ssRNA negative strand Orthomyxoviridae: Influenza A Filoviridae: Ebola, Marburg
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• Le dépistage : recherche systématique à l’aided’examens, dans une population, des individus (oudes groupes) atteints par un trouble de santédonné, passé jusque là inaperçu.
• Le diagnostic : identification d’une maladie chezun sujet qui présente des troubles
Un diagnostic est donc mis en œuvre sur dessujets malades (présence de symptômes ou delésions), tandis que le dépistage est appliqué surdes sujets apparemment sains (absence desymptôme et de lésion)
Principales différences entre diagnostic et dépistage
Différence essentielle
En général
Une seulePlusieursNombre d’investigationsmises en œuvre sur chaque
sujet en même temps
PopulationIndividuSujet de l’examen
Indépendant del’état clinique
Conditionné parl’état clinique
Motifde l’examen
DépistageDiagnostic
Toma et al., 2001
Introduction
Les raisons du diagnostic et du dépistage
• Diagnostic– Maladies pour lesquelles la démarche d’un diagnostic
étiologique est nécessaire (mise en place traitement,prophylaxie, pronostic)
– Zoonoses– Maladies pour lesquelles le statut indemne est requis
(commerce, concours, insémination…)– (Maladies émergentes ou ré-emergentes)
•• DDéépistagepistage– Surveillance épidémiologique– Programmes d’éradication– Programmes de contrôle– (Maladies émergentes ou ré-emergentes)
METHODES DIRECTES METHODES INDIRECTES
DIAGNOSTIC DEPISTAGE
Détection du virus Sérologie
Test diagnostic idéal: rapide, simple, sensible,spécifique et bon marché
Rapidité Coût,simplicité
*Méthodes traditionnelles : en général trop lentes pourpermettre une action efficace sur un cas individuel
*Nouvelles méthodes dites rapides : plus adaptées à unemédecine individuelle :
-il existe ainsi de plus en plus de kit commerciauxà la disposition du praticien
-laboratoires équipés pour donner des réponsesrapides
Problématique du diagnostic étiologique
Fonction
1-de l’objectif fixé
2-du virus recherché (cultivable, non cultivable…)
3-du type de prélèvement (richesse en virus)
Stratégie du diagnostic virologique
1- Diagnostic histopathologique
Prélèvement fixés (formol 10%) le plus souvent
Recherche d’ECP caractéristiques
Les méthodes
2- La microscopie électroniqueMéthode directe, spécifique au diagnostic virologique
Les méthodes
Liquide ou tissusPrélèvements
Diagnostic rapide
Virus inconnu
Besoin méthode non sélective
Autres méthodes non disponibles
Indications
Quantité minimale (105 particules/ml)
Sensibilité (opérateur)
appareillage
Limites
Simplicité
Rapidité
Pas besoin de réactifs spécifiques
Avantages
Contraste négatif
2- La microscopie électronique
contraste négatif, immunomicroscopie, détection cytologique (coupemince)
-Aspects généraux des virus en contraste négatif :
*Observation de virus nus : forme régulière, 20 à 90 nm
Virus grande taille (70-80nm) : Reoviridae, Adenoviridae
Virus taille moyenne (40-50 nm) ou petite taille (<40 nm) sontdifficilement identifiables (ex : Papillomaviridae)
Virus toute petite taille (20-30 nm) : pas de caractéristiquesmorphologiques visibles (Parvoviridae, Picornaviridae)
Les méthodes
2- La microscopie électronique
*Observation virus enveloppés :
Membrane lâche le plus souvent, aspect souvent pléiomorphe,
Forme souvent grossièrement globulaire,
Virus lisses ou virus à spicules
Poxviridae : forme de brique (150-350 nm)
Rhabdoviridae : forme allongée
Filoviridae : longueur variable
Herpesviridae: « oeuf au plat »
Coronaviridae: couronne
Les méthodes
2 L’isolement viral
Méthode de référence, originelle
Les méthodes
Liquide ou tissusPrélèvements
Temps
Matériel : cultures cellulaires
Détectabilité/Inefficacité (virus peu résistants ounon cultivables)
Prélèvements
Confirmation : tests immunologiques
Limites
Spécificité et sensibilité (virus dépendante)Avantages
