LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍADOCENTE: Dra. Celia Bowen Fernández

1. DATOS INFORMATIVOS

MATERIA O MÓDULO: LABORATORIO MICROBIOLOGÍA PRÁCTICASCARRERA: MEDICINANIVEL: CUARTON° CRÉDITOS: 5-CRÉDITOS TEORÍA: 4-CRÉDITOS PRÁCTICA: 1DATOS DEL PROFESOR:Nombre: Celia Annabel Bowen FernándezGrado Académico o Título Profesional: Dra. Bioquímica y Farmacia opción Bioq. ClínicaBreve indicación de la línea de actividad académica: Docencia en diferentes en diferentes ramas de la patología clínica (Laboratorio clínico y Microbiología), coordinadora de los laboratorios en el área de Destrezas Clínico QuirúrgicasIndicación de horario de atención a estudiantes: Martes, Miércoles y Viernes 12:00 a 13.00 horasCorreo Electrónico: bowencelia@yahoo.esTeléfono: 084678618

PROFESOR: Grado académico o título profesional: Dra. Bioquímica y Farmacia opción: Bioq. Clínica/ Diplomado Superior en Pedagogías Innovadoras

2. DESCRIPCIÓN DE LA MATERIA:La unidad tiene como propósito facilitar el aprendizaje de los principales métodos de diagnóstico microbiológico, en lo que se refiere a las enfermedades infecciosas humanas: medios de cultivo, tinciones, pruebas inmunológicas y de microscopía y relacionarlos con los objetivos de la teoría de Microbiología.

3. OBJETIVO GENERAL:Introducir al estudiante de medicina en los métodos de identificación de microorganismos patógenos responsables de las principales enfermedades infecciosas humanas.

4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 4.1. ACTITUDINALES:

a. Cumplir las normativas de bioseguridadb. Escoger las pruebas de laboratorio adecuadas de acuerdo al tipo de infecciónc. Compartir conocimientos y experiencias durante el proceso de aprendizaje

4.2. COGNITIVOS:a. Identificar los diferentes microorganismos como bacterias, parásitos, hongos y virus

causantes de enfermedadesb. Conocer los principales métodos de análisis inmunológicoc. Revisar los principales métodos, medios de cultivos y coloraciones empleados para la

identificación de microorganismos infecciosos 4.3. PROCEDIMENTALES:

a. Ejecutar correctamente la toma y recogida de muestras para análisis microbiológicosb. Reconocer a través del microscopio, los principales microorganismos patógenos a través de

tinciones y montajes básicosc. Realizar siembras en los medios de cultivos comunesd. Observar las características de crecimiento y multiplicación de los microorganismos

5. CONTENIDOS

PARALELO 1,2,3,4

1. Bioseguridad en el laboratorio de Microbiología: Primera semana

2. Coloraciones: Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa:

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Segunda semana3. Medios de cultivo, requerimientos nutricionales, clasificación y técnicas de siembra; utilización de asas y campanas microbiológicas:

Tercera Semana4. Técnica para realización del antibiograma: medios apropiados y antimicrobianos:

Cuarta semana5. Estudio microbiológico del esputo: coloraciones, siembras e interpretación.

Quinta semana6. Identificación de cocos gram positivos: estafilococos y estreptococos. Streptococos del grupo A (Bacitracina, Optoquina, Catalasa, coagulasa): Sexta semana PRIMERA EVALUACIÓN: Séptima semana7. Urocultivos: medios apropiados, manejo de la muestra, siembra, identificación e interpretación:

Octava semana8. Identificación bioquímica y serológica de bacilos gram negativos; grupo

bacterianos de importancia médica Novena semana

9. Coproparasitario, identificación microscópica de parásitosDécima semana

10. Exámen de Heces-Coprocultivos: medios apropiados, manejo de la muestra, siembra, identificación e interpretación. Coproparasitario, identificación microscópica de parásitos

Décima primera semana11. Infecciones de transmisión sexual: Principales microorganismos que la producen, diagnóstico por laboratorio

Décima segunda semana12. Micosis.Toma de muestras y observación de hongos: montajes y preparaciones

Décima tercera semana13. Técnicas básicas de inmunología: aglutinación, floculación, micro-ELISA

Décima cuarta semana14. Investigación de hematozoario: frotis, tinción e identificación microscópica

Décima quinta semana SEGUNDA EVALUACIÓN: Décima sexta semana TERCERA EVALUACIÓN (PRÁCTICA): Décima séptima semana

6. METODOLOGÍA, RECURSOS: 6.1. Métodos didácticos a. Charla de fundamentación teórica b. Explicación práctica y observación c. Realización de prácticas de pruebas de laboratorio d. Lectura e interpretación de resultados 6.2. Recursos

a. Uso del manual de prácticas de Laboratorio Microbiología b. Uso de Atlas de Microbiología c. Equipos de Laboratorio de Microbiología (Microscopio, incubadora,

esterelizadora, etc.) d. Medios de cultivo e. Reactivos varios f. Muestras biológicas varias

7. EVALUACIÓN:

CRONOGRAMA DE EVALUACIONES:a. 1ra. Evaluación: Séptima semanab. 2da. Evaluación: Décima sexta semanac. 3era. Evaluación: Décima séptima semana

SISTEMA DE CALIFICACIÓN:EVALUACIONES PARCIALES PRÁCTICA Y TEÓRICA: 30 puntos 10 puntos de cada prueba parcial (dos parciales) más 10 puntos entre examen práctico al microscopio (6 puntos) y trabajos (consultas, reportes, otros) (4 puntos)

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Nota final: 20 puntosPrimera parte: 10 puntos con un examen final del Área de Prácticas en la semana 18 de la rotación

