diferente. (14) Para sto, en el vectortambin se puede insertar otros cassettes genticosque contengan transgenes que permitan la seleccin negativa de clulas en las que la recombinacinsucedi en lugares incorrectos. En este cassettegentico se inserta un gen de susceptibilidad a algn antiviral o antibitico de una manera que alexistir recombinacin homloga, este gen o cassette sea eliminado y no se exprese. En caso deocurrir recombinacin no-homloga, aquellas clulas que expresen el gen morirn en presencia deesta droga (susceptibilidad), es por esto que se ledenomina seleccin negativa. (13, 14)

Vector de reemplazo del genblancoGen blanco

Neor

Gen blanco mutadoLas clulas son resistentes ala neomicina

Figura 1. Recombinacin homloga. El vector incluye las secuencias flanqueadoras homlogas al gende inters (en color prpura) y el cassette genticoque contiene el neor gen (color rojo). El gen blanco,es decir el gen que se quiere anular (color amarillo)ser reemplazado por el cassette gentico durantela recombinacin homloga cuando las secuenciashomlogas (prpura) se combinen y permitan el intercambio de ambos genes. Las clulas inyectadascon el transgen resultante no poseern el gen original y presentaran resistencia a la neomicina, lo quefacilitara su seleccin en cultivo.

Produccin de ratones quimricos yknock-out

Recombinacin homologa

El vector o transportador, debe ser construido conun clon genmico que contenga secuenciasflanqueadoras homlogas a las secuenciasflanqueadoras del gen blanco. Estos vectores sonpiezas de ADN genmico de tamao mediano, deaproximadamente 6.000 a 8.000 pares de basesde largo, que son replicas cercanas de genesendgenos y que contienen tanto exones (secuencias de codificacin) como intrones (secuencias deintervencin).(10) Para apuntar al gen blanco, el vectores construido con secuencias flanqueadorashomlogas a las del gen blanco mas las secuenciasusadas para desactivar este mismo, as como tambin es construido con un cassette gentico quecontiene el neor, un gen de resistencia a laneomicina que codifica la enzima bacterialaminoglicsido-transferasa (APH), que se expresaen clulas mamferas y que produce resistencia alos antibiticos aminoglicsidos.(7, 9, 10) Cuando elvector entra a las clulas madre por el mtodo detransfeccin, ocurre una recombinacin homlogadel gen transportado por el vector con el gen blanco, esto es, recombinacin de las secuenciasflanqueadoras homlogas de ambos genes y el intercambio del gen blanco por el cassette que contiene el neor. Es as como el gen de inters es reemplazado o anulado (Knock-out) (Fig 1). (11, 12) Sin embargo, en algunas ocasiones se puede presentar elfenmeno de recombinacin no-homloga, en laque el gen husped se combina con otro gen y comoresultado el gen blanco no sufre mutacin alguna.El neor gen, acta como un marcador positivo paraseleccionar a todas las clulas que contienen ungen mutado transgen (homlogo y no-homlogo) por su resistencia a la neomicina. Sin embargo,

Diseo del vector, mutacin del gen yseleccin celular

LIF regula el crecimiento y la diferenciacin de lasclulas madre embrionarias, al tiempo que aumenta su proliferacin. Esto asegura la preservacin dela pluripotencialidad de las clulas embrionarias quelas hace aptas para la transfeccin de materialgentico durante el proceso de creacin de un ratn knock-out. (3)

Las clulas madre embrionarias transfectadas yexitosamente seleccionadas, son inyectadas en losembriones de ratn. Estos son posteriormente imRevista CES MEDICINA Volumen 19 No.1 Enero - Junio / 2005

portar los genes alterados. (5, 9, 14) Cuando estosanimales se cruzan con animales sanos, las crasresultantes heredarn una copia del cromosomaque lleva la mutacin y que proviene de la clulamadre embrionaria transfectada, as estos sernanimales mutados heterocigotos. Posteriormente,es necesario que estos animales heterocigotos secrucen entre s para obtener ratones que tengandos copias del gen mutado (una de cada progenitor), es decir, animales homocigotos knock-out.Estos animales presentan una ausencia completadel gen normal (Fig. 2).(14)

plantados en hembras pseudopreadas, esto es,hembras hormonalmente preparadas para recibir eimplantar un embrin despus de ser cruzadas conratones estriles. (1,9) As, algunos de los ratones quenacen son quimricos, estos presentarn dos tiposdiferentes de clulas: Aquellas que correspondenal genoma del ratn original (embriones), as tambin como las clulas derivadas de las clulas madre embrionarias manipuladas, que llevan el genmodificado integrado en su genoma. El esperma uvulo presente en los ratones quimricos, si provienen de las clulas introducidas en el blastocisto,

Donante deblastocistos

Clulasmadretransfectadas

Donante declulas madre

Hembra pseudopreada

+

+/-

+

+/-

Cruce deheterocigotos

Ratnquimrico

-/

+/-

Ratnknock-out

+/+

Figura 2. Produccin de ratn knock-out.

