Diagnostica della Malattia di Pompe

(Glicogenosi tipo II)

Dott.ssa Angela AmatiServizio di NeurofisiopatologiaAzienda Ospedaliera-Universitaria Policlinico di Bari

ESAMI DI LABORATORIO

– Dosaggio del CK• Bambini: valore aumentato (< 10x);

• Adolescenti e adulti (normale o lievemente

aumentato (5%);

– Dosaggio dell’attività enzimatica dell’alfa

glucosidasi acida;

MALTASI ACIDA(alfa-glucosidasi acida)

• enzima lisosomiale;

•lavora ad un pH compreso

tra 4 e 5;

•dotata di attività alfa-

glucosidasica→può

idrolizzare completamente

il glicogeno in glucosio;

•è il solo enzima

degradativo del glicogeno

presente nei lisososmi;

•è codificato dal gene

GAA;

L’α-1,4-glucosidasi acida

– Localizzazione: presente in tutti i tessuti

– Localizzazione subcellulare: lisosomiale

– Meccanismo d’azione:

• Idrolizzazione lineare dei legami α1-4 glucosidici dei carboidrati

• Il sito catalitico dell’enzima: Asp-518

– Effetti delle mutazioni dell’α-1,4-glucosidasi acida: varie

• Enzima assente: nella forma infantile;

• Enzima e attività proporzionalmente ridotta: nella forma adulta;

• Enzima presente ma attività catalitica ridotta: nelle forme infantili,

giovanili e adulte;

PATOGENESI DELLA MALATTIA DI POMPE

• La GAA è essenziale per la degradazione del glicogeno lisosomiale

• Il deficit causa accumulo e dilatazione

Raben N, Plotz P, Byrne BJ. Acid alfa-glucosidase deficiency (glycogenosis type II, Pompe disease). Curr Mol Med. 2002;2:145-166.

PATOLOGIA

La progressione della Malattia di Pompe

• Dosaggio dell’attività enzimatica della GAA su:– Goccia di sangue essiccato (Dried Blood Spot) (tecnologia

emergente)– Leucociti– Fibroblasti cutanei– Biopsia muscolare

• Dosaggio del gluco-tetrasaccaride derivante dal glicogenonelle urine

• Analisi delle mutazioni genetiche

• Diagnosi prenatale tramite– Amniocentesi– Prelievo dei villi coriali

Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases ofInherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001:3389-3420.Umapathysivam K, Hopwood JJ, Meikle PJ. Determination of acid alfa-glucosidase activity in blood spots as a diagnostic test for Pompe disease. ClinChem. 2001;47:1378-1383.Yijun L, Scott R, Chamoles N, Ghavami A, Pinto B, Turecek F, Gelb M. Direct multiplex assay of lysosomal enzymes in dried blood spots for newbornscreening. Clin Chem. 2004;50:1785-1796.Chamoles NA, Niizawa G, Blanco M, Gaggioli D, Casentiini C. Glycogen storage disease type II: enzymatic screening in dried blood spots on filterpaper. Clin Chimica Acta. 347, 2004:97-102

Dosaggio dell’attività enzimaticadell’α glucosidasi acida

DIAGNOSI

Malattia di Pompe identificata dal test di macchia di sangue essiccato per dosaggio enzimatico dell’α glucosidasi acida

Inviati a: Dott. Severo PAGLIARDINI Ospedale Sant’Anna Torino

DBS (Dried Blood Spot)

Il metodo usato per la determinazione dell’αglucosidasi acida (GAA) su spot è

di tipo fluorimetrico e viene eseguito a pH acido (pH 4) e poi rapportato al pH 6.5

(pH6.5/pH4).Se il valore è basso bisogna confermare il

sospetto di patologia di Pompe ripetendo il dosaggio GAA su sangue intero e poi

confermando con il dosaggio sui leucociti.

Vantaggi DBS

1. Metodo non invasivo;2. Piccola quantità di sangue usata (200µl)

contro i 3-5 ml dei linfociti;3. L’attività dell’enzima nello stato di

essiccamento rimane stabile a temperatura ambiente quindi lo spot può essere conservato e spedito al laboratorio che esegue il test senza problemi;

4. Tempi di risposta molto brevi.

Dosaggio dell’attività enzimatica GAA sui leucociti

• Occorrono 3-5 ml di sangue;• Il dosaggio viene eseguito su pappa

leucocitaria;• La presenza di isoenzimi che interferiscono

con l’attività della GAA è stata superata usando degli inibitori per cui questo metodo serve a confermare la diminuzione dell’attività trovata con il DBS;

• Tempi di risposta più lunghi (6-8 settimane).

Dott.ssa Amelia MorroneResponsabile Laboratorio

di Biologia Molecolare

Dosaggio dell’attività enzimatica GAA su fibroblasti cutanei

• È un metodo più invasivo;• I tempi di risposta sono di 1-2 mesi in

quanto è necessario attendere la confluenza cellulare.

Dosaggio dell’attività enzimatica GAA su biopsia muscolare

È un metodo invasivo ma con tempi di risposta più rapidi rispetto a quello

eseguito sui fibroblasti

Dosaggio del gluco-tetrasaccaride

derivante dal glicogeno• I pazienti affetti da Malattia di Pompe presentano un

aumento dell’escrezione di questo metabolita nelle urine.