Segunda parte (examen integrador de la Macroárea de Morfofunción): semana 18 de la rotación

8. BIBLIOGRAFÍA: TEXTOS DE REFERENCIA:

Forbes-Sahm-Weissfeld, Diagnóstico Microbiológico (Bailey & Scott), 11 a edición, Editorial Médica Panamericana, Argentina, 2004

Ángel M., G. y M. Ángel R., Interpretación Clínica del Laboratorio, 6ª. edición, Editorial Médica Panamericana, Bogotá, 2.001

Álvarez, M. V., et al, Manual de Técnicas en Microbiología Clínica, Asociación Española de Farmacéuticos Analíticos, Salamanca, 1.995

Henry, J. B., Diagnóstico y Tratamiento Clínicos por el Laboratorio, 9ª. Edición, Editorial Salvat Médica, México, 1.993

OPS/OMS, Manual de Técnicas Básicas en Bacteriología Clínica, 1.995 TEXTOS RECOMENDADOS:

Atlas y apuntes de Microbiología de la Dra. Celia Bowen disponibles en la página web ftp.puce.edu.ec

Francisco Javier Pérez Pazmiño-Elena Granda Moreno, Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología, para estudiantes de Medicina

PRÁCTICA No. 1 TEMA: Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología

EL MECHERO DE BUNSENLa llama más utilizada en el laboratorio es la producida por la combustión de un gas (propano, butano o gas ciudad), con el oxígeno del aire.La combustión completa (con exceso de oxígeno) produce agua y dióxido de carbono, una llama poco luminosa y de gran poder calorífico.La combustión incompleta produce, además de dióxido de carbono y agua, carbono, nonóxido de carbono y otros productos intermedios, da origen a llamas de bajo poder calorífico y altamente luminosas (debido a la incandescencia de las partículas de carbono que se producen).Para controlar las llamas se utiliza el mechero de laboratorio que, a pesar de existir diversos tipos, el mecanismo de funcionamiento es similar en todos ellos.

Esencialmente constan de un tubo, llamado cañón, a cuya base llega la entrada de gas a traves de un pequeño orificio (chiclé).En esta zona existen unas aberturas, regulables mediante una anilla (virola), que permiten la entrada del aire al cañón.La expansión del gas a través del pequeño orificio succiona el aire exterior produciendose, de este modo, una mezcla gas-oxígeno que asciende por el cañón hasta la boca del mismo que es donde se produce la llama.

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Sosteniendo con unas pinzas una cápsula de porcelana en la parte superior de la llama producida con la entrada de aire cerrada, se observa un ennegrecimiento producido por el depósito de carbón, lo que indica que la combustión es incompleta.Sosteniendo con unas pinzas una cápsula de porcelana en la parte superior de la llama producida con la entrada de aire abierta, se observa el depósito de pequeñas gotitas de agua, lo que indica la combustión completa del gas a dióxido de carbono y agua.

Si el mechero arde con la entrada de aire cerrada, la combustión es incompleta y la llama presenta un color anaranjado debido a la presencia de partículas incandescentes de carbono.Al abrir el paso de aire, la combustión es completa y en la llama se aprecian dos zonas claramente separadas por un cono azul pálido.En el exterior del cono la combustión es completa, existe un exceso de oxígeno y se producen altas temperaturas (zona oxidante).En el interior del cono los gases todavía no se han inflamado y en el cono mismo hay zonas donde la combustión no es todavía completa y existen gases no oxidados a dióxido de carbono y agua por lo que se tiene una zona reductora de la llama

ENCENDIDO DEL MECHEROCerrar totalmente la entrada de aire, abrir ligeramente la llave de paso del gas y acercar, lateralmente, una cerilla encendida a la boca del cañón. Regular la llave hasta obtener una llama con la altura deseada, gradualmente, abrir la entrada de aire. No abrir repentinamente porque puede apagarse el mechero.

Para obtener mayor temperatura, abrir más el flujo de gas y la entrada de aire.EL MECHERO SE APAGA AL CERRAR LA LLAVE DE GAS.

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PRÁCTICA No. 2

TEMA: Coloraciones: Gram, Ziehl-Neelsen, Giemsa (ver pág. 8 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

PRÁCTICA No. 3

TEMA: Medios de cultivo (ver pág. 13 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

Metodología para realizar un cultivo bacteriano:Antes de realizar un cultivo es necesario contar con todo el material debidamente esterilizado, además de tener la precaución de trabajar junto a una fuente de calor que impida tanto un contagio de la persona que procesa la muestra, así como una posible contaminación del cultivo donde se va a trabajar.

Para realizar un cultivo bacteriano es necesario tomar el asa e introducirla al fuego para que se esterilice, dejar enfriar unos segundos y tomar la muestra que se va a estudiar; abrir la caja petri y flamear delante del mechero, con el asa impregnada de la muestra se efectúa un pequeño inóculo en el borde, de allí se parte la primera estriación; luego de la esquina de una de las estrías de la primera estriación se realiza la segunda estriación y finalmente de la esquina de una de las estrías de la segunda estriación, se realiza la tercera estriación, procurando hacer las estrías mucho más separadas de las dos primeras, con la finalidad de separar las colonias que sean sembradas; se tapa la caja y se lleva a la incubadora, colocándola de lado contrario al que se sembró y se la deja en las condiciones apropiadas para el crecimiento de cada bacteria (temperatura, atmósfera, potencial rédox, tiempo, etc.)

