Diagnostic antenatal et foetal 2ème version
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DIAGNOSTIC ANTENATAL ET FOETAL
LES TECHNIQUES DE LABORATOIRE EN GENETIQUE
METHODES D’EXPLORATIONDyschromosomies dont la fréquence varie entre
10 à 20% avec essentiellement les triploïdes et les trisomies mais également les disomies et les
mosaïques confinées au placenta.
l’organisation du génome humain Le génome = 3 milliard de pb
Nombre de gènes : environ 30 000
1) Les Chromosomes : - 23 paires- 400-550 bandes chromosomiques
2) Une bande : – 5 à 10 mégabases– 130 gènes en moyenne
(densité génique)– distance moyenne entre 2
gènes : 20 000 à 30 000 pb
3) Un gène : - la taille : 10 000 pb en moyenne avec d’énormes variations
1) Les anomalies des chromosomes -> maladies chromosomiques- Anomalies de nombre : aneuploïdies- Anomalies de structure > 5-10 Mbases
2) Les anomalies de régions chromosomiques : -> plusieurs gènes concernésSyndromes microdélétionnels
– délétions < 5 mégabases – duplications < 5 mégabases
3) Les anomalies géniques : un seul gène défectueux- séquence d’ADN
- méthylation de l’ADN
les stratégies d’analyse en génétique
Analyse des trois niveaux d’organisation du génome
1 Analyse chromosomique = la cytogénétique : Caryotype la cytogénétique moléculaire : hybridation sur chromosomes par techniques de FISH biologie moléculaire
2 Analyse de régions chromosomiques 3 techniques de FISH3biologie moléculaire
3 Analyse des gènes3 biologie moléculaire
Les techniques de cytogénétique dans le DPN : le caryotype
1. définition du caryotype2. rappels sur la mitose et les chromosomes 3. réalisation d’un caryotype4. Différents prélèvements
1.Définition du caryotype
La technique qui consiste à colorer les
chromosomes en métaphase puis à prendre une photo lorsqu'ils sont étalés pour les dénombrer, est appelée
technique de caryotypage.
On dit que l'on réalise un caryotype.
2. Rappel sur les chromosomes Les différents stades de condensation de l’ADN
-(1) une molécule d'ADN double brin
- (2) et (3) chromatine (ADN avec histones) au cours de l'interphase
- (4) chromatine condensée au cours de la prophase
-(5) chromosome en métaphase.
télomère
télomère
centromère
• coloration directe par un colorant basique : le Giemsa
• coloration par le Giemsa après dénaturation par la trypsine
• à bandes GTG (Trypsine Giemsa)
• coloration par le Giemsa après dénaturation par la chaleur
• à bandes RHG (Reverse Heat Giemsa)
2. Rappel sur la mitose : place de la mitose dans le cycle cellulaire
3. Réalisation d’un caryotype : prélèvement et recueil des cellules amniotiques
Centrifugeuse -> recueil des cellules
3. Réalisation d’un caryotype : étape de culture cellulaire
Hotte à flux laminaire
milieu stérile nutritifIncubation à 37°C et 5% CO2
étuve
3. Réalisation d’un caryotype : obtention de mitoses en métaphase
1 Arrêt des mitoses en métaphase par la colchicine :
chromosomes condensés au maximum augmentation de mitoses
2 Choc hypotonique : entrée massive d’eau dans la cellule éclatement des cellules dispersion des chromosomes
3 Fixation des chromosomes par un fixateur
4 Etalement sur lame des chromosomes fixéesthermotron : enceinte avec température et degré d’hygrométrie contrôléspour un étalement optimal de la goutte
2.Rappel sur la mitose :Les quatre phases de la mitose
1
4
2
3
Choc hypotonique :
entrée massive d’eau dans la cellule
éclatement des cellules dispersion des chromosomes
• Fixation des chromosomes par un fixateur
3. Réalisation d’un caryotype : Vérification de la richesse des mitoses
mitose
3. Réalisation d’un caryotype : dénaturation et coloration des chromosomes
• coloration directe par un colorant basique : le Giemsa
• coloration par le Giemsa après dénaturation par la trypsine
bandes GTG (Trypsine Giemsa)
• coloration par le Giemsa après dénaturation par la chaleur
bandes RHG (Reverse Heat Giemsa)
3. Réalisation d’un caryotype : analyse des mitoses au microscope à
contraste de phase
3. Réalisation d’un caryotype : classement des chromosomes
• cellule diploïde : les chromosomes homologues par paire identique
• les chromosomes sexuels = gonosomes : XX ou XY
• les autosomes : 22 paires par taille décroissante fonction de la position du centromère
• le banding : 300 bandes400 bandes550 bandes >550 bandes
3. Réalisation d’un caryotype : classement des chromosomes après giemsa
grands à centromères presque médian grands à centromère distaux
