DIAGNOSIS MIKROSKOPIS DAN SEROLOGIS MALARIA

Justina Maria

PendahuluanPendahuluanMalaria disebabkan oleh protozoa dari Malaria disebabkan oleh protozoa dari

genus Plasmodiumgenus Plasmodium Plasmodium penyebab malaria :Plasmodium penyebab malaria :

P. vivaxP. vivaxP.falciparumP.falciparumP.malariaeP.malariaeP. ovaleP. ovaleP.knowlesi ( th.2007 )P.knowlesi ( th.2007 )

Diagnosis malaria yang cepat dan tepat Diagnosis malaria yang cepat dan tepat sangat diperlukan dalam sangat diperlukan dalam penatalaksanaan kasus malaria.penatalaksanaan kasus malaria.

Pemeriksaan laboratorium yang dapat Pemeriksaan laboratorium yang dapat dilakukan :dilakukan :Mikroskop cahayaMikroskop cahayaMikroskop fluoresensiMikroskop fluoresensiFlowcytometriFlowcytometriAutomated blood analyzerAutomated blood analyzerPemeriksaan serologis Pemeriksaan serologis Polymerase chain reaction ( PCR )Polymerase chain reaction ( PCR )Laser desorption mass spectrometry. Laser desorption mass spectrometry.

( LDMS )( LDMS )

Diagnosis mikroskopisDiagnosis mikroskopis

Menegakkan diagnosis.Menegakkan diagnosis.Mengevaluasi hasil pengobatan.Mengevaluasi hasil pengobatan.

Sediaan dibuat dalam bentuk :Sediaan dibuat dalam bentuk :Sediaan tipis Sediaan tipis menentukan spesies menentukan spesiesSediaan tetes darah tebal Sediaan tetes darah tebal menentukan menentukan

adanya parasit.adanya parasit.

Sediaan tipisSediaan tipis

Alat, bahan dan reagen yang diperlukan :Alat, bahan dan reagen yang diperlukan :1.1. MikroskopMikroskop

2.2. Kaca obyekKaca obyek

3.3. PensilPensil

4.4. LancetLancet

5.5. Etanol 70%Etanol 70%

6.6. Kapas alkoholKapas alkohol

7. Metanol absolut7. Metanol absolut

8. Larutan pewarna Giemsa8. Larutan pewarna Giemsa

9. Larutan dapar dengan pH 7,29. Larutan dapar dengan pH 7,2

10. Minyak emersi10. Minyak emersi

11. Larutan pembersih lensa mikroskop.11. Larutan pembersih lensa mikroskop.

Bahan pemeriksaan diambil dari :Bahan pemeriksaan diambil dari :Jari tengahJari tengahJari manisJari manisBayi : ibu jari kaki.Bayi : ibu jari kaki.

Sediaan tetes darah tebalSediaan tetes darah tebal

Ketebalan yang baik :Ketebalan yang baik :Bila sediaan tetes tebal diletakkan di Bila sediaan tetes tebal diletakkan di

atas surat kabar, tulisan pada surat atas surat kabar, tulisan pada surat kabar masih tampak dan samar – kabar masih tampak dan samar – samar dapat terbaca.samar dapat terbaca.

Bersihkan ujung jari dengan alkohol 70 %

Tekan ujung jari dan tusuk dengan lancet.

Tetes darah yang pertama keluar dihapus dengan kapas kering.

Dengan sedikit tekanan pada jari, ambil setetes kecil darah dengan cara menempelkan permukaan bagian tengah kaca objek pada darah yang keluar.

Kemudian dengan sedikit menekan jari, ambil 2 – 3 tetes besar darah dan ditempelkan 1 cm di samping tetes kecil.

Tepi kaca objek lain ( sebagai spreader ) yang di letakkan pada sudut 45° di depan tetes kecil darah lalu tarik ke belakang sampai menyentuh tetes darah tersebut. Setelah darah melebar sepanjang tepi kaca objek spreader, dorong kaca objek tersebut sehingga terbentuk sediaan apus darah tipis

Letakkan salah satu sudut kaca objek spreader pada tetes besar darah dan gabungkan kedua/tiga tetes darah serta dilebarkan sehingga terbentuk tetes darah tebal yang rata.

Tulis identitas pasien pada daerah yang tebal dari sediaan tipis.