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PRÁCTICA No. 4

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TEMA: Técnica para la realización del antibiograma (ver pág. 23 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

DISCOS DE ANTIBIÓTICOS USADOS PARA GÉRMENES GRAM POSITIVOS Y GRAM NEGATIVOS TOMANDO EN CUENTA AL PACIENTE AMBULATORI

GRAM POSITIVOS GRAM NEGATIVOSOxacilina (ox) Ampicilina (am)Eritromicina (E) Cefuroxima (cxm)Clindamicina (cc) Ampicilina + sulbactam (sam)Cefoxitin (fox) Gentamicina (gm)Sulfas (sxt) Norfloxacina (nor)Ciprofloxacina (cip) Nitrofurantoína (fm)Vancomicina (va) Sulfas (sxt)

PRÁCTICA No. 5

1. TEMA: ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DEL ESPUTO: Coloraciones, siembras e interpretación (ver pág. 26 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez)

PRÁCTICA No. 6

2. TEMA: IDENTIFICACIÓN DE COCOS GRAM POSITIVOS: Estafilococos y estreptococos (ver pág. 44 del manual de prácticas Lab.

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Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

Catalasa: la catalasa es una enzimaque descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2) en oxígeno y agua.El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo o aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el peróxido de hidrógeno es letal para las células bacterianas.

2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas) La prueba de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es muy

comúnmente utilizada para diferenciar estreptococos (negativos) de estafilococos (positivos).

Coagulasa: la coagulasa es una enzima proteíca de composición química desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coagulo visible en un sistema analítico adecuado. En el laboratorio, la prueba de la coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al S. aureus (coagulasa positivo) de otros estafilococos y micrococos.

La coagulasa se halla en 2 formas, “libre” y “fija”, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas separadas:

Coagulasa libre (prueba en tubos): la coagulasa libre es una sustancia semejante a la trombina, que se haya presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezclan en partes iguales con una pequeña cantidad de plasma en un tubo de ensayo, se forma un coagulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de la coagulación del plasma de manera similar a cuando se añade trombina.

Bacitracina:Las pruebas presuntivas en la identificación del EbHGA (Estreptococo beta hemolítico del grupo A) se basan en la susceptibilidad e inhibición del crecimiento en una placa de agar sangre, y que tienen la mayor parte (95%) de las cepas al ponerlas en contacto con discos que contienen dosis bajas (0.04U) de bacitracina.

Optoquina: se usa el disco de optoquina para diferenciar entre S. pneumoniae (sensibles) y otras especies de estreptococos a hemolíticos (resistentes). La sensibilidad a la optoquina es una medida de la fragilidad de la membrana celular bacteriana. La optoquina, que es el clorhidrato de etilhidrocupreína.

2. PARTE EXPERIMENTAL :2.1.Técnica o procedimiento: Estudio microbiológico del esputo

Nota: Se utilizan tres medios de cultivo para el esputo que son: agar Macconkey, agar sangre y caldo de tioglicolato. En la práctica haremos con agar sangre y caldo de tioglicolatoa. Siembra en agar sangre (para identificación de bacterias gram-negativas y

gram-positivas): Sacamos el agar sangre de la refrigeradora y esperamos a que adquiera

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la temperatura ambiente Encendemos el mechero de bunsen, colocamos las asas y las muestras

de esputo cerca del mismo Tomamos un cotonete de algodón estéril y tomamos un poco de muestra

de esputo en una lado del agar, luego tomamos el asa lo esterelizamos en el mechero y luego de enfriar lo pasamos por el agar, justo en el sitio por donde paso el cotonete, estriamos en tres direcciones alrededor de la caja

Tapamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 35º- 37ºC y dejamos por 24 a 48 horas en la misma

Una vez transcurrido el tiempo de incubación se realiza la lectura de la siembra y la interpretación de la misma

b.Siembra en caldo de tioglicolatoCon el cotonete de algodón que se tomó la muestra de esputo y se sembró en agar sangre, introducir un poco de la misma en el caldo e incubar de 35° a 37°C durante 48 horas.

Este medio se usa para determinar el efecto del oxígeno sobre el crecimiento microbiano. Un tubo con medio semisólido contiene tioglicolato para reducir el potencial redox del medio. Así sólo hay oxígeno en la superficie y no en el resto del tubo.

Si el microorganismo es aerobio estricto crecerá en la parte de arriba del tubo, si es anaerobio estricto no crecerá en la parte más alta del tubo y si es anaerobio facultativo crecerá por todo el medio.

c. Observación de placas coloreadascon coloración gram de muestra de esputoMirar al microscopio con el lente de gran aumento (100 x) y con aceite de inmersión, las colonias de Stafilococcus, de Streptecoccus, de otras bacterias y otros elementos patógenos presentes anotar el color y las formas que presentan.

2.2. Técnica o procedimiento: Identificación de cocos gram positivos 2.2.1. Catalasa

En una placa portaobjetos añadir 1 o 2 gotas de peróxido de hidrógeno al 3% (diluir la solución al 30% con agua destilada), transferir células del centro de una colonia bien aislada y mezclar. La rápida aparición y producción sostenida de burbujas de gas o efervescencia indica una reacción positiva.

2.2.2.CoagulasaPrueba en tubos (coagulasa libre):1.- colocar asépticamente 0.5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo estéril.3.- mezclar por rotación suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido.4.- colocar el tubo en la incubadora de 4 a 24 horas. Observar la formación de un coagulo visible.

La reacción se considera positiva ante cualquier grado de coagulación visible dentro del tubo.

2.2.3. Prueba de la Bacitracina

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Se toma un agar sangre y en un lado de la placa se estria con el asa en forma continua la cepa de estreptococo beta hemolítico, con una pinza estéril se coloca el disco de bacitracina en el centro del estriado realizado. La placa de agar sangre es incubada a 35-37° C durante toda la noche. Los resultados son cualitativos y es positiva para estreptococo beta hemolítico del grupo A si se encuentra cualquier halo de inhibición alrededor del disco.