Chromosomes de taille moyenne
grands acrocentriques
petits à centromères médian petits acrocentriques Chomosomes sexuels
3. Réalisation d’un caryotype : banding des chromosomes: 400-550 bandes
4. Les différents prélèvements caryotype à partir de l’amniocentèse
• Quoi ?- Le liquide amniotique
• Quand ? Amniocentèse « classique » : à partir de 14 SAAmniocentèse tardive : 32 SA
• Combien ? - quantité prélevée : 1 ml par SA- 2 flacons
• Comment ?- ponction transabdominale- asepsie rigoureuse (bloc opératoire, tubes falcon stérile)
• Prélèvement fragile ?- transport à température ambiante
• Mise en culture- deux tubes prélevés deux cultures
• durée de la culture : - multiplication spontanée des cellules -> autour de 10 j
• Le nombre de clones :- adhésion des cellules sur la paroi -1 cellule => un clone cellulaire
4. Les différents prélèvements caryotype à partir de l’amniocentèse
• Réalisation du caryotype :- sur les deux cultures- deux marquages : bandes RHG et bandes GTG
• Avantages : - belles mitoses diagnostic des anomalies de structure
chromosomique- pas de contamination par des cellules maternelles- cellules du LA = cellules du fœtus
• Inconvénients :- complications liées au prélèvement : 0,5 à 1% de perte foetale- délai de réponse : 10 jours
Dans le LA
Après culture
clones issus de cellules différentes
Culture A Culture B
Pseudo-mosaïcisme
Mosaïcisme vrai
Caryotype du liquide amniotique avec une mosaïque
4. Les différents prélèvements
• Prélèvements prénataux caryotype fœtal
- les villosités choriales = fin du premier trimestre (10-13+6j SA)- le liquide amniotique = Amniocentèse : deuxième trimestre
Amniocentèse « classique » : à partir de 14 SA
Amniocentèse tardive- le sang fœtal = cordocentèse : troisième trimestre- biopsie de tendon foetal
• Autres prélèvements caryotype constitutionnel
- sang des parents
4. Les différents prélèvements 4.1.caryotype à partir du sang du cordon
• Prélèvement au bloc opératoire sous contrôle échographique - tube hépariné - transport à température ambiante
• Mise en culture - sous hotte à flux laminaire- dans un flacon Falcon avec milieu de culture- 1 -2 ml de sang - addition de phytohémaglutinine multiplication des lymphocytes T
• Culture à 37°C sous 5% de CO2 - 1 culture sur 3 jours
• Réalisation du caryotype
5. les prélèvements prénataux : caryotype à partir des villosités choriales
1 mésoblaste extra-embryonnaire2 cytotrophoblaste3 syncytiotrophoblaste
1 Prélèvement - sous contrôle échographique- avec une canule d’aspiration- par voie vaginale ou par voie abdominale
2 Transport immédiat dans tube stérile au laboratoire
3 deux techniques au laboratoire - caryotype après culture- caryotype direct si
poids >5 mg
4. Caryotype direct à partir des villosités choriales
Mitoses spontanées des cytotrophoblastes caryotype direct
• Technique :- sur la VC : colchicine, choc hypotonique, fixation des VC
- une étape supplémentaire : la dilacération de la VC dans du liquide d’éjection
isolement des cellules du cytotrophoblaste
- étalement avec un étaleur de mitoses
- marquage
- analyse et classement des chromosomes
• Avantages du direct :- résultat le jour même
- pas de contamination par des mitoses maternelles
• Inconvénient :- qualité moyenne des mitoses
4. Caryotype après culture des villosités choriales
1 Les cellules mises en culture
= le tissu extra-embryonnaire, syncitiotrophoblaste et cytotrophoblaste
lavage pour enlever les caillots sanguins
nécessité de trier les VC avant la mise en culture
pour éviter une contamination maternelle
2 Mise en culture des cellules dissociation des VC par trypsine
3 La culture : comme le LA- une seule culture
4 Le caryotype :
Origine des VC
Cytotrophoblaste = direct Tissu extra-embryonnaire = culture
caryotype de 2 tissus d’origine différente
Problème des mosaiques sur VC
mosaïque retrouvée aussi chez le fœtus
mosaïque confinée au placenta = non retrouvée dans le LA ou le sang foetal : 1 à 2% des VC
5. Anomalies du caryotype = anomalie des chromosomes
Anomalies de nombre = aneuploidie
> 46 chromosomes
triploïdie : 69 chromosomes
trisomie : 3 chromosomes homologues
marqueur surnuméraire : petit « chromosome » surajouté
< 46 chromosomes
monosomie : absence d’un chromosome
Anomalie de structure =
46 chromosomes
Structure modifiée :
• Échange de matériel entre 2 chromosomes
• Délétion
• Duplication…..
