Diagnóstico laboratorial dos parasitas sistêmicos
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Diagnóstico laboratorial dos
parasitas sistêmicos
Parte 1
Profa. Dra. Irene Soares FCF/USP
2020
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• Malária
• Doença de Chagas
• Toxoplasmose
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Etiologia:
• Gênero: Plasmodium
• Espécies: > 100 espécies
• No homem: P. falciparum
P. vivax
P. malariae
P. ovale
P. knowlesi
Malária
No Brasil
O P. vivax é responsável por ~90% dos casos no Brasil
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Esquizogonia
tecidual ~ 15 dias
(assintomática)
Ciclo biológico
Esquizogonia
sanguínea
(sintomática)
Anopheles sp
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Manifestações Clínicas
Outros sintomas:
o Dor de cabeça
o Dores musculares
o Fadiga
o Náuseas e vômito
Febre Calafrios Sudorese
Malária grave:
o Complicações renais
o Complicações respiratórias
o Complicações hematológicas
o Malária cerebral
Convulsões WHO 2017
dre
amst
ime.
com
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Diagnóstico laboratorial
Exame microscópico:
Pesquisa do parasita no sangue em preparações
coradas
Diagnóstico de espécie é extremamente importante para
efeito de tratamento!
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Coleta do Material
Punção digital
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Esfregaço Delgado:
Visualização dos parasitas através de microscopia óptica após coloração com Giemsa
Parasitos dentro dos eritrócitos
Melhor identificação da morfologia
Método auxiliar (alta especificidade)
Gota Espessa:
Visualização dos parasitas através microscopia óptica após coloração com Azul de metileno fosfatado e Giemsa
Parasitos fora dos eritrócitos
Sensibilidade (20-30x mais alta)
Simples, fácil execução, eficaz e baixo custo
Método de escolha (alta sensibilidade)
Tipos de esfregaço
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Fino (esfregaço delgado) Espesso (gota espessa)
Coloração de Giemsa
Fixação (álcool metílico)
Coloração de Giemsa
Preparo do esfregaço
Diagnóstico microscópico:
Desemoglobinização
(Azul de metileno fosfatado)
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1ª fase: Desemoglobinização Azul de metileno
2ª fase: coloração Giemsa
10 minutos
Enxague: água tamponada
Enxague: água tamponada
Secagem: TA e observação:100X
Coloração
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Características morfológicas dos parasitas em esfregaços sanguíneos
espessos (gota espessa)
P. vivax
P. falciparum
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Método semi-quantitativo:
Pv: “Cruzes”; Exame de 100 campos;
Pf: Avaliação Relativa;
200 leucócitos.
Vantagem: concentra maior quantidade de sangue desemoglobinizado em uma
área relativamente pequena - aumenta a probabilidade de se encontrar parasitas
Desvantagem: requer experiência para a identificação de espécies, uma vez que
a morfologia do parasita altera-se durante o processo de desemoglobinização.