2.2.4. Prueba de la optoquina

Método: se toma una suspensión de colonias puras en caldo Mueller Hinton o tioglicolato y con un hisopo se estría una placa de agar sangre de carnero al 5 %. Sobre la estría se coloca el disco de optoquina. Se incuba con atmósfera de CO2 al 5 % ( jarra con vela ). durante 24 hs. a 35° C. Interpretación: Sensible, cuando hay inhibición alrededor del disco. Se considera como punto de corte 16 mm. (discos de 10 mm) o 14 mm (discos de 6 mm). Resistente, cuando el crecimiento no es inhibido alrededor del disco. Los casos de halos intermedios deben resolverse por acumulación de pruebas a favor o en contra.

3. MATERIALES Y REACTIVOS (este literal no necesita ser memorizado):

Materiales ReactivosAsas microbiológicas Placas coloreadas por

método de gramIncubadora a temperatura 35º-37º C

Agar sangre

Mechero de Bunsen Caldo de tioglicolatoCajas petri Muestras de esputoHisopos estériles Peróxido de hidrógenoMicroscopio Plasma de conejoPlacas portaojetos Discos de bacitracinaTubos de ensayoPalillos de dientes

PRÁCTICA No. 7

TEMA: UROCULTIVOS (ver pág. 29 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

1. Instrucciones para recoger una muestra parcial de orina para EMO

a. El frasco tiene que ser suministrado por el Laboratorio, o adquirir en la farmacia uno estéril apropiado para la recolección de orina.

b. Es preferible que la orina sea la primera orina de la mañana.c. Practicar previo aseo genital, con agua y jabón, sin dejar residuos. Esto es

especialmente importante en la mujer que debe lavarse el área entre los labios de la vagina y evitar la contaminación de la muestra con crema, antisépticos y secreciones vaginales. Los hombres y niños deben limpiarse la cabeza del pene

d. Deje escapar la porción inicial de la micción al inodoro, a continuación recolecte en el frasco la porción media (10 ml) y descarte la porción final de la

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micción nuevamente en el inodoro.e. Tape bien el frasco y entréguelo rápidamente al Laboratorio (máximo dos horas

luego de tomar la muestra).f. NO recoger la muestra durante el Periodo Menstrual

2. Método para el análisis de orina macroscópico y químico:

a. Después de recibir la orina en el laboratorio, analizarla tan pronto como sea posible. Antes del análisis las muestras de orina deben estar a la temperatura ambiente

b. Realizar la homogenización de la orinac. Con movimientos moderados en el recipiente transportado hasta el laboratorio

(bien mezclada y no agitada)d. Verter en un tubo de ensayo de 16 x 100 mm aproximadamente 10 mle. Determinar el color, aspecto (nitidez)f. Registrar la presencia de un olor inusual y de cantidades anormales de espuma

coloreadag. Sumergir brevemente la tira reactiva, no más de un segundo (evitar tocarla con

los dedos, ya sea antes o después de sumergirla)h. Eliminar el exceso de orina en la tira,: limpiar el borde de la misma con el

reborde del tubo o con papel secantei. No permitir que los reactivos de la tira se juntenj. No depositar la tira reactiva directamente sobre la superficie de trabajok. Seguir exactamente las recomendaciones en cuanto al tiempo para cada test

químicol. Mantener la tira reactiva junto a la carta de colores y leer bajo una buena

iluminaciónm. Tener en cuenta las fuentes de error, la sensibilidad y la especificidad de cada

prueba con la tira reactiva

1.1. Parámetros que se observan en el examen macroscópico :

En el examen macroscópico se analiza el aspecto como por ejemplo si es trasnparente, ligeramente turbia, turbia, espesa, opaca y el color de la orina que puede ser amarilla pálida, amarilla oscura, ámbar, roja, verde, azul entre otros.

1.2. Parámetros que se observan en el examen químico:

Densidad (ó gravedad específica): Registra la concentracuión iónica de la orina (es decir, qué tan concentrada o diluida se encuentra). Se basa en la liberación de protones por un formador de complejos en presencia de cationes. Esto causa un viraje de color del indicador azul de bromotimol, de azul hacia amarillo, pasando por verde azulado

pH: Indican la acidez o alcalinidad de la orina. Los valores pH más frecuentes en orina fresca de personas sanas se encuentran entre 5 y 6. El test es específico para la detección de iones hidronio, siendo el valor pH el logaritmo decimal negativo de la concentración de iones hidronio. El papel reactivo contiene los indicadores rojo de metilo, fenolftaleína y azul de bromotimol.

Leucocitos: Comprueba la actividad esterásica de granulocitos. Esta enzimas desdoblan un éster de indoxilo a indoxilo, que reacciona con una sal de

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diazonio formando un colorante violeta. se detectan leucocitos intacto y también los lisados (indicio de IVU)

Nitrito: Los agentes patógenos más frecuentemente causantes de infecciones de las vías urinarias, E. coli y la mayoría de los gérmenes patógenos urinarios, transforman el nitrato absorbido con la alimentación en nitrito. Este es detectado por una coloración del rosa al rojo de la zona reactiva. El ensayo se basa en el principio de la prueba de Griess y es específico para el nitrito. (indicio de IVU)

Proteínas: El test se basa en el principio del error proteico de indicadores de pH y reacciona de manera especialmente sensible a la albúmina.

Glucosa: La detección de glucosa se efectúa según el método específico de la glucosa-oxidasa-peroxidasa.