5.1. Anomalies de nombre du caryotype : triploidie
69,XXXou XXY ou XYY
69,XXX ou XYY
69,XXX ou XXY
5.2. Anomalies de nombre du caryotype : trisomie
5.3. Anomalies de nombre du caryotype : marqueur surnuméraire : 47, XY,+mar
• Caryotype masculin
• un marqueur chromosomique en mosaique
(11/16) sur les cellules étudiées
Les anomalies de structure équilibrées les plus fréquentes : les translocations
5.4. Anomalies de structure du caryotype
Translocation réciproque Translocation Robertsonienne
5.5. Anomalies de structure du caryotype
45,XX,t(13;14)(q10;q10)
Des anomalies de structure équilibrées moins fréquentes : les inversions et les insertions
5.6. Anomalies de structure du caryotype
Inversion paracentrique
insertionInversion péricentrique
5.7. Anomalies du caryotype: Les anomalies de structure déséquilibrées
délétion duplication
chromosome en anneau
isochromosome
5.6. Anomalies de structure du caryotypeRCIU post natal + CIA :46,XX,del(13)(q21.1)
5.8. Anomalies de structure du caryotype
46,XX,r(14)(p11.2q32)
6. Conseil génétique devant une anomalie du caryotype :
Anomalie de structure équilibrée
formation de gamètes déséquilibrés
FCS, MFIU nouveau-né avec malformation, dysmorphie,
retard mental
Méiose Population à risque : parent porteur d ’une
anomalie chromosomique équilibrée
trisomie 13
45,XX,t(13;14)
méïose
trisomie 14
fécondation
Gamete normal Der(13;14) Disomie 14Disomie 13
Les techniques de cytogénétique moléculaire dans le DPN
1 Analyse chromosomique = la cytogénétique : Caryotype standard
la cytogénétique moléculaire : hybridation sur chromosomes par techniques de FISH biologie moléculaire
2 Analyse de régions chromosomiques 3 techniques de FISH3biologie moléculaire
3 Analyse des gènes3 biologie moléculaire
Les techniques de cytogénétique moléculaire dans le DPN
1 le principe de la FISH
2 application : aneuvysion
3 application : microdélétions invisibles sur un caryotype
4 Application : identification des marqueurs Limite de la technique
1. le principe de la FISH : Deux propriétés de la molécule d’ADN
1) La complémentarité de l’ADN
-double hélice
- constituée de bases complémentaires
-liée entre elles par des liaisons hydrogène
A = T G C
2) La dénaturation de l’ADN
- Thermique : rupture des liaisons hydrogène ADN simple brin
- Réversibilité : rétablissement des liaisons hydrogène ADN double brin
1. le principe de la FISH = Fluorescence In Situ Hybridation
1) L’ADN cible : ADN sur lequel est faite
l’hybridation- In situ : les chromosomes
2) Une sonde : ADN ou ARN marqué- fixation de fluorochromes sur la sonde sonde fluorescente
3) Hybridation de l’ADN cible avec une sonde= Etablissement de LH entre la sonde fluorescente et l’ADN cible ADN cible fluorescent
1. principe de la FISH : Les principales étapes d’une FISH
1 Etape de codénaturation- sur plaque chauffante - dénaturation des chromosomes- dénaturation de la sonde
2 Etape d’hybridation à 37°C pendant une nuit - fixation de la sonde sur les chromosomes- renaturation progressive des chromosomes et de la sonde
3 Lavages - élimination de l’excès de sonde non fixée sur les chromosomes Augmentation de la spécificité
4 Contre-coloration des chromosomes avec le DAPI- agent intercalant entre les bases de l’ADN - fluorescent
1. le principe de la FISH : lecture
lecture avec un microscope à épifluorescence
2. Applications de la FISH : différentes sondes
1) Peinture chromosomique un chromosome ou un bras chromosomique
2) Sondes spécifiques d’une région chromosomique- sondes locus spécifiques
régions impliquées dans un syndrome (plusieurs gènes)
-> aneuvysion : chromosomes 13 et 21
- sondes centromériques (CEP)
-> aneuvysion : chromosomes X,Y et 18
-> les centromères de tous les chromosomes
- sondes télomériques (tel)-> télomère du bras court
-> télomère du bras long
2.1. Applications de la FISH aneuvysion à partir du liquide amniotique
1 Intérêts : - examen direct sur les noyaux des amniocytes : 24 heures- sensible : décompte faits sur 100 noyaux
2 Principe de l’aneuvysion* : hybridation sur les noyaux
Diagnostic fiable et rapide des principales aneuploidies