Pengecatan dengan GiemsaPengecatan dengan Giemsa

Sediaan tipisSediaan tipis

1. Siapkan larutan Giemsa 3% dalam larutan 1. Siapkan larutan Giemsa 3% dalam larutan buffer pH 7,2buffer pH 7,2

2. Fiksasi sediaan tipis dengan metanol 2. Fiksasi sediaan tipis dengan metanol 70 %, keringkan dengan udara lalu letakkan di 70 %, keringkan dengan udara lalu letakkan di

atas rak pengeringan.atas rak pengeringan.3. Dengan pipet pasteur, tetesi sediaan darah 3. Dengan pipet pasteur, tetesi sediaan darah

dengan larutan giemsa sampai benar – benar dengan larutan giemsa sampai benar – benar rata di atas gelas obyek. Biarkan selama 30 - rata di atas gelas obyek. Biarkan selama 30 - 45 menit.45 menit.

Pengecatan dengan GiemsaPengecatan dengan Giemsa

4. Bilas dengan baik memakai larutan buffer pH 4. Bilas dengan baik memakai larutan buffer pH 7,27,2

5. Keringkan sediaan dengan udara sampai 5. Keringkan sediaan dengan udara sampai kering benar dalam posisi vertikal.kering benar dalam posisi vertikal.

Sediaan tetes darah tebal:Sediaan tetes darah tebal:

Dibiarkan kering 30 menit sampai 2 Dibiarkan kering 30 menit sampai 2 jam.jam.

Sediaan tetes darah tebal tidak Sediaan tetes darah tebal tidak difiksasi dengan metanol.difiksasi dengan metanol.

Latar belakang bersihLatar belakang bersihLapang pandang yang baik untuk Lapang pandang yang baik untuk

pemeriksaan adalah yang pemeriksaan adalah yang mengandung 10 – 20 leukosit per mengandung 10 – 20 leukosit per lapang pandanglapang pandang

Pemeriksaan mikroskopisPemeriksaan mikroskopis

Dilakukan dengan lensa obyektif 100 x.Dilakukan dengan lensa obyektif 100 x.Pemeriksaan sediaan tetes tebal Pemeriksaan sediaan tetes tebal

dimulai dengan melihat ada atau tidak dimulai dengan melihat ada atau tidak ada parasit dan bila ditemukan parasit ada parasit dan bila ditemukan parasit tentukan spesies dan stadiumnya pada tentukan spesies dan stadiumnya pada sediaan tipis.sediaan tipis.

Ukuran eritrosit umumnya Ukuran eritrosit umumnya tidak berubah.tidak berubah.

Tidak djiumpai titik titikTidak djiumpai titik titik Trofozoit muda sering Trofozoit muda sering

dijumpai, sitoplasma tebal, dijumpai, sitoplasma tebal, padat berwarna padat berwarna biru,kromatin satu titik biru,kromatin satu titik merah ukuran besar.merah ukuran besar.

Trofozoit matang sering Trofozoit matang sering dijumpai, sitoplasma dijumpai, sitoplasma padat, warna biru tua padat, warna biru tua berbentuk pita.berbentuk pita.

Skizon matur mempunyai 8 Skizon matur mempunyai 8 – 10 merozoit– 10 merozoit

Gametosit besar, oval, Gametosit besar, oval, warna biru, inti satu warna biru, inti satu bulatan kromatin berwarna bulatan kromatin berwarna merah dan menempel di merah dan menempel di salah satu sisi.salah satu sisi.

Eritrosit membesar, oval Eritrosit membesar, oval dan kadang-kadang salah dan kadang-kadang salah satu sisinya tercabik, satu sisinya tercabik, dijumpai titik – titik James.dijumpai titik – titik James.

Cincin biru padat dan Cincin biru padat dan regular.regular.

Skizon : 8 – 4 merozoitSkizon : 8 – 4 merozoit Gametosit besar, oval, inti Gametosit besar, oval, inti

satu bulatan berwarna satu bulatan berwarna merah.merah.

Eritrosit membesar, terdapat titik – Eritrosit membesar, terdapat titik – titik Shuffner berwarna merah titik Shuffner berwarna merah muda.muda.

Trofozoit sitoplasma warna biru dan Trofozoit sitoplasma warna biru dan tebal, kromatin satu titik merahtebal, kromatin satu titik merah

Skizon : jumlah merzoit 12 – 18.Skizon : jumlah merzoit 12 – 18. Gametosit oval atau bulat, warna Gametosit oval atau bulat, warna

biru gelap, hampir memenuhi biru gelap, hampir memenuhi eritrosit. Inti warna merah.eritrosit. Inti warna merah.