Cuerpos cetónicos: La detección se realiza en el principio de la prueba de legal y reacciona más intensamente al ácido acetilacético que a la acetona. Las cetonas son un subproducto del metabolismo de las grasas, presente con inanición y diabetes.

Urobilinógeno: Es un producto de degradación de la bilirrubina. El test se basa en que una sal de diazonio estable produce con el urobilinógeno, casi instantáneamente un colorante azóico rojo

Bilirrubina: En la orina es un producto de degradación de la hemoglobina. La detección se basa en la copulación de una sal de diazonio con bilirrubina para formar un colorante azoico. Incluso los más leves matices rosa ya deben ser considerados como positivos.

Hemoglobina: Es un indicio de hemólisis. La mioglobina cataliza la oxidación del indicador por el hidroperóxido orgánico contenido en el papel reactivo. Puntos verdes aislados hasta acumulados en la zona reactiva amarilla indican la presencia de eritrocitos intactos. La hemoglobina así como los eritrocitos hemolizados o la mioglobina son indicados por una coloración verde homogénea de la zona reactiva.

2. Método para realizar el examen microscópico del sedimento urinarioa. Una vez realizado el examen microscópico y químico de la orina, se la

centrifuga por 5-10 minutos a 1500-2000 rpm con la orina previamente homogenizada

b. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante. El volumen final utilizado para resuspender el sedimento puede variar según el sistema estandarizado que se use, pero debe ser siempre constante en cualquier laboratorio dado.

c. Resuspender con suavidad el sedimento, eliminar las dos primeras gotas y colocar la tercera gota en una placa portaobjetos, cubrir con un cubreobjetos. Dejar que la orina se deposite durante 30 a 60 segundos.

d. Observar al microscopio con objetivos de pequeño y gran aumento. Para detectar algunas entidades del sedimento con un índice bajo de refracción será necesaria una luz amortiguada o una iluminación de contraste de fase. El foco fino debe variarse continuamente mientras se examina. Progresar de manera sistemática a lo largo de toda la placa, teniendo cuidado de examinar los bordes en busca de cilindros.

e. Recuento del número de cilindros por lo menos en 10 campos de pequeño aumento (10x) y anotar en el informe el número de cilindros por campo. Puede utilizarse un margen razonable, es decir, 0 a 2, 2 a 5, 5 a 10, etc. Usar

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el gran aumento (40x) para indicar el tipo de cilindros. Los cilindros se apreciarán si se utiliza microscopio de contraste de fase.

f. Identificación y recuento de los eritrocitos, leucocitos y células epiteliales renales utilizando el objetivo de gran aumento (40x). Efectuar el recuento por lo menos 10 campo de gran aumento y expresarlo como células por campo. En el informe puede utilizarse un margen razonable.

g. Reportar:h. Las células epiteliales (bajas) y altas si están presentes en gran número o

como fragmentos (células transicionales)i. Bacterias, levaduras, microorganismos. Una bacteriuria detectable a

pequeño aumento puede expresarse por lo menos como 2 +.j. Los cristales se cuantifican bajo pequeño aumento. La presencia de cristales

anormales debe confirmarse químicamentey correlacionarse con la historia del paciente

k. Grandes cantidades de moco

OBSERVACIÓN: Para el siguiente literal por favor revisar el atlas para segundo nivel ubicado en el internet cuya página es ftp.puce.edu.ec

2.1. Elementos que se observan en el examen microscópico:

Las bacterias y otros microorganismos (normalmente no están presentes) Cilindros urinarios Cristales Grasa Moco Glóbulos rojos (un indicio de daño en los túbulos) Células tubulares renales Células epiteliales de transición Glóbulos blancos (un indicio de infección del tracto urinario)

3. PARTE EXPERIMENTAL PARA REALIZAR UN UROCULTIVO:3.1. Siembra en agar Mc conkey (para identificación de bacilos Gram

negativo):3.1.1. Sacamos el agar Mc conkey de la refrigeradora y esperamos a que adquiera

la temperatura ambiente3.1.2. Encendemos el mechero de bunsen, colocamos las asas y las muestras de

orina cerca del mismo3.1.3. Tomamos el asa calibrada la esterelizamos en el mechero y luego de enfriar

metemos en la muestra de orina retirando los excesos en el borde del envase que contiene la orina

3.1.4. Tomamos el agar Mc conkey y realizamos la siembra estriando en cuatro direcciones alrededor de la caja (colocar el estudiante el gráfico de forma de estriado en el informe)

3.1.5. Tapamos el agar y colocamos en la incubadora alrededor de 35º- 37ºC y dejamos por 24 horas en la misma

3.1.6. Una vez transcurrido el tiempo de incubación se realiza la lectura de la siembra y la interpretación de la misma

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3.2. Siembra en agar sangre (para cuantificación de colonias bacterianas U.F.C./ml)

3.2.1. Sacamos el agar sangre de la refrigeradora y realizamos el mismo procemiento anterior hasta el literal 4.1.6, variando la técnica de estriado

3.2.2. Para el contaje de las colonias que crecieron, contamos las mismas como U.F.C. (unidad formadora de colonias) en uno de los cuatro cuadrantes de la caja de agar sangre, multiplicamos por cuatro y obtenemos el U.F.C contenido en 0.001 ml que nos proporcionó el asa calibrada a ese volumen, luego efectuamos una regla de tres, ejemplo:

350 U.F.C 0.001 ml X 1 ml X= 350.000 U.F.C./ml

3.2.3. El resultado obtenido se lo compara con los rangos de valores normales siguientes:

Menos de 10.000 U:F:C/ml se considera contaminación Entre 10.000 y 100.000 U.F.C./ml se considera sospecha de

infección Mayor a 100.000 U.f.c./ml se considera infección

B. Materiales y reactivos:

Materiales ReactivosAsas calibradas 0.001 ml Agar Mc conkeyIncubadora a temperatura 35º-37º C Agar sangreMechero de Bunsen Muestras de orinaCajas petri

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PRÁCTICA No. 8

TEMA: IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACILOS GRAM NEGATIVOS (mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

A. Disponer a la temperatura ambiente en gradilla una serie doble de tubos de cultivo para reacciones bioquímicas.

B. Resembrar del medio de cultivo que contiene las colonias de bacilos gramnegativos selecionadas como sospechosas a los medios para bioquímicas

En los medios inclinados sembrar por estrias En los medios verticales sembrar por picadura En los medios líquidos sembrar por emulsión

C. Etiquetar con los datos correspondientes. Llevar a la incubadora por 24 horas.D. Retirar las series de tubos con las reacciones bioquímicas.E. Interpretar las reacciones bioquímicas en cada uno de los tubos, de la siguiente

manera.

1. ENSAYO DEL ROJO DE METILOI. PrincipioEl test se usa para determinar la presencia de iones hidrógeno cuando un microorganismo fermenta glucosa. Todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae convierten glucosa en ácido pirúvico por el camino de Embden-Meyerhof. Los organismos que metabolizan ácido pirúvico producen ácido y bajan el pH a menos de 4.4. Los organismos que utilizan, en cambio, el camino del butilenglicol producen acetoína y butanodiol (diacetilo). El indicador del medio, rojo de metilo, es rojo a pH < 5.0 y amarillo a pH > 5.8. El test es útil para la diferenciación de Escherichia coli (rojo metilo positivo) de Klebsiella (rojo metilo negativo).

II. ProcedimientoA. Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo con caldo RM/VP.B. Incubar a 35º C por un mínimo de 48 horas.C. Transferir 2.5 ml de la suspensión a un tubo.D. Agregar 5 gotas del indicador y observar si hay cambio de color.

III. ResultadosEnsayo positivo: el reactivo permanece rojo.Ensayo negativo: el reactivo se torna amarillo-naranja.Si el resultado es negativo continuar la incubación de la bacteria por 24 horas más.

2. ENSAYO DE VOGES-PROSKAUERI. PrincipioEl piruvato es un intermediario en el metabolismo de la glucosa. A partir del ácido pirúvico un microorganismo puede seguir varios caminos. Algunos lo rompen para formar como productos finales ácidos láctico, acético o fórmico. Otros metabolizan el piruvato por el camino del butilenglicol para formar como productos finales acetoína (acetilmetilcarbinol) y 2,3-butanodiol (diacetilo). El ensayo de Voges-Proskauer (VP) detecta estos productos metabólicos. En presencia de oxígeno e KOH, la acetoína se oxida a diacetilo, que da un complejo rojo. La sensibilidad del

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ensayo se aumenta por el agregado de -naftol antes del agregado de KOH.

II. ProcedimientoA. Con un asa estéril tomar material e inocular un tubo de caldo RM/VPB. Incubar a 37ºC por un mínimo de 48 horasC. Transferir 2.5 ml de la suspensión a otro tuboD. Agregar 0.6 ml del reactivo de -naftolE. Agregar 0.2 ml del reactivo de KOHF. Agitar el tubo y dejar descansar 10 a 15 minutosG. Observar la formación de un color rosado a rojo

III. ResultadosEnsayo positivo: desarrollo de color rojo dentro de los 15 minutosEnsayo negativo: no hay desarrollo de color

3. PRUEBA DE LA UREAI. PrincipioLa urea es una diamida del ácido carbónico, cuya hidrólisis por acción de la ureasa da 2 moléculas de amoníaco. La ureasa es una enzima constitutiva que se sintetiza independientemente de la presencia o no de la urea. La prueba determina la capacidad de la bacteria de desdoblar la urea, con la consiguiente alcalinización del medio. Es una actividad característica de especies de Proteus y se usa para diferenciar Klebsiella (+) de Escherichia (-) y Proteus (+ rápido) de Providencia (-); Yersinia pseudotuberculosis (+) de Yersinia pestis (-)

II. ProcedimientoA) Con un asa estéril se toma abundante material y se inocula por punciónB) Se incuba a 37ºC y se efectúan lecturas a las 2, 4, 6 y 18 horas. Los tubos negativos se observandiariamente por 4 a 7 días para detectar reacciones tardías que dan ciertos miembros de lafamilia, registrando los resultados día por día.III. ResultadosEnsayo positivo: aparición de color rojo en el medio por una alcalinización del mismo.Ensayo negativo: no hay cambio de color.

4. PRUEBA DEL SIM (H2S, indol, motilidad) Determinar si la bacteria a través de Triptofanasas puede degradar el

Triptófano a indol. Determinar si hay producción de H2S a partir de aminoácidos azufrados dando

como resultado un color negro Determinar si la bacteria es móvil mediante la difuminación de la misma hacia

los lados, de lo contrario, la bacteria sólo crece en la línea de inoculación

I. Principio del IndolEl indol es uno de los productos del metabolismo del aminoácido triptofano. Con un medio rico en triptofano, el indol se puede detectar por su habilidad para combinarse con ciertos aldehidos para formar un compuesto coloreado. El ensayo constituye un método rápido para detectar organismos productores de indol. Como

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indicador de la presencia del aldehído se usa el reactivo de Erlich. Es especialmente útil en la identificación preliminar de Escherichia coli, y para diferenciar Edwardsiella (+)de Salmonella (-).