2.1. indication de la FISH aneuvysion à partir du liquide amniotique
Indications- signes d’appel échographiques
- nuque épaisse sur échographie du 1° trimestre
18
2.2. application de la FISH : diagnostic d’un syndrome microdélétionnel
• Signe d’appel échographique : cardiopathie
• caryotype normal
• Recherche d’un syndrome de DiGeorge
• Présence d’une microdélétion en 22q11
2.3. application de la FISH
Identification d’un petit marqueur surnuméraire
2.3. application de la FISH :Identification d’un petit marqueur surnuméraire
par FISH centromérique
4. application de la FISH Identification d’un petit chromosome 15 surnuméraire
2.3. application de la FISH Identification d’un petit chromosome 15 surnuméraire
FISH spécifique de la région Willy-Prader-Angelman
2.3. application de la FISH :identification d’un isodicentrique du chromosome 15
CEP 15
CEP 15
SNRPN, D15S10
SNRPN, D15S10
47,XX,+idic(15;15)(q13;q13).ish15q11-q13 (SNRPN++,D15S10++)
2.4. application de la FISH délétion
2.4. application de la FISH délétion
délétion du gène du rétinoblastome RB1
2.4. application de la FISH délétion interstitielle
une délétion interstitielle du chromosome 13
Techniques de biologie moléculaire dans le DPN
1 Analyse chromosomique = la cytogénétique : Caryotype standard
la cytogénétique moléculaire : hybridation sur chromosomes par techniques de FISH biologie moléculaire
2 Analyse de régions chromosomiques 3 techniques de FISH3biologie moléculaire
3 Analyse de l’ADN-> biologie moléculaire
Techniques de biologie moléculaire dans le DPN
Anomalies multiples - Visibles sur le caryotype- invisibles sur le caryotype mais recherche ciblée- invisibles sur le caryotype et inconnues : pêche à la ligne !!!
Techniques multiples :- Synthèse d’ADN : amplification d’un segment d’ADN (PCR), marquage- Hybridation : amorces, sondes ADN ….- Electrophorèse : migration sur gel, sur capillaire
Début commun : une extraction d’ADN à partir d’un prélèvement
Les prélèvements :- fœtal : VC, LA, sang du cordon- parentaux : sang sur tube EDTA
(1) Les techniques de base de la biologie moléculaire
la PCR : amplification exponentielle
Anomalie ciblée pour le choix des amorces
(1) Les techniques de base de la biologie moléculaire électrophorèse sur gel après PCR
Séparation selon la taille
visualisation des bandes avec le bromure d'éthidium sous UV
but : séparer l’ADN chargé négativement au travers d'un gel sous l'effet d'un champ électrique
(1) Les techniques de base de la biologie moléculaire électrophorèse sur capillaire après PCR
Le nombre de paires de bases (pb)
(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / screening des exons
PCR Multiplex
Myopathie de Duchenne
(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct /recherche d’une petite délétion
Détection de la mutation deltaF508 du gène CFTR
1.Hétérozygote pour deltaF508
2.Homozygote pour deltaF508
3.Homozygote normal au locus F508
(En bleu le marqueur de poids interne)
PCR fluorescente
Migration sur un séquenceur automatique
(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / recherche d’une mutation ponctuelle
Enzyme de restriction
1.Hétérozygote (noir) : site de restriction2.Homozygote normal (noir)
Amorce en bleue d’un témoin de digestion hétérozygote
(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / séquençage : principe
H
OH
H
liaison diester
H
didNTP incorporé dans l’ADN -> arrêt de la PCR
(2) Les applications de base de la biologie moléculaire
diagnostic direct / séquençage
• Amplification par PCR dans un seul sens
• Mélange de dNTP et de didNTP fluorescents
• incorporation de didNTP -> Arrêt de la synthèse d’ADN
• Fragments fluorescents de taille différente sur l’électrophorèse -> séquence du fragment amplifié
(2) Les applications de base de la biologie moléculaire diagnostic direct / séquençage
Mutation de la CF
Mise en évidence directe de la mutationMutation uniqueMutation localiséesMutation familiale déjà identifiée
• un microsatellite : répétition de nucléotides court (de 1 à 4 nucléotides) CACACACACA
• Un marqueur : variation du nombre de répétition varie selon les individus.