Gota espessa
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Formas sangüíneas (dentro das hemácias)
trophozoites schizonts gametocytes
P. falciparum
P. vivax
P. malariae
P. ovale
Trofozoítas Esquizontes Gametócito
P. vivax e P. ovale infectam eritrócitos jovens (reticulócitos)
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P. falciparum
Trofozoítas
jovens
Trofozoítas
maduros (raros no sangue
periférico)
Esquizontes (raros no sangue
periférico)
Gametócitos
(aparecem na
2ª semana da
parasitemia)
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P. vivax
Trofozoítas
maduros
Esquizontes Gametócitos
(aparecem
precocemente)
Trofozoítas
jovens
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Estágio P. falciparum P. vivax P. malariae P. ovale
Células vermelhas
infectadas
Tamanho normal,
granulações de
Maurer e pigmento
malárico
Aumentadas, presença
de grânulos de
Schuffner
(avermelhados)
Tamanho normal ou
menores do que o
normal
Aumentadas, podem
ser ovais com fímbria,
presença de grânulos
de Schuffner
Trofozoíta jovem Pequeno e delicado,
freqüente 2 grânulos
na cromatina,
frequente 2 ou mais
anéis por célula
Pouco aumentado, 1
ou 2 grânulos na
cromatina, podem ser
2 anéis por célula
vermelha
Compacto, 2 anéis
por célula vermelha
do sangue, raro
Compacto, 2 anéis
por célula vermelha
do sangue, raro
Trofozoíta maduro Tamanho moderado,
normalmente
compacto, pigmento
granular
Aumentado,
amebóide, pigmento
visto em bastões finos
Pequeno, compacto,
frequente, forma de
banda, pigmento
grosseiro
Pequeno, não
amebóide, pigmento
grosseiro
Esquizonte
Raros em sangue
periférico, merozoítas
pequenos (16-24)
Grandes, merozoítas
grandes (12-24)
Pequenos,
merozoítas grandes
(6-12), pigmento
grosseiro
Menores do que
P. vivax, 6-12
merozoítas, pigmento
mais escuro do que
P. vivax
Gametócitos Forma lua crescente
ou banana, núcleo
único
Esféricos, compactos,
núcleo único, pigmento
difuso e grosseiro
Similares a P. vivax,
porém menores e
menos numerosos,
grânulos de Schuffner
ausentes
Similares a P. vivax,
porém menores
Características morfológicas dos parasitas em esfregaços sanguíneos delgados
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Diagnóstico laboratorial
Testes rápidos de detecção de antígenos: (imunocromatográficos):
Antígenos: HRP2 (Pf), LDH (Pf ou Pv/Pm/Po)
realizado em áreas de difícil acesso
não devem ser usados para controle de cura devido
à possível persistência de partes do parasita
Testes para detecção de anticorpos: Imunofluorescência indireta
ELISA
permanece positivo após o tratamento
Nested PCR
detecção de casos assintomáticos e infecções mistas (sensibilidade)
Dentre as espécies que infectam o homem, o Pf é a única que pode ser cultivada continuamente in vitro
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Testes rápidos de detecção de antígenos:
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•Lane S: Molecular base pair standard (50-bp ladder). Black arrows show the size of standard bands.
•Lane 1: The red arrow shows the diagnostic band for P. vivax (size: 120 bp)
•Lane 2: The red arrow shows the diagnostic band for P. malariae (size: 144 bp)
•Lane 3: The red arrow shows the diagnostic band for P. falciparum (size: 205 bp)
•Lane 4: The red arrow shows the diagnostic band for P. ovale (size: 800 bp)
Diagnóstico por PCR
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P. vivax
Todas as formas:
Trozoítas (anel)
Esquizontes
Gametócitos
Aula Prática Identificação de P. vivax e P. falciparum
em preparações coradas
P. falciparum
Trozoítas (anel)
Gametócitos
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Etiologia:
Trypanosoma cruzi Tripanossomíase americana
Outras espécies de Trypanosoma:
T. brucei Doença do Sono (África)
T. rangeli Não patogênico (Américas)
Doença de Chagas
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Estágios evolutivos do parasita
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Biologia do parasita (formas evolutivas)
Amastigota:
(no hospedeiro vertebrado, em cultura de células e animais de laboratório)
Tripomastigota:
(no hospedeiro vertebrado, em
cultura de células e animais de
laboratório)
Epimastigota (no inseto vetor – “barbeiro”
e em cultura axênica)
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Ciclo biológico do Trypanosoma cruzi
Vetor
(Reduviidae) Hospedeiro
vertebrado
https://www.chagasfound.org/chagas-disease/life-cycle/
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Desenvolvimento da Doença de Chagas no homem
Contaminação por T. cruzi
Fase aguda
(3 a 4 meses)
Tratamento
(cura)
Fase crônica
indeterminada (anos ou décadas)
Morte
Evolução benigna
Evolução maligna
Formas crônicas:
Cardíaca, digestiva
ou mista Morte
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Diagnóstico laboratorial
Exame Microscópico
Hemocultura
Xenodiagnóstico
PCR
Parasitológico
Detecção
de IgM
Sorológico
Diagnóstico
FASE AGUDA Parasitemia patente
Hemocutura
Xenodiagnóstico
PCR
Parasitológico
Detecção
de IgG
Sorológico
Diagnóstico
FASE CRÔNICA Parasitemia subpatente
FASES DA INFECÇÃO FASES DA INFECÇÃO
Diagnóstico
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Diagnóstico parasitológico
Microscopia detecção de tripomastigotas no sangue:
Exame a fresco em lâmina (+ sensível)
Gota espessa ou esfregaço corado com Giemsa ou Leishman
Centrifugação em tubos capilares (micro-hematócrito):
sensibilidade (80 a 90%)
A fresco (lupa entomológica)
Corado
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Diagnóstico parasitológico
Xenodiagnóstico:
Consiste na alimentação de ninfas de triatomíneos não infectados
(criados em laboratório) com o sangue de pacientes – 5 a 10 ninfas
mantidas em jejum por 3 a 4 semanas.