II. Procedimiento1) Con un asa tomar material de una colonia aislada e inocular el caldo que contiene triptofano.2) Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas.3) Transferir 2 ml de la suspensión de caldo a un segundo tubo.4) Agregar 5 gotas del reactivo de Erlich por la pared del tubo.5) Agitar el tubo y observar un color rosado en la interfase entre el caldo y el reactivo.6) Si el ensayo es negativo, el cultivo se debe reincubar otras 24 horas.

III. ResultadosEnsayo positivo: desarrollo de un color rojo en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despuésde agregar el reactivo.Ensayo negativo: no hay cambio de color o hay un color amarillo en la interfase.

5. AGAR KLIGLER I.Principio

El agar de Kligler contiene dos azúcares: lactosa (1%) y glucosa (0.1%).Si el microorganismo fermenta glucosa, tanto la punción como la estría apareceránde color amarillo. Si el organismo fermenta lactosa y, la estría permanecerá ácida(amarilla). Si no fermenta lactosa, la estría se vuelve alcalina (roja). Los organismos que no fermentan glucosa no producen cambios en el pH del medio o producirán productos alcalinos y el medio permanecerá rojo. La producción de SH2 se manifiesta por un ennegrecimiento del medio.

II. ResultadosA. Estría ácida/fondo ácido (amarillo/amarillo): fermentación de glucosa, lactosa (E. coli)B. Estría alcalina/fondo ácido (rojo/amarillo): fermentación de glucosa solamente (Shigella spp.)C. Estría alcalina/fondo alcalino (rojo/rojo): no fermentador (Pseudomonas aeruginosa)D. Precipitado negro en el fondo: producción de SH2 (Salmonella spp)E. Burbujas o roturas: producción de gas (E. coli, Salmonella spp.)

6. PRUEBA DE LA LISINA (CARBOXILASA-DIHIDROLASA)I. PrincipioLa descarboxilación es un proceso en el cual las decarboxilasas atacan el extremo carboxilo de los aminoácidos, formando la correspondiente amina. La decarboxilación de lisina da cadaverina (diaminas). Como la decarboxilación es una reacción anaeróbica, se debe cubrir el medio con una capa de aceite mineral estéril. El proceso ocurre en dos etapas: por fermentación de la glucosa se produce una acidificación del medio (pH < 6.0), apareciendo color amarillo. La

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acidificación es necesaria para que ocurra la decarboxilación. Este último proceso de lugar a la formación de las aminas que elevan el pH con el consiguiente viraje del indicador al color violeta.La prueba de la lisina ayuda en la diferenciación de Edwardsiella (+), y Salmonella (+) de Citrobacter (-); de Enterobacter aerogenes (+) de Enterobacter cloacae (-) y Enterobacter agglomerans (-)

II. ProcedimientoA. Tomar material con un asa e inocular el tubo control y los tubos con los aminoácidosB. Cubrir todos los tubos con una capa de vaselina estéril.C. Incubar a 37ºCD. Efectuar las lecturas día por día hasta 4 días, registrando los resultados día por día

III. ResultadosEnsayo positivo: medio turbio y púrpura a púrpura amarillentoEnsayo negativo: color amarilloTubo control: permanece con su color original o se vuelve amarillo si el organismo es un fermentadorde glucosa (se debe ver turbidez en el tubo)

7. PRUEBA DEL CITRATOI. PrincipioEs uno de los test del IMVIC (Indol, Rojo de metilo, Vogues-proskauer y Citrato) usado para diferenciar enterobacterias. Hay microorganismos capaces de utilizar el citrato como única fuente de carbono produciendo alcalinidad, se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Cuando el resultado es positivo el medio de cultivo se vuelve azul y cuando es negativo se mantiene verde.II. ProcedimientoSe inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir  falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.III. Resultados(+)Klebsiella spp , ( - ) Escherichia Coli

8. FENILALANINA DESAMINASALas desaminasas catalizan la pérdida de NH3 en un aminoácido originando un ácido carboxílico. Las bacterias que desaminan la fenilalanina producen ácido fenilpirúvico que con Fe3Cl en solución ácida produce un color verdoso ( resultado positivo) y cuando es negativo es de color amarillo (reactivo es de color amarillo).

9. MALONATOEl fundamento es igual al citrato, para ver si se utiliza al malonato como fuente de carbono.

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PRÁCTICA No. 9

TEMA: HECES FECALES. EXAMEN COPROPARASITARIO(ver pág. 33-41 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

1. MARCO TEÓRICO:

I.1.Parásitos NEMATODOS: Gusanos redondosAscaris lumbricoides: Se observan huevos miden aprox. 45-75 x 30-50 mm, presenta una célula rodeada por tres capas, producen una patología de dolor de estómago y desnutrición.

Tricocéfalo: El huevo mide de 50-55 x 22-25 mm Tiene la forma de balón de fútbol americano, produce anemia intensa, dolores abdominales, prolapso rectal ocasional.

Uncinarias: Tienen una forma elíptica, están cubiertas de una membrana lisa, transparente y fina, mide de 60 - 40 x mm producen anemia.

Strongyloides stercolaris: Se observan larvas. Produce diarrea, vómito, desnutrición.

Enterobius vermiculares (Oxyurus):Los huevos son ovoides con una cara convexa y una plana, presenta una membrana interna y delicada y otra gruesa hialina y mamelonada, mide de 50-60 x 20-30 mm. Produce prurito en la región perianal, insomnio, cambios de conducta.

CESTODOS: Gusanos planosTaenia: Los huevos miden 20-30 x 30-40 mm, son ovoides con membrana gruesa, amarillenta que se encuentra estriada en forma de empalizada y encierra un embrión de seis ganchos poco visibles. Produce trastornos nerviosos.