• Indications
– Virus connu : succès isolement fonction• Quantité de virus (phase aiguë)• Caractéristiques intrinsèques au virus (ex BVDV cp
et ncp, VRSB)• Qualité du prélèvement (froid positif ou –80°C,
jamais à –20°C, le plus propre possible)
– Etudes ultérieures– Virus inconnu
Valeur Positive du Diagnostic
• Méthodes
Peu rapide en méthode conventionnelle
Possibilité de méthodes dites de « culture rapide »
*Cellules : Cellules primaires ; lignées (souches) cellulairesdiploïdes ; cellules en lignées continues
(Remarque : culture in ovo)
*Détection des virus : ECP ; hémadsorption/hémagglutination ;techniques immunologiques
3- Détection directe antigènes viraux
Méthodes directes largement utilisées
- Prélèvement cellulaire = immuno-cytodiagnostic:immunofluorescence ou immunohistochimie
- détection antigènes solubles
* ELISA (Labo ou Kits)
* immunodiffusion (RSV)
* immunofiltration (RSV)
* immunochromatographie (Kits FeLV)
* test au latex: agglutination passive (rota, parvo)
Les méthodes
Ex: ELISA de type « sandwich »
Ac spécifique
Echantillon à tester
Ac spécifiques de l’antigènecouplé à une enzyme
Substrat de l’enzyme
Rapidité
Pas besoin de virus infectieux
Avantages
InconvénientsAvantagesMéthodes
Détectabilité (1 ngantigène/ml prélèvement)
Spécificité (selontechniques)
Automatisation
Kits commerciaux
Quantification ?
Lq et tissus
Lq et tissus
coût
ELISAs
Délai/IFIHC
Microscope à fluorescence
Spécificité ?
IF
4-Détection des acides nucléiques
- Méthode directe, applicable à tous les virus (même inactivé, noncultivable..)
- Ppe: hybridation d’une sonde nucléique spécifique avec les acidesnucléiques correspondants du virus recherché,
- Méthodes anciennes : hybridation (sonde ADN, ARN marquée)
- Méthodes actuelles: amplification in vitro de la réactiond’hybridation (PCR)
- Méthodes en cours d’élaboration : Biopuces (différentiationmutants, souches)
Les méthodes
• Interprétation de la signification à donner à la présence d’ac.nucléiques dépend:
– De l’acide nucléique détecté
– De la présence ou non de l’acide nucléique détecté chez un individu sain(absence de pathologie)
– De la quantité de génome détectée
Sensibilité: contaminations
Spécificité: variantes génétiques virales
Coût
Inhibiteurs
Inconvénients
Sensibilité
Spécificité
automatisation
Avantages
• Les techniques PCR
– trois méthodes classiquement utilisées : PCR simple, nichée, en temps réel
Comparaison différentes techniques PCR
PCR classique PCR nichée PCR temps réel
Sensibilité + ++ ++(fluorescence)
Spécificité + ++ ++
Contamination ++ +++ + (selon système)
Rapidité/Débit ++ (6 heures) + (12 heures) +++ (3 heures)
Automatisation + + +++
Quantification Non Non Oui
Reproductibilité + + +++
Coût/technicité + + +++
Comparaison différentes méthodes
15 min-1 heureGroupe/familleFaible (> 106ml-1)Particule viraleME
2-14 jours (voir 3semaines)
Groupe/familleElevée (1 particuleinfectieuse/essai)
Infectivité et ECP
Particules viralesIsolement
1-3 hType/groupeElevéeAntigène viralIF
4-8 hType/groupe/famille
Elevée (1-50molécules essai)
Génome viralPCR
1-3 hType/groupeElevée (1 ng/ml)Antigène viralELISA
Temps deréalisation
SpécificitéSensibilitéDétectionTechnique
La sérologie
Recherche des anticorps synthétisés par l’hôte enréponse à une infection aiguë, persistante ou ancienne
• Méthodes sérologiques fondées sur le principe dela spécificité de la réaction Ac/Ag
• Nature et qualité des échantillons
– Sérum + liquides biologiques (lait)– Transport sans conditions particulières (décantation 24-
48 h sous conditions normales)– LCR (humaine)
1- Généralités
2- Techniques sérologiques
Techniques immunoenzymatiques (ELISA)
(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Principe du test ELISA: Recherche de la présenced’anticorps (Ac) spécifiques
EzEz
Ez
- +
- +
- +
- +