Natural (Émile Brumpt, 1914)
Em desuso Artificial
30, 60 e 120 dias
Exame
das
Fezes
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Diagnóstico parasitológico
Hemocultura:
Cultura do sangue em meio LIT (liver infusion
tryptose) – 28oC
Leitura: 30, 45, 60, 90 e 120 dias exame a fresco
ou com coloração vital (azul de metileno)
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Diagnóstico parasitológico
MÉTODO SENSIBILIDADE
(Fase Aguda)
SENSIBILIDADE
(Fase Crônica)
Microscopia 50 - 90%
Xenodiagnóstico 85 - 100% ~ 50%
Hemocultura 100% ~ 50%
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Diagnóstico sorológico (Sorologia convencional)
Métodos: Hemaglutinação indireta (HAI)
Imunofluorescência indireta (IFI)
Ensaio imunoenzimático (ELISA)
Antígenos de T. cruzi: Extratos totais
Frações semi-purificadas
(epimastigotas)
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Realizar: Sorologia para IgM (ELISA e IFI) e Parasitológico
ELISA (+) e IFI para IgM (+) Parasitológico (-) e/ou
Parasitológico (+)
Tratamento ELISA (+) e ELISA (-) e
IFI para IgM (-) IFI para IgM (+)
Reavaliar
Condutas para o Diagnóstico Laboratorial
de Doença de Chagas Aguda (DCA)
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Realizar 2 testes sorológicos (IgG): ELISA, IFI ou HAI
Ambos 1 reagente Ambos não
reagentes 1 não reagente reagentes
POSITIVO INCONCLUSIVORepetir NEGATIVO
Se permanecer
Inconclusivo,
Realizar PCR e WB
Condutas para o Diagnóstico Laboratorial
de Doença de Chagas Crônica
Iniciar
tratamento
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Outros métodos disponíveis
• Western blot (WB) utilizando antígenos nativos: antígenos
de excreção-secreção (tripomastigotas)
• ELISA utilizando antígenos recombinantes
( especificidade)
• PCR: para o controle da parasitemia pós-tratamento
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Caso confirmado de Doença de Chagas
Congênita
Recém-nascido de mãe com exame parasitológico ou sorológico
positivo para T. cruzi e que apresente:
• Exame parasitológico positivo a partir do nascimento
Material: sangue do cordão umbilical, sangue periférico
Ou
• Exame sorológico positivo a partir do 6º mês de nascimento e sem
evidência de infecção por outras formas de transmissão.