Hymenolepis nana : Huevos ovoides, mide aprox. 50 mm tiene una membrana interna y una externa, también puede causar trastornos nerviosos.

PROTOZOARIOS: Amebas

Entamoeba histolítica: Se observan quistes miden aprox. 20 mm se observa con cuatro núcleos. Pueden causar lesión de la mucosa intestinal.

Entamoeba coli: Son quistes más grandes que los de histolítica, tiene más de cuatro núcleos. Es considerada como no patógena.

Endolimax nana: Los quistes son ovalados miden de 6 - 10 mm presentan de uno a cuatro núcleos.

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Iodamoeba bütschlii: Su quiste se caracteriza por la presencia de una vacuola de yodo, no es una ameba patógena.

Gardia lamblia: Es una ameba en forma de pera simétricamente lateral, con un extremo ancho y redondeado, el quiste presenta cuatro núcleos y dos cuerpos parabasales, produce una diarrea amarillenta y vómito.

TREMATODOS : Forma de hoja plana

Fasciola hepática: Daño en hígado . quistes

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I.2.Rotavirus:

Los rotavirus del grupo A constituyen la principal causa de gastroenteritis grave en niños de todo el mundo. Producen unos 125 millones de infecciones cada año en los países en desarrollo y son causa de 873.000 fallecimientos anuales .

Tres proteínas estructurales de rotavirus tienen gran importancia para clasificar a estos virus según su antigenicidad. La proteína VP6, que constituye la cápsida interna del virión, es responsable de la existencia de siete serogrupos (A-G). Las infecciones humanas son producidas principalmente por rotavirus del grupo A y, en menor medida, o con otras características epidemiológicas, por los grupos B y C. El resto de grupos de rotavirus producen infecciones en los animales, aun cuando los del A infectan también algunas especies animales, además del hombre. Los rotavirus humanos del grupo A se subdividen en dos subgrupos (I y II) en función de la especificidad de la VP6.

PRÁCTICA No. 10

TEMA: HECES FECALES. Coprocultivo. Aislamiento de enterobacterias (ver pág. 42-43 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

AISLAMIENTO.1. Sembrar una asada de materia fecal sospechosa en el tubo de caldo de

tetrationato. Inocular con asa por emulsión.2. De la misma manera sembrar otra asada de la misma muestra en el tubo de

caldo nutritivo.3. Etiquetar con los datos respectivos4. Levar a la incubadora a 37ºC durante 24 horas. Colocar los tubos en gradilla, de

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tal manera que se mantengan en posición vertical para evitar que el líquido se derrame.

5. A las 24 horas retirar los tubos de la incubadora.6. Disponer sobre la mesa el medio selectivo (agar entérico Hektoen) para

resembrar el cultivo del caldo de tetrationato.7. Resembrar en cada placa el inóculo correspondiente8. Tapar las placas. Etiquetar con los datos correspondientes9. Llevar las placas a la incubadora. Colocarlas en posición invertida. Mantenerlas

durante 24 horas.10. Al día siguiente:11. Retirar las placas de la incubadora.12. Efectuar análisis macroscópico de cada una para valoración de la prueba

presuntiva13. Efectuar análisis microscópico por el método de Gram de cada una de las placas

para confirmación de la morfología de los bacilos entéricos gramnegativos

PRÁCTICA No. 11

TEMA: INFECCIONES DE TRANSMISIÓN SEXUAL (ver pág. 48 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

PRÁCTICA No. 12

TEMA: MICOSIS (ver pág. 52 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

PRÁCTICA No. 13

TEMA: TÉCNICAS BÁSICAS DE INMUNOLOGÍA (ver pág. 55 del manual deprácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de

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práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)Durante la práctica los estudiantes se realizarán voluntariamente pruebas de ASTO, VIH, y VDRL para poder observar la reacción Ag-Ac. Estas pruebas tienen los siguientes fundamentos:

VIH:La prueba VIH 1&2 es un inmunoensayo rápido de un solo uso basasdo en inmunocromatografía. Emplea reactivos únicos para la detección rápida y segura de anicuerpos a VIH1 y VIH2 en suero y plasma humano sin instrumental.

Las proteínas recombinantes que representan las regiones inmunodominantes de las proteínas envoltura y gag de VIH-1 y VIH-2 son inmovilizadas en la región de Prueba de la tira de nitrocelulosa y un agente bioquímico que reconoce anticuerpos humanos es dispersado en la región de Control de la tira. Las proteínas de VIH-1 y VIH-2, unidas a oro coloidal, son impreganadas por debajo de la región de Prueba del dispositivo. Una banda estrecha de la membrana de nitrocelulosa es también sensibilizada como región de control.

Los complejos de anticuerpos de proteína VIH-oro coloidal se desplazan por cromatografía a lo largo de la membrana nitrocelulosa hacia las regiones de pruebas. Se indica una reacción positiva mediante la presencia de dos bandas de color (ver en la práctica).

ASTO:Es una prueba rápida por el método de aglutinación utilizando partículas de látex para la detección de anticuerpos anti-estreptolisina del grupo O (ASO) en suero humano.

Los anticuerpos ASO son encontrados en el suero del paciente en respuesta a una infección con Streptococo hemolítico del grupo A, C o G (ver el método de aglutinación en el atlas).

PRÁCTICA No. 14

TEMA: INVESTIGACIÓN DE HEMATOZOARIOS (ver pág. 57 del manual de prácticas Lab. Microbiología del Dr. F. Pérez y mirar atlas con el número de práctica correspondiente colocado en la página ftp.puce.edu.ec)

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