Eritrosit ukuran tidak berubahEritrosit ukuran tidak berubah, , stadium stadium gametosit akan mengubah bentuk gametosit akan mengubah bentuk eritrosit.eritrosit.

Cincin bentuk halus ,warna biru pucat.Cincin bentuk halus ,warna biru pucat. Trofozoit : sitoplasma tipis, warna biru, Trofozoit : sitoplasma tipis, warna biru,

bentuk cincin, koma atau tanda seru. bentuk cincin, koma atau tanda seru. Kromatin satu atau dua titik warna Kromatin satu atau dua titik warna merah.merah.

Gametosit : seperti pisang atau sabit, Gametosit : seperti pisang atau sabit, warna biru pucat ( jantan ), biru gelap warna biru pucat ( jantan ), biru gelap ( betina ). Pigmen berwarna hitam biru di ( betina ). Pigmen berwarna hitam biru di bagian tengah ( betina/makrogametosit ) bagian tengah ( betina/makrogametosit ) atau tersebar di sitoplasma ( jantan / atau tersebar di sitoplasma ( jantan / mikrogametosit )mikrogametosit )

Densitas parasitDensitas parasit Adalah jumlah parasit yang tampak Adalah jumlah parasit yang tampak

pada setiap lapang pandang pada setiap lapang pandang mikroskop.mikroskop.

Sediaan tebal dapat digunakan untuk Sediaan tebal dapat digunakan untuk memperkirakan besarnya densitas memperkirakan besarnya densitas parasitparasit

Ada dua cara :Ada dua cara :1.1. Jumlah parasit per mikroliter darahJumlah parasit per mikroliter darah

2.2. Sistem plusSistem plus

Jumlah parasit per mikroliter darah Jumlah parasit per mikroliter darah dapat dilakukan dengan menghitung dapat dilakukan dengan menghitung jumlah parasit dan jumlah leukosit jumlah parasit dan jumlah leukosit yang tampak.yang tampak.

Bila setelah terhitung 200 leukosit Bila setelah terhitung 200 leukosit ditemukan 10 atau lebih parasit malaria, ditemukan 10 atau lebih parasit malaria, maka penghitungan dihentikan.maka penghitungan dihentikan.

Bila setelah terhitung 200 leukosit Bila setelah terhitung 200 leukosit ditemukan 9 atau kurang parasit ditemukan 9 atau kurang parasit malaria, maka penghitungan malaria, maka penghitungan dilanjutkan sampai 500 leukosit dan dilanjutkan sampai 500 leukosit dan dicatat jumlah parasit yang ditemukan.dicatat jumlah parasit yang ditemukan.

Untuk P. falciparum jumlah gametosit dihitung dan Untuk P. falciparum jumlah gametosit dihitung dan dilaporkan terpisah dari stadium aseksual.dilaporkan terpisah dari stadium aseksual.

Jumlah parasit yang ditemukanJumlah parasit yang ditemukan

200 atau 500200 atau 500Jumlah parasit / µl = -------------------------------------------- X jumlah leukosit / µlJumlah parasit / µl = -------------------------------------------- X jumlah leukosit / µl

Pelaporan sistem plusPelaporan sistem plus

LaporanLaporan KriteriaKriteria

++ 1-10 parasit dalam 100 lapang pandang 1-10 parasit dalam 100 lapang pandang sediaan tetes tebalsediaan tetes tebal

++++ 11-100 parasit dalam 100 lapang 11-100 parasit dalam 100 lapang pandang sediaan tetes tebalpandang sediaan tetes tebal

++++++ 1-10 parasit per lapang 1-10 parasit per lapang pandangsediaan tetes tebalpandangsediaan tetes tebal

++++++++ Lebih dari 10 parasit per lapang Lebih dari 10 parasit per lapang pandang sediaan tetes tebalpandang sediaan tetes tebal

Bila setelah diperiksa 300 lapang pandang dan tidak ditemukan parasit malaria, maka dilaporkan sebagai “ tidak ditemukan parasit malaria “

Jumlah parasit pada pemeriksaan sediaan Jumlah parasit pada pemeriksaan sediaan tipis dinyatakan dalam % parasitemia yang tipis dinyatakan dalam % parasitemia yang dihitung dengan mencatat jumlah eritrosit dihitung dengan mencatat jumlah eritrosit yang mengandung parasit malaria di antara yang mengandung parasit malaria di antara 500 – 2000 eritrosit.500 – 2000 eritrosit.