Ag connu spécifique de l’AC recherché
Incubation du sérum à tester
Ajout des AC anti-Fcmarqué par une enzyme
Ajout du substratchromogène de Ez
ColorationPas de coloration
Lavage
Lavage
ELISA Indirect
ELISA indirect
Antigène
Ac de l’échantillon à tester
Ac anti-immunoglobuline del’espèce d’où provient l’échantillon,
couplé à une enzyme
Substrat de l’enzyme
ELISA de blocage
Antigène
Ac de l’échantillon à tester
Ac spécifiques de l’antigène (ousous-unité antigénique) couplé
Substrat de l’enzyme
ELISA de compétition
Antigène
Ac spécifiques de l’antigène (ousous-unité antigénique) couplé
Ac de l’échantillon à testerAc de l’échantillon à tester
Ac de l’échantillon à testerAc de l’échantillon à tester
Ac spécifiques de l’antigène (ou sous-unité antigénique) couplé
Ac spécifiques de l’antigène (ou sous-unité antigénique) coupléAc de l’échantillon à testerAc de l’échantillon à tester
Substrat de l’enzyme
Avantages
-Sensibilité
- Distinction classes d’Ac
-Automatisation et faible volume réactionnel
-Technique facile à utiliser
-Technique qualitative ou quantitative
IgM+/-IgM
IgG
Contamination
Primo-infectionIncubation Ré-infectionRéactivation
Temps3 semaines
à 3mois
Autres techniques
InconvénientsAvantagesTechniques
SpécificitéRapidité
Sensibilité
Agglutination passive
Certains virus
Conditions expérimentales
Moindre sensibilité
Simplicité
Ac potentiellementprotecteurs
Inhibitionhémagglutination
Conditions expérimentales
Virus à ECP
Test référence
Spécificité
Ac protecteurs
Séroneutralisation
Confirmation (Humaine)Spécificité > (ELISA)Western-blot, immuno-blot
Difficulté exploitationId ELISARadio-immunologie
Spécificité
Automatisation
rapiditéIF indirecte
• Détermination du statut immunitaire d’un animalvis-à-vis d’un virus à un moment donné:Dépistage
• Diagnostic d’une infection en cours ou récente
• Evaluation de l’immunité résiduelle aprèsinfection naturelle ou vaccination
3- Circonstances de réalisation et règles d’interprétation
⇒ un seul prélèvement
⇒ Séroconversion : 2 prélèvements (10-20 jours)⇒ Présence d’IgM spécifique: 1 prélèvement
• Interprétation
– Caractère retardé de la réponse humorale– Interférence immunité colostrale– Réactions croisées– Pas de datage de l’infection– Expression variable selon:
• Virus– réponse humorale vs réponse cellulaire– BVDV: IPI
• Laboratoire
Circonstances de réalisation et règles d’interprétation
Rôle du praticien
• Renseignements cliniques
• Prélèvements
• Choix des techniques
• interprétation des résultats
• Renseignements cliniques
• PrélèvementsOù?
• site de réplication du virus (porte entrée-sortie)• pathologie observée et technique utilisée
Quand?• Phase aiguë (le plus tôt possible)• Fenêtre de détection et infection virale
Quoi?fonction de la pathologie observée, du virus suspecté,
de la technique utilisée
Syndrome prélèvement
Respiratoire Ecouvillon nasal/gorge ;aspiration naso-pharyngée
Digestif Fèces
Génital Ecouvillon génital
Oculaire Ecouvillon conjonctival
Cutané Grattage, liquidevésiculaire, biopsie
Nerveux Fèces, écouvillon nasal,LCR
Généralisé Ecouvillon nasal, fèces,leucocytes sanguins
Autopsie/biopsie Selon organe
Toute maladie Sang pour sérologie
- Traitement: selon la technique de laboratoire (fixation pourhistopathologie ; dans milieu de transport, sous couvert dufroid…)
Acheminement le plus rapide possible vers le laboratoire
Ne pas oublier d’indiquer :
date et nature du prélèvement , commémoratifs, diagnosticprésumé, nature de la recherche
•Interprétation des tests
Laboratoire : donne résultats aidant le clinicien à établir sondiagnostic
il ne réalise pas un diagnostic définitif
Lors de diagnostics directs considérer :
-le type de prélèvement d’où a été isolé le virus (+ le contexteclinique)
-les circonstances épidémiologiques accompagnant l’isolement
-le caractère pathogène du virus isolé