• Questo marker è utile per monitorare l’efficacia della terapia ma non la diagnosi, anche se la coesistenza di aumentata escrezione di gluco-tetrasaccaride nelle urine e diminuizione dell’ attività del GAA portano a una conferma della diagnosi.

MALATTIA DI POMPEATTIVITA’ ENZIMATICA RESIDUA

• L’attività residua di GAA è generalmente inversamente correlata alla severità della malattiaInsorgenza infantile Insorgenza tardiva<1% del normale <40% del normale

Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001:3389-3420.

PATOLOGIA

INSORGENZA INFANTILE* INSORGENZA TARDIVA

100%

0%

STAT

O C

LINI

CO ATTIVITÀ R

ESIDU

A GAA

(FIBR

OB

LASTI CUTANEI)

501ETÀ (ANNI)

*CARDIOMIOPATIA

0%

100%

40%

Hirschhorn R, Reuser AJJ. Glycogen storage disease type II: acid alpha-glucosidase (acid maltase) deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2001:3389-3420.

MALATTIA DI POMPEMODELLO DI EREDITARIETÀ

EREDITARIETÀ

Eredità autosomica recessivaPadre portatore Madre portatrice

Soggetto affetto(25%)

Sani ma portatori (50%) Sani(25%)

Allele anormale

Allele normale

• Il gene per la GAA è localizzato sul cromosoma 17;

• Il gene contiene 20 esoni di cui il primo non è codificante• Sono circa 200 le mutazioni del gene GAA a tutt’oggi identificate;

– I difetti includono cambi di coppie di base con mutazioni di senso e non senso, difetti di splicing e delezioni e inserzioni di piccole e grandi dimensioni.

– Alcune mutazioni sono comuni nella popolazione generale o in gruppi etnici specifici; la maggior parte consiste tuttavia in mutazioni identificate in singoli soggetti.

• Elenco aggiornato delle mutazioni:www2.eur.nl/fgg/ch1/pompe/mutations.html

MALATTIA DI POMPE: GENETICA

EREDITARIETÀ

Raben N, Plotz P, Byrne BJ. Acid alfa-glucosidase deficiency (glycogenosis type II, Pompe disease). Curr Mol Med. 2002;2:145-166.Mutations in GSD II. Available at: http://www2.eur.nl/fgg/ch1/pompe/mutations.html.

Analisi molecolareDopo conferma della diagnosi mediante test

biochimico, l’identificazione della mutazione nel gene GAA non è strettamente necessaria.

Tuttavia, il test molecolare è di notevole importanza perché permette di identificare in

modo inconfutabile il portatore di una mutazione ed è quindi fortemente consigliato

a tutti i parenti prossimi di un paziente, soprattutto nel caso questi avessero

l’intenzione di avere un figlio.Finora sono state identificate più di 200

mutazioni diverse

Biopsia muscolare

La biopsia muscolare viene eseguita: • quando non abbiamo dati clinici

fortemente indicativi per malattia di Pompe;

• quando abbiamo dati clinici fortemente indicativi per malattia di Pompe ma il dosaggio dell’ attività enzimatica è normale;

Forma infantileEmatossilina Eosina e Tricromica di Engel: presenza di vacuoli

PAS: i vacuoli appaiono PAS positivi contenenti glicogeno

Fosfatasi Acida: i vacuoli sono positivi alla fosfatasi acida lisosomiale

Forma adulta

Ematossilina Eosina: presenza di vacuoli

PAS: i vacuoli appaiono PAS positivi contenenti glicogeno

Fosfatasi Acida: i vacuoli sono positivi alla fosfatasi acida lisosomiale

Diagnostica differenzialeVacuoli presenti nella glicogenosi di tipo II sono simili a quelli osservati nei pazienti con Malattia

di Danon. Questa malattia è legata alla mutazione del gene

LAMP2 che codifica per la proteina 2 associata alla membrana lisosomiale implicata nella

maturazione dell’autofagosoma e fusione al lisosoma.

Le manifestazioni cliniche ed ereditarie però sono diverse.

Diagnostica differenziale

Glicogenosi dovuta a deficit dell’enzima deramificante caratterizzata da vacuoli

PAS positivi ma da un piccolo incremento della fosfatasi acida e alla microscopia elettronica il glicogeno non è mai legato

alla membrana e non vi è materiale autofagico.

MALATTIA DI POMPE A INSORGENZA TARDIVA. Algoritmo diagnostico

American Association of Neuromuscular & Electrodiagnostic Medicine

Muscle & Nerve, 2009

Ipostenia muscoli cingolo pelvico

Valutazione neurologica CK, LDH, AST, ALT

Difficoltàrespiratorie

FCV da posizioneseduta e supina

IposteniadiaframmaENMG

Elementi suggestivi di una malattia di Pompe

o di una miopatia non specifica

Attività enzimatica GAA su sangue

Biopsia muscolareMiopatia vacuolare +

accumulo di glicogeno lisosomiale

SI

Attività enzimatica GAA su muscolo o sangue

Attività enzimatica ridotta

Attività enzimatica normale

Considerare una diagnosi diversa

Attività enzimaticanormale

Attività enzimatica ridotta

Confermare la ridotta attività enzimatica GAA su un secondo campione

e/o analisi genetica

Positivo NegativoMalattia di Pompe confermata

Elementi suggestivi di una

patologia specifica

Pattern miopatico

Considerare una diagnosi diversa

NO