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Estos embriones en etapa de blastocisto son entonces implantados en una hembra pseudopreadapara la obtencin de los ratones transgnicos. Si laintegracin del ADN forneo en el genoma celularsucede antes de la fusin de los 2 pro-ncleos, lasprobabilidades de obtener un ratn transgnicopuro son muy altas. Sin embargo, si la integracindel ADN al genoma celular sucede despus de lafusin pro-nuclear, se obtendrn ratones quimricos en los que unos tejidos y clulas contarn conel transgen y otros no. (5, 9) Una vez obtenida lascras se procede a la identificacin de la progenietransgnica mediante anlisis del ADN. El porcentaje de ratones transgnicos puros obtenidos usualmente a travs de esta tcnica no excede el 20% ycon el cruce consecutivo de estos ratones se obtendr un ratn transgnico homocigtico, el cuales apto para el estudio de los efectos de diferentesgenes en la expresin proteica de los organismos(Fig. 3). (9, 14)

Transgen

Para obtener ratones transgnicos a travs de inyeccin pro-nuclear, es necesario realizar primerola identificacin y el aislamiento del fragmento deADN o transgen deseado y que va a ser transferido.(1) Este transgen debe aislarse de la misma cepaanimal a la cual va a ser inyectado y tambin debeobtenerse en una cantidad suficiente para realizaruna microinyeccin exitosa. Al mismo tiempo sedeben extraer los embriones de menos de 8 horas(antes de la fusin de los pro-ncleos) de una ratonaa la cual se le indujo super-ovulacin (suministrohormonal para gran produccin de vulos) y quese cruz con un macho de la misma raza. Posteriormente, bajo un microscopio de micro-manipulacin se realiza la micro-inyeccin del ADN forneo en el pro-ncleo masculino (de mayor tamaoque el femenino) y se espera a que se produzca lafusin pro-nuclear y la proliferacin celular. (1, 5, 8, 9)

Inyeccin en el pro-ncleo para laformacin de ratones transgenicos:

Hembra pseudopreada

Identificacin de ratones transgenicos

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A la fecha, hay ms de 3.000 ratones knock-outque han sido desarrollados. En los prximos aos,es muy posible que se induzcan ms anulaciones a

DATOS PARA TENER ENCUENTA

Figura 3. Produccin de ratn transgnico.

la mayora de los genes en el genoma murino, loque suman aproximadamente 30.000 genes. (10) Elfuturo parece entonces muy promisorio para la investigacin biomdica y para el desarrollo de nuevos medicamentos, si se consideran los potenciales avances al combinar la gentica murina y laaproximacin fisiopatolgica de las enfermedades.Revista CES MEDICINA Volumen 19 No.1 Enero - Junio / 2005

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Los ratones knock-out son una herramienta maravillosa usada para estudiar la funcin de genes especficos en algn sistema del organismo. A pesarde todas sus limitaciones y desatinos, esta tcnica

CONCLUSIONES

Hay sin embargo, muchas limitaciones en el modelo knock-out que deben ser consideradas. Entreellas, la mas importante se trata de los efectosdeletreos que tiene en el organismo el anular genesblancos. La anulacin de la funcin de un gen puede causar severas alteraciones en el proceso dedesarrollo del organismo, como tambin alterar subalance homeosttico normal, causando una regulacin compensatoria o secundaria al nivel delgenoma o del organismo por si mismo o tambinpuede causar la muerte del animal en desarrollo.Estos efectos, no fisiolgicos pueden alterar de granmanera el anlisis objetivo de los efectos que tienela nulidad de un gen en particular sobre la expresin protica y el desarrollo de un organismo.(15)Surgen entonces muchos interrogante en cuantola verdadera utilidad de esta tecnologa: Evita lacompensacin gentica la identificacin de la verdadera funcin de los genes?, Que tan relevantees el modelo knock-out en las etapas del desarrollodel organismo para la investigacin de los efectosde un gen en el adulto? y Previene la letalidadembrinica la identificacin de muchos de los genesblancos no identificados en el organismo normal?Adems, aunque hay similaridades entre los mamferos (ratones, conejos, humanos, etc.), los resultados obtenidos en ratones no pueden ser directamente extrapolados o interpretados para los humanos porque, tan cientficamente maravillosocomo parezcan, los ratones knock-out no son tiles para estudiar todos los defectos mdicos, puesestos carecen de las funciones mas refinadas quelos humanos poseen. (8) Sin embargo, estudios retrospectivos (cuando se deja el escepticismo a unlado), han demostrado que los ratones knock-outpueden ser altamente informativos en el descubrimiento de la funcin de un gen y ser de gran utilidad farmacutica para la identificacin del efectode un medicamento. (7, 8, 10,15)

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