Jumlah eritrosit yang mengandung parasit

Jumlah eritrosit

% parasitemia = ------------------------------------------------------------------------X 100

Jumlah eritrosit yang mengandung parasit

Jumlah eritrosit

Jumlah parasit / µl = ----------------------------------------------------- X ∑ eritrosit / µl

DIAGNOSIS SEROLOGIK MALARIADIAGNOSIS SEROLOGIK MALARIA

Diagnosis malaria yang didasarkan Diagnosis malaria yang didasarkan pada deteksi antigen yang spesifik pada deteksi antigen yang spesifik dalam darah penderita.dalam darah penderita.

Prinsip kerja:Prinsip kerja: Imunokromatografi yang cairannya akan Imunokromatografi yang cairannya akan

naik sepanjang kertas nitroselulosanaik sepanjang kertas nitroselulosa

Tiga macam antigen malaria yang Tiga macam antigen malaria yang digunakan pada rapid test:digunakan pada rapid test:Histidine rich protein -2( HRP-2 )Histidine rich protein -2( HRP-2 )Lactate dehydrogenase (LDH )Lactate dehydrogenase (LDH )AldolaseAldolase

HRP-2 :HRP-2 :Protein yang larut dalam airProtein yang larut dalam airDisekresikan oleh berbagai stadium Disekresikan oleh berbagai stadium

aseksual dan gametosit muda P. falciparumaseksual dan gametosit muda P. falciparumTidak ditemukan pada spesies plasmodium Tidak ditemukan pada spesies plasmodium

yang lain.yang lain.Berada di darah sampai 28 hari setelah Berada di darah sampai 28 hari setelah

pengobatanpengobatan

LDH dan Aldolase :LDH dan Aldolase :Dihasilkan oleh stadium aseksual atau Dihasilkan oleh stadium aseksual atau

seksual semua plasmodium.seksual semua plasmodium. Isomer enzim LDH setiap plasmodium Isomer enzim LDH setiap plasmodium

berbeda sehingga dapat digunakan untuk berbeda sehingga dapat digunakan untuk mendeteksi infeksi campuran jika mendeteksi infeksi campuran jika dikombinasi dengan HRP-2dikombinasi dengan HRP-2

(pLDH)(pLDH)

Pan Laktat dehidrogenasePan Laktat dehidrogenase

Semua plasmodiumSemua plasmodium

PfHRP-2 PfHRP-2

(Histidine Rich Protein-2)(Histidine Rich Protein-2)

Khas Khas P. falciparumP. falciparum

Alat dan reagen yang disiapkan :Alat dan reagen yang disiapkan :1.1. LancetLancet

2.2. Kapas alkoholKapas alkohol

3.3. Reagen malariaReagen malaria

4.4. Larutan bufferLarutan buffer

5.5. Pipet sampelPipet sampel

6.6. Pengukur waktuPengukur waktu

Pengambilan Darah dengan Pipet Khusus (5 µl)Pengambilan Darah dengan Pipet Khusus (5 µl)

Penggunaan Uji Malaria Penggunaan Uji Malaria

Teteskan darah dari Teteskan darah dari pipet ke dalam lubang pipet ke dalam lubang sampel sampel (bertuliskan”S” ).(bertuliskan”S” ).

Tambahkan dua tetes Tambahkan dua tetes (60 (60 µµl) larutan bufer l) larutan bufer pada lubang bufer.pada lubang bufer.

Baca hasil tes dalam Baca hasil tes dalam waktu 20 menit.waktu 20 menit.

LingkunganLingkunganTerlalu panas (seharusnya 4 – 30 °C)Terlalu panas (seharusnya 4 – 30 °C)

AlatAlatKaset Kaset aliran tak lancar aliran tak lancarTanggal kadaluwarsaTanggal kadaluwarsa

OperatorOperatorJumlah darahJumlah darahBufferBufferWaktuWaktu

Reaksi positif palsu :Reaksi positif palsu :Faktor rematoidFaktor rematoidPersisten Ag setelah pengobatanPersisten Ag setelah pengobatanAda stadium gametosit muda dan stadium Ada stadium gametosit muda dan stadium

aseksual P. falciparum yang bersekuestrasi aseksual P. falciparum yang bersekuestrasi dalam kapiler alat dalam.dalam kapiler alat dalam.

Reaksi negatif palsu:Reaksi negatif palsu:Jumlah parasit rendah (< 100 parasit / Jumlah parasit rendah (< 100 parasit / µµL )L )Jumlah parasit tinggi ( > 10.000 parasit / Jumlah parasit tinggi ( > 10.000 parasit / µL )µL )