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Tripomastigota
Aula Prática Identificação de Trypanosoma cruzi em
preparações coradas
Epimastigota
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Toxoplasmose
Agente etiológico: Toxoplasma gondii
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Oocistos
esporulados (fezes de gato)
Cistos contendo
bradizoítas (carne crua ou mal
cozida: porco,
carneiro)
Taquizoítas
(fase aguda)
Cistos (bradizoítas)
(fase crônica)
Transmissão placentária
de taquizoítas
Células epiteliais,
musculares e nervosas
Ciclo biológico do T. gondii
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Infecções primárias adquiridas após o nascimento:
• Em imunocompetentes:
- Assintomáticos (90%)
- Quadro autolimitado de linfadenopatia febril (<1%)
» Infecções crônicas: o parasita persiste sob a forma de cisto
• Em imunocomprometidos: as manifestações incluem sinais de
comprometimento dos pulmões, dos olhos, do coração e, sobretudo,
do cérebro. Pode ocorrer reativação de infecções crônicas latentes
(cérebro, olho)
Infecções congênitas: Quadros clínicos de diferentes gravidades
Manifestações Clínicas
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Diagnóstico Laboratorial da Toxoplasmose
Adquirida
• Isolamento do parasita por inoculação de amostras clínicas em
camundongos: 6 a 10 dias → pesquisa de taquizoítas no líquido peritoneal
ou cistos no cérebro ou outros orgãos
Material: sangue, humor aquoso, homogenatos de placenta, LCR
Diagnóstico Parasitológico
» Limitações:
- resultados demorados
- riscos para o manipulador
- custo
Taquizoítas
coletados de
líquido peritoneal
de camundongo
inoculado com T.
gondii (Giemsa)
Cisto contendo
bradizoítas
(tecido cerebral, HE)
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• Semeadura do material em cultura de
células (fibroblastos) IFI
Material: sangue, LCR, líquido amniótico
• Histopatológico: pesquisa de
taquizoítas e cistos em tecidos
Diagnóstico Parasitológico
» Limitações:
- resultados demorados
- custo elevado
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• Hemaglutinação indireta: para “screening”
• Imunofluorescência indireta
– IgM - fase aguda (pico 6-8 sem)
– IgG - fase crônica (pico 12 sem)
• ELISA: IgG, IgM, IgA e IgE » » »
Teste de avidez de IgG (para diagnóstico da infecção materna)
- Fase aguda: altos títulos (ou rápida elevação) de IgG de baixa avidez
- Fase de transição: IgG com avidez crescente
- Fase crônica: baixos títulos de IgG de alta avidez
Diagnóstico Sorológico
» Em gestantes, a diferenciação entre fase aguda e crônica é essencial
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https://doi.org/10.1016/j.pt.2016.04.001
IgM residual
Perfis sorológicos na toxoplasmose adquirida
IgG
avidez
IgG
avidez
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• PCR → detecção do DNA do parasita em amostras de sangue
periférico, sangue de cordão umbilical, líquido amniótico ou LCR
200-
100-
120 pb
Gene B1 de
T. gondii
Pereira-Chioccola (IAL-SP)
Diagnóstico Molecular
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Diagnóstico laboratorial da Toxoplasmose Congênita
Investigar:
• Infecção materna: rastreamento sorológico » » » - Durante o pré-natal, os anticorpos contra o toxoplasma são detectados em
cerca de 50% a 80% das mulheres brasileiras
- Gestantes soronegativas devem ser seguidas durante a gravidez para
detecção precoce de soroconversão
• Infecção Fetal: parasitológico e PCR (líquido amniótico)
Ultrassom morfológico
• Infecção no Recém-Nascido: parasitológico, sorologia e
PCR (sangue periférico ou do cordão umbilical)
Métodos de imagens, exame oftalmológico
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SOROLOGIA NA 1ª CONSULTA
IgM (-)
IgG (+)
Infecção passada (imune)
IgM (-)
IgG (-)
Susceptível (não imune)
Acompanhar por sorologia
Soroconversão
(infecção aguda)
IgM (+)
IgG (-)
Infecção aguda
IgM (+)
IgG (+)
Teste de avidez de IgG
Baixa (< 30%)
Alta (> 60%)
Iniciar tratamento Dispensa
tratamento
(sem risco de
acometimento
fetal) Investigar infecção fetal
(PCR do líq. aminiótico)
Iniciar tratamento
Diagnóstico da toxoplasmose aguda na gestação
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TaquizoítasForma livre ou trofozoíta;
Encontrado na fase aguda da infecção
Forma de arco
(toxon=arco)
Forma móvel, de multiplicação rápida
(tachis=rápido)
Aula PráticaIdentificação de Toxoplasma gondii em
preparações coradas