• Un marqueur non ambigu :
les séquences de part et d’autre du marqueur uniques
(2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : principe
(2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : principe
(1) Les techniques de base de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : principe
Migration selon la taille des microsatellites amplifiés
Migration sur gel Migration dans un capillaire
(2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites : application au diagnostic indirect
1) Détermination du microsatellite lié à la maladie
2) Avantage :gène non connuéchec du diagnostic direct
2 ) Inconvénients :diagnostic probabilisteCas index familialParents informatifs
Fille atteinte d’une MAR
(2) Les applications de la biologie moléculaire amplification de microsatellites :
diagnostic de disomie uniparentale
Une paire de chromosomes homologues héritée d’un seul parent
Invisible sur le caryotype
(2) application de la biologie moléculaire : amplification de microsatellites :
diagnostic de disomie uniparentale
Identification de l’origine des chromosomes :
- les microsatellites
Disomie uniparentale - individu 4
- Individu 5
FCS due à la trisomie 14
correction de la trisomie 14 après fécondation
DUP14 mat
45,XX,t(13;14) 23,Y
méïose fécondation
Disomie 14
45,XY,t(13;14)45,XY,t(13;14)
Trisomie 14
(2) application de la biologie moléculaire : amplification de microsatellites :
anomalies du nombre de chromosomes
PCR fluorescente multiplexe quantitative sur des microsatellites sur les chromosomes 21
(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / sexe foetal
• ADN foetal circulant dans le sang maternel• Indications :
- les maladies récessive liées à l’X (MRX)- hyperplasie congénitale des surrénales (HCS)
• Intérêts :- non invasif - précoce
• En pratique : - MRX : pos à 10 SA ->VC- HCS : corticothérapie si nég à 8 SA-> contrôle à 10 SA
• Technique : PCR quantitative en temps réel du gène SRY
(2) Les applications de la biologie moléculaire diagnostic direct / sexe foetal
La quantité de fluorescence : proportionnelle à la quantité d’ADN amplifiée
(3) Les puces à ADN principe
ADN cible et ADN de référence
Marquage direct des ADNpar deux fluorochromes différents(cyanines)
cohybridation compétitive Sur une lame de verre
ADN cibleADN de référence
(3) Les puces à ADN principe
Lecture des signaux d’hybridation par un scanner de fluorescence Analyse des signaux par logiciel
- gain d’ADN : spot rouge- perte d’ADN : spot vert
Anomalies de nombre du caryotype : marqueur surnuméraire : 47, XY,+mar
• Caryotype masculin
• un marqueur chromosomique en mosaique
(11/16) sur les cellules étudiées
(3) Les puces à ADN identification d’un marqueur
• Un isochromosome 18 p
• une quadrisomie d'un bras court de chromosome 18.
(3) Les puces à ADNintérêts
-pangénomique
-anomalie non connue
- Invisible au caryotype
Techniques de biologie moléculaire dans le DPN
1 Analyse chromosomique par biologie moléculaire• disomies uniparentale par PCR de microsatellites• aneuploidies par PCR de microsatellites
2 Analyse de régions chromosomiques • Puce à ADN
3 Analyse de gènes• Détermination du sexe fœtal ou du Rhésus• Diagnostic direct des mutations par PCR ….• Diagnostic indirect par PCR sur microsatellites